CN112135632A - 选择和设计用于癌症疗法的更安全且更有效的抗ctla-4抗体的方法 - Google Patents

选择和设计用于癌症疗法的更安全且更有效的抗ctla-4抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与人CTLA4分子结合的抗CTLA‑4抗体的组合物及其在癌症免疫疗法中的用途，以及与其他免疫治疗剂相比其用于减少自身免疫副作用的用途。

Description

选择和设计用于癌症疗法的更安全且更有效的抗CTLA-4抗体 的方法
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号AI64350、CA171972和AG036690下在政府支持下部分完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抗体及其抗原结合片段。
发明背景
经典的检查点阻断假说指出，癌症免疫力受两个不同的检查点限制：第一个是CTLA-4与B7之间的相互作用，其限制了淋巴样器官中初始
Figure BDA0002696718270000011
T细胞的引发，而第二个是程序性死亡1(PD-1)/B7H1(PDL1)相互作用，其导致肿瘤微环境中效应T细胞的耗尽[1]。从那时起，已在临床试验中对几个新的靶标进行评估[2]，并且已经描述了靶向剂的多种机制[3]。抗CTLA-4单克隆抗体(mAb)在小鼠[4-6]和患者[7-8]中诱导癌症排斥。
最近，提出了许多另外的机制来解释抗CTLA-4 mAb的免疫治疗作用，包括肿瘤微环境中调节性T细胞(Treg)的消耗[9-11]以及树突状细胞上B7的转胞吞(transendocytosis)的阻断[12-13]。然而，抗CTLA-4抗体是否通过检查点阻断假说假设的机制诱导肿瘤排斥(即阻断B7-CTLA-4相互作用并在淋巴样器官中发挥功能以促进初始T细胞的活化)尚待测试[1]。
抗CTLA-4 mAb的系统性作用受到以下报道的质疑，该报道提出抗小鼠CTLA-4 mAb的肿瘤免疫治疗作用取决于它们与Fc的激活受体的相互作用，并且该治疗作用与肿瘤微环境中Treg的选择性消耗有关[9-11]。尽管这些研究使人们对抗CTLA-4抗体在淋巴样器官上发挥治疗作用的教条产生了怀疑，但它并没有解决核心的问题，即是否需要阻断B7-CTLA-4相互作用或B7-CTLA-4相互作用是否有助于癌症治疗效果，或者B7-CTLA-4相互作用是否参与肿瘤微环境中Treg的消耗。
尽管普遍接受的概念是抗小鼠CTLA-4 mAb通过阻断来自B7-CTLA-4相互作用的负信号传导来诱导肿瘤排斥，但这些抗体的阻断活性[4-6，9-11]尚未得到严格评估。另一方面，据报道，如果使用可溶性B7-1和B7-2与固定化的CTLA-4相互作用，则首个临床使用的抗CTLA-4 mAb伊匹单抗(Ipilimumab)可以阻断B7-CTLA-4相互作用[14]。然而，由于B7-1和B7-2是膜缔合的共刺激分子，因此尚不清楚在生理相关条件下抗体是否阻断B7-CTLA-4相互作用。
抗PD-1 mAb纳武单抗(Nivolumab)和抗CTLA-4 mAb伊匹单抗的组合显著提高晚期黑素瘤患者的客观响应率[6，7]。此种联合疗法在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)中也显示出有希望的结果[8]。在将另一种抗CTLA-4 mAb(曲美木单抗(Tremelimumab))与抗PD-L1 mAb度伐鲁单抗(Durvalumab)组合时观察到类似的临床益处[9]。严重不良事件(SAE)呈现出单独或组合的抗CTLA-4 mAb的更广泛临床应用的主要障碍[6，7]。在伊匹单抗试验中观察到的SAE引起免疫疗法相关的不良事件(irAE)的概念[10]。特别地，在与伊匹单抗和纳武单抗(抗PD-1)联合疗法中，超过50％的患者形成3级和4级SAE。尽管3级和4级SAE以高比率发生，但在NSCLC中，伊匹单抗和纳武单抗联合疗法导致高的响应率[8]。同样，度伐鲁单抗(抗PD-L1)和曲美木单抗(抗CTLA-4)的组合显示NSCLC中的临床活性[9]，尽管该活性在III期临床试验中没有得到证实。可能是由于不可接受的毒性，报道3级和4级SAE的高发生并且患者的放弃率(drop-off rate)较高[9]。由于单一疗法和联合疗法两者中较高剂量的抗CTLA-4mAb与更好的临床结果相关，因此irAE不仅阻止许多患者继续进行免疫疗法，而且还限制了癌症免疫治疗效果(CITE)的功效。此外，大量的患者在这两种抗CTLA-4单抗的情况下放弃，这可能归因于一些临床试验中未能达到临床终点[11，12]。
最近，抗PD-1 mAb纳武单抗和抗CTLA-4 mAb伊匹单抗作为已切除的III和IV期黑素瘤的辅助治疗的面对面比较显示了伊匹单抗具有较低的CITE，但较高的irAE[13]，进一步使CTLA-4靶向性免疫疗法的前景黯淡。然而，存活三年的经伊匹单抗治疗的患者在十年期内没有显示存活率的进一步下降[14]。显著持续的响应突出显示了靶向CTLA-4进行免疫疗法的特殊好处，尤其是若可以使irAE受到控制的话。
产生安全且有效的抗CTLA-4 mAb的基本问题是CITE和irAE是否是内在联系的。由于CTLA-4表达的基因失活导致小鼠和人类自身免疫疾病，因此假设irAE是CITE的必要代价。另一方面，最近的研究表明抗小鼠CTLA-4 mAb的治疗作用不是阻断B7-CTLA-4相互作用，而是需要抗体介导的Treg消耗，特别是在肿瘤微环境内[16-18]。这些研究提出了一个有趣的可能性，即若可以实现局部Treg消耗而不模拟CTLA-4表达的遗传失活，则可以在没有irAE的情况下实现CITE。为了检验该假设，建立一个如实重演临床观察到的irAE的模型是必要的。
接受抗CTLA-4或抗CTLA-4加上抗PD-1/PD-L1药剂的患者中普遍报道的irAE包括血液学异常，如纯红细胞再生障碍[19，20]和对实体器官的非感染相关的炎性损害，如结肠炎、皮炎、肺炎、肝炎和心肌炎[21-23]。尽管术语irAE暗示CITE与自身免疫性AE之间存在内在联系，但很少有调查性研究证实此类联系。相比之下，发明人先前涉及人类Ctla4敲入小鼠的研究表明，抗DNA抗体的水平和癌症排斥参数并不总是相互关联的[24]。特别是，发现测试的抗体之一L3D10在几种测试的mAb中赋予最强的CITE，但却诱导最低水平的抗DNA抗体。但是，由于抗CTLA-4 mAb诱导的不良事件在小鼠中相对温和，因此该模型无法重演临床观察结果。因此，其在了解irAE的发病机理以及鉴定安全且有效的抗CTLA-4 mAb方面价值有限。此外，由于这些研究是在临床使用的抗CTLA-4 mAb可用之前进行的，因此尚不清楚该原理是否与临床产品诱导的irAE相关。
发明概述
假定抗CTLA-4抗体通过阻断来自B7-CTLA-4相互作用的负信号传导而引起肿瘤排斥。如本文所公开的，使用人CTLA4基因敲入小鼠以及人造血干细胞重构的小鼠来系统评估抗人CTLA-4 mAb的CITE是否需要在生理相关条件下阻断B7-CTLA-4相互作用。出人意料的是，在比临床上有效给药达到的血浆水平高得多的浓度下，抗CTLA-4抗体伊匹单抗既不阻断CTLA-4的B7转胞吞，也不阻断CTLA-4结合固定化的或细胞缔合的B7。因此，伊匹单抗不增加CTLA4基因人源化小鼠(Ctla4h/h)或人CD34+干细胞重构的NSGTM小鼠的DC上的B7水平。在同时表达人和小鼠CTLA4基因两者的Ctla4h/m小鼠中，与人而非小鼠CTLA-4结合的抗CTLA-4抗体有效诱导了Fc受体依赖性Treg消耗和肿瘤排斥。阻断抗体L3D10在引起肿瘤排斥方面与非阻断伊匹单抗相当。值得注意的是，在人源化期间失去阻断活性的L3D10后代在Treg消耗和肿瘤排斥中保持完全活性(competent)。有效阻断淋巴样器官中CD4 T细胞活化和从头CD8 T细胞引发的抗B7抗体不对伊匹单抗的免疫治疗效果产生负面影响。因此，临床上有效的抗CTLA-4 mAb伊匹单抗通过独立于检查点阻断但依赖于宿主Fc受体的机制引起肿瘤排斥。本文呈现的数据要求重新评估CTLA-4检查点阻断假说，并为下一代安全有效的抗CTLA-4 mAb提供新的见解。
除了赋予癌症免疫治疗效果(CITE)之外，抗CTLA-4单克隆抗体(mAb)还引起严重的免疫疗法相关不良事件(irAE)。靶向CTLA-4已显示出显著的长期益处，并因此，如果可以控制irAE，其仍然是癌症免疫疗法的重要工具。重演临床irAE和CITE的动物模型对于开发更安全的CTLA-4靶向试剂具有价值。在开发irAE的小鼠模型中，发明人考虑了三个因素。首先，由于抗PD-1和抗CTLA-4的联合疗法正在迅速扩展至多种适应症，因此重演该联合疗法的模型在该领域将具有重要意义。其次，联合疗法在超过50％的受试者中导致SAE(3级和4级器官毒性)的事实将使在小鼠模型中更容易重演irAE。第三，由于小鼠通常对irAE更具抗性，因此必须寻找可以如实重演irAE的条件。由于Ctla4-/-小鼠中的自身免疫表型在幼龄时表现最强[25，26]，并且成年小鼠中Ctla4基因的靶向突变导致不太严重的自身免疫疾病[27]，因此发明人发现小鼠如果在幼龄时施用抗CTLA-4 mAb，则可能对其最敏感。考虑到这些因素，发明人已经鉴定了一种如实重演在联合疗法的临床试验中观察到的irAE的模型系统。
具体地，本文描述了使用具有人源化Ctla4基因的小鼠评估单独或组合的抗CTLA-4抗体的CITE和/或irAE的模型。在该模型中，临床药物伊匹单抗诱导严重的irAE，尤其是与抗PD-1抗体组合时。同时，另一种抗CTLA-4mAb L3D10在相同条件下诱导了相当的CITE及非常温和的irAE，表明irAE和CITE没有内在联系并且它们需要不同的遗传和免疫学基础。irAE对应于系统性T细胞活化并降低自身反应性T细胞之间的Treg/Teff比率。使用人等位基因纯合或杂合的小鼠，发明人发现irAE需要双等位参与，而CITE仅需要单等位参与。由于单等位参与与双等位参与的免疫学区别，发明人发现Ctla4基因的双等位参与对于防止自身反应性T细胞转化为Treg是必要的。导致阻断活性丧失的L3D10的人源化进一步提高了安全性，而不影响治疗效果。综上所述，本文呈现的数据表明，完全CTLA-4占据、系统性T细胞活化和自身反应性T细胞的优先扩增对于肿瘤排斥是可有可无的，但与irAE相关，而阻断B7-CTLA-4相互作用既不影响安全性，也不影响CTLA-4抗体的功效。这些数据为更安全且潜在更有效的CTLA-4靶向免疫疗法的临床开发提供了重要的见解。
本文描述了与抗CTLA-4 mAb诱导的irAE有关的重要原理。具体而言，在低pH下具有CTLA-4的强结合亲和力的抗CTLA-4 mAb(如伊匹单抗或曲美木单抗)将在内化期间驱动表面CTLA-4至溶酶体降解，所述内化由于表面CTLA-4的丧失而触发irAE。相反，在低pH下具有弱结合亲和力的抗CTLA-4mAb在抗体诱导的内化期间与CTLA-4解离。经内化的CTLA-4将从这些抗体中释放出来，并再循环回到细胞表面，并保持CTLA-4作为免疫应答的负调节剂的功能。通过保留细胞表面CTLA-4(用于肿瘤内Treg消耗的ADCC/ADCP的靶标)，pH敏感抗体在肿瘤微环境中在选择性Treg消耗中，因此在排斥大肿瘤方面更有效。这些发现代表了针对治疗剂开发的CTLA-4靶向的重大范例转变，从基于拮抗B7和CTLA-4之间相互作用选择抗体的到保留正常CTLA-4再循环的。这为具有更好的抗肿瘤功效和较低毒性的新的抗CTLA-4抗体的设计和/或选择提供了重要的创新。
具体地，为了增加抗肿瘤活性，CTLA-4靶向剂将消耗肿瘤微环境中的Treg。在一个具体的实施方案中，抗CTLA-4 mAb具有增加的Fc介导的Treg消耗活性。Treg消耗可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)发生。如果CTLA-4抗体不下调肿瘤微环境中调节性T细胞的CTLA-4，优先通过保留内化的CTLA-4分子的再循环，则此活性得以增强。
为了减少irAE，将选择或工程化改造CTLA-4靶向剂以保留正常的CTLA-4再循环，并因此保留其在肿瘤微环境外的调节性T细胞的正常功能。在一个具体的实施方案中，抗CTLA-4 mAb在晚期内体或溶酶体pH(pH4-6)下与CTLA-4的结合亲和力大大降低，并且在抗体诱导的内化期间将从CTLA-4解离，从而允许释放的CTLA-4再循环回到细胞表面并维持CTLA-4作为免疫应答的负调节剂的功能。
在最优选的实施方案中，选择或工程化改造抗CTLA-4抗体以改善Treg消耗性抗肿瘤活性和CTLA-4再循环活性两者。
为了进一步增强CTLA-4靶向剂的毒性概况，它们可以具有降低的与可溶性CTLA-4(sCTLA-4)的结合。sCTLA-4是通过CTLA-4基因转录物的可变剪接产生的，并且CTLA4多态性和多种与可溶性CTLA4的缺陷性生成有关的自身免疫疾病之间存在关联(nature 2003,423:506-511)，且sCTLA4同等型的遗传沉默增加了小鼠I型糖尿病的发作(Diabetes 2011,60:1955-1963)。例如，相对于产生较多sCTLA-4的单倍型(如抗性CT60A单倍型)，产生较少sCTLA-4转录物的遗传变异(如单倍型CT60G)具有增加的自身免疫疾病易感性。因此，血清中sCTLA-4的存在与自身免疫疾病减少有关。此外，可溶性CTLA4(阿巴西普(abatacept)和贝拉西普(belatacept))是广泛用于免疫抑制的药物。因此，与sCTLA-4的结合亲和力降低的抗CTLA-4 mAb可以维持sCTLA-4作为免疫应答的负调节剂的功能。本文所述的发明还包括设计新的抗CTLA-4抗体或增强现有抗CTLA-4抗体的功效和/或毒性概况，通过掺入本文所述抗体的功能特征或属性进行。
本文提供了抗CTLA-4抗体，其可以不赋予系统性T细胞活化或自身反应性T细胞的优先表达，和/或其可以允许CTLA-4循环回到细胞表面。与5.5或4.5的pH相比，抗体可以在pH 7.0以更高的亲和力结合CTLA-4。抗体可以在肿瘤微环境中诱导Fc-R介导的T调节细胞消耗。抗体可以不赋予系统性T细胞活化或自身反应性T细胞的优先表达。前述抗体可以不阻断CTLA-4与其B7配体的结合。与位于细胞表面上的CTLA-4相比，抗体对可溶性CTLA-4可以具有降低的亲和力。抗CTLA-4抗体可以与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合。抗CTLA-4抗体可以用于治疗癌症。
本文还提供了鉴定诱导较低水平的免疫疗法相关不良事件的抗CTLA-4抗体的方法。方法可以包括提供包含细胞表面CTLA-4的细胞，使细胞与候选抗CTLA-4抗体接触，温育一段时间后，检测细胞表面CTLA-4的量以及将细胞表面CTLA-4的量与阈值水平进行比较。阈值水平可以是来自与对照抗CTLA-4抗体接触的细胞的细胞表面CTLA-4的量。与阈值水平相比更高量的细胞表面CTLA-4可以将候选抗CTLA-4抗体鉴定为诱导较低水平irAE的抗CTLA-4抗体。细胞可以表达人CTLA-4，并且细胞表面CTLA-4可以是可检测标记的。可检测标记物可以是荧光标签，如橙色荧光蛋白。检测可以包括使用Western印迹、免疫组织化学或流式细胞术测量细胞表面CTLA-4的可检测标记物的量。温育可以包括使候选抗CTLA-4抗体与经可检测标记的抗IgG抗体接触，并使用Western印迹、免疫组织化学或流式细胞术测量经可检测标记的抗IgG抗体的可检测标记物的量。可检测标记的抗IgG抗体可以包含alex488。细胞可以是293T细胞、中国仓鼠卵巢细胞和T调节细胞(Treg)。
本文进一步提供了抗CTLA-4抗体，其与小于或等于6的低pH相比，在6.5-7.5的高pH下对CTLA-4具有更高的结合亲和力。高pH可以是7且低pH可以是4.5或5.5。
本文还提供了筛选或设计用于免疫疗法中的抗CTLA-4抗体的方法，其中抗CTLA-4抗体不引起溶酶体CTLA-4降解。方法可以包括(a)在6.5-7.5的pH下使抗CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白接触，并定量与CTLA-4蛋白结合的抗CTLA-4抗体的量；(b)在4.5-5.5的pH下使抗CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白接触，并定量与CTLA 4蛋白结合的抗CTLA-4抗体的量；(c)比较(a)和(b)中结合的量。如果与(b)相比(a)中结合的量大于或等于阈值水平，则抗CTLA-4抗体可以不引起溶酶体CTLA-4降解。(a)的pH可以为7.0，(b)的pH可以为5.5，并且阈值水平可以为3倍。(a)的pH可以为7.0，(b)的pH可以为4.5，并且阈值水平可以为10倍。抗CTLA-4抗体结合的量可以是实现与CTLA-4蛋白的50％最大结合所需的抗CTLA-4抗体的量。抗CTLA-4抗体可以允许已经在细胞表面处结合的CTLA-4在内吞作用之后再循环回到细胞表面。
本文进一步提供了治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其可以包括向受试者施用抗体，所述抗体与CTLA-4的结合在对应于内体和溶酶体中发现的pH的酸性pH下被破坏。与pH 7.0相比，抗CTLA-4抗体在pH 5.5下可以表现出其与CTLA-4的结合的至少3倍的降低，并且与pH 7.0相比，在pH 4.5下可以表现出其与CTLA-4的结合的至少10倍的降低。与伊匹单抗或曲美木单抗相比，抗CTLA-4抗体可以表现出更大的与可溶性CTLA-4比与细胞表面结合或固定化的CTLA-4的结合的降低。
本文还提供了如本文所述的进行鉴定、筛选或设计的抗CTLA-4抗体。可以在治疗癌症的方法中将抗CTLA-4抗体施用于有此需要的受试者，抗CTLA-4抗体可以用于治疗癌症，并且可以用于制备用于治疗癌症的药物。抗CTLA-4抗体可以与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合使用，并且抗体可以伴随或依次施用，且可以组合为单一组合物。
附图简述
图1.CTLA-4-Fc的突变分析揭示了，伊匹单抗和L3D10与独特但重叠的表位结合。a-e.基于小鼠和人CTLA-4序列的晶体结构和变异，产生了hCTLA-4-Fc突变体M17(SEQ IDNO:1)和M17-4(SEQ ID NO:2)。a.通过CTLA-4分子与生物素化的B7-1结合的能力证实了其完整性。将对照hIgG-Fc、WT(M1)和突变的(M17和M17-4)hCTLA-4-Fc蛋白以1μg/ml的浓度包被在96孔板上。加入不同剂量的生物素化的hB7-1-Fc以测试其结合能力，其通过链霉抗生物素蛋白-HRP测量。b-e.将对照hIgG-Fc、WT(M1)(SEQ ID NO:3)和突变的(M17和M17-4)hCTLA-4-Fc蛋白以1μg/mL的浓度包被在96孔板上。加入不同剂量的生物素化的L3D10或伊匹单抗以测试其与hCTLA-4-Fc分子的结合能力。结合的特异性通过其与WT CTLA-4-Fc(b)而非hIgG-Fc(c)的结合来证实。虽然M17中的4个突变完全使与L3D10和伊匹单抗两者的结合失活(d)，但M17-4中的3个突变彻底消除与L3D10而非伊匹单抗的结合(e)。
图2.如果B7是固定化的，则伊匹单抗对B7-CTLA-4相互作用显示出较差的阻断活性。a.如果将可溶性B7-1用于结合测定法，则伊匹单抗和L3D10两者均有效力地阻断B7-CTLA-4相互作用。将不同剂量的抗人CTLA-4 mAb与0.025μg/ml的生物素化的人B7-1-Fc一起加入到包被有1μg/ml人CTLA-4-Fc的板上。使用缀合有HRP的抗生物素蛋白测量与板结合的B7-1-Fc的量。显示的数据是一式两份的平均值，并且代表两个独立的实验。b.伊匹单抗比L3D10与生物素化的人CTLA-4-Fc更好结合。将不同剂量的抗人CTLA-4 mAb或对照IgG包被到板上。以0.25μg/ml添加生物素化的CTLA4-Fc。使用缀合有HRP的链霉抗生物素蛋白测量与板结合的CTLA-4的量。显示的数据是一式两份的平均值，并且代表两个独立的实验。c.当mB7-1在CHO细胞上表达时，伊匹单抗对小鼠B7-1-人CTLA-4相互作用的可检测的但适度的阻断。将不同剂量的抗人CTLA-4 mAb与200ng的人CTLA-4-Fc一起加入1.2X 105个表达小鼠B7-1的CHO细胞中。相反，L3D10显示出对小鼠B7-1与人CTLA-4的结合的强烈阻断。显示的数据是一式三份数据的平均值和S.D.，并且代表三个独立的实验。d.L3D10而非伊匹单抗阻断加聚组氨酸标签的人CTLA-4和表达人B7-1的CHO细胞之间的相互作用。将1.2X105个表达人B7-1的CHO细胞与200ng生物素化的且加聚组氨酸标签的CTLA-4以及给定剂量的抗体一起温育。通过流式细胞术用PE-链霉抗生物素蛋白检测与CHO细胞结合的CTLA-4-Fc的量。显示的数据(平均值±S.D.)是一式三份样品的标准化平均荧光强度(MFI)，并且代表两个独立的实验。e.伊匹单抗和L3D10对可溶性hCTLA-4和细胞表面表达的hB7-1之间的相互作用表现出不同的阻断活性。将hB7-1阳性FcR阴性L929细胞(1X105个/测试)与生物素化的CTLA-4-Fc(200ng/测试)与给定剂量的抗体一起温育。用PE-链霉抗生物素蛋白检测B7结合的CTLA-4-Fc的量，并计算PE的平均荧光强度(MFI)。数据代表两个独立实验的结果。
图3.如果B7-1或B7-2是固定化的，则伊匹单抗对B7-1-CTLA-4和B7-2-CTLA-4相互作用显示出较差的阻断活性。(A-C)抗人CTLA-4 mAb伊匹单抗和L3D10在B7-1-CTLA-4相互作用中的阻断活性。(A)将hB7-1-Fc以0.5μg/ml的浓度固定化。与给定剂量的抗体一起以0.25μg/ml加入生物素化的CTLA-4-Fc。(B)与A中一样，只是在存在饱和剂量的伊匹单抗或L3D10(100μg/ml)的情况下使用不同剂量的生物素化的CTLA-4-Fc。(C)与A中一样，只是使用不同剂量的B7-1-Fc包被板并使用饱和剂量的伊匹单抗或L3D10(100μg/ml)来阻断CTLA-4-B7-1相互作用。(D-F)在B7-2-CTLA-4相互作用中抗人CTLA-4 mAb伊匹单抗和L3D10的阻断活性。(D)与A中一样，只是hB7-2-Fc经固定化。(E)与B中一样，只是hB7-2-Fc经固定化。(F)与C中一样，只是hB7-2-Fc经固定化。A-F中显示的数据是在450nm处一式两份或一式三份光密度的平均值。(G)阻断CTLA-4与细胞表面hB7-1的相互作用。将表达hB7-1的CHO细胞与生物素化的CTLA-4-Fc以及给定剂量的抗体一起温育。用PE-链霉抗生物素蛋白检测B7结合的CTLA-4-Fc的量，并计算PE的平均荧光强度(MFI)。(H)阻断CTLA-4与细胞表面mB7-2的相互作用。与C中一样，只是使用表达mB7-2的CHO细胞。(I)阻断CTLA-4-Fc结合经过夜LPS刺激成熟的脾DC。与G和H中一样，只是0.5μg/ml LPS刺激的2X106个脾细胞用于每个测试并且门控CD11c高DC(如图5B)用于分析PE强度。显示的数据(平均值±S.D.)是一式三份样品的标准化MFI值。该图中显示的数据已重复2-5次。
