CN104447990B - 免疫球蛋白变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
提供了具有延长的体内半衰期,在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰的变异免疫球蛋白,及使用它们的方法。
Description
本申请是基于申请日为2009年10月13日,优先权日为2008年10月14日,申请号为200980150204.0,发明名称为:“免疫球蛋白变体及其用途”的专利申请的分案申请。
相关申请
本申请是依据37CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请,依据35USC 119(e)要求2008年10月14日提交的临时申请号61/105,086、2009年2月12日提交的临时申请号61/152,131、2009年4月22日提交的临时申请号61/171,768、和2009年6月25日提交的临时申请号61/220,514的优先权,通过述及将它们的内容收入本文。
发明领域
一般地,本发明涉及分子生物学领域。更具体地,本发明涉及具有改变的生物学特性的IgG免疫球蛋白变体及使用它们的方法。
发明背景
多年来,免疫球蛋白作为治疗剂的使用显著增多。人们对构成免疫系统的一个重要部分的免疫球蛋白(Ig)分子极感兴趣,因为它们(1)与一个多种多样的配体家族反应,(2)拥有不同效应器功能及(3)具有极大的生物学重要性。今天,基于抗体的药物的用途包括治疗癌症、自身免疫性疾病以及多种系统性和传染性疾病。还有,免疫球蛋白作为体内诊断工具,例如在诊断成像规程中是有用的。
IgG是人类和其它哺乳类中最普遍的免疫球蛋白类别,而且在多种类型的免疫疗法和诊断规程中使用。人IgG1是为了治疗最常用的抗体。当前,临床试验中的许多抗体针对肿瘤相关抗原。特别地,抗VEGF中和性抗体显示出遏制裸鼠中多种人肿瘤细胞系的生长(Kim et al.Nature 362:841-844(1993);Warren et al.J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);et al.Cancer Res.56:4032-4039(1996);Melnyk et al.CancerRes.56:921-924(1996)),及还抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管发生(Adamis etal.Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。确实,一种人源化抗VEGF抗体,贝伐单抗(Genentech,South San Francisco,CA)是第一种被美国FDA批准的,设计用于抑制血管发生的疗法。
尽管有潜力,免疫球蛋白免疫疗法的问题之一是免疫球蛋白在循环中的持久性。免疫球蛋白清除速率直接影响免疫球蛋白的量和给药频率(frequency of dosage)。升高的剂量和给药频率可在患者中引起不良作用,而且还提高医疗费用。
经由啮齿类中涉及被动免疫经胎盘或卵黄囊或经初乳自母亲转移至胎儿/新生儿(IgG经胞转的母体胎儿转移)的研究,阐明了循环中IgG异化的机制(Brambell,Lancet,ii:1087-1093,1966;Rodewald,J.Cell Biol.,71:666-670,1976;Morris et al.,In:AntigenAbsorption by the Gut,pp.3-22,1978,University Park Press,Baltimore;Jones etal.,J.Clin.Invest.,51:2916-2927,1972)。新生儿Fc受体(FcRn)在哺乳类中IgG的胞转和稳态中发挥重要作用。FcRn在结构上与主要组织相容性复合物(MHC)I类分子同源,而且由跨膜α链和β2-微球蛋白(β2m)组成。先前敲除小鼠中的研究例示了IgG在FcRn或β2m缺陷小鼠中的血清半衰期大大缩短(Roopenian et al.,J Immunol 170(7),3528-3533,2003;Israel et al.,Immunology 89(4),573-578,1996),证明了FcRn在调节循环IgG水平中的保护性作用。小鼠IgG的Fc区中的多项位点特异性诱变实验导致了涉及IgG和FcRn之间相互作用的某些关键氨基酸残基的鉴定(Kim et al.,Eur.J.Immunol.,24:2429-2434,1994;Medesan et al.,Eur.J.Immunol.,26:2533,1996;Medesan et al.,J.Immunol.,158:2211-2217,1997)。另外,多份出版物记载了通过引入或修饰IgG的FcRn结合区来获得半衰期改变的生理学活性分子的方法(WO 97/43316;美国专利No.5,869,046;美国专利No.5,747,035;WO96/32478;WO2006053301;美国专利No.7,083,784;美国专利No.7,371,826)。
在分子水平,FcRn在CH2-CH3域区中结合IgG的Fc部分。Fc-FcRn相互作用是高度pH依赖性的;IgG在pH 6以高亲和力结合FcRn,但是随着pH上升至7.4,结合亲和力大大下降。此pH依赖性相互作用负责保护IgG免于降解。具体地,被胞饮的IgG在酸性内体中被FcRn捕捉,再循环回到细胞表面,然后释放回到处于生理血清pH 7.4的循环中(Ober et al.ProcNatl Acad Sci USA101(30),11076-11081,2004;Ober et al.J Immunol 172(4),2021-2029,2004;Prabhat et al.Proc Natl Acad Sci USA 104(14),5889-5894,2007)。未被FcRn结合的IgG被靶定至溶酶体并被降解。因为FcRn在调节IgG稳态中是重要的,所以经由蛋白质工程来调控Fc与FcRn之间的相互作用是用于改进治疗性抗体的药动学的一种方法(Shields et al.J Biol Chem 276(9),6591-6604,2001;Dall′Acqua et al.NatBiotechnol 15(7),637-640,1997;Dall′Acqua et al.,J Immunol 169(9),5171-5180,2002;Hinton et al.J Biol Chem 279(8),6213-6216,2004;Hinton et al.J Immunol176(1),346-356,2006;Datta-Mannan et al.Drug Metab Dispos 35(1),86-94,2007;Datta-Mannan et al.J Biol Chem 282(3),1709-1717,2007)。多项小鼠、恒河猴和猕猴中的研究证明了提高IgG的pH 6结合亲和力可延长半衰期(Dall′Acqua et al.NatBiotechnol 15(7),637-640,1997;Dall′Acqua et al.,J Immunol 169(9),5171-5180,2002;Hinton et al.J Biol Chem 279(8),6213-6216,2004;Hinton et al.J Immunol176(1),346-356,2006)。此外,其它研究还证明了在pH 7.4的FcRn结合亲和力是IgG药动学的另一项决定子。具体地,在pH 7.4对小鼠FcRn的结合亲和力升高的某些变体在小鼠中展现升高的清除(即缩短的半衰期)(Dall′Acqua et al.,J Immunol 169(9),5171-5180,2002)。不过,尚未阐明FcRn亲和力与半衰期之间的详细相关性,因为先前的研究都涉及少数变体,在FcRn亲和力的有限范围内。不清楚经由改造Fc:FcRn相互作用可实现的最大程度的半衰期延长。
尽管坚持(顺从)药物治疗是重要的,估计得到处方药物的患者一半没有以推荐方式服用药物。例如,一项最新的研究显示多达三分之一服用在过去10年中开发的乳腺癌药物的女性没有完成她们的五年推荐疗程。顺从性差的一些原因包括健忘、顺从的物理困难(例如旅行至或搬离治疗场所)、不便、不良副作用、方案复杂和药物费用。药物治疗坚持得差可导致所实现的健康福祉不及药物可提供给患者的全部。例如,不完成推荐的癌症疗程可导致疾病复发和存活机会降低。
改善药物顺从性的策略包括使它更加方便患者完成推荐的疗程。使免疫疗法处理下的患者可实现这一点的方式之一是通过延长免疫球蛋白在循环中的持续时间。免疫球蛋白清除速率直接影响免疫球蛋白的量和给药频率。因此,开发赋予延长的体内半衰期的免疫球蛋白可降低量和/或给药频率,如此将不便以及任何别的医疗费用降至最低。
因而,为了治疗,具有赋予延长的体内半衰期的经修饰免疫球蛋白会是高度有益的。本发明解决这些和其它需要,正如阅读下述公开后会显而易见的。
发明概述
本发明提供了新型IgG变体及其用途。在本发明中提供了多种IgG变体。例如,本发明公开了新型IgG变体,其包含如下的人IgG Fc区,相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、428、430、434、和436中两处或更多处的两个或更多个氨基酸替代,其中所述变体IgG与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比,具有延长的半衰期,且其中至少两处所述氨基酸替代是氨基酸残基251、252、307、308、378、428、430、434、或436处的,而且氨基酸残基251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代,氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪氨酸进行的替代,氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,氨基酸残基308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代,氨基酸残基378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代,氨基酸残基428处的氨基酸替代是用亮氨酸进行的替代,氨基酸残基430处的氨基酸替代是用丙氨酸或赖氨酸进行的替代,氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸,丝氨酸或酪氨酸进行的替代,而氨基酸残基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸251处的氨基酸替代,其中所述氨基酸251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处的氨基酸替代,其中所述氨基酸307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸308处的氨基酸替代,其中所述氨基酸308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸378处的氨基酸替代,其中所述氨基酸378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸436处的氨基酸替代,其中所述氨基酸436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述变体IgG具有比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的对FcRn的结合亲和力。
在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丝氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸252处用酪氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸378处用缬氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgGFc区包含氨基酸428处用亮氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸436处用异亮氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用酪氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代和氨基酸436处用异亮氨酸进行的氨基酸替代。
本发明还公开了新型IgG变体,其包含如下的人IgG Fc区,相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基251、252、307、308、378、380、428、430、434、和436中三处或更多处的三个或更多个氨基酸替代,其中所述变体IgG与具有野生型人IgGFc区的IgG的半衰期相比,具有延长的半衰期,且其中至少三处所述氨基酸替代是氨基酸残基251、252、307、308、378、380、428、430、434、或436处的,而且氨基酸残基251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代,氨基酸残基252处的氨基酸替代是用酪氨酸进行的替代,氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,氨基酸残基308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代,氨基酸残基378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代,氨基酸残基380处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代,氨基酸残基428处的氨基酸替代是用亮氨酸进行的替代,氨基酸残基430处的氨基酸替代是用丙氨酸或赖氨酸进行的替代,氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸或组氨酸进行的替代,而氨基酸残基436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。
在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸251处的氨基酸替代,其中所述氨基酸251处的氨基酸替代是用天冬氨酸或谷氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处的氨基酸替代,其中所述氨基酸307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸308处的氨基酸替代,其中所述氨基酸308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸378处的氨基酸替代,其中所述氨基酸378处的氨基酸替代是用缬氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸436处的氨基酸替代,其中所述氨基酸436处的氨基酸替代是用异亮氨酸进行的替代。在某些实施方案中,所述变体IgG与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比,具有更高的对FcRn的结合亲和力。
