JP2023066423A - がん治療のためのより安全でより効果的な抗ctla4抗体を選択及び設計する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗CTLA4抗体を特定する方法、及び、リソソームでのCTLA4分解を引き起こさない抗CTLA4抗体をスクリーニングする方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、アメリカ国立衛生研究所(National Institutes of
Health、NIH)から授与された助成金番号AI64350、CA171972、及びAG036690に基づく政府の支援を受けて一部行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を保有する免疫グロブリン分子を指す。「可変領域」という用語は、抗体に広く共有されるドメイン(抗体Fcドメインなど)とは異なる免疫グロブリンのドメインを指す。可変領域は、その残基が抗原結合に関与している「超可変領域」を含む。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「CDR(Complementarity Determining
Region)」からのアミノ酸残基(すなわち、典型的には軽鎖可変ドメインのおよそ24~34番目(L1)、50~56番目(L2)、及び89~97番目(L3)の残基並びに重鎖可変ドメインのおよそ27~35番目(H1)、50~65番目(H2)、及び95~102番目(H3)の残基、参考文献44)を含み、「超可変ループ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの26~32番目(L1)、50~52番目(L2)、及び91~96番目(L3)の残基並びに重鎖可変ドメインの26~32番目(H1)、53~55番目(H2)、及び96~101番目(H3)の残基、参考文献45)を含み得る。「フレームワーク領域」すなわち「FR」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書に開示される抗体は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、単鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、イントラボディ、又は抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id及び抗-抗Id抗体を含む)であってもよい。特に、前記抗体は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、又はIgYなどの免疫グロブリン分子であってもよく、又はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、若しくはIgA2などのクラス又はサブクラスのものであってもよい。
ヒトCTLA4タンパク質に対する抗体であるイピリムマブは、単一の免疫療法薬として、又は抗PD-1抗体などの別の治療薬と組み合わせて、がん患者の生存期間を延長することが示されている。ただし、がん免疫療法効果は、免疫関連の重大な有害作用(irAE)に関連している。より優れた治療効果又は自己免疫有害作用の低減を達成するために、新規抗CTLA4抗体を開発する大きな必要性がある。本発明者らは、驚くべきことに、免疫療法に関連する重大な自己免疫有害作用を起こすことなくがん拒絶を誘導するために使用できる抗CTLA4抗体を見出した。
さらに、本明細書において、本明細書に記載の抗体の機能的特徴又は属性を組み込むことにより、新規抗CTLA4抗体の設計及び/又は選択、並びに既存の抗CTLA4抗体の抗腫瘍効果及び/又は毒性プロファイルを改善するための抗体改変方法が提供される。具体的には、抗CTLA4抗体のTreg枯渇活性を増加させてがん免疫療法効果を増加させ、エンドソーム輸送と抗体結合CTLA4の破壊を減少させ、CTLA4を細胞表面へ再循環可能にすることによって毒性プロファイルを改善する方法が提供される。最も好ましい実施形態では、前記抗CTLA4抗体は、Treg枯渇活性及びCTLA4再循環活性の両方を改善するように設計又は改変される。抗ヒトCTLA4抗体はマウスなどの他の種のCTLA4と交差反応しない傾向があるため、このような試験ではヒト細胞、ヒトCTLA4でトランスフェクトした細胞、又は本明細書に記載のヒトCTLA4ノックインマウスなどのヒトCTLA4を発現するトランスジェニック動物モデルなどのヒトCTLA4システムを使用する必要があると理解される。一実施形態では、抗体は、腫瘍環境内のTregの枯渇を増強するように設計される。このような抗体は、本明細書に記載のin vitro又はin vivo方法のいずれかを使用して試験又は選択することができる。例えば、ヒトCTLA4ノックインマウスに前記抗CTLA4抗体と共に腫瘍細胞株を注射し、その後のタイムポイントで腫瘍浸潤Tregを取り出してカウントし、陰性又は陽性コントロールと比較する。
本発明はさらに、免疫応答のアップレギュレーションのための、本明細書に記載される抗体組成物の使用に関する。免疫系の上方調節は、がん及び慢性感染症の治療において特に望ましく、したがって、本発明は、そのような障害の治療において有用性を有する。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、細胞の異常な制御不能な増殖から生じる新生物又は腫瘍を指す。「がん」には、白血病及びリンパ腫が明示的に含まれる。「がん」という用語は、遠隔部位に転移する可能性がある細胞が関与する疾患も指す。
本発明はさらに、治療的有効量の任意の上記抗CTLA4抗体組成物又はその抗原結合性断片、及び生理学的に許容される担体又は賦形剤(excipient)を含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的に有効な量の抗CTLA4抗体又はその抗原結合性断片及び薬学的に許容される担体を含む。
本明細書に記載の組成物を投与する方法は、非経口投与(例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下)、硬膜外、及び粘膜(例えば、鼻腔内及び経口経路)を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。前記組成物は、例えば、注入又はボーラス注射、上皮又は粘膜皮膚ライニング(例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など)を介した吸収によって、任意の簡便な経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は全身的又は局所的であり得る。
抗CTLA4 mAbはチェックポイント阻害とは無関係に宿主のFc受容体に依存したメカニズムにより腫瘍拒絶を引き起こす
〔材料と方法〕
(動物)
内因性マウスCtla4遺伝子座の制御下でヒトCTLA4タンパク質と100%の同一性を有するCTLA4タンパク質を発現するCTLA4ヒト化マウスは既に説明されている[38]。このホモ接合型ノックインマウス(Ctla4h/h)をC57BL/6背景に10世代以上戻し交配した。Ctla4h/hマウスと野生型(WT)BALB/c又は野生型C57BL/6マウスとを交配させてヘテロ接合型マウス(Ctla4h/m)を作製した。野生型C57BL/6マウスはCharles River Laboratoriesから購入した。ヒト臍帯血CD34+幹細胞再構成NSG(商標)マウスはJackson Laboratories(メイン州バーハーバー)から購入した。全動物(雄及び雌、6~16週齢、各実験で週齢をマッチさせた)を分析に使用し、マウスを無作為に各群に割付けたことを除き盲検又は無作為化は行われなかった。全動物はChildren's National Medical Center内Children’s Research Instituteの研究動物施設に保管した。マウスを用いる全ての試験は動物管理使用委員会(IACUC;Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を受けた。
