TWI739781B - 嵌合及人類化抗人類ctla4單株抗體及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於與人類CTLA4分子結合之嵌合及人類化抗體之組合物及其在癌症免疫療法中及用於與其他免疫治療劑相比減少自體免疫副作用之用途。

Description

嵌合及人類化抗人類CTLA4單株抗體及其用途

本發明係關於與人類CTLA4分子結合之嵌合及人類化抗體及其使用方法。

人類及其他哺乳動物之免疫系統負責提供對抗感染及疾病之保護作用。此類保護係藉由體液性免疫反應及細胞介導之免疫反應兩者來提供。體液反應會導致能夠識別並中和外來靶標(抗原)之抗體及其他生物分子之產生。相比之下，細胞介導之免疫反應涉及藉由T細胞來活化巨噬細胞、嗜中性白血球、自然殺傷細胞(NK)及抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞之活化，並涉及回應於抗原之識別而釋放各種細胞介素。 T細胞最佳地介導針對抗原之免疫反應之能力需要兩種相異的信號傳導交互作用。首先，必須將已排列在抗原呈現細胞(APC)之表面上之抗原以MHC:肽錯合物形式(1，2)呈現至抗原特異性原初T細胞。此類呈現經由T細胞受體(TCR)遞送一信號，該信號指導T細胞啟動對所呈現抗原具有特異性之免疫反應。其次，經由APC與相異的T細胞表面分子之間的相互作用介導的一系列共刺激信號首先觸發T細胞之活化及增殖且最後觸發其抑制(3至5)。因此，第一信號為該免疫反應賦予了特異性，而第二信號用以測定該反應之性質、量級及持續時間，同時限制對自身的免疫。在此等第二信號分子中，特別重要的係抗原呈現細胞之B7.1 (CD80) (6)及B7.2 (CD86) (7至9)配位體與T淋巴細胞之CD28及CTLA4受體(10至12)之間的結合。 細胞毒性T淋巴細胞抗原-4 (CTLA4)被認為係適應性免疫反應之關鍵調節子，其在維持周邊耐受方面及在形成所出現的T細胞回應之過程方面起重要作用，且因此，被認為係用於治療癌症及發炎之治療性靶標。用抗CTLA4抗體進行處理已展示為用於在臨床前模型中增強抗腫瘤免疫之強力工具(10)。具有針對CTLA4之抗體之單藥療法促進各種來源之可移植腫瘤之排斥反應。 基於有前景的臨床前腫瘤模型研究，已在不同人類惡性腫瘤中研究針對CTLA4之抗體之臨床潛力。儘管抗CTLA4 (伊匹單抗(Ipilimumab)，Yervoy出售)已證實在治療黑素瘤中有效，但CTLA4之治療及靶標係與如毒性之自體免疫相關聯。來自CTLA4之抑制之特徵性副作用一般稱為免疫相關不良事件(irAE)，且最常見的irAE為皮疹、肝炎、結腸炎及內分泌病，特定言之，腦垂體機能減退症。因此，需要藉由增加功效同時減少相關聯irAE來改良抗CTLA4抗體之治療性潛力。 免疫療法及腫瘤治療之領域之另一焦點為，組合不同免疫核查抑制劑，以便增強抗腫瘤活性，尤其針對不良地免疫原性腫瘤的抗腫瘤活性。然而，此方法與進一步增加自體免疫副作用之風險相關聯，另外突出需要在不增強自體免疫的情況下選擇性地調節癌症免疫。 對CD28受體之配位體之另外研究引起一組相關B7分子(「B7」超家族)之識別及表徵(32至33)。目前該家族存在若干已知成員：B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、誘導型共刺激配位體(ICOS-L)、計劃性死亡-1配位體(PD-L1；B7-H1)、計劃性死亡-2配位體(PD-L2；B7-DC)、B7-H3、B7-H4及B7-H6 (35至36)。  B7-H1廣泛地表現於不同人類及小鼠組織中，該等組織諸如該兩個物種之心臟、胎盤、肌肉、胎兒肝、脾、淋巴結及胸腺以及僅小鼠中之肝、肺及腎(37)。B7-H1 (PD-L1，CD274)為B7超家族之尤其顯著成員，因為其中樞性參與形成腫瘤免疫反應(38；美國專利第6,803,192號、第7,794,710號；美國專利申請公開案第2005/0059051號、第2009/0055944號、第2009/0274666號、第2009/0313687號；PCT公開案第WO 01/39722號、第WO 02/086083號)。 計劃性死亡-1 (「PD-1」)為B7-H1以及B7-DC之受體。PD-1為T細胞調節子之延長CD28/CTLA4家族之I型膜蛋白質成員(39；美國專利申請公開案第2007/0202100號、第2008/0311117號、第2009/00110667號；美國專利第6,808,710號、第7,101,550號、第7,488,802號、第7,635,757號、第7,722,868號；PCT公開案第WO 01/14557號)。與CTLA4相比，PD-1更廣泛地負調節免疫反應。PD-1係表現在活化T細胞、B細胞及單核細胞(40至41)上，且以低含量表現於自然殺傷(NK) T細胞(42至43)中。 已發現，B7-H1及PD-1之相互作用向T細胞及B細胞提供關鍵負共刺激信號(43)且充當細胞死亡誘導劑(39)。B7-H1及PD-1在抑制T細胞活化及增殖中之作用已表明，此等生物分子可用作用於治療發炎及癌症之治療性靶標。因此，已提議並證實，使用抗PD1及抗B7-H1抗體治療感染及腫瘤且上調適應性免疫反應對治療許多人類腫瘤係有效的。然而，並非所有個體對抗PD-1或抗B7-H1治療作出反應，或具有完全反應，且因此，存在對於將抗PD-1或抗B7-H1抗體與其他免疫核查抑制劑組合以便增強抗腫瘤活性的強烈興趣。 4-1BB (亦稱為CD137及TNFRSF9)為另一免疫核查點分子。CD137之最佳特徵化活性為其對於活化T細胞之共刺激活性。CD137之交聯促進T細胞增殖、IL-2分泌、存活及溶胞活性。另外，如抗CTLA4，抗4-1BB之抗體可增強免疫活性以消除小鼠中之腫瘤(27至29)。然而，不同於抗CTLA4抗體加重自體免疫疾病之傾向，癌症治療性抗4-1BB mAb已展示消除患狼瘡小鼠中之自體免疫疾病之發展，其中該等癌症治療性抗4-1BB mAb抑制抗dsDNA抗體產生且減少腎病變(25, 26)。先前資料已證實，有可能藉由組合抗CTLA4與抗4-1BB抗體治療同時增強抗腫瘤活性來減少小鼠結腸癌腫瘤模型中之抗CTLA4治療之自體免疫副作用(19)。此證實，有可能抵消抗CTLA4腫瘤療法之自體免疫副作用。 抗人類CTLA4抗體之臨床前篩選係充滿困難的，此係因為活體外免疫相關性有時係無價值的，如藉由對抗小鼠CTLA4抗體之經驗所證實。誘導活體內強效抗腫瘤免疫之相同抗小鼠CTLA4抗體可在活體外對T細胞具有可變效應。抗CTLA4抗體回應於同種抗原而增強T細胞增殖，但回應於藉由抗CD 28之共刺激而遏制T細胞增殖(30，31)。另外，CTLA4與抗體接合可促進或抑制不同亞群之T細胞在同一培養物中之增殖(32)。若有人可以嚙齒動物模型來研究人類T細胞回應，則可克服此併發症。 本文描述抗CTLA4抗體，其在用以增強免疫反應時自體免疫副作用減少，並用於抗腫瘤療法中。另外，此等抗體可與其他核查點抑制劑(諸如，抗PD-1及抗4-1BB)組合使用，以增強抗腫瘤，同時消除自體免疫副作用。

本發明係關於抗體組合物及其與人類CTLA4分子結合之抗原結合片段以及其在自體免疫副作用減少的情況下用於癌症免疫療法的用途。具體言之，本發明係關於具有對於CTLA4配位體B7.1及B7.2之增強的CTLA4阻斷活性、增強的效應功能或相對於膜結合或固定CTLA4減少與可溶CTLA4之結合的抗體。 抗體可包含具有在SEQ ID NO: 1中闡述之胺基酸序列的輕鏈可變胺基酸序列，及具有在SEQ ID NO: 2中闡述之胺基酸序列的重鏈可變胺基酸序列。抗體亦可包含具有在SEQ ID NO: 27、28或29中闡述之胺基酸序列之重鏈可變胺基酸序列及具有在SEQ ID NO: 30、31或32中闡述之胺基酸序列之輕鏈可變胺基酸序列。抗體可包含具有在SEQ ID NO: 21、22及23中闡述之CDR序列之輕鏈可變區及具有在SEQ ID NO: 24、25及26中闡述之CDR序列之重鏈可變區。更具體言之，抗體可包含具有在SEQ ID NO: 33、34或35中闡述之CDR2序列之重鏈可變區及具有在SEQ ID NO: 36、37或38中闡述之CDR序列之輕鏈可變區。 抗體之免疫球蛋白重鏈恆定區可包含在SEQ ID NO: 3或4中闡述之胺基酸序列。抗體之免疫球蛋白重鏈恆定區亦可包含突變。相對於SEQ ID NO: 3中之hIgG1主鏈之序列，突變可為M135Y、S137T、T139E、S181A、E216A、或K217A或其組合。較佳地，抗體之免疫球蛋白重鏈恆定區可包含所有六種突變。抗體可包含具有在SEQ ID NO: 6中闡述之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列及具有在SEQ ID NO: 8中闡述之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列。抗體亦可包含具有在SEQ ID NO: 9、11或13中闡述之胺基酸序列之重鏈胺基酸序列及具有在SEQ ID NO: 15、17或19中闡述之胺基酸序列之輕鏈胺基酸序列。抗體可能夠結合人類CTLA4。抗體亦可抑制人類CTLA4與B7-1或B7-2之結合。 另外，本文提供一種本文所描述之抗體之抗原結合片段。 本文亦提供一種包含治療有效量之本文所描述之抗體之醫藥組合物。醫藥組合物可包含生理學上可接受之載劑或賦形劑。 在另一態樣中，本文中提出用於增強個體中之一或多種免疫功能或反應之方法，該等方法包含向有需要之個體投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物及醫藥組合物。在一具體實施例中，本文中提出用於預防、治療及/或管理其中需要激活或增強一或多種免疫功能或反應之疾病之方法。疾病可為癌症，其可為人類惡性疾病。特定言之，人類惡性疾病可為黑素瘤、肺癌、乳癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病或腎細胞癌。在另一實施例中，待治療之疾病為傳染病。本文所描述之方法可使與免疫療法相關聯之自體免疫不良效應降至最低。 在其他具體實施例中，該方法包含組合療法，其中將本文所描述之抗CTLA4抗體組合物與另一療法組合而向個體投與，該組合療法可激活或增強一或多種免疫功能或反應。在另一實施例中，與抗原組合物組合投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物作為佐劑。在一特定實施例中，與疫苗組合物組合投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物以誘導或激活或增強藉由疫苗組合物引發之免疫反應。 在一具體實施例中，與一或多種靶標不同免疫調節路徑之其他治療劑組合向個體投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物。在一較佳實施例中，靶標不同免疫調節路徑之治療劑之活性與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物互補或為協同的。在一種情況下，與其他核查點抑制劑或較小腫瘤免疫學調節劑(諸如，吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)抑制劑)組合投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物。在另一情況下，與免疫刺激分子組合投與本文所描述之抗CTLA4抗體組合物。具體實施例包括將本文所描述之抗CTLA4抗體組合物與以下進行組合：抗PD-1 (派立珠單抗(pembrolizumab) (克珠達(Keytruda))或納武單抗(Nivolumab) (奧普迪沃(Opdivo)))、抗B7-H1 (阿特唑單抗(atezolizumab) (特森催克(Tecentriq)或德瓦魯單抗(durvalumab))、抗B7-H3、抗B7-H4、抗LAG3、抗Tim3、抗CD40、抗OX40、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗41BB。在另一實施例中，本文所描述之抗CTLA4抗體組合物及第二免疫刺激分子係組合於單一雙特異性抗體中的。 在另一實施例中，本文所描述之抗人類CTLA4抗體可較佳地相對於可溶CTLA4分子與細胞表面上表現之人類CTLA-4結合。抗人類CTLA4抗體可與人類CTLA4結合，且較佳地上調活體內之B7.1或B7.2之表現。抗體可含於用於調節免疫反應(免疫療法)及癌症治療之組合物中。 本發明進一步係關於篩選具有較佳活性之抗人類CTLA4 mAb之方法。抗人類CTLA4 mAb之臨床前篩選係充滿困難的，此係因為對於癌症免疫及自體免疫不良效應之活體外免疫相關性並未經限定。在具有人類抗CTLA4 (伊匹單抗)之臨床試驗中，尤其在與抗PD-1組合時，已觀測到顯著自體免疫副作用。為識別免疫相關聯毒性減少之抗CTLA4抗體，證實在人類化小鼠中的抗腫瘤活性之抗體因其在活體內減少自體免疫不良效應之能力而可使用人類CTLA4基因嵌入小鼠來篩選的。 在另一實施例中，本發明係關於一種篩選具有增強之抗腫瘤效應之抗人類CTLA4 mAb之方法，其中該等抗體證實Treg細胞在腫瘤環境中之增強的局部消減。 在又一實施例中，本發明係關於藉由監測諸如抗原呈現細胞(APC)之免疫細胞上之B7.1及B7.2之表現位準來監測抗CTLA4抗體在活體內之阻斷效應的方法。本發明進一步涵蓋用於量測抗CTLA4抗體在活體內之生物活性及藉由量測活體外免疫細胞上之B7.1及B7.2表現位準來監測對抗CTLA4治療的顯露反應。 為映射L3D10親本抗體及人類化變體、PP4631及PP4637之CTLA4結合抗原決定基，利用小鼠及人類CTLA4蛋白質與B7-1交叉反應但並不與抗CTLA-4抗體交叉反應之事實。因此，設計人類CTLA-4Fc蛋白質之許多突變，其中來自人類CTLA-4蛋白質之成群之胺基酸經來自鼠Ctla-4蛋白質之胺基酸置換。由於此研究中所使用之抗CTLA-4抗體並不與鼠Ctla-4結合，故可在抗體結合抗原決定基之關鍵殘基經鼠胺基酸置換時取消抗人類CTLA-4抗體之結合。

