CN116183472B - Cba法检测非人类灵长类动物细胞因子的验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CBA法检测非人类灵长类动物细胞因子的验证方法，具体公开了一种确认细胞因子检测试验质量的方法，其包括以下步骤：（1）利用TDAR法，检测获得TDAR阳性的样本；（2）利用CBA法，检测（1）获得的样本中的细胞因子。上述TDAR阳性的样本来源为经过免疫刺激的动物，是直接用含有促凝剂的真空采血管采集动物全血后离心获得的血清。本发明的检测样本不用进行细胞培养，步骤简单。对于检测样本的获取更加快捷，方便。本发明的验证方法检测的不同细胞因子含量都高于定量下限，且精密度的CV均小于5%，通过了方法学验证。
Description
技术领域
本发明属于细胞因子检测领域，具体涉及一种CBA法检测非人类灵长类动物细胞因子的验证方法。
背景技术
CBA（流式液相多重蛋白定量）通过验证是进行CBA相关实验的前提，细胞因子在正常非人类灵长类动物中含量较低，获取含有足够浓度的细胞因子样本是实验的第一步，目前刺激细胞方法主要有：
方法1：CD3+单抗与CD28单抗共同作用，提供有效的共刺激信号，激发T细胞活化，并分泌细胞因子；
方法2：PMA+ionomycin离子霉素刺激，PMA可以激活PKC。DAG与钙离子又可共同激活PKC，该过程可导致细胞内的蛋白倍磷酸化所激活，形成级联反应，导致T细胞活化；
方法3：细胞因子阻断法等；
方法1、2可直接激活T细胞，使T细胞分泌细胞因子，但实验步骤繁琐，需要进行细胞培养且试剂昂贵；细胞因子阻断法是利用阻断剂破坏细胞分泌蛋白的转运途径，导致分泌的细胞因子无法被分泌到细胞外，不适用于该方法学验证。
上述获取目细胞因子的方法，试剂成本昂贵，试验操作复杂，周期长，对于无菌条件要求苛刻，不利方法学验证的快速开展。
CBA是一种结合流式细胞仪荧光检测和微球免疫分析的应用技术，可以短时间内检测多种蛋白，相比ELISA能够检测多种待测物，有着较好运用前景。
但由于各类细胞因子在正常非人灵长类动物的普遍含量较低，往往低于检测下限，给实验方法验证带来困扰，从而阻碍了CBA细胞因子检测相关实验的进程，因此获得细胞因子阳性样本是开展CBA细胞因子检测方法验证的前提。
胸腺依赖性抗原（TD-Ag）可刺激细胞产生免疫应答，使Th细胞活化并分泌细胞因子，经过TD-Ag 处理后得到的样本理论上符合实验方法验证样本的要求。原理：TD-Ag与APC细胞表面的受体结合，部分TD-Ag -受体复合物会被胞吞到胞内，在细胞内TD-Ag会被消化成多肽片段，并且转载到MHC-Ⅱ分子呈递到细胞表面，Th细胞的TCR可以识别MHC-Ⅱ复合物，这是T细胞激活的第一步，随后Th细胞被逐步激活后并分泌各种细胞因子。
TDAR（T细胞依赖性抗体反应）试验是检测药物潜在免疫毒性预测较好的功能试验，其原理同上，根据TDAR试验的结果数据选择阳性样本，该阳性说明理论上含有细胞因子，虽然TDAR样本的结果判定是根据免疫球蛋白的滴度而非细胞因子的直接浓度，但是两者之间存在关联，因此可以用于CBA法检测细胞因子的验证。试验结果通过了方法验证。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是为CBA法检测细胞因子提供高效，低成本，简化验证样本获取的方法学验证，方便非人灵长类CBA法检测细胞因子实验的开展。本发明提供了一种不需要额外的体内诱导或体外刺激就可以获得阳性样本的思路，从而便于方法学验证试验的开展。本发明提供的方法可利用TDAR阳性样本进行CBA法细胞因子检测，从而监测检测过程和检测质量。
本发明主是利用TDAR样本直接进行方法学验证，相比上述方法显著提升了方法学验证的效率，无繁琐的验证样本制备过程，降低成本，方便相关实验的开展。
为了解决现有技术中的缺陷，本发明第一方面提供一种确认细胞因子检测试验质量的方法，其包括以下步骤：
（1）利用TDAR法，检测获得TDAR阳性的样本；
（2）利用CBA法，检测（1）获得的样本中的细胞因子。在某一具体实施方案中，所述细胞因子为动物细胞因子。
在某一具体实施方案中，所述细胞因子为非人类灵长类动物细胞因子。
在某一具体实施方案中，所述方法包括如下步骤：
（1）各类微球进行混合，获得混合微球；
（2）将所述混合微球、样本和检测抗体混匀，孵育；
（3）加入洗液后离心，弃上清，加入PBS，混匀。
所述样本可为所述TDAR阳性的样本、标准品或质控。
在某一具体实施方案中，所述各类微球中每种微球之间的体积比均为1:1。
在某一具体实施方案中，所述微球为包被有抗细胞因子抗体的微球。
在某一具体实施方案中，所述各类微球分别包被有抗IL-2抗体、抗IL-4抗体、抗IL-6抗体、抗TNF抗体或抗IFN-γ抗体。