本研究で用いられた細胞系で国際細胞株検証委員会(ICLAC;International Cell Line
Authentication Committee)に提案されるクロスコンタミネーション又は誤認証の細胞株データベースには記載されているものはなかった。マウス又はヒトのB7-1又はB7-2でトランスフェクトされたCHO細胞及びL929細胞は以前説明されている[20、29]。また、B7-1トランスフェクトJ558細胞[22]、B7-H2-GFP[50]トランスフェクトP815細胞は以前説明されている。マウス結腸腫瘍細胞系MC38は以前説明されている[5]。メラノーマ細胞系B16-F10(ATCC(登録商標)CRL-6475(商標))及びHEK293T細胞(ATCC(登録商標)CRL-11268(商標))は最初にATCC(米国バージニア州マナサス)から購入した。販売者より受領後、in vivo試験まで細胞継代は最小限にとどめた。全ての細胞系は37℃でインキュベートし、5%CO2を含む雰囲気下で維持した。細胞は10%FBS(Hyclone)、100単位/mLペニシリン、及び100μg/mLストレプトマイシン(Gibco)を添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium、Gibco)中で培養した。
マウス抗CTLA4 mAbであるL3D10は既に説明されている[15]。本研究で用いられた抗CTLA4 mAb L3D10はヒトIgG1 Fc及びL3D10の可変領域からなるキメラ抗体である。組換えWT(M1)hCTLA4タンパク質及び変異(M17、M17-4)hCTLA4タンパク質、並びに親L3D10及び完全ヒト化L3D10(クローンHL12及びクローンHL32)を含む組換え抗体はLakepharma社(米国カリフォルニア州ベルモント)で作製された。WC500109302及びhttp://www.drugbank.ca/drugs/DB06186に開示されるアミノ酸配列を有する組換えイピリムマブは、Alphamab社(中国、江蘇省蘇州市)又はLakepharma社(米国カリフォルニア州サンフランシスコ)から臨床サンプルの残りを提供された。ヒトIgG-Fc(アジドなし)はAthens Research and Technology(米国ジョージア州アテネ)に一括注文した。抗マウスCD16/32 mAb 2.4G2、抗マウスB7-1mAb 1G10、抗マウスB7-2 mAb GL1、抗マウスCtla4 mAbs 9D9及び9H10、コントロールハムスターIgG、コントロールマウスIgG2b MPC-11、並びにヒトCTLA4-FcはBio-X-Cell社(米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン)から購入した。精製ハムスター抗マウスCtla4 mAb 4F10はBD Biosciences(米国カリフォルニア州サンノゼ)から購入した。in vitroブロッキングアッセイに用いる精製ビオチン化ハムスターIgGアイソタイプコントロール抗体はeBioscience(米国カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。ヒトB7-1-Fc、B7-2-Fc、及びポリヒスチジンタグ化ヒトCTLA4の融合タンパク質はSino Biological社(中国、北京)から購入した。組換えマウスCtla4-Fcタンパク質はBioLegend(米国カリフォルニア州サンディエゴ)から購入した。ビオチン化は製造者の説明書に従いEZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Scientific)を所望のタンパク質に結合させることにより行った。Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ヒトIgG(H+L)吸収処理済み(cross-absorbed)二次抗体はThermoFisher Scientific(米国)から購入した。サイトカインIL-4、IL-6及びIL-10のレベルはサイトメトリックビーズアレイ(BD Biosciences、カタログ番号560485)により製造者のプロトコルに従って評価した。SIYペプチドはMBL International Corporation(米国マサチューセッツ州ウォバーン)から購入し、SIY特異的CD8 T細胞はH-2KbテトラマーSIYRYYGL-PE(MBLコード番号:TS-M008-1)により検出した。NIHより提供されたH-2KbテトラマーOVA(SIINFEKL)-PE(番号31074)はフロー染色のネガティブコントロールに用いた。
3種のアッセイにより抗CTLA4 mAbの阻害活性を評価した。1つ目に、CTLA4-Fc又はそのリガンドであるB7-1でプレートをコートした。結合アッセイの可溶相にビオチン化融合タンパク質を用い、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;HRP)結合アビジン(Pierce High Sensitivity NeutrAvidin-HRP、Thermo Scientific社)によりタンパク質結合量を測定した。重炭酸塩バッファー(0.1M)中、タンパク質を4℃でコートし、室温で結合アッセイを行った。
GFP(C-GFPSparkタグ)タグ付きヒトB7-2/B7-1、及びOFP(C-OFPSparkタグ)タグ付きヒトCTLA4 cDNAを有するプラスミドをSino Biological社(中国、北京)から購入し、これを用いていずれかの分子を発現するCHO安定発現細胞系を確立した。抗CTLA4 mAbによるトランスエンドサイトーシスの阻害を測定するために、製造業者の説明書に従って、Pierce(商標)Fab Preparation Kit(Thermo Scientific、米国)でFab断片を作成した。所定用量のFabタンパク質又はコントロールhIgG-Fcタンパク質を、GFPタグ付きB7-2発現CHO細胞に添加し、その直後にOFPタグ付きCTLA4発現CHO細胞とともに37℃で4時間培養した。
Lakepharma社にて、25℃でOctet Red96で結合実験が行われた。ビオチン化B7-1-Fc又はCTLA4-Fcをストレプトアビジン(SA)バイオセンサーで捕捉した。次に、ロードされたバイオセンサーを、様々な濃度のB7-1-Fc又はCTLA4-Fcの希釈液に浸した(開始300nM、1:3希釈、7点)。
ELISA実験のため、hB7-1-Fc又はhB7-2-Fcを、96ウェル高結合ポリスチレンプレートにて所定濃度で一晩コーティングバッファー中でプレコートした。未結合タンパク質を洗い流した後、プレートをPBST中の1%BSAでブロックし、0.25μg/mLのビオチン化CTLA4-Fcタンパク質と共に2時間インキュベートした。未結合タンパク質を洗い流した後、所定量のhIgG-Fc/イピリムマブ/L3D10を添加して2時間インキュベートした。プレートに結合したビオチン化CTLA4-FcをHRP結合ストレプトアビジンで検出した。フローサイトメトリーアッセイでは、表面hB7-1又はmB7-2発現CHO細胞(1×105個/試験)を室温で30分間、可溶性ビオチン化CTLA4-Fc(200ng/試験)と共にインキュベートした。洗浄後、所定量のコントロールhIgG-Fc又は抗CTLA4 mAbと共に、細胞を100μLのDPBSバッファー中で所定時間(分)インキュベートした。フローサイトメトリーによりPE-ストレプトアビジンを用いてB7に結合したCTLA4-Fc量を検出し、3連のサンプルからPEの平均蛍光強度(MFI)を計算した。
ヒトCTLA4遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性ノックインを有するマウスに、所定数の結腸直腸がん細胞MC38又はメラノーマ細胞系B16-F10を接種した。腫瘍細胞の注射後2日目、7日目、又は11日目に、所定用量で免疫療法を開始した。腫瘍体積を読み出しとして腫瘍の増殖及び退縮を決定した。腫瘍体積(V)は下記式から求めた。
ここで、aは長径、bは短径を表す。