一種針對人類CTLA4蛋白質之抗體(伊匹單抗)已展示作為唯一免疫治療劑或與其他治療劑(諸如但不限於，抗-PD-1抗體)組合來提高癌症患者之存活(13至15)。然而，治療性效應與顯著不良效應相關聯(13至18)。極大地需要研發新穎抗CTLA4抗體以達成更佳治療性效應及/或較少自體免疫不良效應。本發明者已發現，抗CTLA4抗體出人意料地可用於誘導癌症排斥反應，同時亦減少與免疫療法相關聯之自體免疫不良效應。 本發明提供物質抗體組合物及其抗原結合片段。本發明進一步係關於此類分子之實施例，其中分子為單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。 詳言之，本發明提供一種包含免疫特異性地與CTLA4且特定言之人類CTLA4結合之抗體之抗原結合片段之分子，該CTLA4較佳地在活細胞之表面上以內源性或經轉染濃度表現。本發明特定言之係關於此類分子之實施例，其中抗原結合片段與CTLA4結合，且其中活細胞為T細胞。 本發明係關於能夠免疫特異性地與CTLA4結合之抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，此類分子另外能夠阻斷B7.1及B7.2與CTLA4之結合。 本發明進一步係關於此類分子之實施例，其中分子為單株抗體、人類抗體、嵌合抗體或人類化抗體。本發明包括其中此類抗體為單特異性、雙特異性、三特異性或多特異性的實施例。 本發明進一步係關於與CTLA4結合之此類分子或抗體之實施例，且其中其抗原結合片段包含六個CDR，其中該等CDR包含抗CTLA4抗體L3D10之CDR。具體言之，抗體包含抗CTLA4抗體L3D10之三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR。 本發明進一步係關於上述抗體之實施例，其中抗體係以可偵測方式標記或包含經接合之毒素、藥物、受體、酶、受體配位體。 本發明進一步係關於包含治療有效量之以上所描述之抗體組合物中之任一者的醫藥組合物及生理學上可接受之載劑或賦形劑。較佳地，本發明之組合物包含預防或治療有效量之本發明之人類化抗體及醫藥學上可接受之載劑。 在一具體實施例中，術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認之藥典中列出適用於動物，且更特定言之適用於人類。術語「載劑」係指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全及不完全))、賦形劑或與治療劑一起投與之媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體(諸如水及油)，包括石油、動物、植物或合成來源(諸如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似者)之彼等者。當經靜脈內投與該醫藥組合物時，水為較佳的載劑。亦可採用生理鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液作為液體載劑，尤其對於可注射溶液而言。合適的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、乾燥脫脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似者。若需要，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑、或pH緩衝劑。此等組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物及其類似者之形式。 大體而言，本發明之組合物之成份可單獨供應，或在指示活性劑之數量的氣密密封式容器(諸如安瓿或藥囊)中按單位劑型混合在一起(例如)作為乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。當欲藉由輸注投與組合物時，其可用含有無菌醫藥級別水或生理鹽水之輸注瓶來施配。當藉由注射投與組合物時，可提供用於注射之無菌水或生理鹽水之安瓿，以使得該等成份可在投與前混合。 本發明之組合物可調配為中性或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括但不限於：用陰離子形成之彼等者，諸如，衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等之彼等者；及用陽離子形成之彼等者，諸如，衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等等之彼等者。 本發明進一步係關於此處所描述之抗體組合物及其醫藥組合物用於上調免疫反應之用途。在治療癌症及慢性感染時尤其需要上調免疫系統，且因此本發明在此類病症之治療中有用。如本文所使用，術語「癌症」係指由細胞之異常不可控生長引起之贅瘤或腫瘤。如本文所使用，癌症明確地包括白血病及淋巴瘤。該術語係指涉及具有轉移至遠端位點之潛力之細胞的疾病。 因此，本發明之方法及組合物亦可適用於各種癌症或其他異常增生性疾病之治療或預防，該等癌症或其他異常增生性疾病包括(但不限於)以下各者：癌瘤，包括膀胱癌瘤、乳房癌瘤、結腸癌瘤、腎癌瘤、肝癌瘤、肺癌瘤、卵巢癌瘤、胰腺癌瘤、胃癌瘤、子宮頸癌瘤、甲狀腺癌瘤及皮膚癌瘤；包括鱗狀細胞癌瘤；淋巴譜系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、伯克特淋巴瘤；骨髓譜系之造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；間葉細胞源腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細胞瘤、畸胎上皮癌、神經母細胞瘤及神經膠瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠瘤及神經鞘瘤；間葉細胞源腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑素瘤、著色性乾皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌症及畸胎上皮癌。亦考慮，亦將藉由本發明之方法及組合物來治療由細胞凋亡中之畸變引起之癌症。此類癌症可包括但不限於：濾泡淋巴瘤、具有p53突變之癌瘤、乳房、前列腺及卵巢之激素依賴性腫瘤，及諸如家族性腺瘤性息肉病及骨髓發育不良症候群之癌前期病變。在具體實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或預防卵巢、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、胰腺或子宮中之惡性疾病或增殖異常改變(諸如，化生及發育不良)或過度增殖病症。在其他具體實施例中，藉由本發明之方法及組合物來治療或預防肉瘤、黑素瘤或白血病。 在本發明之另一實施例中，抗體組合物及其抗原結合片段可與其他抗腫瘤療法一起使用，該等抗腫瘤療法包括但不限於目前標準及實驗化學療法、激素療法、生物學療法、免疫療法、輻射療法或手術。在一些實施例中，可與治療或預防有效量之一或多種藥劑、治療性抗體或熟習此項技術者已知的用於治療及/或預防癌症、自體免疫疾病、傳染病或中毒之其他藥劑組合投與本發明之分子。此類藥劑包括(例如)以上論述之生物學反應調節劑、細胞毒素、抗代謝物、烷基化劑、抗生素、或抗有絲分裂劑以及免疫治療劑中之任一者。 在本發明之較佳實施例中，可與其他抗腫瘤免疫療法一起使用抗體組合物及其抗原結合片段。在此類實施例中，與破壞或增強替代性免疫調節路徑(諸如，TIM3、TIM4、OX40、CD40、GITR、4-1-BB、B7-H1、PD-1、B7-H3、B7-H4、LIGHT、BTLA、ICOS、CD27或LAG3)或調變效應分子之活性(諸如，細胞介素例如，IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、GF-β、IFNg、Flt3、BLys及趨化激素，例如，CCL21)之分子組合投與本發明之分子，以便增強免疫調節效應。具體實施例包括雙特異性抗體，其包含本文所描述之抗CTLA4抗體組合物及抗PD-1 (派立珠單抗(克珠達)或納武單抗(奧普迪沃))、抗B7-H1 (阿特唑單抗(特森催克)或德瓦魯單抗)、抗B7-H3、抗-B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4、抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。在又一實施例中，與激活免疫反應之不同階段或態樣之分子組合投與本發明之分子，以便達成更廣泛免疫反應。在更佳實施例中，在不加重自體免疫副作用之情況下，將抗體組合物及其抗原結合片段與抗PD-1或抗4-1BB抗體組合。 本發明之另一實施例包括雙特異性抗體，其包含與CTLA4結合之抗體，該CTLA4與結合另一免疫刺激分子之抗體橋接。具體實施例包括雙特異性抗體，其包含本文所描述之抗CTLA4抗體組合物及抗PD-1、抗B7-H1、抗B7-H3、抗-B7-H4、抗LIGHT、抗LAG3、抗TIM3、抗TIM4、抗CD40、抗OX40、抗GITR、抗BTLA、抗CD27、抗ICOS或抗4-1BB。本發明進一步係關於此類抗體用於治療癌症之用途。 投與本發明之抗體組合物之方法包括但不限於：非經腸投與(例如，皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內及皮下)、硬膜外及經黏膜(例如，鼻內及經口途徑)。在一具體實施例中，肌內、經靜脈內或皮下投與本發明之抗體。組合物可藉由任何便利途徑投與，例如藉由輸注或快速注射、藉由經上皮或黏膜皮膚內層(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等等)吸收，且可連同其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部的。 本發明之又一實施例係關於藉由監測B7.1及B7.2在諸如抗原呈現細胞(APC)之免疫細胞上之表現水平來監測抗CTLA4抗體在活體內之阻斷效應。CTLA4主要表現在Treg中，在Treg中，其藉由下調諸如樹突狀細胞之APC上之B7-1及B7-2表現來遏止自體免疫疾病。因此，B7分子、B7.1及B7.2之上調可為B7-CTLA4相互作用之活體內阻斷之讀出。在一具體實施例中，在抗-CTLA4處理前後自個體去除周邊或腫瘤內免疫細胞，且針對免疫細胞之表面上之B7.1及/或B7.2之水平降低對其進行活體外檢定，其中阻斷抗CTLA4抗體之存在防止內源性CTLA4進行B7.1/B7.2結合，其又防止B7.1及B7.2之下調，從而引起B7.1/B7.2表現之淨增加。在一較佳實施例中，在抗原呈現細胞上量測B7.1及B7.1之水平。在最佳實施例中，在樹突狀細胞上量測B7.1及B7.1之水平。 在另一實施例中，將B7.1及B7.2在抗CTLA4處理之後在免疫細胞上之改變(減少)用作用於活體內量測抗CTLA4抗體之生物活性及藉由量測免疫細胞上之B7.1及/或B7.2表現水平及比較在處理前後的表現水平來監測對於抗CTLA4處理之顯露反應的生物標記。在一較佳實施例中，在抗CTLA4療法過程中，隨時間監測B7.1及/或B7.2表現之水平。實例 實例 1 . 產生嵌合抗 CTLA4 抗體 使用人類CTLA4基因嵌入小鼠及hu-PBL- Scid小鼠，先前證實，小鼠抗人類CTLA4抗體會減少腫瘤生長，且鑑定出L3D10在所測試mAb之群組中係最有效的。然而，即使當以相對較高劑量(＞10 mg/kg)且在腫瘤細胞攻擊之後在形成可觸的腫瘤之前(如早在第2天)使用時(19至21)，所獲得抗體中無一者能夠達成完全腫瘤排斥反應。 由於小鼠抗體為並不具有強抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之IgG1子類別，且由於ADCC可能參與腫瘤排斥反應，故以若干方式修飾mAb之Fc，以達成更佳免疫治療效應。首先，將在ADCC中為弱的小鼠IgG1置換以產生具有人類IgG1之具有強ADCC活性之嵌合抗體。其次，基於文獻中之已知技術(22)，將三種突變(S298A、E333A及K334A)引入CH中以增加ADCC活性。再者，引入三種突變(M252Y、S254T及T256E)以增加抗體在活體內之半衰期(23)。新穎嵌合抗體之設計在圖1、左側畫面中描繪。 為工程改造抗體，使用此項技術中已知之標準方法，經由DNA定序來首先識別L3D10融合瘤之可變區。將核苷酸序列轉換成列於SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2中之胺基酸。正常人類IgG1 Fc序列及突變Fc序列分別揭示於SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 4中。重鏈序列及輕鏈序列之胺基酸及密碼子最佳化核苷酸序列揭示於SEQ ID NO: 5至8中。 合成對應於SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 7之DNA並將其插入至表達載體中，且用所設計序列將載體轉染至HEK293細胞中。簡言之，在轉染之前一天將HEK293細胞接種在搖瓶中，且使用無血清的化學限定培養基來生長。使用用於暫時轉染之標準操作程序將DNA表現構築體暫時轉染至0.5公升之HEK293細胞懸浮液中。在20小時後，取樣細胞以獲得存活率及活細胞計數，並量測效價(Octet QKe, ForteBio)。貫穿暫時轉染生產運作獲取額外讀數。在第5天收集培養物。收集用於L3D10之改良性培養基，且其藉由離心及過濾自暫時轉染生產運作澄清。將上清液在蛋白質A管柱上運行，且用低pH緩衝液溶離。在等分之前進行使用0.2 µm膜濾器之過濾。在純化及過濾後，自OD280及消光係數來計算蛋白濃度。自一輪轉染獲得總共43.2 mg之Ig蛋白質。實例 2 . 嵌合 L3D10 抗體結合位點僅與 10D1 部分重疊 在臨床中，已展示抗CTLA4抗體(伊匹單抗)改良癌症患者之存活但誘導顯著自體免疫不良效應。為評價嵌合L3D10抗體及10D1之比較結合位點，將與CTLA4結合同該等抗體競爭與CTLA4結合之能力進行比較。雖然兩種抗體均與固定CTLA4蛋白質在相當功效下結合(圖2)，但10D1並不完全阻斷嵌合L3D10與CTLA4結合(圖3)。如所預期，未經標記之L3D10完全阻斷經標記L3D10結合，指示L3D10之抗體結合位點與10D1僅部分重疊。實例 3 . 嵌合 L3D10 抗體比 10D1 更高效阻斷 CTLA4 : B7 . 1 與 CTLA4 : B7 . 2 相互作用 已報告，若可溶B7-1及B7-2用於與固定CTLA4相互作用，則抗人類CTLA4 mAb (10D1)可阻斷B7-CTLA4相互作用(49)。由於B7-1及B7-2充當細胞表面共刺激分子，故吾人使用固定B7-1及B7-2來評價抗CTLA4抗體阻斷B7-CTLA4相互作用之能力。使用競爭性ELISA檢定格式，L3D10及10D1阻斷CTLA4融合蛋白質(CTLA4-Ig)與盤固定式且經細胞膜表現之B7.1及B7.2結合之能力。對於此等實驗，使用具有類似於10D1 (4 nM) (49)之親和性(2.3 nM)之嵌合抗人類CTLA4-mAb。對於盤固定式檢定，在4℃下以1 µg/ml將B7.1Fc或B7.2Fc塗佈至ELISA盤上隔夜，或在37℃下經2小時。將經生物素標記之CTLA4-Fc與給定濃度之B7.1-Fc、10D1或嵌合L3D10中任一者混合。使用經辣根過氧化酶接合之抗生蛋白鏈菌素來測定CTLA4-Fc與盤上之B7.1結合之量。如圖4中所展示，雖然嵌合L3D10、B7.1Fc及CTLA4-Fc均有效地阻斷CTLA4-Fc:B7.1相互作用，但兩種單獨材料批次之10D1未能阻斷該相互作用。L3D10展示以低至0.2 mg/ml之濃度顯著阻斷盤固定式B7.1結合，從而達成約3 mg/ml下之50%抑制(IC₅₀ )。類似地，L3D10以0.03 mg/ml之IC₅₀ 阻斷CTLA4-Fc與盤固定式B7.2結合之結合，而來自兩種不同材料批次之10D1顯示利用大致200 mg/ml之IC₅₀ 之微小阻斷(圖5)。然而，與先前報告(49)一致，在反向實驗中，當盤固定式CTLA4用於與可溶B7-1相互作用時，抗體10D1強效抑制B7-1-CTLA4相互作用(圖6)。 對於細胞膜蛋白質結合實驗，當B7.1表現在CHO細胞之表面上時，L3D10阻斷CTLA4-Fc之結合，但即使當以512 mg/ml使用時，來自兩種不同材料批次之10D1不阻斷該結合(圖7)。雖然遠不如L3D10強效，但高劑量之10D1在人類CTLA4與小鼠B7-1之間達成大致25%阻斷(圖8)。對於表現於CHO細胞表面上之B7.2，L3D10再次阻斷，而即使當以512 mg/ml使用10D1時，10D1僅部分地阻斷，其中觀測到小於50%之抑制(圖9)。 一個潛在的問題在於，生物素化可能影響10D1與CTLA4-Fc之結合。為解決此問題，吾人比較在阻斷研究中所使用之L3D10及10D1與經生物素標記之CTLA4-Fc之結合。如圖10中所展示，在結合經生物素標記之CTLA4-Fc時，10D1比L3D10更有效。因此，10D1進行之阻斷的失效並不歸因於與經生物素標記之CTLA4-Fc之不充分結合。當經聚組胺酸標記之CTLA4用於與經人類B7-1轉染之CHO細胞相互作用時，觀測到類似模式(圖11)。總之，吾人的資料表明，抗體10D1阻斷B7-CTLA4相互作用之能力係高度取決於所採用之檢定，其中若B7-1及B7-2為固定的，則可偵測阻斷活性最小或無，而抗體L3D10為用於B7-CTLA4相互作用之穩定阻斷劑，不管B7蛋白質是否為固定的。實例 4 . 嵌合 L3D10 抗體在引起腫瘤排斥反應中比未修飾之 L3D10 更高效 先前報告，小鼠L3D10未能引起MC38腫瘤之完全緩解，儘管觀測到顯著延緩(19，20)。為判定嵌合L3D10是否可在同基因型小鼠中引起完全緩解，將1×10⁶ 個MC38腫瘤細胞移植至同基因型C57BL/6小鼠中。一週後，當腫瘤直徑達至約5 mm時，用對照IgG或嵌合L3D10 mAb以在小鼠L3D10之先前研究中所使用劑量之僅一半的劑量來治療小鼠。如圖12中所展示，儘管人類Ig序列可能具有免疫原性，但發現嵌合L3D10在所有所測試小鼠中引起完全緩解。由於係在已形成較大腫瘤負荷時開始治療，該治療比在腫瘤為不可觸時更加困難(19)，此等實驗展示嵌合L3D10比未修飾之L3D10更高效。實例 5 . 嵌合 L3D10 抗體在引起腫瘤排斥反應時具有與 10D1等效之 活性 人類CTLA4基因嵌入小鼠(20)之可用性具備測試嵌合抗人類CTLA-4抗體之生物活性之前所未有的機會，其中臨床上使用抗CTLA-4 mAb (10D1)。