在某一具体实施方案中，所述混合微球、所述TDAR样本以及所述检测抗体的体积比为1:1:1。
在某一具体实施方案中，所述孵育的时间为2-5小时。
在某一具体实施方案中，所述孵育的时间为3小时。
在某一具体实施方案中，所述离心为150-300g。
在某一具体实施方案中，所述离心为200g。
在某一具体实施方案中，所述离心的时间为2-5分钟。
在某一具体实施方案中，所述离心的时间为2分钟。
在某一具体实施方案中，所述PBS为1×PBS。
在某一具体实施方案中，所述PBS的用量为所述样本的30倍体积。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明中的样本来源为经过免疫刺激的动物，直接用含有促凝剂的真空采血管采集动物全血后离心获得的血清即为样本。是一种采用TDAR样本对CBA法检测非人类灵长类动物细胞因子的验证方法。本发明的检测样本不用进行细胞培养，步骤简单。检测样本的获取更加快捷，方便。本发明的验证方法检测的IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ细胞因子含量都高于定量下限，且精密度的CV均小于5%，通过了方法学验证。
附图说明
图1为空白动物血清和TDAR试验动物血清的流式细胞仪产生的原始数据图。
图2为TDAR试验动物血清和TDAR试验动物血清的流式细胞仪产生的原始数据图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
TDAR动物血清的样本来源：（详见[1]熊克朝等，应用t细胞依赖性抗体反应模型评价参麦注射液对大鼠免疫功能的影响. 中国药理学与毒理学杂志, 29(1), 6.中的1.3部分）
使用胸腺依赖性抗原（TD-Ag）来刺激机体的细胞免疫，使T细胞活化，进而检测Th细胞分泌的各种细胞因子，KLH（钥空血蓝蛋白）是一种具有高度免疫原性的蛋白大分子，主要成分是蛋白质，无重复聚集，符合胸腺依赖性抗原（TD-Ag）的性质，配制合适浓度的KLH对刺激受试动物，KLH进入机体后与B细胞表面的BCR结合，部分KLH-BCR复合物会被胞吞到胞内，在细胞内KLH会被消化成多肽片段，并且转载到MHC-Ⅱ分子呈递到细胞表面，Th细胞的TCR可以识别MHC-Ⅱ复合物，这是T细胞激活的第一步，随后Th细胞被逐步激活后并分泌各种细胞因子，用促凝管采取全血后，用血清进行检测，分析各类细胞因子的浓度。可用于CBA的验证工作。
试剂来源：
名称：BDTM Cytometric Bead Array (CBA) Non -Human Primate Th1/Th2Cytokine Kit试剂盒
厂商：BD/bdbiosciences
Cat：557800
实施例1
实施例1.1 上样样品的配制
配制混合微球
微球为包被有抗细胞因子抗体的微球，共5种微球，分别指的是表面包被IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ抗体的微球，每种微球仅包被一种细胞因子的抗体，而且微球具有不同的APC荧光强度，用于相互区分。
（1）将包被IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ抗体的微球各176μl，即体积比为1:1:1:1:1，在试管中进行混合，获得混合微球。
（2）另取流式管，加入上述混合微球50μl，然后加入TDAR样本50μl，最后加入检测抗体50μl（试剂盒），混匀后室温孵育3小时。孵育结束后每管加入1ml洗液（试剂盒中）后离心（200g，2mins），弃上清，加入300μl的1×PBS，混匀。
重复步骤（1），在步骤（2）中将TDAR样本替换成标准品或质控（均来自上述试剂盒中）获得其他上样样品。
实施例1.2 仪器设置
完成流式细胞仪（仪器厂家/型号：BECKMAN COULTER/CytoFLEX S）的日常清洗后进行质控，通过后上机检测。
上样顺序为先标准品后样本，且标准上样顺序为浓度由低到高，见表1。上样时点击运行模式，调整仪器的增益以及荧光补偿，设置参数函数，仪器调节参数见下表2和3，待仪器调试完毕后记录试验数据。
表1 上样浓度
| 标准曲线名称 | 浓度（pg/ml） |
| S1 | 0 |
| S2 | 20 |
| S3 | 40 |
| S4 | 80 |
| S5 | 156 |
| S6 | 312 |
| S7 | 625 |
| S8 | 1250 |
| S9 | 2500 |
| S10 | 5000 |
表2增益调节
| 抗体荧光 | 增益数值 |
| PE | 10 |
| APC | 1 |
表3补偿调节
| 通道 | -PE% | -APC% |
| PE | 0.0 | |
| APC | 0.0 |
实施例1.3 结果解读