各実験の分析に用いられた具体的試験は図の説明に示されている。Shapiro-Wilk検定により、データが正規分布に従うか否かに基づいて、各統計分析で適切な検定を選択した。2群比較には対応のない両側スチューデントのt検定又はマンホイットニー検定、複数比較には一元配置又は二元配置分散分析(ANOVA)及びSidak修正、行動試験には二元配置反復測定分散分析(ANOVA)によりデータを分析した。サンプルサイズは、文献及び過去の経験に基づき適切な統計的検出力で選択した。分析から除外されたサンプルはなく、特記されたものを除き無作為化は行われなかった。動物群の割付けにおいて盲検化は行われなかったが、本試験におけるいくつかの測定(すなわち、腫瘍サイズ測定、B7発現のフローサイトメトリーアッセイ)においては行われた。グラフのy軸のエラーバーは、図示されるように標準誤差(SEM)又は標準偏差(SD)を表す。統計的計算はエクセル(マイクロソフト社)、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)又はRソフトウェア(https://www.r-project.org/)により行った。
B7が細胞膜に提示されている場合、イピリムマブはB7-CTLA4相互作用を阻害しない
よりよい比較のために、マウス抗ヒトCTLA4 mAb(L3D10)の可変領域を使用して、イピリムマブ(ヒトIgG1)と同じアイソタイプを有するキメラ抗ヒトCTLA4 mAb[14]を作製した[15]。キメラ抗体の見かけの親和性は2.3nMであり、これはイピリムマブ(1.8~4nM)と同程度である[14、16]。変異CTLA4分子への結合に基づいて、これらの2つの抗体は、ヒトCTLA4の重複するエピトープに異なる方式で結合する(図1)。以前の報告[14]と一致して、固定化CTLA4を使用して可溶性B7-1と相互作用させると、イピリムマブはB7-1-CTLA4相互作用を強力に阻害した。これはL3D10と同程度である(図2A)。B7-1及びB7-2は細胞表面共刺激分子として機能することから、固定化されたヒトB7-1とB7-2を使用して抗CTLA4抗体の阻害を評価した。図3Aに示されるように、イピリムマブは、非常に高濃度(800μg/mL)で使用した場合でも、プレートに固定化されたhB7-1へのCTLA4-Fcの結合を阻害しなかった。3つの異なる供給源(クリニックで使用される薬を含む)からの市販のイピリムマブを使用して同じ結果が得られたため、この阻害の欠如は、組換えイピリムマブのバッチの違いによるものではない。一方、L3D10は0.2μg/mLの低濃度でもプレートに固定化されたhB7-1の結合を有意に阻害し、約3μg/mLの50%阻害濃度(IC50)を達成した。したがって、B7-1がプレートに固定化されている場合、B7-1-CTLA4相互作用の阻害において、L3D10はイピリムマブよりも1,000倍以上効率的である。イピリムマブの阻害活性の欠如は、広範囲のリガンド濃度及び受容体濃度にわたって明らかであった(図3B及び図3C)。プレートに固定化されたB7-2のCTLA4-Fcへの結合は、約200μg/mLという高いIC50ではあったが、イピリムマブによる阻害の影響を若干受けやすかった(図3D)。このIC50は、3mg/kgという有効用量[7](19.4μg/mL、会社の製品添付文書に基づく)によって達成される安定した血漿レベルよりも10倍高いため、臨床用量においてB7-2-CTLA4の相互作用の有意な阻害が起こる可能性は低い。イピリムマブの低い阻害活性は、広範囲のB7-2及びCTLA4タンパク質濃度で観察された(図3E及び3F)。ここでも、B7-2-CTLA4相互作用の阻害において、L3D10は0.1μg/mLというIC50を有し、イピリムマブよりも約2,000倍効率的である。B7-1-CTLA4複合体とB7-2-CTLA4複合体の構造分析では非常に類似した相互作用が観察されることから[18-19]、B7-1とB7-2の微妙な差異はおそらく結合部位の構造的差異によるものではなく、B7-2-CTLA4相互作用のほうがオフレート(off rate)が高い[17]ことに起因すると考えられる。
ほとんどのCTLA4分子は、AP-2に媒介されるメカニズム[23-24]を介して細胞内に存在する。B7及びCTLA4が両方とも細胞表面で安定して発現している場合に抗CTLA4 mAbがB7-CTLA4相互作用を阻害できるかどうかを測定するため、CTLA4にY201V変異を導入し、CTLA4の元来のエンドサイトーシスを阻止し、細胞表面に安定的に発現するようにした[25](図5A)。図6Aに示されるように、B7-1-GFP又はB7-2-GFPのいずれかを発現するCHO細胞とCTLA4Y201-OFPを発現するHEK293T細胞は、フローサイトメトリーによって明確に区別可能である。これらをFACS分析の直前に混合すると、GFP+OFP+細胞はほとんど観察されなかった。イピリムマブとL3D10の細胞間相互作用の阻害能を比較するため、CTLA4分子のクロスリンクによる間接的な影響を回避するために、双方の抗体からFab断片を調製した(図6B)。これらの抗体のFabは、OFPタグ付きCTLA4で安定的にトランスフェクトされた細胞に対して同程度の結合を示した(図6C及び3D)。抗体をブロックせずに4℃で2時間共培養すると、ほとんどのOFP+細胞はB7-GFP発現細胞と同程度の強度でGFPを獲得した(図6E及び3G)。特に、GFP+OFP+細胞には、細胞クラスターと一致する前方散乱光及び側方散乱光が観察された(図5B)。図6E及び図6Fに示されるように、L3D10 FabはB7-1-GFP-CTLA4Y201V相互作用を効果的に阻害したが、イピリムマブFabはこれを効果的に阻害しなかった。同様に、10μg/mLのイピリムマブFabは細胞のB7-2とCTLA4の相互作用を15%しか阻害しなかったが、同用量のL3D10 Fabは80%の阻害を引き起こした(図6G及び図6H)。
CTLA4は主にTregで発現し、可能性のあるメカニズムの1つとして、樹状細胞(DC)上のB7-1及びB7-2の発現をダウンレギュレートすることにより自己免疫疾患を抑制する[26]。Ctla4の標的変異[26]と阻害的(blocking)抗CTLA4 mAb[12]による処置はいずれも樹状細胞上のB7-1及びB7-2の発現を増加させることから、Treg上のCTLA4の生理的機能は、樹状細胞上のB7をトランスエンドサイトーシスを介してダウンレギュレートすることであることが示唆されている[12、27]。したがって、B7-CTLA4相互作用の阻害は、樹状細胞上のB7のアップレギュレーションに直結する。in vivoで抗CTLA4 mAbの阻害活性を評価するため、非常に高用量の抗CTLA4 mAb(500μg/マウス;約25mg/kg、つまりクリニックで使用されるイピリムマブの最大用量である3mg/kgの8倍超に相当)を、Ctla4h/h又はCtla4h/mマウスに注射し、注射24時間後に脾臓細胞を採取してCD11chighDC(樹状細胞)上のB7-1レベル及びB7-2レベルを測定した(図8A及び5B)。図8C、8D、8Eに示されるように、ヒトIgG1-Fcを投与したCtla4h/hマウスと比較して、L3D10で処置したマウスの樹状細胞では、穏やかではあるが統計的に有意なB7-1の上昇、及び強力なB7-2のアップレギュレーションがみられた。B7-2のアップレギュレーションの程度は、ヒトTregと樹状細胞の共培養において阻害的(blocking)抗CTLA4 mAbを使用した場合と同様である[12、27]。一方、イピリムマブはin vivoでB7-1及びB7-2をアップレギュレートしなかった。混入したLPSの影響の可能性を排除するために、抗体調製物中のエンドトキシンレベルのレベルを測定したところ、0.00025~0.0025ng/μgであり、IgG Fcコントロールの2~10分の1であり、in vivoでのB7-1及びB7-2のアップレギュレーションの原因とはなっていなかった(図9)。