在此人類化小鼠模型中，當在人類CTLA4-基因嵌入小鼠中之MC38腫瘤模型中直接比較嵌合L3D10與10D1之抗腫瘤活性時，編碼與人類CTLA-4蛋白質具有100%一致性之產物之CTLA4基因係在內源性小鼠Ctla4 基因座的控制下表現，顯而易見的係，兩種抗體在引起腫瘤排斥反應中均為相當的，而腫瘤在IgG對照組中漸進地生長。圖13展示來自重複實驗之對腫瘤大小之抗體處理的結果。 令人感興趣的問題係，抗CTLA-4 mAb是否需要與所有CTLA-4相互作用(亦即，達成靶標飽和)，以便施加免疫治療效應。來自CTLA4^{h / h} 及CTLA4^{m / m} 小鼠之F1小鼠以共顯性方式表現小鼠及人類CTLA-4蛋白質兩者。有趣地，如圖14中所展示，嵌合L3D10及10D1均有效地誘導腫瘤排斥反應，儘管大致50%之CTLA-4蛋白質(亦即，鼠型式之蛋白質)不能與抗人類CTLA-4 mAb結合。重要地，在此設定中(亦即，當限制基因劑量(P＜0.05)時) L3D10比10D1更為治療有效的。 先前研究已證實，抗小鼠Ctla-4 mAb不能在不與其他治療性模式組合之情況下誘導黑素瘤細胞株B16-F1之排斥反應。因此，亦在人類CTLA4基因嵌入小鼠中使用此更具挑戰性的B16腫瘤模型來測試嵌合L3D10及10D1抗體之抗腫瘤效應。如圖15中所展示，儘管L3D10與伊匹單抗均不能夠引起所形成腫瘤之排斥反應，但均引起腫瘤生長在統計學上的顯著遲緩，而不同抗體之間的差異在統計學上並不顯著。實例 6 ： 活體內之 CTLA4 阻斷 CTLA4主要在Treg中表現，在Treg中，CTLA4藉由下調樹突狀細胞上之B7-1及B7-2表現來遏止自體免疫疾病(50)。由於Ctla4 之靶向突變(50)及用阻斷抗CTLA4 mAb之處理(51)上調樹突狀細胞上之B7-1及B7-2之表現，已表明，Treg上之CTLA4之生理學功能係下調DC上之B7。因此，B7之上調用作B7-CTLA4相互作用之活體內阻斷之讀出，且使用來自具有人類CTLA4 基因之同種接合基因嵌入之Ctla4^{h / h} 小鼠之T細胞來研發檢定。 如圖16中所概述，表面表現之B7.1或B7.2在T細胞之表面上結合CTLA4，此引起B7.1及B7.2表現之下調。然而，阻斷抗CTLA4抗體之結合防止B7.1/B7.2結合，此防止B7.1及B7.2之下調，從而引起B7.1/B7.2表現之淨增加。然而，在嵌合T細胞表現人類及小鼠CTLA4兩者的情況下，結合人類CTLA4之抗體並不防止B7.1/B7.2與鼠CTLA4結合，該結合恢復B7.1/B7.2抑制。 已描述在內源性小鼠Ctla4 基因座之控制下表現與人類CTLA4蛋白質具有100%一致性之CTLA4基因的CTLA4人類化小鼠(20)。將同種接合基因嵌入小鼠(CTLA4^{h / h} )與C57BL/6背景回交至少10代。藉由將CTLA4^{h / h} 小鼠與WT BALB/c小鼠雜交來產生異種接合小鼠(CTLA4^{h / m} )。 為測試臨床上證實之治療性抗CTLA4 mAb (10D1)，吾人注射極高劑量之抗CTLA4 mAb (500 微克/小鼠，其大約為25 mg/kg或在臨床中所使用最高劑量之8倍)至Ctla4^{h / h} 或Ctla4^{m / h} 小鼠中，並收集脾細胞以量測注射後24小時之Cd11c^hi DC上之B7-1及B7-2的水平(圖17A至圖17B)。如圖17C至圖17E中所展示，相比於接受人類IgG1-Fc之Ctla4^{h / h} 小鼠，來自嵌合L3D10處理之小鼠之DC在表現人類CTLA4之T細胞中具有B7.1表現的統計學上顯著增加，但在表現人類及小鼠CTLA4兩者之T細胞中則並不如此。對於B7.2見到類似結果，如圖17C至圖17E中展示。B7-2上調之量級與在人類Treg-DC共培養物中使用阻斷抗CTLA4 mAb所達成之上調之量級相當(66)。 為進一步確認活體內檢定之特異性，吾人測試L3D10是否可上調其中小鼠及人類CTLA4共顯性地表現之Ctla4^{m / h} 小鼠中之B7。由於至少50%之CTLA4並不與抗人類CTLA4抗體結合，故預期CTLA4在阻斷B7-CTLA4相互作用中將為較不強效的。實際上，抗體均不引起來自Ctla4^{m / h} 小鼠之DC上之B7-1及B7-2之上調(圖17C、圖17 D、圖17F)。完全缺乏藉由L3D10在Ctla4^{m / h} 小鼠中之阻斷表明，由小鼠對偶基因編碼之CTLA4 (其並不與L3D10結合(圖18))足以下調B7表現。因此，吾人的資料證實，以至少比臨床中所使用之最高劑量高8倍之劑量，10D1在B7固定在盤上或錨定在細胞膜上時，在活體內及在活體外均不阻斷B7-CTLA4相互作用。 完全缺乏藉由L3D10在Ctla4^{m / h} 小鼠中之阻斷表明，由小鼠對偶基因編碼之CTLA4 (其並不與L3D10結合(圖18))足以下調B7表現。相比之下，10D1並不增加B7.1或B7.2表現。根據該模型，此表明，L3D10在活體內阻斷CTLA4活性而10D1則不。 然而，儘管在阻斷活性中有此等顯而易見的差異，但L3D10及10D1兩者均顯示針對嵌合CTLA4^{m / h} 小鼠中之MC38模型之強抗腫瘤活性，如圖19中所展示。當腫瘤在經對照Ig治療之小鼠中漸進地生長時，藉由任一抗CTLA4 mAb來達成完全排斥反應。在多個實驗中，兩種抗體在引起腫瘤排斥反應中係相當的。在另一腫瘤模型(B16黑素瘤)中，兩種抗體誘導類似的腫瘤生長遲緩，但並不藉由任一抗體達成完全排斥反應(圖20)。實例 7 ： 抗腫瘤效應與腫瘤內 Treg 消減相關聯 活體內之免疫調節係因免疫細胞活化與免疫查核點之間的平衡而產生。特定言之，調節T細胞(Treg)為調節免疫系統、維持對自身抗原之耐受及消除自體免疫疾病之T細胞之亞群。近期研究已證實，抗小鼠CTLA4 mAb之治療功效受Fc子類別及宿主Fc受體影響，Fc子類別及宿主Fc受體又影響選擇性地處於腫瘤微環境內之Treg之抗體依賴性細胞毒性(52，53)。由於活體內之差異性CTLA4阻斷活性似乎並未轉換為抗腫瘤活性之差異，故吾人試圖建立抗腫瘤藉其出現之作用機制且查看腫瘤微環境內之Treg。為了做到這一點，吾人在完成排斥反應之前處死MC38腫瘤負載小鼠(圖21)並分析在接受對照Ig、10D1或L3D10之Ctla4^{h / h} 基因嵌入小鼠中之Treg之頻率。雖然抗體均不減少脾中之Treg (圖22C)，但均減少腫瘤微環境中之Treg (圖22E)。有趣地，10D1而非L3D10擴增脾中之Treg。藉由10D1擴增脾中之Tre重現伊匹單抗藉由周邊血液白細胞增加FOXP3發現之臨床發現(54)。由於阻斷抗體及非阻斷抗體在腫瘤微環境中在Treg消減方面係相當的，故B7-CTLA4相互作用之阻斷並不促成Treg消減。由於10D1並不阻斷活體內之B7-CTLA4相互作用且仍賦予Ctla4^{h / h} 小鼠及黑素瘤患者中之治療性效應，故此相互作用之阻斷對於其治療性效應並非必需的。此外，由於具有大幅度不同的阻斷效應之兩種mAb在腫瘤微環境中具有相當治療性效應及選擇性Treg消減，故阻斷CTLA4-B7相互作用並不增強抗體之治療性效應。 為證實此觀測，吾人在Ctla4^{m / h} 小鼠中測試兩種抗CTLA4 mAb之治療性作用，其中抗人類CTLA4 mAb可與最大50%之CTLA4分子結合且其中無一抗體可阻斷B7-CTLA4相互作用以達成樹突狀細胞上之B7之上調(圖16)。又，兩種抗體引起MC38腫瘤之快速排斥反應，但L3D10比10D1略微更有效(圖22B)。相應地，兩種抗體在腫瘤微環境中選擇性地消減Treg (圖22D及圖21F)。此等遺傳資料進一步證實腫瘤排斥反應中之CTLA4阻斷與局部Treg消減不相關，且因此反駁抗CTLA4 mAb經阻斷B7-CTLA4相互作用來誘導癌症免疫之盛行假設(10)。實例 8 . 評價常用抗小鼠 CTLA4 mAb 9H10 及 9D9 之阻斷活性 基於兩種抗小鼠CTLA4 mAb (4F10及9H10)之整體及Fab兩者之刺激效應而提出CTLA4為T細胞調節之細胞固有負調節劑之概念(30，31)，但未呈現資料來證實此等抗體阻斷B7-CTLA4相互作用。最近，報導第三抗小鼠CTLA4 mAb (9D9)在腫瘤負載小鼠中具有治療性效應，並引起Treg在腫瘤微環境中之局部消減(52)。因此，吾人開始測試所有三種可商購的抗小鼠CTLA4 mAb，已展示因其在生理上相關組態下阻斷B7-CTLA4相互作用的能力而誘導腫瘤排斥反應。作為第一測試，吾人使用增加量之抗CTLA4 mAb (多至超過CTLA4-Fc的2,000倍莫耳過量)以阻斷經生物素標記之CTLA4-Fc與盤固定式B7-1及B7-2之結合。如圖23A中所展示，即使在所測試之最高濃度下，抗小鼠CTLA4 mAb 9H10並不阻斷B7-1-CTLA4相互作用，但當以極高濃度使用9D9時觀測到微弱阻斷。雖然mAb 9D9有效地阻斷B7-2-CTLA4相互作用，但9H10未能如此(圖23B)。有趣地，雖然9D9展示與可溶CTLA4-Fc強結合，但9H10展示不良結合(圖23c)，儘管其在結合固定小鼠CTLA4-Fc中比9D9更強效(圖23D)。由於在此檢定中缺乏藉由9H10之任何阻斷活性可僅反映其與可溶CTLA4-Fc之不良結合，故吾人再次使用WT小鼠(CTLA4^{m / m} )中之樹突狀細胞上之B7-1及B7-2之上調以量測B7-CTLA4相互作用之活體內阻斷。如圖23E及圖23F中展示，9H10並不上調DC上之B7-1表現，而9D9將B7-1含量提高15% (P＜0.05)。有趣地，雖然9D9明確地上調DC上之B7-2，但9H10未能如此。因此，9H10，即第一及最廣泛研究的腫瘤免疫治療抗CTLA4 mAb，並不阻斷B7-CTLA4相互作用。因此，阻斷B7-CTLA4相互作用並不有助於藉由抗-小鼠CTLA4 mAb誘導抗腫瘤免疫。由於兩種mAb均展示相當的免疫治療效應及腫瘤微環境中之Treg之相當的缺失(52)，故Treg之局部缺失而非B7-CTLA4相互作用之阻斷，提供對抗小鼠CTLA4 mAb之治療性效應之統一解釋。有趣地，雖然4F10在活體外阻斷B7-CTLA4相互作用，但其未能在活體內誘導DC上之B7之上調(圖24)。 總之，吾人已證實，臨床上證實之治療性抗人類CTLA4 mAb (10D1)及兩種抗小鼠CTLA4 mAb (9H10及4F10)在未阻斷B7-CTLA4相互作用之情況下賦予了在生理上相關條件下之免疫治療效應。此外，此類阻斷對於腫瘤排斥反應甚至對於可強效阻斷B7-CTLA4相互作用之mAb (L3D10)並非必需的。由於治療性效應對於在阻斷B7-CTLA4相互作用中具有1000倍差異之抗體係實質上相同的，故此類阻斷並不促成抗CTLA4 mAb之癌症治療性效應。此等資料反駁抗CTLA4 mAb經由核查點阻斷而賦予免疫治療效應之假設(55)。藉由反駁該盛行假設，吾人的資料表明，抗CTLA4 mAb之治療性效應不能藉由改良抗CTLA4 mAb之阻斷活性來最佳化。在此背景下，尤其值得注意的係，在阻斷B7-CTLA4相互作用中為優良(56)的曲美單抗(Tremelimumab)在階段III臨床試驗中並未達至臨床終點(57)。同時，藉由證實局部Treg消減之腫瘤排斥反應之間的強相關性及藉由反駁B7-CTLA4相互作用之阻斷參與腫瘤免疫，吾人的工作證實腫瘤環境內之Treg之局部缺失為治療性抗CTLA4 mAb之主要機制之假設，且因此提出研發用於癌症免疫療法之下一代抗CTLA4 mAb的新方法。 最終，小鼠中之積聚遺傳資料表明，可能需要重新討論CTLA4負調節T細胞活化且此類調節經由SHP-2達成(58，59)之原始概念(30，31) (60)。因此，由於Ctla4^-/- 小鼠中之嚴重自體免疫疾病已用於支援CTLA4作為用於T細胞活化之細胞固有負調節劑(61，62)之觀念，故自此已出現並不與此視圖一致的至少三個株之遺傳資料。首先，在Treg中而非在效應T細胞中之Ctla4基因之譜系特異性缺失足以重現在具有Ctla4基因之生殖系缺失之小鼠中觀測到之自體免疫表現型(50)。此等資料表明，Ctla4^-/- 小鼠中之自體免疫並不歸因於在效應T細胞中缺乏細胞固有負調節劑CTLA4。其次，在由WT T細胞及Ctla4^-/- T細胞兩者組成之嵌合體小鼠中，藉由WT T細胞之共存來預防自體免疫表現型(63)。此等資料再次強烈主張，自體免疫疾病並不係由細胞固有負調節劑之缺乏而引起。亦藉由在嵌合體小鼠中，在病毒性感染期間未觀測到Ctla4^-/- T細胞之較佳擴增(64)來證實缺乏細胞固有負調節劑效應。再者，Shp2之T細胞特異性缺失(提議調節CTLA4之負調節(58, 59))證明減少而非增強T細胞活化(65)。在所報告之此等遺傳資料之上下文中，自提議CTLA4作為用於T細胞活化之負調節劑以來，本文中所報告之吾人的資料需要在癌症免疫療法中重估之CTLA4核查點阻斷。實例 9 . 嵌合 L3D10 證實當與其他免疫治療抗體組合使用時減少免疫不良事件 近來的臨床研究已揭露，抗PD-1與抗CTLA4 mAb之間的組合療法進一步提高末期黑素瘤患者之存活。然而，接受組合療法之55%之患者發展3級及4級免疫相關聯不良事件(irAE)。因此，其為研發具有較少毒性之抗體的關鍵。吾人已研發重現與抗CTLA-4 mAb及抗PD-1 mAb之組合療法相關聯之在臨床中觀測到之irAE的活體內模型。在此模型中，吾人在圍產期期間用高劑量之抗PD-1 mAb及抗CTLA-4 mAb治療人類CTLA4基因嵌入小鼠(CTLA4^{h / h} )。吾人發現，當幼齡小鼠耐受個別mAb之處理時，抗PD-1與10D1之組合療法引起具有多器官發炎、貧血及如圖25中所展示的嚴重生長停滯之嚴重irAE。相比之下，當與抗PD-1組合時，嵌合L3D10僅呈展現溫和irAE，如藉由正常體重增加所證實。 為進一步檢查嵌合L3D10與10D1相比在與抗PD-1組合投與時之相對毒性，吾人查看在投與之後第42天的CTLA4^{h / h} 基因嵌入小鼠中之病理效應。如圖26中所展示，在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中之最後體重(第42天)類似於用hIgG陰性對照抗體處理之小鼠。然而，藉由比較，用10D1+抗PD-1治療之小鼠之體重低許多。因此，當吾人查看此等小鼠之大體解剖時，在用10D1+PD-1治療之小鼠中，子宮/卵巢/膀胱及胸腺明顯地較小(圖27)。又，在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中之器官與hIgG對照相當。相比之下，自用10D1治療之小鼠剝離之心臟的大小顯得略大，具有明顯較白外觀。因此，吾人決定查看在小鼠內之紅血球生成，並在用10D1+抗PD-1治療之小鼠中觀測相對於用L3D10+抗PD-1或極其類似之對照抗體處理之組的清晰差異。如圖27A中所展示，來自用10D1+抗PD-1治療之小鼠之骨髓具有明顯較白色彩且經分離血液幾乎完全為白色(圖28b)。據此，吾人使用CD71及CD119標記更近地查看正經歷血液發育之不同階段的細胞。代表性FACS分佈展示於圖28C中，而概述資料呈現於圖28D中。此等資料揭露在10D1+抗PD-1治療之小鼠中之經歷階段IV發展之細胞的數目在統計學上的顯著減少(圖28D)。 為探究在經10D1處理之小鼠中之貧血之潛在機制，吾人測試10D1+PD-1治療是否誘導抗紅血球抗體。如圖29中所展示，未偵測到抗紅血球抗體。因此，紅血球特異性自體抗體之發育並不係經抗PD-1+10D1治療之小鼠中之貧血的原因。 為進一步判定L3D10相對10D1與抗PD-1組合之毒理學，吾人在固定於10%福馬林中至少24小時之後進行心臟(圖30)、肺(圖31)、唾液腺(圖32)及腎與肝(圖33)之組織學分析。在經研究的組織中之各者中，用10D1+抗PD-1治療之小鼠顯示高水平之T細胞浸潤。基於發炎之嚴重程度之毒性記分概述於圖34中，其展示用10D1+抗PD-1相對於用L3D10+抗PD-1 (其具有僅比hIgG對照小鼠組略高之記分)治療之小鼠之較高毒性記分。實例 10 ： L3D10 與可溶 CTLA4 之結合減少 。 L3D10及10D1對於盤固定式CTLA4顯示類似結合模式(圖36)。作為對於L3D10相對於10D1毒性減少的可能解釋，尤其係與10D1相關聯之增加的T細胞浸潤/活性，吾人決定查看與可溶CTLA4之結合。吾人選擇查看此，係因為CTLA4多形現象與多種自體免疫疾病之間的關聯係關於可溶CTLA4之缺陷性產生(nature 2003, 423: 506-511)，且sCTLA4同功異型物之遺傳靜默增加小鼠中I型糖尿病之發作(Diabetes 2011, 60:1955-1963)。此外，可溶CTLA4 (阿巴西普(abatacept)及貝拉西普(belatacept))為用於免疫抑制之廣泛使用之藥物。根據此想法，當吾人查看與可溶CTLA4之相對結合時，吾人觀測到L3D10結合之顯著減少(圖37)。 吾人已證實，抗CTLA-4 mAb誘導在異種接合Ctla4^{h / m} 小鼠中之穩定腫瘤注射，其中僅50%之CTLA-4分子可與抗人類CTLA-4 mAb結合。為判定50%之CTLA-4之接合是否足以誘導irAE，吾人用抗PD-1+10D1治療Ctla4^{h / m} 小鼠。如圖35中所展示，抗PD-1+10D1未能誘導Ctla4^{h / m} 小鼠中之體重減輕。因此，可以基因改造方式解偶irAE與癌症免疫。 活體內活性證實，L3D10抗體保留其抗腫瘤活性但顯示與其他免疫治療抗體(諸如10D1)觀測到之自體免疫不良效應減少，從而指示有可能增強抗腫瘤活性而不加重自體免疫不良事件。因此，自體免疫副作用並不為癌症免疫之必要性代價且其有可能解偶此等兩種活性。L3D10之表徵證實，其阻斷CTLA4與B7.1及B7.2之相互作用之能力比10D1更有效，且證實其係關於抗體之間的CTLA4結合位點之差異。此外，L3D10與經修飾人類IgG1 Fc域融合，該經修飾人類IgG1 Fc域具有賦予增強抗體之治療性效應之強ADCC活性之突變。另外的表徵證實，L3D10及10D1以類似結合分佈與固定CTLA4結合。然而，L3D10證實與可溶CTLA4之結合親和性遠低於10D1。總之，吾人的資料證實，抗體L3D10有極大的臨床使用潛力以治療具有較少嚴重不良事件之癌症患者。實例 11 . 人類化 L3D10 藉由產生同源性模型化之抗體3D結構及基於結構建模而建立親本抗體之分佈來開始人類化方法。基於跨越構架之整體序列一致性、匹配介面位置、類似分類之CDR典型位置及應必須去除之N-糖基化位點之存在來識別利用之接受體構架。選擇一條輕鏈(LC)及一條重鏈(HC)構架用於人類化設計。 藉由建立將親本抗體序列之選擇部分與人類構架序列融合之多個雜交序列(包括將CDR序列移植至接受體構架中)來設計人類化抗體。提供親本抗體L3D10之所預測CDR序列作為SEQ ID NO: 21至26，如下表1A中所指示： 表1A：親本抗體L3D10之所預測CDR序列