在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代、氨基酸380处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丝氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代、氨基酸380处用丙氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用丙氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgGFc区包含氨基酸252处用酪氨酸进行的氨基酸替代、氨基酸308处用脯氨酸进行的氨基酸替代和氨基酸434处用酪氨酸进行的氨基酸替代。在一个实施方案中,所述人IgG Fc区包含氨基酸251处用天冬氨酸进行的氨基酸替代、氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代和氨基酸434处用组氨酸进行的氨基酸替代。
在某些实施方案中,本发明提供了进一步包含位置297处用丙氨酸进行的氨基酸替代的变体IgG或其片段。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比,具有更高的对FcRn的结合亲和力。在某些实施方案中,所述变体IgG在pH 6.0具有比在pH 7.4更高的对FcRn的结合亲和力。在某些实施方案中,所述变体IgG是人的或人源化的IgG。在某些实施方案中,所述变体IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中,所述变体IgG的IgG Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在某些实施方案中,所述变体IgG的IgG Fc区是IgG1Fc区。
在某些实施方案中,所述变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中,所述变体IgG是贝伐单抗(bevacizumab)的变体。在某些实施方案中,所述具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,所述野生型人IgG Fc区是贝伐单抗的Fc区。在某些实施方案中,所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在某些实施方案中,所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:3)和轻链可变域(SEQ ID NO:4)。在某些实施方案中,所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:7)和轻链可变域(SEQ ID NO:8)。
本发明进一步公开了药物组合物,其包含任何本文所述变体IgG和药学可接受载体。在本文中还提供了试剂盒,其包含容器中的任何本文所述变体IgG和使用说明。
在某些实施方案中,所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比延长了至少50%、100%、150%、200%、300%或更多。在某些实施方案中,所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比延长了至少2倍。在某些实施方案中,所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比延长了至少3倍。在某些实施方案中,所述变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG相比延长了至少4倍。在某些实施方案中,所述具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,所述变体IgG的半衰期是贝伐单抗的均值半衰期。在某些实施方案中,所述贝伐单抗的均值半衰期是约10至12天(如在猕猴中测量的)或约3周(如在人中测量的)。
在某些实施方案中,提供了包含人IgG Fc区的变体IgG,其中所述人IgGFc区相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基307和434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰期,且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。在一个实施方案中,所述变体IgG是变体IgG1,其包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2),且包含如下的人IgG1Fc区,相对于野生型人IgG1 Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基307和434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG1具有与具有野生型人IgG1Fc区的IgG1的半衰期相比延长的半衰期,且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。
在另一个实施方案中,提供了包含人IgG Fc区的变体IgG,其中所述人IgG Fc区相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基307和434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰期,且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丝氨酸进行的替代。
在另一个实施方案中,提供了包含人IgG Fc区的变体IgG,其中所述人IgG Fc区相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基308和434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG1具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰期,且其中所述氨基酸残基308处的氨基酸替代是用脯氨酸进行的替代,而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代。
在另一个实施方案中,提供了包含人IgG Fc区的变体IgG,其中所述人IgG Fc区相对于野生型人IgG Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基307、380和434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰期,且其中所述氨基酸残基307处的氨基酸替代是用谷氨酰胺进行的替代,所述氨基酸残基380处的氨基酸替代是用丙氨酸进行的替代,而所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用丝氨酸进行的替代。
在某些实施方案中,上文所述包含人IgG Fc区的变体IgG具有比具有野生型人IgGFc区的IgG更高的对FcRn的结合亲和力。在某些实施方案中,所述变体IgG在pH 6.0具有比在pH 7.4更高的对FcRn的结合亲和力。在某些实施方案中,所述变体IgG是人的或人源化的IgG。在某些实施方案中,所述变体IgG是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中,所述变体IgG的IgG Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在某些实施方案中,所述变体IgG的IgGFc区是IgG1 Fc区。在某些实施方案中,所述变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中,所述变体IgG是贝伐单抗的变体。在某些实施方案中,所述具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,所述野生型人IgG Fc区是贝伐单抗的Fc区。在某些实施方案中,所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在某些实施方案中,在本文中提供了药物组合物,其包含任何包含人IgG Fc区的变体IgG和药学可接受载体。在本文中还提供了试剂盒,其包含容器中的任何包含人IgG Fc区的变体IgG和使用说明。
在某些实施方案中,提供了包含人IgG1 Fc区的变体IgG,其中所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2),且其中所述人IgG1 Fc区相对于野生型人IgG1 Fc区包含依照Kabat中的EU索引编号的氨基酸残基434处的氨基酸替代,其中所述变体IgG具有与具有野生型人IgG1Fc区的IgG的半衰期相比延长的半衰期,且所述变体IgG具有与具有野生型人IgG1 Fc区的IgG对FcRn的结合亲和力相比更高的对FcRn的结合亲和力,且其中所述氨基酸残基434处的氨基酸替代是用组氨酸的替代。在某些实施方案中,所述变体IgG是变体IgG1。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长了至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100%。在一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长了至少50%。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长了至少75%。在又一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgGFc区的IgG的半衰期相比延长了至少100%。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约15、20、25、30、35、或40天。在一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约15天。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约20天。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约25天。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约30天。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约35天。在另一个实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约40天。在某些实施方案中,所述变体IgG是变体IgG1。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是在人中测量的半衰期。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是在猕猴(cynomolgus monkey)中测量的半衰期。在某些实施方案中,所述野生型IgG或所述具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,贝伐单抗的半衰期是约10至12天(如在猕猴中测量的)或约20天(如在人中测量的)。
在本发明中提供了多种使用IgG变体的方法。提供了治疗受试者中的肿瘤的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中,所述变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中,所述变体IgG是贝伐单抗的变体。在某些实施方案中,所述方法进一步包括对所述受试者施用有效量的化疗剂。
在本发明中提供了抑制受试者中的VEGF活性的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中,所述VEGF活性是血管发生。
在本发明中提供了调控受试者中的血管通透性的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。
在本发明中提供了治疗受试者中的非新生物病症(non-neoplastic disorder)的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中,所述非新生物病症是自身免疫性疾病。在某些实施方案中,所述非新生物病症是阿尔茨海默氏病。在某些实施方案中,所述受试者诊断有老年性黄斑变性。
在本发明中提供了治疗受试者中的表达HER的肿瘤的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。在某些实施方案中,所述变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:7)和轻链可变域(SEQ ID NO:8)。
在本发明中提供了抑制或预防受试者中的癌细胞生长的方法。例如,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG。
在本发明中提供了对受试者施用有效量的变体IgG的方法。这些施用方法可以与本文所述其它方法(例如治疗方法)组合使用。在某些实施方案中,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何上文和本文所述变体IgG,且其中每4周或更长间隔对所述受试者施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每5周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每6周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每7周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每8周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每9周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每10周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每11周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,每12周或更长时间间隔施用所述变体IgG。在某些实施方案中,所述方法包括对所述受试者施用有效量的任何变体IgG,其中以比具有野生型人IgG Fc区的IgG的推荐或规定剂量频率(prescribed dosage frequency)要低的频率施用所述变体IgG。在某些实施方案中,所述具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,以比贝伐单抗的规定剂量频率要低的频率施用所述变体IgG,例如贝伐单抗的变体。