图4.调和(reconcile)伊匹单抗的不同阻断作用。(A-D)伊匹单抗不破坏预形成的B7-CTLA-4复合物。(A，B)抗CTLA-4mAb对B7复合的CTLA-4的影响。B7-CTLA-4复合物是通过将生物素化的CTLA-4加入预包被B7-1(A)或B7-2(B)的板上而形成的。将分级剂量的抗CTLA-4 mAb加到具有预先存在的B7-1-CTLA-4复合物(A)或B7-2-CTLA-4复合物(B)的板上。两小时后，将未结合的蛋白质洗掉，并使用HRP标记的链霉抗生物素蛋白检测B7-1或B7-2-复合的CTLA-4的量。(C)基于使用表达B7的CHO细胞的流式细胞术测定法，B7和CTLA-4复合物的解离动力学。在室温下，将表达表面hB7-1或mB7-2的CHO细胞(1X105个/测试)与可溶性生物素化的CTLA-4-Fc(200ng/测试)温育30分钟。洗涤后，将细胞在100μl DPBS缓冲液中温育指定的分钟。通过流式细胞术用PE-链霉抗生物素蛋白检测B7结合的CTLA-4-Fc的量，并从一式三份样品计算PE的平均荧光强度(MFI)。显示的数据是两个独立实验之一的结果。(D)L3D10而非伊匹单抗显著破坏在CHO细胞上表达的可溶性CTLA-4和hB7-1之间的预先建立的相互作用。在室温下，将表达表面hB7-1的CHO细胞(1X105个/测试)与可溶性生物素化的CTLA-4-Fc(200ng/测试)温育30分钟。洗涤后，将细胞与给定剂量的抗体在100μl DPBS缓冲液中温育1小时。用PE-链霉抗生物素蛋白检测B7结合的CTLA-4-Fc的量，并计算PE的MFI。结果代表具有相似模式的三个独立测定法之一。(E)伊匹单抗不减轻CTLA-4-Fc介导的对CD28-Fc与B7-1转染的J558细胞(J558-B7)结合的抑制。将J558-B7细胞与生物素化的CD28-Fc(20μg/ml)在存在CTLA-4-Fc(5μg/ml)和分级剂量的抗CTLA-4 mAb或对照IgG-Fc的情况下温育。显示的数据是来自一式三份样品的MFI的平均值和S.E.M.，并且代表具有相似结果的至少三个独立的实验。(F)当B7-1固定化时，B7-1-CTLA-4相互作用的动力学。(G)当CTLA-4固定化时，B7-1-CTLA-4相互作用的动力学。该图中显示的数据重复了2-5次。
图5.B7-CTLA-4相互作用的细胞测定法的表征。a.稳定表达人hCTLA-4-OFP蛋白的野生型(WT，上图)和Y201V突变体(下图)的293T细胞的共聚焦图像。请注意，虽然WT hCTLA-4主要位于细胞内，但突变体hCTLA-4分子显示出质膜分布的清晰模式。b.图6中使用的细胞-细胞结合测定法中的GFP+OFP+细胞是基于其前向和侧向散射(scatter)的细胞-细胞聚集体。在4℃下共温育2h的hB7-2-GFP-CHO和hCTLA-4Y201V-OFP-293T细胞的代表性流式概况。上图显示了GFP+OFP+细胞的前向散射与侧向散射，而下图显示了单阳性细胞与双阳性细胞的前向散射(左)和侧向散射(右)的比较。c.跨胞吞测定法的表征。上图显示了用于图7中所示数据的门控，而下图显示了在37℃下共温育4小时后，CTLA-4-OFP-CHO细胞从hB7-2-GFP-CHO细胞获得了GFP信号，前向和侧向散射均未改变。
图6.伊匹单抗在阻断B7/CTLA-4介导的细胞间相互作用中无效。(A)未经共温育的B7-1-GFP或B7-2-GFP转染的CHO细胞或CTLA-4Y201V转染的293T细胞或B7-2和CTLA-4转染子的混合物的概况。(B)用于该研究的Fab的纯度的SDS-PAGE分析。(C，D)代表性FACS概况(C，以10μg/ml使用的Fab)和剂量响应(D)，其显示出L3D10和伊匹单抗Fab与CTLA-4-OFP转染的CHO细胞的相当的结合。使用缀合有Alex Fluor 488的山羊抗人IgG(H+L)作为二抗进行结合测定法。剂量响应显示出伊匹单抗和L3D10 Fab的相似的结合活性。AF488-MFI，AlexFluor 488染料的平均荧光强度。(E)通过抗CTLA-4 mAb Fab抑制B7-1-CTLA-4Y201V介导的细胞间相互作用。将B7-1-GFP转染的CHO细胞和CTLA-4Y201V转染的293T细胞在存在10μg/mlFab或对照蛋白的情况下于4℃共温育2小时。显示的数据是代表性的FACS概况。(F)L3D10和伊匹单抗之间关于其阻断由在相对细胞(opposing cell)上表达的B7-1和CTLA-4介导的细胞间相互作用的定量比较。与E中一样，只是添加分级剂量的抗体。(G)通过抗CTLA-4mAbFab抑制B7-2-CTLA-4Y201V介导的细胞间相互作用。与E中一样，只是使用B7-2-GFP转染子。(H)L3D10和伊匹单抗之间关于其阻断由相对细胞表达的B7-2和CTLA-4介导的细胞间相互作用的定量比较。与F中一样，只是使用B7-2-GFP转染的CHO细胞。所有测定法重复至少2次。
图7.伊匹单抗在阻断由CTLA-4进行的B7-转胞吞中无效。(A)用于转胞吞测定法的B7-2-GFP转染或CTLA-4-OFP转染的CHO细胞系的FACS概况。(B)通过CTLA-4对B7-2的快速转胞吞。将B7-2-GFP转染子和CTLA-4-OFP转染子在37℃下共温育0、0.5、1和4小时。(C)缺乏CTLA-4对B7-H2的转胞吞。与B中一样，除了B7-H2-GFP转染的P815细胞，并呈现了共培养0、1、4小时的数据。(D)代表性概况描绘了在存在对照hIgG-Fc或来自伊匹单抗或L3D10的Fab(10μg/ml)的情况下，共培养4小时期间表达CTLA-4-OFP的CHO细胞对B7-1-GFP的转胞吞的不同阻断。(E)描绘了L3D10和伊匹单抗Fab对B7-1转胞吞的抑制的剂量响应曲线。与D中一样，只是将不同剂量的对照hIgG-Fc或Fab添加至共培养。(F)与D中一样，只是使用B7-2-GFP转染的CHO细胞。(G)描绘了L3D10和伊匹单抗Fab对B7-2转胞吞的抑制的剂量响应曲线。与E中一样，只是使用B7-2-GFP转染的CHO细胞。显示的数据(平均值±S.D.)是在不同剂量的Fab上转胞吞的％。重复所有测定法至少3次。
图8.伊匹单抗在体内不阻断B7-CTLA-4相互作用。(A)实验设计图。(B)代表性数据，其显示针对B7表达进行分析的CD11b+CD11c高树突状细胞(DC)的表型。(C)代表性直方图，描绘了接受对照hIgG-Fc、L3D10或伊匹单抗的小鼠的DC上mB7-1的水平。上图的数据显示了在纯合人CTLA4敲入小鼠(Ctla4h/h)中的抗体作用，而下图的数据显示了在杂合小鼠(Ctla4h/m)中的抗体作用。(D)与C中一样，只是显示了mB7-2的表达。c和d中显示的数据代表每组3只小鼠的数据，并重复一次。(E)在人CTLA4纯合小鼠中，L3D10而非伊匹单抗诱导mB7-1(左图)和mB7-2(右图)的上调。所显示的数据(平均值±S.E.M.)从两个实验(其涉及每组共6只小鼠)中总结。(F)与E中一样，只是使用杂合小鼠。在共显性表达小鼠和人Ctla4基因两者的小鼠中，L3D10和伊匹单抗均未阻断B7-CTLA-4相互作用。使用学生t检验确定统计显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。n.s.，不显著。
图9.尽管在hIgG-Fc对照制剂中检测到的内毒素水平比抗CTLA4抗体制剂略高，但hIgG-Fc并未上调小鼠脾DC上的B7-1和B7-2表达。a，b.来自用500μg的hIgG-Fc或等体积的PBS处理的Ctla4h/h小鼠的、如图5b中所描绘那样门控的脾DC之间的B7-1(a)和B7-2(b)表达的代表性概况。c，d.总结脾DC上表达的B7-1(c)和B7-2(d)的平均荧光强度。每组n＝5只Ctla4h/h小鼠。因此，对照hIgG-Fc处理的小鼠的概况反映了B7-1和B7-2的基础表达水平。因此，如图8中所示，伊匹单抗相对于hIgG-Fc的作用缺乏表明其不能在体内上调B7-1和B7-2。
图10.L3D10、HL12、HL32和伊匹单抗结合人CTLA-4而非小鼠Ctla-4。显示的数据是使用Ctla4h/h(上)或Ctla4m/m(下)小鼠的脾细胞，在门控CD3+CD4+细胞中CTLA-4的细胞内染色的点状图。抗小鼠Ctla-4 mAb4F10(BD Biosciences)用作对照。
图11.伊匹单抗不在体内阻断人B7-人CTLA-4相互作用。(A)FACS概况描绘了用人脐带血CD34+细胞重构的NSGTM小鼠的外周血白细胞(PBL)中人白细胞的组成。(B)如在A中分析的个别小鼠的汇总数据。(C)人源化NSGTM小鼠的脾中Treg(右中图)和DC(右图)的正常组成。(D)在小鼠脾中人CD4T细胞中FOXP3和CTLA-4的表达。(E，F)L3D10而非伊匹单抗阻断人脐带血CD34+干细胞重构的NSGTM小鼠中人B7-2-人CTLA-4相互作用。人源化小鼠接受了对照Ig或抗CTLA-4 mAb(500μg/小鼠)的腹膜内处理。注射后24小时收获脾细胞，并分析DC上B7-2的表达。(E)hB7-2在DC上的代表性概况。(F)来自两个独立实验的汇总数据(平均值±S.E.M.)。对照小鼠中的平均数据人为定义为100，而实验组中的平均数据则相对于对照进行了标准化。使用学生t检验确定统计显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。n.s.，不显著。
图12.阻断B7-CTLA-4相互作用无助于抗CTLA-4 mAb引发的癌症免疫治疗活性和肿瘤内Treg消耗。(A)尽管两种抗CTLA-4 mAb的阻断活性差异很大，但其免疫治疗效果相当。将5x105个或1x106个MC38肿瘤细胞注射(s.c.)到Ctla4h/h小鼠(n＝5-6)中，并在第7、10、13和16天用每小鼠100μg(左)、30μg(中)或10μg(右)伊匹单抗、L3D10或对照hIgG-Fc处理(i.p.)小鼠，如箭头指示。数据表示每组5-6只小鼠的平均值±S.E.M.。通过双向重复测量方差分析(ANOVA)(处理x时间)进行统计分析。对于100μg处理，伊匹单抗对hIgG-Fc：P<0.0001；L3D10对hIgG-Fc：P<0.0001；伊匹单抗对L3D10：P＝0.0699。对于30μg处理，伊匹单抗对hIgG-Fc：P<0.0001；L3D10对hIgG-Fc：P<0.0001；伊匹单抗对L3D10：P＝0.9969。对于10μg治疗，伊匹单抗对hIgG-Fc：P<0.0001；L3D10对hIgG-Fc：P<0.0001；伊匹单抗对L3D10：P＝0.9988。数据代表3-5个独立实验。(B)伊匹单抗和L3D10对B16黑素瘤生长具有相似的治疗作用。将1×105个B16肿瘤细胞注射(s.c.)到Ctla4h/h小鼠(n＝4-5)中，并在第11、14、17天(左)或第2、5和8天(右)用100μg(左)或250μg(右)伊匹单抗、L3D10或对照hIgG-Fc处理(i.p.)小鼠，如箭头指示。对于左图，伊匹单抗对hIgG-Fc：P＝0.0265；L3D10对hIgG-Fc：P＝0.0487；伊匹单抗对P＝0.302。对于右图，伊匹单抗对hIgG-Fc：P＝0.00616；L3D10对hIgG-Fc：P＝0.0269；伊匹单抗对L3D10：P＝0.370。数据代表每组4-5只小鼠的平均值±S.E.M.。(C-F)在Ctla4h/h小鼠的肿瘤微环境中，阻断B7-CTLA-4相互作用无助于Treg的选择性消耗。在第三次处理后3天，L3D10和伊匹单抗没有删除小鼠脾(C)中的Treg。显示的数据是Ctla4h /h小鼠中CD4T细胞中Foxp3+细胞的百分比。每组n＝6只小鼠。L3D10和伊匹单抗两者均消耗了移植到Ctla4h/h小鼠中的肿瘤中的Treg，如通过CD4 T细胞中的％Treg(D，上)、绝对Treg数目(D，下)和CD8/Treg比率(E)确定的。在D(上图)和E中呈现了来自每组涉及7只小鼠的两个实验的汇总数据。在Ctla4h/h小鼠的肿瘤中，在第三抗体处理后3天通过流式细胞术对Foxp3+细胞的数目进行计数(d，下图)。每个组n＝5。通过普通的单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析。(F)阻断B7-CTLA-4相互作用无助于肿瘤浸润CD4(左)或CD8(右)T细胞中产生IFNγ的细胞增加。汇总数据来自每组涉及7只小鼠的两个实验。在13或16天之间制备来自小鼠的胶原酶消化的肿瘤的单细胞悬液，并在存在高尔基阻断剂的情况下培养4小时，并对细胞内细胞因子染色。(G-J)在抗体均不阻断B7-CTLA-4相互作用的Ctla4h/m小鼠中，L3D10和伊匹单抗两者均诱导强烈的肿瘤排斥和肿瘤内Treg消耗。与A中一样，只是使用表达小鼠和人CTLA-4两者的杂合小鼠。(G，H)抗体处理的较高剂量(G，100μg/小鼠/注射)和较低剂量(H，10μg/小鼠/注射)两者均显示出有效的治疗效果。在G中，伊匹单抗对hIgG-Fc：P<0.0001；L3D10对hIgG-Fc：P<0.0001；伊匹单抗对P＝0.4970。数据代表5个独立实验。Treg在抗体均未在体内显著阻断B7-CTLA-4相互作用的Ctla4h/m小鼠的肿瘤(I)而非脾(J)中被选择性消耗。C、D、E和I中显示的数据(平均值±S.E.M.)是肿瘤细胞攻击后第18天(实验1)或20天(实验2)和启动3或4个抗CTLA-4 mAb处理后11或13天的Treg百分比，如箭头指示。使用Mann-Whitney检验确定C-F和I-J的统计显著性。(K)抗FcR mAb施用消除了伊匹单抗的治疗作用。将5x105个MC38肿瘤细胞注射(s.c.)到Ctla4h/h小鼠中，并在第7、10、13和16天用30μg单独的伊匹单抗或30μg伊匹单抗(黑色箭头)加1mg 2.4G2(红色箭头)或对照hIgG-Fc处理(i.p.)小鼠，如所示。通过双向重复测量方差分析(处理x时间)进行统计分析。伊匹单抗对hIgG-Fc：P＝0.0003；伊匹单抗加2.4G2对hIgG-Fc：P＝0.6962；伊匹单抗加2.4G2对伊匹单抗：P＝0.0259。
图13.CTLA-4在肿瘤浸润的Treg中表达。a.肿瘤来源的FoxP3+Treg比Foxp3阴性CD4 T细胞具有更高的CTLA-4表达。如图12中，将MC38肿瘤细胞注射到Ctla4h/h或Ctla4h/m小鼠中，并在第7、10和13天用每剂量100μg的对照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb处理小鼠。第三抗体处理后五天，处死小鼠，并对肿瘤细胞进行流式细胞术分析，用于肿瘤浸润的CD45+CD4+Foxp3+Treg和CD45+CD4+Foxp3-T细胞中人CTLA-4或小鼠Ctla-4表达。数据代表三个独立实验之一的结果。b，c.与脾相比，来自肿瘤的Treg具有更高的表面CTLA-4和总CTLA-4两者的表达。如图12中，MC38肿瘤接种后14天，处死Ctla4h/h小鼠以进行脾和肿瘤来源的CD4+Foxp3+Treg中的表面CTLA-4(b)和总CTLA-4(c)表达的流式细胞术分析。直方图的每一行表示一只单独的小鼠。n＝6只小鼠，且显示的数据代表至少三个独立实验之一的结果。
图14.抗hCTLA-4mAb对脾和肿瘤T细胞中IFNγ和TNFα生成的影响。如图12a中，将MC38肿瘤细胞注射到Ctla4h/h小鼠中，并在第7、10和13天用每剂量100μg的对照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb处理小鼠。第三抗体处理后三天，处死小鼠以分析来自经处理的小鼠的肿瘤(a，b)和脾(c-f)中CD4(a，c，e)和CD8(b，d，f)T细胞中表达IFNγ和TNFα的细胞的频率。汇总数据来自每组涉及7只小鼠的两个实验。
图15.丧失阻断活性的人源化L3D10抗体后代(HL12和HL32)在局部Treg消耗和肿瘤排斥中仍然有效。(A)HL12、HL32和L3D10与1μg/ml固定化的加聚组氨酸标签的CTLA-4的结合活性。(B)HL12和HL32无法阻断B7-1-CTLA-4相互作用。将B7-1-Fc以0.5μg/ml的浓度固定化。与分级浓度的抗CTLA-4 mAb一起，以0.25μg/ml加入生物素化的CTLA-4-Fc。(C)HL12和HL32几乎不阻断B7-2-CTLA-4相互作用。与B中一样，只是B7-2-Fc经固定化。(D)HL12和HL32在体内不能上调B7-1和B7-2。如图8中所示，Ctla4h/h小鼠接受500μg/小鼠/注射对照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb。第二天收获脾细胞，以确定CD11b+CD11c高DC上B7-1和B7-2的水平，如图8中详述。每个组n＝3。(E-G)与L3D10相似，HL12和HL32在Ctla4h/h小鼠的肿瘤微环境中显示出Treg的选择性消耗。如图12中，L3D10、HL12和HL32引起肿瘤(E)中Treg的相当且有效的消耗，但是未消耗脾(F)和肿瘤引流淋巴结(G)中的Treg。显示的数据从2个实验汇集。每个组n＝5只小鼠。一次注射100μg所示药物后一天，处死小鼠。(H)伊匹单抗和人源化L3D10抗体HL12和HL32对MC38肿瘤的有效排斥。在肿瘤细胞接种后第7、10、13和16天用100μg对照IgG-Fc或伊匹单抗或HL12、HL32处理携带MC38的小鼠。显示的数据是肿瘤体积的平均值和S.E.M.。每个组n＝6只小鼠。通过双向重复测量方差分析(处理x时间)进行统计分析。伊匹单抗对hIgG-Fc：P＝0.034；HL12对hIgG-Fc：P＝0.037；HL32对hIgG-Fc：P＝0.0336；HL12对伊匹单抗：P＝0.9021；HL32对伊匹单抗：P＝0.9972；HL32对HL12：P＝0.7250。(I)HL32和L3D10在最小疾病模型中在B16肿瘤细胞的治疗方面同等有效。将1×105个B16肿瘤细胞注射(s.c.)到Ctla4h/h小鼠(n＝4-5)中，并在第2、5和8天用250μg的伊匹单抗、L3D10、HL32或对照IgG-Fc处理(i.p.)小鼠。HL32对hIgG-Fc：P＝0.0002；L3D10对HL32：P＝0.9998；伊匹单抗对HL32：P＝0.8899。数据表示每组5-6只小鼠的平均值±S.E.M.。
图16.尽管不能阻断CTLA-4-B7相互作用，但HL12和HL32对外周淋巴器官和肿瘤中T细胞亚群的丰度表现出与L3D10类似的作用。a.消除了HL12和HL32阻断可溶性B7与固定化的CTLA-4-Fc结合的能力。将hCTLA-4-Ig以0.25μg/ml的浓度固定化在96孔ELISA板上。与给定剂量的抗CTLA-4 mAb(L3D10，HL12和HL32)或对照hIgG-Fc一起，以0.25μg/ml加入生物素化的hB7-1-Fc。洗涤后，用缀合有HRP的抗生物素蛋白检测与板结合的生物素化的hB7-1-Fc。显示的数据是在450nm处一式三份的光密度平均值。结果代表3次独立实验。b，c.与L3D10一样，HL12和HL32优先消除肿瘤浸润的Treg。如图12e-12g所示，分析了肿瘤、脾和肿瘤引流淋巴结(dLN)中的CD8 T细胞(上排)、CD4+Foxp3-T细胞(中排)和CD4+Foxp3+Treg(下排)的频率(b)和数目(c)。最后，对活的CD45+白细胞进行门控，以定量各种组织中T细胞亚群的频率(T亚组/CD45+细胞X 100％)，并针对肿瘤重量(克)对肿瘤中T细胞亚群的数目进行标准化。注射100μg所示药物后一天，处死小鼠。显示的数据从2个实验汇集。每个组n＝5只小鼠。
图17.通过阻断CTLA-4-B7负信号传导无法达到伊匹单抗的治疗效果。(A)确认抗B7 mAb的阻断活性。将表达小鼠B7-1或B7-2的CHO细胞与抗体(20μg/ml)和生物素化的人CTLA-4-Fc(2μg/ml)的混合物温育1小时。洗去未结合的蛋白质后，通过缀合有PE的链霉抗生物素蛋白检测细胞表面CTLA-4-Fc，并通过流式细胞仪进行测量。显示的数据是代表性的FACS概况，并重复2次。(B)实验设计图。MC38荷瘤的Ctla4h/m小鼠接受与对照Ig或伊匹单抗联合的抗B7-1和抗B7-2抗体(300μg/小鼠/注射，每3天一次，共3次注射)，接受伊匹单抗而无抗B7-1和抗B7-2的小鼠用作肿瘤排斥的阳性对照。(C，D)如B中所示，通过抗体处理使B7-1和B7-2饱和。在第13天最后一次抗B7处理后24小时，用缀合有FITC的抗B7-1和抗B7-2 mAb对PBL进行染色。将来自Cd80-/-Cd86-/-小鼠的PBL用作阴性对照。(E)在体内完全阻断B7-2。与C和D中一样，只是使用从携带MC38的小鼠的引流淋巴结的单细胞悬液中门控的CD45+白细胞。上图描绘了B7-2染色的概况，而下图显示了平均荧光强度。这项研究已经重复了3次。(F)抗体应答的消融证实了抗B7-1和抗B7-2mAb对B7的功能性阻断。在肿瘤攻击后第22天收集血清，以评估抗人IgG抗体应答。(G)通过抗B7-1和抗B7-2mAb的饱和阻断不影响伊匹单抗的免疫治疗作用。g中表示的数据是随时间变化的肿瘤体积，并且重复两次，结果相似。D-G中的数据表示平均值±S.E.M.。n.s.，不显著。
图18.抗B7mAb的体内处理防止伊匹单抗介导的T细胞活化和CD8T细胞的从头引发。(A)抗B7-1(1G10)和抗B7-2(GL1)mAb对B7的功能性阻断阻止伊匹单抗诱导的CD4 T细胞活化。在第7、10和13天用hIgG-Fc(100μg/小鼠/注射)、伊匹单抗(100μg/小鼠/注射)或伊匹单抗加抗mB7 mAb(300μg1G10加300μgGL1每小鼠/注射)腹膜内处理MC38荷瘤Ctla4h/h小鼠(每组n＝5)，并在第14天安乐死。将性别和年龄匹配的无肿瘤Ctla4h/h小鼠用作对照未处理
Figure BDA0002696718270000171
小鼠。通过MACS阴性选择纯化来自这些小鼠的脾T细胞，并将其在存在10μg/mlhIgG-Fc的情况下与未处理的脾DC共培养4天。通过细胞因子珠测定法(CBA)定量上清液中Th2细胞因子(包括IL-4、IL-6和IL-10)的水平。(B，C)抗B7 mAb阻止伊匹单抗诱导的抗原特异性CD8 T细胞的引发。与A中一样，只是在第8天用在100μl完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的50μgSIY肽皮下免疫所有小鼠(每个组n＝4)。在第15天处死小鼠并收集肿瘤引流淋巴结，以通过四聚体(tetramer)染色评估SIY特异性CD8 T细胞(在CD3+CD4-细胞上门控)。OVA四聚体用于对照染色。显示了代表性的FACS概况(B)和汇总数据(C)。显示的数据代表两个独立的实验，结果相似。
图19.评估常用的抗小鼠Ctla-4 mAb 9H10和9D9的阻断活性。a，b.如果将B7-1(a)和B7-2(b)包被到板上，则9H10不阻断B7-CTLA-4相互作用。在存在给定浓度的对照IgG或抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9和9H10的情况下，将生物素化的小鼠Ctla-4-Fc融合蛋白与B7包被的板一起温育。显示的数据是一式两份孔的平均值，并且代表两个独立的实验。c，d.9D9和9H10表现出对可溶性(c)和与板结合的Ctla-4-Fc(d)的不同结合能力。MPC-11(小鼠IgG2b)和仓鼠IgG(Ham IgG)是同种型匹配的对照Ig蛋白。显示的数据是一式两份孔的平均值，并且代表至少两个独立的实验。e，f.抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9和9H10对上调来自WT(Ctla4m/m)小鼠的脾CD11c高DC上B7-1(e)和B7-2(f)的水平的不同作用。用500μg抗体处理后24小时，处死小鼠并收获脾细胞立即进行流式染色。IgG组表示接受500μg的MPC-11和500μg的Ham IgG的小鼠。在每组各自涉及3只小鼠的两个独立实验中，从每组6只独立小鼠中汇总数据(平均值±S.E.M.)。使用学生t检验确定e和f中的统计显著性。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。n.s.，不显著。
图20.抗小鼠Ctla-4mAb 4F10的不同的体外和体内阻断活性。a，b.4F10对Ctla-4Fc与包被板的B7-1(a)或B7-2(b)的相互作用的影响。在存在给定浓度的对照IgG或抗小鼠Ctla-4 mAb 4F10的情况下，将生物素化的小鼠Ctla-4-Fc融合蛋白与B7包被的板温育。用缀合有HRP的抗生物素蛋白检测Ctla-4-Fc结合。显示的数据是一式两份的平均值，并且代表两个独立的实验。c，d.4F10对CD11c高树突状细胞上B7-1和B7-2表达的影响。通过流式细胞术分析用500μg4F10或hIgG-Fc i.p.施用的WT(Ctla4m/m)小鼠的脾细胞的B7水平。B7-1(c)和B7-2(d)水平的汇总数据(平均值±S.E.M.)来自每组6只小鼠。对照IgG处理组的B7水平人为定义为100。
