TW201945029A - 選擇及設計用於癌症療法之較安全及較有效之抗ｃｔｌａ－４抗體的方法 - Google Patents

選擇及設計用於癌症療法之較安全及較有效之抗ｃｔｌａ－４抗體的方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於結合至人類CTLA4分子之抗CTLA-4抗體的組合物，以及其用於癌症免疫療法中及相較於其他免疫治療劑減少自體免疫副作用之用途。

Description

選擇及設計用於癌症療法之較安全及較有效之抗CTLA-4抗體的方法
本發明係關於抗細胞毒性T淋巴球細胞相關抗原-4 (CTLA-4)抗體及其抗原結合片段。
經典的檢查點阻斷假設宣稱癌症免疫受到兩個不同檢查點約束：第一個係CTLA-4與B7之間的相互作用，其限制淋巴器官中之初始T細胞的預致敏，而第二個係程式化死亡1 (PD-1)/B7H1 (PDL1)相互作用，其引起腫瘤微環境內之效應子T細胞耗竭[1]。此後，若干新穎標靶已在臨床試驗中評估[2]且已描述用於靶向試劑之多重機制[3]。抗CTLA-4單株抗體(mAb)誘導小鼠[4-6]及患者[7-8]中之癌症排斥反應。
近來，提出多種其他機制來解釋抗CTLA-4 mAb之免疫治療效應，包括耗乏腫瘤微環境中之調控性T細胞(Treg)[9-11]及阻斷樹突狀細胞上之B7轉胞吞[12-13]。然而，仍應測試抗CTLA-4抗體是否藉由根據檢查點阻斷假設而假定的機制誘導腫瘤排斥反應，亦即，阻斷B7-CTLA-4相互作用且在淋巴器官中起到促進初始T細胞活化的作用[1]。
抗CTLA-4 mAb的全身作用受到報導的質疑，該等報導提出抗小鼠CTLA-4 mAb的腫瘤免疫治療作用依賴於其與Fc之活化受體的相互作用且治療效果與腫瘤微環境中之Tregs的選擇性耗乏相關[9-11]。儘管此等研究對抗CTLA-4抗體在淋巴器官執行其治療作用的意見產生疑問，但其未解決核心問題，該核心問題係關於阻斷B7-CTLA-4相互作用是否為癌症治療作用所需或有助於癌症治療作用，或涉及腫瘤微環境中之Tregs的耗乏。
儘管抗小鼠CTLA-4 mAb藉由阻斷B7-CTLA-4相互作用信號負向傳導來誘導腫瘤排斥反應的構思得到普遍接受，但此等抗體的阻斷活性[4-6、9-11]尚未得到關鍵性評價。另一方面，已報導若使用可溶性B7-1及B7-2與固著的CTLA-4相互作用，則臨床上首次使用的抗CTLA-4 mAb伊匹單抗(Ipilimumab)可以阻斷B7-CTLA-4相互作用[14]。然而，由於B7-1及B7-2為膜相關共刺激分子，故不清楚抗體是否在生理學相關條件下阻斷B7-CTLA-4相互作用。
抗PD-1 mAb尼沃單抗(Nivolumab)與抗CTLA-4 mAb伊匹單抗之組合顯著地提高晚期黑色素瘤患者之目標反應率[6，7]。此組合療法在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)中亦出現有希望的結果[8]。當另一種抗CTLA-4 mAb (曲美單抗(Tremelimumab))與德瓦魯單抗(Durvalumab)(一種抗PD-L1 mAb)組合時，觀測到類似臨床益處[9]。嚴重不良事件(SAE)給單獨或組合之抗CTLA-4 mAb的較廣泛臨床使用帶來嚴重障礙[6，7]。伊匹單抗試驗中所觀測到之SAE導致免疫療法相關不良事件(irAE)的概念[10]。詳言之，在伊匹單抗與尼沃單抗(抗PD-1)之組合療法中，超過50%患者出現3級及4級SAE。在NSCLC中，伊匹單抗與尼沃單抗組合療法引起高反應率，但3級及4級SAE的發生率亦較高[8]。同樣，德瓦魯單抗(抗PD-L1)與曲美單抗(抗CTLA-4)之組合對NSCLC展示臨床活性[9]，但此活性在III期臨床試驗中未得到證實。3級及4級SAE的報導率較高並且患者退出率較高，此可能由於毒性不可接受[9]。由於較高劑量的抗CTLA-4 mAb在單一療法與組合療法中均與較佳臨床結果相關，因此irAE不僅妨礙許多患者繼續進行免疫療法，而且限制癌症免疫治療作用(CITE)的功效。另外，停用兩種抗CTLA-4 mAb的患者數目較高可能歸因於未能滿足若干臨床試驗中的臨床終點[11，12]。
最近，對抗PDl1 mAb尼沃單抗及抗CTLA-4 mAb伊匹單抗作為經切除之III及IV期黑色素瘤之輔助療法進行的頭對頭比較表明，伊匹單抗具有較低CITE，但具有較高irAE [13]，使得CTLA-4靶向免疫療法的前景進一步暗淡。然而，存活三年的經伊匹單抗治療之患者在十年期間、在存活率方面未展示進一步下降[14]。顯著持續之反應突顯靶向CTLA-4對於免疫療法之非凡益處，尤其是可以使irAE受到控制。
關於產生安全且有效之抗CTLA-4 mAb的基本問題係CITE與irAE是否內在地關聯。由於基因滅活CTLA-4表現引起小鼠及人類之自體免疫疾病，因此假定irAE為CITE之必需代價。另一方面，近期研究表明，抗小鼠CTLA-4 mAb之治療作用需要抗體特異性地介導腫瘤微環境內之Treg耗乏，而非阻斷B7-CTLA-4相互作用[16-18]。此等研究引人興趣之可能性在於，若吾人可以達成局部Treg耗乏而不模擬基因滅活CTLA-4表現，則可以達成CITE而無irAE。為了測試此假設，必需建立如實再現臨床上觀測到之irAE的模型。
接受抗CTLA-4或抗CTLA-4加上抗PD-1/PD-L1藥劑之患者中共同報導的irAE包括血液異常，諸如純紅血球發育不全[19，20]，及對實體器官造成的非感染相關發炎損傷，諸如結腸炎、皮炎、肺炎、肝炎及心肌炎[21-23]。儘管術語irAE意味著CITE與自體免疫AE之間的內在聯繫，但證實此類聯繫的研究性研究非常少。相比之下，涉及人類Ctla4基因敲入小鼠的發明人先前研究表明，抗DNA抗體含量與癌症排斥反應參數彼此間並非始終相關[24]。詳言之，已發現，所測試之抗體之一，L3D10，賦予最強CITE，但在所測試之若干mAb中仍誘導含量最低之抗DNA抗體。然而，由於抗CTLA-4 mAb誘導的不良事件在小鼠中相對輕微，因此此模型不能再現臨床觀測結果。因此，在理解irAE發病機制及鑑別安全且有效的抗CTLA-4 mAb方面，其價值有限。另外，由於此等研究係在臨床上所用之抗CTLA-4 mAb可獲得之前進行，因此不清楚所述原理是否與臨床產物誘導irAE有關。
假設抗CTLA-4抗體藉由阻斷B7-CTLA-4相互作用信號之負向傳導來引起腫瘤排斥反應。如本文所揭示，人類CTLA4 基因嵌入小鼠以及經人類造血幹細胞重建之小鼠用於系統地評估抗人類CTLA-4 mAb之CITE是否需要在生理學相關條件下阻斷B7-CTLA-4相互作用。驚人地，在濃度大大高於臨床有效劑量所達成之血漿含量的情況下，抗CTLA-4抗體伊匹單抗既不阻斷CTLA-4對B7的轉胞吞，亦不阻斷CTLA-4結合至所固著之B7或細胞締合之B7。因此，伊匹單抗不使CTLA4基因人類化小鼠(Ctla4h / h )或人類CD34+幹細胞重建之NSG™小鼠之DC上的B7含量增加。在表現人類與小鼠CTLA4基因之Ctla4h/m小鼠中，結合至人類、但不結合至小鼠CTLA-4的抗CTLA-4抗體有效地誘導Fc受體依賴性Treg耗乏及腫瘤排斥反應。阻斷抗體L3D10在引起腫瘤排斥反應方面類似於非阻斷伊匹單抗。顯然，在人類化期間失去阻斷活性之L3D10後代在Treg耗乏及腫瘤排斥反應方面仍然完全勝任。有效阻斷淋巴器官中之CD4 T細胞活化及重新CD8 T細胞預致敏的抗B7抗體對伊匹單抗之免疫治療作用無負面影響。因此，臨床上有效的抗CTLA-4 mAb伊匹單抗藉由不依賴於檢查點阻斷、但依賴於宿主Fc受體的機制來引起腫瘤排斥反應。本文所提供之資料要求對CTLA-4檢查點阻斷假設進行再評估且為下一代安全且有效的抗CTLA-4 mAb提供新見解。
除賦予癌症免疫治療作用(CITE)之外，抗CTLA-4單株抗體(mAb)引起嚴重的免疫療法相關不良事件(irAE)。若可以使irAE受到控制，則靶向CTLA-4展示顯著的長期益處且因此仍為癌症免疫療法的寶貴工具。再現臨床irAE及CITE的動物模型對於開發更安全CTLA-4靶向試劑而言係有價值的。開發irAE之小鼠模型時，本發明人考量三種因素。第一，由於抗PD-1與抗CTLA-4之組合療法正快速地向多種適應症擴展，故再現該組合療法之模型對於該領域具有重大意義。第二，組合療法在超過50%個體中引起SAE (3級及4級器官毒性)的事實使得在小鼠模型中更容易再現irAE。第三，由於小鼠對irAE的抗性通常更大，因此吾人必須搜尋可以如實再現irAE所依的條件。由於Ctla4-/- 小鼠在幼小年齡時呈現最強的自體免疫表型[25，26]，且成年小鼠中之Ctla4基因靶向突變引起不太嚴重的自體免疫疾病[27]，因此本發明人洞悉小鼠若其在幼小年齡時投藥則可能對抗CTLA-4 mAb最敏感。考量此等因素，本發明人已鑑別出如實再現組合療法臨床試驗中所觀測到之irAE的模型系統。
特定言之，本文描述一種模型，其利用具有人類化Ctla4基因之小鼠來評價單獨或組合之抗CTLA-4抗體的CITE及/或irAE。在此模型中，臨床藥物伊匹單抗誘導嚴重irAE，尤其當與抗PD-1抗體組合時。同時，另一種抗CTLA-4 mAb L3D10在相同條件下誘導類似CITE伴極輕微的irAE，此表明irAE與CITE並無內在聯繫且其需要不同的基因及免疫基礎。irAE對應於全身T細胞活化且在自體反應性T細胞中對應於降低的Treg/Teff比率。使用對於人類對偶基因而言為同型接合或異型接合之小鼠，本發明人發現irAE需要雙對偶基因接合，而CITE僅需要單對偶基因接合。由於單對偶基因相對於雙對偶基因接合存在免疫學區別，因此本發明人發現，Ctla4基因之雙對偶基因接合為防止自體反應性T細胞轉化成Treg所必需的。引起阻斷活性損失的L3D10人類化使安全性進一步增強而對治療作用無影響。綜合而言，本文所提供之資料證明，完全的CTLA-4佔據、全身性T細胞活化及自體反應性T細胞之優先擴增對於腫瘤排斥反應而言為非必需的，但與irAE相關，而阻斷B7-CTLA-4相互作用既不影響抗CTLA-4抗體的安全，亦不影響其功效。此等資料為臨床開發更安全且潛在更有效之CTLA-4靶向免疫療法提供重要的見解。
本文描述與抗CTLA-4 mAb誘導irAE相關之重要原理。詳言之，在低pH下對CTLA-4具有強結合親和力的抗CTLA-4 mAb (如伊匹單抗或曲美單抗)將驅動表面CTLA-4在內化期間發生溶酶體降解，作為表面CTLA-4損失的結果而觸發irAE。相比之下，在低pH下具有弱結合親和力的抗CTLA-4 mAb在抗體誘導的內化期間與CTLA-4解離。內化之CTLA-4自此等抗體中釋放且再循環回至細胞表面且維持CTLA-4作為免疫反應負調控因子之功能。藉由保留作為ADCC/ADCP標靶以供瘤內Treg耗乏的細胞表面CTLA-4，pH敏感性抗體對腫瘤微環境中之選擇性Treg耗乏且從而對排斥大腫瘤更有效。此等發現代表用於開發治療劑之CTLA-4標靶發生顯著的範式轉移：自基於拮抗B7與CTLA-4之間之相互作用來選擇抗體的範式轉移至保留正常CTLA-4再循環的範式。此為設計及/或選擇具有較佳抗腫瘤功效及較低毒性之新穎抗CTLA-4抗體提供重要創新。
特定言之，為了增強抗腫瘤活性，CTLA-4靶向劑將耗乏腫瘤微環境中之Treg。在一個特定實施例中，抗CTLA-4 mAb增強Fc介導之Treg耗乏活性。Treg耗乏可以藉由抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞介導的吞噬(ADCP)發生。若CTLA-4抗體不下調腫瘤微環境中之調控性T細胞之CTLA4，較佳藉由保留內化之CTLA-4分子之再循環來達成，則此活性亦可得到增強。
為了減少irAE，CTLA-4靶向劑經選擇或經工程改造以保留正常的CTLA-4再循環且從而保留調控T細胞在腫瘤微環境外部之其正常功能。在一個特定實施例中，抗CTLA-4 mAb在晚期核內體或溶酶體pH (pH 4-6)下對CTLA-4之結合親和力大大減弱且在抗體誘導之內化期間與CTLA-4解離，從而允許所釋放之CTLA-4再循環回至細胞表面且維持CTLA-4作為免疫反應負調控因子之功能。
在最佳實施例中，抗CTLA-4抗體經選擇或經工程改造以改良Treg耗乏式抗腫瘤活性與CTLA-4再循環活性。
為了進一步增強CTLA-4靶向劑之毒性分佈，可以使其對可溶性CTLA-4 (sCTLA-4)的結合性降低。CTLA-4基因轉錄物發生替代性剪接而產生sCTLA-4，且CTLA4多形性與多種自體免疫疾病之間存在關係，此涉及可溶性CTLA4的產生缺乏(nature 2003, 423：506-511)及sCTLA4同功異型物的基因靜默使小鼠的I型糖尿病發作增加(Diabetes 2011, 60:1955-1963)。舉例而言，相對於產生較多sCTLA-4之單倍型，諸如抗性CT60A單倍型，產生較少sCTLA-4轉錄物之基因變異體(諸如單倍型CT60G)對自體免疫疾病的易感性增強。因此，血清中sCTLA-4之存在與減少之自體免疫疾病相關。另外，可溶性CTLA4 (阿巴西普(abatacept)及貝拉西普(belatacept))為廣泛使用的免疫抑制藥物。因此，對sCTLA-4結合親和力減小的抗CTLA-4 mAb可以sCTLA-4作為免疫反應負調控因子的功能。本文所述之本發明亦包括藉由合併本文所述抗體之功能特徵或屬性來設計新穎抗CTLA-4抗體或增強現有抗CTLA-4抗體之功效及/或毒性分佈。
本文提供一種抗CTLA-4抗體，其可以不賦予全身T細胞活化或自體反應性T細胞之優先表現，及/或其可以允許CTLA-4循環回細胞表面。相較於pH 5.5或4.5，該抗體在pH 7.0可以更高親和力結合至CTLA-4。抗體可以在腫瘤微環境中誘導Fc-R介導T調控細胞耗乏。抗體可以不賦予全身T細胞活化或自體反應性T細胞之優先表現。前述抗體可以不阻斷CTLA-4結合至其B7配位體。相較於位於細胞表面上的CTLA-4，該抗體可以具有減小之針對可溶性CTLA-4的親和力。抗CTLA-4抗體可以與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合。抗CTLA-4抗體可以用於治療癌症。
本文亦提供一種鑑別抗CTLA-4抗體的方法，該抗CTLA-4抗體誘導免疫療法相關不良事件的水準降低。該方法可以包含：提供包含細胞表面CTLA-4之細胞，使該等細胞與候選抗CTLA-4抗體接觸，培育期之後偵測細胞表面CTLA-4的量，及將細胞表面CTLA-4的量與臨限水準進行比較。臨限水準可以是來自細胞之與對照抗CTLA-4抗體接觸之細胞表面CTLA-4的量。細胞表面CTLA-4之量高於臨限水準可以鑑別候選抗CTLA-4抗體為誘導較低irAE程度的抗CTLA-4抗體。該等細胞可以表現人類CTLA-4，且細胞表面CTLA-4可以可偵測地加以標記。可偵測標記可為螢光標籤，諸如橙色螢光蛋白。偵測可以包含使用西方墨點法、免疫組織化學或流式細胞術量測細胞表面CTLA-4之可偵測標記的量，培育可以包含使候選抗CTLA-4抗體與可偵測標記之抗IgG抗體接觸，及使用西方墨點法、免疫組織化學或流式細胞術量測可偵測標記之抗IgG抗體中之可偵測標記的量。可偵測標記之抗IgG抗體可以包含alex488。該等細胞可為293T細胞、中國倉鼠卵巢細胞及T調控細胞(Tregs)。
本文進一步提供一種抗CTLA-4抗體，相較於小於或等於6之低pH，其在6.5-7.5之高pH下對CTLA-4具有較高結合親和力。高pH可為7且低pH可為4.5或5.5。
本文亦提供一種篩選或設計供免疫療法使用之抗CTLA-4抗體的方法，其中該抗CTLA-4抗體不引起溶酶體CTLA-4降解。該方法可以包含：(a)使抗CTLA-4抗體與CTLA-4蛋白在6.5-7.5之pH下接觸，及定量結合至該CTLA 4蛋白之抗CTLA-4抗體的量；(b)使抗CTLA-4抗體與CTLA-4蛋白在4.5-5.5之pH下接觸，及定量結合至CTLA-4蛋白之抗CTLA-4抗體的量；(c)比較(a)及(b)中之結合量。若(a)中的結合量相較於(b)大於或等於臨限水準，則抗CTLA-4抗體可不引起溶酶體CTLA-4降解。(a)之pH可為7.0，(b)之pH可為5.5，且臨限水準可為3倍。(a)之pH可為7.0，(b)之pH可為4.5，且臨限水準可為10倍。抗CTLA-4抗體結合量可為達成對CTLA-4蛋白之50%最大結合所需之抗CTLA-4抗體的量。抗CTLA-4抗體可以允許已在細胞表面結合的CTLA-4在內吞之後再循環回至細胞表面。
本文進一步提供一種治療有需要之個體之癌症的方法，其可以包含向該個體投與抗體，該抗體對CTLA-4的結合在對應於核內體及溶酶體中所發現之pH的酸性pH下斷裂。抗CTLA-4抗體在pH 5.5下對CTLA-4展現的結合相較於pH 7.0可以減少至少3倍，且在pH 4.5下對CTLA-4展現的結合相較於pH 7.0可以減少至少10倍。相較於伊匹單抗或曲美單抗，抗CTLA-4抗體對可溶性CTLA-4之結合的減少大於細胞表面所結合或固著之CTLA-4。
本文亦提供如本文所述加以鑑別、篩選或設計的抗CTLA-4抗體。抗CTLA-4抗體可以在治療癌症之方法中投與有需要之個體，可以用於治療癌症，且可以用於製造供治療癌症用的藥劑。抗CTLA-4抗體可以與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合使用，且該等抗體可以同時或依序投與，且可以合併成單一組合物。
關於聯邦政府資助之研究或開發的聲明
本發明部分地在政府支持下依據美國國家衛生研究院授予的授權號AI64350、CA171972及AG036690完成。政府享有本發明之某些權利。
1. 定義
如本文所用，術語「抗體」係指具有「可變區」抗原識別位點之免疫球蛋白分子。術語「可變區」係指免疫球蛋白的一種結構域，該結構域不同於抗體廣泛共享之結構域(諸如抗體Fc域)。可變區包含殘基負責抗原結合之「高變區」。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(亦即，典型地為輕鏈可變域中之大約殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)及89-97 (L3)及重鏈可變域中之大約殘基27-35 (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)；參考文獻44)且可以包含「高變環」之彼等殘基(亦即，輕鏈可變域中之殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)及91-96 (L3)及重鏈可變域中之26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)；參考文獻45)。「構架區」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基之外的彼等可變域殘基。本文所揭示之抗體可為單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、合成抗體、嵌合抗體、駱駝化抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fv (sdFv)、胞內抗體，或抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如針對本發明抗體之抗Id及抗抗Id抗體)。詳言之，抗體可為免疫球蛋白分子，諸如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY，或為一類，諸如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 或IgA2 ，或為子類。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」係指抗體之一或多個部分，其含有抗體之互補決定區(「CDR」)及視情況存在的構架殘基，該等構架殘基包含抗體之「可變區」抗原識別位點且展現免疫特異性結合抗原之能力。此類片段包括Fab'、F(ab')2 、Fv、單鏈(scFv)及其突變體、天然存在之變異體，及包含抗體之「可變區」抗原識別位點及異源蛋白質(例如毒素、不同抗原之抗原識別位點、酶、受體或受體配位體等)的融合蛋白。如本文所用，術語「片段」係指一種肽或多肽，其包含至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基酸殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少100個鄰接胺基酸殘基、至少125個鄰接胺基酸殘基、至少150個鄰接胺基酸殘基、至少175個鄰接胺基酸殘基、至少200個鄰接胺基酸殘基或至少250個鄰接胺基酸殘基的胺基酸序列。
人類、嵌合或人類化抗體對於在人類活體內使用尤其較佳，然而，鼠類抗體或其他物種之抗體可有利地用於許多用途(例如活體外或原位偵測分析、急性活體內使用等)。
「嵌合抗體」為一種分子，其中抗體之不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子，諸如具有衍生自非人類抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區的抗體。包含來自非人類物種之一或多個CDR及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的嵌合抗體可使用此項技術中已知之多種技術產生，包括例如CDR移植(EP 239,400；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾或表面再塑(EP 592,106；EP 519,596；46-48)，及鏈改組(美國專利第5,565,332號)，該等所有文獻的內容皆以引用之方式併入本文中。
本發明尤其係關於「人類化抗體」。如本文所用，術語「人類化抗體」係指包含人類構架區及一或多個來自非人類(通常為小鼠或大鼠)免疫球蛋白之CDR的免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供者」且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「受者」。恆定區無需存在，但若其存在，則其必須與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，亦即至少約85-90%，較佳約95%或更高一致性。因此，可能除CDR之外，人類化免疫球蛋白之所有部分與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分實質上一致。人類化抗體為包含人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。舉例而言，人類化抗體不涵蓋典型的嵌合抗體，原因為例如嵌合抗體之整個可變區為非人類的。供者抗體係指藉由「人類化」方法達成「人類化」，原因為預期所得人類化抗體與提供CDR之供者抗體結合至相同抗原。人類化抗體可為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者的高變區殘基被來自諸如具有所需特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供者抗體)的高變區殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基被相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含不會出現在接受者抗體或供者抗體中之殘基。此等修飾可進一步改進抗體效能。人類化抗體可包含至少一個且典型兩個可變域之實質上全部，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體亦可視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，其可為免疫特異性地結合至FcγIIB多肽、已藉由引入一或多個胺基酸殘基取代、缺失或添加而改變(亦即，突變)之人類免疫球蛋白的至少一部分。
2. 抗CTLA4抗體組合物
作為單獨免疫治療劑或與另一治療劑(諸如抗PD-1抗體)組合的針對人類CTLA-4蛋白之抗體伊匹單抗已展示可增加癌症患者存活率。然而，CITE與顯著的免疫相關顯著不良效應(irAE)相關。非常需要開發出可達成較佳治療效果或較少自體免疫不良效應的新穎抗CTLA-4抗體。本發明人已發現可以驚人地用於誘導癌症排斥反應而無與免疫療法有關之顯著自體免疫不良效應的抗CTLA-4抗體。