使用3D模型，藉由眼睛及電腦建模來有條理地分析此等人類化序列以分離應最可能保留抗原結合之序列。目標為使最終人類化抗體中之人類序列之量達到最大，同時保留初始抗體特異性。 基於所選擇接受體構架，設計三種人類化輕鏈(LC1、LC2及LC3)及三種人類化重鏈(HCl、HC2及HC3)。三種HC或三種LC序列中之各者係來自同一生殖系，具有至鼠親本序列之不同回復突變，如圖38中所展示。人類化可變區胺基酸序列及其最佳化編碼核苷酸序列列於SEQ ID NO: 9至20中。兩種人類化重鏈及輕鏈之CDR2序列含有相對於親本L3D10抗體序列之胺基酸改變，且列於SEQ ID NO 33至38中，如下表1B中所指示。 表1B：人類化抗體可變區之CDR2序列。

現在組合人類化輕鏈及重鏈以產生不同的完全人類化之抗體。測試人類化輕鏈及重鏈之所有可能組合之表現水平及抗原結合親和性，以識別執行類似於親本抗體之抗體。 使用計算用於單株抗體之人類化記分之新工具(24)。此記分表示抗體可變區序列如何看起似人類的，其為當人類化抗體時之重要因素。親本抗體及人類化抗體之人類化記分展示於下表2及3中。基於吾人的方法，對於重鏈，79或大於79之記分指示看起來似人類的；對於輕鏈，86或大於86之記分指示看起來似人類的。 表2：人類化輕鏈資訊及人類化記分。

表3：人類化重鏈資訊及人類化記分。

藉由首先合成可變區序列來構建全長抗體基因。將該等序列最佳化用於哺乳動物細胞中之表現。接著將此等可變區序列選殖至已經含有人類Fc域之表現載體中；對於重鏈，利用hIgG1 (M252Y、S254T、T256E、S298A、E333A、K334A)主鏈。另外，為了比較，使用相同主鏈Fc序列將嵌合親本重鏈及輕鏈之可變區建構為全長嵌合鏈。 所有9種人類化抗體經受0.01公升較小規模製造。亦按比例增加嵌合親本抗體用於直接比較。在無血清存在下使用化學限定之培養基將用於所指示重鏈及輕鏈之質體轉染至HEK293細胞懸浮液中以製作抗體。使用MabSelect SuRe 蛋白質A培養基(GE Healthcare)來純化改良性培養基中之全部抗體。所測試之10種抗體展示於下表4中。 表4：在HEK293細胞中展示產生之十種抗體

藉由Octet來評價9種人類化抗體組合及嵌合親本抗體與抗原(huCTLA4)之親和性。對Octet Red96系統(ForteBio)執行多濃度動力學實驗。將抗hIgG Fc生物感測器(ForteBio, #18-5064)在樣本稀釋劑(含0.1% BSA之PBS及0.02%吐溫20)中水合並在pH 1.7甘胺酸中預處理。使用7點、2倍連續稀釋在600 nM處開始用樣本稀釋劑來稀釋抗原。用樣本稀釋劑將所有抗體稀釋至10 µg/mL，且接著固定至抗hIgG Fc生物感測器上達120秒。在於樣本稀釋劑中建立基線60秒之後，以一系列濃度將生物感測器移動至含有抗原之槽以量測締合。對於樣本稀釋劑中所關注之各蛋白質，觀測締合120秒且觀測解離180秒。結合親和性特徵在於使動力學感測器圖譜適應單價結合模型(1:1結合)。完整動力學量測概述於下表5中。 表5：人類化抗體及親本抗體之動力學量測

實例 12 . 人類化抗 CTLA4 抗體之抗腫瘤活性 基於相對結合親和性及人類化記分，吾人選擇3種抗體用於進一步評價： PP4631 -高親和性及良好表現 PP4637 -高親和性及良好表現 PP4638 -略低親和性但最高人類化記分 藉由以0.1公升規模在HEK293細胞中進行暫時製造，隨後進行蛋白質A純化來產生用於此等抗體中之各者之材料。藉由Octet分析來確認經純化抗體之結合親和性，如下表6中所展示。 表6.人類化抗體及親本抗體之動力學量測

吾人使用在上文實例5中所描述之人類CTLA4嵌入小鼠中之同基因型MC38小鼠腫瘤模型來評價此等三種人類化抗體與10D1及嵌合L3D10抗體相比之抗腫瘤活性。圖39A展示活體內實驗之治療進度表；在接種後第7天開始每3天對小鼠給予總共4劑量之抗體。如圖39B中所展示，所有人類化抗體均完全地根除腫瘤且與10D1相當。 在另一實驗中，吾人使用在實例5中所描述之異種接合Ctla4^{h / m} 小鼠中之同基因型MC38小鼠腫瘤模型(圖14)以兩種不同劑量來評價人類化抗體PP4631及PP4637與10D1及嵌合L3D10抗體相比之抗腫瘤活性。如圖40中所展示，儘管所有mAb在以30微克/小鼠/注射(1.5 mg/kg)使用時均無法區分，但PP4637以10微克/小鼠/注射(0.5 mg/kg)更有效，而PP4631及10D1展示相當的活性。 亦使用如圖41中所展示之人類CTLA4基因嵌入小鼠中之同基因型B16-F1黑素瘤小鼠腫瘤模型來證實人類化抗體與10D1及嵌合L3D10抗體相比之抗腫瘤活性。在接種後第2天開始每3天對小鼠給與總共3劑量之抗體。如圖41中所展示，L3D10及人類化抗體延緩腫瘤生長且與10D1相當。實例 13 . L3D10 之人類化純系維持比 10D1 優良的安全性分佈。 為測試是否可在人類化之後維持L3D10之優良安全性分佈，吾人比較當與抗PD-1組合使用時PP4631及PP4637與10D1之不良效應。如圖42中所展示，PP4631及PP4637兩者當與抗PD-1組合使用時均比10D1毒性更少。 與圖28中所描述之缺陷性紅血球生成一致，用10D1加抗PD-1治療之小鼠根據完全血球計數(complete blood cell counts；CBC)是貧血的，而接受抗PD-1+PP4631及抗PD-1+PP4637之彼等小鼠具有很大程度上是正常的CBC分佈，如圖43中所展示。此外，PBL中之T細胞分佈之分析揭露，接受10D1+抗-PD-1之小鼠而非接受抗PD-1+PP4631或抗PD-1+PP4637之彼等小鼠中之CD4 T細胞及CD8 T細胞兩者之穩定全身性活化(圖44)，從而進一步支持以下的觀念：以L3D10為基礎的抗CTLA-4 mAb並不造成全身性T細胞活化。實例 14 . 人類化抗 CTLA4 抗體之結合特徵 為確認人類化抗體保留其CTLA4結合特徵，吾人查看與固定及盤結合之CTLA4的結合。如圖45中所展示，人類化並不影響與固定CTLA4結合，且所有3種人類化抗體均證實與親本嵌合L3D10抗體類似結合。然而，人類化進一步減少L3D10與可溶CTLA4結合，如圖46中所展示。基於與可溶CTLA4之結合減少，預期3種人類化抗體將誘導具有比L3D10甚至更少自體免疫副作用之等效的腫瘤排斥反應。 吾人已證實，嵌合L3D10具有比10D1高1000倍之阻斷活性。此提出一種令人感興趣的可能性：阻斷B7-CTLA-4相互作用可闡釋其缺乏irAE。如圖47及圖48中所展示，PP4631與PP4637在活體外及活體內均不阻斷B7-CTL-A4相互作用。PP4631及PP4637展示減弱的irAE的事實進一步支援以下觀念：阻斷B7-CTLA-4相互作用不係L3D10安全性經改良的原因。 鑒於所提議的CTLA-4在針對自體免疫疾病保護中之作用，吾人將與可溶CTLA-4之結合的減少提議為用於經改良安全性分佈之基礎機制。為測試此假設，吾人使用在圍產期期間接受抗PD-1+抗CTLA-4 mAb之雌性小鼠中之生長體重增加作為irAE之基礎指標。如圖42中所展示，在接受10D1及抗PD-1兩者之小鼠中觀測到體重增加之劇烈減少，而在接受PP4631且接著L3D10之前接受PP4637+抗PD-1之彼等小鼠具有最低irAE。與同sCTLA-4之結合減少的嚴格的逆相關與中心假設一致。實例 15 . 人類化抗 CTLA4 抗體之可加工性評價 為評價三種不同人類化抗體之發育及製造潛力，進行許多分析方法以表徵不同抗體。

作為始評定，基於胺基酸序列來計算三種前導候選抗體之經預測分子量及等電點。如表7中所展示，所有抗體均極其類似，但抗體具有略低PI。 表7：三種人類化抗體之理論參數

產物產量評定 為評定不同抗體之產率，用表現不同抗體之重鏈及輕鏈之載體暫時轉染HEK293細胞。接著在搖瓶中使用無血清培養基培養此等細胞6天。在6天後，採集上清液並藉由一步蛋白質A層析來純化抗體。如下表8中所展示，抗體PP4631及PP4637證實類似蛋白質產量而抗體PP4638係以低許多之相對產量而產生。 表8：人類化抗體生產產量評定。

為評定暫時表現之抗體之純度，藉由還原性及非還原性SDS-PAGE來分析樣本。如圖50中所展示，來自所有3種抗體之樣本產生指示抗體分子之凝膠條帶，且樣本在蛋白質A純化之後相對較純。尺寸排外層析法 為進一步檢查不同抗體在暫時表現之後的純度及凝集，吾人進行純化蛋白質之尺寸排外層析法。簡言之，將50µg之經過濾(使用0.22 µm過濾器)樣本用於使用TOSOH G3000 SWxl 5µm管柱之SE-HPLC分離。PBS pH 7.4用作移動相。如下表9中所展示，所有人類化抗體在蛋白質A純化之後均展示＞90%純度。抗體PP4631及PP4637類似地證實大部分蛋白質在主峰內的抗體樣本存在低水平之較高分子量(MW)凝集及降解。相比之下，抗體PP4638具有較高含量之凝集及一些降解。SE-HPLC層析圖展示於圖51中。 表9：尺寸排外層析法

毛細電泳法 ( CE ) 毛細電泳法用於在還原及非還原條件下定量在峰值條帶內之蛋白質之量以及未經糖基化之重鏈蛋白質之量。簡言之，連同2 µL之10 kDa標準蛋白質，將100 µg樣本稀釋至CE-SDS樣本緩衝液連同碘乙醯胺(非還原性條件)或β-巰基乙醇(還原性條件)中。接著在70℃下處理樣本10 min。為了分離，使用PA-800，50 µm I.D.裸熔融矽石毛細管；運行長度20.2 cm；分離電壓15 kV；OD₂₂₀ 用於偵測。如下表10中所展示，所有三種蛋白質證實高純度水平(與SDS-PAGE一致)，且所有均高度糖基化。CE-SDS層析圖展示於圖52中。 表10：毛細電泳法

脫醯胺 ： 毛細管等電聚焦 ( cIEF ) 及液相層析質譜 法 ( LC - MS ) 藉由經兩個不同時段(5小時及12.5小時)之高pH脅迫處理的情況下及在無該高pH脅迫處理的情況下比較抗體，隨後進行cIEF及LC-MS分析，來測定在高pH脅迫下之蛋白質脫醯胺水平。 藉由毛細管等電聚焦(cIEF)來測定不同抗體之電荷同型分佈及等電點。簡言之，樣本經受緩衝交換至20 mM Tris pH 8.0中，且接著將100 µg樣本蛋白質與兩性電解質(甲基纖維素)、連同PI 7.05及PI 9.77標記混合。使用iCE3^TM 用於分析，具有100 µm I.D.毛細管；1.5 kV加3 kV；OD₂₈₀ 用於偵測。對於脫醯胺脅迫處理，用500 mM NaHCO₃ 處理樣本5小時或12.5小時，接著用cIEF及LC-MS檢查。分析之結果展示於下表11中，且LC-MS圖展示於圖53中。所有三種抗體均展示隨著脅迫條件之經脫醯胺物質之量之預測增加及主峰中之對應下降。如自胺基酸序列所預測，抗體PP4637之pI比PP4631及PP4638之pI稍低(表7)，且與預測pI相比，觀測到的較高pI大概指示糖基化。 表11：等電聚焦及脫醯胺

差示掃描 熱量測定 ( DSC ) 熱分析 為測定不同抗體之熱穩定性及熔化溫度，對其進行差示掃描熱量測定(DSC)熱分析。簡言之，以1℃/min之速率對含2 mg/mL樣本之PBS pH 7.4進行自15℃至105℃之溫度斜升。監測樣本及緩衝液兩者之隨溫度之Cp變化(作為背景)。利用背景減除獲得Cp對比溫度曲線，且峰指示分析物之Tm。如下表12中所展示，所有三種抗體證實類似高的熔化溫度。三種抗體之DSC曲線展示於圖54中。 表12：尺寸排外層析法

氧化：肽映射 在有氧化脅迫或無氧化脅迫之情況下，藉由使用LC-MS之肽映射來評價人類化抗體之氧化修飾。在65℃下在6 M GnCl及5 mM β-ME存在下對樣本進行變性，接著用碘乙醯胺對其乙醯化。接著在55℃下用胰蛋白酶(Promega，定序級別)分解經處理樣本，且在C18反相LC管柱(ACQUITY UPLC BEH130 C18, 2.1×100 mm,1.7 μm)上分離經分解混合物，並使用Masslynx及Biophatmlynx分析工具藉由質譜法(Waters XEVO-G2S QTOF)來分析。對於氧化脅迫分析，用0.05%或0.1% H₂ O₂ 處理樣本1小時，接著用LC-MS檢查。結果展示於下表13至16中。 表13.人類化抗體在甲硫胺酸位點處之氧化。頂部畫面：抗體PP4631。中部畫面：抗體PP4637。底部畫面：抗體PP4638。

表14.人類化抗體PP4631在色胺酸位點處之氧化。紅色數字指示發現分裂之證據；「—」指示未偵測到；「0」指示以極低含量偵測到。

表15.人類化抗體PP4637在色胺酸位點處之氧化。紅色數字指示發現分裂之證據；「—」指示未偵測到；「0」指示以極低含量偵測到。

表16.人類化抗體PP4638在色胺酸位點處之氧化。紅色數字指示發現分裂之證據；「—」指示未偵測到；「0」指示以極低含量偵測到。

結合特異性 藉由評定在兩種不同濃度下相對於10D1偵測與並不表現CTLA4 (CHO及HEK293)之兩種不同細胞株非特異性結合之能力來測定不同抗體之結合特異性。簡言之，將含有100 µg/mL或20 µg/mL樣本(或參考mAb)之PBS與3×10e⁶ 細胞/毫升(CHO或HEK293)一起培育。使用經FITC標記之家兔抗人類IgG抗體(Boster, Wuhuan, China)用於偵測，且藉由FACS來量測靶標mAb與細胞之結合。如下表17中所展示，抗體PP4631及PP4637證實極低結合及良好特異性，而抗體PP4638顯示與對照細胞株之非特異性結合活性。 表17：與CHO及HEK293細胞株之結合特異性

實例 16 . L3D10 及人類化抗體之抗原決定基映射 為映射L3D10親本抗體及人類化變體(PP4631及PP4637)之CTLA4結合抗原決定基，吾人利用小鼠及人類CTLA4蛋白質與B7-1交叉反應但並不與抗CTLA-4抗體交叉反應之事實。因此，吾人設計人類CTLA-4Fc蛋白質之許多突變體，其中來自人類CTLA-4蛋白質之成群胺基酸經來自鼠Ctla-4蛋白質之胺基酸置換。由於用於此研究之抗CTLA-4抗體並不與鼠Ctla-4結合，故抗人類CTLA-4抗體之結合應在抗體結合抗原決定基之關鍵殘基經鼠胺基酸置換時消除。 基於野生型人類CTLA-4Fc序列來建構編碼11種CTLA-4Fc突變蛋白質(M1至M11) (SEQ ID NO: 40至50)之DNA載體，且藉由以0.01 mL規模暫時轉染在HEK293中，之後進行一步蛋白質A層析純化來產生蛋白質。 藉由ELISA來進行抗CTLA4抗體與CTLA4Fc蛋白質之結合。以1 µg/mL用CTLA-4Fc蛋白質塗佈盤，且接著在結合檢定中將經生物素標記之抗體或B7-1Fc融合蛋白質用於可溶相中，其中使用經辣根過氧化酶(HRP)接合之抗生蛋白鏈菌素來量測結合蛋白質之量。 抗人類CTLA-4抗體並不與鼠Ctla-4交叉反應，其大概反映在細胞外域中人類CTLA-4與小鼠CTLA-4之間的胺基酸序列之差異。圖55展示人類、獼猴及小鼠CTLA-4細胞外域之對準且高亮顯示人類與獼猴之間的序列保守性，同時展示鼠與靈長類序列之間的許多差異。歸因於MYPPPY結合主結構之保守性，小鼠及人類CTLA4蛋白質與B7-1交叉反應(72)。 為映射抗人類CTLA-4抗體之結合抗原決定基，吾人生成許多未重疊CTLA-4Fc突變蛋白質，其將成群鼠特異性胺基酸併入至人類CTLA-4序列中。併入至11個突變體中之各者中之胺基酸展示於圖55中，且WT CTLA-4Fc蛋白質及突變體CTLA-4Fc蛋白質之胺基酸序列展示於圖56中。藉由暫時轉染在HEK293細胞中來產生此等蛋白質，且產量提供於表18中。許多突變似乎影響蛋白質表現，如藉由其相對於WT人類CTLA-4Fc蛋白質之產量所指示。 表18：在HEK293細胞中展示產生之WT CTLA-4Fc蛋白質及突變CTLA-4Fc蛋白質。