免疫療法効果にB7-CTLA4相互作用の阻害が必要かどうかを試験するため、まずL3D10とイピリムマブの腫瘍拒絶反応を誘発する能力について比較した。Ctla4h/hマウスに結腸がん細胞系MC38を接種した。腫瘍が直径約5mmのサイズに達したところで、当該マウスを、コントロールのヒトIgG-Fc、L3D10、又はイピリムマブで、10、30、及び100μg/マウス/注射の用量で4回処置し、4~6週間の間腫瘍サイズを観察した。図12Aに示されるように、コントロールIgG Fc処置マウスでは腫瘍が徐々に成長したが、抗CTLA4 mAbは両方とも10μg/マウスという低用量においても完全な拒絶が達成された。複数の実験において、これらの2つの抗体は腫瘍拒絶を引き起こす能力において同等であった。別の腫瘍モデルであるB16メラノーマでは、これらの抗体はいずれも、腫瘍形成前に投与した場合であっても腫瘍形成後に投与した場合であっても、腫瘍増殖を同様に遅延させた(図12B)。一方、公表されている研究[10]から予測されたように、抗体単独療法では完全な拒絶は達成されなかった。
CTLA4チェックポイント阻害仮説の重要な予測として、抗CTLA4 mAbは、負のシグナルを送達するためにB7が存在しない限り、免疫療法の効果を生まないであろうと考えられている。Cd80(B7-1をコード)及びCd86(B7-2をコード)の標的変異を有するマウスはTregを有さないため[33]Ctla4をほとんど発現しないことから、抗B7-1(1G10)mAb及び抗B7-2(GL1)mAbの飽和用量を用いて上記予測を試験した。上記抗B7-1(1G10)mAb及び抗B7-2(GL1)mAbはそれぞれヒトCTLA4のmB7-1、mB7-2への結合をそれぞれ阻害する(図17A)。図17Bに図示されるように、コントロールIg、又は抗mB7-1 mAbと抗mB7-2 mAbとの組み合わせと共に、イピリムマブでMC38担腫瘍マウスを処置した。新たな抗mB7 mAbへのB7-1及びB7-2の結合は、Cd80及びCd86(dKO)の両方の標的変異を持つマウスで観察されたものと同程度にまで減少していたことから(図17C及び17D)、使用した抗mB7 mAbは、末梢血白血球の全てのB7-1及びB7-2を完全にマスキングした。腫瘍流入領域リンパ節からの樹状細胞においてもB7-2の同様の阻害が観察された(図17E)。一方、抗体処置にかかわらず、1G10 mAbではB7-1レベルはほとんど検出できなかったため(データ未掲載)、内因性B7-1のマスキングの程度は評価できなかった。B7-1とB7-2はいずれも抗原に対する抗体反応に必要であり[34]、抗CTLA4抗体は抗薬物抗体(anti drug antibody:ADA)の強力な誘導因子であるため[5]、ADAはin vivoにおけるB7-1とB7-2の機能の優れた指標である。イピリムマブに対する抗体反応が完全に消失したことから、機能的阻害も確認された(図17F)。重要なことに、抗mB7で処置されたマウスもコントロールIgで処置されたマウスもイピリムマブ療法に同様に反応したことから(図17G)、B7の飽和的阻害はイピリムマブに誘発される腫瘍拒絶に影響しなかった。したがって、イピリムマブの免疫療法効果はB7による負のシグナル伝達の無効化によっては説明できない。
チェックポイント阻害仮説における別の重要な予測として、抗CTLA4 mAbがナイーブT細胞のブレーキを放出してがん免疫療法効果を達成すると考えられている。抗B7 mAbによってT細胞依存性抗体応答が完全に消失したことから、抗B7 mAbのin vivo処理によってイピリムマブに誘導されるTh2細胞活性化が阻止されるかどうか試験した。図18Aに示されるように、イピリムマブ処置によってIL-4、IL-6、IL-10等のTh2型サイトカインのin vitro産生が有意に増加した。これは、in vivoでの抗B7 mAbs処理によって相殺された。末梢リンパ器官のCD8 T細胞の新規プライミングに対する抗B7 mAbの影響を試験するため、担腫瘍マウスをSIYペプチドで免疫化し、抗B7 mAbの存在下又は非存在下、イピリムマブでマウスを処置した。SIY-H-2Kb特異的T細胞の代表的プロファイルを図18Bに示し、代表的な試験の要約データを図18Cに示す。図18B及び18Cに示されるように、抗B7 mAbの非存在下では、SIYペプチドによる免疫化によって、SIY特異的T細胞が有意に増加した。これはイピリムマブによって若干増加するようである。一方、抗B7 mAbの存在下では、SIY特異的T細胞の新規プライミングは観察されなかった。図17のデータにより、抗B7 mAbがイピリムマブの免疫療法効果に干渉しないことが示されていることから、図18のデータは、イピリムマブによる免疫療法効果を達成するためにイピリムマブ処置後の新規T細胞プライミングは必要ないことを示唆している。
2つの抗マウスCtla4 mAbsである4F10及び9H10のインタクト抗体及びFabの刺激効果[35~36]に基づき、CTLA4はT細胞制御のための細胞固有の負の制御因子であるという概念が提案された。ただし、これらの抗体がB7-Ctla4相互作用を阻害することを示すデータは提示されていない。より最近では、3つ目の抗マウスCtla4 mAbである9D9が、担腫瘍マウスに対して治療効果を有し、腫瘍微小環境におけるTregの局所的な枯渇をもたらすことが報告されている[10]。そのため、腫瘍拒絶を誘発することが示されているこれら3つの市販の抗マウスCtla4
mAb全てについて、生理学的条件下でB7-Ctla4相互作用を阻害する能力を試験した。第1の試験として、漸増量(モル基準でCtla4-Fcの2000倍量まで)の抗マウスCtla4 mAbを使用して、ビオチン化Ctla4-Fcのプレート被覆mB7-1及びmB7-2への結合阻害を行った。図19Aに示されるように、抗マウスCtla4 mAb 9D9を非常に高濃度で使用した場合には多少の阻害が観察されたものの、抗マウスCtla4 mAb 9H10は試験された最高濃度でもmB7-1-Ctla4相互作用を阻害しなかった。また、mAb 9D9はmB7-2-Ctla4相互作用を効果的に阻害したが、9H10はこれを阻害しなかった(図19B)。興味深いことに、9D9は可溶性Ctla4-Fcへの強い結合を示したが、9H10は結合が弱く(図19C)、その一方、固定化マウスCtla4-Fcへの結合に関しては9H10は9D9よりも強力であった(図19D)。このアッセイにおける9H10による阻害活性の欠如は、単に9H10が可溶性Ctla4-Fcに対して結合力が不十分であることを反映している可能性があるため、野生型(WT)マウス(Ctla4m/m)の樹状細胞上のB7-1及びB7-2のアップレギュレーションを用いてin vivoでのB7-Ctla4の相互作用の阻害を測定した。図19E及び図19Fに示されるように、9H10は樹状細胞上のB7-1発現をアップレギュレートしなかったが、9D9はmB7-1レベルを15%増加させた(P<0.05)。興味深いことに、9D9は樹状細胞で明らかにmB7-2をアップレギュレートしたが、9H10ではmB7-2はアップレギュレートされなかった。したがって、9H10は、最初にかつ最も詳細に研究されてきた腫瘍免疫療法用抗Ctla4 mAbであるが、B7-Ctla4の相互作用を阻害しない。これらのデータは、抗マウスCtla4 mAbによる抗腫瘍免疫の誘導におけるB7-Ctla4相互作用阻害の役割に反するものである。いずれのmAbも同等の免疫療法効果及び同等の腫瘍微小環境内Treg枯渇を示したため[10]、抗マウスCTLA4 mAbの治療効果は、mB7-CTLA4の相互作用の阻害というよりは、Tregの局所的枯渇により統一的に説明される。興味深いことに、4F10はin vitroでB7-Ctla4相互作用を阻害したが、in vivoで樹状細胞上のB7のアップレギュレーションを誘導しなかった(図20)。
イピリムマブはB7が可溶型で添加された場合にB7-CTLA4相互作用を阻害(block)することに基づき、阻害的(blocking)mAbと呼ばれたが、上記データは、生理学的条件下、例えばB7-1及びB7-2が固相に固定化されている場合や細胞膜上に発現している場合、抗CTLA4 mAbに晒される前にB7-CTLA4複合体が形成されている場合、B7及びCTLA4がいずれも細胞表面分子として発現している場合、そして特にB7とCTLA4がそれぞれ樹状細胞上、T細胞上に天然に発現したものとして提示されている場合や、動物がin vivoで抗体治療を受ける場合には、イピリムマブはB7-CTLA4相互作用をほとんど阻害しないことを示唆している。さらに重要なことには、イピリムマブは、Ctla4h/mマウスにおいて50%以上のCTLA4が当該抗体に結合していない場合や宿主B7が抗B7 mAbでマスキングされている場合にも有効性を維持していることから、イピリムマブはB7-CTLA4相互作用を阻害しなくてもその免疫療法効果を有する。