在某些实施方案中,变体IgG首先每2周施用,稍后每4周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中,变体IgG首先每3周施用,稍后每6周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中,变体IgG首先每4周施用,稍后每8周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中,变体IgG首先每5周施用,稍后每10周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中,变体IgG首先每6周施用,稍后每12周或更长时间间隔施用。在某些实施方案中,变体IgG(例如贝伐单抗的变体)首先以贝伐单抗的规定剂量频率施用,之后以比贝伐单抗的规定剂量低的频率施用。
在本文所述方法的某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中,抗VEGF抗体包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在另一个实施方案中,抗VEGF抗体是贝伐单抗的变体。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG静脉内施用于受试者。在某些实施方案中,本发明的变体IgG皮下施用于受试者。
在本文所述方法的某些实施方案中,受试者是人。在某些实施方案中,受试者诊断有癌症。在某些实施方案中,所述癌症选自下组:非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、和结肠直肠癌。
在本文中还提供了治疗受试者中的良性、癌前或非转移性癌症的方法,其包括对该受试者施用有效量的变体IgG。在某些实施方案中,变体IgG的施用预防良性、癌前、或非转移性癌症变成攻击性(invasive)或转移性癌症。例如,良性、癌前或非转移性癌症可以是0期、I期、或II期癌症,而在某些实施方案中,变体IgG的施用预防良性、癌前或非转移性癌症进展到下一期,例如I期、II期、III期或IV期癌症。在某些实施方案中,施用所述变体IgG的时间和量足以治疗受试者中的良性、癌前、或非转移性肿瘤或者预防良性、癌前、或非转移性肿瘤变成攻击性或转移性癌症。在某些实施方案中,施用变体IgG降低良性、癌前、或非转移性肿瘤的肿瘤尺寸、肿瘤负荷、或肿瘤数目。变体IgG还可以一定的量和时间施用以降低良性、癌前、或非转移性肿瘤中的血管密度。
如本文所述,本发明的方法可用于治疗例如0期(例如原位癌)、I期、或II期癌症。新辅助疗法和辅助疗法可用于治疗任何类型的癌症,例如良性或恶性。在本发明的某些实施方案中,所述癌症是实体瘤,包括但不限于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃肠癌、头颈癌、肝癌和软组织癌(例如B细胞淋巴瘤诸如NHL和多发性骨髓瘤和白血病诸如慢性淋巴细胞性白血病)。在另一个实施方案中,良性、癌前、或非转移性肿瘤是息肉、腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤、软骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、脑脊膜瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、鳞状细胞乳头状瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、胆管囊瘤(cystanoma)、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽肿、错构瘤、移行细胞乳头状瘤、唾液腺的多形(pleiomorphic)腺瘤、硬纤维瘤(desmoid tumor)、皮样囊乳头状瘤(cystpapilloma)、囊腺瘤、灶性结节性增生、或结节再生性增生。在另一个实施方案中,该方法希望用于治疗腺瘤。腺瘤的非限制性例子包括肝细胞(liver cell)腺瘤、肾腺瘤、后肾腺瘤、支气管腺瘤、肺泡(alveolar)腺瘤、肾上腺腺瘤、垂体腺瘤、甲状旁腺腺瘤、胰腺腺瘤、唾液腺腺瘤、肝细胞(hepatocellular)腺瘤、胃肠腺瘤、管状腺瘤(tubularadenoma)、和胆管腺瘤。
本发明的特征还有如下的方法,其包括对受试者施用有效量的变体IgG以预防该受试者中良性、癌前、或非转移性癌症的发生或复发。在本发明的某些实施方案中,受试者处于癌症、息肉、或癌症综合征的风险。在一个例子中,受试者具有癌症、息肉、或遗传性癌症综合征的家族史。在本发明的某些方面,受试者处于形成良性、癌前、或非转移性肿瘤的风险。在某些实施方案中,该方法预防从未具有肿瘤的受试者、从未具有临床可检测癌症的受试者、或只具有良性肿瘤的受试者中所述良性、癌前或非转移性癌症的发生或复发。
另一方面,提供了在受试者中预防癌症复发或降低癌症复发可能性的方法,其包括对该受试者施用变体IgG,其时间和量足以在该受试者中预防癌症复发或降低癌症复发可能性。本发明包括一种在具有肿瘤的受试者中预防癌症复发的方法,其包括除去该肿瘤(例如使用确定性手术(definitive surgery))及然后对该受试者施用变体IgG的步骤。本发明包括在受试者中预防肿瘤再生长的方法,其包括除去该肿瘤(例如使用确定性手术)及然后对该受试者施用变体IgG的步骤。在一个相关方面,本发明包括一种在受试者中预防癌症复发或在受试者中降低癌症复发可能性的方法,其任选包括对该受试者在手术前施用有效量的变体IgG,施用确定性手术,及在手术后施用有效量的变体IgG,其中所述在手术后施用变体IgG预防癌症复发或降低癌症复发可能性。在另一个相关方面,本发明包括一种在受试者中预防癌症复发或在受试者中降低癌症复发可能性的方法,其包括在任何别的抗癌治疗剂缺失下对该受试者施用有效量的变体IgG,其中所述施用在受试者预防癌症复发或在受试者中降低癌症复发可能性。
对于每一个上述方面,肿瘤可以是任何类型的肿瘤,包括但不限于实体瘤,特别是肿瘤和腺瘤,本文所述的。受试者可具有休眠肿瘤或微转移,其可以是或不是临床可检测的。在此方面的一个实施方案中,施用所述变体IgG,其时间和量足以降低休眠肿瘤或微转移的新血管形成。在另一个实施方案中,施用所述变体IgG,其时间和量足以预防临床可检测肿瘤或其转移的发生,或延长受试者的存活持续时间。
在一个实施方案中,变体IgG是单一疗法。在另一个实施方案中,受试者先前经历过对肿瘤的处理,例如使用抗癌疗法。在一个例子中,抗癌疗法是手术。在另一个实施方案中,受试者可在施用变体IgG之前、期间(例如同时)、或之后进一步用别的抗癌疗法处理。抗癌疗法的例子包括但不限于手术、放射疗法(放疗)、生物疗法、免疫疗法、化疗、或这些疗法的组合。
在受试者经历过确定性手术的实施方案中,变体IgG一般在受试者自手术恢复一段时间之后施用。此时间段可包括伤口愈合或手术切口愈合所需要的时段、降低伤口开裂的风险所需要的时间段、或受试者回到与手术前的健康水平相比本质上相似或更好的健康水平所需要的时间段。确定性手术完成和第一次施用变体IgG之间的时段还可包括药物假期所需要的时段,其中受试者在各治疗方案间需要或要求一段时间。一般地,确定性手术完成和变体IgG疗法开始之间的时间段可包括小于1周、1周、2周、3周、4周(28天)、5周、6周、7周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、或更长。在一个实施方案中,确定性手术和施用变体IgG之间的时段大于2周且小于1年。在一个实施方案中,确定性手术和施用变体IgG之间的时段大于4周(28天)。
在某些实施方案中,每一个上述方面可进一步包括对受试者监测癌症复发。
本发明还提供了手术切除受试者例如人患者中可手术癌症之前新辅助疗法的方法,包括对患者施用有效量的变体IgG,其中该患者已经诊断有肿瘤或癌症。变体IgG可以单独地或与至少一种化疗剂组合地施用。
本发明还包括一种治疗有可手术癌症的受试者的方法,其包括在手术之前对该受试者施用有效量的变体IgG,然后实施手术,由此切除癌症。在一个实施方案中,该方法进一步包括在手术之后对该受试者施用有效量的变体IgG以预防癌症复发。
在另一个方面,本发明关注一种新辅助疗法的方法,包括在确定性手术之前对有可手术癌症的受试者施用有效量的变体IgG和至少一种化疗剂。
在另一个方面,本发明包括一种在具有不可切除肿瘤的受试者中缩小肿瘤尺寸的方法,包括对该受试者施用有效量的变体IgG,其中该施用缩小肿瘤尺寸,由此容许完全切除肿瘤。在一个实施方案中,该方法进一步包括在完全切除肿瘤之后对该受试者施用有效量的变体IgG。
在另一个方面,本发明关注一种在受试者中治疗癌症的方法,包括下述步骤:a)包含多个处理周期的第一阶段,其中每个周期包含以预定间隔对受试者施用有效量的变体IgG和至少一种化疗剂;b)确定性手术,由此除去癌症;和c)包含多个维持周期的第二阶段,其中每个周期包含以预定间隔在没有任何化疗剂的情况下对受试者施用有效量的变体IgG。在一个实施方案中,第一阶段包含第一多个处理周期(first plurality oftreatment cycle),其中施用变体IgG和第一化疗方案,接着是第二多个处理周期(secondplurality of treatment cycle),其中施用变体IgG和第二化疗方案。
本发明提供了方法,包括在确定性手术后对有转移性或非转移性癌症的受试者施用有效量的变体IgG。在某些实施方案中,该方法进一步包括使用至少一种化疗剂。
在一个方面,该方法包括下述步骤:a)包含多个处理周期的第一阶段,其中每个周期包括以预定间隔对受试者施用有效量的变体IgG和至少一种化疗剂;和b)包含多个维持周期的第二阶段,其中每个周期包括以预定间隔在没有任何化疗剂的情况下对受试者施用有效量的变体IgG。在一个实施方案中,第一阶段包括第一多个处理周期,其中施用变体IgG和第一化疗方案,接着是第二多个处理周期,其中施用变体IgG和第二化疗方案。
在某些实施方案中,变体IgG是结合VEGF或降低VEGF表达或生物学活性的抗VEGF抗体。抗VEGF抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、嵌合抗体、完全人的抗体、或人源化抗体。在某些实施方案中,在本发明的方法中有用的例示性抗体包括贝伐单抗G6-31、B20-4.1、B20-4.1.1、及其片段。
在某些实施方案中,变体IgG是人源化抗HER2单克隆抗体在某些实施方案中,变体IgG是嵌合抗CD20抗体抗IgE抗体抗CD20抗体、抗CD11a抗体抗Her2抗体抗oxLDL抗体、抗CD4抗体MTRX1011A、抗HCV抗体、抗IL-17A/F抗体、抗A-β抗体、抗DR6抗体、抗人巨细胞病毒(HCMV)抗体、抗HER受体家族抗体、抗组织因子抗体、MLN-02抗体、人源化抗CD 18F(ab′)2抗体、或人源化抗IgE IgG1抗体rhuMab-E25。在某些实施方案中,变体IgG是双特异性抗体,其中靶抗原是IL-4和IL-13。在某些实施方案中,变体IgG是靶向金黄色葡萄球菌表位的抗体。
虽然可以在施用变体IgG之前、期间、或之后以多种不同方式处理受试者,但是在某些实施方案中,在没有手术或化疗的情况下处理受试者。在其它实施方案中,用变体IgG进行的处理是单一疗法或对于变体IgG治疗期间的时间段是单一疗法,如临床医生所评估的或本文所述的。
在其它实施方案中,用变体IgG进行的处理与别的抗癌疗法组合,包括但不限于手术、放射疗法、化疗、区别疗法(differentiating therapy)、生物疗法、免疫疗法、血管发生抑制剂、和抗增殖化合物。用变体IgG进行的治疗还可包括上述类型的治疗方案的任何组合。在某些实施方案中,细胞毒剂、抗血管发生剂和抗增殖剂可以与变体IgG组合使用。在一个实施方案中,抗癌疗法是化疗。在某些实施方案中,所述化疗剂和变体IgG并行施用。
在某些实施方案中,本发明的方法在治疗和预防早期肿瘤,由此预防进展成更晚期,导致与晚期癌症有关的发病率和死亡率降低中是有利的。本发明的方法在预防肿瘤复发或肿瘤再生长,例如切除原发性肿瘤后持续存在的休眠肿瘤中,或者在降低或预防微转移的发生或增殖中也是有利的。
对于本发明的方法,所述癌症可以是实体瘤,例如诸如乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、肺癌、肾细胞癌、胶质瘤(例如间变性(anaplastic)星形细胞瘤、间变性少突星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、间变性少突神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤)、肾癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、类癌、头颈癌、黑素瘤、和卵巢癌。
本发明的方法还可包括对受试者监测癌症或肿瘤复发。
根据详述、附图、和权利要求,本发明的其它特征和优点会是显而易见的。
本文所述任何实施方案或任何其组合适用于本文所述发明的任何和所有变体IgG和方法。
附图简述
图1小图A-B:在pH 6.0抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF变体对人FcRn的结合。实施了两次分开的实验,其中在芯片上偶联不同水平的FcRn。对于每次实验运行,将稳态响应单位作为变体浓度的函数绘图以评估解离常数。
图2:在pH 6.0抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF变体对人FcRn的解离常数。KD是自图1所示两次不同实验运行评估的。
图3:在pH 7.4抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF变体对人FcRn的结合。将稳态响应单位作为抗VEGF变体浓度的函数作图。
图4小图A-D:抗VEGF野生型和抗VEGF变体对(A)人FcRn在pH 6.0,(B)人FcRn在pH7.4,(C)猕猴FcRn在pH 6.0及(D)猕猴FcRn在pH 7.4的结合。
图5:在pH 6.0和25℃各种抗VEGF变体对人FcRn的动力学参数和单价解离常数(KD)。结果代表三次独立实验。
图6:在pH 6.0和25℃多种抗VEGF变体对猕猴FcRn的动力学参数和单价解离常数(KD)。结果代表三次独立实验。
图7小图A-B:在不同pH(A)人FcRn和(B)猕猴FcRn对不同抗VEGF变体的解离速率(koff)。