图21.L3D10和伊匹单抗显示出相当的抗肿瘤活性。MC38荷瘤Ctla4h/h小鼠(n＝5)在第7、10、13和16天接受对照hIg、伊匹单抗或L3D10(30μg/注射x4)的处理。每3天测量肿瘤生长。数据为平均值±S.E.M.，并被重复了超过3次。通过双向重复测量方差分析与Bonferroni多重比较检验分析统计显著性。hIg对伊匹单抗，P＝0.0335；hIg对L3D10，P＝0.0248；伊匹单抗对L3D10，P＝0.6928。
图22.来自新生小鼠和成年荷瘤小鼠的Treg表达的CTLA-4分子水平高于未处理的成年小鼠。A.新生小鼠(10日龄雄性小鼠，灰线)和成年小鼠(2-3月龄雄性小鼠，黑线)之间的比较。显示的数据是来自雄性小鼠脾的Foxp3+CD4+Treg的概况(n＝3)。B.未处理(黑线)和荷瘤(灰线)成年雄性小鼠(3月龄，n＝6)之间的比较。显示的数据是FACS概况，其描绘了Foxp3+CD4+细胞中总CTLA-4的分布。差异是统计显著的，并且已至少重复了五次。
图23.当单独使用或与抗PD-1 mAb组合使用时，人CTLA4基因敲入小鼠区分抗CTLA-4 mAb伊匹单抗和L3D10的irAE：生长迟缓和纯红细胞再生障碍。(A)抗体处理和分析的时间线。在第10、13、16和19天以100μg/小鼠/注射的剂量用对照人IgG-Fc、抗人CTLA-4mAb伊匹单抗、人IgG1 Fc嵌合L3D10+人IgG-Fc、抗PD-1(RMP1-14)+人IgG-Fc、抗PD-1+伊匹单抗或抗PD-1+L3D10处理C57BL/6Ctla4h/h小鼠。在出生后第41天进行CBC分析并在出生后第42天进行尸体剖检。为了避免笼子变化，对同一笼子中的小鼠进行单独标记并用不同的抗体处理。双盲进行测试。(B)伊匹单抗+抗PD-1得到的雌性小鼠的主要生长迟缓。由于在第22天死亡并伴有严重的生长迟缓，将来自伊匹单抗加抗PD-1处理组的一只雌性小鼠排除在分析之外。显示的数据是第一次注射后％体重增加的平均值和S.E.M.。hIg对伊匹单抗+抗PD-1，P<0.0001；L3D10+抗PD-1对伊匹单抗+抗PD-1，P＝0.003。(C)伊匹单抗+抗PD-1得到的雄性小鼠的主要生长迟缓。与B中一样，只是使用雄性小鼠。hIg对伊匹单抗+抗PD-1，P＝0.0116；L3D10+抗PD-1对伊匹单抗+抗PD-1，P＝0.0152。使用的小鼠的数目包括在组标记物后的括号中。(D-G)纯红细胞再生障碍在小鼠模型中以irAE的典型表型重演。(D)伊匹单抗+抗PD-1联合疗法降低血细胞比容(HCT)、血红蛋白(Hb)和平均红细胞体积(MCV)。显示的数据是2-3个独立实验的汇总，其中每个点代表一只单独的小鼠(蓝色代表雄性小鼠而红色代表雌性小鼠，每组n＝9-22只小鼠)。(E)骨髓中红细胞的缺陷生成。图片描绘了接受指定处理的小鼠的骨骼(上图)和骨髓冲洗(下图)的着色变化。(F)通过流式细胞仪分析红细胞发育。显示的数据为代表性的FACS概况，其描绘了骨髓细胞中Ter119、CD71和前向散射(FSC-A)的分布。指示了I-V阶段的门控和细胞％。(G)每个发育阶段的红系细胞百分比的汇总数据。显示的数据是具有每组3-4只雌性小鼠的数据的平均值和S.E.M.，并在雄性和雌性小鼠两者中均重复至少三次。统计检验使用：B和C，双向重复测量方差分析与Bonferroni多重比较检验；D和G，单向方差分析与Bonferroni多重比较检验和非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)以及Dunn的多重比较检验。
图24.如图23中概述的抗体处理后的正常血细胞参数。显示的数据是2-3个独立实验的汇总，其中每个点表示一只单独的小鼠(雄性小鼠为深灰色，而雌性小鼠为浅灰色)。通过非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)以及Dunn的多重比较检验分析CBC结果。在成对比较中没有发现统计学上的显著差异。NE，嗜中性粒细胞；WBC，白细胞；RBC，红细胞；MO，单核细胞；LY，淋巴细胞；EO，嗜曙红细胞；RDW，红细胞分布宽度；PLT，血小板；MPV，平均血小板体积。
图25.伊匹单抗与抗小鼠PD-1组合使用时引起心脏缺陷。(A)尽管用抗PD-1+伊匹单抗处理的小鼠体形减小，但大体解剖(gross anatomy)显示心脏增大。左图中的图片来自接受了指定处理的小鼠的福尔马林固定的心脏，并且右图中的数据显示了针对体重标准化后的大小。(B)描绘心房和心室扩大，以及相应的心脏壁变薄的宏观图片。(C)对照hIg、L3D10+抗PD-1或抗PD-1+伊匹单抗处理的心脏的组织学。上面的4个图显示主动脉底部的H&E染色，而下面的4个图显示左心室心肌中的炎症。(D)通过免疫组织化学(上图)和使用FITC标记的CD4或CD8、罗丹明标记的抗CD3或抗Foxp3抗体的三色免疫荧光染色(下图)鉴定白细胞和T细胞。(E)接受不同处理的雄性和雌性小鼠(n＝5-12)的综合病理评分。雄性小鼠的评分(score)用蓝色圆圈表示，而雌性小鼠的评分用红色圆圈表示。从6个独立实验中收集样品，并进行双盲评分。数据为平均值±S.E.M.并通过单向方差分析与Bonferroni多重比较检验进行了分析。
图26.大体解剖和H&E染色显示伊匹单抗+抗PD-1处理后卵巢和子宫发育不良。如图23和图25中，在出生后第42天进行尸体剖检。
图27.伊匹单抗增加了血清ACTH水平。在第10、13、16和19天以100μg/小鼠/注射的剂量分别用对照人IgG Fc、抗PD1、抗人CTLA-4 mAb伊匹单抗、L3D10、HL12或HL32处理C57BL/6Ctla4h/h小鼠。出生后第42或43天收集血清。使用用于促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒(Cloud-Clone Corp.,Cat.No.SEA836Mu)测量血清ACTH水平。每组n＝8-18只小鼠。通过单向方差分析与Bonferroni多重比较检验分析统计显著性。
图28.伊匹单抗用作单一药剂或与抗PD-1组合使用时引起多器官炎症。(A)来自不同器官的H&E染色石蜡切片的代表性图像。代表性的炎性灶用箭头标识。比例尺，200μm。(B)内部器官和腺体的毒性评分。雄性小鼠的评分用深灰色圆圈表示，而雌性小鼠的评分用浅灰色圆圈表示。(C)所有器官和腺体的综合评分。数据是平均值±S.E.M.，每组n＝5-12只小鼠。从6个独立实验中收集样品，并进行双盲评分。通过单向方差分析与Bonferroni多重比较检验分析数据。
图29.比较从第10天开始接受免疫治疗药物的小鼠的系统性T细胞活化。(A)抗PD-1和抗CTLA-4对CD4(上图)和CD8(下图)T细胞频率的微小影响。显示的数据是开始抗体处理后第32天，脾中CD4和CD8 T细胞的百分比。(B)代表性的FACS概况描绘了围产期期间接受单一疗法和抗PD-1加伊匹单抗组合处理的小鼠中记忆和效应CD4(上图)或CD8(下图)T细胞的增加。(C，D)接受了抗PD-1加抗CTLA-4 mAb组合处理的小鼠中CD4(C)和CD8(D)T细胞表型的汇总数据，如所示。显示的数据是具有未处理(左)、中央记忆(中)和效应(右)记忆表型的细胞的百分比。显示的数据是从每组涉及7-11只雌性小鼠和2-6只雄性小鼠的四个实验汇总的。使用的统计检验：A，单向方差分析与Bonferroni多重比较检验；C和D，单向方差分析与Bonferroni多重比较检验。
图30.伊匹单抗增加了经伊匹单抗处理的小鼠的脾中Treg的频率。在第10、13、16和19天，以100μg/小鼠/注射的剂量分别用对照小鼠IgG Fc、抗PD-1或抗CTLA-4 mAb伊匹单抗或L3D10与抗PD-1组合处理C57BL/6Ctla4h/h小鼠。收集脾，并在出生后第42天通过流式细胞术评估脾CD4 T细胞中Foxp3+Treg的百分比。通过单向方差分析与Bonferroni多重比较检验分析统计显著性。
图31.与抗PD-1组合，伊匹单抗优先扩增自身反应性Teff。(A)育种方案图。分两步产生小鼠。如所示，第一步是两个近交系之间的异型杂交。第二步是F1的杂交，以获得设计基因型的小鼠(H-2d+Ctla4h/h或h/mMmtv8+9+)用于研究。(B)实验时间线的图。(C)代表性的FACS概况，其描绘了接受抗体处理的小鼠的门控CD4 T细胞中Vβ11、Vβ8和Foxp3标志物的分布。(D)在VSAg反应性(Vβ5+、11+或12+，上图)和非反应性(Vβ8+)CD4 T细胞中Treg/Teff的综合比率。(E)对胸腺细胞的影响的缺乏。与D中一样，只是分析CD3+CD4+CD8-胸腺细胞。显示的数据是平均值和S.D.，每组n＝6-7只小鼠。
图32.伊匹单抗结合人CTLA-4而非小鼠CTLA-4。显示的数据是使用Ctla4h/h(上)或Ctla4m/m(下)小鼠的脾细胞的门控CD3+CD4+细胞中CTLA-4的细胞内染色的点状图。生物素化的hIg和伊匹单抗用于细胞内染色。抗CD3(克隆145-2C11)、CD4(克隆RM4-5)、FoxP3(克隆FJK-16s)mAb和FoxP3染色缓冲液购自eBioscience。
图33.当与抗PD-1 mAb用于联合疗法中时，人源化L3D10克隆保持安全性概况。(A)比较人源化L3D10克隆HL12和HL32与伊匹单抗在围产期期间使用时的组合毒性。除了所用抗体的变化外，实验方案与图23A中所示相同。(B)当与抗PD-1抗体组合使用时，伊匹单抗而非人源化的L3D10克隆HL12和HL32诱导贫血。(C)用对照或给定的免疫治疗药物的组合处理小鼠后，内部器官和腺体的病理学评分。(D)综合病理评分。深灰色圆圈代表雄性小鼠的评分，而浅灰色评分代表所用的雌性小鼠。所有得分均双盲进行。数据是平均值±S.E.M.，每组n＝5-12只小鼠。从5个独立实验中收集样品，并进行双盲评分。使用的统计方法是：A，重复测量双向方差分析与Bonferroni的多重比较检验；B，非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)与Dunn的多重比较检验；C和D，单向方差分析与Bonferroni的多重比较检验。
图34.接受给定免疫治疗的人源化小鼠脾中CD4和CD8 T细胞活化的表型。如图23A中所示处理小鼠，只是使用人源化的L3D10克隆(HL12和HL32)。显示的数据是抗体处理开始后第32天的CD4(上图)和CD8(下图)脾T细胞的百分比和表型。从每组涉及5-11只小鼠(浅灰色：雌性；深灰色：雄性)的3个实验中汇总数据。通过单向方差分析与Bonferroni的多重比较检验和非参数单向方差分析(Kruskal-Wallis检验)与Dunn的多重比较检验分析统计显著性。
图35.比较HL12和HL32与伊匹单抗的免疫治疗作用。(A，B)在第7、10、13和16天用30μg(A)或10μg(B)的对照hIg、伊匹单抗、HL12或HL32i.p.处理携带MC38的Ctla4h/m小鼠(n＝5)。(C，D)在第7、10、13和16天用150μg(C)或100μg(D)的对照Ig、伊匹单抗、HL12或HL32i.p.处理携带CT26的Ctla4h/m小鼠(n＝6-10)。(E，F)用250μg对照Ig、伊匹单抗、HL12(E)或HL32(F)i.p.处理携带B16的Ctla4h/h小鼠(n＝5-6)。数据为平均值±S.E.M.并且通过重复测量双向方差分析与Bonferroni的多重比较检验分析数据。在所有背景下，与对照hIgG相比，HL12和HL32诱导统计显著的肿瘤排斥，HL12(A，P＝0.0023；B，P＝0.0105；C，P<0.0001；D，P＝0.0272；E，P<0.0001)；HL32(A，P＝0.004；B，P＝0.0059；C，P<0.0001；D，P＝0.0259；F，P＝0.1003)。除一种(C)背景外，伊匹单抗诱导的肿瘤排斥在所有背景下也是显著的(A，P＝0.0026；B，P＝0.0231；C，P＝0.2；D，P＝0.0003，E，P＝0.0145；F，P＝0.0234)。不同治疗性抗体之间的差异在统计上不显著。
图36.在C57BL/6.Ctla4h/m小鼠中揭示的irAE和CITE的不同遗传需求。(A-C)评估irAE。在围产期期间用对照人IgG(hIg)或抗PD-1+伊匹单抗处理给定基因型的雌性小鼠(n＝5)，并在6周龄时评估体重增加、炎症和红细胞贫血。(A)伊匹单抗+抗PD-1组合在Ctla4h/h而非Ctla4h/m小鼠中诱导生长迟缓。(B)除了唾液腺中的一些小鼠中的适度诱导外，伊匹单抗+抗PD-1在杂合小鼠中不诱导内部器官的炎症。(C)伊匹单抗+抗PD-1在杂合小鼠中不诱导红细胞贫血。(D)伊匹单抗诱导的有效肿瘤排斥。在第7、10、13和16天，荷瘤Ctla4h/h和Ctla4h/m小鼠接受对照hIg或伊匹单抗(100μg/注射×4)的处理。每3天测量肿瘤生长。数据为平均值±S.E.M.并且所有显示的数据均被重复2次。(E)伊匹单抗+抗PD-1在Ctla4h/m小鼠中未引起系统性T细胞活化。左侧显示描绘CD44和CD62L分布的代表性FACS概况，而右侧显示了汇总数据。A和D中的数据通过重复测量双向方差分析与Bonferroni的多重比较检验进行分析；而B、C和E中的数据则通过未配对的两尾学生t检验进行了分析。
图37.6-7周龄的幼龄成年和10日龄的荷瘤小鼠中的irAE和CITE。(A-C)用MC38肿瘤细胞接种携带MC38的幼龄雄性小鼠(7周龄)，并在肿瘤细胞攻击后第7、10、13和16天用对照hIgG、伊匹单抗、HL12或HL32(100μg/注射×4)对其进行处理。(A)随时间的肿瘤体积。(B)通过ELISA确定肿瘤攻击后第25天的血清TNNI3水平。(C)H&E染色显示心肌的玻璃样变和炎症。比例尺100μm。(D，E)用MC38肿瘤细胞接种携带MC38的幼龄雄性小鼠(6周龄)，并在肿瘤细胞攻击后第7、10、13和16天用对照hIgG、伊匹单抗或伊匹单抗+抗PD-1(100μg/注射×4)对其进行处理。(D)随时间的肿瘤体积。(E)通过ELISA确定肿瘤攻击后第25天的血清TNNI3水平。(F)用MC38肿瘤攻击10日龄的小鼠，并在14、17、20和23日龄开始免疫治疗，并呈现随时间的肿瘤大小。数据为平均值±S.E.M.并且通过重复测量双向方差分析与Bonferroni的多重比较检验进行分析。hIg对伊匹单抗或伊匹单抗+抗PD-1，P<0.0001；伊匹单抗对伊匹单抗+α-PD-1，ns。(G)联合疗法和单一疗法诱导多器官炎症。呈现了唾液腺和肺的代表性H&E切片。比例尺，100μm。B和E，数据为平均值±S.E.M.并分析了统计显著性。
图38A-F.未处理的T细胞的丢失和效应记忆T细胞的增加与多器官炎症相关。显示的数据是对图16、25、28、29和33中所呈现的数据的重新分析。未处理的T细胞：CD44LoCD62LHi；中央记忆T细胞：CD44HiCD62LHi；效应记忆T细胞：CD44HiCD62LLo。通过Pearson方法计算线性回归的相关系数和P值。
图39.伊匹单抗在荷瘤小鼠中引起中度的肾功能异常。在第7、10、13和16天，用100μg/注射/小鼠处理携带MC38的小鼠3或4次，在接种肿瘤后第18-25天收集血清。A.第18-20天，携带MC38的hCTLA4-KI小鼠血清中的肌酐和BUN水平(红色：雌性；蓝色：雄性)。B.在肿瘤接种后第25天，携带MC38的hCTLA4-KI小鼠(全部为雄性)的血清中肌酐和BUN的水平。使用肌酐(血清)比色测定试剂盒(Colorimetric Assay)或肌酐(CREA)试剂盒(RANDOX,Cat No,CR2336)测量肌酐水平。使用尿素氮直接试剂盒(Stanbio laboratory)测量血清BUN水平。通过学生t检验确定统计显著性。
图40.基于综合病理评分，人源化进一步改进了L3D10的安全性。深灰色点代表雄性小鼠的评分，浅灰色点代表所用的雌性小鼠。所有评分均双盲进行。数据是平均值±S.E.M.，且每组n＝9只小鼠。通过单向方差分析与Bonferroni多重比较检验确定统计显著性。
图41.负责irAE和CITE的不同机制。(A)irAE是由抑制自身反应性T细胞向自身反应性Treg的转化而引起的，其导致外周淋巴样器官中自身反应性T细胞的多克隆扩增。(B)肿瘤排斥是通过肿瘤微环境中FcR介导的Treg消耗而实现的，并且独立于外周淋巴样器官中的未处理的T细胞活化。irAE和CITE均不依赖于B7-CTLA-4相互作用的阻断。
图42.临床抗CTLA-4 mAb伊匹单抗诱导细胞表面CTLA-4下调。A-B，将用橙色荧光蛋白(OFP)加标签的人CTLA-4分子转染的293T细胞与对照IgG或伊匹单抗(IP)温育4小时。(A)通过流式细胞术检测OFP的荧光。B，在有或没有环己酰亚胺(CHX)存在的情况下，通过Western印迹分析A中CTLA-4的蛋白水平。C，通过用可商购的抗CTLA-4 mAb(BNI3)(其即使在存在饱和剂量的伊匹单抗的情况下，也具有与细胞表面CTLA-4的强力结合)染色来测试A中的细胞表面CTLA-4。D，分离A中的质膜蛋白，并通过Western印迹检测表面CTLA-4。E，用对照IgG或伊匹单抗(IP)处理表达人CTLA-4的CHO稳定细胞系4小时。通过Western印迹分析CTLA-4的蛋白质水平。F，通过流式细胞术测试E中的细胞表面CTLA-4。G，分离E中的质膜蛋白，并通过Western印迹检测表面CTLA-4。H，在C57BL/6Ctla-4h/h-KI小鼠中诱导MC38小鼠结肠癌模型。通过胶原酶消化分离肿瘤细胞，并在体外用对照IgG或伊匹单抗(IP)处理4小时。通过流式细胞术测试肿瘤浸润Treg的表面和细胞内CTLA-4。I，在肿瘤接种后第14天，用100μg的对照IgG或伊匹单抗(IP)i.p.处理携带MC38的Ctla4h/h小鼠16小时。通过流式细胞术测试肿瘤浸润Treg的表面和细胞内CTLA-4。C和H中的结果一式三份(平均值±SEM)。I中的数据是平均值±SEM(n＝8)。*p<0.05，**p<0.01。未配对的两尾学生t检验。
图43.伊匹单抗在免疫疗法相关不良反应(irAE)模型和活化的人Treg中诱导细胞表面CTLA-4下调。A，用抗PD-1(100ug)i.p.处理CTLA-4h/h-KI新生小鼠(n＝5)24小时或48小时。之后，进一步用100μg的对照IgG或伊匹单抗i.p.处理小鼠4小时。通过流式细胞术评估肺和脾Treg的表面和细胞内CTLA-4。B-C，通过抗CD3/抗CD28刺激将来自健康供体血液的人PBMC 2天，并用对照IgG或伊匹单抗(IP)处理4小时。通过流式细胞术测量CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD25+Foxp3-non-Treg的表面CTLA-4(B)。(C)中显示了对来自四个健康供体的CD4+CD25+Foxp3+Treg的分析。数据是平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，#p<0.001。未配对的两尾学生t检验。
图44.抗体诱导的表面CTLA-4的下调引起免疫疗法相关不良反应(irAE)。A，在10、13、16和19日龄以100μg/小鼠/注射的剂量分别用对照人IgG+抗PD-1、曲美木单抗(IgG1)+抗PD-1或HL12+抗PD-1处理C57BL/6Ctla4h/h新生小鼠。显示了不同处理的体重增加。曲美木单抗(IgG1)加抗PD1处理组的一只小鼠从分析中排除，因为在18日龄死亡并伴有严重发育迟缓。显示的数据是第一次注射后的％体重增加的平均值和SEM。B，在出生后第41天进行A中小鼠的血液的CBC分析。显示了血细胞比容(HCT)、总血红蛋白(Hb)和平均红细胞体积(MCV)的数据。C，在肿瘤接种后第7、10、13和16天用对照Ig(100μg)或曲美木单抗(IgG1)(1μg、30μg或100μg)i.p.处理携带MC38的Ctla4h/h小鼠(n＝5)。显示的肿瘤体积为第一次注射后的％体重增加的平均值和SEM。D，将用hCTLA-4转染的293T细胞与对照IgG、伊匹单抗、曲美木单抗(IgG1)、HL12或HL32温育4小时。通过Western印迹分析CTLA-4的蛋白质水平。E，用伊匹单抗、曲美木单抗(IgG1)、HL12或HL32在4/37℃下处理表达hCTLA-4的CHO稳定细胞系2小时。洗去未结合的抗体后，在4℃下通过抗hIgG(H+L)-alex488检测表面CTLA-4半小时，并通过流式细胞术进行分析。通过减去在4℃下的alex488荧光进行标准化后，显示的表面CTLA-4的荧光强度为一式三份(平均值+SEM)*P<0.05，未配对的双尾t检验。F，将用hCTLA-4转染的293T细胞与对照IgG伊匹单抗或HL12温育4小时。分离质膜蛋白，并通过Western印迹检测表面CTLA-4。G，用抗PD-1(100ug)i.p.处理Ctla-4h/h-KI新生小鼠(n＝6)。此后24小时，进一步用100μg的对照IgG、伊匹单抗或HL12 i.p.处理小鼠4小时。通过流式细胞术评估肺和脾Treg的表面和细胞内CTLA-4。由于HL12阻断BIN3与CTLA-4的结合，因此在将HL12组与对照组进行比较时，在通过BNI3克隆进行CTLA-4染色之前加入饱和剂量的HL12。H，通过用另一种商用抗CTLA-4 mAb(eBio20A)(其不阻断HL12与CTLA-4的结合)染色细胞来评估G中的HL12处理。I，通过抗CD3/抗CD28刺激来自健康供体血液的人PBMC达2天，并用对照IgG、伊匹单抗(IP)或HL12对其处理4小时。通过流式细胞术测量CD4+CD25+Foxp3+Treg的表面CTLA-4。抗CTLA-4 mAb(BNI3)用于比较对照组和伊匹单抗组，而抗CTLA-4 mAb(eBio20A)用于HL12组。G和H中的数据是平均值±SEM。I中的结果是一式三份(平均值±SEM)。*p<0.05，**p<0.01，#p<0.001。未配对的两尾学生t检验。
图45.抗CTLA-4 mAb通过溶酶体介导的降解调节表面CTLA-4。A，在4℃下用伊匹单抗-Alex488或HL12-Alex488标记表达hCTLA-4的CHO稳定细胞系上的表面CTLA-4，并将其转移至37℃ 30分钟。显示了抗体标记的表面CTLA-4的代表性共聚焦图像。B，用lyso-tracker染色A中的表面CTLA-4，并通过共聚焦图像显示表面CTLA-4和溶酶体之间的共定位(绿色：表面CTLA-4；粉红色：溶酶体；白色：合并)。C，代表性的共聚焦图像显示了B中伊匹单抗和HL12诱导的CTLA-4内化后细胞表面CTLA-4定位的时间跨度。D，在有或没有溶酶体抑制剂氯喹(CQ)预处理的情况下，将用hCTLA-4转染的293T细胞与对照IgG或伊匹单抗温育4小时。通过Western印迹分析CTLA-4的蛋白质水平。
图46.抗CTLA-4 mAb(其在内体-溶酶体运输期间保留了较高的结合亲和力)有助于表面CTLA-4的溶酶体降解。A，将His-hCTLA-4(0.5μg/ml)包被在ELISA板中，并在pH 4.0至7.0的不同pH范围的缓冲液中以10μg/ml添加不同的抗CTLA4-mAb。通过ELISA测量与CTLA-4结合的抗体。B.比较不同抗CTLA-4抗体在pH4.5、5.5和7.0的限制剂量。将His-hCTLA-4(0.5μg/ml)包被在ELISA板中，并测量不同剂量的抗CTLA4-mAb与CTLA-4的结合。注意，伊匹单抗和曲美木单抗在pH7.0和pH5.5下显示出基本相同的剂量响应。在pH5.5达到50％最大pH7.0结合所需的抗体量(IC50)与在pH7.0所需的抗体量基本相同。在pH4.5下的IC50提高约50-250％。相反，基于IC50的增加，当在pH5.5的结合与在pH7.0的结合相比，HL12和HL32表现出超过10倍的降低。再次基于IC50的增加，当将其在pH 4.5的结合与pH7.0比较时，观察到在pH 4.5的IC的降低大于100倍。C，包被His-hCTLA-4(0.5μg/ml)，并在pH 7.0下以10μg/ml添加不同的抗CTLA4-mAb。将额外的抗体洗掉后，检测到CTLA-4的结合，然后在较低pH的缓冲液(pH4.5、5.5和6)中温育2小时。A-C中的数据是在450nm处一式两份光密度的平均值。D，用抗CTLA-4 mAb于4℃标记表面CTLA-4达30分钟，然后将其转移至37℃达1小时。通过蛋白G珠捕获抗体结合的CTLA-4，并通过Western印迹进行了测试。E，在有或没有CQ(其中和内体-溶酶体的pH)的情况下预处理D中的表面CTLA-4达30分钟。通过蛋白G珠捕获抗体结合的CTLA-4，并通过Western印迹进行了测试。