接著藉由ELISA來測定嵌合L3D10及人類化抗體PP4631及PP4637結合固定CTLA-4Fc突變構築體之能力，其中用CTLA-4突變構築體塗佈盤且添加經生物素標記之抗CTLA-4抗體或B7-1 Ig對照蛋白質並且使用經HRP接合之抗生蛋白鏈菌素來量測結合。結合檢定之結果展示於表19至表22中。如所預期，所有4種結合蛋白質證實WT CTLA-4Fc蛋白質之良好劑量依賴性結合。然而，引入至M9及M10蛋白質中之突變似乎更改整體結構且此等突變體未能結合B7-1Fc。引入M2及M4中之突變亦部分地更改CTLA-4構形，如藉由相對於WT蛋白質之結合減少所指示。與此觀念一致，所有4種此等突變體(M2、M4、M9及M10)均以低許多之產量表現(表18)。相比之下，使用與WT CTLA-4Fc蛋白質結合及B7-1Fc蛋白質之結合作為參考，M11作為表現良好、有效地結合B7-1Fc但未能結合兩種人類化抗CTLA-4抗體之蛋白質而明顯極出色。其與原始L3D10結合亦降低了大致100倍(表20)。如所預期，影響整體確認之突變亦影響與抗CTLA-4抗體的結合。 表19：CTLA4Ig突變體之完整性，如藉由其與B7-1 Ig融合蛋白質之結合所指示。藉由ELISA來進行與CTLA4Fc蛋白質之結合，其中藉由經辣根過氧化酶(HRP)接合之抗生蛋白鏈菌素來量測經生物素標記之結合蛋白質之量。所展示值為OD450量測值。WT=野生型CTLA-4Fc。M1至M11為CTLA-4Fc突變蛋白質。

表20：嵌合L3D10抗體之抗原決定基映射。藉由ELISA來進行與CTLA4Fc蛋白質之結合，其中藉由經辣根過氧化酶(HRP)接合之抗生蛋白鏈菌素來量測經生物素標記之結合蛋白質之量。所展示值為OD450量測值。WT=野生型CTLA-4Fc。M1至M11為CTLA-4Fc突變蛋白質。

表21：人類化抗體PP4631之抗原決定基映射。藉由ELISA來進行與CTLA4Fc蛋白質之結合，其中藉由經辣根過氧化酶(HRP)接合之抗生蛋白鏈菌素來量測經生物素標記之結合蛋白質之量。所展示值為OD450量測值。WT=野生型CTLA-4Fc。M1至M11為CTLA-4Fc突變蛋白質。

表22：人類化抗體PP4637之抗原決定基映射。藉由ELISA來進行與CTLA4Fc蛋白質之結合，其中藉由經辣根過氧化酶(HRP)接合之抗生蛋白鏈菌素來量測經生物素標記之結合蛋白質之量。所展示值為OD450量測值。WT=野生型CTLA-4Fc。M1至M11為CTLA-4Fc突變蛋白質。

表23：來自展示僅在M11中之抗原決定基之特異性損失之重複研究的原始資料。與表2至5中相同，不同之處在於包括額外對照來展示結合之特異性。

由於L3D10保留與M11的顯著結合，吾人測試結合是否為特異性的。吾人用人類CTLA4-Fc (hCTLA4Fc)、小鼠CTLA4-Fc (mCTLA4-Fc)、對照IgG1-Fc或所有突變hCTLA4-Fc塗佈盤，且量測其與B7-1Fc連同L3D10、PP4631及PP4637之結合。大部分資料呈現於表23中。如圖57中所展示，經生物素標記之B7-1同樣良好地結合hCTLA-4、mCTLA-4及M11。藉由缺乏與IgG1-Fc的結合來證實檢定之特異性。令人感興趣的係，雖然L3D10與M11之結合比與IgG1-Fc及mCTLA4-Fc之彼等結合更強，但與IgG1-Fc之顯著結合表明嵌合抗體與M11之結合可能為非特異性的。相比之下，人類化抗體中無一者與M11、mCTLA-4及IgG1-Fc對照結合。此等資料證實，引入M11中之突變選擇性地消融L3D10、PP4631及PP4637與CTLA-4結合。 使用已知錯合物結構133，吾人將CTLA-4抗原決定基映射於3D結構中。如圖58中所展示，藉由定位於由B7-1覆蓋之區域內之此等mAb來辨識抗原決定基。因此，L3D10、PP4631及PP4637與CTLA-4結合應為與B7-1彼此排他性的。不良阻斷PP4631及PP4637係歸因於較低親合力而非獨特結合域。 利用小鼠及人類CTLA4蛋白質與B7-1交叉反應但抗人類CTLA-4抗體並不與鼠Ctla-4蛋白質交叉反應之事實，吾人能夠藉由ELISA來映射L3D10衍生之抗體之結合抗原決定基。使用許多人類CTLA-4Fc蛋白質之突變體，其中，來自人類CTLA-4蛋白質之成群胺基酸經來自鼠Ctla-4蛋白質之胺基酸置換，吾人明確證實，當吾人置換緊跟在CTLA-4之已知B7-1結合域的4個胺基酸時，在很大程度上消除抗體之劑量依賴性結合。結合抗原決定基直接鄰近於B7-1結合域映射之事實與L3D10抗體在活體外及在活體內均阻斷B7-CTLA-4相互作用之經證實能力極大相關。由於藉由將胞外IgV域之C端胺基酸與胞內域融合來產生可溶CTLA4，具吸引力的係，推測與多晶型C端域殘基(來自C端之僅18個胺基酸)結合之抗體更可能失去與可溶CTLA-4之反應性，其中較大胞內域與細胞外域之C端融合。 為進一步研究抗CTLA4抗體之結合域，設計6種額外突變CTLA4-Fc融合蛋白質(指定為M12至M17 (SEQ ID NO: 51至56)) (圖59)且用於比較抗CTLA4抗體10D1 (圖60A)、PP4631 (圖60B)及PP4637 (圖60C)之結合。如圖60中所展示，M11中之突變(其在位置Y¹⁰³ L¹⁰⁴ I¹⁰⁶ 處)消除與10D1、PP4631及PP4637結合，從而證實用於10D1、PP4631及PP4637之結合位點包括殘基Y¹⁰³ L¹⁰⁴ I¹⁰⁶ 。重要地，A29＞Y中之額外突變利用Y¹⁰³ L¹⁰⁴ I¹⁰⁶ 中之突變恢復CTLA-4與PP4631及PP4637之結合。此等資料證實CTLA4中之位置A²⁹ 對於抗體PP4631及PP4637而非10D1之結合係重要的。實例 17 . 抗 CTLA - 4 mAb 與 抗 4 - 1BB 在誘導腫瘤排斥反應時協同作用 動物模型中之研究已指示，藉由抗CTLA-4單株抗體(mAb)引發之抗腫瘤反應至少部分係歸因於針對正常「自身」分化抗原之抗原特異性T細胞反應(73，74)。抗CTLA-4抗體加重自體免疫疾病之傾向在小鼠中係顯而易見的(75至78)。進一步證實及證明此觀念為最新人類試驗中之主要限制，在該等試驗中，患者產生需要停止治療之嚴重自體免疫表現(79)。另一方面，癌症治療性抗4-1BB mAb已展示消除患狼瘡小鼠中之自體免疫疾病之發展(24，25)。 抗4-1BB mAb均可刺激抗腫瘤反應並減少自體免疫表現之事實提出引人興趣的可能性：此抗體與抗CTLA-4 mAb之組合可在無自體免疫之情況下引起癌症排斥反應。在此研究中，將抗CTLA-4與抗4-1BB組合以誘導較大的所形成腫瘤之排斥反應。抗鼠 CTLA - 4 及抗鼠 - 4 - 1BB 抗體在誘導 CD8T 細胞 介 導之腫瘤排斥反應中之組合效應 兩種模型(一個為微小疾病且一個為較大形成腫瘤)用於測試組合抗鼠-4-1BB及抗鼠-CTLA-4 mAb治療之抗腫瘤效應。利用皮下接種MC38結腸癌細胞攻擊C57BL/6小鼠，且在腫瘤細胞接種之後的不同時間，將抗體注射至腫瘤攻擊之小鼠中，並藉由物理檢查來監測腫瘤大小及發病率。 在微小疾病模型中，在接種腫瘤細胞之後48小時開始，用倉鼠IgG加大鼠IgG、抗4-1BB加倉鼠IgG (僅有抗4-1BB的組)、抗CTLA-4加大鼠IgG (僅有抗CTLA-4的組)或抗4-1BB與抗CTLA-4組合來治療小鼠。在第2天、第9天及第16天腹膜內(i.p.)投與抗體。用抗4-1BB或抗CTLA-4 mAb單獨處理引起在排斥腫瘤之各組中5分之1之小鼠延緩腫瘤生長，而5分之4用抗CTLA-4及抗4-1BB mAb兩者治療之小鼠在實驗結束時不含腫瘤。圖61A顯示各小鼠之腫瘤生長量測。為比較各組之間的生長速率，將線性隨機效應模型應用於資料。組合療法僅經由抗CTLA-4使腫瘤大小之每日生長顯著減少達4.6 mm² /天(p=0.0094)。此外，組合療法僅經由抗4-1BB使生長顯著減少達8.4 mm² /天(p=0.0006)。除生長速率以外，比較在初始腫瘤攻擊六週之後各治療組之間的實際腫瘤大小。與單獨給與抗CTLA-4 (137.8 mm² , p=0.0251)或抗4-1BB (287.6,p=0.0006)之小鼠相比，給與組合療法之小鼠在第六週之平均腫瘤大小明顯地更小(27.5 mm² )。因此，在微小腫瘤負荷之設定中，抗4-1BB及抗CTLA-4 mAb之組合引起經由單獨給與之抗4-1BB或抗CTLA-4的腫瘤生長之顯著延緩。 為判定針對小腫瘤負荷之組合mAb處理之抗腫瘤效應是否可擴展至針對較大腫瘤負荷之治療性應用，用抗體處理具有所形成腫瘤之小鼠。利用皮下接種MC38結腸癌細胞來攻擊野生型C57BL/6小鼠。允許腫瘤生長14天，此時選擇具有所形成腫瘤(通常直徑＞7 mm)之小鼠並隨機劃分為四個治療組：倉鼠IgG加大鼠IgG、抗4-1BB加倉鼠IgG、抗CTLA-4加大鼠IgG及抗4-1BB mAb與抗CTLA-4 mAb組合。在腫瘤攻擊之後第14天、第21天及第28天腹膜內投與抗體。如圖61B中所展示，當與對照IgG處理相比時，用抗CTLA-4 mAb處理並不妨礙腫瘤生長，但在該組中之八隻小鼠中之一者中見到排斥反應。用抗4-1BB mAb處理略微減緩腫瘤生長，但八隻小鼠中僅一者排斥腫瘤。相比之下，利用抗CTLA-4及抗4-1BB mAb兩者之組合療法引起8個小鼠中有7個根除了腫瘤且防止剩餘小鼠中之進一步腫瘤生長。如上，藉由將線性隨機效應模型應用於資料來比較各組之間的生長速率。組合療法僅經由抗CTLA-4使腫瘤大小之每日生長顯著減少達10.6 mm² /天(p＜0.0001)。此外，組合療法僅經由抗4-1BB使生長顯著減少達6.2 mm² /天(p=0.0002)。除生長速率以外，比較在初始腫瘤攻擊八週之後各治療組之間的實際腫瘤大小。與單獨給與抗CTLA-4 (404.9 mm² , 95% CI: 285.4, 524.4 mm² ；p＜0.0001)或抗4-1BB (228.4 mm² , 95% CI: 200.4, 689.9 mm² ；p = 0.0004)之小鼠相比，給與組合療法之小鼠在第八週的所評估平均腫瘤大小明顯更小(-1.7 mm² , 95% CI: -10.8, 7.5 mm² )。因此，亦在較大腫瘤負荷中，組合mAb亦似乎單獨經由抗CTLA-4或抗4-1BB上明顯延緩腫瘤生長。 已知MC38形成肝癌轉移。⁸⁰ 為評價治療性抗體對肝癌轉移之效應，藉由組織學來分析參與實驗之所有小鼠之肝癌轉移。如表24中所展示，大致60%之經對照Ig治療之小鼠在肝中具有微小癌轉移。單獨用抗CTLA-4或抗4-1BB抗體處理略微減少癌轉移之速率，但該減少並未達至統計顯著性。值得注意地，用兩種抗體處理之組中僅1/22小鼠具有肝癌轉移。使用邏輯回歸模型，吾人發現經單獨給與抗4-1BB之小鼠之肝癌轉移之機率大致比經給與抗4-1BB及抗CTLA-4 (95% CI: 1.6, 13.7；p = 0.0050)兩者之小鼠之機率高4.7倍。類似地，僅經給與抗CTLA-4之小鼠之肝癌轉移之機率與經給與兩種處理(95% CI: 1.3, 10.2；p = 0.0174)之小鼠相比高3.6倍。因此，當與單獨用任一抗體處理相比時，組合療法藉由MC38顯著減少肝癌轉移。表 24 ：組合療法實質上減少肝癌轉移 ^*