图8:抗VEGF变体相对于抗VEGF野生型的人FcRn亲和力改善的汇总。数据是自图4和5汇总的。
图9小图A-B:(1)抗VEGF野生型及抗VEGF变体(2)N434H、(3)T307Q/N434A、(4)T307Q/N434S、(5)T307Q/E380A/N434S和(6)V308P/N434A的VEGF结合。(A)抗体的VEGF结合是通过在37℃在经VEGF-A109包被的传感器芯片上注射抗VEGF野生型和抗VEGF变体,使用3000测定的。(B)50nM和100nM注射的传感图。使每个传感器基线偏移4RU以得到更好的视图。
图10:抗VEGF野生型(贝伐单抗)和抗VEGF变体的体外HUVEC增殖抑制。人脐带血管内皮细胞(HUVEC)在存在VEGF和多种浓度的抗VEGF抗体下培养。评估培养4天后的存活力。
图11:IV单剂5mg/kg后,抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在猕猴中的药动学概况。抗体的血清浓度是通过ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差(n=12只动物/组,例外是V308P/N434A组有11只动物)。
图12:IV单剂5mg/kg后,抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在猕猴中的药动学参数。
图13:该图显示了抗VEGF野生型和五种抗VEGF变体在猕猴中的终末半衰期与pH6.0FcRn亲和力之间的相关性。误差棒代表每组11或12只动物的标准偏差。
图14小图A-B:IV单剂0.3或5mg/kg后,抗VEGF野生型和抗VEGF变体T307Q/N434A在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学概况。抗体的血清浓度是使用(A)VEGF捕捉ELISA或(B)人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。
图15:IV单剂0.3或5mg/kg后,抗VEGF野生型和抗VEGF变体T307Q/N434A在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学参数。
图16小图A-B:多剂0.3或5mg/kg后,抗VEGF变体T307Q/N434A在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学概况。抗体在第0,3,6和9天施用。抗体的血清浓度是使用(A)VEGF捕捉ELISA或(B)人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。
图17:在第0,3,6和9天IV四剂0.3或5mg/kg后,T307Q/N434A在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学参数。
图18小图A-C:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗HM-7异种移植物s.c.植入RAG2 KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5mg/kg和0.5mg/kg野生型和T307Q/N434A变体和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)HM-7肿瘤的生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(B)0.5和0.05mg/kg处理组的HM-7肿瘤生长曲线。(C)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度(抗豚草的第18天和抗VEGF处理组的第21天)。浓度是使用VEGF捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。
图19小图A-E:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗HM-7异种移植物s.c.植入RAG2 KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的一项重复功效研究。5,0.5和0.05mg/kg野生型和T307Q/N434A变体和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)HM-7肿瘤的生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(B)0.5和0.05mg/kg处理组的HM-7肿瘤生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(C)处理结束时测定的HM-7肿瘤终末重量(抗豚草的第16天,0.05mg/kg组的第19天,和其余组的第22天)。数据表述为均值±标准误差。(D)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。(E)肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值±标准偏差。
图20小图A-D:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗HM-7异种移植物s.c.植入RAG2KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的第三项功效研究。5,0.5和0.05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)处理结束时每个组的均值肿瘤体积(第22天)。数据表述为均值±标准误差。(B)HM-7肿瘤的终末重量。数据表述为均值±标准误差。(C)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用抗人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。(D)肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值±标准偏差。
图21小图A-D:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗HT-55异种移植物s.c.植入RAG2KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5,0.5和0.05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)HT-55肿瘤的生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(B)处理结束时测定的HT-55肿瘤终末重量(第35天)。数据表述为均值±标准误差。(C)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。(D)肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值±标准偏差。
图22小图A-E:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗Colo-205异种移植物s.c.植入RAG2KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠中的功效。5,0.5和0.05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)Colo-205肿瘤的生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(B)0.5和0.05mg/kg处理组的Colo-205肿瘤生长曲线。(C)处理结束时测定的Colo-205肿瘤终末重量(第38天)。数据表述为均值±标准误差。(D)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。(E)肿瘤中相对于血液中抗体浓度之比。肿瘤抗体浓度是通过测量肿瘤溶胞物总量和肿瘤溶胞物中的抗VEGF抗体量而确定的。数据表述为均值±标准偏差。
图23小图A-D:抗VEGF野生型和T307Q/N434A(QA)变体在治疗Colo-205异种移植物中的一项重复功效研究。5,0.5和0.05mg/kg野生型和T307Q/N434A和5mg/kg抗豚草对照每周两次腹膜内施用。(A)Colo-205肿瘤的生长曲线。数据表述为均值±标准误差。(B)0.5和0.05mg/kg处理组的Colo-205肿瘤生长曲线。(C)处理结束时测定的Colo-205肿瘤终末重量(第32天)。数据表述为均值±标准误差。(D)处理结束时的血清抗VEGF抗体浓度。浓度是使用人Fc捕捉ELISA测量的。数据表述为均值±标准偏差。
图24:在pH 6.0和25℃,使用BIAcore,抗HER2(曲妥单抗)IgG1 Fc变体对人FcRn的单价解离常数(KD)。结果代表两次独立实验。
图25:FcRn在不同人肿瘤细胞系中的表达水平。每种细胞系的5x106个细胞用于实验。Raji细胞(人B细胞淋巴瘤)用作阴性对照,而可溶性人FcRn蛋白(其缺失7kDa跨膜和胞质区)作为阳性对照印迹。可溶性FcRn蛋白的稀释液用作标准来定量FcRn表达水平。本文所示结果代表至少三次独立实验。
图26:抗HER2(曲妥单抗)IgG1 Fc变体对人FcRn的pH依赖性结合。变体是以L251、L314、和E430处的突变构建的。结合是在6至7.2范围的pH使用BIAcore在25℃测量的。确定变体相对于抗HER2 IgG1野生型的亲和力之比,并作为ph的函数绘图。
图27小图A-C:在(A)pH 6.0,(B)pH 7.1,和(C)pH 7.4,抗HER2(曲妥单抗)IgG1野生型、变体T307Q/N434A、变体L251D/T307Q/N434H和变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I对人FcRn的结合。结合是使用BIAcore在25℃测量的。在图27C中在pH 7.4检测不到变体L251D/T307Q/N434H对人FcRn的结合。
图28:在不同pH,人FcRn对多种抗VEGF和抗HER2变体的解离速率(koff)。抗VEGF变体为T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434S和V308P/N434A。抗HER2变体为L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I。为每种变体将在不同pH的koff值对pH进行拟合,以产生最佳拟合线的斜率(方程:log(koff)=斜率x pH+y-截距)。
发明详述
本发明涉及Fc域(包括那些在抗体、Fc融合物、和免疫粘附素中找到的)的新变体,其具有延长的体内半衰期。这些变体包含人IgG Fc区或其结合FcRn的片段,其相对于野生型人IgG Fc区含有一处或多处氨基酸修饰,该修饰提高IgG Fc区或其片段对FcRn的亲和力。
本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解,而且通常利用常规方法得以采用,诸如例如广泛应用的方法,记载于Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.;CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003));the series METHODS IN ENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames andG.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,A LABORATORYMANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987));OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;CellBiology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;Animal CellCulture(R.I.Freshney),ed.,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller andM.P.Calos,eds.,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janewayand P.TraVers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood AcademicPublishers,1995);Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita etal.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)。
除非另有定义,本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导:Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and MolecularBiology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)及March,Advanced OrganicChemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)。通过述及而完整收录本文中引用的所有参考文献,包括专利申请和出版物。
定义
为了解释本说明书的目的,应用以下定义,而且在任何适宜的时候,以单数使用的术语也会包括复数,反之亦然。应当理解本文中所使用的术语只是为了描述具体实施方案,并非意图限制。在下文所列任何定义与通过述及而收入本文的任何文件抵触的情况中,应当以下文所列定义为准。
贯穿本说明书和权利要求书,免疫球蛋白重链中的残基编号方式是如Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)(通过述及明确收入本文)中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
如本文中使用的,术语“体内半衰期”或“抗体体内半衰期”指特定类型IgG分子或其含有FcRn结合位点的片段在给定动物的循环中的生物学半衰期,而且表述为分子的循环浓度降低50%所需要的时间。在某些实施方案中,当给定IgG的浓度作为时间的函数绘图时,所述曲线通常是两阶段的,有快速的α期(其代表血管内空间和血管外空间之间所注射IgG分子的平衡)和更长的β期(其代表自血管内空间清除IgG分子)。在某些实施方案中,术语“体内半衰期”对应于IgG分子在β期中的半衰期。在某些实施方案中,给定IgG的浓度对时间曲线是三阶段的,相应分配成α期和β期,及终末清除(以γ期表示)。因此,在某些实施方案中,体内半衰期对应于终末清除期或γ期的半衰期。在某些实施方案中,给定IgG的浓度对时间曲线是单阶段的,有单个清除期。因此,在某些实施方案中,体内半衰期对应于单一清除期的半衰期。