图47.HL12触发的内化CTLA-4再循环回到细胞表面，并阻止了抗CTLA-4诱导的irAE。A，将用dsRed加标签的人Rab11转染的293T细胞与伊匹单抗Alex488或HL12-Alex488在4℃温育30分钟，并转移至37℃达1h。显示了表面CTLA-4和Rab11之间共定位的代表性共聚焦图像(绿色：表面CTLA-4；红色：Rab11；蓝色：核；黄色：CTLA-4和Rab11的合并)。B，将用hCTLA-4-GFP转染的293T细胞与对照IgG、伊匹单抗或HL12温育4小时。显示了表面CTLA-4的代表性共聚焦图像。C，描绘了负责抗体诱导的免疫疗法相关不良反应(irAE)的抗CTLA-4mAb的独特调节的模型。
图48.pH敏感的抗CTLA-4抗体在肿瘤微环境中诱导Treg方面更有效率。MC38荷瘤的Ctla4h/h小鼠在肿瘤接种后第14天接受了对照hIgG、伊匹单抗、HL32或HL12(100μg/小鼠)。通过抗体处理后16小时收获的肿瘤的单细胞悬液的流式细胞术测定肿瘤中CD4 T细胞中的Treg细胞百分比。请注意，两种pH敏感抗体HL12和HL32在抗体处理后24小时引起快速Treg消耗(P<0.0001)。相反，尽管伊匹单抗可以在重复给药后引起Treg消耗(图21)，但是在单次给药后24小时很大程度上无效。
图49.pH敏感的抗CTLA-4抗体在诱导大型建立肿瘤的排斥方面更有效率。在肿瘤接种后第17和20天MC38荷瘤的Ctla4h/h小鼠接受了对照hIgG、伊匹单抗、曲美木单抗(IgG1)(TremeIgG1)、HL32或HL12(30μg/小鼠)。使用卡尺测量肿瘤大小。
发明详述
1.定义
如本文所用，术语“抗体”是指拥有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”是指不同于抗体广泛共享的域(例如抗体Fc域)的免疫球蛋白域。可变区包含“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常在轻链可变域的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)处和在重链可变域中大约残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；参考文献44)，并且可以包含来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；参考文献45)。“框架区”或“FR”残基是除如本文所定义的高变区残基以外的那些可变域残基。本文公开的抗体可以是单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼化抗体、单链抗体、二硫化物连接的Fv(sdFv)、内抗体(intrabody)或抗独特型(抗-Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗-Id和抗-抗-Id抗体)。特别地，抗体可以是免疫球蛋白分子，例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY，或者是某个类别的抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2或某个亚类的抗体。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体中含有抗体的互补决定区(“CDR”)以及任选地包含抗体的“可变区”抗原识别位点的框架残基并且表现出免疫特异性结合抗原的能力的一个或多个部分。此类片段包括Fab’、F(ab’)2、Fv、单链(ScFv)及其突变体，天然存在的变体以及包含抗体“可变区”抗原识别位点和异源蛋白(例如，毒素、不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)的融合蛋白。如本文所用，术语“片段”是指包含至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的肽或多肽。
人的、嵌合的或人源化的抗体特别优选用于人体内使用，但是，鼠抗体或其他物种的抗体可有利地用于多种用途(例如，体外或原位检测测定法、短期体内使用等)。
“嵌合抗体”是抗体的不同部分源自不同免疫球蛋白分子的分子，例如具有源自非人抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。可以使用本领域已知的多种技术来产生包含来自非人类物种的一个或多个CDR和来自人类免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体，所述技术包括例如CDR-嫁接(EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)，饰面或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；46-48)和链改组(美国专利No.5,565,332)，它们全部的内容通过引用并入本文。
本发明特别涉及人源化抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含人框架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的人免疫球蛋白称为“接受体”。不需要存在恒定区，但是若存在的话，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选约95％相同或更多。因此，除可能地CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。人源化抗体是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，人源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体，因为例如嵌合抗体的整个可变区是非人的。根据“人源化”过程将供体抗体称为“人源化的”，因为预期所得的人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化抗体可以是人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中接受体的高变区残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰可以进一步改善抗体性能。人源化抗体可包含至少一个，且通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可任选地包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Fc)，其可以是与FcsRIIB多肽免疫特异性结合的人免疫球蛋白的部分，其已通过引入一种或多种氨基酸残基的取代、缺失或增加(即突变)而改变。
2.抗CTLA4抗体组合物
已经显示了针对人类CTLA-4蛋白的抗体伊匹单抗，作为唯一的免疫治疗剂或与另一种治疗剂如抗PD-1抗体组合增加癌症患者的存活。但是，CITE与明显的免疫相关重大不良反应(irAE)有关。迫切需要开发新的抗CTLA-4抗体，以获得更好的治疗效果或更少的自身免疫不良反应。发明人发现了抗CTLA-4抗体，令人惊讶地，该抗CTLA-4抗体可以在不具有明显的与免疫疗法有关的自身免疫不良反应的情况下用于诱导癌症排斥。
本文提供了抗体及其抗原结合片段，以及包含前述物质的组合物。该组合物可以是药物组合物。该抗体可以是抗CTLA-4抗体。该抗体可以是单克隆抗体、人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。抗体也可以是单特异性、双特异性、三特异性或多特异性的。抗体可以是可检测地标记的，并且可以包含缀合的毒素、药物、受体、酶或受体配体。
本文还提供了与CTLA-4，特别是人CTLA-4免疫特异性结合的抗体的抗原结合片段，所述CTLA-4可以以内源或转染浓度在活细胞表面上表达。抗原结合片段可以结合CTLA-4，并且活细胞可以是T细胞。
在具体的实施方案中，抗CTLA-4抗体可以有效地诱导Treg消耗和Fc受体依赖性肿瘤排斥。在一个优选的实施方案中，为了增加抗肿瘤活性，CTLA-4靶向剂将选择性地消耗肿瘤微环境中的Treg。在一个具体的实施方案中，抗CTLA-4单抗具有增加的Fc介导的Treg消耗活性。Treg消耗可通过Fc介导的效应器功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)发生。Fc介导的效应器功能可以通过本领域已知的任何方法引入或增强。在一个实例中，抗体为IgG1同种型，其与其他同种型相比具有增强的效应器功能。Fc介导的效应器功能可通过Fc域的氨基酸序列的突变进一步增强。例如，可以将三个突变(S298A、E333A和K334A)引入Fc域的CH区域中以增加ADCC活性。用于ADCC介导的活性的抗体通常需要某种修饰，以增强其ADCC活性。有许多技术可用于这点的技术，其通常涉及对抗体进行工程化改造，以使抗体Fc区中的寡糖不具有任何岩藻糖糖单元，从而改善与FcγIIIa受体的结合。当抗体被岩藻糖基化时，作用是增加抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。例如，Biowa的
Figure BDA0002696718270000301
技术使用FUT8基因敲除CHO细胞系来生产100％无岩藻糖基化抗体。FUT8是唯一编码a1,6-岩藻糖基转移酶的基因，该酶催化在复杂型寡糖的a1,6-连接中岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到GlcNAc。Probiogen已开发出CHO系，其经工程化改造以在MAb上产生较低水平的岩藻糖基化聚糖，尽管不是通过FUT敲除。Probiogen的系统引入了一种细菌酶，其将从头岩藻糖合成途径重定向到无法被细胞代谢的糖-核苷酸。作为一种替代方法，Seattle Genetics拥有专有的补料系统，该系统可在CHO(也许还有其他)细胞系中在单克隆抗体上产生较低水平的岩藻糖基化聚糖。Xencor开发了XmAb Fc域技术，其设计为改善免疫系统对肿瘤和其他病理细胞的清除。该Fc域具有两个氨基酸变化，导致大40倍的对FcγRIIIa的亲和力。它还增加对FcγRIIa的亲和力，具有募集其他效应细胞，如巨噬细胞的潜力，所述巨噬细胞通过吞噬和消化外来物质在免疫中发挥作用。
在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体可以不赋予完全CTLA-4占据(即，非阻断性或非完全阻断性)、系统性T细胞活化或自身反应性T细胞的优先扩增。
在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体在低pH下对CTLA-4具有弱的结合亲和力，并且在抗体诱导的内化期间将从CTLA-4解离，从而允许释放的CTLA-4再循环回到细胞表面并维持CTLA-4作为免疫应答的负调节剂的功能。与在pH7.0相比时，此类抗体在pH5.5下可以显示出>3倍的结合降低，这是基于在晚期内体pH5.5达到pH7.0下最大结合的50％所需的抗体剂量的增加。在溶酶体pH4.5下，此类降低达到10倍或更多。优选地，在pH5.5和pH4.5下的降低分别大于10倍和100倍。
在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体与sCTLA-4的结合亲和力降低，从而循环中的sCTLA-4可以维持其作为免疫应答的负调节剂的功能。
在一个优选的实施方案中，抗CTLA-4抗体具有这些特性中的两个或更多个。具体而言，抗CTLA-4抗体将在肿瘤微环境中选择性地消耗Treg，而不拮抗(即消耗或阻断)膜结合的或可溶性CTLA-4的功能，因此其可以维持免疫应答的负调节剂的功能。
3.设计和选择抗体的方法
本文进一步提供了新的抗CTLA-4抗体的设计和/或选择，以及通过整合本文所述抗体的功能特征或属性而对抗体进行工程化改造以增强现有抗CTLA-4抗体的抗肿瘤功效和/或毒性概况的方法。具体而言，提供了增加抗CTLA-4抗体的Treg消耗活性以增加CITE的方法，和减少内体运输和对抗体结合的CTLA-4的破坏的方法，以通过允许CTLA-4循环到细胞表面来改善毒性概况。在最优选的实施方案中，抗CTLA-4抗体经设计或工程化改造以改善Treg消耗活性和CTLA-4再循环活性。由于抗人CTLA-4抗体往往不与其他物种(如小鼠)的CTLA-4发生交叉反应，因此应理解，此类测试必须使用人CTLA4系统，如人细胞、用人CTLA-4转染的细胞或表达人CTLA-4的转基因动物模型(如本文所述的人CTLA-4敲入小鼠)。在一个实施方案中，抗体经设计以增强肿瘤环境内Treg的消耗。可以使用本文所述的体外或体内方法中的任何一种来测试或选择此类抗体。例如，向人CTLA-4敲入小鼠注射肿瘤细胞系以及抗CTLA-4抗体，并在稍后的时间点取出肿瘤浸润Treg并计数，并与阴性或阳性对照进行比较。
在另一个实施方案中，抗体经设计以降低其诱导毒性，特别是irAE的能力。最好使用表达人CTLA-4的动物模型在体内进行测试。在一个优选的实施方案中，将抗CTLA-4抗体单独或组合地在围产期或新生儿阶段施用于小鼠，以确定其诱导irAE的能力。毒性或irAE的读出包括体重增加、血液学(CBC)、组织病理学和生存率降低。
如本文所证明的，作为替代或其减少irAE的能力，可以测定抗CTLA-4抗体在内体(酸性)pH下释放CTLA-4的能力。在一个实施方案中，这可以通过测定在pH范围内结合CTLA-4分子的能力在体外确定。更具体地，可以以有限的剂量添加抗CTLA-4抗体，以确定在低pH下达到在pH 7.0下达到的最大结合的50％所需的量。在另一个实施方案中，这可以使用细胞在体外测定，从而追踪抗CTLA-4衔接后细胞表面CTLA-4的内化和细胞内定位和运输。在一个实施方案中，可以将CTLA-4蛋白的定位与内体标志物(例如LysoTracker)进行比较，其中与内体标志物的共定位指示内体降解和再循环的缺乏，其继而与诱导irAE的能力相关。在另一个实施方案中，可以使用荧光CTLA-4蛋白测定内化的CTLA-4再循环到细胞表面的能力，其中再循环回到细胞表面与减少irAE的能力相关。在另一个实施方案中，可以通过与用于再循环内体的标志物如Rab11共定位来测定内化的CTLA-4再循环到细胞表面并减少irAE的能力。
在另一个实施方案中，设计或选择抗体以减少与可溶性CTLA-4(sCTLA-4)的结合或阻断可溶性CTLA-4(sCTLA-4)。可以通过测试可溶性CTLA-4分子(如CTLA-4-Fc)结合其天然配体(B7-1或B7-2)或另一种在板或细胞表面上固定化的抗CTLA-4分子的能力在体外进行测试。在一个优选的实施方案中，对可溶性CTLA-4分子进行标记，从而可以检测其在结合后的存在。
4.治疗方法
本发明进一步涉及本文描述的抗体组合物用于上调免疫应答的用途。免疫系统的上调在癌症和慢性感染的治疗中是特别期望的，因此本发明在此类病症的治疗中具有效用。如本文所用，术语“癌症”是指由异常的不受控制的细胞生长引起的新生物或肿瘤。“癌症”明确包括白血病和淋巴瘤。术语“癌症”还指涉及具有转移到远端部位的潜力的细胞的疾病。
因此，本发明的方法和组合物还可用于治疗或预防多种癌症或其他异常增殖性疾病，所述癌症或其他异常增殖性疾病包括(但不限于)以下各项：癌，包括膀胱、乳房、结肠、肾、肝、肺、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺和皮肤癌；包括鳞状细胞癌；淋巴样谱系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Berketts lymphoma)；髓样谱系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、tetratocarcinoma、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和许旺细胞瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenoderma pegmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎瘤。还考虑到由凋亡异常引起的癌症也可以通过本发明的方法和组合物治疗。此类癌症可包括但不限于滤泡性淋巴瘤，具有p53突变的癌，乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌的激素依赖性肿瘤以及癌前病变，如家族性腺瘤性息肉病和骨髓增生异常综合症。在具体的实施方案中，通过本发明的方法和组合物在卵巢、膀胱、乳房、结肠、肺、皮肤、胰腺或子宫中治疗或预防恶性或异常增殖变化(例如化生和发育不良)或过度增殖性病症。在其他具体的实施方案中，通过本发明的方法和组合物治疗或预防肉瘤、黑素瘤或白血病。
在本发明的另一个实施方案中，抗体组合物及其抗原结合片段可以与另一种抗肿瘤疗法一起使用，该抗肿瘤疗法可以选自但不限于当前的标准和实验化学疗法、激素疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法或手术。在一些实施方案中，本发明的分子可以与治疗或预防有效量的一种或多种本领域技术人员已知用于治疗或预防癌症、自身免疫性疾病、传染病或中毒的试剂、治疗性抗体或其他试剂组合施用。此类试剂包括例如以上讨论的生物反应修饰剂、细胞毒素、抗代谢物、烷基化剂、抗生素、抗有丝分裂剂或免疫治疗剂中的任何一种。
在本发明的一个优选实施方案中，抗体组合物及其抗原结合片段可以与另一种抗肿瘤免疫疗法一起使用。在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段与破坏或增强替代的免疫调节途径的分子(诸如TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H1、PD-1、B7-H3、B7-H4、LIGHT、BTLA、ICOS、CD27或LAG3)或调节效应分子如细胞因子(诸如IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、GF-beta、IFNg、Flt3、BLys)和趋化因子(例如CCL21)的活性的分子组合施用以增强免疫调节作用。具体实施方案包括双特异性抗体，其包含本文所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，与抗PD-1(派姆单抗(Keytruda)或纳武单抗(Opdivo))，抗B7-H1(阿特珠单抗(atezolizumab)(Tecentriq)或度伐鲁单抗(Imfinzi))、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4、抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB组合。在又一个实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与激活免疫应答的不同阶段或方面以便实现更广泛的免疫应答的分子(例如IDO抑制剂)组合施用。在更优选的实施方案中，抗体组合物及其抗原结合片段与抗PD-1或抗4-1BB抗体组合，而不加剧自身免疫的副作用。
本发明的另一个实施方案包括双特异性抗体，该双特异性抗体包含桥接到结合另一种免疫刺激分子的抗体的与CTLA4结合的抗体。具体实施方案包括双特异性抗体，其包含本文所述的抗CTLA4抗体组合物和抗PD-1、抗B7-H1、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。本发明进一步涉及此类抗体用于治疗癌症的用途。
5.生产
本文所述的抗CTLA4抗体及其抗原结合片段可以使用真核表达系统制备。表达系统可需要在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中从载体表达。系统也可以是病毒载体，如可以用于感染真核细胞的复制缺陷型逆转录病毒载体。抗体也可以由稳定的细胞系产生，所述稳定的细胞系从已经整合到细胞基因组中的载体或载体的一部分表达抗体。稳定的细胞系可以从整合的复制缺陷型逆转录病毒载体表达抗体。表达系统可以是GPExTM。
本文所述的抗CTLA4抗体及其抗原结合片段可以使用例如层析法，诸如亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析来纯化。在一些实施方案中，抗体可以被工程化改造为包含含有氨基酸序列的额外域，该氨基酸序列允许多肽被捕获到亲和基质上。例如，可以使用蛋白A或蛋白G柱从细胞培养上清液或细胞质提取物中分离出包含免疫球蛋白域的Fc区的本文所述的抗体。另外，标签诸如c-myc、血凝素、聚组氨酸或Flag TM(Kodak)可用于辅助抗体纯化。此类标签可以插入多肽序列内的任何地方，包括在羧基或氨基末端。可以有用的其他融合物包括有助于检测多肽的酶，例如碱性磷酸酶。免疫亲和层析也可以用于纯化多肽。
6.药物组合物
本发明进一步涉及药物组合物，其包含治疗有效量的任何上述抗CTLA4抗体组合物或其抗原结合片段，以及生理上可接受的载体或赋形剂。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于动物尤其是人类的。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等的那些。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。也可以使用盐水溶液、水性右旋糖和甘油溶液作为液体载体，特别是用于注射液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望的话，该组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，例如Poloxamer或Polysorbate，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释制剂等形式。
通常，本发明的组合物的成分可以在密闭容器中，例如指示活性剂量的安瓿或小药囊(sachette)中在单位剂型中单独提供或混合在一起提供，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物。当组合物要通过输注施用时，它可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶分配。当通过注射施用组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿瓶以便可以在施用之前将成分混合。
本发明的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于与阴离子形成的盐，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与阳离子形成的盐，例如源自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
本文所述的抗CTLA-4抗体组合物或其抗原结合片段也可以被配制用于冻干以允许长期保存，特别是在室温。冻干制剂对于皮下施用特别有用。
7.施用方法
施用本文所述的组合物的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在一个具体的实施方案中，肌内、静脉内或皮下施用本发明的抗体。组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是系统的或局部的。
实施例
实施例1
抗CTLA-4 mAb通过独立于检查点阻断但依赖于宿主Fc受体的机制引起肿瘤排斥。
材料和方法
动物