本文提供抗體及其抗原結合片段，及包含前述各者之組合物。該組合物可為醫藥組合物。該抗體可為抗CTLA-4抗體。該抗體可為單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。該抗體亦可具單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性。該抗體可以可偵測方式標記，且可以包含所結合之毒素、藥物、受體、酶或受體配位體。
本文亦提供免疫特異性結合至CTLA-4且特定言之人類CTLA-4之抗體的抗原結合片段，其可在活細胞表面上以內源或轉染濃度表現。抗原結合片段可以結合至CTLA-4，且活細胞可為T細胞。
在一個特定實施例中，抗CTLA-4抗體可以有效地誘導Treg耗乏及Fc受體依賴性腫瘤排斥反應。在一個較佳實施例中，為了提高抗腫瘤活性，CTLA-4靶向劑將選擇性地耗乏腫瘤微環境中之Treg。在一個特定實施例中，抗CTLA-4 mAb增強Fc介導之Treg耗乏活性。Treg耗乏可藉由Fc介導之效應功能發生，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞介導之吞噬(ADCP)。Fc介導之效應功能可藉由此項技術中已知之任何方法引入或增強。在一個實例中，抗體為IgG1同型，其效應功能相較於其他同型增加。Fc介導之效應功能可藉由Fc域之胺基酸序列之突變進一步增強。舉例而言，可將三種突變(S298A、E333A及K334A)引入Fc域之CH區中，以提高ADCC活性。ADCC介導之活性所利用的抗體通常需要某種修飾以便增強其ADCC活性。有多種技術可供此利用，典型地包括對抗體進行工程改造以使得抗體Fc區中之寡醣不具有任何岩藻糖單元，從而改良對FcγIIIa受體的結合。當抗體發生去岩藻糖基化時，效應為增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。舉例而言，Biowa的POTELLIGENT®技術係使用FUT8基因剔除CHO細胞株產生100%去岩藻糖基化抗體。FUT8為編碼a1,6-岩藻糖基轉移酶之唯一基因，該酶催化岩藻糖自GDP-岩藻糖轉移至複合型寡醣之a1,6-鍵聯中的GlcNAc。Probiogen已開發出一種CHO株系，其經工程改造以在MAb上產生較低含量的岩藻糖基化聚醣，但非經由FUT基因剔除。Probiogen的系統係引入一種細菌酶，該酶係將岩藻糖重新合成路徑再導向不能被細胞代謝的糖-核苷酸。作為一種替代方法，Seattle Genetics具有一種專屬的饋料系統，其在CHO(及可能其他)細胞株中所產生之MAb上產生較低含量的岩藻糖基化聚醣。Xencor已開發出一種XmAb Fc域技術，其為了改良免疫系統排除腫瘤及其他病理學細胞而設計。此Fc域具有兩個胺基酸變化，從而對FcγRIIIa產生大40倍的親和力。其亦增加對FcγRIIa之親和力，從而潛在地募集其他效應細胞，諸如藉由吞噬及消化外來物質而起免疫作用的巨噬細胞。
在另一個實施例中，抗CTLA-4抗體可不賦予完全的CTLA-4佔據(亦即，不阻斷或不完全地阻斷)、全身T細胞活化或自體反應性T細胞之優先擴增。
在另一實施例中，抗CTLA-4抗體對CTLA-4的結合親和力在低pH下較弱且在抗體誘導的內化期間與CTLA-4解離，從而允許所釋放的CTLA-4再循環回至細胞表面且維持CTLA-4作為免疫反應負調控因子之功能。基於在晚期核內體pH5.5下為達成在pH7.0下之50%最大結合所需之抗體劑量的增加，此類抗體在pH5.5下的結合相較於pH7.0可以減少＞3倍。在溶酶體pH4.5下，此類減少達到10倍或更多。較佳地，pH5.5及pH4.5下之減少分別大於10倍及100倍。
在另一個實施例中，抗CTLA-4抗體對sCTLA-4的結合親和力減小，使得循環中之sCTLA-4可以維持其作為免疫反應之負調控因子的功能。
在一個較佳實施例中，抗CTLA-4抗體具有此等特性中之兩者或更多者。具體言之，抗CTLA-4抗體選擇性地耗乏腫瘤微環境中之Treg而不拮抗(亦即，耗乏或阻斷)膜結合或可溶性CTLA-4的功能，使得其可以維持免疫反應負調控因子的功能。
3. 設計及選擇抗體之方法
本文進一步提供新穎抗CTLA-4抗體的設計及/或選擇，以及藉由合併本文所述抗體之功能特徵或屬性來工程改造抗體以增強現有抗CTLA-4抗體之抗腫瘤功效及/或毒性分佈的方式。具體言之，提供增強抗CTLA-4抗體之Treg耗乏活性以增加CITE且減少抗體所結合CTLA-4之核內體運輸及摧毀以藉由允許CTLA-4再循環至細胞表面來改良毒性分佈的方法。在一個最佳實施例中，抗CTLA-4抗體係為了改良Treg耗乏活性與CTLA-4再循環活性而設計或經工程改造。由於抗人類CTLA-4抗體傾向於不與來自諸如小鼠之其他物種之CTLA-4交叉反應，因此應理解，此類測試必須使用人類CTLA4系統，諸如人類細胞、經人類CTLA-4轉染之細胞或表現人類CTLA-4的基因轉殖動物模型，諸如本文所述之人類CTLA-4基因敲入小鼠。在一個實施例中，抗體係為了增強腫瘤環境內之Treg耗乏而設計。此類抗體可使用本文所述之任一種活體外或活體內方法測試或選擇。舉例而言，將腫瘤細胞株連同抗CTLA-4抗體一起注射至人類CTLA-4基因敲入小鼠中，且在稍後時間點移除腫瘤浸潤Treg且計數，且與陰性或陽性對照進行比較。
在另一個實施例中，抗體係為了降低其誘導毒性(特定言之，irAE)之能力而設計。此最佳在活體內使用表現人類CTLA-4之動物模型來測試。在一個較佳實施例中，將單獨或組合之抗CTLA-4抗體投與圍產期或新生兒期的小鼠以確定其誘導irAE的能力。毒性或irAE讀數包括減少的體重增加、血液學(CBC)、組織病理學及存活率。
如本文中所證實，作為其減少irAE之能力的替代分析，可分析抗CTLA-4抗體在核內體(酸性) pH下釋放CTLA-4的能力。在一個實施例中，此可在活體外藉由分析在pH範圍內結合CTLA-4分子之能力來確定。更具體言之，可以添加有限劑量之抗CTLA-4抗體以確定在低pH下為了達成在pH 7.0下所達成之50%最大結合而需要的量。在另一個實施例中，此可以在活體外使用細胞來分析，藉此追蹤抗CTLA-4接合之後的細胞表面CTLA-4內化及細胞內定位及運輸。在一個實施例中，可以對CTLA-4蛋白之定位與核內體標記物(例如LysoTracker)進行比較，其中與核內體標記物共定位表示核內體降解及缺乏再循環，此又與誘導irAE的能力相關。在另一實施例中，內化之CTLA-4再循環至細胞表面之能力可使用螢光-CTLA-4蛋白來分析，其中再循環回至細胞表面與減少irAE之能力相關。在另一實施例中，內化之CTLA-4再循環至細胞表面及減少irAE之能力可藉由與用於再循環核內體之標記物(諸如Rab11)共定位來分析。
在另一實施例中，抗體係為了減少對可溶性CTLA-4 (sCTLA-4)的結合或阻斷而設計或選擇。此可以在活體外藉由測試可溶性CTLA-4分子(諸如CTLA-4-Fc)結合至其天然配位體(B7-1或B7-2)或固著於培養盤或細胞表面上之另一抗CTLA-4分子的能力來測試。在一個較佳實施例中，可溶性CTLA-4分子經標記以便可偵測其在結合之後之存在。
4. 治療方法
本發明進一步係關於本文所述之抗體組合物用於上調免疫反應之用途。治療癌症及慢性感染時特別需要免疫系統上調，且因此本發明在此類病症之治療中具有效用。如本文所用，術語「癌症」係指細胞之異常不可控生長而引起之贅生物或腫瘤。「癌症」明確包括白血病及淋巴瘤。術語「癌症」亦指涉及具有轉移至遠端位點之潛力之細胞的疾病。
因此，本發明的方法及組合物亦可適用於治療或預防多種癌症或其他異常增殖性疾病，包括(但不限於)以下：癌瘤，包括膀胱、乳房、結腸、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰臟、胃、子宮頸、甲狀腺及皮膚之癌瘤；包括鱗狀細胞癌；淋巴譜系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯克特淋巴瘤(Berketts lymphoma)；骨髓譜系之造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精細胞癌、畸胎上皮癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及許旺細胞瘤；間葉細胞來源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精細胞癌、甲狀腺濾泡性癌症及畸胎癌。亦預期，由細胞凋亡中之畸變引起之癌症應亦藉由本發明之方法及組合物治療。此類癌症可包括(但不限於)濾泡淋巴瘤、具有p53突變之癌瘤、乳房、前列腺及卵巢之激素依賴性腫瘤，及諸如家族性腺瘤性息肉病之癌前病變，及骨髓發育不良症候群。在特定實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或防治卵巢、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、胰臟或子宮中之惡性疾病或增殖異常變化(諸如化生及發育不良)或過度增殖病症。在其他特定實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或防治肉瘤、黑色素瘤或白血病。
在本發明之另一實施例中，抗體組合物及其抗原結合片段可與另一抗腫瘤療法一起使用，該抗腫瘤療法可選自(但不限於)當前標準及實驗化學療法、激素療法、生物學療法、免疫療法、輻射療法或手術。在一些實施例中，本發明之分子可與治療或預防有效量之一或多種藥劑、治療性抗體或熟習此項技術者已知之其他藥劑組合投與以便治療或預防癌症、自體免疫疾病、感染性疾病或中毒。此類藥劑包括例如以上論述之生物學反應調節劑、細胞毒素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、抗有絲分裂劑或免疫治療劑中之任一者。
在本發明之較佳實施例中，抗體組合物及其抗原結合片段可與另一抗腫瘤免疫療法一起使用。在此類實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與干擾或增強替代性免疫調節路徑之分子(諸如TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H1、PD-1、B7-H3、B7-H4、LIGHT、BTLA、ICOS、CD27或LAG3)或調節效應分子(諸如細胞介素(例如IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、GF-b、IFNg、Flt3、BLys)及趨化因子(例如CCL21))之活性的分子組合投與。特定實施例包括雙特異性抗體，其包含本文所述之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，以及抗PD-1 (派立珠單抗(pembrolizumab)(Keytruda)或尼沃單抗(Opdivo))、抗B7-H1(阿特珠單抗(atezolizumab)(Tecentriq)或德瓦魯單抗(Imfinzi)、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。在另一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與活化免疫反應之不同階段或方面以便達成較廣泛免疫反應的分子(諸如IDO抑制劑)組合投與。在更佳的實施例中，在不加重自體免疫副作用之情況下，將抗體組合物及其抗原結合片段與抗PD-1或抗4-1BB抗體組合。
本發明之另一實施例包括雙特異性抗體，其包含結合至CTLA4之抗體，該抗體與結合另一免疫刺激分子之抗體橋接。特定實施例包括包含本文所述之抗CTLA4抗體組合物及抗PD-1、抗B7-H1、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB的雙特異性抗體。本發明進一步係關於此類抗體用於治療癌症之用途。
5. 產生
本文所述之抗CTLA4抗體及其抗原結合片段可以使用真核表現系統製備。表現系統可需要載體在哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表現。系統亦可為病毒載體，諸如可以用於感染真核細胞的複製缺乏型逆轉錄病毒載體。抗體亦可由穩定細胞株產生，該穩定細胞株利用載體或已整合於細胞基因組中之載體之一部分表現抗體。穩定細胞株可利用所整合之複製缺乏型逆轉錄病毒載體表現抗體。表現系統可為GPEx™。
本文所述之抗CTLA4抗體及其抗原結合片段可使用例如層析法(諸如親和層析法、離子交換層析法、疏水相互作用層析法、DEAE離子交換法、凝膠過濾法及羥磷灰石層析法)純化。在一些實施例中，抗體可經工程改造以含有另一結構域，該另一結構域含有允許多肽捕捉於親和基質上之胺基酸序列。舉例而言，包含免疫球蛋白域之Fc區的本文所述之抗體可使用蛋白質A或蛋白質G管柱自細胞培養上清液或細胞質提取物中分離。另外，可使用標籤(諸如c-myc、血球凝集素、聚組胺酸或Flag™ (Kodak))來幫助抗體純化。此類標籤可插入多肽序列內之任何位置，包括在羧基或胺基末端插入。可適用之其他融合物包括有助於偵測多肽之酶，諸如鹼性磷酸酶。免疫親和層析亦可用於純化多肽。
6. 醫藥組合物
本發明進一步關於一種醫藥組合物，其包含治療有效量之上述抗CTLA4抗體組合物或其抗原結合片段中之任一者及生理學上可接受之載劑或賦形劑。較佳地，本發明之組合物包含預防或治療有效量之抗CTLA4抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
在一個特定實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之管制機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑，或與治療劑一起投與之媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。當靜脈內投與醫藥組合物時，水為較佳載劑。亦可使用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑，諸如泊洛沙姆(Poloxamer)或聚山梨醇酯，或pH緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、藥丸、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似物之形式。
一般而言，本發明組合物之成分可分開供應或混合在一起以單位劑型提供，例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式於指示活性劑之量之氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中供應。當藉由輸注投與組合物時，可用含有無菌醫藥級水或生理食鹽水之輸液瓶分配組合物。當藉由注射投與組合物時，可提供具有注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿，以使得該等成分可在投與前混合。
本發明之組合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括(但不限於)用陰離子形成之彼等物，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之彼等物；及用陽離子形成之彼等物，諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等之彼等物。
本文所述之抗CTLA-4抗體組合物或其抗原結合片段亦可調配成凍乾形式以便長期儲存，尤其在室溫下長期儲存。凍乾調配物特別適用於皮下投與。
7. 投藥方法
投與本文所述組合物的方法包括(但不限於)非經腸投藥(例如皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及黏膜(例如鼻內及經口途徑)。在一個特定實施例中，肌內、靜脈內或皮下投與本發明之抗體。該等組合物可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射、藉由上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收且可與其他生物學活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部的。
實例 實例1
抗CTLA-4 mAb藉由不依賴於檢查點阻斷、但依賴於宿主Fc受體的機制引起腫瘤排斥反應。
材料及方法
動物
在小鼠內源Ctla4 基因座之控制下表現與人類CTLA-4蛋白具有100%一致性之CTLA-4蛋白的CTLA4 人類化小鼠已有描述[38]。將同型接合基因敲入小鼠(Ctla4h / h )與C57BL/6背景回交至少10代。藉由使Ctla4h / h 小鼠與野生型(WT) BALB/c或C57BL/6小鼠雜交來產生異型接合小鼠(Ctla4h / m )。WT C57BL/6小鼠購自Charles River Laboratories。人類臍帶血CD34+ 幹細胞重建的NSG™小鼠獲自Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine)。分析中包括所有動物(雌性與雄性，6-16週齡，各實驗中年齡匹配)，且不使用不知情或隨機分組，但其中小鼠隨機分配至各組。所有小鼠皆在國立兒童醫學中心兒童研究所動物研究機構(Research Animal Facility, Children's Research Institute, Children's National Medical Center)維護。涉及小鼠之所有研究均由機構動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
細胞培養
此研究中所用之細胞株均未列舉於國際細胞株鑑別委員會(International Cell Line Authentication Committee，ICLAC)提出之交叉污染或未鑑別細胞株之資料庫中。經小鼠或人類B7-1或B7-2轉染的CHO細胞及L929細胞先前已有描述[20，29]。經B7-1轉染之J558細胞[22]、經B7-H2-GFP轉染的P815細胞[50]先前已有描述。鼠類結腸腫瘤細胞株MC38先前已描述[5]。黑色素瘤細胞株B16-F10 (ATCC® CRL-6475™)及HEK 293T細胞(ATCC® CRL-11268™)最初購自ATCC (Manassas, VA, USA)。自供應商接收之後，使細胞傳代在活體內測試之前保持最小。所有細胞株均在37℃下培育且在含有5% CO2 的氛圍中維持。使細胞在補充有10% FBS (Hyclone)、100個單位/毫升青黴素及100 µg/mL鏈黴素(Gibco)之DMEM (杜爾貝科氏改良之伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)，Gibco)中生長。
抗體
小鼠抗人類CTLA-4 mAb L3D10已有描述[15]。研究中所用的抗CTLA-4 mAb L3D10為由人類IgG1 Fc及L3D10可變區組成的嵌合抗體。重組WT (M1)及突變型(M17，M17-4) hCTLA-4蛋白以及重組抗體(包括親代及完全人類化L3D10 (純系HL12及HL32))係由Lakepharma, Inc (Belmont, CA, USA)產生。具有WC500109302及http://www.drugbank.ca/drugs/DB06186中所揭示之胺基酸序列的重組伊匹單抗係由Alphamab Inc. (中國江蘇蘇州)或Lakepharma Inc (San Francisco, CA, USA)利用剩餘臨床樣品提供。人類IgG-Fc (無疊氮化物)自Athens Research and Technology (Athens, GA, USA)批量訂購。抗小鼠CD16/32 mAb 2.4G2、抗小鼠B7-1mAb 1G10、抗小鼠B7-2 mAb GL1、抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9及9H10、對照倉鼠IgG、對照小鼠IgG2b MPC-11及人類CTLA-4-Fc購自Bio-X-Cell Inc. (West Lebanon, NH USA)。純化之倉鼠抗小鼠Ctla-4 mAb 4F10購自BD Biosciences (San Jose, CA, USA)。活體外阻斷分析中使用的經純化且經生物素標記之倉鼠IgG同型對照抗體購自eBioscience (San Diego, CA, USA)。用於人類B7-1-Fc、B7-2-Fc及聚組胺酸標記之人類CTLA-4的融合蛋白購自Sino Biological Inc. (中國北京)。重組小鼠Ctla-4Fc蛋白購自BioLegend (San Diego, CA, USA)。根據製造商說明書，藉由使EZ連接的磺酸基-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific)與所需蛋白質結合來完成生物素標記。Alexa Fluor 488結合之山羊抗人類IgG (H+L)交叉吸附二次抗體購自ThermoFisher Scientific,USA。依循製造商方案，利用細胞測量術珠粒陣列(Cytometric Beads Array，BD Biosciences，目錄號560485)評估細胞介素IL-4、IL-6及IL-10的含量。SIY肽購自MBL International Corporation (Woburn, MA, USA)，且SIY特異性CD8 T細胞係藉由H-2Kb 四聚體SIYRYYGL-PE (MBL代碼#TS-M008-1)偵測。NIH提供的H-2Kb 四聚體OVA (SIINFEKL)-PE (#31074)作為陰性對照用於流式染色。
B7 - CTLA - 4 相互作用之活體外及活體內阻斷分析
採用三種分析來評估抗CTLA-4 mAb之阻斷活性。首先，用CTLA-4-Fc或其配位體B7-1塗佈培養盤。經生物素標記之融合蛋白在結合分析中於可溶相中使用，其中藉由辣根過氧化酶(HRP)結合之抗生物素蛋白(Pierce高敏感性中性抗生物素蛋白-HRP，Thermo Scientific Inc.)量測所結合之蛋白質的量)。在4℃下塗佈存在於碳酸氫鹽緩衝液(0.1 M)中的蛋白質且在室溫下進行結合分析。
第二，利用流式細胞術偵測經生物素標記之融合蛋白對CHO細胞的結合，該等CHO細胞經轉染以在細胞表面上表現小鼠或人類B7-1及B7-2。在由105 μl PBS溶液組成之各分析中，將1.2×105 個CHO細胞與200 ng經生物素標記之人類或小鼠CTLA-4蛋白以及不同劑量之抗人類或小鼠CTLA-4 mAb或對照IgG一起在室溫下培育30分鐘。使用購自BioLegend (San Diego, CA, USA)之與藻紅蛋白(PE)結合的抗生蛋白鏈菌素來量測所結合之受體的量。使用FACS CantoII (BD Biosciences)進行流式細胞術，且藉由FlowJo (Tree Star Inc.)分析資料。
第三，抗CTLA-4 mAb引起的B7-1及B7-2上調用作阻斷B7-1-CTLA-4及B7-2-CTLA-4相互作用之讀數。簡言之，年齡及性別匹配之小鼠腹膜內接受500 µg抗體或其對照物。注射之後24小時，處死小鼠且將其脾細胞用針對CD11c (純系N418)、CD11b (純系M1/70)、B7-1 (純系16-10-A1)及B7-2 (純系PO3.1)之抗體及購自eBioscience Inc (San Jose, CA, USA)之同型對照Ab染色。用人類CD34+ 臍帶血細胞重建之NSGTM 小鼠接受相同劑量之抗體。使脾臟嚙合於兩個顯微鏡毛面載片之間，且接著在37℃下、在含有100 μg/ml膠原蛋白酶IV型及5 U/ml去氧核糖核酸酶I之5 ml緩衝液中培育20分鐘。藉由將消化的結節輕輕地推移通過細胞過濾器來製備細胞懸浮液，且用特異性針對以下標記物的抗體染色：hB7-1：純系2D10 (Biolegend目錄號305208)；hB7-2：純系IT2.2 (BioLegend，目錄號305438)；hCD11c：純系3.9 (BioLegend，目錄號301614)；HLA-DR：純系L243 (BioLegend，目錄號307616)；hCD45：純系HI30 (BioLegend，目錄號304029)。