mAbのシグナル伝達によるものであるという説明の可能性を除外するため、マウスとヒトの両方のCTLA4アレルからなるヘテロ接合型マウスを使用した[38]。本モデルにおいて、抗ヒトCTLA4 mAbは有効なアゴニストになる可能性はあるが、抗ヒトCTLA4 mAbはCTLA4分子の50%に結合できないため、有効なアンタゴニストにはならない。阻害的(blocking)抗CTLA4 mAbであるL3D10はホモ接合性マウスではB7のアップレギュレーションを誘発するがヘテロ接合性マウスでは誘発しないという事実は、in vivoでのアッセイの特異性を裏付け、機能的阻害にはCTLA4の50%を超える阻害が必要であろうことを示した。これはおそらく非占有CTLA4が50%以下であるとトランスエンドサイトーシスが起こるためであると考えられる。このように、B7-CTLA4相互作用の阻害には、樹状細胞上のB7のアップレギュレーションが最も生理学的に関連しており直接的な読み出しとなるものと考えられる。
CTLA4の完全な占有、全身性T細胞の活性化、及び自己反応性T細胞の優先的増殖は腫瘍拒絶には不要であるが免疫療法関連有害事象と相関し、一方B7-CTLA4相互作用の阻害は抗CTLA4抗体の安全性や有効性に影響しない
〔方法〕
(動物)
内因性マウスCtla4遺伝子座の制御下でヒトCTLA4タンパク質と100%の同一性を有するCTLA4タンパク質を発現するCTLA4ヒト化マウスは既に説明されている[24]。このホモ接合型ノックインマウス(Clta4h/h)をC57BL/6背景に10世代以上戻し交配した。Ctla4h/hマウスと野生型(WT)BALB/cマウス(腫瘍増殖研究用)又は野生型C57BL/6マウス(免疫療法関連有害事象研究用)とを交配させてヘテロ接合型マウス(Ctla4h/m)を作製した。野生型BALB/cマウス及び野生型C57BL/6マウスは、NCI契約を通じてCharles River Laboratoriesから購入した。全動物はChildren’s National Medical Center内Children’s Research Instituteの研究動物施設に保管された。マウスを用いる全ての試験は動物管理使用委員会(IACUC;Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を受けた。
マウス結腸腫瘍細胞系MC38は以前説明されており[2]、CT-26細胞系及びB16-F10細胞系はATCC(米国バージニア州マナサス)から購入した。販売者より受領後、in vivo試験まで細胞継代は最小限にとどめた。細胞系は認証を受けておらず、マイコプラズマ汚染についての定期的試験も行われていない。MC38細胞系、CT26細胞系、及びB16-F10細胞系は5%CO2内、37℃でインキュベートした。MC38細胞及びB16細胞は10%FBS(Hyclone)、100単位/mLのペニシリン、及び100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco)を添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium、Gibco)中で増殖させた。CT26細胞は完全RPMI1640培地(Gibco)で培養した。
マウス抗CTLA4 mAbであるL3D10は既に説明されている[28]。本試験で用いられた抗CTLA4 mAb L3D10はヒトIgG1 Fc及びL3D10の可変領域からなるキメラ抗体である。組換え抗体は請負契約を通じてLakepharma社(米国カリフォルニア州ベルモント)で作製された。WC500109302及びhttp://www.drugbank.ca/drugs/DB06186に開示されるアミノ酸配列を有する組換えイピリムマブは、Alphamab社(中国、江蘇省蘇州市)及びLakepharma社(米国カリフォルニア州サンフランシスコ)から提供された。主要な結果を検証するため、臨床的に使用されている薬剤も用いた。ヒトIgG-Fc(アジドなし)はAthens Research and Technology(米国ジョージア州アテネ)に一括注文した。抗マウスPD-1 mAB RMP1-14はBio-X Cell社(米国ニューハンプシャー州ウェストレバノン)から購入した。全てのmAbのエンドトキシンレベルをLALアッセイ(Sigma)で決定したところ、0.02EU/mgより低かった。
ヒトCTLA4遺伝子のヘテロ接合性又はホモ接合性ノックインを有するマウスに、所定数の結腸直腸がん細胞MC38、CT26、又はメラノーマ細胞系B16-F10を接種した。腫瘍細胞の注射後2日目、7日目、又は11日目に、所定用量で免疫療法を開始した。腫瘍体積を読み出しとして腫瘍の増殖及び退縮を決定した。腫瘍体積(V)は下記式から求めた。
ここで、aは長径、bは短径を表す。
L3D10は請負契約を通じてLakepharma社でヒト化された。それぞれの第1のヒト化鎖は第1のフレームワークを用い、最も多いヒト配列と最小限の親抗体のフレームワーク配列を含む(ヒト化HC1及びLC1)。それぞれの第2のヒト化鎖は、HC1及びLC1と同じフレームワークを用いたものだが、追加で親L3D10抗体配列を含む(ヒト化HC2及びLC2)。それぞれの第3のヒト化鎖は、第2のフレームワークを用い、HC2/CL2と同様に、ヒトフレームワークに融合された追加の親配列を含む(ヒト化HC3及びLC3)。3つのヒト化軽鎖及び3つのヒト化重鎖を可能な全組み合わせで組み合わせ、その発現レベル及び抗原結合親和性を試験し、親L3D10抗体と同様の作用を有する抗体を特定した。
K2EDTA(BD)を備えたチューブを使用して血液サンプル(50μL)を41日齢で収集し、製造業者のマニュアルに従ってHEMAVET HV950(Drew Scientific Group、米国フロリダ州マイアミレイクス)で分析した。
治療用抗体又はコントロール抗体を投与したマウスから収集したホルマリン固定臓器からH&E切片を作製し、二重盲検でスコア化した。
スコア基準:
心臓:心膜、右心房又は左心房、大動脈基部、及び左心室又は右心室への浸潤をそれぞれ1ポイントとしてカウントする。
肺スコアリングは、細気管支を取り囲むリンパ球凝集体に基づく:1は部位毎のリンパ球凝集体の1~3個の小さな病巣;2は4~10個の小さな病巣又は1~3個の中間的な病巣;3は4個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在;4は実質における顕著な間質性線維症及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
肝スコアリングは、門脈三管を取り巻くリンパ球浸潤凝集体に基づく:1は部位毎の1~3個のリンパ球凝集体の小さな病巣;2は4~10個の小さな病巣又は1~3個の中間的な病巣;3は4個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在;4は実質における顕著な間質性線維症及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
腎臓スコアリング:1.糸球体細胞質の穏やかな増加;2.糸球体細胞質の増加、及び遠位尿細管又は近位尿細管におけるリンパ球浸潤;3.集合管内の大きなリンパ球の凝集;4.腎臓の皮質及び髄質内における顕著なリンパ球凝集体。
唾液腺スコアリングは、顎下腺におけるリンパ球浸潤に基づく:1は部位毎の1~3個のリンパ球凝集体の小さな病巣;2は4~10個の小さな病巣、又は1~3個の中間的な病巣;3は4個以上の中間的な病巣、又は大きな病巣の存在;4は、実質における顕著な間質性線維症及び組織破壊、及びリンパ球凝集体の大きな病巣を表す。
示されているデータは、調査した全ての臓器のスコアの合計である。
図31Aに図示されるように、C57BL/6.Ctla4h/hマウスを野生型BALB/cマウスと異系交配させた。F1マウスを相互交配させて、Ctla4hとH-2アレルの両方がランダムに分離されているF2を生成させた。公表されている報告[24、30]に従い、尾DNAを用いてCtla4アレルと内因性ウィルススーパー抗原(VSAg)Mmtv8、9の遺伝子型を特定し、末梢血白血球を用いてフローサイトメトリーによってH-2dハプロタイプの存在を決定した。