已经描述了在内源小鼠Ctla4基因座的控制下表达与人CTLA-4蛋白具有100％同一性的CTLA-4蛋白的CTLA4人源化小鼠[38]。将纯合的敲入小鼠(Ctla4h/h)回交至C57BL/6背景达至少10代。通过将Ctla4h/h小鼠与野生型(WT)BALB/c或C57BL/6小鼠杂交，产生杂合小鼠(Ctla4h/m)。WT C57BL/6小鼠购自Charles River Laboratories。从JacksonLaboratories(Bar Harbor,Maine)获得人脐带血CD34+干细胞重构的NSGTM小鼠。所有动物(雌性和雄性，每个实验中为6-16周龄，年龄匹配)均包括在分析中，并且未使用盲法或随机化，只是将小鼠随机分配到各组中。所有小鼠均养在儿童国家医学中心(Children’sNational Medical Center)儿童研究所的研究动物设施(Research Animal Facility ofChildren’s Research Institute)中。所有涉及小鼠的研究均得到机构动物护理和使用委员会的批准。
细胞培养
国际细胞系认证委员会(International Cell Line AuthenticationCommittee，ICLAC)提出的交叉污染或错误识别的细胞系的数据库中未列出该研究中使用的细胞系。先前已经描述了用小鼠或人B7-1或B7-2转染的CHO细胞和L929细胞[20，29]。先前已描述了B7-1转染的J558细胞[22]用B7-H2-GFP转染的P815细胞[50]。先前已经描述了鼠结肠肿瘤细胞系MC38[5]。黑素瘤细胞系B16-F10(
Figure BDA0002696718270000371
CRL-6475TM)和HEK 293T细胞(
Figure BDA0002696718270000372
CRL-11268TM)最初是购自ATCC(Manassas,VA,USA)。从供应商处收到后，在体内测试之前，将细胞传代次数保持在最低限度。所有细胞系均在37℃下温育，并保持在含5％CO2的气氛中。细胞在补充有10％FBS(Hyclone)，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，Gibco)中生长。
抗体
已经描述了小鼠抗人CTLA-4 mAb L3D10[15]。研究中使用的抗CTLA-4 mAb L3D10是由人IgG1 Fc和L3D10的可变区组成的嵌合抗体。重组的WT(M1)和突变的(M17，M17-4)hCTLA-4蛋白以及包括亲本和完全人源化的L3D10(克隆HL12和HL32)的重组抗体由Lakepharma,Inc(Belmont,CA,USA)生产。具有WC500109302和http://www.drugbank.ca/drugs/DB06186中公开的氨基酸序列的重组伊匹单抗由Alphamab Inc.(中国，江苏，苏州)或Lakepharma Inc(San Francisco,CA,USA)利用剩余临床样品提供。人IgG-Fc(无叠氮化物)是从Athens Research and Technology(Athens,GA,USA)批量订购的。抗小鼠CD16/32mAb 2.4G2、抗小鼠B7-1mAb 1G10、抗小鼠B7-2 mAb GL1、抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9及9H10、对照仓鼠IgG、对照小鼠IgG2b MPC-11及人CTLA-4-Fc购自Bio-X-Cell Inc.(West Lebanon,NH USA)。纯化的仓鼠抗小鼠Ctla-4 mAb 4F10购自BD Biosciences(San Jose,CA,USA)。体外阻断测定法中使用的经纯化且生物素化的仓鼠IgG同种型对照抗体购自eBioscience(San Diego,CA,USA)。用于人B7-1-Fc、B7-2-Fc及聚组氨酸标记的人CTLA-4的融合蛋白购自Sino Biological Inc.(Beijing,China)。重组小鼠Ctla-4Fc蛋白购自BioLegend(SanDiego,CA,USA)。根据制造商的说明，通过将EZ-连接Sulfo-NHS-LC-生物素(ThermoScientific)与所期望的蛋白质缀合，可以完成生物素化。缀合有Alexa Fluor 488的山羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗购自ThermoFisher Scientific,USA。遵循制造商的规程，通过细胞计数珠阵列(BD Biosciences,目录号560485)评估细胞因子IL-4、IL-6和IL-10的水平。SIY肽购自MBL International Corporation(Woburn,MA,USA)，并且通过H-2Kb四聚体SIYRYYGL-PE(MBL Code#TS-M008-1)检测SIY特异性CD8 T细胞。NIH(#31074)提供的H-2Kb四聚体OVA(SIINFEKL)-PE用作流式染色的阴性对照。
B7-CTLA-4相互作用的体外和体内阻断的测定法
采用三种测定法评估抗CTLA-4 mAb的阻断活性。首先，将板用CTLA-4-Fc或其配体B7-1包被。在结合测定法中将生物素化的融合蛋白用于可溶相中，其中结合蛋白的量通过辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗生物素蛋白(Pierce High Sensitivity NeutrAvidin-HRP,Thermo Scientific Inc.)进行测量。将蛋白质在碳酸氢盐缓冲液(0.1M)中于4℃进行包被，并在室温下进行结合测定法。
第二，使用流式细胞术检测生物素化的融合蛋白与转染以在细胞表面上表达小鼠或人B7-1和B7-2的CHO细胞的结合。在由105μl PBS溶液组成的各测定法中，将1.2X105个CHO细胞与200ng生物素化的人或小鼠CTLA-4蛋白以及不同剂量的抗人或小鼠CTLA-4 mAb或对照IgG在室温下温育30分钟。使用购自BioLegend(San Diego,CA,USA)的藻红蛋白(PE)缀合的链霉抗生物素蛋白来测量结合受体的量。使用FACS CantoII(BD Biosciences)进行流式细胞术，并通过FlowJo(Tree Star Inc.)分析数据。
第三，将抗CTLA-4 mAb对B7-1和B7-2的上调用作阻断B7-1-CTLA-4和B7-2-CTLA-4相互作用的读出。简而言之，年龄和性别匹配的小鼠腹膜内接受500μg的抗体或其对照。注射后24小时，处死小鼠，并用针对CD11c(克隆N418)、CD11b(克隆M1/70)、B7-1(克隆16-10-A1)和B7-2(克隆PO3)的抗体和购自eBioscience Inc(San Jose,CA,USA)的同种型对照Ab对其脾细胞进行染色。用人CD34+脐带血细胞重构的NSGTM小鼠接受相同剂量的抗体。将脾在两个磨砂的显微镜载玻片之间啮合，然后在37℃下于5ml含有100μg/ml IV型胶原酶和5U/ml DNase I的缓冲液中温育20分钟。通过将消化后的结节轻轻推过细胞过滤器来制备细胞悬液，并用对下列标志物特异的抗体染色：hB7-1，克隆2D10(Biolegend Cat.No 305208)；hB7-2:克隆IT2.2(BioLegend，Cat No.305438)；hCD11c，克隆3.9；BioLegend CatNo.301614)；HLA-DR，克隆L243(BioLegend Cat.No.307616)；hCD45，克隆HI30(BioLegend，Cat.No.304029)。
跨胞吞测定法和细胞间相互作用测定法
具有加GFP(C-GFPSpark标签)标签的人B7-2/B7-1和加OFP(C-OFPSpark标签)标签的人CTLA-4cDNA的质粒购自Sino Biological Inc.(中国，北京)，并且用于建立表达任一种分子的稳定CHO细胞系。为了测量抗CTLA-4 mAb对跨胞吞的抑制作用，按照制造商的说明用PierceTMFab制备试剂盒(Thermo Scientific,USA)制备Fab片段。将给定剂量的Fab或对照hIgG-Fc蛋白加入表达加GFP标签的B7-2的CHO细胞中，然后立即将其与表达加OFP标签的CTLA-4的CHO细胞在37℃共培养4小时。
使用编码加OFP标签的人CTLA-4或人CTLA4Y201VcDNA的质粒来建立稳定的HEK293T细胞系。在15mL离心管中过夜悬浮培养后，将加B7-GFP标签的CHO细胞和CTLA4Y201V–加OFP标签的HEK293T细胞在4℃下以大约2:1的比率共同温育2小时。将给定剂量的Fab或对照hIgG-Fc蛋白添加到混合的细胞中，然后立即对其进行共培养。对于跨胞吞和细胞间相互作用测定法两者，在每个单独的测试中均使用1X105个加B7-GFP标签的CHO细胞。基于CTLA-4-OFP转染的CHO细胞或CTLA4Y201V-OFP转染的HEK293T细胞从B7-GFP转染的CHO细胞中获取GFP信号，通过流式细胞术确定跨胞吞和细胞间相互作用的量。
以下公式用于两种测定法的计算：
％跨胞吞或细胞间相互作用
＝(GFP+OFP+％)/(GFP+OFP+％+GFP-OFP+％)
B7-CTLA-4相互作用的动力学
结合实验由Lakepharma Inc.在25℃的Octet Red96上进行。生物素化的B7-1-Fc或CTLA-4-Fc被链霉抗生物素蛋白(SA)生物传感器捕获。然后将加载的生物传感器浸入处于可变浓度的B7-1-Fc或CTLA-4-Fc稀释液中(300nM起始，1:3下降，7个点)。缔合速率常数ka描述了每秒在1M的CTLA-4-Fc或B7-1-Fc溶液中形成的B7-1-CTLA-4复合物的数目。
抗CTLA-4 mAb对预形成的B7-CTLA-4复合物的影响
对于ELISA实验，将hB7-1-Fc或hB7-2-Fc在包被缓冲液中以给定浓度在96孔高结合聚苯乙烯板上预包被过夜。洗去未结合的蛋白质后，将板用PBST中的1％BSA封闭，然后与0.25μg/ml生物素化的CTLA-4-Fc蛋白温育2小时。洗去未结合的蛋白质后，加入给定剂量的hIgG-Fc/伊匹单抗/L3D10，并温育2小时。用缀合有HRP的链霉抗生物素蛋白检测板结合的生物素化的CTLA-4-Fc。对于流式细胞术测定法，将表达表面hB7-1或mB7-2的CHO细胞(1X105个/测试)与可溶性生物素化CTLA-4-Fc(200ng/测试)在室温下温育30分钟。洗涤后，将细胞在100μl DPBS缓冲液中温育指定的分钟，并提供给定剂量的对照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb。通过流式细胞术用PE-链霉抗生物素蛋白检测结合B7的CTLA-4-Fc的量，并从一式三份样品计算PE的平均荧光强度(MFI)。
肿瘤生长和消退测定法
用给定数目的结直肠癌细胞MC38或黑素瘤细胞系B16-F10攻击具有人CTLA4基因的杂合或纯合敲入的小鼠。注射指定剂量的肿瘤细胞后第2、7或11天开始进行免疫疗法。通过肿瘤体积作为读出确定肿瘤生长和消退。使用以下公式计算体积(V)。
V＝ab2/2，其中a是长直径，而b是短直径。
生物统计学
在图例中指出了用于分析每组实验的具体检验。对于每个统计分析，基于数据是否使用Shapiro-Wilk检验正态分布来选择适当的检验。使用未配对的两尾学生t检验或Mann-Whitney检验以在两组之间进行比较，单向或双向方差分析(ANOVA，方差分析)与Sidak校正以进行多重比较，双向重复测量方差分析以进行行为测试，来对数据进行分析。基于文献和过去的经验选择具有足够统计能力的样本量。没有样品被排除在分析之外，实验没有随机化，除非有特别说明。在动物组分配期间没有进行盲化，但在研究中进行的一些测量(即，肿瘤大小测量，B7表达的流式细胞术测定法)中进行了盲化。在图中，如所示，y轴误差条代表S.E.M.或S.D.。使用Excel(Microsoft)、GraphPad Prism软件(GraphPadSoftware，San Diego,California)或R软件(https://www.r-project.org/)进行统计计算。
结果
如果B7在质膜上呈现，则伊匹单抗不阻断B7-CTLA-4相互作用
为了更好地比较，使用小鼠抗人CTLA-4 mAb(L3D10)的可变区[15]产生了与伊匹单抗(人IgG1)具有相同同种型的嵌合抗人CTLA-4 mAb[14]。嵌合抗体具有2.3nM的表观亲和力，与伊匹单抗(1.8-4nM)相似[14，16]。两种抗体基于其与突变体CTLA-4分子的结合，以独特的方式与人CTLA-4上的重叠表位结合(图1)。与先前的报道一致[14]，当使用固定化的CTLA-4与可溶性B7-1相互作用时，伊匹单抗有效力地抑制B7-1-CTLA-4相互作用，所述可溶性B7-1与L3D10相当(图2A)。由于B7-1和B7-2发挥细胞表面共刺激分子的功能，因此使用固定化的人B7-1和B7-2评估了抗CTLA-4抗体的阻断。如图3A中所示，即使以极高的浓度(800μg/ml)使用时，伊匹单抗也不阻断CTLA-4-Fc与板固定化的hB7-1的结合。阻断的缺乏不是由于重组伊匹单抗的批次变化，因为使用来自三个独立来源(包括临床使用的药物)的商业伊匹单抗获得了相同的结果。相反，在低至0.2μg/ml的浓度下，L3D10表现出对板固定化的hB7-1结合的显著阻断，在3μg/ml左右达到了50％抑制(IC50)。因此，当将B7-1固定化在板上时，在阻断B7-1-CTLA-4相互作用方面，L3D10比伊匹单抗更有效至少1000倍。在宽的配体和受体浓度范围内，伊匹单抗的阻断活性缺乏是明显的(图3B和3C)。尽管在约200μg/ml的高IC50下，板固定化的B7-2对CTLA-4-Fc的结合略易于被伊匹单抗阻断(图3D)。由于IC50比有效剂量3mg/kg达到的稳定血浆水平[7](19.4μg/ml，基于公司产品插页而定)高10倍，因此临床剂量不太可能实现B7-2-CTLA-4相互作用的显著阻断。在宽的B7-2和CTLA-4蛋白浓度范围内观察到了伊匹单抗的阻断活性差(图3E和3F)。同样，在IC50为0.1μg/ml的情况下，L3D10在阻断B7-2-CTLA-4相互作用上比伊匹单抗有效约2,000倍。B7-1和B7-2之间的细微差别也许可以通过以下事实来解释：B7-2-CTLA-4相互作用具有较高的解离速率[17]，而不是独特的结合位点结构，因为B7-1-CTLA-4和B7-2-CTLA-4复合物的结构分析展示极其相似的相互作用[18-19]。
为了证实这一令人惊讶的发现，使用了表达B7及FcR的中国卵巢细胞(CHO)[20]。使用生物素化的CTLA-4-Fc评估两种抗人CTLA-4 mAb的阻断活性。同样，尽管L3D10有效地阻断了CTLA-4-Fc与B7-1转染的CHO细胞的结合，但伊匹单抗即使在以512μg/ml使用的情况下也未能阻断(图3G)。虽然远不如L3D10有效力，但高剂量的伊匹单抗实现约25％的人CTLA-4与小鼠B7-1(mB7-1)之间的相互作用的阻断(图2C)。尽管伊匹单抗实现了CTLA-4-Fc与B7-2和FcR转染的CHO细胞的结合的一些阻断，但即使当伊匹单抗以512μg/ml使用时，也观察到小于50％的抑制(图3H)。一个潜在的告诫(caveat)在于生物素化可能影响伊匹单抗与CTLA-4-Fc的结合。为了解决这个问题，比较了L3D10和伊匹单抗与在阻断研究中使用的生物素化CTLA-4-Fc的结合。如图2B中所示，伊匹单抗在结合生物素化的CTLA-4-Fc上比L3D10更有效。因此，伊匹单抗的阻断失败不是由于与生物素化的CTLA-4-Fc的结合不足。当使用加聚组氨酸标签的CTLA-4与B7-1转染的CHO细胞相互作用时，观察到类似的模式(图2D)。为了排除在细胞表面上FcR的可能作用，使用了表达hB7-1和FcR阴性的L929细胞。如图2E中所示，L3D10而非伊匹单抗阻断了CTLA-4与细胞表面B7-1的结合。此外，当使用LPS成熟的脾树突状细胞作为B7的来源时，也观察到了伊匹单抗阻断的缺乏(图3I)。综上所述，数据表明，伊匹单抗阻断B7-CTLA-4相互作用的能力高度依赖于所采用的测定形式，其中如果B7-1和B7-2经固定化，则阻断活性极小甚至检测不到，而L3D10是稳健的B7-CTLA-4相互作用的阻断剂，无论是否B7蛋白是否固定化。
由于CTLA-4和B7在体内共存并以动态方式相互作用，所以有效的阻断将需要破坏预先存在的B7-CTLA-4复合物。为了解决这个问题，首先允许B7与生物素化的CTLA-4-Fc形成复合物。洗去未结合的CTLA-4后，添加分级剂量的伊匹单抗或L3D10。再温育两个小时后，将抗体和未结合的蛋白质洗掉，并通过缀合有HRP的链霉抗生物素蛋白检测剩余的结合的CTLA-4分子。如图4A中所示，尽管L3D10有效力地破坏了预先存在的B7-1-CTLA-4复合物，但伊匹单抗无法做到这样。同样，尽管高剂量的伊匹单抗部分破坏了B7-2-CTLA-4复合物，但其效力比L3D10低250倍(图4B)。
作为评估抗CTLA-4抗体对细胞表面上预形成的B7-CTLA-4复合物的影响的第一步，通过将表达B7的CHO细胞与生物素化的CTLA-4-Fc蛋白在4℃下温育0-120分钟经由流式细胞术评估复合物的稳定性。洗去解离的CTLA-4-Fc后，使用缀合有PE的链霉抗生物素蛋白来测量细胞结合的CTLA-4-Fc。如图4C中所示，在整个研究过程的120分钟内，表达B7-1的CHO细胞上CTLA-4-Fc的量保持不变，从而允许我们测试抗CTLA-4抗体对破坏预形成的B7-1-CTLA-4复合物的影响。相反，B7-2-CTLA-4-Fc复合物在15分钟内迅速解离，大多数复合物在30分钟内坍塌(图4C)。快速解离使得无法在这些测定法中评估抗CTLA-4 mAb对预形成的B7-2-CTLA-4复合物的影响。如图4D中所示，伊匹单抗对破坏细胞表面上预形成的B7-1-CTLA-4复合物的影响最小。
因为CTLA-4对B7的亲和力高于CD28-Fc[17，21]，所以阻断CTLA-4可以减轻其对CD28-B7相互作用的抑制。为了测试L3D10和伊匹单抗是否可以逆转这种抑制作用，添加分级量的每种抗体或对照IgG-Fc，以及生物素化的CD28-Fc和未标记的CTLA-4-Fc，并且测量了CD28-Fc与B7-1转染的J558细胞的结合[22]。如图4E中所示，L3D10而非伊匹单抗显著拯救了B7-CD28相互作用。伊匹单抗不能破坏预形成的复合物，这表明B7-CTLA-4相互作用的动力学将是伊匹单抗阻断活性的关键决定因素。因此，通过使用固定化的B7-1或CTLA-4评估了B7-CTLA-4相互作用的动力学。如图4F中所示，当B7-1经固定化时，二价B7-1-Fc和CTLA-4-Fc的表观亲和力为9.9x10-10 M，这比CTLA-4-Fc经固定化时的亲和力(1.5x10-9 M)略高(图4G)。值得注意的是，CTLA-4与固定化的B7-1的缔合速率(Kon＝5.9x106(1/Ms))(图4F)比B7-1与固定化的CTLA-4的缔合速率(其是1.4x106(1/Ms))(图4G)高4倍(P＝0.0015)。当溶液中存在B7时，B7-CTLA-4复合物的较慢形成可以允许伊匹单抗在对伊匹单抗的分裂具抗性的B7-CTLA-4复合物形成之前占据CTLA-4，从而提供调和伊匹单抗的测定法依赖性阻断活性的机制。另一方面，L3D10可以破坏预形成的复合物，并且因此可以阻断CTLA-4-B7的相互作用，不管在此采用的条件如何。
伊匹单抗未有效阻断B7-CTLA-4介导的细胞间相互作用及CTLA-4对B7-1及B7-2的跨胞吞
大多数CTLA-4分子通过AP-2介导的机制驻留在细胞内部[23-24]。为了测量抗CTLA-4 mAb是否可以阻断B7-CTLA-4相互作用(当它们均在细胞表面上稳定表达时)，将Y201V突变引入CTLA-4中以消除其自发内吞作用，从而允许稳定的细胞表面表达[25](图5A)。如图6A中所示，表达B7-1-GFP或B7-2-GFP的CHO细胞和表达CTLA-4Y201V-OFP的HEK293T细胞可通过流式细胞术清楚地区分。当将它们在FACS分析之前即刻混合时，几乎没有观察到任何GFP+OFP+细胞。为了比较伊匹单抗和L3D10阻断细胞间相互作用的能力，从两种抗体制备了Fab片段(图6B)，以避免由CTLA-4分子交联引起的间接作用。抗体Fab显示出与用加OFP标签的CTLA-4稳定转染的细胞的相当的结合(图6C和3D)。在没有阻断抗体的情况下在4℃下共温育2小时后，大多数OFP+细胞以B7-GFP表达细胞相同的强度获得GFP(图6E和3G)。值得注意的是，GFP+OFP+细胞具有与细胞簇一致的前向和侧向散射(图5B)。如图6E和6F中所示，通过L3D10而非伊匹单抗Fab实现了对B7-1-GFP-CTLA-4Y201V相互作用的有效阻断。同样，尽管通过10μg/ml的伊匹单抗Fab对细胞B7-2和CTLA-4相互作用仅实现15％抑制，但相同剂量的L3D10 Fab却引起80％的抑制(图6G和6H)。
已经证明CTLA-4介导细胞表面B7-2的跨胞吞作用[12]。这些发现为我们提供了另一种测定法，以在更生理相关的条件下测量抗CTLA-4 mAb的阻断活性。使用以加GFP标签的B7或加OFP标签的CTLA-4转染的CHO细胞(图7A)。使用加荧光蛋白标签的受体和配体允许我们定量它们在活细胞中的相互作用。为了确保CTLA-4-OFP+细胞被B7-2-GFP+细胞包围，添加了过量的B7-2-GFP+细胞。如图7B中所示，在37℃下共温育导致表达CTLA-4和B7-2两者的新细胞群的时间依赖性积累。共温育后4小时，该积累达到峰值。由于基本上所有的OFP+细胞都随着时间变成了OFP+GFP+，而GFP+OFP-细胞的百分比在整个共温育过程中保持不变，因此双阳性细胞的出现是由于CTLA-4-OFP转染的CHO细胞摄取了B7-2-GFP，如预期。与该解释一致，OFP+GFP+的散射是单个细胞的散射(图10C)。作为对照，将CTLA-4-OFP转染子与B7-H2-GFP转染子共培养。如图7C中所示，在4小时的时段内未观察到GFP信号向CTLA-4-OFP转染子的可检测的转移，从而证实了测定法的特异性。建立模型后，比较了L3D10和伊匹单抗Fab对跨胞吞作用的影响。如图7D和4E中所示，在阻断B7-1的跨胞吞作用中，L3D10 Fab比伊匹单抗Fab有效约10倍。类似地，L3D10 Fab在阻断B7-2跨胞吞作用方面有效约高30倍(图7F和7G)。应当注意的是，尽管L3D10 Fab有效地阻止了B7-2的跨胞吞作用(IC50＝1μg/ml)，但当以10μg/ml使用时，伊匹单抗Fab实现对B7-1跨胞吞作用的小于20％抑制(图7E)，而对B7-2跨胞吞作用仅为30％抑制(图7G)。以摩尔比计，该剂量等于30μg/ml的完整的伊匹单抗，其比临床上使用有效剂量的伊匹单抗(3mg/kg)时的稳态血浆药物浓度高约50％[7]。
伊匹单抗不在体内阻断CTLA-4对B7-1/B7-2的下调
在其他潜在机制中，CTLA-4主要在Treg中表达，在Treg中其通过下调树突状细胞(DC)上的B7-1和B7-2表达来抑制自身免疫疾病[26]。由于Ctla4的靶向突变[26]和阻断抗CTLA-4 mAb的处理[12]均增加了DC上B7-1和B7-2的表达，因此提示CTLA-4在Treg上的生理功能是通过跨胞吞作用下调DC上的B7[12，27]。因此，阻断B7-CTLA-4相互作用的直接后果是DC上B7的上调。为了在体内评估抗CTLA-4 mAb的阻断活性，将非常高剂量的抗CTLA-4mAb(500μg/小鼠，其大约为25mg/kg或是临床使用的最高伊匹单抗剂量(3mg/kg)的>8倍)注射到Ctla4h/h或Ctla4h/m小鼠中，并收集脾细胞以在注射后24小时测量CD11c高DC上的B7-1和B7-2水平(图8A和5B)。如图8C、8D和8E中所示，与接受人IgG1-Fc的Ctla4h/h小鼠相比，经L3D10处理的小鼠的DC表现出适度但统计学上显著的B7-1升高和B7-2的强烈上调。B7-2中的上调幅度与在人Treg-DC共培养物中使用阻断性抗CTLA-4 mAb达到的幅度相当[12，27]。另一方面，伊匹单抗不能在体内上调B7-1和B7-2。为了排除污染性LPS的潜在影响，测量了抗体制剂中的内毒素水平，其显示内毒素水平在0.00025-0.0025ng/μg之间，并且比IgG Fc对照(其不在体内导致B7-1和B7-2上调)低2-10倍(图9)。