轉胞吞分析及細胞 - 細胞相互作用分析
具有經GFP (C-GFPSpark標籤)標記之人類B7-2/B7-1及經OFP (C-OFPSpark標籤)標記之人類CTLA-4 cDNA的質體購自Sino Biological Inc. (中國北京)且用於建立表現任一分子的穩定CHO細胞株。為了量測抗CTLA-4 mAb對轉胞吞的抑制，利用Pierce™ Fab製備套組(Thermo Scientific, USA)、依循製造商說明書製備Fab片段。將指定劑量的Fab或對照hIgG-Fc蛋白添加至表現經GFP標記之B7-2的CHO細胞中，隨即與表現經OFP標記之CTLA-4的CHO細胞在37℃下共培養4小時。
使用編碼經OFP標記之人類CTLA-4或人類CTLA4Y201V cDNA的質體建立穩定的HEK293T細胞株。在15 mL離心管中培養懸浮液隔夜之後，將B7-GFP標記之CHO細胞及CTLA4Y201V -OFP標記之HEK293T細胞以約2:1比率在4℃下共培育2小時。將指定劑量的Fab或對照hIgG-Fc蛋白添加至混合細胞中，隨即將其共培養。在轉胞吞與細胞-細胞相互作用分析中，各單一測試中使用1×105 個經B7-GFP標記之CHO細胞。藉由流式細胞術，基於經CTLA-4-OFP轉染之CHO細胞或CTLA4Y201V -OFP轉染之HEK293T細胞擷取來自經B7-GFP轉染之CHO細胞的GFP信號來測定轉胞吞及細胞-細胞相互作用之量。
下式用於兩種分析中之計算：
轉胞吞或細胞-細胞相互作用%
= (GFP+ OFP+ %)/( GFP+ OFP+ %+ GFP- OFP+ %)
B7 - CTLA - 4 相互作用動力學
Lakepharma Inc.用Octet Red96在25℃下進行結合實驗。經生物素標記之B7-1-Fc或CTLA-4-Fc捕捉於抗生蛋白鏈菌素(SA)生物感測器上。接著將負載之生物感測器浸漬於不同濃度(300 nM起始，1:3稀釋，7個點)之B7-1-Fc或CTLA-4-Fc稀釋液中。締合速率常數ka描述在CTLA-4-Fc或B7-1-Fc之1 M溶液中每秒形成之B7-1-CTLA-4複合物的數目。
抗 CTLA - 4 mAb 對 預形成之 B7 - CTLA - 4 複合物的影響
在ELISA實驗中，將hB7-1-Fc或hB7-2-Fc於塗佈緩衝液中以指定濃度在96孔高結合聚苯乙烯盤上預塗隔夜。洗掉未結合之蛋白質之後，培養盤用含有1%BSA的PBST阻斷且接著與0.25 µg/ml經生物素標記之CTLA-4-Fc蛋白一起培育兩小時。洗掉未結合之蛋白質之後，添加指定劑量之hIgG-Fc/伊匹單抗/L3D10且培育2小時。利用HRP結合之抗生蛋白鏈菌素偵測培養盤所結合的經生物素標記之CTLA-4-Fc。在流式細胞術分析中，將表面表現hB7-1或mB7-2的CHO細胞(1×105 /測試)與經生物素標記之可溶性CTLA-4-Fc (200 ng/測試)一起在室溫下培育30分鐘。洗滌之後，將細胞連同指定劑量的對照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb一起在100 µl DPBS緩衝液中培育指定分鐘數。使用PE-抗生蛋白鏈菌素，藉由流式細胞術偵測B7所結合之CTLA-4-Fc的量，且利用三重複樣品計算PE之平均螢光強度(MFI)。
腫瘤生長及消退分析
用指定數目個結腸直腸癌細胞MC38或黑色素瘤細胞株B16-F10攻擊人類CTLA4 基因異型接合或同型接合基因敲入的小鼠。腫瘤細胞以指定劑量注射之後的第2、7或11天起始免疫療法。以腫瘤體積作為讀數來測定腫瘤生長及消退。使用下式計算體積(V)。
V=ab 2 /2，其中a 為長直徑，而b 為短直徑。
生物統計
用於分析各組實驗之特定測試在圖式圖例中指示。對於各統計分析而言，基於資料是否呈正態分佈(使用夏皮羅-威爾克檢驗(Shapiro-Wilk test))來選擇適當檢驗。利用對兩個群組之間進行比較的不成對雙尾史都登氏t檢驗或曼-惠特尼檢驗、單向或雙向ANOVA (變異數分析)聯合多重比較用的絲達克校正(Sidak's correction)、行為測試用的雙向重複量測ANOVA來分析資料。基於文獻及過去經歷，選擇具有足夠統計能力之樣品大小。無樣品自分析排除，且除指定者外，實驗不隨機分組。動物組不進行盲法分配，但對於研究中進行的一些量測(亦即，腫瘤尺寸量測、對B7表現進行的流式細胞術分析)而言，進行盲法分配。圖中，y軸誤差條表示S.E.M.或S.D.，如所指示。利用Excel (Microsoft)、GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, San Diego, California)或R軟體(https://www.r-project.org/)進行統計學計算。
結果
若B7呈現於質膜上，則伊派利單抗不阻斷B7-CTLA-4相互作用
為了更好的比較，使用小鼠抗人類CTLA-4 mAb (L3D10) [15]之可變區產生具有與伊匹單抗(人類IgG1) [14]相同之同型的嵌合抗人類CTLA-4 mAb。嵌合體抗體具有2.3 nM之表觀親和力，其類似於伊匹單抗(1.8-4 nM) [14、16]。該兩種抗體基於其對突變型CTLA-4分子之結合、以不同方式結合至人類CTLA-4上之重疊抗原決定基(圖1)。與先前報導[14]一致，當使用所固著之CTLA-4與可溶性B7-1相互作用時，伊匹單抗強有力地抑制B7-1-CTLA-4相互作用，此類似於L3D10 (圖2A)。由於B7-1及B7-2充當細胞表面共刺激分子，故使用所固著之人類B7-1及B7-2評估抗CTLA-4抗體之阻斷。如圖3A中所示，伊匹單抗不阻斷CTLA-4-Fc結合至培養盤所固著之hB7-1，即使在極高濃度(800 µg/ml)下使用時。阻斷的缺乏不歸因於重組伊匹單抗之批次變化，因為相同結果係使用得自三個獨立來源(包括臨床中使用之藥物)之市售伊匹單抗獲得。相比之下，L3D10展示在低至0.2 µg/ml之濃度下顯著阻斷培養盤所固著的hB7-1結合，在約3 µg/ml下達成50%抑制(IC50 )。因此，當B7-1固著於培養盤上時，L3D10阻斷B7-1-CTLA-4相互作用的效率為伊匹單抗的至少1,000倍。在配位體及受體濃度之寬範圍內，伊匹單抗明顯缺乏阻斷活性(圖3B及3C)。培養盤所固著之B7-2對CTLA-4-Fc的結合在某種程度上更容易被伊匹單抗阻斷，儘管在約200 µg/ml之高IC50 下(圖3D)。由於IC50為3 mg/kg有效劑量所達成之穩定血漿含量[7] (19.4 µg/ml，基於伴隨產物插入片段)的10倍，因此臨床劑量不大可能顯著阻斷B7-2-CTLA-4相互作用。在B7 - 2及CTLA-4蛋白濃度的寬範圍內觀測到伊匹單抗的弱阻斷活性(圖3E及3F)。又，在IC50 為0.1 µg/ml的情況下，L3D10阻斷B7-2-CTLA-4相互作用的效率為伊匹單抗的約2,000倍。B7-1與B7-2之間的細微差異或許可以藉由如下事實解釋：B7-2-CTLA-4相互作用具有較高的解離速率[17]，而非不同的結合位點結構，因為B7-1-CTLA-4及B7-2-CTLA-4複合物的結構分析展示極其相似的相互作用[18-19]。
為了證實此驚人的觀測結果，使用表現B7結合FcR之中國卵巢細胞(CHO) [20]。使用經生物素標記之CTLA-4-Fc來評估兩種抗人類CTLA-4 mAb之阻斷活性。又，雖然L3D10有效阻斷CTLA-4-Fc結合至經B7-1轉染的CHO細胞，但伊匹單抗即使在512 µg/ml下使用時亦未能阻斷(圖3G)。雖然效力比L3D10小得多，但高劑量的伊匹單抗對人類CTLA-4與小鼠B7-1 (mB7-1)之間的相互作用達成約25%阻斷(圖2C)。雖然伊匹單抗對CTLA-4-Fc結合至經B7-2及FcR轉染之CHO細胞達成一些阻斷，但觀測到小於50%抑制，即使使用512 µg/ml的伊匹單抗時(圖3H)。一個潛在的問題在於，生物素標記可能影響伊匹單抗對CTLA-4-Fc的結合。為了解決此擔憂，比較L3D10與伊匹單抗對阻斷研究中所用之經生物素標記之CTLA-4-Fc的結合。如圖2B中所示，伊匹單抗結合經生物素標記之CTLA-4-Fc的效率高於L3D10。因此，伊匹單抗阻斷失敗不歸因於對經生物素標記之CTLA4-Fc的結合不足。當使用聚組胺酸標記之CTLA-4與經B7-1轉染之CHO細胞相互作用時觀測到類似模式(圖2D)。為了排除FcR在細胞表面上之可能作用，使用表現hB7-1的FcR陰性L929細胞。如圖2E中所示，L3D10而非伊匹單抗阻斷CTLA-4結合至細胞表面B7-1。另外，當LPS成熟的脾臟樹突狀細胞用作B7來源時，亦觀測到伊匹單抗缺乏阻斷(圖3I)。綜合而言，資料表明伊匹單抗阻斷B7-CTLA-4相互作用的能力高度依賴於所用分析形式，其中若使B7-1及B7-2固著，則阻斷活性最小直至偵測不到，而L3D10為B7-CTLA-4相互作用之穩定阻斷劑，不論是否固著B7蛋白。
由於CTLA-4與B7在活體內共存且以動態方式相互作用，因此高效阻斷需要裂解預先存在的B7-CTLA-4複合物。為了解決此問題，首先允許B7與經生物素標記之CTLA-4-Fc形成複合物。洗掉未結合之CTLA-4之後，添加分級劑量的伊匹單抗或L3D10。培育兩個多小時之後，洗掉抗體及未結合的蛋白質，且藉由HRP結合的抗生蛋白鏈菌素來偵測剩餘所結合的CTLA-4分子。如圖4A中所示，雖然L3D10強有力地斷裂預先存在的B7-1-CTLA-4複合物，但伊匹單抗卻未能如此。同樣，雖然高劑量的伊匹單抗使B7-2-CTLA-4複合物部分地裂解，但其效率比L3D10小250倍(圖4B)。
作為評估抗CTLA-4抗體對細胞表面上預先形成之B7-CTLA-4複合物之影響的第一步驟，藉由將表現B7之CHO細胞與經生物素標記之CTLA-4-Fc蛋白一起在4℃下培育0至120分鐘、經由流式細胞術來評估該複合物之穩定性。洗掉所解離之CTLA-4-Fc之後，使用PE結合的抗生蛋白鏈菌素量測細胞所結合的CTLA-4-Fc。如圖4C中所示，表現B7-1之CHO細胞上之CTLA-4-Fc的量在120分鐘之整個研究持續時間期間保持不變，從而允許吾人測試抗CTLA-4抗體對分裂預先形成之B7-1-CTLA-4複合物的影響。相比之下，B7-2-CTLA-4-Fc複合物在15分鐘內快速解離，其中大部分複合物在30分鐘內崩潰(圖4C)。快速解離使得在此等分析中評估抗CTLA-4 mAb對預先形成之B7-2-CTLA-4複合物的影響變得不可能。如圖4D中所示，伊匹單抗對分裂細胞表面上預先形成之B7-1-CTLA-4複合物的影響最小。
由於CTLA-4對B7的親和力高於CD28-Fc [17，21]，因此阻斷CTLA-4可以減輕其對CD28-B7相互作用的抑制。為了測試L3D10及伊匹單抗是否能逆轉此抑制，逐量添加各抗體或對照IgG-Fc以及經生物素標記之CD28-Fc及未標記之CTLA-4-Fc，且量測CD28-Fc對經B7-1轉染之J558細胞的結合[22]。如圖4E中所示，L3D10而非伊匹單抗顯著地拯救B7-CD28相互作用。伊匹單抗不能使預先形成的複合物斷裂表明，B7-CTLA-4相互作用動力學係伊匹單抗阻斷活性之關鍵決定因素。因此，藉由使用所固著之B7-1或CTLA-4來評估B7-CTLA-4相互作用動力學。如圖4F中所示，當使B7-1固著時，二價B7-1-Fc及CTLA-4-Fc之表觀親和力為9.9x10- 10 M，其稍微高於當CTLA-4-Fc固著時之表觀親和力(1.5x10- 9 M)(圖4G)。值得注意的是，CTLA-4對所固著之B7-1的結合速率Kon=5.9x106 (1/Ms)(圖4F)為B7-1對所固著之CTLA-4之結合速率(其為1.4x106 (1/Ms))(圖4G)的4倍高(P=0.0015)。當B7存在於溶液中時，B7-CTLA-4複合物之較慢形成可允許伊匹單抗在對伊匹單抗之分裂作用具抗性的B7-CTLA-4複合物形成之前佔據CTLA-4，從而提供調和伊匹單抗之分析依賴性阻斷活性的機制。另一方面，L3D10可以使預先形成之複合物裂解，且從而可以阻斷CTLA-4-B7相互作用，不論本文中使用的條件。
伊匹單抗不能有效阻斷B7-CTLA-4介導的細胞-細胞相互作用及CTLA-4對B7-1及B7-2的轉胞吞
大部分CTLA-4分子經由AP-2介導之機制而駐留於細胞內部[23-24]。為了量測抗CTLA-4 mAb是否可以阻斷B7-CTLA-4相互作用(當其均穩定表現於細胞表面上時)，將Y201V突變引入CTLA-4中以消除其自發內吞且從而允許穩定的細胞表面表現[25](圖5A)。如圖6A中所示，表現B7-1-GFP或B7-2-GFP之CHO細胞與表現CTLA-4Y201V -OFP之HEK293T細胞藉由流式細胞術可明顯區分。當其在FACS分析之前即刻混合時，幾乎觀測不到任何GFP+ OFP+ 細胞。為了比較伊匹單抗與L3D10阻斷細胞-細胞相互作用之能力，自兩種抗體製備Fab片段(圖6B)以避免CTLA-4分子交聯所引起之間接影響。抗體Fab對經OFP標記之CTLA-4穩定轉染的細胞展示類似的結合(圖6C及3D)。在4℃下在阻斷抗體不存在下共培育2小時之後，大部分OFP+ 細胞在表現B7-GFP之細胞的相等強度下獲得GFP (圖6E及3G)。值得注意的是，GFP+ OFP+ 細胞具有與細胞叢一致之前向及側向散射(圖5B)。如圖6E及6F中所示，L3D10而非伊匹單抗Fab達成對B7-1-GFP-CTLA-4Y201V 相互作用之有效阻斷。同樣，雖然10 µg/ml伊匹單抗Fab對細胞B7-2與CTLA-4相互作用僅達成15%抑制，但相同劑量的L3D10 Fab引起80%抑制(圖6G及6H)。
已證明CTLA-4介導細胞表面B7-2之轉胞吞[12]。此等發現為吾人提供另一分析來量測抗CTLA-4 mAb在更多生理學相關條件下之阻斷活性。使用經GFP標記之B7或經OFP標記之CTLA-4轉染的CHO細胞(圖7A)。使用經螢光蛋白標記的受體及配位體允許無人定量其在活細胞中之相互作用。為確保CTLA-4-OFP+細胞被B7-2-GFP+細胞包圍，添加過量的B7-2-GFP+細胞。如圖7B中所示，在37℃下的共培育引起表現CTLA-4與B7-2之新細胞群發生時間依賴性聚積。此聚積在共培育之後的第4小時達到峰值。由於基本上所有的OFP+細胞已隨時間推移變為OFP+GFP+，同時GFP+OFP-細胞之百分比在整個共培育中保持不變，因此雙陽性細胞之出現係歸因於藉由經CTLA-4-OFP轉染之CHO細胞對B7-2-GFP的吸收，如所預期。與此解釋一致，OFP+GFP+之散射體係單一細胞之散射體(圖10C)。作為對照，將CTLA-4-OFP轉染物與B7-H2-GFP轉染物共培養。如圖7C中所示，在4小時時段期間未觀測到GFP信號可偵測地轉移至CTLA-4-OFP轉染物，從而證實該分析之特異性。已建立該模型後，比較L3D10與伊匹單抗Fab對轉胞吞之影響。如圖7D及4E中所示，L3D10 Fab阻斷B7-1轉胞吞之效率為伊匹單抗Fab的約10倍。類似地，L3D10 Fab阻斷B7-2轉胞吞的效率高約30倍(圖7F及7G)。應注意，雖然L3D10 Fab有效地阻斷B7-2轉胞吞(IC50=1 µg/ml)，但伊匹單抗Fab在10 µg/ml下使用時對B7-1轉胞吞達成小於20%抑制(圖7E)且對B7-2轉胞吞達成僅30%抑制(圖7G)。以莫耳比計，此劑量等於30 µg/ml完整伊匹單抗，比臨床中使用有效劑量之伊匹單抗(3 mg/kg)時的穩態血漿藥物濃度高約50%[7]。
伊匹單抗不阻斷 CTLA-4活體內下調 B7-1/B7-2
在其他潛在機制中，CTLA-4主要表現於Treg中，其中其藉由下調樹突狀細胞(DC)上之B7-1及B7-2表現來抑制自體免疫疾病[26]。由於Ctla4 之靶向突變[26]及用阻斷抗CTLA-4 mAb處理[12]均增加DC上之B7-1及B7-2表現，因此已表明Treg上之CTLA-4生理學功能經由轉胞吞下調DC上之B7 [12，27]。因此，阻斷B7-CTLA-4相互作用之直接結果為DC上之B7上調。為了評估活體內抗CTLA-4 mAb阻斷活性，將極高劑量之抗CTLA-4 mAb (500 µg/小鼠，其為約25 mg/kg或為臨床中所用之最高伊匹單抗劑量的＞8倍，3 mg/kg)注射至Ctla4h / h 或Ctla4h / m 小鼠中且收集脾細胞以量測在注射之後第24小時之CD11c高 DC上之B7-1及B7-2含量。如圖8C、圖8D及圖8E中所示，相較於接受人類IgG1-Fc之Ctla4h / h 小鼠，經L3D10處理之之小鼠的DC展示B7-1之適度但統計學顯著之升高及B7-2之穩定上調。B7-2之上調量值與使用人類Treg-DC共培養物中之阻斷抗CTLA-4 mAb達成之量值類似[12，27]。另一方面，伊匹單抗未能活體內上調B7-1及B7-2。為了排除污染性LPS之潛在影響，量測抗體製劑中之內毒素含量，展示其在0.00025-0.0025 ng/µg之間，且比IgG Fc對照物低2-10倍，IgG Fc對照物在活體內不引起B7-1及B7-2上調(圖9)。
由於Ctla4h / m 小鼠中之至少50% CTLA-4蛋白具有小鼠來源且不結合至抗人類CTLA-4抗體(圖10)，但在功能上與小鼠B7-1及B7-2交叉反應[28-30]，且由於轉胞吞僅需要Treg上之一些未阻斷之CTLA-4分子，因此未結合之CTLA-4應下調DC上之B7，即使在阻斷性抗人類CTLA-4 mAb存在下。實際上，兩種抗體均不引起Ctla4h / m 小鼠之DC上的B7-1及B7-2上調(圖8C、8D及8F)。Ctla4h / h 而非Ctla4h / m 小鼠中之L3D10特異性地使B7上調進一步驗證如下觀點：B7上調依賴於B7-CTLA-4相互作用之完全阻斷且排除L3D10使B7上調歸因於污染性LPS的可能性。
為了確定Ctla4h / h 小鼠中所觀測到之伊匹單抗阻斷缺乏是否能在人類T細胞與人類樹突狀細胞之間觀測到，採用人類臍帶血CD34+ 幹細胞重建之NSG™小鼠。如圖11A及11B中所示，本文所用小鼠之周邊血液係由70-90%之人類白血球組成，包括T及B淋巴球及DC。在脾臟中，觀測到FOXP3+ Treg及CD11c+ HLA-DR+ DC之頻率高(圖11C)。觀測到DC上存在hB7-2 (圖11E)而非hB7-1 (資料未展示)之顯著表現。由於人類CTLA-4高量表現於FOXP3+ Treg (圖11D)中，因此此模型用於在活體內背景下研究人類DC與Treg之間的B7-2-CTLA-4相互作用。如圖11E及11F中所示，伊匹單抗不能使DC上之B7-2表現顯著上調(P=0.22)，而經L3D10處理之小鼠的DC展示B7-2之近2.5倍更高含量(P＜0.001)，此與人類CTLA4 基因敲入小鼠資料一致。因此，在人類化小鼠之人類造血系統中，L3D10而非伊匹單抗阻斷hCTLA-4使B7-2下調。
Treg耗乏與腫瘤排斥反應皆不需要阻斷B7-CTLA-4相互作用
為了測試免疫治療作用是否需要阻斷B7-CTLA-4相互作用，首先比較L3D10及伊匹單抗誘導腫瘤排斥反應的能力。Ctla4h / h 小鼠用結腸癌細胞株MC38攻擊。當腫瘤達到直徑約5 mm之尺寸時，小鼠用劑量為10、30及100 µg/小鼠/注射的對照人類IgG-Fc、L3D10或伊匹單抗處理四次且觀測腫瘤尺寸4-6週。如圖12A中所示，雖然經對照IgG Fc處理之小鼠中的腫瘤逐漸生長，但兩種抗CTLA-4 mAb均達成完全的排斥反應，即使每隻小鼠使用低至10 µg。在多個實驗中，兩種抗體在引起腫瘤排斥反應方面類似。在另一種腫瘤模型(B16黑色素瘤)中，兩種抗體均誘導腫瘤生長出現類似的遲緩，不論抗體是否在腫瘤之前或之後投與(圖12B)。然而，抗體單一療法未達成完全的排斥反應，如公開的研究所預期[10]。
近期研究已證實，抗小鼠Ctla-4 mAb之治療功效受到Fc子類別及宿主Fc受體影響，此又選擇性地影響腫瘤微環境內之Treg之抗體依賴性耗乏[9-11]。然而，尚未測試此類耗乏是否需要阻斷B7-CTLA-4相互作用。此仍有可能，原因為此類阻斷可以上調B7 (圖8及11)，從而可以引起CD28超刺激，潛在引起T細胞發生細胞凋亡[31-32]。為了解決此問題，在排斥反應完成之前處死帶有腫瘤之小鼠，且分析接受對照Ig、伊匹單抗或L3D10之小鼠中之Treg頻率。雖然抗CTLA-4抗體皆不減少脾臟中之Treg (圖12C)，但在腫瘤微環境中卻使其減少(基於Treg之% (圖12D，上圖)及絕對數目(圖12D，下圖))。有趣的是，儘管腫瘤浸潤性FoxP3- T細胞表現CTLA-4，但其含量較低，其未被抗CTLA-4 mAb耗乏(圖13A)。腫瘤而非脾臟或淋巴結中之Treg的高效耗乏可以依據腫瘤浸潤性Treg上之高得多的CTLA-4表現來解釋(圖13B及13C)，先前研究對此亦有報導[9-11]。作為Treg耗乏的結果，CD8 T細胞相對於Treg的比率在腫瘤中選擇性地增加(圖12E)。另外，Treg耗乏與CD8及CD4 T細胞之功能成熟有關，如腫瘤微環境內(圖14A及14B)而非脾臟中(圖14C-14F)之產生干擾素γ (IFNγ)之細胞(圖12F)及產生腫瘤壞死因子α (TNFα)之T細胞增加所證明。
由於L3D10與伊匹單抗在腫瘤微環境中之Treg耗乏方面類似，故阻斷B7-CTLA-4相互作用不大可能促成Treg耗乏。另外，由於伊匹單抗在活體內似乎不阻斷B7-CTLA-4相互作用且仍對Ctla4h / 小鼠及黑色素瘤患者產生治療作用，因此其治療作用不大可能需要阻斷此相互作用。另外，由於具有顯著不同阻斷活性之兩種mAb具有類似的治療作用且在腫瘤微環境中、在選擇性Treg耗乏方面展示類似功效，因此阻斷B7-CTLA-4相互作用不會增強抗體之治療作用。為了證實此觀測結果，測試Ctla4h / m 小鼠對該兩種抗CTLA-4 mAb的治療反應，其中抗人類CTLA-4 mAb可以結合至最多50%的CTLA-4分子且其中兩種抗體皆不能阻斷B7-CTLA-4相互作用以達成樹突狀細胞上之B7上調(圖8F)。又，當使用高劑量(圖12G)或較低劑量(圖12H)抗體時，兩種抗體均引起MC38腫瘤之快速排斥反應。相應地，兩種抗體均選擇性地耗乏腫瘤微環境中之Treg (圖12I)，但不耗乏脾臟中之Treg (圖12J)。此等基因資料進一步質疑CTLA-4阻斷與腫瘤排斥反應及局部Treg耗乏的相關性，且從而對如下盛行假設提出爭議：抗CTLA-4 mAb經由阻斷B7-CTLA-4相互作用來誘導癌症免疫[4]。由於治療抗體在Treg耗乏方面皆有效，但其阻斷B7-CTLA-4相互作用的能力不同，因此假設此等抗體係藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)誘導Treg耗乏來產生腫瘤排斥反應。由於ADCC依賴於宿主效應細胞上之FcR，因此測試抗FcR抗體是否能消除腫瘤排斥反應。如圖12K中所示，並行的抗FcR處理完全抹除伊匹單抗之腫瘤免疫治療作用。
在L3D10 mAb之人類化期間，獲得兩種稱為HL12及HL32之純系，其對CTLA-4保持強結合(圖15A)，但阻斷CTLA-4結合至培養盤所結合之B7-1 (圖15B)及B7-2 (圖15C)的能力喪失，此或許歸因於解離速率及相應二價親合力的約4倍增加(表1)。
在Octet Red96系統(ForteBio)上進行多濃度動力學實驗。使抗hIgG-Fc生物感測器(ForteBio，#18-5064)在樣品稀釋劑(含0.1% BSA之PBS及0.02% Tween 20)中發生水合且在pH 1.7甘胺酸中預調節。使用7點、2倍連續稀釋度，在600 nM開始用樣品稀釋劑稀釋抗原。所有抗體用樣品稀釋劑稀釋至10 µg/ml且接著固著至抗hIgG-Fc生物感測器上維持120秒。在樣品稀釋劑中建立基線60秒之後，使生物感測器移動至含有一系列濃度之抗原的孔中以量測結合。對於樣品稀釋劑中所關注之各蛋白質而言，觀測結合120秒且觀測解離180秒。K合 ，結合速率；K離 ，解離速率；KD，平衡解離常數。
表1：此研究中所用之人類化L3D10純系的結合特徵。