血清心筋トロポニンI タイプ3(TNNI3)を測定するためのキットはCloud-Clone社から購入し(カタログ番号SEA478Mu)、製造業者のプロトコルに従ってELISAを使用してTNNI3レベルを測定した。クレアチニンレベルは、クレアチニン(血清)比色アッセイキット(Cayman Chemical)又はクレアチニン(CREA)キット(RANDOX、カタログ番号CR2336)を使用して測定した。血清BUNレベルは、UREA NITROGEN DIRECTキット(Stanbio laboratory)を使用し、製造元のマニュアルに従って測定した。
各実験の分析に用いられた具体的試験は図の説明に示されている。ダゴスティーノ・ピアソンの正規性検定により、外れ値を削除したデータが正規分布に従うか否かに基づいて、各統計分析で適切な検定を選択した。2群比較には対応のない両側スチューデントのt検定又はマンホイットニー検定、複数比較には一元配置分散分析(ANOVA)又はクラスカル・ウォリス試験、行動試験には二元配置反復測定分散分析(ANOVA)によりデータを分析した。線形回帰の相関係数及びP値はピアソン法を用いて算出した。サンプルサイズは、文献及び過去の経験に基づき適切な統計的検出力で選択した。分析から除外されたサンプルはなく、特記されたものを除き無作為化は行われなかった。動物群の割付けにおいて盲検化は行われなかったが、本試験におけるいくつかの測定(すなわち、腫瘍サイズ測定、組織学的検査のスコアリング)においては行われた。グラフのy軸のエラーバーは、図示されるように標準誤差(SEM)又は標準偏差(SD)を表す。統計的計算はエクセル(マイクロソフト社)、GraphPad Prismソフトウェア(GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ)又はRソフトウェア(https://www.r-project.org/)により行った。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
ヒトCTLA4ノックインマウスモデルは併用療法の免疫療法関連有害事象を忠実に再現する
併用療法における免疫療法関連有害事象のメカニズム及び予防的戦略を研究する際の主な課題は、マウスが顕著な有害事象を起こすことなく抗CTLA4 mAbの高用量に耐えることである。本研究では、臨床で使用されるイピリムマブと、抗CTLA4 mAbのパネルの中で最も強力なL3D10と、の2つのヒトCTLA4 mAbを選択した[24、28]。同じモデルで比較すると、2つのmAbは腫瘍拒絶を引き起こす点で同等であった(図21)。若いマウスは成体担腫瘍マウスの特徴を再現しつつ、より高レベルのCTLA4を発現したため(図22)、ヒトCTLA4ノックイン(Ctla4h/h)マウスを、周産期に、それぞれコントロール用のヒトIgG-Fc、抗CTLA4 mAbであるイピリムマブ、L3D10、抗PD-1、抗PD-1+イピリムマブ、又は抗PD-1+L3D10で処置した。マウスを生後10日目、13日目、16日目、及び19日目に100μg/マウス/注射の用量で処置し、経時的な体重増加率、及び6週齢における血液学的及び組織病理学的変化を評価した(図23A)。図23Bに示すように、イピリムマブと抗PD-1の組み合わせは雌マウスの成長を大幅に遅らせたが、いずれの抗体も単独では体重増加に大きな影響を与えなかった。雄マウスでも抗PD-1+イピリムマブに対して実質的かつ統計的に有意な成長の遅延がみられた(図23C)。注目すべきことに、抗PD-1+L3D10を使用した場合には成長遅延は観察されなかった(図23B及び図1C)。併用療法の造血に対する影響を研究するため、併用療法の開始後1か月後に全血球計算(CBC)を実施した(図24)。イピリムマブ+抗PD-1で処置された大多数のマウスで血中ヘマトクリット(HCT)、総ヘモグロビン(Hb)及び平均赤血球容積(MCV)レベルの有意な低下が観察されたが、L3D10+抗PD-1を投与されたマウスは影響を受けなかった(図23D)。白血球の存在は概ね正常であった(図24)。これらのデータは、抗PD-1とイピリムマブの組み合わせは貧血を引き起こすが、抗PD-1とL3D10の組み合わせは貧血を引き起こさないことを示している。単剤では、イピリムマブは、平均減少量は統計的に有意ではなかったものの、若いマウスの高割合で貧血を誘発したが、L3D10では貧血は誘発されなかった。剖検後、イピリムマブ+抗PD-1投与マウスから得られた骨及び骨髄は青白く、骨髄での赤血球生成は非常に制限されていたことが明らかである。一方、L3D10+抗PD-1投与の骨及び骨髄はコントロールIgで処置されたマウスと同様であった(図23E)。骨髄の赤血球系統の欠陥を定量化するため、骨髄細胞間のCD71及びTer119マーカーの分布と細胞サイズを分析した。これらのマーカーは、赤血球発生の5つの段階をIからVの順で示すために用いられた:ステージI、CD71+Ter119-;ステージII、FSC-AhiCD71+Ter119+;ステージIII、FSC-AmiCD71+Ter119+;ステージIV、FSC-AloCD71+Ter119+;ステージV、CD71-Ter119+。図23Fと図23Gに示すように、抗PD-1+イピリムマブ処置マウスは、前駆細胞の有意な増加(ステージI)と成熟赤血球の頻度の減少(ステージV)を示し、明らかに重度の貧血を示した。一方、L3D10と抗PD-1で処置されたマウスは、骨髄において赤血球の正常な分布と成熟を示した。
イピリムマブ+抗PD-1併用療法により誘発された重篤な有害事象のメカニズムを理解するために、コントロールIgG、イピリムマブ+抗PD-1、及びL3D10+抗PD-1をそれぞれ投与されたマウスの3群におけるT細胞の頻度及び機能的サブセットを分析した。図29Aに示されるように、3群のCD4 T細胞及びCD8 T細胞の頻度は実質的に同じであった。CD44マーカー及びCD62Lマーカーを使用すると、イピリムマブ+抗PD-1グループでエフェクターメモリーT細胞(CD44hiCD62Llo)の大幅な増加が観察されたが、セントラルメモリーT細胞(CD44hiCD62Lhi)の頻度は影響を受けていなかった(図29B及び4D)。これと対応して、抗PD-1及びイピリムマブ治療群ではナイーブT細胞の頻度は大幅に減少していた(図29B及び4D)。Tregの頻度は脾臓で有意に上昇していたため、異常なT細胞の活性化はTregの枯渇によるものではない(図30)。
本研究で使用された抗CTLA4 mAbはヒトCTLA4と反応するがマウスCTLA4とは反応しないため(図32)、マウスCtla4アレルとヒトCTLA4アレルを有するヘテロ接合性マウス(Ctla4h/m)では全てのCTLA4分子の機能を阻害することができない。最大50%のCTLA4のエンゲージメントでも、ウィルススーパー抗原(VSAg)反応性T細胞のTreg/Teff比の低下を引き起こすのに十分であるかどうかを試験した。図31Dに要約されているように、CTLA4h/mマウスでは、抗体処置に関係なく、Tregに対する従来型T細胞の比率の変化は観察されなかった。
L3D10抗体を臨床試験にトランスレーションする第1のステップとして、L3D10をヒト化し、同様のCTLA4に対する結合を有する2つのクローンを作製し、これらを免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果についてイピリムマブと比較した。図33Aに示されるように、Ctla4h/hマウスにおいてイピリムマブは抗PD-1と組み合わせると成長遅延を引き起こしたが、HL12及びHL32では抗PD-1と組み合わせても成長遅延は引き起こされなかった。イピリムマブとは対照的に、HL12もHL32もHCTとHbで測定される貧血を誘発しなかった(図33B)。組織病理学的分析により、HL12及びHL32を抗PD-1と組み合わせると、ごく一部のマウスでは肺及び唾液腺に中程度の炎症が観察されたものの、心臓、肝臓、結腸、又は腎臓では炎症が引き起こされないことが確認された(図33C)。複合病理スコアによると、HL12とHL32は併用療法においてL3D10よりも炎症の誘発がさらに軽度であることが明らかになった(図33Dと図28Cを比較)。さらに、これらのヒト化クローンを抗PD-1抗体と組み合わせて使用した場合、T細胞の全身性活性化は誘導されなかった(図34)。したがって、L3D10の安全性プロファイルは、ヒト化によって損なわれていなかった。