由于Ctla4h/m小鼠中至少50％的CTLA-4蛋白是小鼠来源的，并且不与抗人CTLA-4抗体结合(图10)，但在功能上与小鼠B7-1和B7-2交叉反应[28-30]，并且由于跨胞吞作用应仅需要Treg上一些未阻断的CTLA-4分子，因此即使在存在阻断抗人CTLA-4 mAb的情况下，未结合的CTLA-4也应下调DC上的B7。实际上，两种抗体均未引起Ctla4h/m小鼠DC上B7-1和B7-2的上调(图8C、8D和8F)。L3D10特异性地在Ctla4h/h小鼠中而不是在Ctla4h/m小鼠中对B7的上调进一步证实了B7上调取决于完全阻断B7-CTLA-4相互作用的观点，并排除L3D10使B7上调是由于污染性LPS的可能性。
为了确定是否可以在人T细胞和人树突细胞之间观察到在Ctla4h/h小鼠中观察到的伊匹单抗的阻断的缺乏，采用了人脐带血CD34+干细胞重构的NSGTM小鼠。如图11A和11B中所示，此处使用的小鼠的外周血由70-90％的人类白细胞组成，包括T和B淋巴细胞和DC。在脾中，观察到高频率的FOXP3+Treg和CD11c+HLA-DR+DC(图11C)。在DC上观察到hB7-2(图11E)，而非hB7-1(数据未显示)的显著表达。由于人CTLA-4在FOXP3+Treg中以高水平表达(图11D)，因此该模型用于研究体内环境中人DC与Treg之间的B7-2-CTLA-4-相互作用。如图11E和11F中所示，伊匹单抗未显著上调DC上的B7-2表达(P＝0.22)，而来自经L3D10处理的小鼠的DC则显示出近2.5倍更高水平的B7-2(P<0.001)，与人类CTLA4基因敲入小鼠数据一致。因此，在人源化小鼠的人类造血系统中，L3D10而非伊匹单抗阻断了hCTLA-4对B7-2的下调。
Treg消耗或肿瘤排斥都不需要阻断B7-CTLA-4相互作用
为了测试免疫治疗作用是否需要阻断B7-CTLA-4相互作用，首先比较了L3D10和伊匹单抗诱导肿瘤排斥的能力。用结肠癌细胞系MC38攻击Ctla4h/h小鼠。当肿瘤达到直径约5mm的大小时，用对照人IgG-Fc、L3D10或伊匹单抗以10、30和100μg/小鼠/注射的剂量处理小鼠四次，并观察肿瘤大小4-6周。如图12A中所示，尽管在对照IgG Fc处理的小鼠中肿瘤逐渐生长，但两种抗CTLA-4 mAb抗体均实现了完全排斥，即使使用低至10μg/小鼠。在多个实验中，两种抗体在引起肿瘤排斥方面是相当的。在另一种肿瘤模型B16黑素瘤中，两种抗体均诱导相似的肿瘤生长的延迟，无论在肿瘤建立之前或之后是否施用抗体(图12B)。但是，正如已发表的研究所期望的，通过抗体单一疗法无法实现完全排斥[10]。
最近的研究表明，抗小鼠Ctla-4 mAb的治疗功效受Fc亚类和宿主Fc受体的影响，其继而选择性地影响肿瘤微环境中Treg的抗体依赖性消耗[9-11]。然而，尚未测试此类消耗是否需要阻断B7-CTLA-4相互作用。这仍然是可能的，因为此类阻断可以上调B7(图8和11)，这可导致CD28的超刺激，从而潜在地导致T细胞凋亡[31-32]。为了解决这个问题，在完成排斥之前处死了荷瘤小鼠，并分析了接受对照Ig、伊匹单抗或L3D10的小鼠中Treg的频率。尽管两种抗CTLA-4抗体均未减少脾中的Treg(图12C)，但基于Treg的百分比(图12D，上图)和绝对数目(图12D，下图)，两者在肿瘤微环境中均减少了。有趣的是，尽管肿瘤浸润Foxp3-T细胞表达CTLA-4，尽管以较低的水平，但其并未被抗CTLA-4 mAb消耗(图13A)。肿瘤而非脾或淋巴结中Treg的有效消耗可以通过肿瘤浸润Treg上高得多的CTLA-4表达来解释(图13B和13C)，其也由先前的研究所报道[9-11]。由于Treg消耗，肿瘤中CD8T细胞与Treg的比率选择性增加(图12E)。而且，Treg的消耗与CD8和CD4T细胞的功能成熟有关，如肿瘤微环境内(图14A和14B)而非脾中(图14C-14F)产生干扰素γ(IFNγ)的细胞(图12F)以及产生肿瘤坏死因子α(TNFα)的T细胞增加所证明。
由于L3D10和伊匹单抗在肿瘤微环境中的Treg的消耗上是相当的，因此B7-CTLA-4相互作用的阻断不可能有助于Treg消耗。另外，由于伊匹单抗似乎未在体内阻断B7-CTLA-4相互作用，并且仍然在Ctla4h/h小鼠和黑素瘤患者中赋予治疗作用，因此其治疗作用不太可能需要阻断这种相互作用。此外，由于两种具有截然不同的阻断活性的mAb具有相当的治疗作用，并且在肿瘤微环境中选择性Treg消耗方面显示出相似的功效，因此阻断B7-CTLA-4相互作用不增强抗体的治疗作用。为了证实这一观察结果，在Ctla4h/m小鼠中测试了两种抗CTLA-4 mAb的治疗反应，其中抗人CTLA-4mAb可以结合最多50％的CTLA-4分子，且其中这两种抗体都不可以阻断B7-CTLA-4相互作用以实现树突状细胞上B7的上调(图8F)。再次，当使用高剂量(图12G)或低剂量(图12H)的抗体时，两种抗体均引起MC38肿瘤的快速排斥。相应地，两种抗体在肿瘤微环境中选择性消耗Treg(图12I)，但在脾中则不消耗Treg(图12J)。这些遗传数据进一步质疑了CTLA-4阻断在肿瘤排斥和局部Treg消耗两者中的相关性，并因此反驳了这样一个普遍的假设，即抗CTLA-4 mAb通过阻断B7-CTLA-4相互作用来诱导癌症免疫[4]。由于治疗性抗体对Treg消耗都是有效的，但它们阻断B7-CTLA-4相互作用的能力各不相同，因此假设这些抗体通过抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)诱导Treg消耗而引起肿瘤排斥。由于ADCC依赖于宿主效应细胞上的FcR，因此测试了抗FcR抗体是否可以消除肿瘤排斥。如图12K中所示，同时进行的抗FcR处理完全消除了伊匹单抗的肿瘤免疫治疗作用。
在L3D10 mAb的人源化期间，获得了两个称为HL12和HL32的克隆，其保留了与CTLA-4的有效力结合(图15A)，但是丧失了阻断CTLA-4与板结合的B7-1(图15B)和B7-2(图15C)结合的能力，可能是由于解离速率和相应的二价亲合力增加了约4倍(表1)。
在Octet Red96系统(ForteBio)上进行了多浓度动力学实验。将抗hIgG-Fc生物传感器(ForteBio,#18-5064)在样品稀释液(PBS中的0.1％BSA和0.02％Tween 20)中水合，并在pH 1.7甘氨酸中进行预调节(precondition)。使用7点、2倍连续稀释度，在600nM开始用样品稀释液稀释抗原。用样品稀释液将所有抗体稀释至10μg/ml，然后固定化到抗hIgG-Fc生物传感器上120秒钟。在样品稀释液中建立基线60秒后，将生物传感器移至含有一系列浓度抗原的孔中以测量缔合。对于样品稀释液中的每种感兴趣的蛋白质，观察缔合120秒并观察解离180秒。Kon，缔合速率；Kdis，解离速率；KD，平衡解离常数。
表1本研究中使用的人源化L3D10克隆的结合特征。
抗体 抗原 KD(M) K<sub>on</sub>(1/Ms) K<sub>dis</sub>(1/s)
HL12 CTLA4Fc 7.2E-09 2.3E+05 1.6E-03
HL32 CTLA4Fc 7.1E-09 2.7E+05 1.9E-03
L3D10 CTLA4Fc 2.3E-09 3.5E+05 8.0E-04
相应地，这些抗体也丧失了诱导宿主APC上B7-1和B7-2上调的能力(图15D)。还消除了抗体阻断可溶性B7与固定化的CTLA-4-Fc结合的能力(图16A)。这些人源化抗体丧失了阻断B7-CTLA-4相互作用的能力的事实为我们提供了进一步测试阻断活性对于肿瘤排斥和Treg消耗是否必不可少的机会。如图15E中所示，尽管丧失了阻断活性，但人源化抗体在肿瘤微环境中迅速诱导Treg消耗，但在脾(图15F)或引流淋巴结(图15G)中却没有。此外，HL12和HL32对周围淋巴器官和肿瘤中T细胞亚群的丰度表现出与L3D10类似的作用(图16B和16C)。更重要的是，两种抗体在引起MC38(图15H)和B16(图15I)肿瘤排斥方面与伊匹单抗和亲本L3D10一样有效。
伊匹单抗的免疫治疗活性不需要B7-CTLA-4相互作用
CTLA-4检查点阻断假设的关键预测是，除非存在B7递送负信号，否则抗CTLA-4mAb不应赋予免疫治疗作用。由于具有Cd80(编码B7-1)和Cd86(编码B7-2)的靶向突变的小鼠不具有Treg[33]并因此仅表达很少的Ctla4，因此通过使用饱和剂量的抗B7-1(1G10)和抗B7-2(GL1)mAb(其分别阻断人CTLA-4与mB7-1和mB7-2的结合)来测试该预测(图17A)。如图17B中所示，用与对照Ig或抗mB7-1和抗mB7-2 mAb的组合联合的伊匹单抗处理MC38荷瘤小鼠。所使用的抗mB7 mAb完全掩蔽了外周血白细胞中的所有B7-1和B7-2，因为它们与新的抗mB7 mAb的结合降低至具有Cd80和Cd86两者靶向突变(dKO)的小鼠中所观察到的程度(图17C和17D)。对于来自肿瘤引流淋巴结的DC观察到类似的B7-2阻断(图17E)。但是，无论抗体处理如何，1G10 mAb几乎都无法检测到B7-1的水平(数据未显示)，因此无法评估内源性B7-1的掩蔽程度。由于B7-1和B7-2两者都是对抗原的抗体应答所必需的[34]，并且由于抗CTLA-4抗体是抗药物抗体(ADA)的有效诱导剂[5]，因此ADA是体内B7-1与B7-2两者的功能的良好指示物。通过完全消除对伊匹单抗的抗体应答这一事实进一步证实了功能阻断(图17F)。重要的是，对B7的饱和阻断不影响伊匹单抗诱导的肿瘤排斥，因为抗mB7和Ig处理的小鼠对伊匹单抗疗法的应答等同(图17G)。因此，B7对负信号传导的消除未解释伊匹单抗的免疫治疗作用。
检查点阻断假设的另一个关键预测是抗CTLA-4 mAb释放未处理的T细胞的断裂以达到癌症免疫治疗作用。由于抗B7 mAb完全消除了T细胞依赖性抗体应答，因此测试了抗B7mAb的体内处理是否阻止伊匹单抗诱导的Th2细胞活化。如图18A中所示，伊匹单抗处理显著增强了Th2型细胞因子的体外产生，包括IL-4、IL-6和IL-10。这在体内通过抗B7 mAb处理得以消除。为了测试抗B7 mAb对周围淋巴器官中CD8 T细胞从头引发的影响，将荷瘤小鼠用SIY肽免疫，并在存在或不存在抗B7 mAb的情况下用伊匹单抗处理小鼠。代表性概况或SIY-H-2Kb特异性T细胞显示在图18B中，而代表性研究的汇总数据显示在图18C中。如图18B和18C中所示，在不存在抗B7 mAb的情况下，用SIY肽免疫诱导了SIY特异性T细胞的显著扩增。这似乎被伊匹单抗略微增加。但是，在存在抗B7 mAb的情况下，未观察到SIY特异性T细胞的从头引发。由于图17中的数据显示抗B7 mAb未干扰伊匹单抗的免疫治疗作用，因此图18中的数据表明，不需要伊匹单抗处理后从头T细胞引发来实现伊匹单抗的免疫治疗作用。
阻断B7-Ctla-4相互作用与抗小鼠Ctla-4 mAb的免疫治疗作用无关
基于两种抗小鼠Ctla-4 mAb(4F10和9H10)的完整和Fab两者的刺激作用[35-36]，提出了CTLA-4是用于T细胞调节的细胞固有负调节剂的概念，尽管没有数据呈现以表明这些抗体阻断B7-Ctla-4相互作用。最近，据报道第三种抗小鼠Ctla-4 mAb(9D9)在荷瘤小鼠中具有治疗作用，并导致肿瘤微环境中Treg的局部消耗[10]。因此，测试了已显示出诱导肿瘤排斥的所有三种可商购抗小鼠Ctla-4 mAb在生理相关条件下阻断B7-Ctla-4相互作用的能力。作为第一个测试，使用增加量的抗小鼠Ctla-4 mAb(相对于Ctla-4-Fc最多2,000倍摩尔过量)来阻断生物素化的Ctla-4-Fc与板包被的mB7-1和mB7-2的结合。如图19A中所示，抗小鼠Ctla-4 mAb 9H10即使在测试的最高浓度下也不阻断mB7-1-Ctla-4相互作用，尽管当以非常高的浓度使用9D9时观察到适度的阻断。尽管mAb 9D9有效地阻断了mB7-2-Ctla-4相互作用，但9H10未能阻断(图19B)。有趣的是，尽管9D9显示出与可溶性Ctla-4Fc的强结合，但9H10显示出较差的结合(图19C)，即使它在结合固定化的小鼠Ctla-4Fc方面比9D9更有效力(图19D)。由于该测定法中9H10任何阻断活性的缺乏可能仅反映了其与可溶性Ctla-4Fc的差结合，因此再次使用WT小鼠(Ctla4m/m)中树突状细胞上的B7-1和B7-2上调来测量B7-Ctla-4相互作用的体内阻断。如图19E和19F中所示，9H10不上调DC上B7-1的表达，而9D9则将mB7-1水平提高了15％(P<0.05)。有趣的是，尽管9D9明显上调了DC上的mB7-2，但9H10却未能上调。因此，首个且研究最广泛的肿瘤免疫治疗性抗Ctla-4 mAb(9H10)不阻断B7-Ctla-4相互作用。这些数据反对阻断B7-Ctla-4相互作用在通过抗小鼠Ctla-4 mAb诱导抗肿瘤免疫中的作用。由于两种mAb在肿瘤微环境中均显示出相当的免疫治疗作用和相当的Treg的消耗[10]，因此Treg的局部删除而非mB7-CTLA-4相互作用的阻断为抗小鼠CTLA-4mAb的治疗作用提供了统一的解释。有趣的是，尽管4F10在体外阻断了B7-Ctla-4相互作用，但它未能在体内诱导DC上B7的上调(图20)。
讨论
尽管基于伊匹单抗在以可溶性形式添加B7时阻断B7-CTLA-4相互作用的事实而将其称为阻断性mAb，但数据表明在生理相关条件下，它几乎不能阻断B7-CTLA-4相互作用，所述生理相关条件包括当将B7-1和B7-2固定化到固相或在细胞膜上表达时，当B7-CTLA-4复合物在暴露于抗CTLA-4mAb之前形成时，当以细胞表面分子表达B7和CTLA-4两者时，和特别地当B7和CTLA-4如分别在DC和T细胞上天然表达一样呈现时以及当动物在体内接受抗体处理时。更重要的是，伊匹单抗在不阻断B7-CTLA-4相互作用的情况下赋予它的免疫治疗作用，因为当至少50％的CTLA-4不与Ctla4h/m小鼠中的抗体结合或当宿主B7被抗B7 mAb掩蔽时，它仍然有效。
在本文所述的研究中的令人惊讶的发现是伊匹单抗阻断活性的显著差异，这取决于是否将B7或CTLA-4蛋白置于可溶性相中。现在可以用两个数据来解释。首先，伊匹单抗不破坏现有的B7-CTLA-4复合物。第二，可溶性CTLA-4与板结合的B7结合的缔合速率是可溶性B7与板结合的CTLA-4结合的缔合速率的至少三倍。结合起来，这些数据表明，当在溶液中添加B7时，伊匹单抗比当B7经固定化时有更多机会结合游离CTLA-4，并且有更多机会在形成复合物之前阻断CTLA-4-B7相互作用。由于CTLA-4抗体相互作用是动态的，因此与抗体解离的CTLA-4分子可以结合固定化的B7并对伊匹单抗的阻断变得“免疫”。因此，如最近所报道的[37]，CTLA-4上B7结合位点和伊匹单抗结合位点之间的部分重叠[37]不一定使其能够在生理学相关条件下阻断B7-CTLA-4相互作用。
L3D10与伊匹单抗之间断裂预形成的复合物的差异活性仍待阐明。虽然伊匹单抗的Kon(2.6x105/Ms或3.83x105/Ms)[14，16]低于可溶性B7的Kon(1-4x106/Ms，本研究)，但L3D10的Kon(2.07x105/Ms)不比伊匹单抗更快[15]。因此，Kon或Koff没有提供两种抗体差异性阻断B7-CTLA-4与固定化B7相互作用的能力的解释。更合理的解释为一旦形成复合物，CTLA-4构象以如下的方式改变，使得阻止伊匹单抗与其结合。伊匹单抗-CTLA-4复合物的公开数据表明CTLA-4上的伊匹单抗表位与B7结合位点之间存在部分重叠[37]，这与该解释一致。
为了模拟细胞表面上存在B7和CTLA-4两者的生理条件，使用分别表达加GFP标签的B7-1或B7-2或加OFP标签的CTLA-4的CHO细胞进行了跨胞吞测定法。为了克服通过CTLA-4交联引起的并发症相关的信号传导，重要的是使用Fab而不是二价抗体。数据清楚地表明，尽管以比饱和结合所需高10倍的浓度(10μg/ml)与细胞表面CTLA-4牢固结合，但伊匹单抗Fab仅引起对B7-1和B7-2的跨胞吞作用的15-30％抑制。更重要的是，通过摩尔比，该浓度将转变成比临床有效给药所达成的稳定血浆浓度高约50％的浓度。同样，当通过Y201V突变使细胞表面CTLA-4稳定化以允许稳定的B7-CTLA-4介导的细胞间相互作用时，高剂量的伊匹单抗Fab仅引起小于20％的抑制。由于临床上的有效给药不足以引起既非B7跨胞吞作用，又非B7和CTLA-4介导的细胞表面相互作用的有效抑制，因此基于细胞的体外测定法强烈反对将CTLA-4阻断作为临床上有效药物的作用机制。
来自这些体外研究的预测被体内研究证实。我们的体内测定法基于最近的发现，即CTLA-4通过经由跨胞吞作用引起树突状细胞上B7的下调而发挥功能[12，27]。由于这种独特的特性，人们不会预期通过B7-CTLA-4相互作用介导的体内的稳定的DC-Treg缀合。相反，阻断CTLA-4介导的跨胞吞作用直接导致B7在DC上的更高表达[12，27]。为了排除潜在的警告，即B7的上调是由于抗CTLA-4 mAb的信号传导，使用了由小鼠和人CTLA4等位基因两者组成的杂合小鼠[38]。在此模型中，抗人CTLA-4 mAb可以是有效的激动剂，但不是拮抗剂，因为它无法结合50％的CTLA-4分子。阻断抗CTLA-4 mAb L3D10在纯合小鼠而非杂合小鼠中诱导B7上调这一事实证实了体内测定法的特异性，并表明功能性阻断需要阻断超过50％的CTLA-4，这可能是因为跨胞吞作用可以用50％或更少的未占用的CTLA-4完成。因此，树突状细胞上B7的上调代表了与B7-CTLA-4相互作用的阻断最生理相关且直接的读出。
来自B7-CTLA-4阻断的贡献的缺乏也通过阻断作用与治疗功效之间的相关的缺乏来证明。尽管在阻断B7-CTLA-4相互作用方面差异超过1000倍，但L3D10和伊匹单抗在诱导肿瘤排斥方面具有可比性。因此，此类阻断对抗CTLA-4 mAb的功效没有显著贡献。有趣的是，由于L3D10在杂合小鼠中有效诱导肿瘤排斥，在杂合小鼠中它无法功能性阻断所有B7-CTLA-4相互作用，因此即使对于阻断性抗体，此类阻断对于肿瘤排斥也是不必要的。值得注意的是，失去了阻断活性的人源化L3D10后代在免疫疗法中仍然具有完全活性。这些数据驳斥了抗CTLA-4 mAb主要通过检查点阻断运作的假设[1]。通过驳斥普遍的假设，数据表明，提高抗CTLA-4 mAb的阻断活性不太可能是提高抗CTLA-4 mAb治疗功效的正确方法。我们的配套论文进一步验证了这一概念。
已知一小部分人类受试者表达可溶性B7-1[39]。由于伊匹单抗阻断了可溶性CD80和CTLA-4之间的相互作用，因此感兴趣的是考虑阻断可溶性CD80是否可能导致肿瘤排斥。出于两个原因这不太可能。首先，由于已知可溶性CD80促进肿瘤排斥，因为它为T细胞提供共刺激[40]，因此阻断这种相互作用应抑制而不是促进肿瘤排斥。其次，人源化的L3D10克隆HL12和HL32(无论CD80是固定化的还是以可溶形式，其失去了阻断B7-CTLA-4相互作用的能力)都是肿瘤排斥的有效力的诱导物。
同时，体内研究表明，本文使用的所有治疗有效的抗CTLA-4抗体在引起局部Treg消耗方面均非常有效。我们的数据提供了一个明确的证据，与抗小鼠Ctla-4 mAb一样，抗人CTLA-4 mAb(包括临床有效的伊匹单抗)也可以通过ADCC提供治疗作用。宿主FcR在伊匹单抗诱导的肿瘤排斥中的关键作用证实了这一假设。我们的工作支持以下假设：肿瘤环境中Treg的局部消耗是临床上有效的抗人CTLA-4 mAb的主要机制，并因此提出了新的方法来开发新一代的用于癌症免疫疗法的抗CTLA-4 mAb，通过选择性地增强局部Treg消耗进行，而不考虑阻断活性。
在肿瘤微环境中诱导局部Treg消耗以达到治疗作用的要求与检查点阻断假设的另一种假设不一致[1]，该假设指出，与抗PD-1/PD-L1抗体不同，抗CTLA-4抗体通过防止周围淋巴样器官的负信号传导来促进肿瘤排斥。通过证明B7阻断阻止了从头T细胞活化而不影响伊匹单抗的治疗作用，该数据驳斥了这一假设。重要的是，已证明系统性T细胞活化与免疫疗法相关的不良反应密切相关，而不是导致肿瘤排斥。
最后，在小鼠中积累的遗传数据表明，CTLA-4负调节T细胞活化以及通过Shp-2实现此类调节的原始概念[35-36][41-42]可能需要重新审视[43]。因此，尽管Ctla4-/-小鼠中的严重自身免疫疾病已用于支持CTLA-4作为T细胞活化的细胞固有负调节剂的想法[44-45]，但自那以来出现了与此观点不一致的至少有三条遗传数据线。首先，在Treg中而不是在效应T细胞中Ctla4基因的谱系特异性删除足以重演在Ctla4基因种系删除的小鼠中观察到的自身免疫表型[26]，尽管死亡的发作比具有种系或泛-T细胞基因删除的小鼠要慢[44-46]。尽管在Foxp3-细胞中Ctla4的功能仍有待研究，但这些数据表明在Ctla4-/-小鼠中致命性自身免疫的发展不需要在效应T细胞中缺失Ctla4。其次，在由WT和Ctla4-/-T细胞两者组成的嵌合体小鼠中，WT T细胞的共存可预防自身免疫表型[47]。这些数据再次强烈证明，自身免疫疾病不是由缺乏细胞固有的负调节剂引起的。嵌合体小鼠中在病毒感染期间未观察到Ctla4-/-T细胞优先扩增的事实，也证明了缺乏细胞固有的负调节剂作用[48]。第三，Shp2的T细胞特异性缺失(其被认为是介导CTLA-4的负调控[41-42])的结果是减少而不是增强T细胞活化[49]。在自从提议将CTLA-4作为T细胞活化的负调节剂以来报道的这些遗传数据的背景下，本文报道的数据要求重新评估癌症免疫疗法中的CTLA-4检查点阻断假设。
实施例2
完全CTLA-4占据、系统性T细胞活化和自身反应性T细胞的优先扩增对于肿瘤排斥是可有可无的，但与irAE相关，而阻断B7-CTLA-4相互作用既不影响CTLA-4抗体的安全性，也不影响功效。
方法
动物
已经描述了在内源性小鼠Ctla4基因座的控制下表达与人CTLA-4蛋白具有100％同一性的CTLA-4蛋白的CTLA4人源化小鼠[24]。将纯合的敲入小鼠(Clta4h/h)回交至C57BL/6背景至少10代。通过将CTLA4h/h小鼠与野生型(WT)BALB/c小鼠(用于肿瘤生长研究)或WTC57BL/6小鼠(用于irAE研究)杂交，产生杂合小鼠(Ctla4h/m)。WT BALB/c和C57BL/6小鼠是通过NCI合同从Charles River Laboratories购买的。所有小鼠均养在儿童国家医学中心儿童研究所的研究动物设施中。所有涉及小鼠的研究均得到机构动物护理和使用委员会的批准。
细胞培养
先前已经描述了鼠结肠肿瘤细胞系MC38[2]，并且CT-26和B16-F10细胞系购自ATCC(Manassas，VA，USA)。从供应商处收到后，在体内测试之前，将细胞传代次数保持在最低限度。细胞系既未经鉴定，也未定期检测支原体污染。将MC38、CT26和B16-F10细胞系在37℃，5％CO2温育。MC38和B16细胞在补充有10％FBS(Hyclone)、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，Gibco)中生长。在完全RPMI 1640培养基(Gibco)中培养CT26细胞。
抗体
已经描述了小鼠抗人CTLA-4 mAb L3D10[28]。研究中使用的抗CTLA-4 mAb L3D10是由人IgG1 Fc和L3D10可变区组成的嵌合抗体。重组抗体由Lakepharma,Inc(Belmont,CA,USA)通过服务合同生产。具有在WC500109302和www.drugbank.ca/drugs/DB06186中公开的氨基酸序列的重组伊匹单抗由Alphamab Inc.(中国，江苏，苏州)和Lakepharma Inc.(SanFrancisco,CA,USA)提供。临床使用的药物也用于验证关键结果。人IgG-Fc(无叠氮化物)是从Athens Research and Technology(Athens,GA,USA)批量订购的。抗小鼠PD-1 mAbRMP1-14购自Bio-X Cell,Inc.(West Lebanon,NH,USA)。所有单克隆抗体的内毒素水平均通过LAL测定法(Sigma)确定，且低于0.02EU/μg。
肿瘤生长和消退测定法
用给定数目的结直肠癌细胞MC38、CT26或黑素瘤细胞系B16-F10攻击具有人CTLA4基因的杂合或纯合敲入的小鼠。注射指定剂量的肿瘤细胞后第2、7或11天开始进行免疫疗法。将体积用作读出确定肿瘤生长和消退。使用以下公式计算体积(V)。