相應地，此等抗體亦喪失誘導宿主APC上之B7-1及B7-2上調的能力(圖15D)。抗體阻斷可溶性B7結合至所固著之CTLA-4-Fc的能力亦被消除(圖16A)。此等人類化抗體喪失阻斷B7-CTLA-4相互作用之能力的事實向吾人提供進一步測試阻斷活性對於腫瘤排斥反應及Treg耗乏而言是否必不可少的機會。如圖15E中所示，儘管損失阻斷活性，但人類化抗體快速誘導腫瘤微環境中而非脾臟(圖15F)或引流淋巴結(圖15G)中之Treg耗乏。另外，HL12及HL32對周邊淋巴器官及腫瘤中之T細胞亞群的豐度展現的影響與L3D10類似(圖16B及16C)。更重要的是，兩種抗體在引起MC38 (圖15H)及B16 (圖15I)腫瘤之排斥反應方面與伊匹單抗及親本L3D10同樣有效。
伊匹單抗之免疫治療活性無需B7-CTLA-4相互作用
CTLA-4檢查點阻斷假設之關鍵預測為，除非存在B7以遞送負信號，否則抗CTLA-4 mAb不應賦予免疫治療作用。由於具有Cd80 (編碼B7-1)及Cd86 (編碼B7-2)之靶向突變的小鼠不具有Treg [33]且從而表現極小Ctla4，因此此預測係藉由使用飽和劑量的抗B7-1 (1G10)及抗B7-2 (GL1) mAb來測試，該等mAb分別阻斷人類CTLA-4對mB7-1及mB7-2的結合(圖17A)。如圖17B中所圖解，帶有MC38腫瘤之小鼠用伊匹單抗聯合對照Ig或抗mB7-1與抗mB7-2 mAb之組合處理。所用抗mB7 mAb因其對新抗mB7 mAb的結合性降低至在具有Cd80 與Cd86 (dKO)之靶向突變之小鼠中所觀測到之程度而完全遮蔽周邊血液白血球中之所有B7-1及B7-2(圖17C及17D)。觀測腫瘤引流淋巴結之DC存在類似的B7-2阻斷(圖17E)。然而，不論抗體處理，藉由1G10 mAb幾乎偵測不到B7-1的含量(資料未展示)，以致不可能評估內源B7-1的遮蔽程度。由於抗體對抗原的反應均需要B7-1及B7-2 [34]，且由於抗CTLA-4抗體為抗藥物抗體(ADA)之強誘導因子[5]，因此ADA為活體內B7-1與B7-2功能之良好指標。針對伊匹單抗之抗體反應被完全消除的事實進一步證實功能阻斷(圖17F)。重要的是，B7之飽和阻斷不影響伊匹單抗誘導之腫瘤排斥反應，因為抗mB7及對照Ig處理之小鼠對伊匹單抗療法有同等反應(圖17G)。因此，B7消除負信號傳導不能解釋伊匹單抗之免疫治療作用。
檢查點阻斷假設之另一關鍵預測為，抗CTLA-4 mAb釋放使初始T細胞碎裂以達成癌症免疫治療作用。由於抗B7 mAb完全消除T細胞依賴性抗體反應，因此測試抗B7 mAb之活體內處理是否防止伊匹單抗誘導Th2細胞活化。如圖18A中所示，伊匹單抗處理顯著地增強Th2型細胞介素(包括IL-4、IL-6及IL-10)之活體外產生。此因活體內抗B7 mAb處理而消除。為了測試抗B7 mAb對周邊淋巴器官中之CD8 T細胞之重新預致敏的影響，帶有腫瘤之小鼠免疫接種SIY肽且在抗B7 mAb之存在或不存在下用伊匹單抗處理小鼠。代表性分佈或SIY -H-2Kb 特異性T細胞展示於圖18B中，而得自代表性研究的總結資料呈現於圖18C中。如圖18B及18C中所示，在抗B7 mAb不存在下，免疫接種SIY肽誘導SIY特異性T細胞顯著擴增。伊匹單抗似乎使此稍微增加。然而，在抗B7 mAb存在下，未觀測到SIY特異性T細胞發生重新預致敏。由於圖17中之資料展示抗B7 mAb不干擾伊匹單抗之免疫治療作用，因此圖18中之資料表明伊匹單抗達成免疫治療作用不需要在伊匹單抗處理後進行T細胞重新預致敏。
阻斷B7-Ctla-4相互作用與抗小鼠Ctla-4 mAb之免疫治療作用不相關。
儘管未提供證明此等抗體阻斷B7-Ctla-4相互作用的資料，但基於兩種抗小鼠Ctla-4 mAb [35-36] (4F10及9H10)的完整抗體與Fab，提出CTLA-4為T細胞調控之細胞固有負調控因子的概念。最近，第三抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9據報導對有腫瘤小鼠具有治療作用且引起腫瘤微環境中之Treg局部耗乏[10]。因此，測試已展示可誘導腫瘤排斥反應之所有三種市售抗小鼠Ctla-4 mAb在生理學相關條件下阻斷B7-Ctla-4相互作用的能力。作為第一測試，使用遞增量之抗小鼠Ctla-4 mAb (相對於Ctla-4-Fc高達2,000倍莫耳過量)阻斷經生物素標記之Ctla-4-Fc對培養盤所塗佈之mB7-1及mB7-2的結合。如圖19A中所示，抗小鼠Ctla-4 mAb 9H10即使在最高測試濃度下亦不阻斷mB7-1-Ctla-4相互作用，但當在極高濃度下使用9D9時觀測到適度阻斷。儘管mAb 9D9有效阻斷mB7-2-Ctla-4相互作用，但9H10則不能(圖19B)。有趣的是，雖然9D9對可溶性Ctla-4Fc展示強結合，但9H10展示弱結合(圖19C)，即使其在結合所固著之小鼠Ctla-4Fc時比9D9更強(圖19D)。由於在此分析中9H10缺乏任何阻斷活性可簡單地反映其對可溶性Ctla-4Fc之結合弱，因此利用WT小鼠(Ctla4m / m )中之樹突狀細胞上的B7-1及B7-2再次上調來量測B7-Ctla-4相互作用之活體內阻斷。如圖19E及19F中所示，9H10未使DC上之B7-1表現上調，而9D9使mB7-1含量增加15% (P＜0.05)。有趣的是，雖然9D9使DC上之mB7-2明顯上調，但9H10卻非如此。因此，9H10，第一種且研究最廣泛的腫瘤免疫治療抗Ctla-4 mAb不阻斷B7-Ctla-4相互作用。此等資料辯稱反駁抗小鼠Ctla-4 mAb阻斷B7-Ctla-4相互作用在誘導抗腫瘤免疫中的作用。由於兩種mAb在腫瘤微環境中均展示類似的免疫治療作用及類似的Treg耗乏[10]，因此Treg局部缺失而非阻斷mB7-CTLA-4相互作用給抗小鼠CTLA-4 mAb之治療作用提供統一的解釋。有趣的是，儘管4F10活體外阻斷B7-Ctla-4相互作用，但其未能活體內誘導DC上之B7上調(圖20)。
論述
儘管伊匹單抗基於其阻斷B7-CTLA-4相互作用(當B7以可溶形式添加時)的事實而稱為阻斷型mAb，但資料證明其在生理學相關條件下幾乎不阻斷B7-CTLA-4相互作用，包括如下時的彼等生理學相關條件：當B7-1及B7-2固著至固相或表現於細胞膜上時；B7-CTLA-4複合物在暴露於抗CTLA-4 mAb之前形成時；B7與CTLA-4均作為細胞表面分子表現時，且尤其當B7及CTLA-4被呈現(如分別在DC及T細胞上天然表現)時及當動物活體內接受抗體處理時。更重要的是，伊匹單抗在不阻斷B7-CTLA-4相互作用之情況下賦予其免疫治療作用，因為當至少50% CTLA-4不結合至Ctla4 h / m 小鼠中之抗體時或當宿主B7被抗B7 mAb遮蔽時，其仍然有效。
本文所述研究中之驚人發現為伊匹單抗阻斷活性之顯著差異，此視B7或CTLA-4蛋白是否置放於可溶相中而定。此現可藉由兩段資料來解釋。第一，伊匹單抗不使現有B7-CTLA-4複合物分裂。第二，可溶性CTLA-4結合至培養盤所結合之B7的結合速率為可溶性B7結合至培養盤所結合之CTLA-4之結合速率的至少三倍。組合而言，此等資料表明當B7以溶液添加時，伊匹單抗結合至游離CTLA-4的機會比B7被固著時多且在複合物形成之前具有更多的阻斷CTLA-4-B7相互作用之機會。由於CTLA-4-抗體相互作用為動態的，因此與抗體解離之CTLA-4分子可結合至所固著的B7且對伊匹單抗之阻斷作用變得「免疫」。因此，如最近報導[37]，CTLA-4上之B7結合位點與伊匹單抗結合位點之間的部分重疊不一定使其能夠在生理學相關條件下阻斷B7-CTLA-4相互作用。
L3D10與伊匹單抗之間使預形成之複合物裂解的有差異活性仍待闡明。雖然伊匹單抗之K合 (2.6x105 /Ms或3.83x105 /Ms)[14，16]低於可溶性B7之K合 (1-4x106 /Ms，此研究)，但L3D10的K合 (2.07x105 /Ms)不比伊匹單抗更快[15]。因此，K合 或K離 不能為兩種抗體在B7固著的情況下差異性阻斷B7-CTLA-4相互作用的能力提供解釋。更合理之解釋為在複合物形成後，以阻止伊匹單抗結合其之方式改變CTLA-4構形。伊匹單抗-CTLA-4複合物之公開資料表明CTLA-4上之伊匹單抗抗原決定基與B7結合位點之間存在部分重疊[37]，這符合此解釋。
為使B7與CTLA-4據以存在於細胞表面上之生理學條件模型化，使用分別表現經GFP標記之B7-1或B7-2或經OFP標記之CTLA-4的CHO細胞進行轉胞吞分析。為了經由CTLA-4之交聯來克服複合相關的信號傳導，重要的是使用Fab而非二價抗體。資料清楚地證明，儘管穩定結合至細胞表面CTLA-4，但在超過飽和結合所需10倍的濃度(10 µg/ml)下，伊匹單抗Fab僅引起B7-1及B7-2轉胞吞發生15-30%抑制。更重要的是，以莫耳比計，此濃度將轉變成比臨床有效劑量所達成之穩定血漿濃度高約50%的濃度。同樣，當Y201V突變使細胞表面CTLA-4穩定化以允許B7-CTLA-4介導穩定的細胞-細胞相互作用時，高劑量的伊匹單抗Fab僅引起小於20%的抑制。由於臨床有效劑量不足以引起有效抑制，既不能對B7轉胞吞、亦不能對B7及CTLA-4介導之細胞表面相互作用引起有效抑制，因此基於細胞之活體外分析強烈辯稱反駁CTLA-4阻斷為臨床有效藥物的作用機制。
此等活體外研究之預測已得到活體內研究的證實。吾人之活體內分析係基於如下近期發現：CTLA-4經由轉胞吞作用，引起樹突狀細胞上之B7下調來發揮作用[12，27]。由於此獨特特性，因此吾人未預期穩定的DC-Treg結合係由活體內的B7-CTLA-4相互作用介導。相反，阻斷CTLA-4介導之轉胞吞，會直接引起DC上之B7出現較高表現[12，27]。為了排除B7上調歸因於抗CTLA-4 mAb之信號傳導的潛在問題，使用由小鼠與人類CTLA4 對偶基因組成之異型接合小鼠[38]。在此模型中，抗人類CTLA-4 mAb可為有效促效劑而非拮抗劑，因為其沒有能力結合50% CTLA-4分子。阻斷抗CTLA-4 mAb L3D10誘導同型接合而非異型接合小鼠中之B7上調的事實證明在活體內分析之特異性，且顯示功能性阻斷需要阻斷超過50%的CTLA-4，此或許是因為轉胞吞可以經由50%或更少的未佔據CTLA-4完成。因此，樹突狀細胞上之B7上調代表阻斷B7-CTLA-4相互作用之生理學最相關及直接的讀數。
阻斷與治療功效之間缺乏相關性亦證明阻斷B7-CTLA-4不會有影響。儘管阻斷B7-CTLA-4相互作用的差異超過1000倍，但L3D10與伊匹單抗在誘導腫瘤排斥反應方面類似。因此，此類阻斷不會顯著影響抗CTLA-4 mAb的功效。有趣的是，由於L3D10可以在無法在功能上阻斷所有B7-CTLA-4相互作用之異型接合小鼠中有效誘導腫瘤排斥反應，因此即使是阻斷型抗體，腫瘤排斥反應不一定需要此類阻斷作用。顯然，已喪失阻斷活性的人類化L3D10後代在免疫療法中仍具完全活性。此等數據反駁了抗CTLA-4 mAb主要經由檢查點阻斷作用來運作的假設[1]。藉由反駁盛行的假設，數據顯示改良抗CTLA-4 mAb之阻斷活性不大可能為增加抗CTLA-4 mAb治療功效的正確方法。吾等隨附的論文進一步驗證此概念。
已知有小部分的人類個體表現可溶性B7-1 [39]。由於伊匹單抗阻斷可溶性CD80與CTLA-4之間的相互作用，因此值得探討阻斷可溶性CD80是否會引起腫瘤排斥反應。此因兩個原因而不大可能。第一，由於已知可溶性CD80因向T細胞提供共刺激作用而促進腫瘤排斥反應[40]，因此阻斷此相互作用應抑制而非促進腫瘤排斥反應。第二，不論CD80是否為固定化或呈可溶形式，喪失阻斷B7-CTLA-4相互作用之能力的人類化L3D10純系HL12及HL32為腫瘤排斥反應之強誘導劑。
同時，活體內研究顯示，本文所用之所有治療有效CTLA-4抗體皆顯著有效地引起局部Treg耗乏。吾等數據提供一段明確的證據證明，非常類似於抗小鼠Ctla-4 mAb，抗人類CTLA-4 mAb (包括臨床上有效的伊匹單抗)可以經由ADCC提供治療作用。宿主FcR在伊匹單抗誘導腫瘤排斥反應中的關鍵作用驗證了此假設。吾等研究支持如下假設：腫瘤環境內之Treg局部耗乏為臨床有效抗人類CTLA-4 mAb之主要機制，且因此表明不論阻斷活性，藉由選擇性地增強局部Treg耗乏為開發用於癌症免疫療法之下一代抗CTLA-4 mAb的新途徑。
為達成治療作用而需要誘導腫瘤微環境內之局部Treg耗乏不符合檢查點阻斷假設之另一假定[1]，該假定表述不同於抗PD-1/PD-L1抗體，抗CTLA-4抗體藉由阻止周邊淋巴器官中之負信號傳導來促進腫瘤排斥反應。資料藉由表明B7阻斷阻止T細胞重新活化而不影響伊匹單抗治療作用而反駁了此假定。重要的是，已證明全身性T細胞活化與免疫療法相關副作用強烈相關，而非促成腫瘤排斥反應。
最終，積累的小鼠基因資料表明，CTLA-4負向調控T細胞活化[35-36]且此類調控經由Shp-2達成[41-42]的原始觀念可能需要再審視[43]。因此，雖然Ctla4 -/- 小鼠之嚴重自體免疫疾病已用於支持CTLA-4為T細胞活化之細胞固有負調控因子的觀點[44-45]，但是此後已出現至少三個系列的基因資料與此觀點不一致。第一，Treg而非效應子T細胞中之Ctla4 基因的譜系特異性缺失足以再現其中生殖系缺失Ctla4 基因之小鼠中所觀測到的自體免疫表型[26]，但死亡發作比其中生殖系或泛T細胞缺失該基因之小鼠慢[44-46]。雖然Ctla4 在Foxp3- 細胞中之功能仍待探究，但此等資料表明Ctla4 -/- 小鼠之致死性自體免疫的發展無需效應子T細胞中缺失Ctla4 。第二，在由WT與Ctla4 -/- T細胞組成之嵌合小鼠中，WT T細胞之共存阻止自體免疫表型[47]。此等資料再次強烈辯稱，自體免疫疾病並非由細胞固有負調控因子之缺乏而引起。細胞固有負調控效應的缺乏亦藉由如下事實證明：在嵌合體小鼠中，在病毒感染期間，未觀測到Ctla4 -/- T細胞的優先擴增[48]。第三，已提出介導CTLA-4之負向調控[41-42]之Shp2 的T細胞特異性缺失證明減少而非增強T細胞活化[49]。在所報導之此等基因資料之上下文中，由於提出CTLA-4為T細胞活化之負調控因子，因此本文中所報導之資料需要對癌症免疫療法中之CTLA-4檢查點阻斷假設進行重新評估。
實例2
完全的CTLA-4佔據、全身T細胞活化及自體反應性T細胞之優先擴增係腫瘤排斥反應非必需的，但與irAE相關，而阻斷B7-CTLA-4相互作用既不影響抗CTLA-4抗體的安全，亦不影響其功效。
方法
動物
在小鼠內源Ctla4 基因座控制下表現與人類CTLA-4蛋白100%一致之CTLA-4蛋白的CTLA4 人類化小鼠已有描述[24]。將同型接合基因敲入小鼠(Ctla4h / h )與C57BL/6背景回交至少10代。藉由使CTLA4h / h 小鼠與野生型(WT) BALB/c小鼠(用於腫瘤生長研究)或WT C57BL/6小鼠(用於irAE研究)雜交來產生異型接合小鼠(Ctla4h / m )。WT BALB/c及C57BL/6小鼠經由NCI合約購自Charles River Laboratories。所有小鼠皆在國立兒童醫學中心兒童研究所動物研究機構維護。涉及小鼠之所有研究均由機構動物照護及使用委員會批准。
細胞培養
鼠類結腸腫瘤細胞株MC38先前已描述[2]，且CT-26及B16-F10細胞株購自ATCC (Manassas, VA, USA)。自供應商接收之後，使細胞傳代在活體內測試之前保持最小。細胞株既未經認證，亦未定期測試黴漿菌污染。在37℃、5% CO2 下培育MC38、CT26及B16-F10細胞株。使MC38及B16細胞在補充有10% FBS (Hyclone)、100個單位/ml青黴素及100 µg/ml鏈黴素(Gibco)的DMEM (杜爾貝科氏改良之伊格爾氏培養基，Gibco)中生長。在完全RPMI 1640培養基(Gibco)中培養CT26細胞。
抗體
小鼠抗人類CTLA-4 mAb L3D10已有描述[28]。研究中使用的抗CTLA-4 mAb L3D10為由人類IgG1 Fc及L3D10可變區組成的嵌合抗體。重組抗體係由Lakepharma, Inc (Belmont, CA, USA)根據服務合約生產。具有WC500109302及www.drugbank.ca/drugs/DB06186中所揭示之胺基酸序列的重組伊匹單抗係由Alphamab Inc. (中國江蘇蘇州)及Lakepharma Inc. (San Francisco, CA, USA)提供。臨床上使用之藥物亦用於驗證關鍵結果。人類IgG-Fc (無疊氮化物)自Athens Research and Technology (Athens, GA, USA)批量訂購。抗小鼠PD-1 mAb RMP1-14購自Bio-X Cell, Inc. (West Lebanon, NH, USA)。所有mAb之內毒素含量藉由LAL分析(Sigma)測定且低於0.02 EU/μg。
腫瘤生長及消退分析
用指定數目個結腸直腸癌細胞MC38、CT26或黑色素瘤細胞株B16-F10攻擊人類CTLA4 基因異型接合或同型接合基因敲入小鼠。腫瘤細胞以指定劑量注射之後的第2、7或11天起始免疫療法。使用體積作為讀數來測定腫瘤生長及消退。使用下式計算體積(V)。
V=ab 2 /2，其中a 為長直徑，而b 為短直徑。
L3D10人類化
L3D10抗體之人類化係由Lakepharma, Inc根據服務合約進行。每一者之第一人類化鏈利用第一構架且含有具有最小親本抗體構架序列的大部分人類序列(人類化HC 1及LC 1)。每一者的第二人類化鏈使用與HC 1及LC 1相同的構架，但含有其他親本L3D10抗體序列(人類化HC 2及LC 2)。每一者之第三人類化鏈利用第二構架且類似於HC 2/LC 2，亦含有與人類構架融合的其他親本序列(人類化HC 3及LC 3)。接著使3條人類化輕鏈及3條人類化重鏈以所有可能的組合進行組合，從而產生9種變異型人類化抗體，測試其表現量及抗原結合親和力以鑑別出與親本L3D10抗體效能類似的抗體。
全血計數
41日齡時使用含有K2 EDTA (BD)的管收集血液樣品(50 µl)且藉由HEMAVET HV950 (Drew Scientific Group, Miami Lakes, FL、 USA)、依循製造商手冊進行分析。
內部器官之組織病理學分析
利用自接受治療或對照抗體之小鼠收集的經福馬林固定之器官製備H&E切片，且進行雙盲評分。評分準則：心臟，心包膜、右或左心房、主動脈基底及左或右心室出現浸潤，各計為1分；肺評分係基於細支氣管周圍之淋巴球聚集體，1表示每個切片之淋巴球聚集體出現1-3個小病灶，2表示4-10個小病灶或1-3個中等病灶，3表示超過4個中等病灶或存在大病灶，4表示腦實質出現顯著的間質纖維化及淋巴球聚集體出現大病灶；肝臟評分係基於肝門三元體周圍出現淋巴球浸潤聚集體，1表示每個切片之淋巴球聚集體出現1-3個小病灶，2表示4-10個小病灶或1-3個中等病灶，3表示4個或更多個中等病灶或存在大病灶，4表示腦實質出現顯著的間質纖維化及淋巴球聚集體出現大病灶；腎臟評分：1.腎絲球細胞含量輕度增加；2.腎絲球細胞含量增加且遠側或近側管中出現淋巴球浸潤；3.收集管中出現大淋巴球聚集體；4.腎臟皮質及髓質內出現顯著的淋巴球聚集體。唾液腺評分係基於頜下腺體中之淋巴球浸潤：1表示每個切片之淋巴球聚集體出現1-3個小病灶，2表示4-10個小病灶或1-3個中等病灶，3表示4個或更多個中等病灶或存在大病灶，4表示腦實質出現顯著的間質纖維化及組織毀壞且淋巴球聚集體出現大病灶。所示資料為所檢查之所有器官之組合分數。
經由 F1 互交來 分析自體反應性 T 細胞
如圖31A中所圖解，使C57BL/6.Ctla4h / h 小鼠與WT BALB/c小鼠發生異型雜交。使F1小鼠互交以產生其中Ctla4h 與H-2對偶基因隨機分隔的F2。根據公開的報導[24，30]，利用尾DNA確定Ctla4 對偶基因及內源VSAgMmtv8 , 9 的基因型，同時使用周邊血液白血球、藉由流式細胞術確定H-2d單倍型的存在。
藥物毒性之臨床化學方法
用於量測血清中之心肌鈣蛋白I 3型(TNNI3)的套組購自Cloud-Clone Corp. (目錄號SEA478Mu)，且使用ELISA、依循製造商方案量測TNNI3含量。使用肌酐(血清)比色分析套組(Cayman Chemical)或肌酐(CREA)套組(RANDOX，目錄號CR2336)量測肌酐含量。使用UREA NITROGEN DIRECT套組(Stanbio laboratory)，根據製造商手冊量測血清BUN含量。
生物統計
用於分析各組實驗之特定測試在圖式圖例中指示。對於各統計分析而言，基於缺失離群值之資料是否呈正態分佈(藉由使用迪阿哥及帕耳遜正態檢驗(D'Agostino & Pearson normality test))來選擇適當檢驗。利用在兩個群組之間進行比較的不成對雙尾史都登氏t 測試或曼-惠特尼檢驗、多重比較用的單因子變異數分析(ANOVA)或克拉斯卡-瓦立斯檢驗，及行為測試用的雙向重複量測ANOVA來分析資料。線性回歸中之相關係數及P 值係藉由帕耳遜方法來計算。基於文獻及過去經歷，選擇具有足夠統計能力之樣品大小。無樣品自分析排除，且除指定者外，實驗不隨機分組。動物組不進行盲法分配，但對於研究中進行的一些量測(亦即，腫瘤尺寸量測、組織學評分)而言，進行盲法分配。圖中，y軸誤差條表示S.E.M.或S.D.，如所指示。利用Excel (Microsoft)、GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, San Diego, California)或R軟體(www.r-project.org/)進行統計學計算。*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。
結果
人類CTLA 4基因敲入小鼠模型如實地再現組合療法之irAE
研究組合療法中之irAE之機制及預防策略的重大挑戰為，小鼠耐受高劑量的抗CTLA-4 mAb而無顯著AE。選擇兩種人類CTLA-4 mAb用於此研究：在一組抗CTLA-4 mAb中，臨床上使用的伊匹單抗及L3D10最強[24，28]。當在相同模型中比較時，兩種mAb在引起腫瘤排斥反應方面類似(圖21)。由於幼齡小鼠表現較高量之CTLA-4，其再現帶有腫瘤之成年小鼠的特徵(圖22)，因此人類CTLA4 基因敲入(Ctla4h / h )小鼠在圍產期期間分別用對照人類IgG-Fc、抗CTLA-4 mAb伊匹單抗、L3D10、抗PD-1、抗PD-1 + 伊匹單抗或抗PD-1 + L3D10處理。在出生之後第10、13、16及19天以100 µg/小鼠/注射之劑量處理小鼠，且評估隨時間變化的體重增加速率，以及6週齡時之血液學及組織病理學變化(圖23A)。如圖23B中所示，雖然伊匹單抗與抗PD-1之組合顯著遲緩雌性小鼠生長，但單獨的任一抗體對體重增加無重大影響。雄性小鼠作為對抗PD-1 + 伊匹單抗的反應亦展示實質上及統計學上顯著的生長遲緩(圖23C)。顯然，當使用抗PD-1 + L3D10時未觀測到生長遲緩(圖23B及圖1C)。為研究組合療法對造血的影響，組合療法起始之後的第一個月進行總血球計數(CBC)(圖24)。在經伊匹單抗 + 抗PD-1處理之小鼠大部分中觀測島血液血容比(HCT)、總血紅素(Hb)及平均紅血球體積(MCV)水準顯著降低，而接受L3D10 + 抗PD-1的小鼠不受影響(圖23D)。白血球之呈現基本上正常(圖24)。此等資料證明，抗PD-1與伊匹單抗之組合，而非抗PD-1與L3D10之組合引起貧血。作為單一藥劑，伊匹單抗而非L3D10誘導高比例之幼齡小鼠貧血，但平均減少無統計顯著性。屍檢之後，顯而易見的是，骨髓中之紅血球產生受到嚴重限制，此係因為自伊匹單抗 + 抗PD-1處理之小鼠中清除之骨骼及骨髓呈現蒼白色，而L3D10 + 抗PD-1處理之小鼠中之彼等骨骼及骨髓與來自對照IgG處理之小鼠中之骨骼及骨髓類似(圖23E)。為定量骨髓中之紅血球譜系之缺陷，分析CD71及Ter119標記物在骨髓細胞間之分佈以及細胞尺寸。此等標記物用於標示紅血球發育之五個階段，自I至V依序為：階段I，CD71+ Ter119- ；階段II，FSC-Ahi CD71+ Ter119+ ；階段III，FSC-Ami CD71+ Ter119+ ；階段IV，FSC-Alo CD71+ Ter119+ ；及階段V，CD71- Ter119+ 。如圖23F及圖23G中所示，抗PD-1 + 伊匹單抗處理之小鼠展示祖細胞顯著增加(階段I)及成熟紅血球頻率減小(階段V)，其解釋明顯的嚴重貧血。相比之下，L3D10及抗PD-1處理的小鼠展現紅血球在骨髓中之正常分佈及成熟。