*自4個獨立實驗概述資料。在H&E染色之後，檢查每個肝之至少兩個截面。 為判定免疫細胞之何亞群促成藉由組合mAb處理引發之抗腫瘤效應，利用淋巴細胞之主要亞群消減單株抗體。皮下注射MC38腫瘤細胞。一旦腫瘤為可觸的，則將腫瘤負載小鼠分成四個組。各組具有一系列腹膜內抗體注射以消減不同亞群之免疫細胞，包括利用正常大鼠IgG而消減、利用抗CD4 mAb (GK 1.5)之CD4 T細胞消減、利用抗CD8 mAb (2.4.3)之CD8 T細胞消減及利用抗-NK1.1 mAb(PK136)之NK細胞消減。另外，每週用抗CTLA-4加抗4-1BB mAb治療所有組中之所有小鼠一次，持續三週。藉由緊接著在完成實驗之前對獲取自小鼠之周邊血液之流式細胞測量術來評價免疫細胞亞群之適當消減(資料未展示)。如所預期，無免疫細胞消減之小鼠對用抗CTLA-4與抗4-1BB mAb組合之處理作出反應(圖62)。類似地，NK細胞及CD4 T細胞之消減並不影響抗CTLA-4加抗4-1BB mAb之組合療法之抗腫瘤活性。然而，CD8 T細胞之消減消除組合抗體療法之抗腫瘤活性。在第28天，針對CD8 T細胞消減之小鼠之評估的平均腫瘤大小(92.3 mm² , 95% CI: 64.5, 120.1 mm² )明顯高於無免疫細胞消減之小鼠的平均腫瘤大小(28.7 mm² , 95% CI: -17.1, 74.4 mm² )、CD4 T細胞消減之小鼠的平均腫瘤大小(16.7 mm² , 95% CI: 1.0, 32.4 mm² )及NK細胞消減之小鼠的平均腫瘤大小(9.3 mm² , 95% CI: -8.3, 26.9 mm² )。此等資料證實抗CTLA-4及抗4-1BB mAb處理之腫瘤根除效應為CD8 T細胞依賴性的。抗 4 - 1BB 抗體減少對異種抗 CTLA - 4 抗體之抗體反應。 重複抗體療法之障礙中之一者為增強對於治療性抗體之宿主抗體反應。⁸¹ 由於已知4-1BB減少對蛋白質之抗體反應，故吾人評價抗4-1BB抗體對於對抗CTLA-4抗體之宿主反應之影響。如圖63中所展示，若在用對照IgG或抗4-1BB治療之小鼠中偵測到任何抗抗體反應，則其為極小的。與抗CTLA-4 mAb促進CD4 T細胞反應⁸² 之能力一致，用抗CTLA-4加大鼠IgG治療之小鼠發展針對所投與4F10抗體及大鼠IgG之強宿主抗體反應(圖63A至圖63B)。當抗4-1BB與抗CTLA-4 mAb共投與時，此反應降低超過30倍。此等資料表明，抗4-1BB抗體可潛在地藉由減少對該等治療劑之宿主反應而增加其他共投予之治療性蛋白質之持續時間。在人類 CTLA - 4 基因嵌入小鼠中，抗小鼠 4 - 1BB 及抗人類 CTLA - 4 抗體之組合誘導腫瘤排斥反應及持久的癌症免疫。 由於抗4-1BB減少針對抗CTLA-4抗體之抗體之製造，令人感興趣的問題為藉由抗4-1BB增強腫瘤排斥反應是否僅歸因於其在遏制抗體反應中之效應。此人類CTLA4基因嵌入小鼠允許吾人測試是否可藉由抗4-1BB抗體增強抗人類CTLA4抗體之抗腫瘤效應。如圖64A中所展示，雖然抗人類CTLA-4 (L3D10)及抗4-1BB抗體(2A)兩者均單獨引起腫瘤生長延緩，但該兩種抗體之組合引起最明顯的腫瘤排斥反應。分別地，在用抗CTLA-4、抗4-1BB或該兩種抗體處理之組中，1/7、2/7、5/7小鼠未曾發展腫瘤，而未經治療之組中之所有小鼠均發育腫瘤。由於抗人類CTLA-4抗體為小鼠來源的，故4-1BB抗體之影響不能歸因於其將抗體抑制為治療性抗CTLA-4抗體。此外，吾人的資料亦證實，組合療法之優良效應將可能適用於基於抗人類CTLA-4抗體之免疫療法。 為測試經雙抗體處理之小鼠是否對進一步的腫瘤細胞攻擊免疫，吾人在其第一次腫瘤細胞攻擊之後第110天用腫瘤細胞攻擊該等小鼠。如圖64B中所展示，已在第一輪中排斥腫瘤細胞之所有五隻經雙抗體處理之小鼠仍係無腫瘤的，而對照原初小鼠具有進行性腫瘤生長。因此，組合療法亦誘導對癌細胞之持久免疫。 基於蛋白質之免疫療法之障礙中之一者為對於治療蛋白之宿主免疫。就抗體而言，宿主可將抗體安裝至異源、異型的及個體基因型抗原決定基。⁸¹ 可藉由完全人類化來消除異源反應，但其他抗抗體反應需要特殊考量。對於抗CTLA-4抗體，障礙係更明顯的，係因為抗CTLA-4抗體自身為佐劑。Mittler等人之先前工作證實對T細胞依賴性體液性免疫反應之顯著抑制。⁸³ 吾人的資料證實，抗4-1BB抗體之共投與減少對抗CTLA-4抗體之宿主反應，此表明使用抗CTLA-4及抗4-1BB抗體之組合療法之另一優勢。 總之，吾人的資料證實，與抗CTLA-4抗體及抗4-1BB抗體之組合療法提供三個主要優點，亦即，增加癌症免疫效應、相互抑制自體免疫副作用及改善抗抗體反應。 本說明書中所提及之所有公開案及專利均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各個別公開案或專利申請案經特定且單獨指示以全文引用的方式併入本文中般。雖然本發明已結合其具體實施例進行描述，但應瞭解，其能夠進行進一步修改且本申請案意圖意欲涵蓋大體而言遵循本發明之原理且包括在本發明所關於之領域內之已知或習用實施範圍內之與本發明之此類背離之本發明之任何變化、使用或修改且可應用於上文闡述之基本特徵。所引用之參考案。 1.      Townsend ARM, Tothbard J, Gotch FM, Bahadur G, Wraith D, McMichael AJ. 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圖1.在IgG1 Fc區中具有突變新穎組合之嵌合(左)及人類化(右) L3D10抗體之示意圖。Fc區中之突變之位置係藉由其胺基酸位置編號來識別，且該等胺基酸係藉由其單字母碼識別，其中數字前之字母表示置換胺基酸而數字後之字母表示引入的胺基酸。以空心橢圓形來描繪抗體之可變區，且以灰色矩形來描繪人類序列。V=可變區；C=恆定區；L=輕鏈；H=重鏈。 圖2.嵌合L3D10及10D1與盤固定CTLA4之CTLA4結合，如藉由ELISA所測定。用1 mg/ml之CTLA4-His蛋白質(Sino Biological, China)來塗佈ELISA盤。添加給定濃度之經生物素標記之結合蛋白質，並使用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來量測結合。10D1-1及10D1-2係同一抗體之兩種獨立材料批次。B7.1-Fc為陽性對照且Fc為陰性對照。 圖3. L3D10競爭檢定。10D1相比嵌合L3D10在阻斷嵌合L3D10與CTLA4結合中係低效的。如圖2中進行實驗，不同之處在於，將經生物素標記之嵌合L3D10與給定濃度之未經標記之CTLA4結合蛋白質或CTLA4-Fc混合，而後添加至ELISA盤。注意，未經標記之L3D10比10D1進行更好的阻斷，此表明此等抗體結合位點並不一致。 圖4.阻斷CTLA4與盤固定B7.1結合。將B7.1Fc蛋白質以0.5 mg/ml塗佈至ELISA盤上。在洗滌及阻斷之後，在給定濃度之競爭性蛋白質存在下以0.25 mg/ml添加經生物素標記之CTLA4-Fc蛋白質。所展示資料為在405 nM下之重複光學密度之平均值。儘管B7.1-Fc、嵌合L3D10及CTLA4-Fc均以劑量依賴性方式阻斷CTLA4:B7.1相互作用，但兩種單獨批次之10D1抗體未能在所有經測試劑量下進行阻斷。由於兩批次之10D1展示與經生物素標記之CTLA4強力結合，CTLA4之生物素化並不會毀壞CTLA4上之10D1抗原決定基(資料未展示)。 圖5.阻斷CTLA4與盤固定B7.2結合。將B7.2Fc蛋白質以0.5 mg/ml塗佈至ELISA盤上。在洗滌及阻斷之後，在給定濃度之競爭性蛋白質存在下以0.25 mg/ml添加經生物素標記之CTLA4-Fc蛋白質。儘管嵌合L3D10以劑量依賴性方式阻斷CTLA4:B7.2相互作用，但兩種單獨批次之10D1抗體甚至在最高濃度下未能完全阻斷CTLA4:B7.2相互作用。 圖6.10D1及L3D10兩者使用可溶B7-1及B7-2與固定CTLA4-Fc強效阻斷B7-CTLA4相互作用。向塗佈有人類B7-1Fc之盤添加變化劑量之抗人類CTLA4 mAb連同0.25 µg/ml之經生物素標記之人類CTLA4-Fc。使用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來量測與盤結合之CTLA4的量。所展示資料為重複之平均值且表示兩個獨立實驗。 圖7.阻斷CTLA4與細胞表面表現之B7.1之結合。在給定濃度之競爭性蛋白質存在下，以0.5 mg/ml向表現CHO細胞之B7.1添加經生物素標記之CTLA4-Fc蛋白質。藉由流式細胞測量術來偵測經生物素標記之融合蛋白質與經轉染有小鼠或人類B7-1及B7-2之CHO細胞之結合。使用接合藻紅蛋白之抗生蛋白鏈菌素來量測結合受體之量。所展示資料為三個重複樣本之螢光強度的平均值。嵌合L3D10以劑量依賴性方式阻斷CTLA4:B7.1相互作用，兩種單獨批次之10D1抗體未能在所有經測試劑量下進行阻斷。 圖8.阻斷CTLA4與細胞表面表現之鼠B7.1之結合。當mB7-1表現在CHO細胞上時，10D1對小鼠B7-1-人類CTLA4相互作用的阻斷微弱但可偵測。向表現小鼠B7-1之CHO細胞添加變化劑量之抗人類CTLA4 mAb連同0.25 µg/ml之人類CTLA4-Fc。所展示資料為平均值及SEM或三個重複資料，且表示兩個獨立實驗。 圖9.阻斷CTLA4與細胞表面表現之B7.2的結合。在給定濃度之競爭性蛋白質存在下，以0.5 mg/ml向表現CHO細胞之B7.2添加經生物素標記之CTLA4-Fc蛋白質。儘管嵌合L3D10以劑量依賴性方式阻斷CTLA4:B7.2相互作用，但兩種單獨批次之10D1抗體甚至在最高濃度下未能完全阻斷CTLA4:B7.2相互作用。此圖中所展示資料已重複至少5次。 圖10. 10D1比L3D10更佳地與經生物素標記之人類CTLA4-Fc結合將變化劑量之抗人類CTLA4 mAb或對照IgG塗佈至盤上。以0.25 µg/ml添加經生物素標記之CTLA4-Fc。使用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來量測與盤結合之CTLA4的量。所展示資料為重複之平均值且表示兩個獨立實驗。 圖11.L3D10而非10D1阻斷聚組胺酸標記之CTLA4與表現人類B7-1之CHO細胞之間的相互作用。將表現人類B7-1之CHO細胞與經聚組胺酸標記之CTLA4連同給定劑量之抗體一起培育，用PE-抗生蛋白鏈菌素來偵測CTLA4-Fc之量且藉由FACSCanto II來量測CTLA4-Fc之量。所展示資料為三個重複樣本之螢光強度之平均值，且表示兩個獨立實驗。 圖12.嵌合L3D10誘導所形成腫瘤在同基因型MC38模型中之完全緩解。頂部畫面描繪實驗設計且下部畫面展示MC38腫瘤在接受對照IgG (左下方畫面，n=6)或嵌合L3D10 (右下方畫面，n=5)之小鼠中之生長動力學。 圖13.嵌合L3D10及10D1在MC38腫瘤模型中之治療性效應。使用體重大致為20公克之人類CTLA4基因嵌入小鼠用於研究。將1×10⁶ MC38腫瘤細經胞皮下注射至Ctla4^{h / h} 小鼠中，且當腫瘤直徑達至0.5 cm之大小時，將負載腫瘤小鼠隨機分入三組中，各組具有5或6隻小鼠。接著在第7天、第10天、第13天及第16天用100 μg/注射之10D1、嵌合L3D10或對照hIgGFc來(腹膜內)治療小鼠，如藉由箭頭所指示。展示重複實驗之結果(左側畫面及右側畫面)，且所展示資料為腫瘤大小之平均值及標準差(S.D.) (左側畫面中n=每組6個，右側畫面中n=每組5個)。L3D10及10D1在此模型中具有類似治療性效應，且均能夠誘導所形成腫瘤之完全緩解。使用下式來計算腫瘤之直徑(d)：D=√(ab)，V=ab² /2，其中，a為較長直徑，而b為較短直徑。藉由雙向重複量測ANOVA (處理×次)來進行統計分析。對於左側畫面：P = 10D1對於hIgGFc: 5.71e-07；L3D10對於hIgGFc: P = 5.53e-07；10D1對於L3D10: P = 0.869。 圖14.在CTLA4^{h / m} 小鼠中抗CTLA-4 mAb對MC38之有效排斥。與圖13中相同，不同之處在於使用異種接合CTLA4^{h / m} 小鼠。所展示資料為腫瘤直徑之平均值及SEM (每組6隻小鼠)； 10D1對於hIgGFc: P = 0.0011；L3D10對於hIgGFc: P = 5.55e-05；10D1對於L3D10: P = 0.0346。 圖15.嵌合L3D10及10D1在B16-F1黑素瘤腫瘤模型中之治療性效應。使用體重大致為20公克之人類CTLA4基因嵌入小鼠用於研究。箭頭指示處理時間(50 mg/小鼠/治療)。所展示資料為腫瘤大小之平均值及S.D. (n=每組4個)。L3D10在此模型中具有類似治療性效應，且在此侵襲性及弱免疫原性腫瘤模型中均能夠延緩腫瘤生長。 圖16.在活體內量測CTLA4阻斷之檢定。B7.1或B7.2結合在樹突狀細胞上，與T細胞表面上之CTLA4結合且藉由其下調。然而，阻斷抗CTLA4抗體之結合防止B7.1/B7.2與CTLA4結合，且因此防止B7.1及B7.2之下調，從而引起B7.1/B7.2表現中之淨增加。然而，在嵌合T細胞表現人類及小鼠CTLA4兩者的情況下，結合人類CTLA4之抗體並不防止B7.1/B7.2與鼠CTLA4結合，該結合恢復B7.1/B7.2抑制。 圖17A至17F.10D1並不阻斷活體內之B7-CTLA4相互作用。使用圖11中所描述之檢定，來自用抗CTLA4抗體處理之小鼠之細胞用於檢定B7.1及B7.2表現。圖17A展示實驗設計之圖。簡言之，年齡及性別匹配之小鼠經腹膜內接受500 mg之抗體或其對照物。在注射24小時之後，處死小鼠且用抗CD11c、抗CD11b、抗B7-1及抗B7-2 mAb將其脾細胞染色。圖17B展示代表性資料，其展示針對B7表現分析之CD11c^hi DC之表現型。圖17C展示代表性直方圖，其描繪來自接受對照IgG1-Fc、L3D10或10D1之小鼠之DC上之B7-1的含量。頂部畫面中之資料展示同種接合基因嵌入小鼠中之抗體效應，而底部畫面中之資料展示異種接合小鼠中之抗體效應。圖17D之展示與圖17C相同，不同之處在於展示了B7-2之表現。圖17C及圖17D中展示之資料為來自每組3隻小鼠之彼等資料之表示，且已用每組三隻小鼠重複一次。圖17E展示在人類CTLA4同種接合小鼠中，L3D10而非10D1誘導B7-1 (左側畫面)及B7-2 (右側畫面)之表現。自涉及每組共6隻小鼠之兩個實驗概述所展示資料。在各實驗中，將對照小鼠中之平均值資料人工定義為100%且將實驗組中之彼等平均值資料相對於對照而正規化。圖17F與圖17E相同，不同之處在於使用了異種接合小鼠。L3D10與10D1均不阻斷共顯性地表現小鼠及人類Ctla4 基因兩者之小鼠中之B7-CTLA4相互作用。 圖18.L3D10與人類CTLA4結合但不與小鼠CTLA4結合。展示之資料為在閘控Cd3⁺ Cd4⁺ 細胞中使用來自Ctla4^{h / h} (頂部)或Ctla4^{m / m} (底部)小鼠之脾細胞對CTLA4之胞內染色的點狀圖。將抗小鼠CTLA4 mAb 4F10用作對照。 圖19.嵌合L3D10及10D1在CTLA4^{h / m} 小鼠中之治療性效應。頂部畫面描繪實驗設計。用結腸癌細胞株MC38攻擊Ctla4^{h / h} 小鼠，且當腫瘤直徑達至大致5 mm之大小時，用對照人類IgG-Fc、L3D10或10D1治療小鼠4次且經6週時段觀測腫瘤大小。下部畫面展示MC38腫瘤在接受對照IgG、嵌合L3D10或10D1 (n=每組6個)之小鼠中之生長動力學。儘管如圖16中所示在活體內CTLA4阻斷活性之差異顯而易見，但L3D10及10D1均顯示針對嵌合CTLA4^{m / h} 小鼠中之MC38模型之強力抗腫瘤活性。 圖20A至圖20B.10D1及L3D10對B16黑素瘤生長具有類似治療性效應。將1×10⁵ B16腫瘤細胞經(皮下)注射至Ctla4^{h / h} 小鼠(n=4至5)中，且在第11天、第14天、第17天(圖20A)或在第2天、第5天及第8天(圖20B)用100 μg (圖20A)或250 μg (圖20B) 10D1、L3D10或對照IgGFc (腹膜內)治療，如藉由箭頭所指示。對於圖20A，10D1對於hIgGFc: P = 0.0265； L3D10對於hIgGFc: 10D1對於L3D10: P =  0.0487；P= 0.302。對於圖20B，10D1對於hIgGFc:  P = 0.00616；L3D10對於hIgGFc: P = 0.0269；10D1對於L3D10: P=0.370。資料表示每組4至5隻小鼠之平均值±SEM。藉由雙向重複量測ANOVA來進行統計分析。 圖21A至圖21B.在小鼠中之Ctla4^{h / h} (圖21A)及Ctla4^{m / h} (圖21B)中的L3D10與10D1之間的免疫治療效應，其在完全排斥反應之前終止以便評價在腫瘤微環境內之Treg消減。所展示資料為涉及每組5隻小鼠之兩個獨立實驗之腫瘤直徑之平均值及SEM。 圖22A至圖22F.阻斷B7-CTLA4相互作用並不有助於抗CTLA4 mAb之癌症免疫治療活性。圖22A展示相當的免疫治療效應，儘管兩種抗CTLA4 mAb的阻斷活性大為不同。將5×10⁵ MC38腫瘤細胞經(皮下)注射至Ctla4^{h / h} 小鼠(n=6)中，且在第7天、第10天、第13天及第16天用100 μg 10D1、L3D10或對照hIgG-Fc(腹膜內)治療，如藉由箭頭所指示。資料表示每組六隻小鼠之平均值±SEM。藉由雙向重複量測ANOVA (處理×次)來進行統計分析。10D1對於hIgG-Fc: P = 5.71^e-07 ；L3D10對於hIgG-Fc: P = 5.53e^-07 ；10D1對於L3D10: P = 0.869。資料表示三個獨立實驗。圖22B.在小鼠中，兩種抗體均不阻斷B7-CTLA4相互作用，均誘導穩定腫瘤排斥反應。與圖22A中相同，不同之處在於使用了表現小鼠及人類CTLA4兩者之異種接合小鼠。10D1對於hIgG-Fc: P = 0.0011；L3D10對於hIgG-Fc: P = 5.55e^-05 ；10D1對於L3D10: P = 0.0346。資料表示三個獨立實驗。圖22C至圖22F，阻斷B7-CTLA4相互作用並不有助於腫瘤微環境中之Treg之選擇性消減。圖22C及圖22D.不管其阻斷B7-CTLA4相互作用之能力，L3D10及10D1並不缺失脾中之Treg。所展示資料為在Ctla4^{h / h} (圖22C)及Ctla4^{m / h} (圖22D)小鼠中之脾CD4 T細胞中之Foxp3+細胞%。n=6。e及f，L3D10及10D1均缺失在Ctla4^{h / h} (圖22E)及Ctla4^{m / h} (圖22F)小鼠中之腫瘤浸潤性CD4 T細胞中之Treg。在c至f中展示之資料為在腫瘤細胞攻擊之後第17天(實驗1)或第19天(實驗2)及如箭頭所指示在起始4種抗CTLA4 mAb處理之後第10天或第12天之Treg%。 圖23A至圖23F.常用抗小鼠CTLA4 mAb 9H10及9D9之阻斷活性之評價。圖23A及23B展示，若將B7-1 (圖23A)及B7-2 (圖23B)塗佈至盤上，9H10並不阻斷B7-CTLA4相互作用。在給定濃度之對照IgG或抗小鼠CTLA4 mAb 9D9及9H10存在下，用經B7塗佈之盤來培育經生物素標記之小鼠CTLA4-Fc融合蛋白質。用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來偵測CTLA4結合。所展示資料為重複之平均值且表示兩個獨立實驗。圖23C及圖23D展示，9D9及9H10展現與可溶CTLA4-Fc (圖23C)及盤結合CTLA4-Fc (圖23D)之差異性結合。所展示資料為重複之平均值且表示至少兩個獨立實驗。圖23E及圖23F展示在用500 µg抗體腹膜內處理後24小時抗小鼠CTLA4 mAb 9D9及9H10對來自WT (Ctla4^{m / m} )脾細胞之CD11c^hi DC上之B7-1 (圖23E)及B7-2 (圖23F)的含量的影響。自涉及每組各3隻小鼠的兩個獨立實驗中之每組6隻獨立小鼠概述出該資料。 圖24A至圖24D.抗小鼠CTLA4 mAb 4F10在活體內及在活體內之相異阻斷活性。圖24A及圖24B展示4F10對CTLA4-Fc與塗佈B7-1 (圖24A)或B7-2(圖24B)之盤之相互作用的影響。在給定濃度之對照IgG或抗小鼠CTLA4 mAb 4F10存在下，用經B7塗佈之盤來培育經生物素標記之小鼠CTLA4-Fc融合蛋白質。用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來偵測CTLA4結合。所展示資料為重複之平均值且表示兩個獨立實驗。圖24C及圖24D展示4F10對B7-1及B7-2表現之影響。關於B7-1 (圖24C)及B7-2 (圖24D)含量之概述資料來自每組6隻小鼠。將經對照IgG治療之組中之B7含量人工定義為100%。 圖25.嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合之不良效應。頂部畫面描繪實驗設計。使用體重大於4公克之10天大的僅雌性人類CTLA4基因嵌入小鼠用於研究。該等小鼠接受所指示蛋白質或其組合。箭頭指示處理時間(100 mg/小鼠/處理)。所展示資料為體重增加%之平均值及S.D.。嵌合L3D10及10D1在成年小鼠中具有相當的癌症治療性效應(圖13)，但當10D1與抗PD-1 mAb組合時發現相異的不良效應。 圖26.嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合之不良效應。圖展示來自圖25概述之實驗的接受對照IgG、10D1+抗PD-1或嵌合L3D10+抗PD-1 (n=每組5個)之小鼠在第42天之最後體重。抗PD1+10D1組合觀測到體重顯著減少，此在抗PD-1+嵌合L3D10組合並未發現。 圖27.嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合之病理學效應。為進一步檢查當L3D10與抗PD-1組合投與時與10D1相比之相對毒性，吾人查看上文圖26中描述之小鼠之大體解剖。用10D1+PD-1治療之小鼠中之子宮/卵巢/膀胱及胸腺明顯更小，而用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中之器官與hIgG對照相當。相比之下，自用10D1治療之小鼠剝離之心臟的大小顯得更大，具有明顯較白外觀。 圖28A至圖28D.用10D1與抗PD-1組合治療引起異常紅血球生成。鑒於圖27中觀測到之心臟的差異，吾人查看在小鼠內之紅血球生成，且觀測到用10D1+抗PD-1治療之小鼠相對於極其類似之用L3D10+抗PD-1或對照抗體(hIgG)治療之組中的清晰差異。來自用10D1+抗PD-1治療之小鼠之骨髓具有明顯較白色彩(圖28A)，且經分離血液幾乎完全為白色(圖28B)。據此，當吾人使用CD119及CD71標記之分佈來分析紅細胞之分異時，吾人觀測到在經10D1+抗PD-1治療之小鼠中正經歷IV階段發展之細胞的數目在統計學上的顯著減少。代表性FACS分佈展示於圖28C中，而概述資料呈現於圖28D中。 圖29.抗紅血球抗體之流式細胞測量術分析。