检测完成后，以FCS格式导出试验数据，再将FCS文件导入FCAP Array软件进行分析，分析结果见下表4。
表4 FCAP Array软件分析结果
| 样本ID | IL-2（pg/ml） | IL-4（pg/ml） | IL-6（pg/ml） | TNF（pg/ml） | INF-γ（pg/ml） |
| 1 | 97.85 | 48.79 | 64.66 | 45.72 | 17.83 |
| 2 | 100.34 | 48.34 | 101.19 | 43.70 | 21.63 |
| 3 | 99.48 | 48.86 | 83.97 | 40.09 | 24.45 |
| 4 | 98.34 | 52.52 | 79.19 | 48.60 | 23.78 |
| 空白动物血清（食蟹猴） | 1.77 | 0.00 | 10.62 | 0.00 | 0.00 |
| 标准曲线拟合后定量下限 | 20.13 | 20.09 | 19.65 | 18.00 | 21.24 |
其中，样本1、2、3和4分别为间隔4个月、3个月、2个月和4个月，根据表4的试验结果可知：
在时隔4个月内的不同时期的检测结果均很稳定，且IL-2，IL-4，IL-6，TNF指标的试验结果数据均高于标准曲线拟合后定量下限。
INF-γ指标的试验结果有一支样本结果低于下限，其他三支样本试验结果高于标准曲线拟合后定量下限。
图1的A中P1为目的微球（原理为双抗夹心法，各类细胞因子为抗原，微球上包被有抗细胞因子抗体，每种微球仅包被一种细胞因子的抗体）所在的SSC-A和FSC-A作图的具体位置。
图1的B为以P1为门，以APC和 PE 坐标轴作的图，每种微球的APC荧光是不同的，从图可以看出微球被APC荧光明显区分出6团，从上至下，APC荧光强度依次减弱，分别代表IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ。横坐标表示PE荧光的强度，检测抗体均被标记上PE荧光，样本中含有的上述细胞因子含量越高，则对应的微球的PE的信号值也就越高。
由图1结合FCAP Array软件分析的结果（表4）可知空白动物血清中的IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ含量都低于定量下限。
图2为TDAR试验动物血清，具体描述同上。
由图2结合FCAP Array软件分析的结果（表4）可知TDAR试验动物血清中的IL-2，IL-4，IL-6，TNF，IFN-γ含量都高于定量下限。IL-5低于定量下限。
试验结果符合方法学接受标准，方法学验证通过。
应用实施例
精密度测试
上样样品的制备同实施例1.1，仪器设置同实施例1.2。
检测完成后将试验原始数据以FCS格式导出，再将FCS文件导入FCAP Array软件进行分析、整理，见表5。
表5 一支样本重复检测5次的实验结果
| 样本ID | IL-2（pg/ml） | IL-4（pg/ml） | IL-6（pg/ml） | TNF（pg/ml） | INF-γ（pg/ml） |
| 1 | 105.36 | 43.55 | 61.85 | 43.37 | 20.41 |
| 2 | 103.14 | 43.06 | 61.13 | 44.59 | 16.95 |
| 3 | 106.16 | 46.58 | 62.08 | 44.19 | 19.87 |
| 4 | 106.71 | 44.34 | 61.00 | 43.74 | 21.02 |
| 5 | 105.70 | 44.25 | 60.30 | 47.54 | 17.00 |
| SD | 1.22 | 1.21 | 0.64 | 1.49 | 19.05 |
| AVERAGE | 105.41 | 44.36 | 61.27 | 44.69 | 1.73 |
| CV% | 1.16 | 2.72 | 1.04 | 3.32 | 0.09 |
根据表5可知各类细胞因子的CV值均低于5%，精密度验证通过。
对比例1 阳性样本1的结果对比
选择正常饲养的食蟹猴，并使用常规方法采集的阳性样本1（即EDTA抗凝血样本）（动物号5）作为对比，使用sysmexXN1000V血液细胞仪检测白细胞结果为20.4^3细胞/µL（血液学结果如表6所示，表明选择的EDTA抗凝血样本存在感染，理论上会引起细胞因子波动）用作阳性对照，其余实验步骤同实施例1。
表6 EDTA抗凝血样本的血液结果
| WBC^3/µL | %LYMPH% | %MONO% | %NEUT% | EOS%% | %BASO% | LYMPH^3/µL | MONO^3/µL | NEUT^3/µL | EOS^3/µL | BASO^3/µL |
| 20.4 | 37 | 11.3 | 49.4 | 1.9 | 0.4 | 7.55 | 2.3 | 10.09 | 0.38 | 0.08 |