イピリムマブがCTLA4h/mマウスにおいて腫瘍拒絶を誘発できるという上記のデータは、このmAbが細胞表面CTLA4の一部のみエンゲージした場合に免疫療法関連有害事象を誘発しうるかどうかに関しての興味深い問題を提起した。本研究で使用された抗ヒトCTLA4 mAbはマウスCTLA4分子と反応しないため(図32)、Ctla4h/mマウスで免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果を比較することにより、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果が同様のレベルの受容体エンゲージメントを必要とするかどうかを評価した。驚くべきことに、Ctla4h/hマウスで成長遅延を誘発した場合と同じ用量のイピリムマブ+抗PD-1(図23A)は、Ctla4h/mマウスでは成長遅延を誘発しなかった(図36A)。免疫療法関連有害事象がみられないことと一致して、組織病理学的分析により、唾液腺の中程度の炎症を除いて、抗PD-1+イピリムマブは分析した他の臓器に炎症を引き起こさないことが明らかになった(図36B)。一方ホモ接合型マウスでは、上記で使用された用量と同じ用量で実質的に全ての分析された臓器で重度の炎症が引き起こされている(図25及び図28)。同様に、抗PD-1+イピリムマブで処置したCtla4h/mマウスでは貧血は観察されなかった(図36C)。しかしながら、イピリムマブによる免疫療法に関してはヘテロ接合型マウスはホモ接合型マウスとほとんど同様の反応性を示した(図36D)。したがって、免疫療法関連有害事象とがん免疫は遺伝的に連動していない可能性がある。ヒトCTLA4遺伝子は優性的様式でイピリムマブに対するがん免疫療法効果反応を起こさせるが、ヒトCTLA4遺伝子の免疫療法関連有害事象に対する役割は劣性である。これらのデータは、免疫療法関連有害事象とがん免疫療法効果の原因となるメカニズムは異なることを示唆している。
これまで、免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果のより頑健な評価を可能にするために、それぞれ別個の設定を使用してきたが、同じ設定下でも免疫療法関連有害事象及びがん免疫療法効果が観察されうることを示すことは興味深い。この目標を達成するために2つのアプローチをとった。まず、抗CTLA4抗体処置を受けている若い成体マウスの心臓の有害作用を、血清マーカーとしての心筋トロポニンI(TNNI3、様々な心疾患の一般的な診断マーカー)と組織学分析の両方に基づいて評価した。図37Aに示されるように、6~7週齢の若い成体マウスにおいて、抗CTLA4 mAbは同様に頑健な腫瘍拒絶を誘発した。腫瘍拒絶は同様であったにもかかわらず、3つのmAbはそれぞれ異なる有害な心臓欠陥を誘発した。特に、イピリムマブは高レベルのTNNI3を誘導した(図37B)。これに対応して、組織学的分析により、広範囲の心膜炎症(図37C、下部パネル)を伴う筋細胞内外の広範なヒアリン沈着が明らかになった(図37C、上部パネル)。HL12で処置されたマウス血清でも、より低いレベルではあるが顕著なTNNI3が観察され、これと対応する程度低いレベルの心臓のヒアリン化及び炎症も観察された。一方、HL32処置マウスでは、血清TNNI3の上昇はなく、またこれと対応するように、ヒアリン化や炎症の組織学的所見も観察されなかった。イピリムマブの治療効果は、抗PD-1と組み合わせると、単独療法と併用療法との間で同等であった(図37D)。心毒性は増加したが、毒性研究における典型的な高い固体差のため、イピリムマブ単独群とイピリムマブ+抗PD-1群の間に統計的有意性はなかった(図37E)。
本研究で用いた様々な抗体は免疫療法関連有害事象及び末梢T細胞活性化についてそれぞれ異なるプロファイルを示すため、末梢T細胞活性化が免疫療法関連有害事象と関係するかどうかを決定することは興味深い。図38A及び38Dに示されるように、コントロール又は5つの異なる抗CTLA4 mAbs投与のいずれかを受けたマウスの個別の免疫療法関連有害事象スコアは、脾臓のナイーブCD4及びナイーブCD8 T細胞の割合と負に相関している。セントラルメモリーT細胞の割合は、そのような相関関係を示さない(図38C及び図10F)。一方、エフェクターメモリーT細胞の割合は、免疫療法関連有害事象と正に相関する(図38B及び図38E)。強い相関関係は、末梢における広範なT細胞活性化が免疫療法関連有害事象の根本的な原因である可能性があることを示唆している。
免疫療法関連有害事象が新たな臨床的事項であることが記載されて以来[10]、がん免疫療法の進歩におけるこの大きな障壁を克服するために、マウスモデルにおける状態のモデル化への関心が高まっている。しかしながら、免疫系ががん組織と慢性的に相互作用しているヒトのがん患者とマウスの腫瘍モデルとは異なることにおそらく起因して、その進展は遅い。さらに、免疫療法関連有害事象は薬物特異的である可能性が高いため、1つの抗マウスCTLA4 mAbを用いて特定の抗ヒトCTLA4 mAbの免疫療法関連有害事象をモデル化することは困難である。本開示における我々の研究では、ヒトCTLA4ノックインマウスを使用して、臨床で使用されている抗CTLA4 mAbの免疫療法関連有害事象を評価した。このモデルは、単独での又は抗PD-1 mAbと組み合わせたイピリムマブに関連するほとんどの病理学的観察(心臓、肺、肝臓、腎臓、腸等の臓器への重度の炎症を含む)をうまく再現できたことが示された。このモデルでは、赤芽球癆等、イピリムマブに関連する希少な疾患[19、20]も観察された。
抗体に誘導されるリソソーム分解は抗CTLA4モノクローナル抗体の免疫療法関連有害作用の根底にある
マウスでもヒトでも、CTLA4の標的変異によって強力な自己免疫の表現型が与えられた場合、免疫療法関連有害事象が、抗体に誘発される受容体のダウンレギュレーションに関連する可能性があることが提案されている。この仮説を試験するため、外因性のヒトCTLA4分子を発現する複数の細胞系を作製し、臨床薬であるイピリムマブのCTLA4発現に対する影響を試験した。イピリムマブは、hCTLA4トランスフェクト293T細胞(図42A~D)でもヒトCTLA4を発現するCHO安定発現細胞系(図42E~G)でもCTLA4、特に細胞表面CTLA4のダウンレギュレーションを誘導することがわかった。CTLA4はもともと細胞内に存在し、活性化に伴い細胞表面に再循環するため、CTLA4の細胞表面への発現はイピリムマブのCTLA4のダウンレギュレーション誘発能をつかさどる主要因子である可能性がある。未処置の成体マウスでは、制御性T細胞上に検出される細胞表面CTLA4はごくわずかである(データ未掲載)。これと対応して、イピリムマブはナイーブマウスでCTLA4の有意なダウンレギュレーションを引き起こさなかった。一方、腫瘍浸潤Treg細胞は非常に高いレベルの細胞表面CTLA4を発現し、これはin vitroでもin vivoでもイピリムマブによって大幅にダウンレギュレートされる(図42H~I)。
pH感受性抗CTLA4抗体は、腫瘍微小環境におけるTreg枯渇及び確立された大きな腫瘍の拒絶反応の誘発においてより効果的である
(免疫療法関連有害事象の傾向の低い)pH感受性抗CTLA4抗体のポイントは、CTLA4から解離して、CTLA4をリソソーム分解から逃れさせ、細胞表面に再循環させることである。CTLA4レベルは(ADCC)/ADCPのターゲットの感受性を決定するため、本発明者らは、上記性質がTreg枯渇に役立ちうることに着眼した。がん免疫療法効果に対する腫瘍微小環境のTreg枯渇の重要な役割を考慮すると、免疫療法関連有害事象を低減するpH感受性がどのようにがん免疫療法効果に影響するかを検討することは非常に興味深い。腫瘍微小環境において、及び大きな腫瘍の拒絶反応において、Treg枯渇についてpH感受性抗体とpH非感受性抗体とを比較した。腫瘍微小環境でのTreg枯渇における抗体の機能を試験するため、14日前にMC38腫瘍を投与したマウスにこれらの抗体を注射した。16時間後、腫瘍を採取し、フローサイトメトリーでCD4 T細胞中のTregの割合(%)を評価した。図48に示されるように、HL12とHL32は16時間以内にTregを有意に減少させたが、イピリムマブはこの時点でTregを枯渇させなかった。