接受抗PD-1聯合L3D10相對於伊匹單抗之CTLA4h / h 小鼠之生長速率的顯著差異表明兩種抗CTLA-4 mAb可以誘導極其不同的AE。為了測試此可能性，小鼠當其達到42日齡時處死且進行屍檢。在抗PD-1 + 伊匹單抗處理之小鼠中，而非抗PD-1 + L3D10處理的小鼠中，觀測到顯著的心肥大(圖25A)。心臟腫大表明右心室與左心室之腔室均擴張，但左心室更明顯，此表示嚴重的擴張型心肌症。相較於hIgG處理組的心臟，左心室及心室間隔心肌壁厚減小超過50%(圖25B)。組織學展現心肌炎，其中心內膜及心肌出現彌漫性及大量淋巴球浸潤，發炎病灶處之心肌細胞變性且結構破壞(圖25C)。藉由免疫組織化學觀測到經抗PD-1 + 伊匹單抗處理之小鼠之心臟中存在高豐度的CD45+ 及CD3+ T細胞(圖25D，上圖)，此與T細胞介導的病理學一致。此等細胞包括CD4與CD8 T亞群(圖25D，下圖)。經抗PD-1 + 伊匹單抗處理之小鼠之發炎位點處存在Foxp3+ CD4+ Treg細胞，此表明儘管存在Treg，組織毀壞亦發生(圖25D)。在接受L3D10 + 抗PD-1組合療法或伊匹單抗單一療法之小鼠中觀測到輕度至中度發炎。然而，L3D10及抗PD-1單一療法均不引起可偵測的發炎(圖25E)。不同於具有BALB/c背景的小鼠，由於具有C57BL/6背景的小鼠即使當Pd1 基因缺失時亦不出現心臟疾病[29]，因此抗PD-1處理不誘導心臟發炎的事實可以歸因於使用具有C57BL/6背景的小鼠。除心臟之外，伊匹單抗與抗PD-1 mAb之組合亦誘導雌性泌尿-生殖器官發生嚴重缺陷，其中組織學發現卵巢及子宮發育不全(圖26)。與缺乏型腎上腺功能一致，觀測到促腎上腺皮質激素顯著升高，此為腎上腺對皮質醇產生缺乏作出的可能反應(圖27)。
為了定量分析抗PD-1及抗CTLA-4及其組合對組織毀壞之影響，對接受對照Ig或免疫治療抗體之小鼠的內臟及腺體進行組織學分析。使器官及腺體在10%福馬林中固定，切片且用蘇木精及曙紅(H&E)染色，且雙盲評分。代表性載片展示於圖28A中，且來自各組中個別小鼠之分數呈現於圖28B中。所有器官之複合分數呈現於圖28C中。L3D10單一療法對所檢查的任何器官均未誘導嚴重發炎，證明其安全。相比之下，伊匹單抗單一療法誘導所有小鼠出現中度至重度發炎，比對照Ig、抗PD-1及L3D10單一療法群組中之偶然背景發炎顯著更強。與抗PD-1組合時，伊匹單抗誘導所有小鼠發炎，所有主要器官中均發現嚴重炎症。尤其值得注意的是，在抗PD-1及伊匹單抗處理的小鼠中觀測到透壁性發炎，其為結腸中最嚴重形式之組織學發現，且在經抗PD-1及伊匹單抗處理之小鼠中觀測到克羅恩氏病(Crohn's disease)的獨特病理學特徵，但在其他群組中不存在。將所有器官的分數組合時，顯而易見的是，伊匹單抗 + 抗PD-1誘導的發炎比L3D10 + 抗PD-1處理顯著更強(圖28C)。另外，單獨的伊匹單抗亦誘導的不良事件比作為單一藥劑的單獨抗PD-1或單獨L3D10顯著更強(圖28C)。
伊匹單抗 + 抗PD1而非L3D10 + 抗PD-1誘導全身T細胞活化及自體反應性效應子T細胞擴增
為理解伊匹單抗 + 抗PD-1組合療法誘導嚴重AE的機制，分析分別接受對照IgG、伊匹單抗 + 抗PD1及L3D10 + 抗PD1之三組小鼠中的T細胞頻率及功能亞群。如圖29A中所示，三個群組中的CD4及CD8 T細胞頻率基本上相同。使用CD44及CD62L標記物，觀測到伊匹單抗 + 抗PD-1群組中之效應記憶T細胞(CD44hi CD62Llo )大幅度擴增，但中心記憶T細胞(CD44hi CD62Lhi )之頻率不受影響(圖29B及4D)。相應地，抗PD-1及伊匹單抗處理組中的初始T細胞頻率大大減小(圖29B及4D)。異常T細胞活化並非歸因於Treg耗乏，因為Treg在脾臟中之頻率顯著升高(圖30)。
為了理解irAE之發病機制，至關重要的是理解免疫療法對自體反應性T細胞之影響。為了解決此問題，利用內源性自抗原被少數選擇性Vβ識別的事實[30]。由於C57BL/6小鼠缺乏呈現內源超抗原的I-E，因此經由(B6.Ctla4h / h x BALB/c WT) F1xF1雜交來產生F2小鼠，且利用區分H-2d (BALB/c背景)及H-2b (C57BL/6背景)單倍型的mAb對子代定型。尾DNA之PCR亦用於確定小鼠Ctla4 相對於人類CTLA4 對偶基因的狀態，以及內源VSAg8, 9 (圖31A)。
使用Ctla4 具有靶向突變之小鼠，Yamaguchi等人表明CTLA-4有助於將表現Vβ5、11及12的T細胞轉化成Treg，因為CTLA-4之靶向突變使Teff %增加[31]。因此，分析抗PD-1 + 伊匹單抗或抗PD-1 + L3D10對H-2d + CTLA4h / h 小鼠中之VSAg反應性Teff及Treg的影響(圖31B)。使用與VSAg8, 9反應之Vβ11的代表性資料展示於圖31C中，而VSAg反應性T細胞之Treg/Teff比率總結資料展示於圖31D中。特異性Vβ的資料提供於補充的表2中。
表2
伊匹單抗誘導VSAg反應性CD4 T細胞間之Foxp3- 隔室優先擴增
如圖31C中所示，伊匹單抗 + 抗PD1使Foxp3- Vβ11+ CD4 T細胞頻率加倍，但使Foxp3+ Vβ11+ CD4 T細胞頻率僅增加30%。因此，伊匹單抗 + 抗PD-1不僅提高自體反應性T細胞之頻率，而且降低自體反應性T細胞中之Treg頻率。不論Foxp3表現，非VSAg反應性T細胞(Vβ8+ )之頻率不受影響。相比之下，抗PD-1 + L3D10對CD4 T細胞之頻率無影響。Vβ5+ 及Vβ12+ CD4 T細胞中亦觀測到VSAg反應性Teff選擇性擴增(表2)。因此，所研究之全部VSAg反應性CD4 T細胞中的Treg/Teff比率在接受抗PD-1 + 伊匹單抗的小鼠中顯著減小(P=0.0026)。由於Vβ8中的Treg/Teff比率不受影響，因此減小對於VSAg反應性T細胞而言具選擇性。此等資料證明自體反應性T細胞之抗原特異性抑制受到抗PD-1 + 伊匹單抗處理的減弱。此外，為解決該處理在T細胞發育期間是否影響Treg/Teff，亦分析VSAg反應性胸腺細胞中之Treg/Teff比率。如圖31E中所示，抗PD-1 + 伊匹單抗對胸腺細胞中之Treg/Teff比率無影響。
此研究中所用的抗CTLA-4 mAb與人類而非小鼠CTLA-4反應(圖32)，且因此不能阻斷攜有小鼠Ctla4 及人類CTLA4 對偶基因(Ctla4h / m )之異型接合小鼠中之所有CTLA-4分子的功能。測試銜接最大50%之CTLA-4是否足以引起VSAg反應性T細胞中之Treg/Teff減小。如圖31D中所概述，在CTLA4h / m 小鼠中，不論抗體處理，均未觀測到習知T細胞與Treg之比率變化。
人類化 L3D10 純系展現強 CITE ，但最小 irAE
作為將L3D10抗體轉入臨床測試之第一步驟，將L3D10人類化，產生與CTLA-4結合類似之兩個純系，且針對irAE與CITE，將此等純系與伊匹單抗進行比較。如圖33A中所示，在Ctla4h / h 小鼠中，當與抗PD-1組合時，伊匹單抗而非HL12及HL32引起生長遲緩。相比於伊匹單抗，如藉由HCT及Hb所量測，HL12與HL32均不誘導貧血(圖33B)。組織病理學分析進一步證實，當與抗PD-1組合時，HL12及HL32不誘導心臟、肝臟、結腸或腎臟發炎，但在小比例之小鼠中觀測到肺及唾液腺中度發炎(圖33C)。複合病理學分數揭露，HL12及HL32誘導的發炎甚至比組合療法中之L3D10更少(將圖33D與圖28C比較時)。另外，當與抗PD-1抗體組合使用時，人類化純系不誘導全身T細胞活化(圖34)。因此，在人類化期間，L3D10之安全分佈不受損。
為了確定HL12及HL32之較佳安全是否以治療作用為代價，首先對伊匹單抗的治療作用與HL12及HL32進行比較。先前研究已揭露，抗鼠類CTLA-4 mAb單一療法能夠誘導C57BL/6來源之結腸癌細胞株MC38及BALB/c來源之CT26的排斥反應。因此，藉由使BALB/c.Ctla4m / m 小鼠與C57BL/6.Ctla4h / h 小鼠雜交來產生F1小鼠(Ctla4h / m )。如圖35中所示，雖然MC38腫瘤在對照Ig處理之小鼠中的生長不受阻礙，但其生長因添加低劑量抗人類CTLA-4 mAb而被阻止。在30 µg/注射(4次)之劑量下，所有抗CTLA-4 mAb同等強效(圖35A)。在10 µg/注射(4次)之低劑量下，HL32稍微更強於伊匹單抗及HL12，但差異在統計學上不顯著(圖35B)。CT26對抗CTLA-4免疫療法的抗性稍微強於MC38，且因此需要更高的劑量。使用高劑量抗體時，所有三種mAb誘導統計學上顯著之生長抑制(圖35C)。在較低劑量下，伊匹單抗的確在某種程度上減少腫瘤生長，但減少程度在統計學上不顯著(P=0.29)。另一方面，HL12與HL32均誘導明顯的生長抑制(P＜0.001)(圖35D)。使用B16F10黑色素瘤腫瘤模型時，兩種抗體均達成顯著抑制(圖35E及35F)。綜合而言，人類化L3D10純系HL12及HL32在引起腫瘤排斥反應方面至少與伊匹單抗一樣強。因此，人類化小鼠模型允許吾等鑑別出顯著更安全但至少同等強效之抗CTLA-4 mAb。
在Ctla4h / m 小鼠中，人類CTLA-4之接合足以誘導腫瘤排斥反應，但不足以誘導自體免疫疾病
伊匹單抗可以誘導CTLA4h / m 小鼠出現腫瘤排斥反應的上述資料提出一個引人關注的問題，亦即，此mAb是否可以藉由與細胞表面CTLA-4之僅一部分接合來誘導irAE。由於此研究中使用的抗人類CTLA-4 mAb不與小鼠CTLA-4分子反應(圖32)，因此藉由比較Ctla4h / m 小鼠中之irAE及CITE來評估irAE及CITE是否需要類似的受體接合水準。驚人的是，誘導Ctla4h / h 小鼠生長遲緩之相同劑量的伊匹單抗 + 抗PD-1(圖23A)對Ctla4h / m 小鼠未能如此(圖36A)；與缺乏irAE一致，組織病理學分析揭露，除唾液腺中度發炎之外，抗PD-1 + 伊匹單抗不引起所分析之任何其他器官的發炎(圖36B)，即使所用劑量引起同型接合小鼠中所分析之基本上全部器官重度發炎(圖25及圖28)。同樣，經抗PD-1 + 伊匹單抗處理之Ctla4h / m 小鼠中未觀測到貧血(圖36C)。然而，異型接合小鼠對伊匹單抗免疫療法的反應與同型接合小鼠幾乎相同(圖36D)。因此，irAE與癌症免疫可以非成對遺傳：雖然人類CTLA4 基因以主導方式賦予CITE對伊匹單抗的反應，但其對賦予irAE的作用係隱性的。此等資料亦表明造成irAE與CITE的機制不同。
相比於在同型接合小鼠中所觀測到的(圖29)，伊匹單抗 + 抗PD-1之組合未誘導Ctla4h / m 小鼠之全身T細胞活化(圖36E)。為理解不同的自體免疫副作用，分析抗PD-1 + 伊匹單抗在人類CTLA-4同型接合及異型接合小鼠中對Treg/Teff比率的影響。如圖31C及圖31D中所示，使同型接合小鼠中之Treg/Teff比率減小的相同處理對異型接合小鼠無影響。不同基因需求進一步加強自體免疫副作用可以與癌症免疫不成對的觀點。缺乏全身T細胞活化及未能選擇性擴增自體反應性Teff解釋Ctla4h / m 小鼠中irAE之缺乏。
在相同背景下觀測irAE及CITE
儘管迄今已使用單獨背景來對irAE及CITE實現更穩健的評估，但關注的是irAE及CITE可以在相同背景下觀測到。採取兩種方法達成此目標。第一，基於作為血清標記物的心肌鈣蛋白I (TNNI3，各種心臟病症之常規診斷標記物)與組織學分析，評估接受抗CTLA-4抗體處理之年輕成年小鼠的心臟不良事件。如圖37A中所示，在6-7週年輕成年小鼠中，抗CTLA-4 mAb類似地誘導穩定的腫瘤排斥反應。儘管腫瘤排斥反應類似，但三種mAb誘導不同的不良心臟缺陷。值得注意的是，伊匹單抗誘導高含量的TNNI3 (圖37B)。相應地，組織學分析揭露肌細胞內部及外部存在廣泛玻璃質(圖37C，上圖)以及廣泛心包炎(圖37C，下圖)。然而，經HL12處理之小鼠血清中觀測到顯著較低含量的TNNI3，相應地，心臟透明蛋白變性及發炎程度較低。相比之下，在經HL32處理之小鼠中，未觀測到血清TNNI3升高，且相應地，組織學既無透明蛋白變性發現，亦無炎症發現。當與抗PD-1組合時，伊匹單抗之治療作用在單一療法與組合療法之間類似(圖37D)。雖然心臟毒性增加，但單獨伊匹單抗群組與伊匹單抗 + 抗PD-1群組之間不存在統計顯著性，此歸因於毒性研究中典型的個別變異體高(圖37E)。
反之，使用10日齡小鼠測試CITE，因為其對於評估irAE而言係穩定的。如圖37F中所示，MC38腫瘤在移植至10日齡小鼠中之後逐漸生長。值得注意的是，如根據腫瘤快速消退(圖37F)及普遍伺服器官炎症(圖37G)所證明，年輕小鼠在腫瘤排斥反應與誘導irAE方面對伊匹單抗均有高度反應。
全身 T 細胞活化與 irAE 強烈相關
由於此研究中使用的各種抗體展現獨特的irAE分佈及周邊T細胞活化，因此確定周邊T細胞活化是否與irAE相關受到關注。如圖38A及38D中所示，接受對照物或五種不同抗CTLA-4 mAb投藥之一的小鼠之個別irAE分數與脾臟中之初始CD4及CD8 T細胞百分比負相關。中樞記憶T細胞之百分比不展示此類相關性(圖38C及10F)。相比之下，效應記憶T細胞之百分比與irAE正相關(圖38B及38E)。強相關性表明周邊中之普遍T細胞活化潛在地為irAE之根本原因。
論述
由於irAE被描述為新臨床實體[10]，因此，為了克服癌症免疫療法進步中之此主要瓶頸，以小鼠模型將病狀模型化受到愈來愈多的關注。然而進展緩慢，原因或許是小鼠腫瘤模型不同於人類癌症患者，人類癌症患者的免疫系統與癌症組織具有慢性相互作用。另外，由於irAE可能具有充分的藥物特異性，因此難以經由抗小鼠CTLA-4 mAb對特定抗人類CTLA-4 mAb的irAE進行模型化。吾等研究在此使用人類CTLA4 基因敲入小鼠評估臨床上所用之抗CTLA-4 mAb的irAE。已表明此模型成功地再現與伊匹單抗(單獨或與抗PD-1 mAb組合)有關的大部分病理學觀測結果，包括諸如心臟、肺、肝臟、腎臟及腸等器官重度炎症。在此模型中亦觀測到與伊匹單抗有關的罕見疾病，諸如純紅血球發育不全[19，20]。
應注意，雖然該等模型可用於模擬伊匹單抗與抗PD-1之組合，但單獨抗PD-1不誘導模型中之irAE。與臨床觀測結果一致，雖然單獨的伊匹單抗誘導基於多種器官炎症之顯著不良效應，但其嚴重程度大大小於組合療法。另外，為了觀測到嚴重irAE，須使用非常年輕的小鼠。然而，雖然副作用不太嚴重，但觀測到心臟病(圖37)及腎臟毀壞(圖39)之實驗室及病理學發現。感興趣的是注意到，在兩種人類化L3D10純系中，一者在引起心臟病變方面比另一者更安全。總體而言，人類化之後觀測到安全性改善而無損於功效(圖40)。因此，Ctla4h / h 小鼠可以用於區分高相似度抗體且從而用於選擇次純系供進一步的臨床開發。相關研究已證明，人類化基本上消除L3D10之阻斷活性而無損於治療作用或安全，此進一步表明CITE與irAE均不涉及CTLA-4-B7相互作用之阻斷。
雖然以非常年輕小鼠評估抗CTLA-4 mAb之irAE最佳，其在伊匹單抗處理之後亦展現強CITE。由於在年輕小鼠中觀測許多irAE，諸如生長延遲、生殖系統發育有缺陷，因此本文所述之模型在預測兒科癌症患者特別重要之潛在irAE方面可為有價值的。
已確定由於淋巴球減少症，因此T細胞在年輕小鼠中經歷廣泛恆穩增殖[32，33]。由於癌症患者及年輕小鼠通常具有淋巴球減少症，且淋巴球減少症與恆穩增殖及自體免疫疾病相關[34，35]，因此認為淋巴球減少症是否為irAE之輔助因素受到極大關注。若情況如此，則可使用淋巴球減少症作為irAE之潛在生物標記物。另外，資料證明帶有腫瘤之小鼠在表現較高量Ctla4 方面類似於年輕小鼠，因此，得自年輕小鼠的資料可以解釋帶有腫瘤之宿主。年輕小鼠中之組織炎症範圍(包括心肌炎、再生不全性貧血及內分泌病變)再現臨床發現且給此論點提供有力支持。
Liu等人最近已使用部分Treg耗乏使小鼠對irAE敏感[36]。雖然此模型再現irAE之一些病理性特徵，但應注意，伊匹單抗全身性地擴增而非耗乏人類癌症患者中之Treg [37]，當伊匹單抗用於人類CTLA4 基因敲入小鼠中時觀測到之特徵(資料未示出)。因此之故，基於Treg耗盡之模型不大可能反映癌症患者中之irAE原因。然而，由於發現組合療法降低Treg/Teff比率，因此Treg中之一般缺陷可再現irAE之一些病理性特徵。
使用對於人類CTLA4 對偶基因為同型接合或異型接合之小鼠，irAE與CITE在遺傳上可為不成對的。因此，雖然僅在同型接合小鼠中觀測到irAE，但在異型接合與同型接合小鼠中均觀測到CITE。基因需求之顯著差異表明irAE及CITE之不同機制：雖然irAE表示伊匹單抗所施加之CTLA-4功能的損失，但CITE表示人類CTLA-4基因之功能獲得。
作為免疫學基礎，不同的基因需求反映在總體T細胞活化上，因為伊匹單抗 + 抗PD-1誘導同型接合小鼠而非異型接合小鼠中之廣泛T細胞活化。使用內源性超抗原反應性作為自體反應性之標記物，已發現伊匹單抗 + 抗PD-1阻止自體反應性T細胞轉化成Treg，引起自體反應性效應細胞相對於自體反應性Treg之比率增加。吾等先前研究證明，若Treg與效應T細胞共享抗原特異性，則Treg在活體內抑制T細胞活化方面最有效[38]。因此，如圖41A中所提出，自體反應性效應子相對於自體反應性Treg之比率增加允許自體反應性T細胞活化，導致自體免疫疾病。
已證明CTLA4基因之雙對偶基因缺失使自體反應性T細胞向Treg的轉化減少[31]。抗CTLA4 mAb為了irAE而對雙對偶基因接合的需求至少部分地藉由轉化對CTLA-4之雙對偶基因接合的需求來解釋，原因為自體反應性效應子/調控T細胞之比率增加可能導致自體免疫疾病。Ctla4 基因座之遺傳性失活與雙對偶基因抗體接合之間的彙聚產生引人關注的可能性：伊匹單抗在某種程度上使CTLA4分子不活化。由於相關研究證明伊匹單抗在生理條件下不阻斷B7-CTLA-4相互作用，因此伊匹單抗不活化CTLA-4分子之機制仍有待確定。
與人類CTLA-4在CITE中之主導功能一致，若干近期研究，包括本發明人之一些研究，已證明腫瘤微環境中之Treg局部耗乏的關鍵作用。因此，利用具有相同Fv、但不同Fc同型的抗小鼠CTLA-4 mAb，Selby等人證明抗小鼠CTLA-4 mAb誘導腫瘤排斥反應的能力係根據Fc部分來確定[16]。具體言之，用於活化FcgR之具有更強親和力的彼等物，包括IgG2a及IgG2b，可以有效誘導腫瘤排斥反應及腫瘤微環境中之Treg耗乏。相比之下，親和力較弱之彼等物則不能如此。與此觀點一致，Bulliard等人[18]表明，編碼活化信號傳導受體亞單元的Fcer1基因對於抗CTLA-4 mAb誘導之腫瘤排斥反應為必不可少的。另外，在併入Fcer1所編碼之亞單元的活化FcγR中，Simpson等人表明腫瘤排斥反應及Treg耗乏需要活化FcγRIV之接合[17]，處表明嗜中性球或巨噬細胞上之抗CTLA-4 mAb之Fc部分與FcR之間存在強制性相互作用。隨附論文中之吾等資料進一步證明，抗CTLA-4誘導的腫瘤排斥反應需要Treg耗乏，但不需要阻斷B7-CTLA-4相互作用(圖41B)。由於CTLA-4 mAb在腫瘤排斥反應方面類似，但在誘導周邊T細胞活化方面大為不同，因此資料與抗CTLA-4抗體藉由刺激周邊中之初始T細胞活化來促進腫瘤排斥反應的觀點不一致1 。與irAE及CITE有關的不同機制及位置使吾等初次瞭解到生產有利於腫瘤微環境內之Treg耗乏的更有效且更安全CTLA-4靶向試劑，同時避免周邊淋巴器官中之總體T細胞活化。
經典的檢查點阻斷假設已表明抗CTLA-4 mAb係藉由誘導淋巴器官中之初始T細胞活化來誘導腫瘤排斥反應。相比之下，資料表明，實際上，mAb引起淋巴器官中之T細胞總體活化的能力與irAE而非CITE相關。此因irAE分數與組合療法所觸發之全身T細胞活化之間的驚人相關性而突顯。相比之下，相關研究證明，伊匹單抗可以誘導腫瘤排斥反應而不會使抗原特異性T細胞重新預致敏。此係由於在伊匹單抗處理時，T細胞預致敏已達成。此時，Treg釋放局部抑制，而非淋巴器官中之T細胞預致敏變成釋放癌症免疫之關鍵。
綜合而言，此研究旨在如下解決基本問題：irAE及CITE是否可以不成對以允許開發更安全且更有效的免疫治療抗體。本文描述如實再現irAE的新模型，且使用此模型，已證明irAE與CITE無內在聯繫。此觀念為鑑別出至少與伊匹單抗同樣有效、但毒性顯著更弱的治療性抗CTLA-4 mAb提供基礎。資料證明人類化L3D10純系為治療性開發人類癌症療法的潛在候選物。腫瘤微環境中之T細胞活化需要癌症免疫，而周邊淋巴器官中之總體T細胞活化使自體免疫面臨風險(圖41)的觀點可能對選擇標靶以及靶向治療候選物具有寬泛的影響。
本說明書中所提及之所有公開案及專利均以引用之方式併入本文中，其引用之程度如各個別公開案或專利申請案經特定及單獨地指示以全文引用之方式併入一般。儘管本發明已結合其特定實施例進行描述，但應理解，其能夠進行進一步修改，且本申請案希望涵蓋對本發明之任何變更、使用或改編，其一般而言遵循本發明之原理且包括如在本發明所涉及之技術範圍內已知或慣用實務範圍內出現之相對於本發明的此類偏離，且可應用於上文闡述之基本特徵。
實例3
針對抗體之溶酶體降解造成抗CTLA4單株抗體之免疫療法相關副作用
鑒於具有CTLA-4之靶向突變之小鼠與人類均呈自體免疫表型，因此提出irAE可能與抗體誘導之受體下調有關。為了測試此假設，產生表現外源人類CTLA-4分子之多種細胞系且測試臨床藥物伊匹單抗對CTLA-4表現之影響。已發現，伊匹單抗誘導經hCTLA-4轉染之293T細胞(圖42A -D)及表現人類CTLA-4之CHO穩定細胞株(圖42E-G)中之CTLA-4 (尤其細胞表面CTLA-4)下調。由於CTLA4主要駐留於細胞內部且在活化後再循環至細胞表面，因此CTLA-4之細胞表面表現可為控制伊匹單抗誘導CTLA-4下調之能力的主要因素。在未處理之成年小鼠中，在調控T細胞上可偵測到極少細胞表面CTLA-4 (資料未展示)。相應地，伊匹單抗在初始小鼠中不引起CTLA-4之顯著下調。相比之下，腫瘤浸潤性Treg細胞對細胞表面CTLA-4的表現量相當高，此被伊匹單抗活體外與活體內顯著下調(圖42H-I)。
為了測試抗體誘導的細胞表面CTLA4下調是否導致容易發生irAE，在經伊匹單抗處理之irAE CTLA-4 h / h -KI新生小鼠模型中分析Treg中之細胞表面CTLA-4含量。在此模型中，Treg已展示對表面CTLA-4的表現量大大高於成年小鼠，且伊匹單抗 + 抗PD-1組合療法引起嚴重irAE (18)。有趣的是，發現經由抗PD-1處理，肺及脾Treg中之CTLA-4表現顯著增加(圖43A)。伊匹單抗與抗PD-1之組合療法引起表面與細胞內CTLA-4顯著下調回至與未經抗PD-1處理之Treg相同的量(圖43A)。另外，伊匹單抗在人類系統中引起的CTLA-4下調係藉由刺激來自健康供者血液之周邊血液單核細胞(PBMC)來測試。未活化人類血液Treg中之細胞表面CTLA-4含量極低(資料未展示)。藉由抗CD3與抗CD28刺激活化之後，細胞表面CTLA-4顯著增加，此顯著增加被伊匹單抗顯著下調(圖43B-C)。
已展示癌症免疫治療作用(CITE)類似的不同抗人類CTLA-4 mAb產生多種irAE (18)。臨床藥物伊匹單抗(而非人類CTLA-4 mAb HL12及HL32)與抗PD-1處理組合誘導嚴重irAE (18)。用相同序列之曲美單抗產生的抗CTLA-4單株IgG1抗體亦在具有CITE潛力之CTLA-4 h / h -KI新生小鼠模型中引起irAE (圖44A-C)。從而比較此等抗CTLA-4 mAb下調CTLA4的作用。如圖44-F中所示，伊匹單抗及曲美單抗(IgG1)而非HL12及HL32選擇性下調表現外源性CTLA-4之人類細胞株中的表面及細胞內CTLA-4。活體內研究亦表明，觸發強副作用的伊匹單抗，而非不引起任何irAE的HL12，使irAE CTLA-4 h / h -KI新生小鼠模型之肺及脾臟Treg中的表面及細胞內CTLA4含量下調(圖44G-H)。相應地，經伊匹單抗及HL12處理之人類活化Treg細胞展示類似結果(圖44I)。此等資料提供抗體誘導表面CTLA-4下調引起免疫療法相關副作用的重要證據。