其检测结果如表7所示，可以看出使用阳性样本1的检测含量低于定量下限，无法作为CBA法的验证样本。
表7 EDTA抗凝血样本
| 动物号 | IL-2（pg/ml） | IL-4（pg/ml） | IL-5（pg/ml） | IL-6（pg/ml） | TNF（pg/ml） | INF-γ（pg/ml） |
| 5 | 0 | 0.44 | 10.62 | 0 | 0 | - |
对比例2 阳性样本2的稳定性对比
阳性样本2（食蟹猴动物静脉给予常规生理盐水刺激后采集的血清样本）采用557800 BDCBA Th1/Th2 Cytokine kit试剂盒检测的细胞因子结果如表8所示，检测值偏低，稳定性较差，在冷冻保存至第10个月时几乎检测不出。
与前述实施例相比，TDAR阳性样本结果偏高，且比较固定。采集的样本在保存至4~10个月时结果依然比较稳定。
表8 阳性样本2不同时期检测的结果
| 采集日期 | 检测日期 | 动物号 | IL-2（pg/ml） | IL-4（pg/ml） | IL-5（pg/ml） | IL-6（pg/ml） | TNF（pg/ml） | INF-γ（pg/ml） |
| 2021/09/02 | 2021/11/01 | 4-00 | 105.44 | 45.40 | 13.96 | 66.04 | 47.10 | 20.03 |
| 2021/09/02 | 2021/11/01 | 6-00 | 101.80 | 41.87 | 14.25 | 73.91 | 45.24 | 16.95 |
| 2021/09/02 | 2021/11/01 | 7-00 | 104.68 | 42.94 | 14.88 | 77.71 | 41.35 | 13.53 |
| 2021/09/02 | 2021/11/01 | 12-00 | 110.75 | 44.22 | 15.54 | 80.10 | 50.68 | 17.97 |
| 2021/09/02 | 2021/11/01 | 23-00 | 105.27 | 44.17 | 14.20 | 63.68 | 42.91 | 20.64 |
| 2021/09/02 | 2022/6/23 | 4-00 | 0.00 | 0.00 | 0.14 | 0.00 | 0.54 | 0.29 |
| 2021/09/02 | 2022/6/23 | 6-00 | 0.00 | 0.77 | 0.25 | 0.00 | 0.44 | 0.27 |
| 2021/09/02 | 2022/6/23 | 7-00 | 0.00 | 0.76 | 0.13 | 1.74 | 0.19 | 0.50 |
| 2021/09/02 | 2022/6/23 | 12-00 | 0.00 | 0.00 | 0.06 | 0.65 | 0.68 | 0.00 |
| 2021/09/02 | 2022/6/23 | 23-00 | 0.00 | 1.15 | 0.34 | 0.34 | 0.00 | 0.69 |
综上，传统细胞因子阳性样本的获取需要对细胞进行体外培养，再对细胞进行刺激后才能分泌足够高浓度的目的细胞因子，该过程较为复杂，需要花费大量成本，对无菌条件要求苛刻。TDAR样本（阳性）的获取只需用促凝管抽取被KLH（一种可以刺激机体免疫系统并分泌细胞因子的抗原）刺激的实验动物的外周血，离心后获得的血清即为TDAR样本。本发明使用来源于被KLH刺激的动物血清，但不局限于KLH，根据作用原理KLH可以与其他相同性质的抗原进行替换。
Claims (1)
1.一种确认细胞因子检测试验质量的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
（1）利用TDAR法，检测获得TDAR阳性的样本；
（2）利用CBA法，检测（1）获得的样本中的细胞因子；所述细胞因子为非人类灵长类动物细胞因子；
所述方法还包括如下步骤：
（2-1）各类微球进行混合，获得混合微球；
（2-2）将所述混合微球、所述样本和检测抗体混匀，孵育；
（2-3）加入洗液后离心，弃上清，加入PBS，混匀；
其中，所述各类微球中每种微球之间的体积比均为1:1；
所述各类微球为包被有抗细胞因子抗体的微球；
所述各类微球分别包被有抗IL-2抗体、抗IL-4抗体、抗IL-6抗体、抗TNF抗体或抗IFN-γ抗体；
所述混合微球、所述样本以及所述检测抗体的体积比为1:1:1；
所述孵育的时间为3小时；
所述PBS为1×PBS；
所述PBS的用量为所述样本的30倍体积；
所述离心为200g，所述离心的时间为2分钟。
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