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Claims (39)
- 全身性T細胞活性化又は自己反応性T細胞の優先的増殖をもたらさない、がんの治療に使用するための抗CTLA4抗体。
- CTLA4が細胞表面に再循環することを可能にする、がんの治療に使用するための抗CTLA4抗体。
- pH5.5と比較してpH7でCTLA4により高い親和性で結合する、請求項2に記載の抗CTLA4抗体。
- pH4.5と比較してpH7でCTLA4により高い親和性で結合する、請求項2に記載の抗CTLA4抗体。
- 腫瘍微小環境においてFc受容体(FcR)媒介性制御性T細胞の枯渇を誘導する、請求項2~請求項4のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- 全身性T細胞活性化又は自己反応性T細胞の優先的増殖をもたらさない、請求項2~請求項5のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- CTLA4のB7リガンドへの結合を阻害しない、請求項1~請求項6のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- 細胞表面に位置するCTLA4と比較して可溶性CTLA4に対する親和性が低い、請求項1~請求項7のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- 抗PD-1抗体又は抗PD-L1抗体と組み合わされている、請求項1~請求項8のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- (a)細胞表面CTLA4を含む細胞を提供すること、
(b)前記(b)の細胞を抗CTLA4抗体候補と接触させること、
(c)インキュベーションの期間後、細胞表面CTLA4の量を検出すること、及び
(d)工程(c)の細胞表面CTLA4の量を閾値レベルと比較することであって、前記閾値レベルは、コントロール抗CTLA4抗体と接触させた細胞からの細胞表面CTLA4の量である、前記比較すること、を含み、
細胞表面CTLA4の量が前記閾値レベルよりも多い場合に、前記抗CTLA4抗体候補は、誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗CTLA4抗体であると特定される、
誘発する免疫療法関連有害事象のレベルがより低い抗CTLA4抗体を特定する方法。 - 前記コントロール抗CTLA4抗体がイピリムマブ又はトレメリムマブである、請求項10に記載の方法。
- 前記工程(a)の細胞がヒトCTLA4を発現する、請求項10に記載の方法。
- 前記細胞表面CTLA4が検出可能に標識されている、請求項10に記載の方法。
- 前記検出可能な標識が蛍光タグである、請求項13に記載の方法。
- 前記蛍光タグがオレンジ色の蛍光タンパク質である、請求項14に記載の方法。
- 前記工程(c)の検出が、ウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して、前記細胞表面CTLA4の検出可能な標識の量を測定することを含む、請求項10に記載の方法。
- 前記(c)のインキュベーションが、
前記抗CTLA4抗体候補を、検出可能に標識された抗IgG抗体と接触させること、及び
前記検出可能に標識された抗IgG抗体の検出可能な標識の量をウエスタンブロット、免疫組織化学、又はフローサイトメトリーを使用して測定すること、
を含む、請求項10に記載の方法。 - 前記検出可能に標識された抗IgG抗体の検出可能な標識がAlexa488を含む、請求項17記載の方法。
- 前記細胞が、293T細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、及び制御性T細胞(Treg)からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- pH6以下の低pHでよりもpH6.5~7.5の高pHでCTLA4に対する結合親和性が高い抗CTLA4抗体。
- 前記高pHがpH7であり、前記低pHがpH4.5である、請求項20に記載の抗体。
- 前記高pHがpH7であり、前記低pHがpH5.5である、請求項20に記載の抗体。
- 免疫療法で使用するための抗CTLA4抗体をスクリーニング又は設計する方法であって、前記抗CTLA4抗体がリソソームでのCTLA4分解を引き起こさない、方法。
- (a)pH6.5~7.5で前記抗CTLA4抗体をCTLA4タンパク質と接触させ、前記CTLA4タンパク質への前記抗CTLA4抗体の結合量を定量すること、
(b)pH4.5~5.5で前記抗CTLA4抗体をCTLA4タンパク質と接触させ、前記CTLA4タンパク質への前記抗CTLA4抗体の結合量を定量すること、並びに
(c)(a)及び(b)における結合量を比較すること、を含み、
(b)と比較した(a)の結合量が閾値レベル以上の場合、前記抗CTLA4抗体はリソソームでのCTLA4分解を引き起こさない、請求項23に記載の方法。 - 前記(a)のpHがpH7.0であり、前記(b)のpHがpH5.5であり、前記閾値レベルが3倍である、請求項24に記載の方法。
- 前記(a)のpHがpH7.0であり、前記(b)のpHがpH4.5であり、前記閾値レベルが10倍である、請求項24に記載の方法。
- 前記抗CTLA4抗体の結合量が、前記CTLA4タンパク質への50%最大結合を達成するのに必要な抗CTLA4抗体の量である、請求項24~請求項26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗CTLA4抗体は、細胞表面で結合されていたCTLA4がエンドサイトーシス後に前記細胞表面に再循環することを可能にする、請求項23に記載の方法。
- がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、エンドソーム及びリソソームにみられるpHに対応する酸性pHにおいてCTLA4への結合が破壊される抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記抗CTLA4抗体は、pH7.0と比較してpH5.5においてCTLA4への結合が3分の1以下に減少するものである、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体は、pH7.0と比較してpH4.5においてCTLA4への結合が10分の1以下に減少するものである、請求項29に記載の方法。
- 前記抗CTLA4抗体は、イピリムマブ又はトレメリムマブと比較して、細胞表面結合CTLA4又は固定化CTLA4への結合よりも可溶性CTLA4への結合がより大きく減少するものである、請求項29に記載の方法。
- 請求項10~請求項19及び請求項23~請求項28のいずれか一項に従って同定、スクリーニング、又は設計された抗CTLA4抗体。
- がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項1~請求項8、請求項20~請求項22、及び請求項33のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
- 前記抗CTLA4抗体が抗PD-1又は抗PD-L1抗体と組み合わせて投与される、請求項34に記載の方法。
- 対象におけるがんの治療に使用するための、請求項1~請求項8、請求項20~請求項22、及び請求項33のいずれか一項に記載の抗CTLA4抗体。
- 抗PD-1又は抗PD-L1抗体と組み合わせて投与される、請求項36に記載の使用のための抗CTLA4抗体。
- がんを治療するための医薬の製造における、請求項1~請求項8、請求項20~請求項22、及び請求項33のいずれか一項に記載の抗体の使用。
- 前記抗CTLA4抗体が抗PD-1又は抗PD-L1抗体と組み合わされている、請求項38に記載の使用。
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