用來自在圍產期期間接受抗體處理之小鼠的血漿樣品將來自NOD.SCID.Il2rg-/- (NSG)小鼠之血液樣本染色。將來自NSG小鼠之血清及無血清之彼等NSG小鼠用作陰性對照。所有血清均以1:50稀釋來使用。此等資料展示，無小鼠產生抗紅血球抗體。 圖30.用嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合治療之小鼠中之心臟之病變。為進一步確定L3D10對於10D1與抗PD-1組合之毒理學，吾人在圖26中描述之小鼠中進行心臟之組織學分析。用10D1+抗PD-1治療之小鼠顯示在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中或用人類IgG對照治療之小鼠未觀測到之高水平的T細胞浸潤。 圖31.用嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合治療之小鼠中之肺之病變。為進一步確定L3D10對於10D1與抗PD-1組合之毒理學，吾人在圖26中描述之小鼠中進行肺之組織學分析。用10D1+抗PD-1治療之小鼠顯示在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中或用人類IgG對照治療之小鼠未觀測到之高水平的T細胞浸潤。 圖32.用嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合治療之小鼠中之唾液腺之病變。為進一步判定L3D10對於10D1與抗PD-1組合之毒理學，吾人在圖26中描述之小鼠中進行唾液之組織學分析。用10D1+抗PD-1治療之小鼠顯示相比在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中或用人類IgG對照治療之小鼠中觀測到的水平高許多的T細胞浸潤。 圖33A至圖33F.用嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合治療之小鼠中之腎及肝之病變。為進一步確定L3D10對於10D1與抗PD-1組合之毒理學，吾人在圖26中描述之小鼠中進行腎及肝之組織學分析。圖33A至圖33C為來自腎之截面，且圖33D至圖33E為自肝截取之截面。用10D1+抗PD-1治療之小鼠顯示相比在用L3D10+抗PD-1治療之小鼠中或用人類IgG對照治療之小鼠中觀測到的水平較高的T細胞浸潤。 圖34.用嵌合L3D10及10D1與抗PD-1組合治療之小鼠中之毒性記分。若圖30至圖33經概述且展示用10D1+抗PD-1相對於用L3D10+抗PD-1 (其具有僅比hIgG對照小鼠組略高之記分)治療之小鼠之高毒性記分，則展示此組織資料。 圖35. 10D1+抗PD-1在Ctla4^h/m 小鼠中並不具有顯著的毒性，如藉由在圍產期期間接受抗體處理之小鼠之正常體重增加來證明。小鼠在第10天、第13天、第16天、第19天及第22天接受用給定抗體或組合的腹膜內處理(100 µg/小鼠/注射/抗體)。至少每3天稱重小鼠一次。 圖36.L3D10及10D1顯示對於盤固定CTLA4的類似結合模式。用1 mg/ml之CTLA4-His蛋白質(Sino Biological, China)來塗佈ELISA盤。添加給定濃度之經生物素標記之結合蛋白質，並使用接合HRP之抗生蛋白鏈菌素來量測結合。10D1-1及10D1-2係同一抗體之兩種獨立材料批次。hIgG-Fc為人類Ig陰性對照。 圖37.L3D10顯示與可溶CTLA4之結合減少。將給定濃度之抗人類CTLA4 mAb塗佈在盤上隔夜，在用牛血清白蛋白洗滌並阻斷之後，以0.25 mg/ml添加經生物素標記之CTLA4-Fc。在培育及洗滌之後，使用經HRP標記之抗生蛋白鏈菌素來量測所俘獲CTLA4-Fc之量。 圖38.人類化抗體可變區與親本L3D10抗體序列之對準。將人類化抗體序列之重鏈可變區(上部) (SEQ ID NO: 62-64)及輕鏈可變區(下部) (SEQ ID NO: 70-72)與親本L3D10抗體(重鏈：SEQ ID NO: 57；輕鏈：SEQ ID NO: 65)及各別人類抗體構架(重鏈：SEQ ID NO: 58-61；輕鏈：SEQ ID NO: 66-69)進行對準。以黃色高亮顯示至小鼠親本序列之回復突變。以綠色高亮顯示新穎胺基酸(亦即，在親本抗體序列或各別人類抗體構架中不存在之胺基酸殘基)。以紫色展示引入至CDR2序列中之突變。基於www.bioinf.org.uk/abs/，以紅色展示CDR序列。 圖39A至圖39B.人類化L3D10抗體與10D1相比之抗腫瘤活性。在人類CTLA4金銀基因嵌入小鼠中使用MC38小鼠腫瘤模型，吾人查看人類化L3D10抗體與嵌合L3D10抗體及10D1相比之抗腫瘤活性。頂部畫面展示活體內實驗之治療進度表；在接種後第7天開始，每3天對小鼠給與總共4劑量之抗體。所有人類化抗體(n=每組6個)完全根除腫瘤且與10D1相當(底部畫面)。 圖40.人類化L3D10抗體在CTLA4^{h / m} 小鼠中之抗腫瘤活性。頂部畫面展示活體內實驗之治療進度表；在MC38腫瘤注射後之指示日期，Ctla4^{h / m} 小鼠以每次注射30 mg (-30，實線)或10 mg (-10，虛線)之劑量接受對照hIg或三種不同抗人類CTLA4 mAb中之一者。每三天量測腫瘤大小一次。 圖41.抗CTLA-4 mAb在微小疾病B16-F1腫瘤模型中之治療性效應。在人類CTLA4基因嵌入小鼠中使用B16-F1小鼠腫瘤模型，吾人查看人類化L3D10抗體之抗腫瘤活性。將1×10⁵ B16腫瘤細胞(皮下)注射至Ctla4^{h / h} 小鼠中(n=5至6)。在第2天、第5天及第8天，用對照Ig、10D1、嵌合L3D10或PP4637及PP4638 (250 µg/小鼠，腹膜內)治療小鼠。每隔一天量測腫瘤發病率及大小。10D1對於hIgGFc: P = 0.00616；L3D10對於hIgGFc: P = 0.0269；10D1對於L3D10: P=0.370；PP4637對於hIgGFc: P=0.0005；PP4637對於10D1: P=0.805；PP4638對於hIgGFc: P=0.0016；PP4638對於10D1: P=0.856。資料表示每組5至6隻小鼠之平均值±SEM。對於腫瘤從不發育之小鼠，腫瘤大小被視為0。 圖42.在10D1、PP4631及PP4637雌性中就其與抗PD-1 mAb組合之毒性的比較。在其出生之後第10天或第11天經4次注射抗體(100 µg/小鼠/注射，每三天一次)或對照Fc來治療雌性CTLA4^{h / h} 小鼠，如圖例中所說明。每3天稱重小鼠一次。所展示資料為30天期間體重增加%之平均值及SEM。在第43天處死所有小鼠以用於組織學分析。每組所使用小鼠之數目在標記之圓括號中展示。 圖43.與10D1及抗PD-1之組合療法引起貧血，而與PP4631+抗PD-1抑或PP4637+抗PD-1之彼等組合療法則不會引起貧血。所展示資料為43天大的小鼠的血容比，該等小鼠已在第11天、第14天、第17天及第20天接受四次劑量為100 µg/小鼠/抗體的抗體處理。 圖44A至圖44B.與10D1+抗PD-1之組合療法引起全身性T細胞活化，而與PP4631+抗PD-1或PP4637+抗PD-1之彼等組合療法則不會引起全身性T細胞活化。所展示資料為在周邊血液(圖44A)或在脾(圖44B)中具有原初(CD44^lo CD62L^hi ) T細胞、中央記憶(CD44^hi CD62L^hi ) T細胞及效應記憶(CD44^hi CD62L^lo ) T細胞表現型之CD4 (上畫面) T細胞%及CD8 (下畫面) T細胞%。該等細胞係收集自43天大的小鼠，該等小鼠已在第11天、第14天、第17天及第20天接受四次劑量為100 µg/小鼠/抗體的抗體處理。 圖45. L3D10之人類化並不影響與固定CTLA4結合。如圖36中所描述來測定人類化L3D10抗體結合固定CTLA4之能力。X軸指示添加至溶液中之抗CTLA-4 mAb之濃度。人類化並不影響與固定CTLA4結合，且所有3種人類化抗體均證實與親本嵌合L3D10抗體及10D1的類似結合。當使用CTLA4-Ig替代CTLA-4-his時，觀測到類似模式。 圖46.人類化進一步減少L3D10與可溶CTLA4結合。如圖37中所描述來測定人類化L3D10抗體結合可溶CTLA4之能力。X軸指示塗佈至ELISA盤上之抗CTLA-4 mAb之濃度。相對於親本L3D10嵌合抗體，人類化進一步減少與可溶CTLA4結合。當使用CTLA4-Ig替代CTLA-4-his時，觀測到類似模式。 圖47A至圖47B.PP4631、PP4638及PP4637並不阻斷活體外之B7-CTLA-4相互作用。圖47A展示藉由抗人類CTLA-4 mAb 10D1、PP4631、PP4637及L3D10對B7-1-CTLA-4相互作用之阻斷。B7-1Fc固定在0.5 µg/ml之濃度。以0.25 µg/ml添加經生物素標記之CTLA4-Fc連同給定劑量之抗體。所展示資料為在405 nM下之重複光學密度之平均值。圖47B展示藉由抗人類CTLA-4 mAb 10D1及L3D10對B7-2-CTLA-4相互作用之阻斷。與圖47A中相同，不同之處在於固定了B7-2-Fc。 圖48.PP4631及PP4637並不阻斷活體內之B7-CTLA-4相互作用，如藉由其缺乏對於樹突狀細胞上之B7-1及B7-2表現的作用所證實。關於B7-1 (a)及B7-2 (b)含量之概述資料來自每組3隻小鼠。將經對照IgG治療之組中之B7含量人工定義為100%。 圖49.PP4637，與抗PD-1 mAb組合而展現最佳安全分佈(見圖42)，基於最低治療性劑量下之腫瘤排斥反應，其最強效地引起腫瘤排斥反應。在指示日期，Ctla4^{h / m} 小鼠接受每次注射30 mg (-30，實線)或10 mg (-10，虛線)之劑量下之對照IgFc或三種不同抗人類CTLA4 mAb中之一者。每三天量測腫瘤大小一次。在10 mg/注射下，PP4637 (HL32)最高效地誘導腫瘤排斥反應。 圖50.人類化抗體純度評定。藉由蛋白質A層析來純化暫時表現之人類化L3D10抗體，且藉由還原及非還原SDS-PAGE來評定來自所有3個抗體之樣本。純化蛋白質產生凝膠紋，其指示在還原及非還原條件下之抗體分子之大小。「流出」色帶展示蛋白質A管柱流通物，其指示大部分抗體蛋白質黏附於蛋白質A管柱。 圖51.暫時表現之蛋白質之尺寸排外層析法(SE-HPLC)。在單一步驟蛋白質A層析之後藉由SE-HPLC來分析人類化抗體中之各者之蛋白質樣本。頂部畫面：抗體PP4631。中部畫面：抗體PP4637。底部畫面：抗體PP4638。 圖52.暫時表現之蛋白質之CE-SDS分析。在單一步驟蛋白質A層析之後藉由CE-SDS來分析人類化抗體中之各者之蛋白質樣本。左側畫面展示在非還原性條件下之結果，而右側畫面展示在還原性條件下之結果。頂部畫面：抗體PP4631。中部畫面：抗體PP4637。底部畫面：抗體PP4638。 圖53A至圖53C.電荷同功異型物分佈及人類化L3D10抗體之脫醯胺，如藉由毛細管等電聚焦(cIEF)所測定。在藉由cIEF分析來分析經兩個不同時段(5小時及12.5小時)之高pH脅迫處理之前或之後，藉由比較人類化L3D10抗體來測定在高pH脅迫下之蛋白質脫醯胺之水平。圖53A至圖53C分別展示抗體PP4631、PP4637及PP4638之分佈。 圖54A至圖54C.人類化L3D10抗體之差示掃描熱量測定(DSC)熱分析。為測定不同抗體之熱穩定性及熔化溫度，對其進行差示掃描熱量測定(DSC)熱分析。圖54A至圖54C分別展示抗體PP4631、PP4637及PP4638之正規化DSC曲線。 圖55.人類、獼猴及小鼠CTLA-4細胞外域之對準。將人類(Hm，以紅色展示) (SEQ ID NO: 73)、獼猴(Mk，以黑色展示)及小鼠(Ms，以綠色展示) CTLA-4蛋白質細胞外域之胺基酸序列對準，且用短劃線(-)展示保守胺基酸(相對於人類序列)。為幫助對準，小鼠序列在以黃色高亮顯示之位置處具有缺失及插入(相對於人類序列及猴序列)。以粗體展示已知B7-1Ig結合位點並加下劃線。序列證實，人類序列及猴序列為高度保守的，而小鼠序列具有許多胺基酸差異。基於此序列對準，設計11個突變(M1-M11) (SEQ ID NO: 40-50)人類CTLA-4Fc蛋白質，其併入有鼠特異性胺基酸——以藍色展示併入至各突變蛋白質中之胺基酸。 圖56A至圖56B.WT及突變CTLA-4Fc蛋白質之胺基酸序列組合物。如圖所示來設計編碼WT CTLA-4Fc蛋白質(SEQ ID NO: 39)及併入有鼠Ctla-4胺基酸之11個突變蛋白質(SEQ ID NO: 40-50)的DNA構築體。胺基酸序列係用於包括IgG1 Fc部分但不包括信號肽之成熟蛋白質。以藍色大寫字母展示已知B7-1Ig結合位點並加雙下劃線。以紅色小寫字母展示突變中之經置換鼠胺基酸殘基。為蛋白質之IgG1 Fc部分加下劃線。 圖57.M11 (AA103-106，YLGI＞fcGm)中之突變選擇性地取消抗體與人類CTLA-4結合。所展示資料為重複之平均值，其描繪B7-1Fc (a)、L3D10 (b)、PP4631 (c)及PP4637(d)與盤塗佈之hCTLA4-Fc (空心圓)、mCTLA4-Fc (實心三角形)、M11 (實心圓)及IgG1-Fc (空心三角形)結合之結合。 圖58.將L3D10、PP4631及PP4637映射至鄰近於B7-1-CTLA4錯合物之3-D結構中之B7-1結合位點之抗原決定基。以紅色為B7-1結合主結構著色，而以紫色為抗體抗原決定基著色。B7-1經描繪於在具有空間填充帶之CTLA4上方，而CTLA-4之空間填充帶經描繪為末填充帶。 圖59.WT (SEQ ID NO: 39)及突變CTLA-4Fc蛋白質(M12至M17 (SEQ ID NO: 51-56))之胺基酸序列組合物如圖所示來設計編碼併入有鼠Ctla-4胺基酸的6個突變CTLA-4Fc蛋白質(M12至M17)之DNA構築體。胺基酸序列係用於包括IgG1 Fc部分但不包括信號肽之成熟蛋白質。以藍色大寫字母展示已知B7-1Ig結合位點並加雙下劃線。以紅色小寫字母展示突變中之經置換鼠胺基酸殘基。為蛋白質之IgG1 Fc部分加下劃線。 圖60A至圖60C.突變分析揭露10D1 (圖60A)、PP4631 (圖60B)及PP4637 (圖60C)與CTLA-4之相異的結合要求。在4℃下以1 µm/ml塗佈CTLA-4Fc突變體隔夜。在利用BSA進行阻斷之後，添加給定濃度之經生物素標記之抗CTLA-4 mAb並培育2小時。在洗掉非結合抗體後，用經HRP標記之抗生蛋白鏈菌素來偵測結合抗體。 圖61A至圖61B.抗4-1BB抗體及抗CTLA-4抗體在微小疾病(圖61A)及所形成腫瘤(圖61B)模型兩者中之治療性效應。圖61A展示微小疾病之療法。C57BL/6小鼠經皮下接種5×10⁵ 個MC38細胞。在腫瘤細胞注射之後第2天、第9天及第16天，注射對照倉鼠及大鼠IgG抗體、抗CTLA-4抗體及/或抗4-1BB抗體。藉由物理檢查來量測腫瘤大小。所展示資料為腫瘤之生長動力學，其中各線表示一隻小鼠中之腫瘤生長。所呈現大小為腫瘤之較長直徑與較短直徑之乘積。圖61B展示所形成腫瘤之療法。與圖61A中相同，不同之處在於在腫瘤攻擊之後第14天開始療法；所有小鼠在開始用mAb治療之前已形成介於9 mm² 至60 mm² 範圍內之腫瘤。兩種抗體在所形成腫瘤上之組合效應已重複3次。 圖62.CD8T細胞而非CD4或NK細胞，係為抗體誘導腫瘤排斥反應所必需的。藉由在腫瘤細胞接種之後第9天、第12天及第16天(*)三次注射對CD4、CD8或NK1.1之任一者特異的抗體來使負載腫瘤小鼠消減CD4、CD8或NK細胞。在第9天、16天及23天(豎直箭頭)注射治療性抗體(抗CTLA-4加抗4-1BB)。所展示資料為腫瘤大小之平均值及SEM (n=3)。與其他組(†)中之各者相比，就CD8消減的組而言，p＜0.05。 圖63A至圖63B.組合療法減少對抗CTLA-4抗體之宿主回應。將倉鼠抗小鼠-CTLA-4 (圖63A)抗體或大鼠抗小鼠-4-1BB (圖63B)抗體塗佈在ELISA盤中。將來自各5隻小鼠之組之不同稀釋血清添加至盤。使用二級步驟試劑(藉由吸收而消減對大鼠及倉鼠IgG之反應性之經生物素標記之山羊抗小鼠抗體)來測定抗體結合之相對量。所展示資料為在490 nm下之光學密度之平均值及SEM。當用相同抗體處理無腫瘤小鼠時觀測到對抗CTLA-4及4-1BB之宿主抗體回應之類似減少(資料未展示)。 圖64A至圖64B.與抗4-1BB及L3D10 (抗人類-CTLA4)抗體在人類CTLA-4基因嵌入小鼠中之組合療法。圖64A展示治療性效應。人類CTLA4基因嵌入小鼠經皮下接種5×10⁵ 個MC38腫瘤細胞。兩天後，用大鼠及小鼠IgG、抗4-1BB及小鼠IgG、L3D10及大鼠IgG或L3D10及抗4-1BB治療7隻小鼠之組，如藉由箭頭所指示。所展示資料為平均腫瘤體積及SEM (n=7)。所有處理均顯著地減少腫瘤生長(P＜0.001)，且相比於對照(P＜0.0001)或L3D10抗體(P=0.0007)或抗4-1BB抗體處理(P=0.03)中任一者，雙重抗體處理組展示顯著減小腫瘤大小。當經對照IgG治療之組達至早期去除準則時，處死所有負載腫瘤小鼠。圖64B展示接受組合療法之小鼠中之持久免疫。雙經重抗體處理之組中之無腫瘤小鼠形成對MC38腫瘤之持久免疫。在第一次腫瘤細胞攻擊之後第110天，經雙重抗體處理之無腫瘤小鼠或對照原出小鼠受到5×10⁵ 個腫瘤細胞皮下攻擊。藉由物理檢查來監測腫瘤生長。應注意，在第一輪中排斥腫瘤之所有小鼠完全抵抗再次攻擊，而所有原處小鼠具有進行性腫瘤生長。定義 如本文所使用，術語「抗體」意欲指代具有「可變區」抗原識別位點之免疫球蛋白分子。術語「可變區」意欲將免疫球蛋白之此類域與由抗體廣泛共用之域(諸如，抗體Fc域)區分開。可變區包含其殘基負責抗原結合之「高變區」。高變區包含來自「互補決定區或CDR」之胺基酸殘基(亦即，通常大致處於輕鏈可變域中之殘基24至34 (L1)、50至56 (L2)及89至97 (L3)及大致處於重鏈可變域中之殘基27至35 (H1)、50至65 (H2)及95至102 (H3)；參考44)及/或來自「高變環」之彼等殘基(亦即，輕鏈可變域中之殘基26至32 (L1)、50至52 (L2)及91至96 (L3)及重鏈可變域中之殘基26至32 (H1)、53至55 (H2)及96至101 (H3)；參考45)。「構架區」或「FR」殘基為除如本文所定義之高變區殘基以外之彼等可變域殘基。術語抗體包括單株抗體、多特異性抗體、人類抗體、人類化抗體、合成抗體、嵌合抗體、駱駝化抗體、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、胞內抗體及抗個體基因型(抗Id)抗體(包括例如抗Id抗體及抗抗Id抗體至對本發明抗體)。特定言之，此類抗體包括任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如，IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 及IgA₂ )或子類別之免疫球蛋白分子。 如本文所使用，術語抗體之「抗原結合片段」係指含有抗體的互補決定區(「CDR」)之抗體之一或多個部分及視情況存在之構架殘基，其包含抗體之「可變區」抗原識別位點且展現免疫特異性地結合抗原之能力。此類片段包括Fab'、F(ab')₂ 、Fv、單鏈Fv (ScFv)及其突變體、天然存在之變體及包含抗體之「可變區」抗原識別位點之融合蛋白質及異源蛋白質(例如，毒素、不同抗原之抗原識別位點、酶、受體或受體配位體等等)。如本文所使用，術語「片段」係指包含以下胺基酸序列之肽或多肽：至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少60個連續胺基殘基、至少70個連續胺基酸殘基、至少80個連續胺基酸殘基、至少90個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基或至少250個連續胺基酸殘基。 人類、嵌合或人類化抗體對於在人類中活體內使用係尤其較佳的，然而，對於許多用途(例如，活體外或原位偵測檢定、急性活體內使用等等)，可有利地採用鼠抗體或其他物種之抗體。 「嵌合抗體」為其中抗體之不同部分係衍生自不同免疫球蛋白分子(諸如，具有衍生自非人類抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之抗體)之分子。可使用此項技術中已知之各種技術來製造包含來自非人類物種之一或多個CDR及來自人類免疫球蛋白分子之構架區之嵌合抗體，該等技術包括(例如) CDR移植(EP 239,400；國際公開案第WO 91/09967號；及美國專利第5,225,539號、第5,530,101號及第5,585,089號)、面飾或表面再塑(EP 592,106；EP 519,596；46-48)及鏈改組(美國專利第5,565,332號)。 本發明尤其係關於「人類化抗體」。如本文所使用，術語「人類化抗體」係指包含人類構架區及來自非人類(通常為小鼠或大鼠)免疫球蛋白之一或多個CDR之免疫球蛋白。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供體」且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「接受體」。恆定區未必存在，但若其存在，則其必須與人類免疫球蛋白恆定區實質上一致，亦即，至少約85至90%，較佳地約95%或更多一致。因此，人類化免疫球蛋白之所有部分(除可能的CDR外)與天然人類免疫球蛋白序列之對應部分實質上一致。人類化抗體為包含人類化輕鏈及人類化重鏈免疫球蛋白之抗體。舉例而言，人類化抗體將不涵蓋典型嵌合抗體，係因為(例如)嵌合抗體之整個可變區為非人類的。一種說法為，供體抗體已藉由「人類化」之方法來「人類化」，係因為預期所得人類化抗體與同提供CDR之供體抗體相同之抗原結合。在最大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受體抗體)，其中接受體之高變區殘基經來自諸如具有所需特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠、家兔或非人類靈長類的非人類物種(供體抗體)之高變區殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經對應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在接受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。大體而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有者，其中所有或實質上所有高變區均對應於非人類免疫球蛋白之彼等高變區，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之彼等FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，通常為人類免疫球蛋白的一部分，該人類免疫球蛋白免疫特異性地與已藉由引入胺基酸殘基取代、缺失或添加(亦即，突變)而更改之Fc.γ.RIIB多肽結合之人類免疫球蛋白。