如本文中使用的,“亲本多肽”或“野生型多肽”意指未修饰多肽、天然存在多肽、或天然存在多肽的经改造经修饰形式(其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文公开的Fc区氨基酸修饰且在效应器功能方面不同)。亲本多肽可包含天然序列Fc区或具有现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或替代)的Fc区。亲本多肽还可包含下文所述非天然氨基酸。亲本多肽可以指多肽自身、包含该亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。亲本多肽包括但不限于亲本免疫球蛋白、野生型免疫球蛋白、亲本抗体和野生型抗体。
因而,如本文中使用的,“亲本免疫球蛋白”、“亲本IgG”、“野生型免疫球蛋白”或“野生型IgG”意指未修饰免疫球蛋白、天然存在免疫球蛋白、或天然存在免疫球蛋白的经改造经修饰形式(其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文公开的Fc区氨基酸修饰且在效应器功能方面不同)。亲本免疫球蛋白可包含天然序列Fc区或具有现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或替代)的Fc区。亲本免疫球蛋白还可包含下文所述非天然氨基酸。亲本免疫球蛋白可以指免疫球蛋白自身、包含亲本免疫球蛋白的组合物、或编码它的氨基酸序列。
如本文中使用的,“亲本抗体”或“野生型抗体”意指未修饰抗体、天然存在抗体、或天然存在抗体的经改造经修饰形式(其与本文公开的变体IgG相比缺少一处或多处本文公开的Fc区氨基酸修饰且在效应器功能方面不同)。亲本抗体可包含天然序列Fc区或具有现有氨基酸序列修饰(诸如添加、删除和/或替代)的Fc区。亲本抗体还可包含下文所述非天然氨基酸。亲本抗体可以指抗体自身、包含亲本抗体的组合物、或编码它的氨基酸序列。
在某些实施方案中,“亲本IgG”、“亲本抗体”、“野生型IgG”、或“野生型抗体”包括但不限于已知的商业性的、重组生产的本文所述抗体。在某些实施方案中,野生型IgG是具有野生型人IgG Fc区的IgG。在某些实施方案中,野生型人IgG Fc区指缺少一处或多处本文公开的Fc区氨基酸修饰的Fc区。在某些实施方案中,野生型人IgG Fc区指具有一处或多处本文未公开的Fc区氨基酸修饰的Fc区。在某些实施方案中,野生型IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,野生型抗体是不含Fc区的抗体片段。在某些实施方案中,此类野生型抗体的变体IgG是Fc融合蛋白,其包含野生型抗体的Fab域片段或非抗体蛋白的一个或多个域,及包含一处或多处本文公开的Fc区修饰的Fc域片段。在某些实施方案中,野生型人IgG Fc区指具有Fc突变L251D或L251D/434H但没有其它本文中公开的Fc区氨基酸修饰的IgG Fc区。
如本文中使用的,“变体”、“变异蛋白质”或“蛋白质变体”意指由于至少一处氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质自身、包含蛋白质的组合物、或编码它的氨基酸序列。在某些实施方案中,蛋白质变体与亲本多肽相比具有至少一处氨基酸修饰,例如约1处至约10处氨基酸修饰。在某些实施方案中,蛋白质变体在IgG Fc区中具有至少2处氨基酸修饰。在某些实施方案中,蛋白质变体在IgG Fc区中具有至少3处氨基酸修饰。本文中的蛋白质变体序列会与亲本蛋白质序列优选拥有至少约80%同一性,和最优选至少约90%同一性,更优选至少约95%同一性。蛋白质变体还可包含下文定义的非天然氨基酸。术语“蛋白质变体”包括本文所述免疫球蛋白变体和抗体变体。
如本文中使用的,术语“免疫球蛋白变体”、“变异免疫球蛋白”、“变体IgG”或“IgG变体”意指由于至少一处氨基酸修饰而与亲本或野生型免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。在某些实施方案中,变体IgG相对于野生型IgG在Fc区中具有至少2处氨基酸修饰。在某些实施方案中,变体IgG相对于野生型IgG在Fc区中具有至少3处氨基酸修饰。在某些实施方案中,变体IgG是变异抗体。在某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中,变体IgG是在抗体的Fc区中包含一处或多处氨基酸修饰的贝伐单抗变体。
如本文中使用的,“抗体变体”或“变异抗体”意指由于至少一处氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体。在某些实施方案中,变异抗体相对于野生型抗体在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰。
如本文中使用的,“位置”意指蛋白质的序列中的定位。位置可以连续地,或依照已确立的形式(例如Kabat中的EU索引)来编号。
术语“含Fc区的多肽”或“Fc多肽”指包含整个或部分Fc区的多肽。例如,Fc多肽包括抗体、Fc融合物、分离的Fc、和Fc片段。
“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以消除,例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此,包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。
“氨基酸修饰”指预定氨基酸序列的氨基酸序列中的改变。例示性修饰包括氨基酸替代、插入和/或删除。在某些实施方案中,氨基酸修饰是替代。
指定位置(例如Fc区的)处的“氨基酸修饰”指指定残基的替代或删除,或指定残基附近至少一个氨基酸残基的插入。指定残基“附近”的插入意味着其一个至两个残基内的插入。插入可以在指定残基的N端或C端。
“氨基酸替代”指用另一种不同的“替换”氨基酸残基替换在预定氨基酸序列中的至少一个现有氨基酸残基。一个或多个替换残基可以是“天然存在氨基酸残基”(即由遗传密码所编码的),并且选自下组:丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);天冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰胺(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);组氨酸(His);异亮氨酸(Ile);亮氨酸(Leu);赖氨酸(Lys);甲硫氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);丝氨酸(Ser);苏氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和缬氨酸(Val)。在某些实施方案中,替换残基不是半胱氨酸。本文中氨基酸替代的定义还涵盖用一种或多种非天然存在氨基酸残基进行的替代。
“非天然存在氨基酸残基”指能够与多肽链中的相邻氨基酸残基共价结合的、在上文所列的那些天然存在氨基酸残基以外的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸及其它氨基酸残基类似物,诸如那些记载于下列文献的,Ellman et al.Meth.Enzym.202:301-336(1991);美国专利No.6,586,207;WO 98/48032;WO03/073238;美国公开No.2004-0214988A1;WO 05135727A2;WO 05/74524A2;J.W.Chin etal.,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027;J.W.Chin, &P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem 11:1135-1137;J.W.Chin,et al.,(2002),PICASUnited States of America 99:11020-11024,都通过述及而完整收录。
“氨基酸插入”指将至少一个氨基酸掺入预定氨基酸序列。虽然插入通常会由一个或两个氨基酸残基的插入组成,但是本申请涵盖更大的“肽插入”,例如约3个至约5个或甚至多达约10个氨基酸残基的插入。所插入的残基可以是上文所公开的天然存在的或非天然存在的。
“氨基酸删除”指从预定氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
在某些实施方案中,术语“延长”、“延长的半衰期”或“延长的体内半衰期”指根据标准本领域已知方法诸如本文所述那些的检测,与野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比,本发明的变体IgG的体内半衰期总体延长至少约25%,30%,40%,50%,60%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,100%,150%,200%,300%或更多。在某些实施方案中,术语延长指变体IgG的延长的体内半衰期,其中与野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG相比,延长至少约1.25X,1.5X,1.75X,2X,3X,4X,5X或10X或更多。在某些实施方案中,野生型IgG或具有野生型人IgG Fc区的IgG是贝伐单抗。在某些实施方案中,贝伐单抗的均值半衰期是约10至12天(如在猕猴中测量的)或约20天(如在人类中测量的)。
“铰链区”通常定义为自人IgG1的Glu216至Pro230的区段(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。
Fc区的“较低位置处铰链区(lower hinge region)”通常定义为紧挨着铰链区C-末端的一段残基,即Fc区的残基233-239。在本发明之前,FcγR结合一般归功于IgG Fc区的较低位置处铰链区中氨基酸残基。
“C1q”指包含供免疫球蛋白Fc区结合的位点的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶即C1r和C1s一起形成复合物C1,即补体依赖性细胞毒性(CDC)途径的第一组分。人C1q可购自例如Quidel,San Diego,Calif。
术语“结合结构域”指多肽中能结合另一分子的区域。在FcR的情况中,结合结构域可以包含其多肽链(例如其α链)中负责Fc区结合的部分。一种有用的结合结构域是FcRα链的胞外结构域。
本文中术语“抗体”以最广义使用,明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段,只要它们展现出期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的研究、诊断或治疗用途的物质,可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中,将抗体纯化至(1)根据例如Lowry法的测定,抗体重量超过95%,而在有些实施方案中,重量超过99%,(2)足以通过使用例如转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用例如考马斯蓝或银染色,达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接,而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL),而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起,而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分,其相对于免疫球蛋白的其它部分,即含有抗原结合位点的可变域,具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的CH1、CH2和CH3域及轻链的CHL域。
抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变域可以称为“VH”。轻链的可变域可以称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区,它们大多采取β-折叠片构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起,并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应器功能,诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。
根据其恒定域的氨基酸序列,来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种,称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。
如本文中使用的,术语IgG“同种型”或“亚类”意指由其恒定区的化学和抗原特征定义的任何免疫球蛋白亚类。
根据其重链恒定域的氨基酸序列,抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的,一般性描述于例如Abbas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价连接而形成的更大融合分子的一部分。
如本文中使用的,术语“IgG亚类修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转变成一种不同的、比对的IgG同种型中的相应氨基酸的氨基酸修饰。例如,因为在EU位置296处IgG1包含酪氨酸而lgG2包含苯丙氨酸,所以IgG2中的F296Y替代被认为是IgG亚类修饰。