由於CTLA-4自質膜組成性內化且經歷再循環與降解(19)，因此假設抗體誘導之表面CTLA-4下調可歸因於內化表面CTLA-4之溶酶體降解。此藉由用Alex488標記伊匹單抗及HL12且追蹤表面CTLA-4運輸來測試(圖45A-C)。簡言之，將表現CTLA-4之CHO細胞與伊匹單抗-Alex488或HL12-Alex488一起在4℃下培育，且表面CTLA-4經展示結合至抗體(圖45A)。將此等細胞恢復至37℃後，伊匹單抗與HL12標記之表面CTLA-4被內化。然而，內化CTLA-4定位模式在伊匹單抗處理與HL12處理之間明顯不同(圖45A)。細胞用溶酶體追蹤劑染色，發現引起CTLA-4顯著下調的伊匹單抗，而非對CTLA-4含量無作用的HL12，將細胞表面CTLA-4驅動至溶酶體進行降解(圖45B-C)。相應地，藉由伊匹單抗處理之細胞中之溶酶體阻斷來抑制CTLA-4下調，證實伊匹單抗而非HL12驅動表面CTLA-4被溶酶體降解之構思(圖45D)。
細胞表面蛋白靶向內化之後的早期核內體。在核內體中，配位體可由於低pH而與其同源受體解離，且核內體酸化期間發生的配位體與受體之間之持續結合係晚期溶酶體降解需要的(20-22)。基於此，進入溶酶體降解或再循環之表面CTLA-4的命運可在核內體酸化期間與其對抗CTLA-4 mAb之結合親和力關聯。為了對此進行測試，比較抗CTLA-4 mAb在核內體酸化過程中存在之不同pH條件下對CTLA4的結合。圖46A中之資料表明，在10 µg/ml下，伊匹單抗及曲美單抗(IgG1)在pH 7.0至pH 4.0展現類似的飽和結合，此預測此等複合物可以在細胞表面上(pH 7.0)、核內體(pH 5.0-6.5)或溶酶體(pH 4.5) pH下維持(圖46A-B)。相比之下，當pH達到核內體水準(pH更小或等於6.0)時，HL12及HL32開始失去對CTLA-4之結合親和力。如圖46B中所示，伊匹單抗及曲美單抗在pH 7.0及pH 5.5展現基本上相同的劑量反應。在pH 5.5下達成50%最大pH 7.0結合所需之抗體的量(IC50 )與pH 7.0下所需之抗體的量基本上相同。pH 4.5下之IC50 增加約50-250%。相比之下，當比較pH 5.5下之結合與pH 7.0下之結合時，基於IC50 之增加，HL12及HL32展現超過10倍的減少。當比較pH 4.5與pH 7.0下之結合時，又基於IC50 之增加，觀測到IC在pH 4.5下之減少大於在pH 7.0下之減少的100倍。CTLA-4已結合至抗體之後，當pH減小時，展示pH依賴性結合之類似結果(圖46C)。為了確立低pH下之結合親和力損失是否關係到內化期間抗體與CTLA-4之間的解離，表面CTLA-4在4℃下用抗CTLA-4 mAb標記，隨後使細胞移至37℃以允許CTLA-4內化及隨後降解或再循環回至質膜(圖46D-E)。在37℃下培育之後，抗體結合之CTLA-4被蛋白質G珠粒捕捉且藉由西方墨點法測試(圖46D-E)。資料清楚展示HL12及HL32，而非伊匹單抗及曲美單抗(IgG1)，在抗體誘導之CTLA-4內化期間與CTLA-4解離(圖46D)，此在核內體-溶酶體轉運期間藉由中和pH來拯救(圖46E)。
由於HL12及HL32內化之CTLA-4自抗體釋放且逃逸溶酶體降解，因此進行實驗以測試其是否可再循環回至質膜。藉由檢查再循環核內體標記物Rab11，發現由HL12觸發之內化CTLA-4與Rab11之共定位多於伊匹單抗處理(圖47A)，表明由HL12而非伊匹單抗觸發之內化CTLA-4再循環回至細胞表面。為了對此進行證實，將經GFP-CTLA-4轉染之293T細胞與對照IgG、伊匹單抗或HL12一起培育，且藉由共焦顯微鏡測試細胞表面CTLA-4 (圖47B)。如所預期，相較於具有完整表面CTLA-4之經對照hIgG-Fc處理之細胞，經伊匹單抗處理之細胞喪失細胞表面CTLA-4的大部分(圖6B)。經HL12處理之細胞大部分已展示表面CTLA-4，即使此等細胞之表面CTLA-4存在一些間隙，此可能歸因於未完成之再循環過程(圖47B)。
資料證明與抗CTLA-4 mAb誘導之irAE相關的重要原理。如圖47C中所示，在內化期間，在低pH下對CTLA-4具有強結合親和力的抗CTLA-4 mAb (如伊匹單抗或曲美單抗)將表面CTLA-4驅動至溶酶體降解，從而觸發由於表面CTLA-4損失所致的irAE。相比之下，在低pH下具有弱結合親和力的抗CTLA-4 mAb (如HL12或HL32)在抗體誘導的內化期間將與CTLA-4解離。自此等抗體釋放的表面CTLA-4將再循環回至細胞表面且維持CTLA-4作為免疫反應負調控因子的功能。此等發現為設計新穎抗CTLA4抗體或工程改造現有抗CTLA-4抗體而具有較佳抗腫瘤功效及較低毒性提供重要創新。
實例4
pH敏感性抗CTLA-4抗體在腫瘤微環境中之Treg耗乏及誘導已建立較大腫瘤之排斥反應方面更有效
pH敏感性(不容易發生irAE)抗CTLA-4抗體的關鍵為自CTLA-4解離，以允許其逃避溶酶體降解且再循環至細胞表面。本發明人意識到此特性可以有助於Treg耗乏，因為CTLA-4含量決定標靶對ADCC/ADCP之敏感性。鑒於Treg耗乏在腫瘤微環境中對於CITE必不可少的作用，因此考慮賦予較少irAE之pH敏感性如何影響CITE受到極大關注。比較在腫瘤微環境中在Treg耗乏方面對pH敏感及不敏感的抗體以及大腫瘤排斥反應。為測試抗體對腫瘤微環境中之Treg耗乏的功能，將抗體注射至先前第14天用MC38腫瘤攻擊之小鼠中。十六小時後，收集腫瘤且藉由流式細胞術評估CD4 T細胞中之Treg %。如圖48中所示，儘管HL12及HL32使Treg在16小時內顯著減少，但伊匹單抗在此時不耗乏Treg。
本發明人先前已證明，對於經歷四次處理之各種小腫瘤而言，伊匹單抗、HL12及HL32在誘導腫瘤排斥反應方面具有類似的功效(圖35)。鑒於HL12及HL32引起之Treg耗乏功效較佳，且鑒於Treg在抑制抗腫瘤T細胞反應方面之關鍵規則，因此在更具挑戰性之背景下，亦即，在帶有具有已充分建立之腫瘤微環境之大腫瘤的小鼠中，重新評估不同抗CTLA-4抗體的功效。先前第17天已接受MC38腫瘤(直徑平均尺寸為10 mm)的小鼠用每劑量1.5 mg/kg伊匹單抗或HL12及HL32處理兩次。如圖49中所示，在此相對較低劑量下，HL32比伊匹單抗顯著更有效(P＜0.0001)。HL12亦展示較佳功效之傾向，儘管差異未達到統計顯著性。
實例 2 及 3 之前引用的參考文獻
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圖1. CTLA-4-Fc之突變分析揭露伊匹單抗與L3D10結合至不同但重疊的抗原決定基。a-e. 基於小鼠及人類CTLA-4序列之晶體結構及變異，產生hCTLA-4-Fc突變體M17 (SEQ ID NO：1)及M17-4 (SEQ ID NO：2)。a. CTLA-4分子之完整性係根據其結合至經生物素標記之B7-1的能力來證實。對照hIgG-Fc WT (M1)及突變型(M17及M17-4) hCTLA-4-Fc蛋白質係以1 µg/ml之濃度塗佈於96孔盤上。添加不同劑量的經生物素標記之hB7-1-Fc以測試其結合能力，此係利用抗生蛋白鏈菌素-HRP量測。b-e. 對照hIgG-Fc WT (M1) (SEQ ID NO：3)及突變型(M17及M17-4) hCTLA-4-Fc蛋白係以1 µg/mL之濃度塗佈於96孔盤上。添加不同劑量之經生物素標記之L3D10或伊匹單抗以測試其對hCTLA-4-Fc分子的結合能力。結合特異性係根據其對WT CTLA-4-Fc (b)、而非對hIgG-Fc (c)的結合來證實。雖然M17中之4個突變使得對L3D10與伊匹單抗之結合完全失活(d)，但M17-4中之3個突變顯著消除對L3D10之結合，但不消除對伊匹單抗的結合(e)。
圖2. 若B7被固著，則伊匹單抗對B7-CTLA-4相互作用展現弱阻斷活性。a. 若使用可溶性B7-1進行結合分析，則伊匹單抗與L3D10均強有力地阻斷B7-CTLA-4相互作用。將不同劑量的抗人類CTLA-4 mAb以及0.025 µg/ml經生物素標記之人類B7-1-Fc添加至經1 µg/ml 人類CTLA-4-Fc塗佈的培養盤中。使用HRP結合之抗生物素蛋白來量測結合至培養盤之B7-1-Fc的量。所示資料為雙重複之平均值且代表兩次獨立實驗。b. 伊匹單抗對經生物素標記之人類CTLA-4-Fc的結合優於L3D10。將不同劑量之抗人類CTLA-4 mAb或對照IgG塗佈至培養盤上。添加0.25 µg/ml之經生物素標記之CTLA4-Fc。使用HRP結合之抗生蛋白鏈菌素來量測結合至培養盤之CTLA-4的量。所示資料為雙重複之平均值且代表兩次獨立實驗。c. 當mB7-1表現於CHO細胞上時，伊匹單抗對小鼠B7-1-人類CTLA-4相互作用發生可偵測但適度的阻斷。將不同劑量的抗人類CTLA-4 mAb以及200 ng 人類CTLA-4-Fc添加至1.2×105 個表現小鼠B7-1之CHO細胞中。相比之下，L3D10對小鼠B7-1與人類CTLA-4的結合展示強阻斷作用。所示資料為三重複資料之平均值與標準偏差且代表三次獨立實驗。d. L3D10而非伊匹單抗阻斷經聚組胺酸標記之人類CTLA-4與表現人類B7-1之CHO細胞之間的相互作用。將1.2×105 個表現人類B7-1之CHO細胞與200 ng經生物素標記且經聚組胺酸標記之CTLA-4連同指定劑量之抗體一起培育。藉由流式細胞術，利用PE-抗生蛋白鏈菌素偵測結合至CHO細胞之CTLA-4-Fc的量。所示資料(平均值±標準偏差)為三重複樣品之標準化平均螢光強度(MFI)且代表兩次獨立實驗。e. 伊匹單抗及L3D10對可溶性hCTLA-4與細胞表面表現之hB7-1之間的相互作用展現有差異的阻斷活性。將hB7-1陽性、FcR陰性L929細胞(1×105 /測試)與經生物素標記之CTLA-4-Fc (200 ng/測試)以及指定劑量之抗體一起培育。利用PE-抗生蛋白鏈菌素偵測B7所結合之CTLA-4-Fc的量，且計算PE之平均螢光強度(MFI)。資料代表兩次獨立實驗之結果。
圖3. 若B7-1或B7-2被固著，則伊匹單抗對B7-1-CTLA-4及B7-2-CTLA-4相互作用展現弱阻斷活性。(A-C)抗人類CTLA-4 mAb伊匹單抗及L3D10對B7-1-CTLA-4相互作用的阻斷活性。(A) hB7-1-Fc在0.5 µg/ml之濃度下固著。添加0.25 µg/ml之經生物素標記的CTLA-4-Fc以及指定劑量的抗體。(B)如同A，但其中在飽和劑量之伊匹單抗或L3D10 (100 µg/ml)存在下使用不同劑量的經生物素標記之CTLA-4-Fc。(C)如同A，但其中使用不同劑量的B7-1-Fc塗佈培養盤且使用飽和劑量的伊匹單抗或L3D10 (100 µg/ml)阻斷CTLA-4-B7-1相互作用。(D-F)抗人類CTLA-4 mAb伊匹單抗及L3D10對B7-2-CTLA-4相互作用的阻斷活性。(D)如同A，但其中使hB7-2-Fc固著。(E)如同B，但其中使hB7-2-Fc固著。(F)如同C，但其中使hB7-2-Fc固著。A-F中所示資料為450 nm雙重複或三重複光學密度之平均值。(G)阻斷CTLA-4與細胞表面hB7-1的相互作用。將表現hB7-1的CHO細胞與經生物素標記之CTLA-4-Fc以及指定劑量的抗體一起培育。利用PE-抗生蛋白鏈菌素偵測B7所結合之CTLA-4-Fc的量，且計算PE之平均螢光強度(MFI)。(H)阻斷CTLA-4與細胞表面mB7-2的相互作用。如同C，但其中使用表現mB7-2的CHO細胞。(I)阻斷CTLA-4-Fc結合至經由隔夜LPS刺激而成熟之脾臟DC。如同G及H，但其中各測試均使用0.5 µg/ml經LPS刺激之2×106 個脾細胞且閘選出CD11c高 DC (如圖5B)用於分析PE強度。所示資料(平均值±標準偏差)為三重複樣品之標準化MFI值。此圖中所示的資料已重複2-5次。
圖4. 調諧伊匹單抗之差異阻斷效應。(A-D)伊匹單抗不分解預形成之B7-CTLA-4複合物。(A，B)抗CTLA-4 mAb對與B7複合之CTLA-4的影響。B7-CTLA-4複合物係藉由將經生物素標記之CTLA-4添加至預塗有B7-1 (A)或B7-2 (B)之培養盤中而形成。將抗CTLA-4 mAb之分級劑量添加至預先存在B7-1-CTLA-4複合物(A)或B7-2-CTLA-4複合物(B)的培養盤中。兩小時後，洗掉未結合之蛋白質且使用經HRP標記之抗生蛋白鏈菌素偵測與B7-1或B7-2之CTLA-4的量。(C)B7與CTLA-4複合物之解離動力學(使用表現B7之CHO細胞，基於流式細胞術分析)。將表面表現hB7-1或mB7-2之CHO細胞(1X105 個/測試)與經生物素標記之可溶性CTLA-4-Fc (200 ng/測試)在室溫下一起培育30分鐘。洗滌之後，將細胞在100 µl DPBS緩衝液中培育指定的分鐘數。使用PE-抗生蛋白鏈菌素，藉由流式細胞術偵測B7所結合之CTLA-4-Fc的量，且利用三重複樣品計算PE之平均螢光強度(MFI)。所示資料為兩次獨立實驗之一的結果。(D) L3D10而非伊匹單抗顯著地中斷可溶性CTLA-4與CHO細胞上所表現之hB7-1之間預先建立的相互作用。將表面表現hB7-1之CHO細胞(1X105 個/測試)與經生物素標記之可溶性CTLA-4-Fc (200 ng/測試)在室溫下一起培育30分鐘。洗滌之後，將細胞與指定劑量之抗體一起在100 µl DPBS緩衝液中培育1小時。利用PE-抗生蛋白鏈菌素偵測B7所結合之CTLA-4-Fc的量，且計算PE之MFI。結果代表具有類似模式之三次獨立分析之一。(E)伊匹單抗不減輕CTLA-4-Fc介導抑制CD28-Fc對經B7-1轉染之J558細胞(J558-B7)的結合。將J558-B7細胞與經生物素標記之CD28-Fc (20 µg/ml)一起在CTLA-4-Fc (5 µg/ml)及抗CTLA-4 mAb或對照IgG-Fc之分級劑量存在下培育。所示資料為三重複樣品之MFI的平均值及S.E.M.且代表具有類似結果之至少三次獨立實驗。(F)當B7-1被固著時，B7-1-CTLA-4相互作用之動力學。(G)當CTLA-4被固著時，B7-1-CTLA-4相互作用之動力學。此圖中所示的資料已重複2-5次。
圖5. 細胞分析對B7-CTLA-4相互作用的表徵。a. 穩定表現人類hCTLA-4-OFP蛋白之野生型(WT，上圖)及Y201V突變型(下圖)之293T細胞的共聚焦影像。應注意，雖然WT hCTLA-4主要係細胞內的，但突變型hCTLA-4分子展示質膜分佈之明確模式。b. 圖6所用之細胞-細胞結合分析中的GFP+ OFP+ 細胞為細胞-細胞聚集體(基於其前向及側向散射)。在4℃共培育2小時之hB7-2-GFP-CHO及hCTLA-4Y201V -OFP-293T細胞之代表性流動分佈曲線。上圖展示GFP+ OFP+ 細胞之前向散射相對於側向散射，而下圖展示單一陽性細胞相對於雙陽性細胞之前向散射(左)及側向散射(右)的比較。c. 轉胞吞分析之表徵。上圖展示對圖7所呈現之資料使用的閘選，而下圖展示在37℃共培育4小時之後，CTLA-4-OFP-CHO細胞獲得來自hB7-2-GFP-CHO細胞的GFP信號，而前向及側向散射無變化。
圖6. 伊匹單抗阻斷B7/CTLA-4介導之細胞-細胞相互作用的效率低。(A)經B7-1-GFP或B7-2-GFP轉染之CHO細胞或經CTLA-4Y201V 轉染之293T細胞或B7-2與CTLA-4轉染體之混合物在不共培育情況下的分佈曲線。(B)對研究所用之Fab純度的SDS-PAGE分析。(C，D)代表性FACS分佈曲線(C，使用10 µg /ml的Fab)及劑量反應(D)展示L3D10與伊匹單抗Fab對經CTLA-4-OFP轉染之CHO細胞的結合類似。結合分析中使用Alex Fluor 488結合的山羊抗人類IgG (H+L)作為二次抗體。劑量反應展示伊匹單抗與L3D10 Fab之結合活性相似。AF488-MFI，Alex Fluor 488染料之平均螢光強度。(E)抗CTLA-4 mAb Fab抑制B7-1-CTLA-4Y201V 介導的細胞-細胞相互作用。經B7-1-GFP轉染的CHO細胞及經CTLA-4Y201V 轉染的293T細胞在10 µg/ml Fab或對照蛋白存在下、在4℃共培育2小時。所示資料為代表性FACS分佈。(F) L3D10與伊匹單抗之間在其阻斷細胞-細胞相互作用方面的定量比較，該相互作用係由相對細胞上所表現的B7-1及CTLA-4介導。如同E，但其中添加抗體的分級劑量。(G)抗CTLA-4 mAb Fab抑制B7-2-CTLA-4Y201V 介導的細胞-細胞相互作用。如同E，但其中使用B7-2-GFP轉染體。(H) L3D10與伊匹單抗之間在其阻斷細胞-細胞相互作用方面的定量比較，該相互作用係由相對細胞上所表現的B7-2及CTLA-4介導。如同F，但其中使用經B7-2-GFP轉染之CHO細胞。所有分析重複至少2次。
圖7. 伊匹單抗阻斷CTLA-4轉胞吞B7的效率低。(A)轉胞吞分析中所用之經B7-2-GFP或CTLA-4-OFP轉染之CHO細胞株的FACS分佈。(B) CTLA-4對B7-2的快速轉胞吞。B7-2-GFP轉染體及CTLA-4-OFP轉染體在37℃共培育0、0.5、1及4小時。(C) CTLA-4缺乏對B7-H2的轉胞吞。如同B，但其中改用經B7-H2-GFP轉染的P815細胞且提供共培養0、1及4小時時的資料。(D)代表性分佈曲線，其描繪在對照hIgG-Fc或來自伊匹單抗或L3D10之Fab (10 µg/ml)存在下共培養4小時期間，對表現CTLA-4-OFP之CHO細胞轉胞吞B7-1-GFP的有差異阻斷。(E)劑量反應曲線，其描繪L3D10及伊匹單抗Fab對B7-1轉胞吞的抑制。如同D，但其中將不同劑量的對照hIgG-Fc或Fab添加至共培養物中。(F)如同D，但其中使用經B7-2-GFP轉染的CHO細胞。(E)劑量反應曲線，其描繪L3D10及伊匹單抗Fab對B7-2轉胞吞的抑制。如同E，但其中使用經B7-2-GFP轉染之CHO細胞。所示資料(平均值±標準偏差)為在Fab之不同劑量下的轉胞吞%。所有分析重複至少3次。
圖8. 伊匹單抗不阻斷活體內B7-CTLA-4相互作用。(A)實驗設計圖。(B)代表性資料，其展示針對B7表現所分析之CD11b+ CD11c高 樹突狀細胞(DC)的表型。(C)代表性直方圖，其描繪接受對照hIgG-Fc、L3D10或伊匹單抗之小鼠之DC上的mB7-1含量。上圖中之資料展示同型接合人類CTLA4 基因敲入小鼠(Ctla4h / h )中之抗體效應，而下圖中之資料展示異種接合小鼠(Ctla4h / m )中之抗體效應。(D)如同C，但其中展示mB7-2表現。c及d中所示的資料代表每組3隻小鼠的彼等資料且重複一次。(E)在人類CTLA4 同型接合小鼠中，L3D10而非伊匹單抗誘導mB7-1 (左圖)及mB7-2 (右圖)上調。概述得自兩個實驗的所示資料(平均值±S.E.M.)，其涉及每組總共6隻小鼠。(F)如同E，但其中使用異型接合小鼠。L3D10與伊匹單抗均不阻斷共顯性地表現小鼠與人類Ctla4 基因之小鼠中的B7-CTLA-4相互作用。使用史都登氏t 檢驗(Student'st test)來確定統計顯著性。*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。n.s.，不顯著。
圖9. 儘管hIgG-Fc對照製劑中所偵測到之內毒素含量稍微高於抗CTLA4抗體製劑，但hIgG-Fc未時小鼠脾臟DC上之B7-1及B7-2表現上調。a, b. 在如圖5b中所描繪閘選之脾臟DC中，B7-1 (a)及B7-2 (b)表現之代表性分佈，該等脾臟DC來自經500 µg hIgG-Fc或等體積PBS處理的Ctla4h / h 小鼠。c, d. 脾臟DC上所表現之B7-1 (c)及B7-2 (d)之平均螢光強度的概述。每組n=5隻Ctla4h / h 小鼠。因此，經對照hIgG-Fc處理之小鼠的分佈曲線反映B7-1及B7-2之基本表現量。因此，伊匹單抗對hIgG-Fc無作用表示其不能活體內上調B7-1及B7-2，如圖8中所示。
圖10. L3D10、HL12、HL32及伊匹單抗結合至人類CTLA-4，但不結合至小鼠Ctla-4。所示資料為細胞內CTLA-4染色在所閘選之CD3+ CD4+ 細胞之間的點圖，其使用來自Ctla4h / h (上圖)或Ctla4m / m (下圖)小鼠的脾臟細胞。抗小鼠CTLA-4 mAb 4F10 (BD Biosciences)用作對照。
圖11. 伊匹單抗不阻斷活體內人類B7-人類CTLA-4相互作用。(A) FACS分佈曲線，其描繪人類白血球在用人類臍帶血CD34+ 細胞重建之NSGTM 小鼠之周邊血液白血球(PBL)中的組成。(B)如A中所分析之個別小鼠的總結資料。(C)人類化NSGTM 小鼠脾臟中之Tregs (中右圖)及DC (右圖)的正常組成。(D)小鼠脾臟之人類CD4 T細胞中的FOXP3及CTLA-4表現。(E，F) L3D10而非伊匹單抗在經人類臍帶血CD34+ 幹細胞重建之NSG™小鼠中阻斷人類B7-2-人類CTLA-4相互作用。人類化小鼠接受對照Ig或抗CTLA-4 mAb (500 µg/小鼠)之腹膜內處理。注射之後24小時收集脾細胞且分析DC上之B7-2表現。(E) DC上之hB7-2之代表性分佈曲線。(F)得自兩次獨立實驗的總結資料(平均值±S.E.M.)。對照小鼠之平均值資料人工定義為100且實驗組之彼等資料相對於對照組標準化。使用史都登氏t檢驗來確定統計顯著性。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。n.s.，不顯著。
圖12. 阻斷B7-CTLA-4相互作用無助於抗CTLA-4 mAb誘發癌症免疫治療活性及腫瘤內Treg耗乏。(A)儘管兩種抗CTLA-4 mAb的阻斷活性懸殊極大，但免疫治療作用類似。將5x105 或1x106 個MC38腫瘤細胞注射(皮下)至Ctla4h / h 小鼠(n=5-6)中，且小鼠在第7、10、13及16天用每個小鼠100 μg (左)、30 μg (中)或10 μg (右)伊匹單抗、L3D10或對照hIgG-Fc處理(腹膜內)，如箭頭所指示。資料表示每組5至6隻小鼠之平均值±S.E.M.。藉由雙向重複量測ANOVA (處理×次數)來進行統計分析。對於100 μg處理而言，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；L3D10相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；伊匹單抗相對於L3D10：P =0.0699。對於30 μg處理而言，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；L3D10相對於hIgGFc：P ＜0.0001；伊匹單抗相對於L3D10：P =0.9969。對於10 μg處理而言，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；L3D10相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；伊匹單抗相對於L3D10：P =0.9988。資料代表3-5次獨立實驗。(B)伊匹單抗與L3D10對B16黑色素瘤生長具有相似的治療作用。將1×105 個B16腫瘤細胞注射(皮下)至Ctla4h / h 小鼠(n=4-5)中，且小鼠在第11、14、17天(左)或在第2、5及8天(右)用100 μg (左)或250 μg (右)伊匹單抗、L3D10或對照hIgG-Fc處理(腹膜內)，如箭頭所指示。在左圖中，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P =0.0265；L3D10相對於hIgG-Fc：P =0.0487；伊匹單抗相對於L3D10：P =0.302。在右圖中，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P =0.00616；L3D10相對於hIgG-Fc：P =0.0269：伊匹單抗相對於L3D10：P =0.370，資料表示每組4-5隻小鼠的平均值±S.E.M.。(C-F)阻斷B7-CTLA-4相互作用無助於Ctla4h / h 小鼠之腫瘤微環境中之Treg的選擇性耗乏。第三次處理之後的第3天，L3D10及伊匹單抗不能耗乏小鼠脾臟(C)中的Treg。所示資料為Foxp3+ 細胞在Ctla4h / h 小鼠之CD4 T細胞中的百分比。每組n=6隻小鼠。L3D10與伊匹單抗均耗乏移植至Ctla4h / h 小鼠中之腫瘤中的Treg，如根據CD4 T細胞中之Treg %(D，上圖)、絕對Treg數目(D，下圖)及CD8/Treg比率(E)所確定。得自涉及每組7隻小鼠之兩次實驗的總結資料呈現於D (上圖)及E中。第三次抗體處理之後的第3天，藉由流式細胞術對Ctla4h / h 小鼠腫瘤中之Foxp3+ 細胞(d，下圖)數目計數。每組n=5。藉由普通單向ANOVA聯合杜凱氏多重比較檢驗(Tukey's multiple comparisons test)來進行統計分析。(F)阻斷B7-CTLA-4相互作用無助於腫瘤浸潤性CD4 (左)或CD8 (右)T細胞中之IFNγ產生細胞增加。總結資料得自涉及每組7隻小鼠的兩次實驗。第13天或第16天之間製備經膠原蛋白酶消化之小鼠腫瘤的單一細胞懸浮液且在高爾基體阻斷劑存在下培養4小時且針對細胞內細胞介素加以染色。(G-J)在兩種抗體皆不阻斷B7-CTLA-4相互作用的Ctla4h / m 小鼠中，L3D10與伊匹單抗均誘導穩定的腫瘤排斥反應及腫瘤內Treg耗乏。如同A，但其中使用表現小鼠與人類CTLA-4的異型接合小鼠。(G，H)較高劑量(G，100 µg/小鼠/注射)與較低劑量(H，10 µg/小鼠/注射)的抗體處理展示有效的治療作用。在G中，伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；L3D10相對於hIgG-Fc：P ＜0.0001；伊匹單抗相對於L3D10：P =0.4970。資料代表5次獨立實驗。Treg在兩種抗體活體內皆不顯著阻斷B7-CTLA-4相互作用之Ctla4h / m 小鼠之腫瘤(I)、而非脾臟(J)中受到選擇性地耗乏。C、D、E及I中所示的資料(平均值±S.E.M.)為腫瘤細胞攻擊之後第18天(實驗1)或第20天(實驗2)之Treg百分比以及第3或4次抗CTLA-4 mAb處理起始之後第11天或第13天的Treg百分比，如箭頭所指示。使用曼-惠特尼檢驗(Mann-Whitney test)確定C-F及I-J之統計顯著性。(K)抗FcR mAb投藥消除伊匹單抗之治療作用。將5x105 個MC38腫瘤細胞注射(皮下)至Ctla4h h 小鼠中，且小鼠在第7、10、13及16天上用30 μg單獨的伊匹單抗或30 μg伊匹單抗(黑色箭頭)加上1 mg 2.4G2 (紅色箭頭)或對照hIgG-Fc處理(腹膜內)，如所指示。藉由雙向重複量測ANOVA (處理×次數)來進行統計分析。伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P =0.0003；伊匹單抗加上2.4G2相對於hIgG-Fc：P =0.6962；伊匹單抗加上2.4G2相對於伊匹單抗：P =0.0259。