V＝ab2/2，其中a是长直径，而b是短直径。
L3D10的人源化
L3D10抗体通过服务合同由Lakepharma,Inc.进行人源化。每个的第一条人源化链均采用第一框架，并包含具有最少亲本抗体框架序列的最人类序列(人源化HC 1和LC 1)。每个的第二条人源化链使用与HC 1和LC 1相同的框架，但包含另外的亲本L3D10抗体序列(人源化HC 2和LC 2)。每个的第三条人源化链采用第二框架，并且与HC 2/LC 2相似，还包含与人框架融合的另外的亲本序列(人源化HC 3和LC 3)。然后将3条轻和3条重人源化链以所有可能的组合方式组合，以创建9种变异体人源化抗体，测试其表达水平和抗原结合亲和力，以鉴定出与亲本L3D10抗体相似的抗体。
全血细胞计数
使用装有K2EDTA(BD)的试管，在41日龄时收集血样(50μl)，并按照制造商手册通过HEMAVET HV950(Drew Scientific Group,Miami Lakes,FL,USA)进行分析。
内部器官的组织病理学分析
H&E切片是从福尔马林固定器官中制备的，该福尔马林固定器官是从接受治疗性抗体或对照抗体的小鼠中收获的，并进行双盲评分。评分标准：心，心包、右或左心房、主动脉基部和左或右心室浸润各记为1分；肺评分基于细支气管周围的淋巴细胞聚集体，1代表每切片淋巴细胞聚集体的1-3个小病灶，2代表4-10个小病灶或1-3个中病灶，3代表超过4个中病灶或存在大病灶，4代表实质组织间质纤维化和淋巴细胞聚集体的大病灶；肝评分基于门脉三联管周围的淋巴细胞浸润聚集体，1代表每切片淋巴细胞聚集体的1-3个小病灶，2代表4-10个小病灶或1-3个中病灶，3代表4个或更多个中病灶或存在大病灶，4代表实质组织间质纤维化和淋巴细胞聚集体的大病灶；肾评分：1.肾小球细胞轻度增加；2.增加远端或近端管的肾小球细胞性和淋巴细胞浸润；3.集合管中大的淋巴细胞聚集体；4.肾皮质和髓质内明显的淋巴细胞聚集体。唾液腺评分基于下颌下腺中的淋巴细胞浸润：1代表每切片淋巴细胞聚集体的1-3个小病灶，2代表4-10个小病灶或1-3个中病灶，3代表4个或更多个中病灶或存在大病灶，4代表实质组织间质纤维化和组织破坏以及淋巴细胞聚集体的大病灶。显示的数据是所有检查器官的综合得分。
通过F1杂交分析自身反应性T细胞
如图31A中所示，将C57BL/6.Ctla4h/h小鼠与WT BALB/c小鼠异型杂交。将F1小鼠杂交以生成F2，其中Ctla4h和H-2等位基因两者均随机分离。根据已发表的报道[24，30]，使用尾部DNA对Ctla4等位基因和内源性VSAg Mmtv8,9进行基因分型，而使用外周血白细胞通过流式细胞术确定H-2d单倍型的存在。
药物毒性的临床化学
用于测量心脏血清3型肌钙蛋白I(TNNI3)的试剂盒购自Cloud-Clone Corp.(Cat.No.SEA478Mu)，并按照制造商的方案使用ELISA测量TNNI3水平。使用肌酐(血清)比色测定试剂盒(Cayman Chemical)或肌酐(CREA)试剂盒(RANDOX,Cat No,CR2336)测量肌酐水平。根据制造商的手册，使用尿素氮直接试剂盒(Stanbio laboratory)测量血清BUN水平。
生物统计学
在图例中指示了用于分析每组实验的特定测试。对于每个统计分析，根据使用D'Agostino&Pearson正态性检验异常删除的数据是否正常分布来选择适当的检验。使用未配对的两尾学生t检验或Mann-Whitney检验以在两组之间进行比较，单向方差分析(ANOVA)或Kruskal-Wallis检验进行多重比较，和双向重复测量方差分析进行行为测试，来对数据进行分析。线性回归的相关系数和P值通过Pearson方法计算。基于文献和过去的经验选择具有足够统计能力的样本量。没有样品被排除在分析之外，并且除非另有说明，否则实验不是随机的。在动物组分配期间没有进行致盲，但在研究中进行的一些测量(即，肿瘤大小测量，组织学评分)中进行了致盲。在图中，如所示，y轴误差条代表S.E.M.或S.D.。使用Excel(Microsoft)、GraphPad Prism软件(GraphPad Software，San Diego,California)或R软件(https://www.r-project.org/)进行统计计算。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
结果
人类CTLA4敲入小鼠模型如实重演联合疗法的irAE
在联合疗法中研究irAE的机制和预防策略的主要挑战是小鼠耐受高剂量的抗CTLA-4 mAb而没有明显的AE。选择了两种人类CTLA-4 mAb用于本研究：临床使用的伊匹单抗和L3D10，它们在抗CTLA-4 mAb的组中最为有效力[24，28]。当在同一模型中进行比较时，两种mAb在导致肿瘤排斥方面具有可比性(图21)。由于幼龄小鼠表达较高水平的CTLA-4(重演了成年荷瘤小鼠的特征)(图22)，因此在围产期期间对分别具有对照人IgG-Fc、抗CTLA-4mAb伊匹单抗、L3D10、抗PD-1、抗PD-1+伊匹单抗或抗PD-1+L3D10的人CTLA4敲入(Ctla4h/h)小鼠进行处理。小鼠在出生后第10、13、16和19天以100μg/小鼠/注射的剂量进行处理，并评估其随时间的体重增加率，以及在第6周龄时的血液学和组织病理学变化(图23A)。如图23B中所示，尽管伊匹单抗和抗PD-1的组合显著延迟了雌性小鼠的生长，但是单独使用任何一种抗体都不对体重增加产生重大影响。雄性小鼠还显示出对抗PD-1+伊匹单抗的大幅和统计学上显著的生长迟缓(图23C)。值得注意的是，使用抗PD-1+L3D10时未观察到生长迟缓(图23B和1C)。为了研究联合疗法对造血的影响，在联合疗法开始后一个月进行了总血细胞计数(CBC)(图24)。在用伊匹单抗+抗PD-1处理的大多数小鼠中，观察到血细胞比容(HCT)、总血红蛋白(Hb)和平均红细胞体积(MCV)水平显著降低，而接受L3D10+抗PD-1的小鼠未受影响(图23D)。白细胞的呈现在很大程度上是正常的(图24)。这些数据证明抗PD-1和伊匹单抗的组合而不是抗PD-1和L3D10的组合引起贫血。作为单一药剂，伊匹单抗而非L3D10在高比例的幼龄小鼠中引起贫血，尽管平均减少在统计学上并不显著。尸体剖检后，很明显，骨髓中红细胞生成受到严重限制，因为来自伊匹单抗+抗PD-1处理的小鼠的骨骼和冲洗出的骨髓显得苍白，而L3D10+抗PD-1处理的小鼠的骨骼和骨髓与来自对照IgG处理的小鼠的那些相当(图23E)。为了定量骨髓中红细胞谱系的缺陷，分析了CD71和Ter119标志物在骨髓细胞中的分布以及细胞大小。这些标志物用于标记红细胞发育的五个阶段，依序从I到V：阶段I，CD71+Ter119-；阶段II，FSC-AhiCD71+Ter119+；阶段III，FSC-AmiCD71+Ter119+；阶段IV，FSC-AloCD71+Ter119+；以及阶段V，CD71-Ter119+。如图23F和图23G中所示，抗PD-1+伊匹单抗处理的小鼠显示祖细胞显著增加(阶段I)，而成熟红细胞的频率降低(阶段V)，这说明了明显的严重贫血。相反，经L3D10和抗PD-1处理的小鼠在骨髓中表现出红细胞的正常分布和成熟。
接受抗PD-1联合L3D10对伊匹单抗的CTLA4h/h小鼠的生长速率的显著差异表明两种抗CTLA-4 mAb可以诱导非常不同的AE。为了测试这种可能性，将小鼠处死并在其达到42日龄时进行尸体剖检。在抗PD-1+伊匹单抗处理的小鼠中观察到明显的心脏肥大，但在抗PD-1+L3D10处理的小鼠中未观察到(图25A)。扩大的心脏显示右心室与左心室的腔室均扩张，尽管在左心室更明显，表明严重的扩张型心肌病。与来自hIgG处理组的心脏相比，左心室和心室间隔心肌壁厚度减少超过50％(图25B)。组织学显示心肌炎，伴心内膜和心肌中的弥漫性和大量淋巴细胞浸润、心肌细胞变性和炎性灶处结构破坏(图25C)。通过免疫组织化学在抗PD-1+伊匹单抗处理的小鼠的心脏中观察到高丰度的CD45+和CD3+T细胞(图25D，上图)，与T细胞介导的病理学一致。这些细胞包括CD4和CD8 T亚组两者(图25D，底部)。Foxp3+CD4+Treg细胞存在于抗PD-1+伊匹单抗处理的小鼠的炎症部位，这表明尽管存在Treg，组织破坏仍然发生(图25D)。在接受L3D10+抗PD-1联合疗法或伊匹单抗单一疗法的小鼠中观察到轻度至中度炎症。但是，L3D10和抗PD-1单一疗法均未引起可检测的炎症(图25E)。抗PD-1处理未能诱导心脏炎症的事实可能归因于使用具有C57BL/6背景的小鼠，因为即使Pd1基因缺失，具有C57BL/6背景的小鼠也没有发展为心脏病[29]，与具有BALB/c背景的小鼠不同。除心脏外，伊匹单抗和抗PD-1 mAb的组合还诱导雌性泌尿生殖器官严重缺陷，并伴有卵巢和子宫发育不良的组织学发现(图26)。与肾上腺功能缺陷相一致，观察到肾上腺促皮质激素显著升高，对肾上腺的皮质醇的缺陷生成的可能响应(图27)。
为了定量分析抗PD-1和-CTLA-4及其组合对组织破坏的影响，进行了来自接受对照Ig或免疫治疗抗体的小鼠的内部器官和腺体的组织学分析。将器官和腺体固定在10％福尔马林中，切成切片并用苏木精和曙红(H&E)染色，并进行双盲评分。代表性的切片显示在图28A中，且每组中每只小鼠的得分显示在图28B中。所有器官的综合评分显示在图28C中。证实其安全性，L3D10单一疗法未能在任何检查的器官中诱导严重的炎症。相反，伊匹单抗在所有小鼠中均诱导中度至重度炎症，这比对照Ig、抗PD-1和L3D10单一疗法组中的偶然背景炎症明显更强。当与抗PD-1组合时，伊匹单抗在所有小鼠中均诱导炎症，并在所有主要器官中均出现严重炎症。尤其值得注意的是，在抗PD-1和伊匹单抗处理的小鼠中观察到透壁炎症，但在其他组中缺乏，所述透壁炎症是结肠中组织学发现的最严重的形式和克罗恩病的独特病理特征。当组合所有器官的评分时，很明显，伊匹单抗+抗PD-1诱导的炎症比L3D10+抗PD-1处理显著更强(图28C)。另外，单独的伊匹单抗也比作为单一药剂的单独的抗PD-1或单独的L3D10诱导显著更强的不良事件(图28C)。
伊匹单抗+抗PD1而非L3D10+抗PD-1诱导系统性T细胞活化和自身反应性效应T细胞的扩增
为了解伊匹单抗+抗PD-1联合疗法诱导的严重AE的机制，分析了分别接受对照IgG、伊匹单抗+抗PD1和L3D10+抗PD1的三组小鼠中T细胞的频率和功能亚组。如图29A中所示，三组中的CD4和CD8T细胞的频率基本相同。使用CD44和CD62L标志物，虽然中心记忆T细胞(CD44hiCD62Lhi)的频率不受影响，但观察到伊匹单抗+抗PD-1组中的效应记忆T细胞(CD44hiCD62Llo)的显著扩增(图29B和4D)。相应地，在经抗PD-1和伊匹单抗处理的组中，未处理的T细胞的频率大大降低(图29B和4D)。异常T细胞活化不是由于Treg的消耗引起的，因为脾中Treg的频率显著升高(图30)。
为了解irAE的发病机理，了解免疫疗法对自身反应性T细胞的影响至关重要。为了解决这个问题，利用了内源性自身抗原被一些选择性Vβ识别的事实[30]。由于C57BL/6小鼠缺乏I-E以呈递内源性超抗原，因此从(B6.Ctla4h/h x BALB/c WT)F1xF1杂交产生F2小鼠，并使用区分H-2d(用于BALB/c背景)和H-2b(用于C57BL/6背景)单倍型的mAb对后代进行分型。尾部DNA的PCR还用于确定小鼠Ctla4与人类CTLA4等位基因以及内源性VSAg8,9的状态(图31A)。
使用具有Ctla4的靶向突变的小鼠，Yamaguchi等人表明，CTLA-4有助于将表达Vβ5、11和12的T细胞转化为Treg，因为CTLA-4的靶向突变增加了Teff的百分比[31]。因此，分析了抗PD-1+伊匹单抗或抗PD-1+L3D10对H-2d+CTLA4h/h小鼠中VSAg反应性Teff和Treg的影响(图31B)。使用与VSAg8、9反应的Vβ11的代表性数据显示在图31C中，而VSAg反应性T细胞的Treg/Teff比率汇总显示在图31D中。补充表2中提供了特定Vβ的数据。
表2
伊匹单抗诱导VSAg反应性CD4 T细胞中Foxp3-区的优先扩增
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如图31C中所示，伊匹单抗+抗PD1使Foxp3-Vβ11+CD4 T细胞的频率加倍，但使Foxp3+Vβ11+CD4 T细胞的频率仅增加30％。因此，伊匹单抗+抗PD-1不仅增加了自身反应性T细胞的频率，而且降低了自身反应性T细胞中Treg的频率。不论Foxp3表达，非VSAg反应性T细胞(Vβ8+)的频率不受影响。相反，抗PD-1+L3D10对CD4 T细胞的频率没有影响。在Vβ5+和Vβ12+CD4 T细胞中也观察到VSAg反应性Teff的选择性扩增(表2)。结果，在接受抗PD-1+伊匹单抗的小鼠中，所有研究的VSAg反应性CD4 T细胞之间的Treg/Teff比率均显著降低(P＝0.0026)。对于VSAg反应性T细胞，该降低是选择性的，因为Vβ8之间的Treg/Teff比率不受影响。这些数据表明，抗PD-1+伊匹单抗处理减弱了对自身反应性T细胞的抗原特异性抑制。此外，为了解决该处理是否影响T细胞发育期间的Treg/Teff，还分析了VSAg反应性胸腺细胞之间的Treg/Teff比率。如图31E中所示，抗PD-1+伊匹单抗对胸腺细胞中的Treg/Teff比率没有影响。
在该研究中使用的抗CTLA-4 mAb与人而非小鼠CTLA-4反应(图32)，因此不能在携带小鼠Ctla4和人CTLA4等位基因的杂合小鼠(Ctla4h/m)中阻断所有CTLA-4分子的功能。测试衔接最大50％的CTLA-4是否足以引起VSAg反应性T细胞中Treg/Teff降低。如图31D中汇总，在CTLA4h/m小鼠中，无论抗体处理如何，均未观察到常规T细胞与Treg的比率发生变化。
人源化的L3D10克隆表现出有效力的CITE但最少的irAE
作为将L3D10抗体转化为临床测试的第一步，将L3D10人源化，产生了两个与CTLA-4具有相当结合的克隆，并针对irAE和CITE两者将这些与伊匹单抗进行比较。如图33A中所示，在Ctla4h/h小鼠中，当与抗PD-1组合时，伊匹单抗而非HL12和HL32引起生长迟缓。与伊匹单抗相反，如通过HCT和Hb所测量的，HL12和HL32均不引起贫血(图33B)。组织病理学分析进一步证实，当与抗PD-1组合时，尽管在小部分小鼠中的肺和唾液腺中观察到中度炎症，但HL12和HL32在心、肝、结肠或肾中未诱导炎症(图33C)。综合病理学评分揭示，在联合疗法中，HL12和HL32诱导的炎症甚至比L3D10少(当比较图33D和图28C时)。此外，当与抗PD-1抗体组合使用时，人源化克隆未诱导T细胞的系统活化(图34)。因此，L3D10的安全性概况在人源化期间没有受到损害。
为了确定是否以治疗作用为代价实现了HL12和HL32的更好的安全性，首先将伊匹单抗与HL12和HL32比较它们的治疗作用。先前的研究已经揭示抗鼠CTLA-4 mAb单一疗法能够诱导C57BL/6来源的结肠癌细胞系MC38和BALB/c来源的CT26的排斥。因此，通过使BALB/c.Ctla4m/m小鼠和C57BL/6.Ctla4h/h小鼠杂交产生F1小鼠(Ctla4h/m)。如图35中所示，尽管在对照Ig处理的小鼠中MC38肿瘤不受阻碍地生长，但通过添加低剂量的抗人CTLA-4 mAb阻止了它们的生长。以30μg/注射的剂量进行4次，所有抗CTLA-4 mAb均具有同等效力(图35A)。以10μg/注射的低剂量进行4次，HL32似乎稍微比伊匹单抗和HL12稍有效力，尽管差异在统计学上并不显著(图35B)。CT26比MC38对CTLA-4免疫疗法稍具抗性，因此需要更高的剂量。当使用高剂量的抗体时，所有三个mAb均诱导统计学上显著的生长抑制(图35C)。在较低剂量下，伊匹单抗确实略微降低了肿瘤的生长，尽管降低在统计学上不显著(P＝0.29)。另一方面，HL12和HL32两者均诱导明显的生长抑制(P＜0.001)(图35D)。当使用B16F10黑素瘤肿瘤模型时，两种抗体均实现了显著抑制(图35E和35F)。综上所述，人源化的L3D10克隆HL12和HL32在引起肿瘤排斥方面至少与伊匹单抗一样有效力。因此，人源化的小鼠模型允许我们鉴定出明显更安全但至少同样有效力的抗CTLA-4mAb。
在Ctla4h/m小鼠中，人CTLA-4的衔接足以诱导肿瘤排斥，但不足以用于自身免疫疾病
伊匹单抗可以在CTLA4h/m小鼠中诱导肿瘤排斥的以上数据提出了一个有趣的问题，即该mAb是否可以通过仅衔接部分细胞表面CTLA-4来诱导irAE。由于本研究中使用的抗人CTLA-4 mAb不与小鼠CTLA-4分子反应(图32)，因此通过比较Ctla4h/m小鼠中的irAE和CITE来评估irAE和CITE是否需要相似水平的受体衔接。出人意料的是，在Ctla4h/h小鼠中诱导生长迟缓的相同剂量的伊匹单抗+抗PD-1(图23A)在Ctla4h/m小鼠中未能做到(图36A)。与缺乏irAE一致，组织病理学分析显示，除唾液腺中的中度炎症外，抗PD-1+伊匹单抗在所分析的任何其他器官中均未引起炎症(图36B)，即便所使用的剂量引起纯合小鼠中分析的基本上所有器官中的严重炎症(图25和图28)。同样，在抗PD-1+伊匹单抗处理的Ctla4h/m小鼠中未观察到贫血(图36C)。然而，就伊匹单抗的免疫疗法而言，杂合小鼠几乎与纯合小鼠一样有响应(图36D)。因此，irAE和癌症免疫力可以在基因上解耦：尽管人类CTLA4基因以显性方式赋予CITE对伊匹单抗的应答，但其赋予irAE的作用却是隐性的。这些数据还提示了导致irAE与CITE的不同机制。
与在纯合小鼠中观察到的情况相反(图29)，伊匹单抗+抗PD-1的组合在Ctla4h/m小鼠中不诱导T细胞的系统性活化(图36E)。为了了解不同的自身免疫不良反应，分析了抗PD-1+伊匹单抗在人CTLA-4纯合和杂合小鼠中对Treg/Teff比率的影响。如图31C和图31D中所示，在纯合小鼠中降低Treg/Teff比率的相同处理在杂合小鼠中没有作用。独特的遗传学要求进一步加强了这样的观念，即自身免疫不良反应可以与癌症免疫力解耦。缺乏系统性T细胞活化和无法选择性扩增自身反应性Teff解释了Ctla4h/m小鼠中irAE的缺乏。在相同背景下观察irAE和CITE
尽管到目前为止已使用单独的背景以允许对irAE和CITE进行更稳健的评估，但令人感兴趣的是，可以在同一背景中观察到irAE和CITE。采取了两种方法来实现此目标。首先，基于心肌钙蛋白I(TNNI3，用于各种心脏病症的常规诊断标志物)作为血清标志物和组织学分析来评估接受抗CTLA-4抗体处理的幼龄成年小鼠的心脏不良事件。如图37A中所示，在6-7周的幼龄成年小鼠中，抗CTLA-4 mAb诱导了相似的稳健肿瘤排斥。尽管有相似的肿瘤排斥反应，这三种mAb仍诱导不同的不良心脏缺陷。值得注意的是，伊匹单抗诱导高水平的TNNI3(图37B)。相应地，组织学分析显示心肌细胞内外有大量的透明质沉积物(图37C，上图)，伴有广泛的心包炎(图37C，下图)。尽管在经HL12处理的小鼠血清中观察到了显著但较低水平的TNNI3，伴有心脏中的相应较低水平的透明质化(hyalination)和炎症。相反，在HL32处理的小鼠中未观察到血清TNNI3升高，以及相应地未观察到透明质化或炎症的组织学发现。当与抗PD-1组合时，伊匹单抗的治疗作用在单一疗法和联合疗法之间具有可比性(图37D)。虽然心脏毒性增加，但由于毒性研究中典型的个体差异较大，因此单独的伊匹单抗组和伊匹单抗加抗PD-1组之间无统计学显著性(图37E)。
相反，使用10日龄的小鼠测试CITE，因为它们对于评估irAE具有稳健性。如图37F中所示，将MC38肿瘤移植到10日龄的小鼠中后逐渐生长。值得注意的是，如快速的肿瘤消退(图37F)和普遍严重器官炎症(图37G)所示，幼龄小鼠在肿瘤排斥和诱导irAE方面均对伊匹单抗高度响应。
系统性T细胞活化与irAE密切相关
由于本研究中使用的各种抗体显示出irAE和外周T细胞活化的独特概况，因此确定外周T细胞活化是否与irAE相关是感兴趣的。如图38A和38D中所示，接受对照或五种不同抗CTLA-4 mAb之一施用的小鼠的单独irAE评分与脾中未处理的CD4和CD8 T细胞的百分比呈负相关。中央记忆T细胞的百分比没有显示出此类相关性(图38C和10F)。相反，效应记忆T细胞的百分比与irAE正相关(图38B和38E)。强烈的相关性表明，外周血中普遍的T细胞活化可能是irAE的潜在原因。
讨论
自从将irAE描述为新的临床实体[10]以来，为了克服癌症免疫疗法发展的这一主要瓶颈，对在小鼠模型中建立状况模型的兴趣日益增加。然而，进展缓慢，原因或许是小鼠肿瘤模型不同于人类癌症患者，人类癌症患者的免疫系统与癌症组织具有慢性相互作用。另外，由于irAE可以完全是药物特异性的，因此难以通过抗小鼠CTLA-4 mAb对特定抗人类CTLA-4 mAb的irAE进行建模。我们的研究在此使用人类CTLA4基因敲入小鼠评估临床上所用的抗CTLA-4 mAb的irAE。已表明该模型成功地重演了与伊匹单抗(单独或与抗PD-1 mAb组合)有关的大部分病理学观察，包括器官如心脏、肺、肝、肾及肠的重度炎症。在该模型中还观察到与伊匹单抗有关的罕见疾病，如纯红细胞再生障碍[19，20]。
应注意的是，尽管可以将模型用于模拟伊匹单抗和抗PD-1的组合，但是单独的抗PD-1不在模型中诱导irAE。与临床观察一致，尽管单独的伊匹单抗确实诱导基于多器官炎症的重大不良反应，但其严重程度远低于联合疗法。此外，为了观察严重的irAE，必须使用非常幼龄的小鼠。但是，尽管不良反应不太严重，但观察到心脏病(图37)和肾脏破坏(图39)的实验室和病理发现。感兴趣的是注意到在两个人源化的L3D10克隆中，一个在引起心脏病理方面比另一个更安全。总体而言，人源化后观察到安全性改善，而没有损害功效(图40)。因此，Ctla4h/h小鼠可以用于区分高度相似的抗体，从而为进一步的临床开发选择亚克隆。一项相关研究表明，人源化在很大程度上消除L3D10的阻断活性，而不损害治疗作用或安全性，进一步表明CITE和irAE均与阻断CTLA-4-B7相互作用无关。
尽管将非常幼龄的小鼠用于评估抗CTLA-4 mAb的irAE是最佳的，但在伊匹单抗处理后它们也表现出强的CITE。由于在幼龄小鼠中观察到许多irAE，如生长迟缓，生殖系统发育缺陷，因此本文所述的模型对于预测潜在的irAE可能是有价值的，这对小儿癌症患者至关重要。
已经确定由于淋巴细胞减少症，T细胞在幼龄小鼠中经历了广泛的稳态增殖[32，33]。由于癌症患者和幼龄小鼠经常患有淋巴细胞减少症，而淋巴细胞减少症与稳态增殖和自身免疫疾病有关[34，35]，因此考虑淋巴细胞减少症是否是irAE的辅助因素是具有重大兴趣的。如果情况如此，则可以使用淋巴细胞减少症作为irAE的潜在生物标志物。此外，数据表明，荷瘤小鼠在表达更高水平的Ctla4方面与幼龄小鼠相似，因此，来自幼龄小鼠的数据可以揭示荷瘤宿主的数据。幼龄小鼠的器官炎症范围(包括心肌炎、再生障碍性贫血和内分泌病)重演了临床发现，并为本论文提供了有力的支持。
Liu等最近已使用部分Treg消耗来在irAE上使小鼠增敏[36]。虽然该模型重演了irAE的某些病理特征，但值得注意的是，伊匹单抗在人类癌症患者中系统性地扩增而不是消耗Treg[37]，当伊匹单抗用于人CTLA4敲入小鼠时观察到的特征(数据未显示)。因此，基于Treg消耗的模型不太可能反映出癌症患者中irAE的原因。然而，由于发现联合治疗降低了Treg/Teff比率，因此Treg的一般缺陷可以重演irAE的某些病理特征。
使用对于人CTLA4等位基因纯合或杂合的小鼠，可以使irAE和CITE在遗传上解耦。因此，尽管仅在纯合小鼠中观察到了irAE，但在杂合和纯合小鼠两者中均观察到CITE。遗传需求的显著差异提示了irAE和CITE的不同机制：虽然irAE代表伊匹单抗施加的CTLA-4功能丧失，但CITE代表人CTLA-4基因的功能获得。
作为免疫学基础，不同的遗传需求反映在一般的T细胞活化上，因为伊匹单抗+抗PD-1诱导纯合小鼠而非杂合小鼠中的广泛T细胞活化。使用内源性超抗原反应性作为自身反应性的标志物，发现伊匹单抗+抗PD-1阻止了自身反应性T细胞向Treg的转化，从而导致自身反应性效应细胞比自身反应性Treg的比率增加。我们以前的研究表明，如果Treg与效应T细胞共享抗原特异性，则它们在体内抑制T细胞活化方面最有效[38]。因此，如图41A中所示，自身反应性效应物相对于自身反应性Treg的比率增加允许自身反应性T细胞活化，从而导致自身免疫疾病。