如本文中使用的,“非天然存在修饰”意指非同种型的氨基酸修饰。例如,因为无一IgG在位置332处包含谷氨酸,所以IgG1、lgG2、IgG3、或lgG4中位置332处用谷氨酸进行的替代(332E)被认为是非天然存在修饰。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用,指基本上完整形式的抗体。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“裸抗体(裸露的抗体)”为本发明目的指未偶联细胞毒性模块或放射性标记物的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区。在某些实施方案中,抗体片段包含Fc区或部分Fc区,其包含一处或多处本文中公开的Fc区修饰。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,各自具有一个抗原结合位点,及一个剩余的“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段,它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中,双链Fv种类由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中,一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接,使得轻链和重链可以在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中,每个可变域的三个HVR相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段包含重链和轻链可变域,而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般而言,scFv多肽在VH与vI结构域之间进一步包含多肽接头,其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun,于《The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,NewYork,1994,第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VI)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对,迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对,从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003);及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体相同,除了可能以极小量存在的可能的突变,例如天然存在的突变。如此,修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中,此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体,其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如,选择过程可以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解,所选择的靶物结合序列可进一步改变,例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等,而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外,单克隆抗体制备物的优势在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。
修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征,不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如,将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成,包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature,256:495-97(1975);Hongo etal.,Hybridoma,14(3):253-260(1995),Harlow et al.,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版1988);Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu etal.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year in Immuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg et al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnol.14:826(1996);Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体,其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中,人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔、或非人灵长类动物的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中,将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成,包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法:Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boemer et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584,关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006),关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
“物种依赖性抗体”指对来自第一哺乳动物物种的抗原的结合亲和力强于对来自第二哺乳动物物种的该抗原同系物的亲和力的抗体。通常,物种依赖性抗体“特异性结合”人抗原(即结合亲和力(Kd)数值不超过大约1x10-7M,优选不超过大约1x10-8M,且最优选不超过大约1x10-9M),但是对来自第二非人哺乳动物物种的该抗原同系物的结合亲和力比对人抗原的结合亲和力弱至少大约50倍、或至少大约500倍、或至少大约1000倍。物种依赖性抗体可以是上文所定义的各种类型抗体中的任一种,但是优选人源化抗体或人抗体。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中,H3和L3展示这六个HVR的最大多样性,而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000);Johnson and Wu,于:Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上,仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature 363:446-448,(1993);Sheriffet al.Nature Struct.Biol.3:733-736,(1996)。
本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的,而且是最常用的(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷,而且得到OxfordMolecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。
HVR可包括如下“延伸的HVR”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个,可变域残基是依照Kabat等,见上文编号的。
“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的HVR残基外的那些残基。
术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.,见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统,实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸,对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest.5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.,见上文中报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明,提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明,提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(参见例如PCT公开号WO2006073941)。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案,亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可使用本领域已知的某些规程来生成。例如,Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变:例如Barbas et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813(1994);Schier et al.,Gene 169:147-155(1995);Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-9(1995);及Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。
“激动性抗体”在用于本文时指部分或完全模拟目的多肽的至少一项功能性活性的抗体。
“生长抑制性”抗体指那些阻止或降低表达抗体所结合之抗原的细胞增殖的抗体。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC);Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体)下调;和B细胞活化。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域,包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447,依照EU编号系统)可以消除,例如在生产或纯化抗体的过程中,或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而,完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。在某些实施方案中,免疫球蛋白的Fc区包含两个恒定域,即CH2和CH3。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”结构域)通常自大约氨基酸231延伸至大约氨基酸340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是,有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测该碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C-端的一段残基(即IgG的自大约氨基酸残基341至大约氨基酸残基447)。
“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括Fc受体结合;C1q结合;CDC;ADCC;吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体;BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合结构域(例如抗体可变域)联合,而且可以使用多种测定法来评估。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型);天然序列人IgG2 Fc区;天然序列人IgG3 Fc区;和天然序列人IgG4 Fc区;以及它们的天然存在变体(参见例如SEQ IDNO:11至SEQ ID NO:17)。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中,变异Fc区包含与天然序列Fc区的氨基酸序列相差一处或多处氨基酸替代的氨基酸序列。在某些实施方案中,变异Fc区与野生型IgG或野生型抗体的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代。在某些实施方案中,变异Fc区在野生型抗体的Fc区中具有两个或更多个氨基酸替代。在某些实施方案中,变异Fc区在野生型抗体的Fc区中具有三个或更多个氨基酸替代。在某些实施方案中,变异Fc区具有至少一处、两处或三处或更多处本文所述Fc区氨基酸替代。在某些实施方案中,变异Fc区在本文中与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性。在某些实施方案中,变异Fc区在本文中与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约90%的同源性。在某些实施方案中,变异Fc区在本文中与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约95%的同源性。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中,FcR是天然人FcR。在有些实施方案中,FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体),包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994);及de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。
术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997,Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997);Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997);Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004);WO 2004/92219(Hinton et al.))。