圖13. CTLA-4表現於腫瘤浸潤的Treg中。a. 腫瘤源FoxP3+ Treg中的CTLA-4表現高於Foxp3陰性CD4 T細胞。如同圖12，將MC38腫瘤細胞注射至Ctla4h / h 或Ctla4h / m 小鼠中且小鼠在第7、10及13天用100 µg/劑量之對照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb處理。第三次抗體處理之後的第五天，處死小鼠且對腫瘤細胞進行流式細胞術分析以測定腫瘤浸潤之CD45+ CD4+ Foxp3+ Treg及CD45+ CD4+ Foxp3- T細胞中的人類CTLA-4或小鼠Ctla-4表現。資料表示三次獨立實驗之一的結果。b, c. 來自腫瘤之Treg的表面CTLA-4與總CTLA-4表現高於與來自脾臟之Treg。如圖12中，MC38腫瘤接種之後的第14天，處死Ctla4h / h 小鼠以便對脾臟及腫瘤源CD4+ Foxp3+ Treg之表面CTLA-4 (b)及總CTLA-4 (c)表現進行流式細胞術分析。直方圖中之每條線表示一種個別小鼠。n=6隻小鼠且所示資料表示至少三次獨立實驗之一的結果。
圖14. 抗hCTLA-4 mAb對脾臟及腫瘤T細胞中之IFNγ及TNFα產生的影響。如圖12a中，將MC38腫瘤細胞注射至Ctla4h / h 小鼠中且小鼠在第7、10及13天用每劑100 µg對照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb處理。第三次抗體處理之後的第三天，處死小鼠，分析經處理小鼠之腫瘤(a、b)及脾臟(c-f)中之CD4 (a、c、e)及CD8 (b、d、f) T細胞中之IFNγ及TNFα表現細胞的頻率。總結資料得自涉及每組7隻小鼠的兩次實驗。
圖15. 失去阻斷活性之人類化L3D10抗體後代(HL12及HL32)對局部Treg耗乏及腫瘤排斥反應仍然有效。(A) HL12、HL32及L3D10對1 μg/ml經固著、經聚組胺酸標記之CTLA-4的結合活性。(B) HL12及HL32不能阻斷B7-1-CTLA-4相互作用。B7-1-Fc係在0.5 µg/ml之濃度下固著。添加0.25 µg/ml之經生物素標記之CTLA-4-Fc以及分級濃度之抗CTLA-4 mAb。(C) HL12及HL32幾乎不阻斷B7-2-CTLA-4相互作用。如同B，但其中使B7-2-Fc固著。(D) HL12及HL32不能活體內上調B7-1及B7-2。如同圖8，Ctla4h / h 小鼠接受500 µg/小鼠/注射之對照hIgG-Fc或抗CTLA-4 mAb。次日收集脾臟細胞，測定CD11b+ CD11c高 DC上之B7-1及B7-2含量，如圖8中所詳述。每組n=3。(E-G)類似於L3D10，HL12及HL32展示Ctla4h / h 小鼠之腫瘤微環境中之Treg的選擇性耗乏。如圖12中，L3D10、HL12及HL32誘發腫瘤中之Treg的類似且高效耗乏(E)，但不能使脾臟(F)及腫瘤引流淋巴結(G)中之Treg耗乏。彙集得自2次實驗之所示資料。每組n=5隻小鼠。100 µg指定藥物一次注射之後的第一天處死小鼠。(H)伊匹單抗及人類化L3D10抗體HL12及HL32有效排斥MC38腫瘤。在腫瘤細胞接種之後的第7、10、13及16天，用100 µg對照IgG-Fc或伊匹單抗或HL12、HL32處理具有MC38的小鼠。所示資料為腫瘤體積之平均值及S.E.M.。每組n=6隻小鼠。藉由雙向重複量測ANOVA (處理×次數)來進行統計分析。伊匹單抗相對於hIgG-Fc：P =0.034；HL12相對於hIgG-Fc：P =0.037；HL32相對於hIgG-Fc：P =0.0336；HL12相對於伊匹單抗：P =0.9021；HL32相對於伊匹單抗：P =0.9972；HL32相對於HL12：P =0.7250。(I) HL32及L3D10在最小疾病模型中、在處理B16腫瘤細胞方面同等有效。將1×105 個B16腫瘤細胞注射(皮下)至Ctla4h / h 小鼠(n=4-5)中，且小鼠在第2、5及8天用250 μg伊匹單抗、L3D10、HL32或對照IgG-Fc處理(腹膜內)。HL32相對於hIgG-Fc：P =0.0002；L3D10相對於HL32：P =0.9998；伊匹單抗相對於HL32：P =0.8899。資料表示每組5至6隻小鼠之平均值±S.E.M.。
圖16. 儘管無能力阻斷CTLA-4-B7相互作用，但HL12及HL32對周邊淋巴器官及腫瘤中之T細胞亞群的豐度展現的影響與L3D10相似。a. HL12及HL32阻斷可溶性B7結合至所固著之CTLA-4-Fc的能力被消除。hCTLA-4-Ig在0.25 µg/ml之濃度下固著於96孔ELISA盤上。添加0.25 µg/ml之經生物素標記之hB7-1-Fc以及指定劑量之抗CTLA-4 mAb (L3D10、HL12及HL32)或對照hIgG-Fc。洗滌之後，利用HRP結合之抗生物素蛋白偵測培養盤所結合之經生物素標記之hB7-1-Fc。所示資料為450 nm三重複光學密度之平均值。結果代表3次獨立實驗。b, c. 如同L3D10，HL12及HL32優先排除腫瘤浸潤的Treg。如同圖12e-12g，分析腫瘤、脾臟及腫瘤引流淋巴結(dLN)中之CD8 T細胞(上列)、CD4+ Foxp3- T細胞(中列)及CD4+ Foxp3+ Treg (下列)的頻率(b)及數目(c)。初始閘選活CD45+ 白血球以定量多個組織中之T細胞亞群的頻率(T亞群/CD45+ 細胞×100%)，且使腫瘤中之T細胞亞群的數目相對於腫瘤重量(公克)標準化。100 µg指定藥物一次注射之後的第一天處死小鼠。彙集得自2次實驗的所示資料。每組n=5隻小鼠。
圖17. 易普單抗(Ipilumumab)不能藉由阻斷CTLA-4-B7負向信號傳導而達成治療作用。(A)證實抗B7 mAb之阻斷活性。表現小鼠B7-1或B7-2之CHO細胞與抗體(20 µg/ml)及經生物素標記之人類CTLA-4-Fc (2 µg/ml)之混合物一起培育1小時。洗掉未結合之蛋白質之後，細胞表面CTLA-4-Fc藉由PE結合之抗生蛋白鏈菌素偵測且藉由流式細胞術量測。所示資料為代表性FACS分佈且重複2次。(B)實驗設計圖。具有MC38腫瘤之Ctla4h / m 小鼠接受抗B7-1及抗B7-2抗體(300 µg/小鼠/注射，每3天一次，總共3次注射)聯合對照Ig或伊匹單抗，接受伊匹單抗而不接受抗B7-1及抗B7-2的小鼠用作腫瘤排斥反應之陽性對照。(C，D)藉由如圖B中所示之抗體處理使B7-1及B7-2飽和。第13天最近一次抗B7處理之後的第24小時，PBL用FITC結合之抗B7-1及抗B7-2 mAb染色。來自Cd80 -/- Cd86 -/ 該小鼠的PBL用作陰性對照。(E) B7-2活體內被完全阻斷。如同C及D，但其中使用自具有MC38之小鼠之引流淋巴結之單一細胞懸浮液中閘選出的CD45+ 白血球。上圖描繪B7-2染色之分佈，而下圖展示平均螢光強度。此研究已重複3次。(F)抗體反應的消除證實抗B7-1及抗B7-2 mAb對B7的功能阻斷。腫瘤攻擊之後的第22天收集血清以評估抗人類IgG抗體反應。(G)抗B7-1及抗B7-2 mAb的飽和阻斷不影響伊匹單抗之免疫治療作用。g中所示的資料為隨時間變化的腫瘤體積且重複兩次而結果相似。D-G中的資料表示平均值±S.E.M.。n.s.：不顯著。
圖18. 抗B7 mAb之活體內處理防止伊匹單抗介導之T細胞活化及CD8 T細胞之重新預致敏。(A)抗B7-1 (1G10)及抗B7-2 (GL1) mAb對B7的功能阻斷防止伊匹單抗誘導CD4 T細胞活化。具有MC38腫瘤的Ctla4h / h 小鼠(每組n=5)在第7、10及13天腹膜內用hIgG-Fc (100 μg/小鼠/注射)、伊匹單抗(100 μg/小鼠/注射)或伊匹單抗加上抗mB7 mAb (300 μg 1G10加上300 μg GL1/小鼠/注射)處理且在第14天安樂死。性別及年齡匹配的無腫瘤Ctla4h / h 小鼠用作對照初始小鼠。得自此等小鼠的脾臟藉由MACS負向選擇加以純化且與未處理脾臟DC在10 μg/ml hIgG-Fc存在下共培養4天。上清液中之Th2細胞介素(包括IL-4、IL-6及IL-10)含量藉由細胞介素珠粒分析(CBA)定量。(B，C)抗B7 mAb防止伊匹單抗誘導抗原特異性CD8 T細胞預致敏。如同A，但其中所有小鼠(每組n=4)在第8天皮下用50 µg在100 µl弗氏完全佐劑(CFA)中乳化的SIY肽免疫。小鼠在第15天處死且收集腫瘤引流淋巴結，以藉由四聚體染色來評估SIY特異性CD8 T細胞(基於CD3+ CD4- 細胞來閘選)。OVA四聚體用於對照染色。展示代表性FACS分佈(B)及總結資料(C)。所示資料代表結果相似的兩次獨立實驗。
圖19. 評估常用抗小鼠Ctla-4 mAb 9H10及9D9之阻斷活性。a, b. 若將B7-1 (a)及B7-2 (b)塗佈於培養盤上，則9H10不阻斷B7-CTLA-4相互作用。經生物素標記之小鼠Ctla-4-Fc融合蛋白與B7塗佈的培養盤一起在指定濃度的對照IgG或抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9及9H10存在下培育。所示資料為雙重複孔之平均值且代表兩次獨立實驗。c, d. 9D9及9H10展現對可溶性(c)及培養盤所結合之Ctla-4-Fc (d)的差異結合能力。MPC-11 (小鼠IgG2b)及倉鼠IgG (Ham IgG)為同型匹配的對照Ig蛋白。所示資料為雙重複孔之平均值且代表至少兩次獨立實驗。e, f. 抗小鼠Ctla-4 mAb 9D9及9H10上調WT (Ctla4m / m )小鼠之脾CD11c高 DC上之B7-1 (e)及B7-2 (f)含量的差異作用。用500 µg抗體處理之後的第24小時，處死小鼠且收集脾細胞立即進行流式染色。IgG組指示接受500 µg MPC-11及500 µg Ham IgG之小鼠。在涉及每組各3隻小鼠之兩次獨立實驗中，總結每組6隻獨立小鼠的資料(平均值±S.E.M.)。e及f中之統計顯著性係使用史都登氏t 檢驗確定。*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。n.s.：不顯著。
圖20. 抗小鼠Ctla-4 mAb 4F10之活體外及活體內不同阻斷活性。a, b. 4F10對Ctla-4Fc與培養盤所塗之B7-1 (a)或B7-2 (b)相互作用的影響。經生物素標記之小鼠Ctla-4-Fc融合蛋白與B7塗佈之培養盤一起在指定濃度之對照IgG或抗小鼠Ctla-4 mAb 4F10存在下培育。使用HRP結合之抗生物素蛋白偵測Ctla-4-Fc結合。所示資料為雙重複之平均值且代表兩次獨立實驗。c, d. 4F10對CD11c高 樹突狀細胞上之B7-1及B7-2表現的影響。藉由流式細胞術分析腹膜內投與500 μg 4F10或hIgG-Fc之WT (Ctla4m / m )小鼠之脾臟細胞中的B7含量。B7-1 (c)及B7-2 (d)含量之總結資料(平均值±S.E.M.)來自每組6隻小鼠。對照IgG處理組中之B7含量人工定義為100。
圖21. L3D10及伊匹單抗展現類似的抗腫瘤活性。具有MC38腫瘤的Ctla4h / h 小鼠(n=5)在第7、10、13及16天接受對照hIg、伊匹單抗或L3D10 (30 µg/注射x4)之處理。每3天量測腫瘤生長。資料為平均值±S.E.M.且再現超過3次。藉由雙向重複量測ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗(Bonferroni multiple comparison test)來分析統計顯著性。hIg相對於Ipi，P=0.0335；hIg相對於L3D10，P=0.0248；Ipi相對於L3D10，P=0.6928。
圖22. 來自新生小鼠及帶有腫瘤之成年小鼠的Treg表現CTLA-4分子的量高於初始成年小鼠。A.新生小鼠(10日齡雄性小鼠，灰線)與成年小鼠(2-3月齡雄性小鼠，黑線)之間的比較。所示資料為雄性小鼠(n=3)之脾臟中的Foxp3+ CD4+ Treg分佈。B.初始(黑線)與具有腫瘤(灰線)之成年雄性小鼠(3月齡，n=6)之間的比較。所示資料為FACS分佈曲線，其描繪Foxp3+ CD4+ 細胞中之總CTLA-4的分佈。差異具統計顯著性且已再現至少五次。
圖23.在人類CTLA4 基因敲入的小鼠中，當單獨或與抗PD-1 mAb組合使用時，抗CTLA-4 mAb伊匹單抗的irAE有別於L3D10：生長遲緩及純紅血球發育不全。(A)抗體處理及分析之時間軸。C57BL/6Ctla4h / h 小鼠在第10、13、16及19天分別用劑量為100 µg/小鼠/注射的對照人類IgG-Fc、抗人類CTLA-4 mAb伊匹單抗、人類IgG1 Fc嵌合L3D10 + 人類IgG-Fc、抗PD-1 (RMP1-14) + 人類IgG-Fc、抗PD-1 + 伊匹單抗，或抗PD-1 + L3D10加以處理。出生之後的第41天進行CBC分析且出生之後的第42天進行屍檢。為了避免籠子偏差，同籠小鼠個別地標記且用不同抗體處理。測試雙盲進行。(B)伊匹單抗 + 抗PD-1引起雌性小鼠生長嚴重遲緩。伊匹單抗 + 抗PD-1處理組中的一隻雌性小鼠由於第22天因生長嚴重遲緩死亡而自分析排除。所示資料為第一次注射之後之體重增加%的平均值及S.E.M.。hIg相對於伊匹單抗 + 抗PD-1，P ＜0.0001；L3D10 + 抗PD-1相對於伊匹單抗 + 抗PD-1，P =0.003。(C)伊匹單抗 + 抗PD-1引起雄性小鼠生長嚴重遲緩。如同B，但其中使用雄性小鼠。hIg相對於伊匹單抗 + 抗PD-1，P =0.0116；L3D10 + 抗PD-1相對於伊匹單抗 + 抗PD-1，P =0.0152。群組標記之後的括弧中包括所用小鼠的數目。(D-G)小鼠模型中再現之純紅血球發育不全，其為irAE之典型表型。(D)伊匹單抗 + 抗PD-1組合療法減小血容比(HCT)、血紅素(Hb)及平均紅血球體積(MCV)。所示資料為2至3次獨立實驗之概述，其中各點表示一隻個別小鼠(對於雄性小鼠為藍色且對於雌性小鼠為紅色，且每組n=9-22隻小鼠。(E)骨髓中之紅血球產生缺乏。相片描繪接受指定處理之小鼠中之骨骼(上圖)及骨髓沖洗液(下圖)之顏色變化。(F)藉由流式細胞術分析紅血球發育。所示資料為代表性FACS分佈曲線，其描繪骨髓細胞中之Ter119、CD71及前向散射(FSC-A)之分佈。指示I-V期之細胞閘選及%。(G)紅血球系細胞在各發育階段之%的總結資料。所示資料為每組3-4隻雌性小鼠之資料的平均值及S.E.M.，且在雄性與雌性小鼠中重複至少三次。所用統計學檢驗：B及C，雙向重複量測ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗；D及G，單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗，及非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗(Kruskal-Wallis test))聯合鄧氏多重比較檢驗(Dunn's multiple comparisons test)。
圖24.如圖23中所概述進行抗體處理之後的正常血球參數。所示資料為2-3次獨立實驗的總結，其中各點表示個別小鼠(深灰色表示雄性小鼠且較淺灰色表示雌性小鼠)。藉由非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)聯合鄧氏多重比較檢驗來分析CBC結果。成對比較時未發現統計顯著差異。NE，嗜中性球；WBC，白血球；RBC，紅血球；MO，單核球；LY，淋巴球；EO，嗜伊紅血球；RDW，紅血球分佈寬度；PLT，血小板；MPV，平均血小板體積。
圖25.伊匹單抗當與抗小鼠PD-1組合使用時引起心臟缺損。(A)大體解剖學展示經抗PD-1 + 伊匹單抗處理之小鼠儘管身體尺寸減小，但心臟腫大。左圖相片得自福馬林固定的心臟，其來自接受指定處理的小鼠，且右圖資料展示相對於體重標準化之後的尺寸。(B)宏觀影像，其描繪腫大的心房及心室，以及相應薄化的心壁。(C)經對照hIg、L3D10 + 抗PD-1或抗PD-1 + 伊匹單抗處理之心臟的組織學。上4個圖展示主動脈基底之H&E染色，而下4個圖展示左心室之心肌發炎。(D)藉由免疫組織化學(上圖)及使用FITC標記之CD4或CD8、若丹明(Rhodamine)標記之抗CD3或抗Foxp3抗體進行之三色免疫螢光染色(下圖)鑑別白血球及T細胞。(E)接受不同處理之雄性及雌性小鼠(n=5-12)的複合病理學分數。雄性小鼠之分數用藍色圓圈指示，而雌性小鼠之分數用紅色圓圈指示。自6次獨立實驗收集樣品且進行雙盲評分。資料為平均值±S.E.M.且藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗加以分析。
圖26. 大體解剖學及H&E染色展示伊匹單抗 + 抗PD-1處理之後的卵巢及子宮發育不全。如圖23及圖25，出生之後的第42天進行屍檢。
圖27.伊匹單抗使血清中的ACTH含量增加。C57BL/6Ctla4h / h 小鼠在第10、13、16及19天分別用劑量為100 µg/小鼠/注射的對照人類IgG Fc、抗PD1、抗人類CTLA-4 mAb伊匹單抗、L3D10、HL12或HL32處理。出生之後第42或43天收集血清。使用針對促腎上腺皮質激素的酶聯免疫吸附分析套組(Cloud-Clone Corp.，目錄號SEA836Mu)來量測血清ACTH含量。每組n=8-18隻小鼠。藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗來分析統計顯著性。
圖28.伊匹單抗當作為單一藥劑或與抗PD-1組合使用時引起多個器官發炎。(A)不同器官之H&E染色石蠟切片的代表性影像。代表性發炎病灶用箭頭標示。比例尺：200 µm。(B)內臟及腺體之毒性分數。雄性小鼠之分數用深灰色圓圈指示，而雌性小鼠之分數用較淺灰色圓圈指示。(C)所有器官及腺體之複合分數。資料為平均值±S.E.M.，每組n=5-12隻小鼠。自6次獨立實驗收集樣品且雙盲評分。藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗來分析資料。
圖29.第10天開始比較接受免疫治療藥物之小鼠之全身T細胞活化。(A)抗PD-1及抗CTLA-4對CD4 (上圖)及CD8 (下圖) T細胞頻率的影響輕微。所示資料為抗體處理開始之後的第32天，脾臟中之CD4及CD8 T細胞%。(B)代表性FACS分佈曲線，其描繪接受單一療法及抗PD-1 + 伊匹單抗組合療法之小鼠在圍產期期間之記憶體及效應子CD4 (上圖)或CD8 (下圖) T細胞增加。(C，D)如所指示接受抗PD-1 + 抗CTLA-4 mAb組合療法之小鼠中之CD4 (C)及CD8 (D) T細胞表型的總結資料。所示資料為初始表型(左)、中心記憶體(中)及效應子(右)記憶體表型之細胞%。總結涉及每組7-11隻雌性小鼠及2-6隻雄性小鼠之四次實驗的所示資料。所用統計學檢驗：A，單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗；C及D，單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗。
圖30. 伊匹單抗使經伊匹單抗處理之小鼠之脾臟中的Treg頻率增加。C57BL/6Ctla4h / h 小鼠在第10、13、16及19天分別用劑量為100 µg/小鼠/注射的對照人類IgG Fc、抗PD-1或抗CTLA-4 mAb伊匹單抗或L3D10與抗PD-1組合處理。收集脾臟且在出生後第42天藉由流式細胞術評估脾CD4 T細胞中之Foxp3+ Treg百分比。藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗來分析統計顯著性。
圖31. 伊匹單抗與抗PD-1組合優先擴增自體反應性Teff。(A)育種流程圖。用兩個步驟產生小鼠。第一步驟為如所指示之兩個近交品系之間的異型雜交。第二步驟為F1的互交，以獲得為研究所設計之基因型(H - 2d + Ctla4h / h 或 h / m Mmtv8 + 9 + )的小鼠。(B)實驗時間軸之圖。(C)代表性FACS分佈，其描繪接受抗體處理之小鼠之所閘選CD4 T細胞中的Vβ11、Vβ8及Foxp3標記分佈。(D) VSAg反應性(Vβ5+ 、11+ 或12+ ，上圖)及非反應性(Vβ8+ ) CD4 T細胞中的Treg/Teff複合比率。(E)對胸腺細胞缺乏影響。如同D，但其中分析CD3+ CD4+ CD8- 胸腺細胞。所示資料為平均值及標準偏差，每組n=6-7隻小鼠。
圖32. 伊匹單抗結合至人類CTLA-4，但不結合至小鼠CTLA-4。所示資料為細胞內CTLA-4染色在所閘選之CD3+ CD4+ 細胞之間的點圖，其使用來自Ctla4h / h (上圖)或Ctla4m / m (下圖)小鼠的脾臟細胞。使用經生物素標記之hIg及伊匹單抗進行細胞內染色。抗CD3 (純系145-2C11)、CD4 (純系RM4-5)、FoxP3 (純系FJK-16s) mAb及FoxP3染色緩衝液購自eBioscience。