已经证明，CTLA4基因的双等位缺失减少了自身反应性T细胞向Treg的转化[31]。irAE需要抗CTLA4 mAb的双等位衔接至少部分由转化中CTLA-4的双等位衔接的要求来解释，因为自身反应性效应物/调节性T细胞比率的增加可导致自身免疫疾病。Ctla4基因座的遗传失活与双等位抗体衔接之间的汇聚提高了伊匹单抗以某种方式使CTLA4分子失活的可能性。由于一项相关研究表明，伊匹单抗在生理条件下不阻断B7-CTLA-4相互作用，因此伊匹单抗使CTLA-4分子失活的机制仍待确定。
与人CTLA-4在CITE中的显性功能一致，包括本发明人的一些研究的最新研究表明，在肿瘤微环境中局部消耗Treg起关键作用。因此，使用具有相同Fv但具有不同Fc同种型的抗小鼠CTLA-4 mAb，Selby等证明抗小鼠CTLA-4 mAb诱导肿瘤排斥的能力由Fc部分决定[16]。具体而言，对包括IgG2a和IgG2b在内的激活FcgR具有更强亲和力的抗体可以有效诱导肿瘤微环境中的肿瘤排斥和Treg消耗。相反，亲和力较弱的那些则无法做到。与这一观点一致的是，Bulliard等人[18]表明，编码激活信号传导受体亚基的Fcer1基因对于抗CTLA-4mAb诱导的肿瘤排斥至关重要。此外，在掺入了Fcer1编码亚基的激活FcγR中，Simpson等人表明肿瘤排斥和Treg消耗需要激活FcγRIV的衔接[17]，表明嗜中性粒细胞或巨噬细胞上的抗CTLA-4 mAb的Fc部分与FcR之间存在强制性相互作用。我们在随附论文中的数据进一步证明，抗CTLA-4诱导的肿瘤排斥反应需要Treg消耗，但不需要阻断B7-CTLA-4相互作用(图41B)。由于CTLA-4 mAb在肿瘤排斥方面具有可比性，但在诱导外周T细胞活化方面却有很大差异，因此该数据与抗CTLA-4抗体通过刺激周围1的初始T细胞活化促进肿瘤排斥的观点不一致。与irAE和CITE相关的不同机制和局部性为我们提供了新的见解，从而生产出更有效，更安全的CTLA-4靶向试剂，这些试剂有利于肿瘤微环境中的Treg消耗，同时避免外周淋巴样器官中的T细胞活化。
经典检查点阻断假设已经表明，抗CTLA-4 mAb通过诱导淋巴样器官中的初始T细胞活化来诱导肿瘤排斥。相反，数据显示，mAb实际上导致淋巴央器官中T细胞普遍活化的能力与irAE而非CITE相关。irAE评分与联合疗法触发的系统性T细胞活化之间的惊人相关性突显了这一点。相反，一项相关研究表明，伊匹单抗可以诱导肿瘤排斥，而无需从头引发抗原特异性T细胞。这是因为在伊匹单抗处理时，已经实现了T细胞的引发。此时，Treg释放局部抑制，而非淋巴样器官中的T细胞引发变成释放癌症免疫的关键。
综上所述，这项工作旨在解决一个基本问题，即是否可以将irAE和CITE解耦以允许开发更安全、更有效的免疫治疗抗体。本文描述了一个如实重演irAE的新模型，并且使用该模型已证明irAE和CITE并不是固有地联系的。该概念为鉴定治疗性抗CTLA-4 mAb提供了基础，这些抗CTLA-4 mAb至少与伊匹单抗一样有效，但毒性显著更低。数据表明，人源化的L3D10克隆是用于人类癌症疗法的治疗开发的潜在候选物。肿瘤微环境中的T细胞活化需要癌症免疫，而外周淋巴样器官中的一般T细胞活化则具有自身免疫风险(图41)，这一观点可能对选择靶标和靶向治疗候选物具有广泛的意义。
本说明书中所提及的所有出版物和专利均以引用的方式并入本文中，其引用的程度如各个别出版物或专利申请经特定及单独地指示以全文引用的方式并入一般。尽管本发明已结合其特定实施方案进行描述，但应理解，其能够进行进一步修改，且本申请希望涵盖对本发明的任何变化、使用或改编，其一般而言遵循本发明的原理且包括如在本发明所涉及的技术范围内已知或惯用实践范围内出现的相对于本发明的此类偏离，且可以应用于上文阐述的基本特征。
实施例3
抗体导向的溶酶体降解成为抗CTLA4单克隆抗体的免疫疗法相关不良反应的基础
考虑到在具有CTLA-4靶向突变的小鼠和人两者中强的自身免疫表型，提出irAE可能与抗体诱导的受体下调有关。为了检验该假设，生成了表达外源人CTLA-4分子的多种细胞系，并测试了临床药物伊匹单抗对CTLA-4表达的影响。已发现伊匹单抗在hCTLA-4转染的293T细胞(图42A-D)和表达人CTLA-4的CHO稳定细胞系(图42E-G)中均诱导CTLA-4，特别是细胞表面CTLA-4的下调。由于CTLA4主要位于细胞内部，并在激活后再循环到细胞表面，因此CTLA-4的细胞表面表达可能是决定伊匹单抗诱导CTLA-4下调的能力的主要因素。在未经处理的成年小鼠中，在调节性T细胞上几乎检测不到细胞表面CTLA-4(数据未显示)。相应地，伊匹单抗在初始小鼠中并未引起CTLA-4的显著下调。相反，肿瘤浸润Treg细胞表达明显更高水平的细胞表面CTLA-4，其在体外和体内均被伊匹单抗显著下调(图42H-1)。
为了测试抗体诱导的细胞表面CTLA4的下调是否有助于对irAE的敏感性，在伊匹单抗处理的irAE CTLA-4h/h-KI新生小鼠模型中分析了Treg中的细胞表面CTLA-4水平。在该模型中，已显示与成年小鼠相比，Treg表达的相当高水平的表面CTLA-4，并且伊匹单抗加抗PD-1联合治疗导致严重的irAE(18)。有趣的是，发现用抗PD-1处理，在肺和脾Treg中CTLA-4表达显著增加(图43A)。伊匹单抗和抗PD-1的联合治疗导致表面和细胞内CTLA-4的显著下调回至与不具有抗PD-1处理的Treg中相同的水平(图43A)。此外，通过刺激健康供体的血液中的外周血单核细胞(PBMC)，测试了伊匹单抗在人系统中对CTLA-4的下调。在未活化的人血Treg中，细胞表面CTLA-4的水平极低(数据未显示)。抗CD3和抗CD28刺激激活后，细胞表面CTLA-4急剧增加，其被伊匹单抗显著下调(图43B-C)。
已经显示具有可比的癌症免疫治疗作用(CITE)的不同抗人CTLA-4 mAb导致irAE的变化(18)。与抗PD-1联合治疗时，临床药物伊匹单抗而非人CTLA-4 mAb HL12和HL32诱导了严重的irAE(18)。用相同的曲美木单抗序列产生的抗CTLA-4单克隆IgG1抗体也在具有CITE潜力的CTLA-4h/h-KI新生小鼠模型中引起irAE(图44A-C)。因此，比较了这些抗CTLA-4mAb对CTLA4下调的影响。如图44D-F中所示，伊匹单抗和曲美木单抗(IgG1)而非HL12和HL32选择性地下调表达外源CTLA-4的人细胞系中的表面和细胞内CTLA-4。体内研究还显示，伊匹单抗(其触发强烈的不良反应)而非HL12(其不引起任何irAE)下调了irAE CTLA-4h/h-KI新生小鼠模型中肺和脾Treg的表面和细胞内CTLA4水平(图44G-H)。因此，在伊匹单抗和HL12处理的人活化的Treg细胞中显示了相似的结果(图44I)。这些数据提供了重要的证据，证明抗体诱导的表面CTLA-4的下调引起免疫疗法相关的不良反应。
由于CTLA-4从质膜组成性内化并且经历再循环和降解两者(19)，因此假设，抗体诱导的表面CTLA-4的下调可能是由于内化的表面CTLA-4的溶酶体降解。通过用Alex488标记伊匹单抗和HL12并追踪表面CTLA-4转运来对此进行了测试(图45A-C)。简而言之，将表达CTLA-4的CHO细胞与伊匹单抗-Alex488或HL12-Alex488在4℃温育，并且显示表面CTLA-4与抗体结合(图45A)。将这些细胞放置回37℃后，伊匹单抗和HL12标记的表面CTLA-4两者均内化。但是，伊匹单抗处理和HL12处理之间的内化CTLA-4定位模式明显不同(图45A)。通过用溶酶体示踪剂对细胞进行染色，发现伊匹单抗(其引起CTLA-4的显著下调)而非HL12(其对CTLA-4的水平没有影响)驱动细胞表面CTLA-4至溶酶体以降解(图45B-C)。相应地，伊匹单抗处理的细胞中溶酶体阻断对CTLA-4下调的抑制，证实了伊匹单抗驱动溶酶体的表面CTLA-4降解的想法，而不是HL12(图45D)。
细胞表面蛋白在内化后靶向到早期的内体。在内体中，由于pH低，配体可能与其同源受体解离，并且内体酸化期间配体与受体之间的持续结合对于后期溶酶体降解是必不可少的(20-22)。基于此，在内体酸化期间，用于溶酶体降解或再循环的表面CTLA-4的命运可能与它们与抗CTLA-4 mAb的结合亲和力有关。为了测试这一点，比较了在内体酸化过程期间存在的不同pH条件下抗CTLA-4 mAb的CTLA4结合。图46A中的数据表明，以10μg/ml，伊匹单抗和曲美木单抗(IgG1)在pH 7.0至pH 4.0表现出相似的饱和结合，其预示着这些复合物可以在细胞表面上(pH 7.0)、内体(pH 5.0-6.5)或溶酶体(pH 4.5)pH下维持(图46A-B)。相反，当pH达到内体水平(pH小于或等于6.0)时，HL12和HL32开始失去与CTLA-4的结合亲和力。如图46B中所示，伊匹单抗和曲美木单抗在pH 7.0和pH 5.5下显示出基本相同的剂量响应。在pH 5.5达到50％最大pH 7.0结合所需的抗体量(IC50)与在pH7.0所需的抗体量基本相同。在pH 4.5下的IC50提高了大约50-250％。相反，基于IC50的增加，当在pH 5.5时的结合与在pH7.0时的结合相比，HL12和HL32表现出超过10倍的降低。同样基于IC50的增加，当将它们在pH 4.5的结合与pH 7.0进行比较时，观察到在pH 4.5时IC的降低大于100倍。当CTLA-4已经结合抗体后pH降低时，显示出pH依赖性结合的相似结果(图46C)。为了确定内化期间低pH中结合亲和力的丧失是否与抗体和CTLA-4之间的解离相关联，将表面CTLA-4在4℃用抗CTLA-4 mAb标记，然后将细胞移至37℃以允许CTLA-4内化，随后降解或再循环回质膜(图46D-E)。在37℃下温育后，通过蛋白G珠捕获抗体结合的CTLA-4，并通过蛋白质印迹进行测试(图46D-E)。数据清楚地表明，在抗体诱导的CTLA-4内化期间，HL12和HL32而非伊匹单抗和曲美木单抗(IgG1)从CTLA-4解离(图46D)，其在内体溶酶体转运期间通过中和pH得以拯救(图46E)。
由于被HL12和HL32内化的CTLA-4从抗体中释放并从溶酶体降解逃逸，因此进行了实验以测试其是否可以再循环回到质膜。通过检查再循环内体标志物Rab11，发现与伊匹单抗处理相比，由HL12触发的内化的CTLA-4显示与Rab11更多的共定位(图47A)，这表明由HL12而非伊匹单抗触发的内化CTLA-4再循环回到细胞表面。为了证实这一点，将GFP-CTLA-4转染的293T细胞与对照IgG、伊匹单抗或HL12一起温育，并通过共聚焦显微镜测试细胞表面CTLA-4(图47B)。如所预期的，与具有完整的表面CTLA-4的对照hIgG-Fc处理的细胞相比，经伊匹单抗处理的细胞丧失了大部分细胞表面CTLA-4(图6B)。在大部分经HL12处理的细胞中已显示表面CTLA-4，即使这些细胞的表面CTLA-4存在一些间隙，这可能归因于未完成的再循环过程(图47B)。
数据证明了与抗CTLA-4 mAb诱导的irAE有关的重要原理。如图47C中所示，在低pH下具有CTLA-4的强结合亲和力的抗CTLA-4 mAb(例如伊匹单抗或曲美木单抗)将在内化期间驱动表面CTLA-4溶酶体降解，其由于表面CTLA-4的丧失而触发irAE。相反，在低pH下具有弱结合亲和力的抗CTLA-4 mAb(如HL12或HL32)在抗体诱导的内化期间将从CTLA-4解离。从这些抗体释放的表面CTLA-4将再循环回到细胞表面，并保持CTLA-4作为免疫应答的负调节剂的功能。这些发现为设计具有更好的抗肿瘤功效和较低的毒性的新的抗CTLA4抗体或工程化改造现有的抗CTLA-4抗体提供了重要的创新。
实施例4
pH敏感性抗CTLA-4抗体在肿瘤微环境中的Treg消耗和诱导已建立的大肿瘤的排斥中更有效
pH敏感性(非irAE易发性)抗CTLA-4抗体的关键是从CTLA-4解离，以允许其从溶酶体降解中逃逸并再循环至细胞表面。发明人意识到，由于CTLA-4水平确定对ADCC/ADCP的靶敏感性，所以该性质可以帮助Treg消耗。鉴于Treg消耗在肿瘤微环境中对于CITE的重要作用，因此考虑赋予较少irAE的pH敏感性如何影响CITE受到极大关注。比较在肿瘤微环境中在Treg消耗方面对pH敏感及不敏感的抗体以及大肿瘤排斥。为了测试抗体在肿瘤微环境中Treg消耗中的功能，将抗体注射到14天前受到MC38肿瘤攻击的小鼠中。16小时后，收获肿瘤并通过流式细胞术评估CD4+T细胞中Treg的百分比。如图48中所示，虽然HL12和HL32在16小时内显著减少了Treg，但伊匹单抗在该时间点并未消耗Treg。
发明人先前证明了对于经历四次处理的各种小肿瘤而言，伊匹单抗、HL12及HL32在诱导肿瘤排斥的功效方面具有可比性(图35)。鉴于HL12和HL32对Treg消耗的功效更好，并且鉴于Treg在抑制抗肿瘤T细胞应答方面的关键规则，在更具挑战性的背景下(即在荷大肿瘤的小鼠中，其具有良好建立的肿瘤微环境)重新评估了不同的抗CTLA-4抗体的功效。在17天之前接受过MC38肿瘤(平均直径为10mm)的小鼠用1.5mg/kg/剂量的伊匹单抗或HL12和HL32处理两次。如图49中所示，在相对较低的剂量下，HL32比伊匹单抗显著更有效(P<0.0001)。HL12也显示出更好的功效趋势，尽管差异未达到统计学显著性。
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Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Glu Gly Met Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
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145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变体蛋白质
<400> 2
Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
130 135 140
Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
145 150 155 160
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
165 170 175
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 3
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 3
Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile
1 5 10 15
Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val
20 25 30
Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
35 40 45
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
50 55 60
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
85 90 95
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
100 105 110
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
115 120 125
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130 135 140
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
180 185 190
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195 200 205
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
210 215 220
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
225 230 235 240
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
260 265 270
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275 280 285
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
290 295 300
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
305 310 315 320
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
325 330 335
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
340 345 350
Leu Ser Pro Gly Lys
355

Claims (39)

1.用于治疗癌症的抗CTLA-4抗体，其中所述抗体不赋予系统性T细胞活化或自身反应性T细胞的优先扩增。
2.用于治疗癌症的抗CTLA-4抗体，其中所述抗体允许CTLA-4循环回到细胞表面。
3.权利要求2的抗CTLA-4抗体，其中与pH 5.5相比，所述抗体在pH 7以更高的亲和力结合CTLA-4。
4.权利要求2的抗CTLA-4抗体，其中与pH 4.5相比，所述抗体在pH 7以更高的亲和力结合CTLA-4。
5.权利要求2-4中任一项的抗CTLA-4抗体，其中所述抗体在肿瘤微环境中诱导FcR介导的T调节细胞耗竭。
6.权利要求2-5中任一项的抗CTLA-4抗体，其中所述抗体不赋予系统性T细胞活化或自身反应性T细胞的优先扩增。
7.前述权利要求中任一项的抗CTLA-4抗体，其中所述抗体不阻断CTLA-4与其B7配体的结合。
8.前述权利要求中任一项的抗CTLA-4抗体，其中与位于细胞表面上的CTLA-4相比，所述抗CTLA-4抗体具有对可溶性CTLA-4降低的亲和力。
9.前述权利要求中任一项的抗CTLA-4抗体，其中所述抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体组合。
10.鉴定诱导较低水平的免疫疗法相关不良事件(irAE)的抗CTLA-4抗体的方法，其包括：
(a)提供包含细胞表面CTLA-4的细胞；
(b)使(b)的细胞与候选抗CTLA-4抗体接触；
(c)温育时段后，检测细胞表面CTLA-4的量；
(d)将来自步骤(c)的细胞表面CTLA-4的量与阈值水平进行比较，其中所述阈值水平是来自与对照抗CTLA-4抗体接触的细胞的细胞表面CTLA-4的量，
其中与所述阈值水平相比细胞表面CTLA-4的更高量将所述候选抗CTLA-4抗体鉴定为诱导较低水平irAE的抗CTLA-4抗体。
11.权利要求10的方法，其中所述对照抗CTLA-4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。
12.权利要求10的方法，其中步骤(a)的细胞表达人CTLA-4。
13.权利要求10的方法，其中所述细胞表面CTLA-4是可检测标记的。
14.权利要求13的方法，其中可检测标记物是荧光标签。
15.权利要求14的方法，其中所述荧光标签是橙色荧光蛋白。
16.权利要求10的方法，其中步骤(c)的检测包括使用Western印迹、免疫组织化学或流式细胞术测量所述细胞表面CTLA-4的可检测标记物的量。
17.权利要求10的方法，其中步骤(c)的温育包括使所述候选抗CTLA-4抗体与可检测标记的抗IgG抗体接触，并使用Western印迹、免疫组织化学或流式细胞术测量所述可检测标记的抗IgG抗体的可检测标记物的量。
18.权利要求17的方法，其中所述可检测标记的抗IgG抗体的可检测标记物包含alex488。
19.权利要求10的方法，其中所述细胞选自下组：293T细胞、中国仓鼠卵巢细胞和T调节细胞(Treg)。
20.抗CTLA-4抗体，其与小于或等于6的低pH相比，在6.5-7.5的高pH对CTLA-4具有更高的结合亲和力。
21.权利要求20的抗体，其中所述高pH是7且所述低pH是4.5。
22.权利要求20的抗体，其中所述高pH是7且所述低pH是5.5。
23.筛选或设计用于免疫疗法中的抗CTLA-4抗体的方法，其中所述抗CTLA-4抗体不引起溶酶体CTLA-4降解。
24.权利要求23的方法，其包括
(a)在6.5-7.5的pH使所述抗CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白接触，并定量与所述CTLA 4蛋白结合的抗CTLA-4抗体的量；
(b)在4.5-5.5的pH使所述抗CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白接触，并定量与所述CTLA 4蛋白结合的抗CTLA-4抗体的量；
(c)比较(a)和(b)中结合的量，
其中若与(b)相比(a)中结合的量大于或等于阈值水平，则所述抗CTLA-4抗体不引起溶酶体CTLA-4降解。
25.权利要求24的方法，其中(a)的pH为7.0，(b)的pH为5.5，并且所述阈值水平为3倍。
26.权利要求24的方法，其中(a)的pH为7.0，(b)的pH为4.5，并且所述阈值水平为10倍。
27.权利要求24-26中任一项的方法，其中抗CTLA-4抗体结合的量是实现与所述CTLA-4蛋白的50％最大结合所需的抗CTLA-4抗体的量。
28.权利要求23的方法，其中所述抗CTLA-4抗体允许已经在细胞表面处结合的CTLA-4在内吞作用之后再循环回到所述细胞表面。
29.治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用抗体，所述抗体与CTLA-4的结合在与内体和溶酶体中发现的pH对应的酸性pH下被破坏。
30.权利要求29的方法，其中与pH 7.0相比，所述抗CTLA-4抗体在pH 5.5表现出其与CTLA-4的结合的至少3倍的降低。
31.权利要求29的方法，其中与pH 7.0相比，所述抗体在pH 4.5表现出其与CTLA-4的结合的至少10倍的降低。
32.权利要求29的方法，其中与伊匹单抗或曲美木单抗相比，所述抗CTLA-4抗体表现出与可溶性CTLA-4比与细胞表面结合或固定化的CTLA-4的结合的更大的降低。
33.根据权利要求10-19和23-28中任一项鉴定、筛选或设计的抗CTLA-4抗体。
34.治疗有此需要的受试者中的癌症的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1-8、20-22和33中任一项的抗CTLA-4抗体。
35.权利要求34的方法，其中与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合施用所述抗CTLA-4抗体。
36.权利要求1-8、20-22和33中任一项的抗CTLA-4抗体，用于治疗受试者中的癌症。
37.权利要求36使用的抗CTLA-4抗体，其中与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合施用所述抗CTLA-4抗体。
38.权利要求1-8、20-22和33中任一项的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
39.权利要求38的用途，其中所述抗CTLA-4抗体与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合。
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