可测定人FcRn高亲和力结合多肽的体内或血清半衰期,例如在转基因小鼠中,在人中,或者在施用了具有变异Fc区的多肽的非人灵长类动物中。还可参见例如Petkova etal.International Immunology 18(12):1759-1769(2006)。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中,该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离,例如血液。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞,随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、和FcγRIII。Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的,该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
FcR结合亲和力或ADCC活性“改变”了的多肽变体指与亲本多肽或者与包含天然序列Fc区的多肽相比FcR结合活性和/或ADCC活性得到增强或减弱的多肽变体。“展示出对FcR的结合增加”的多肽变体以好于亲本多肽的亲和力结合至少一种FcR。“展示出对FcR的结合减少”的多肽变体以低于亲本多肽的亲和力结合至少一种FcR。此类展示出对FcR的结合减少的变体可拥有很少的或没有显著的对FcR的结合,例如与天然序列IgG Fc区相比0-20%对FcR的结合。
“在存在人效应细胞时比亲本抗体更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的变异Fc区的”多肽变体指在多肽变体和亲本抗体在测定中使用的量基本上相同时在体外或在体内显著更有效地介导ADCC的多肽变体。一般而言,此类变体使用本文中所披露的体外ADCC测定法来鉴定,但是涵盖用于测定ADCC活性的其它测定法或方法,例如在动物模型中。
“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd),即结合常数(Ka)的倒数来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且/或趋于容易解离,而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且/或趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法,其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
在某些实施方案中,依照本发明的“KD”、“Kd”、“Kd”或“Kd值”是通过表面等离振子共振测定法使用BIACORETM-2000或BIACORETM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和M羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量,于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%TWEEN-20的PBS(PBST)中连续稀释的多肽,例如全长抗体。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation Software version3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算。参见例如Chen et al.,J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1s-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下,测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体于25℃的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm带通)的升高或降低。
依照本发明的“结合速率”(on-rate,rate of association,association rate)或“kon”也可如上所述使用或系统(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)来测定。
短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的相似程度,以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学和/或统计学显著性。在某些实施方案中,作为参照/比较值的函数,所述两个数值之间的差异例如小于约50%,小于约40%,小于约30%,小于约20%,和/或小于约10%。
短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值之间足够高的差异程度,以致本领域技术人员将认为在用所述数值(例如Kd值)所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。在某些实施方案中,作为参照/比较分子该数值的函数,所述两个数值之间的差异例如大于约10%,大于约20%,大于约30%,大于约40%,和/或大于约50%。
就本文目的而言,“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列,或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。在有些实施方案中,预先存在的氨基酸变化的数目是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时,优选那些变化只存在于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置;例如,位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚型。通常,序列亚型是如Kabat等人,见上文的亚型。在一个实施方案中,对于VL,亚型是如Kabat等人,见上文的亚型κI。在一个实施方案中,对于VH,亚型是如Kabat等人,见上文的亚型III。
“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等人的可变重链亚型III中的氨基酸序列获得的共有序列。
“VL亚型I共有框架”包含从Kabat等人的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。
“纯化的”意味着分子以至少95%(以重量计)、或至少98%(以包含它的样品的重量计)的浓度存在于样品中。
“分离的”核酸分子指与例如该核酸分子的天然来源中通常与之关联的至少一种其它核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子进一步包括包含在通常表达该核酸分子的细胞中的核酸分子,但是所述核酸分子是以染色体外形式存在的或在染色体上的定位不同于它其天然染色体定位。
术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”,指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体,其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中,由此随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常,在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是载体的最常用形式。
如本文中使用的,“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物,包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物,或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸,诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话,对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后包含修饰,诸如偶联至标记物。其它类型的修饰包括例如“帽”,将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代,核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰,含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外,通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换,用标准保护基团保护,或活化以制备与别的核苷酸的别的连接,或者可偶联至固体或半固体支持物。5′和3′末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式,包括例如2′-氧-甲基-、2′-氧-烯丙基-、2′-氟-或2′-叠氮-核糖,碳环糖类似物,α-端基异构糖,差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖,无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案,其中磷酸酯用P(O)S(“硫代酸酯”(thioate))、P(S)S(“二硫代酸酯”(dithioate))、(O)NR2(“酰胺酯”(amidate))、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(“甲缩醛”(formacetal))替代,其中R或R′各自独立为H或者取代或未取代的烷基(1-20个C),任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸,一般是单链,一般是合成的,长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如,适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中,则它是“可操作连接的”。例如,若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein),则它与该多肽的DNA可操作连接;若启动子或增强子影响编码序列的转录,则它与该序列可操作连接;或者,若核糖体结合位点的位置促进翻译,则它与编码序列可操作连接。一般而言,“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的,而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而,增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点,则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。
在用于本文时,表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用,而且所有此类名称包括后代。如此,词语“转化子”和“(经)转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物,不管传代的次数。还应理解,所有后代在DNA内容上可能不是精确相同的,这是由于有意或无意的突变。包括与最初对转化细胞所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代。在意指不同的名称时,上下文会有清楚表述。
在用于本文时,“密码子集”指用于编码期望变异氨基酸的一套不同核苷酸三联体序列。可以通过例如固相合成来合成一套寡核苷酸,其包括呈现密码子集所提供的核苷酸三联体的所有可能组合并编码期望氨基酸组的序列。一种标准形式的密码子命名是IUB代码,其是本领域已知的且在本文中有记载。密码子集通常以3个斜体大写字母表示,例如NNK、NNS、XYZ、DVK等等。如此,“非随机密码子集”在用于本文时指编码部分、优选完全满足本文所述氨基酸选择标准的选定氨基酸的密码子集。在某些位置具有选定核苷酸“简并性”的寡核苷酸的合成是本领域众所周知的,例如TRIM法(Knappek等(1999)J.Mol.Biol.296:57-86);Garrard&Henner(1993)Gene 128:103)。此类具有某些密码子集的寡核苷酸集可以使用商品化核酸合成仪来合成(可购自例如Applied Biosystems,Foster City,CA),或者可以通过商业途径获得(例如购自Life Technologies,Rockville,MD)。因此,一套具有特定密码子集的合成寡核苷酸通常包括具有不同序列(在整个序列中由密码子集所建立的差异)的多种寡核苷酸。寡核苷酸,在依照本发明使用时,具有容许与可变域核酸模板杂交的序列,而且还可以但非必须包含可用于例如克隆目的的限制酶位点。
表述“线性抗体”指Zapata等(1995)Protein Eng,8(10):1057-1062中所描述的抗体。简言之,这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1),该区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性的,或者是单特异性的。
在用于本文时,“文库”或“库”指众多抗体或抗体片段序列(例如本发明的变体IgG),或者编码这些序列的核酸,变异氨基酸组合方面不同的序列根据本发明方法导入这些序列。
“噬菌体展示”是一种将多肽作为与外壳蛋白至少一部分的融合蛋白展示在噬菌体(例如丝状噬菌体)颗粒表面上的技术。噬菌体展示的效用在于能够对随机化蛋白质变体的大型文库快速且高效分选那些能以高亲和力与靶抗原结合的序列的实情。肽和蛋白质文库在噬菌体上的展示已经用于对数以百万计的多肽筛选那些具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示法已经用于展示小随机肽和小蛋白,其通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII融合来实现。Wells and Lowman(1992)Curr.Opin.Struct.Biol.3:355-362,及其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中,将蛋白质或肽文库与基因III或其一部分融合,并在存在野生型基因III蛋白时以低水平表达,使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或者不展示融合蛋白。亲合效应(avidity effect)相对于多价噬菌体得到了降低,使得分选基于内在的配体亲和力,而且使用噬菌粒载体,这简化了DNA操作。Lowman and Wells(1991)Methods:Acompanion to Methods in Enzymology 3:205-0216。