圖33. 當與抗PD-1 mAb以組合療法使用時，人類化L3D10純系維持安全分佈。(A)比較人類化L3D10純系HL12及HL32與伊匹單抗在圍產期期間使用時之組合毒性。除所用抗體之變化之外，實驗方案與圖23A中所描繪相同。(B)當與抗PD-1抗體組合使用時，伊匹單抗而非人類化L3D10純系HL12及HL32誘導貧血。(C)小鼠經免疫治療藥物之指定組合的對照物處理之後的內臟及腺體之病理學分數。(D)複合病理學分數。深灰色圓圈表示雄性小鼠之分數且較淺灰色分數表示所用雌性小鼠。所有評分均雙盲進行。資料為平均值±S.E.M.，每組n=5-12隻小鼠。自5次獨立實驗收集樣品且雙盲評分。所用統計學方法為：A.重複量測雙向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗；B.非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)聯合鄧氏多重比較檢驗；C及D.單向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗。
圖34. 接受指定免疫治療劑之人類化小鼠之脾臟中之CD4及CD8 T細胞活化表型。如圖23A中所示處理小鼠，但其中使用人類化L3D10純系(HL12及HL32)。所示資料為抗體處理開始之後第32天之CD4 (上圖)及CD8 (下圖)脾臟T細胞之百分比及表型。概述涉及每組5-11隻小鼠之3次實驗的資料(較淺灰色：雌性；深灰色：雄性)。藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼多重比較檢驗及非參數單向ANOVA (克拉斯卡-瓦立斯檢驗)聯合鄧氏多重比較檢驗來分析統計顯著性。
圖35. 比較HL12及HL32與伊匹單抗之免疫治療作用。(A，B)具有MC38之Ctla4h / m 小鼠(n=5)第7、10、13及16天腹膜內用30 µg (A)或10 µg (B)對照hIg、伊匹單抗、HL12或HL32處理。(C，D)具有CT26之Ctla4 h / m 小鼠(n=6-10)在第7、10、13及16天腹膜內用150 µg (C)或100 µg (D)對照Ig、伊匹單抗、HL12或HL32處理。(E，F)具有B16之Ctla4 h / h 小鼠(n=5-6)腹膜內用250 µg對照Ig、伊匹單抗、HL12 (E)或HL32 (F)處理。資料為平均值±S.E.M.且藉由重複量測雙向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗來分析資料。在所有配置中，相較於對照hIgG，HL12及HL32誘導統計顯著的腫瘤排斥反應：HL12 (A，P =0.0023；B，P =0.0105；C，P ＜0.0001；D，P =0.0272；E，P ＜0.0001)；HL32 (A，P =0.004；B，P =0.0059；C，P ＜0.0001；D，P =0.0259；F，P =0.1003)。在除一種(C)配置之外的所有配置中，伊匹單抗亦誘導顯著的腫瘤排斥反應(A，P =0.0026；B，P =0.0231；C，P =0.2；D，P =0.0003；E，P =0.0145；F，P =0.0234)。不同治療性抗體之間的差異在統計學上不顯著。
圖36.C57BL / 6 . Ctla4h / m 小鼠中所顯現之irAE及CITE的基因需求不同。(A-C)評估irAE。指定基因型之雌性小鼠(n=5)在圍產期期間用對照人類IgG (hIg)或抗PD-1 + 伊匹單抗處理且評估6週齡時之體重增加、發炎及紅血球貧血。(A)伊匹單抗 + 抗PD-1組合誘導Ctla4h / h 小鼠而非Ctla4h / m 小鼠出現生長遲緩。(B)除一些小鼠之唾液腺被適度誘導之外，伊匹單抗 + 抗PD-1不誘導異型接合小鼠之內臟發炎。(C)伊匹單抗 + 抗PD-1不誘導異型接合小鼠之紅血球貧血。(D)伊匹單抗誘導有效的腫瘤排斥反應。具有腫瘤之Ctla4h / h 及Ctla4h / m 小鼠在第7、10、13及16天接受對照hIg或伊匹單抗(100 µg/注射×4)之處理。每3天量測腫瘤生長。資料為平均值±S.E.M.且所示全部資料再現2次。(E)伊匹單抗 + 抗PD-1不引起Ctla4h / m 小鼠之全身T細胞活化。描繪CD44及CD62L分佈之代表性FACS分佈曲線展示於左側且總結資料展示於右側。A及D中之資料係藉由重複量測雙向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗來分析；而B、C及E中之資料係藉由不成對雙尾史都登氏t 檢驗來分析。
圖37. 6-7週齡年輕成年小鼠及10日齡有腫瘤小鼠之irAE及CITE。(A-C)具有MC38之年輕雄性小鼠(7週齡)接種MC38腫瘤細胞且在腫瘤細胞攻擊之後的第7、10、13及16天用對照hIgG、伊匹單抗、HL12或HL32 (100 µg/注射×4)處理。(A)隨時間變化之腫瘤體積。(B)腫瘤攻擊之後第25天的血清TNNI3含量藉由ELISA測定。(C) H&E染色展示心肌之透明蛋白變性及發炎。比例尺100 µm。(D，E)具有MC38之年輕雄性小鼠(6週齡)接種MC38腫瘤細胞且在腫瘤細胞攻擊之後的第7、10、13及16天用對照hIgG、伊匹單抗或伊匹單抗 + 抗PD-1處理(100 µg/注射×4)。(D)隨時間變化的腫瘤體積。(E)腫瘤攻擊之後第25天的血清TNNI3含量係藉由ELISA測定。(F) 10日齡小鼠用MC38腫瘤攻擊，且在14、17、20及23日齡時起始免疫療法，且提供隨時間變化的腫瘤尺寸。資料為平均值±S.E.M.且藉由重複量測雙向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗加以分析。hIg相對於伊匹單抗或Ipi + 抗PD-1，P ＜0.0001；伊匹單抗相對於Ipi + α-PD-1，ns。(G)組合療法及單一療法誘導多個器官發炎。提供來自唾液腺及肺的代表性H&E切片。比例尺，100 µm。B及E，資料為平均值±S.E.M.且分析統計顯著性。
圖38A-F. 初始T細胞損失且效應記憶T細胞的增加與多個器官發炎相關。所示資料為圖16、25、28、29及33中所呈現之資料的再分析。初始T細胞：CD44Lo CD62LHi ；中心記憶T細胞：CD44Hi CD62LHi ；效應記憶T細胞：CD44Hi CD62LLo 。線性回歸中之相關係數及P 值係藉由帕耳遜方法(Pearson's method)來計算。
圖39. 伊匹單抗誘導有腫瘤小鼠出現中度腎功能異常。具有MC38之小鼠在第7、10、13及16天用100 µg/注射/小鼠處理3或4次。腫瘤接種之後的第18 -25天收集血清。A.第18-20天，具有MC38之hCTLA4-KI小鼠之血清中的肌酐及BUN含量(紅色：雌性；藍色：雄性)。B.腫瘤接種之後的第25天，具有MC38之hCTLA4-KI小鼠(皆為雄性)之血清中的肌酐及BUN含量。使用肌酐(血清)比色分析套組(Cayman Chemical)或肌酐(CREA)套組(RANDOX，目錄號CR2336)量測肌酐含量。使用UREA NITROGEN DIRECT套組(Stanbio laboratory)量測血清BUN含量。藉由史都登氏t 檢驗來確定統計顯著性。
圖40. 基於複合病理學分數，人類化進一步改良L3D10之安全性。深灰色點表示雄性小鼠之分數且較淺灰色點表示所用雌性小鼠。所有評分皆雙盲進行。資料為平均值±S.E.M.，且每組n=9隻小鼠。藉由單向ANOVA聯合邦弗朗尼氏多重比較檢驗來確定統計顯著性。
圖41. 引起irAE及CITE的不同機制。(A) irAE係因抑制自體反應性T細胞轉化成自體反應性Treg而引起，此轉化導致自體反應性T細胞在周邊淋巴器官中發生多株擴增。(B)腫瘤排斥反應係藉由FcR介導腫瘤微環境中之Treg耗乏而達成且不依賴於周邊淋巴器官中之初始T細胞活化。irAE與CITE均不依賴於對B7-CTLA-4相互作用的阻斷。
圖42. 臨床抗CTLA-4 mAb伊匹單抗誘導細胞表面CTLA-4下調。A-B，經橙色螢光蛋白(OFP)標記之人類CTLA-4分子轉染的293T細胞與對照IgG或伊匹單抗(IP)一起培育4小時。(A)OFP之螢光係藉由流式細胞術偵測。B.在環己醯亞胺(CHX)之存在或不存在下，藉由西方墨點法分析A中之CTLA-4蛋白含量。C.藉由市售抗CTLA-4 mAb (BNI3)染色來測試A中之細胞表面CTLA-4，該市售mAb對細胞表面CTLA-4的結合強，即使在飽和劑量的伊匹單抗存在下亦強。D.分離出A中之質膜蛋白質且藉由西方墨點法偵測表面CTLA-4。E.表現人類CTLA-4的CHO穩定細胞株用對照IgG或伊匹單抗(IP)處理4小時。CTLA-4蛋白含量係藉由西方墨點法分析。F.藉由流式細胞術測試E中之細胞表面CTLA-4。G.分離出E中之質膜蛋白質且藉由西方墨點法偵測表面CTLA-4。H.在C57BL/6 Ctla-4 h / h -KI小鼠中誘導MC38小鼠結腸癌模型。藉由膠原蛋白酶消化分離出腫瘤細胞且活體外用對照IgG或伊匹單抗(IP)處理4小時。藉由流式細胞術測試腫瘤浸潤性Treg之表面及細胞內CTLA-4。I.具有MC38之Ctla4 h / h 小鼠在腫瘤接種之後的第14天腹膜內用100 μg對照IgG或伊匹單抗(IP)處理16小時。藉由流式細胞術測試腫瘤浸潤性Treg之表面及細胞內CTLA-4。C及H中之結果為一式三份(平均值±SEM)。I中之資料為平均值±SEM (n=8)。*p＜0.05，**p＜0.01。不成對雙尾史都登氏t檢驗。
圖43.伊匹單抗在免疫治療相關不良效應(irAE)模型中及活化人類Treg中誘導細胞表面CTLA-4下調。A. CTLA-4 h / h -KI新生小鼠(n=5)腹膜內用抗PD-1 (100 ug)處理24小時或48小時。此後，小鼠腹膜內用100 μg對照IgG或伊匹單抗進一步處理4小時。藉由流式細胞術評估肺及脾臟Treg之表面及細胞內CTLA-4。B-C.來自健康供者血液的人類PBMC用抗CD3/抗CD28刺激2天且用對照IgG或伊匹單抗(IP)處理4小時。藉由流式細胞術量測CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg及CD4+ CD25+ Foxp3- 非Treg之表面CTLA-4(B)。對來自四個健康供者之CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg的分析已展示於(C)中。資料為平均值±SEM。*p＜0.05，**p＜0.01，#p＜0.001。不成對雙尾史都登氏t檢驗。
圖44. 抗體誘導的表面CTLA-4下調引起免疫治療相關不良效應(irAE)。A. C57BL/6 Ctla4 h / h 新生小鼠在10、13、16及19日齡分別用劑量為100 μg/小鼠/注射的對照人類IgG + 抗PD-1、曲美單抗(IgG1) + 抗PD-1，或HL12 + 抗PD-1處理。展示不同處理之體重增加。曲美單抗(IgG1) + 抗PD1處理組中之一隻小鼠因18日齡時生長嚴重遲緩死亡而自分析中排除。所示資料為第一次注射後之體重增加%的平均值及SEM。B.出生後第41天，對A中之小鼠的血液進行CBC分析。所示資料為血液血容比(HCT)、總血紅素(Hb)及平均紅血球體積(MCV)。C.具有MC38之Ctla4 h / h 小鼠(n=5)在腫瘤接種之後的第7、10、13及16天腹膜內用對照Ig (100 µg)或曲美單抗(IgG1)(1 µg、30 µg或100 µg)處理。所示腫瘤體積為第一次注射之後之體重增加%的平均值及SEM。D.經hCTLA-4轉染的293T細胞與對照IgG、伊匹單抗、曲美單抗(IgG1)、HL12或HL32一起培育4小時。藉由西方墨點法分析CTLA-4蛋白含量。E.表現hCTLA-4之CHO穩定細胞株在4/37℃下用伊匹單抗、曲美單抗(IgG1)、HL12或HL32處理2小時。洗掉未結合之抗體之後，表面CTLA-4在4℃下藉由抗hIgG (H+L)-alex488偵測半小時且藉由流式細胞術加以分析。藉由減去4℃下之alex488螢光標準化之後，所示表面CTLA-4螢光強度為一式三份(平均值+SEM)，*P＜0.05，不成對雙尾t檢驗。F.經hCTLA-4轉染之293T細胞與對照IgG伊匹單抗或HL12一起培育4小時。分離出質膜蛋白質且藉由西方墨點法偵測表面CTLA-4。G. Ctla-4 h / h -KI新生小鼠(n=6)腹膜內用抗PD-1 (100 ug)處理。24小時之後，小鼠腹膜內用100 μg對照IgG、伊匹單抗或HL12進一步處理4小時。藉由流式細胞術評估肺及脾臟Treg之表面及細胞內CTLA-4。由於HL12阻斷BIN3結合至CTLA-4，因此當對HL12組與對照組比較時，在藉由BNI3純系進行CTLA-4染色之前，添加飽和劑量的HL12。H. 藉由不阻斷HL12結合至CTLA-4的另一市售抗CTLA-4 mAb (eBio20A)將細胞染色來評估G中之HL12處理。I.來自健康供者血液的人類PBMC用抗CD3/抗CD28刺激2天且用對照IgG、伊匹單抗(IP)或HL12處理4小時。藉由流式細胞術量測CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg之表面CTLA-4。使用抗CTLA-4 mAb (BNI3)比較對照組與伊匹單抗組，而HL12組使用抗CTLA-4 mAb (eBio20A)。G及H中之資料為平均值±SEM。I中之結果為一式三份(平均值±SEM)。*p＜0.05，**p＜0.01，#p＜0.001。不成對雙尾史都登氏t檢驗。
圖45. 抗CTLA-4 mAb經由溶酶體介導的降解來調控表面CTLA-4。A. 在4℃下，在表現hCTLA-4之CHO穩定細胞株上的表面CTLA-4上，使用伊匹單抗-Alex488或HL12-Alex488標記，且轉移至37℃維持30分鐘。出示抗體標記之表面CTLA-4的代表性共聚焦影像。B.使用溶酶體追蹤劑，將A中之表面CTLA-4染色，且藉由共聚焦影像來展示表面CTLA-4與溶酶體之間的共定位(綠色：表面CTLA-4；粉色：溶酶體；白色：匯合)。C. 藉由代表性共聚焦影像，出示伊匹單抗及HL12在B中誘導CTLA-4內化之後之細胞表面CTLA-4定位的時間跨度。D.在經由或不經由溶酶體抑制劑氯奎(chloroquine，CQ)之預處理下，由經hCTLA-4轉染的293T細胞與對照IgG或伊匹單抗一起培育4小時。藉由西方墨點法分析CTLA-4蛋白含量。
圖46. 在核內體-溶酶體轉運期間，保留較高結合親和力的抗CTLA-4 mAb促進溶酶體對表面CTLA-4之降解。A.將His-hCTLA-4 (0.5 μg/mL)塗佈於ELISA盤中且添加含在pH 4.0至7.0範圍內之不同pH緩衝液中之10 μg/ml不同抗CTLA4-mAb。藉由ELISA量測抗體與CTLA-4的結合。B. 在pH4.5、5.5及7.0下，比較不同抗CTLA-4抗體之限制劑量。將His-hCTLA-4 (0.5 μg/ml)塗佈於ELISA盤中且量測不同劑量之抗CTLA4-mAb對CTLA-4的結合。注意，伊匹單抗與曲美單抗在pH7.0及pH5.5下展現基本上相同的劑量反應。在pH5.5下為達成50%最大pH7.0結合性之抗體需要量(IC50)與在pH7.0下之抗體需要量基本上相同。pH4.5下之IC50增加約50-250%。相反地，依據IC50之增加，HL12及HL32在pH5.5下展現的結合性比在pH7.0下展現的結合性下降超過10倍。當再次依據IC50之增加，比較pH 4.5下之結合性與pH7.0下之結合性時，觀測到pH4.5下之IC下降超過100倍。C.塗佈His-hCTLA-4 (0.5 μg/ml)且添加pH 7.0的10 μg/ml不同抗CTLA4-mAb。洗掉額外抗體之後，偵測CTLA-4之結合，隨後在較低pH緩衝液(pH4.5、5.5及6)中培育2小時。A-C中之數據為450 nm下之二重覆光密度之平均值。D.在4℃下用抗CTLA-4 mAb標記表面CTLA-4 30分鐘，接著轉移至37℃維持1小時。抗體結合的CTLA-4藉由蛋白質G珠粒捕捉且藉由西方墨點法測試。E.使用或不使用中和核內體-溶酶體pH的CQ，將D中之表面CTLA-4預處理30分鐘。藉由蛋白質G珠粒捕捉抗體結合的CTLA-4且藉由西方墨點法測試。
圖47. HL12觸發的內化CTLA-4再循環回至細胞表面且防止抗CTLA-4誘導irAE。A.經dsRed標記之人類Rab11轉染的293T細胞與伊匹單抗-Alex488或HL12-Alex488一起在4℃下培育30分鐘且轉移至37℃維持1小時。展示表面CTLA-4與Rab11之間共定位的代表性共聚焦影像(綠色：表面CTLA-4；紅色：Rab11；藍色：細胞核；黃色：CTLA-4與Rab11之匯合)。B.經hCTLA-4-GFP轉染的293T細胞與對照IgG、伊匹單抗或HL12一起培育4小時。展示表面CTLA-4之代表性共聚焦影像。C.描繪抗CTLA-4 mAb之不同調控作用促使抗體誘導免疫治療相關不良效應(irAE)的模型。
圖48. pH敏感性抗CTLA-4抗體誘導腫瘤微環境中之Treg的效率更高。具有MC38腫瘤之Ctla4h / h 小鼠在腫瘤接種之後的第14天接受對照hIgG、伊匹單抗、HL32或HL12 (100 µg/小鼠)。藉由對抗體處理之後第16小時收集之腫瘤的單一細胞懸浮液執行流式細胞術來測定腫瘤中之CD4 T細胞中的Treg細胞%。注意，兩種pH敏感性抗體HL12及HL32在抗體處理之後的第24小時引起快速的Treg耗乏(P＜0.0001)。相比之下，雖然伊匹單抗在重複給藥之後會引起Treg耗乏(圖21)，但其在單次給藥之後的第24小時基本上為低效的。
圖49. pH敏感性抗CTLA-4抗體誘導已建立之大腫瘤之排斥反應的效率更高。具有MC38腫瘤之Ctla4h / h 小鼠在腫瘤接種之後的第17及20天接受對照hIgG、伊匹單抗、曲美單抗(IgG1)(TremeIgG1)、HL32或HL12 (30 µg/小鼠)。使用測徑規量測腫瘤尺寸。
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Claims (39)

  1. 一種用於治療癌症的抗CTLA-4抗體，其中該抗體不賦予全身T細胞活化或自體反應性T細胞之優先擴增。
  2. 一種用於治療癌症的抗CTLA-4抗體，其中該抗體允許CTLA-4循環回至細胞表面。
  3. 如請求項2之抗CTLA-4抗體，其中相較於pH 5.5，該抗體在pH 7下以更高親和力結合至CTLA-4。
  4. 如請求項2之抗CTLA-4抗體，其中相較於pH 4.5，該抗體在pH 7下以更高的親和力結合至CTLA-4。
  5. 如請求項2至4中任一項之抗CTLA-4抗體，其中該抗體在腫瘤微環境中誘導FcR介導T調控細胞耗乏。
  6. 如請求項2至5中任一項之抗CTLA-4抗體，其中該抗體不賦予全身T細胞活化或自體反應性T細胞之優先擴增。
  7. 如前述請求項中任一項之抗CTLA-4抗體，其中該抗體不阻斷CTLA-4結合至其B7配位體。
  8. 如前述請求項中任一項之抗CTLA-4抗體，其中相較於位於細胞表面上的CTLA-4，該抗CTLA-4抗體對可溶性CTLA-4的親和力減小。
  9. 如前述請求項中任一項之抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體與抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體組合。
  10. 一種鑑別抗CTLA-4抗體的方法，該抗CTLA-4抗體誘導較低程度的免疫療法相關不良事件(irAE)，該方法包含： (a)提供包含細胞表面CTLA-4之細胞； (b)使(a)之該等細胞與候選抗CTLA-4抗體接觸； (c)培育期之後，偵測細胞表面CTLA-4之量； (d)將得自步驟(c)之細胞表面CTLA-4的量與臨限水準進行比較，其中該臨限水準為來自與對照抗CTLA-4抗體接觸之細胞的細胞表面CTLA-4之量， 其中細胞表面CTLA-4之量高於該臨限水準時，鑑別出該候選抗CTLA-4抗體為誘導較低irAE程度的抗CTLA-4抗體。
  11. 如請求項10之方法，其中該對照抗CTLA-4抗體為伊匹單抗(Ipilimumab)或曲美單抗(Tremelimumab)。
  12. 如請求項10之方法，其中步驟(a)之該等細胞表現人類CTLA-4。
  13. 如請求項10之方法，其中該細胞表面CTLA-4已標記可偵測物。
  14. 如請求項13之方法，其中該可偵測標記為螢光標籤。
  15. 如請求項14之方法，其中該螢光標籤為橙色螢光蛋白。
  16. 如請求項10之方法，其中步驟(c)之該偵測包含利用西方墨點法、免疫組織化學或流式細胞術量測該細胞表面CTLA-4中之該可偵測標記的量。
  17. 如請求項10之方法，其中步驟(c)之該培育包含使該候選抗CTLA-4抗體與標記可偵測物之抗IgG抗體接觸，及利用西方墨點法、免疫組織化學或流式細胞術量測該標記可偵測物之抗IgG抗體中之該可偵測標記的量。
  18. 如請求項17之方法，其中該標記可偵測物之抗IgG抗體中的該可偵測標記包含alex488。
  19. 如請求項10之方法，其中該等細胞選自由293T細胞、中國倉鼠卵巢細胞及T調控細胞(Treg)組成之群。
  20. 一種抗CTLA-4抗體，相較於在低於或等於6之低pH下，其在6.5-7.5之高pH下對CTLA-4具有較高的結合親和力。
  21. 如請求項20之抗體，其中該高pH為7且該低pH為4.5。
  22. 如請求項20之抗體，其中該高pH為7且該低pH為5.5。
  23. 一種篩選或設計供免疫療法使用之抗CTLA-4抗體的方法，其中該抗CTLA-4抗體不引起溶酶體CTLA-4降解。
  24. 如請求項23所述之方法，包含 (a)使該抗CTLA-4抗體與CTLA-4蛋白在6.5-7.5之pH下接觸，且定量結合至該CTLA-4蛋白之抗CTLA-4抗體的量； (b)使該抗CTLA-4抗體與CTLA-4蛋白在4.5-5.5之pH下接觸，且定量結合至該CTLA-4蛋白之抗CTLA-4抗體的量； (c)比較(a)與(b)中之結合量， 其中若(a)中之結合量與(b)相比大於或等於臨限水準，則該抗CTLA-4抗體不引起溶酶體CTLA-4降解。
  25. 如請求項24之方法，其中(a)中之pH為7.0，(b)中之pH為5.5，且該臨限水準為3倍。
  26. 如請求項24之方法，其中(a)中之pH為7.0，(b)中之pH為4.5，且該臨限水準為10倍。
  27. 如請求項24至26中任一項之方法，其中該抗CTLA-4抗體結合量為達成與該CTLA-4蛋白之50%最大結合所必需的抗CTLA-4抗體之量。
  28. 如請求項23之方法，其中該抗CTLA-4抗體允許已在細胞表面結合之CTLA-4在內吞之後再循環回至該細胞表面。
  29. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與抗體，該抗體對CTLA-4的結合在對應於核內體及溶酶體中pH的酸性pH下中斷。
  30. 如請求項29之方法，其中相較於pH 7.0，該抗CTLA-4抗體在pH 5.5下對CTLA-4展現的結合性下降至少3倍。
  31. 如請求項29之方法，其中相較於pH 7.0，該抗體在pH 4.5下對CTLA-4展現的結合性下降至少10倍。
  32. 如請求項29之方法，其中相較於伊匹單抗或曲美單抗，該抗CTLA-4抗體對可溶性CTLA-4展現比對細胞表面所結合或固著之CTLA-4更大幅下降的結合性。
  33. 一種抗CTLA-4抗體，其係根據請求項10至19及23至28中之任一項鑑別、篩選或設計。
  34. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包含向該個體投與如請求項1至8、20至22及33中任一項之抗CTLA-4抗體。
  35. 如請求項34之方法，其中該抗CTLA-4抗體係與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合投與。
  36. 如請求項1至8、20至22及33中任一項之抗CTLA-4抗體，其係用於治療個體之癌症。
  37. 如請求項36所使用的抗CTLA-4抗體，其中該抗CTLA-4抗體係與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合投與。
  38. 一種如請求項1至8、20至22及33中任一項之抗體的用途，其係用於製造供治療癌症用的藥劑。
  39. 如請求項38之用途，其中該抗CTLA-4抗體係與抗PD-1或抗PD-L1抗體組合。
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