<110> 美商昂科免疫公司(ONCOIMMUNE,INC.)

<120> 嵌合及人類化抗人類CTLA4單株抗體及其用途

<130> 060275.0600.03PC00

<140> TW 105141656

<141> 2016-12-15

<150> 62/267,735

<151> 2015-12-15

<150> 62/359,036

<151> 2016-07-06

<150> 62/309,169

<151> 2016-03-16

<160> 73

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 329

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經工程改造之片段

<400> 4

<210> 5

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最佳化之片段

<400> 5

<210> 6

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最佳化之片段

<400> 6

<210> 7

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 最佳化之片段

<400> 7

<210> 8

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合

<400> 8

<210> 9

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體片段

<400> 9

<210> 10

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體片段

<400> 10

<210> 11

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體片段

<400> 11

<210> 12

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 12

<210> 13

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 13

<210> 14

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 14

<210> 15

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 15

<210> 16

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 16

<210> 17

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 17

<210> 18

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 18

<210> 19

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 19

<210> 20

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> RRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 23

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 24

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 26

<210> 27

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 27

<210> 28

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 28

<210> 29

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 29

<210> 30

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 30

<210> 31

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 31

<210> 32

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化抗體

<400> 32

<210> 33

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 33

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 34

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 35

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽片段

<400> 36

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 37

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽

<400> 38

<210> 39

<211> 358

<212> PRT

<212> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 39

<210> 40

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 40

<210> 41

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 41

<210> 42

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 42

<210> 43

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 43

<210> 44

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 44

<210> 45

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 45

<210> 46

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 46

<210> 47

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 47

<210> 48

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 48

<210> 49

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 49

<210> 50

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 50

<210> 51

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 51

<210> 52

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 52

<210> 53

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 53

<210> 54

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 54

<210> 55

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> 融合蛋白質

<400> 55

<210> 56

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白質

<400> 56

<210> 57

<211> 125

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 57

<210> 58

<211> 25

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 58

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 59

<210> 60

<211> 31

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 60

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 61

<210> 62

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 62

<210> 63

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 63

<210> 64

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 64

<210> 65

<211> 107

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 65

<210> 66

<211> 23

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 66

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 67

<210> 68

<211> 32

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 68

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 69

<210> 70

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 70

<210> 71

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 71

<210> 72

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類化

<400> 72

<210> 73

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人

<400> 73

Claims (19)

1. 一種抗CTLA4抗體，其包含：(a)輕鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO：21所載胺基酸序列之互補決定區(CDR)1，(ii)包含SEQ ID NO：36、37或38所載胺基酸序列之CDR2，及(3)包含SEQ ID NO：23所載胺基酸序列之CDR3；及(b)重鏈可變區，其包含(i)包含SEQ ID NO：24所載胺基酸序列之CDR1，(ii)包含SEQ ID NO：33、34或35所載胺基酸序列之CDR2，及(3)包含SEQ ID NO：26所載胺基酸序列之CDR3。
2. 如請求項1之抗CTLA4抗體，其中該中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62、63或64所載之胺基酸序列；及該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：70、71或72所載之胺基酸序列。
3. 如請求項1之抗CTLA4抗體，其中(a)該輕鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：37所載之胺基酸序列且該重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：33所載之胺基酸序列；(b)該輕鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：37所載之胺基酸序列且該重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：35所載之胺基酸序列；或(c)該輕鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：38所載之胺基酸序列且該重鏈可變區CDR2包含SEQ ID NO：35所載之胺基酸序列。
4. 如請求項3之抗CTLA4抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：62所載之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71所載之胺基酸序列。
5. 如請求項3之抗CTLA4抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64所載之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：71所載之胺基酸序列。
6. 如請求項3之抗CTLA4抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：64所載之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：72所載之胺基酸序列。
7. 如請求項1至6中任一項之抗CTLA4抗體，其中該抗體能夠結合人類CTLA4。
8. 如請求項1至6中任一項之抗CTLA4抗體，其中該抗體特徵在於相對於膜結合或固定CTLA4，與可溶CTLA4之結合減少。
9. 一種如請求項1至8中任一項之抗CTLA4抗體之抗原結合片段。
10. 如請求項9之抗原結合片段，其中該片段係選自由下列所組成之群：Fab'、F(ab')₂、Fv及單鏈Fv(ScFv)。
11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗CTLA4抗體或如請求項9或10之抗原結合片段，及生理學上可接受之載劑或賦形劑。
12. 一種如請求項1至8中任一項之抗CTLA4抗體、如請求項9或10之抗 原結合片段或如請求項11之醫藥組合物在製造治療個體癌症之藥物之用途。
13. 如請求項12之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群：癌瘤；膀胱癌瘤；乳房癌瘤；結腸癌瘤；腎癌瘤；肝癌瘤；肺癌瘤；卵巢癌瘤；胰腺癌瘤；胃癌瘤；子宮頸癌瘤；甲狀腺癌瘤；皮膚癌瘤；鱗狀細胞癌瘤；淋巴譜系之造血腫瘤；白血病；急性淋巴球性白血病；急性淋巴母細胞白血病；B細胞淋巴瘤；T細胞淋巴瘤；伯克特淋巴瘤；骨髓譜系之造血腫瘤；急性或慢性骨髓性白血病；前髓細胞性白血病；間葉細胞源腫瘤；纖維肉瘤；橫紋肌肉瘤；黑素瘤、精原細胞瘤；畸胎上皮癌；神經母細胞瘤；神經膠瘤；中樞及周邊神經系統之腫瘤；星形細胞瘤；神經母細胞瘤；神經膠瘤；神經鞘瘤；間葉細胞源腫瘤；骨肉瘤；著色性乾皮病及甲狀腺濾泡癌症。
14. 如請求項13之用途，其中該癌症係結腸癌瘤。
15. 如請求項12之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群：黑素瘤、肺癌、乳癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴球性白血病、慢性淋巴球性白血病及腎細胞癌。
16. 如請求項15之用途，其中該癌症係黑素瘤。
17. 如請求項12至16中任一項之用途，其中該醫藥組合物進一步包含選 自由抗PD-1或抗4-1BB組成之群的額外藥劑，或其中該藥物進一步包含選自由抗PD-1或抗4-1BB組成之群的額外藥劑或用於與該額外藥劑一起投與。
18. 如請求項17之用途，其中該抗PD-1抗體或該抗4-1BB抗體，及抗CTLA4抗體係組合於單一分子中作為雙特異性抗體。
19. 如請求項12之用途，其中該藥物係誘導腫瘤微環境中之Treg之強缺失及局部T細胞活化，但誘導最低程度的全身性T細胞活化。

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