“噬菌粒”是具有细菌复制起点(例如Co1E1)和一个拷贝的噬菌体基因区间的质粒载体。噬菌粒可利用任何已知噬菌体,包括丝状噬菌体和λ类噬菌体。质粒一般也包含抗生素抗性的可选择标志物。克隆入这些载体的DNA区段可以像质粒一起而扩增。在给容纳这些载体的细胞提供生成噬菌体颗粒所必需的所有基因时,质粒的复制模式变成滚环复制,以生成质粒DNA的一条链的拷贝,并包装噬菌体颗粒。噬菌粒可形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。此术语包括这样的噬菌粒,它们包含与异源多肽基因连接成基因融合物的噬菌体外壳蛋白基因或其片段,使得异源多肽展示在噬菌体颗粒的表面上。
术语“噬菌体载体”指包含异源基因且能够复制的双链复制型噬菌体。噬菌体载体具有容许噬菌体复制和噬菌体颗粒形成的噬菌体复制起点。噬菌体优选是丝状噬菌体,诸如M13、f1、fd、Pf3噬菌体或其衍生物,或者是λ类噬菌体,诸如λ、21、82、424、434等或其衍生物。
在用于本文时,“溶剂可及位置”指源抗体或抗原结合片段重链和轻链可变区中根据抗体或抗原结合片段的结构、结构系综(ensemble)和/或建模结构确定为潜在触及溶剂和/或接触分子(诸如抗体特异性抗原)的氨基酸残基位置。这些位置通常发现于CDR中和蛋白质外部上。如本文所定义的抗体或抗原结合片段的溶剂可及位置可使用本领域已知的多种算法来确定。在一个实施方案中,溶剂可及位置是使用来自抗体三维模型的坐标而确定的,优选使用计算法程序,诸如InsightII程序(Accelrys,San Diego,CA)。溶剂可及位置还可以使用本领域已知的算法来确定(例如Lee and Richards(1971)J.Mol.Biol.55,379和Connolly(1983)J.Appl.Cryst.16,548)。溶剂可及位置的确定可使用适于蛋白质建模的软件和自抗体得到的三维结构信息来进行。可用于这些目的的软件包括SYBYL BiopolymerModule软件(Tripos Associates)。一般,若算法(程序)要求用户输入大小参数,计算中所使用的探针的“大小”设为半径大约1.4埃或更小。另外,Pacios(1994)Comput.Chem.18(4):377-386记载了使用供个人计算机用的软件确定溶剂可及区域和面积的方法。
关于参考多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于对比序列的适宜参数,包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而,为了本发明的目的,%氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559),并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可自Genentech公司(South San Francisco,California)得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算:
分数X/Y乘100
其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数,且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会,若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等,则A相对于B的%氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的%氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中所使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述,使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子,如Leung等(1989)Science 246:1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin,5:1806所述,及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时,来自特定物种的VEGF表示如下,hVEGF表示人VEGF,mVEGF表示鼠VEGF,等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”、“VEGF-A109”或“VEGF165”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如,截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。
“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体、VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)和结合VEGF的免疫粘附素诸如VEGF Trap。如本文中所使用的,术语“VEGF拮抗剂”明确包括结合VEGF且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子。如此,术语“VEGF活性”明确包括VEGF介导的VEGF生物学活性。
关于VEGF多肽或“VEGF活性”的术语“生物学活性”和“有生物学活性的”指与全长和/或截短的VEGF有关的物理/化学特性和生物学功能。在某些实施方案中,VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进血管发生。在某些实施方案中,VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进新血管形成。在某些实施方案中,VEGF活性为诱导和/或调控血管通透性。在某些实施方案中,VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进内皮细胞迁移和/或内皮细胞增殖。
抗VEGF中和性抗体遏制多种人肿瘤细胞系在裸鼠中的生长(Kim et al.,Nature362:841-844(1993);Warren et al.,J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);et al.,Cancer Res.56:4032-4039(1996);Melnyk et al.,Cancer Res.56:921-924(1996)),而且还抑制缺血性视网膜病症的模型中的眼内血管发生(Adamis et al.,Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。
术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体,该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。例如,本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。参见例如美国专利6,582,959,6,703,020;WO 98/45332;WO 96/30046;WO 94/10202;WO 2005/044853;EP 0666868B1;美国专利申请20030206899,20030190317,20030203409,20050112126,20050186208和20050112126;Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004);及WO2005012359。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和力。例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的Kd值结合hVEGF。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法,如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的);酶联免疫吸附测定法(ELISA);和竞争测定法(例如RIA)来测定。所述抗体可以进行其它生物学活性测定法,例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的,而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。例子包括HUVEC抑制测定法;肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692所记载的);抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362);及激动性活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物,诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E,也不会结合其它生长因子,诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中,抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体;重组人源化抗VEGF单克隆抗体(参见Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599),包括但不限于称为贝伐单抗即“bevacizumab(BV)”、也称为“rhuMAb VEGF”或的抗体。是当前商品化的。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列(包括大部分框架区)衍生自人IgG1,而大约7%的序列衍生自A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量,而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6.884.879。别的抗VEGF抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4.1),如PCT申请公开号WO 2005/012359所记载的。别的优选的抗体参见美国专利No.7,060,269,6,582,959,6,703,020;6,054,297;WO 98/45332;WO 96/30046;WO94/10202;EP 0666868B1;美国专利申请公开号2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409和20050112126;及Popkov et al.,Journal of ImmunologicalMethods 288:149-164(2004)。
如本文中使用的,术语“B20系列抗体”指结合VEGF的多肽,包括抗体。B20系列多肽包括但不限于自B20抗体或美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267(通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文)中记载的B20衍生抗体的序列衍生的抗体。在一个实施方案中,B20系列多肽为美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的B20-4.1。在另一个实施方案中,B20系列多肽为PCT公开号WO 2009/073160中记载的B20-4.1.1(通过述及明确将其完整公开内容收入本文)。
如本文中使用的,术语“G6系列多肽”指结合VEGF的多肽,包括抗体。G6系统多肽包括但不限于自G6抗体或美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的G6衍生抗体的序列衍生的抗体。如美国公开号20060280747、美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的,G6系列多肽包括但不限于G6-8、G6-23和G6-31。
“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育,例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如,血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员(VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、ephrin、德尔塔样配体4(DLL4)、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、神经纤毛蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-o)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。它还包括加速伤口愈合的因子,诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrunand D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39;Streit and Detmar(2003)Oncogene22:3172-3179;Ferrara&Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。
“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。应当理解,抗血管发生剂包括那些结合并阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的药剂。例如,抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂,例如VEGF-A的抗体、VEGF-A受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂诸如(Imatinib Mesylate)、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、(sunitinib malate)、AMG706、或那些记载于例如国际专利申请WO 2004/113304的)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂,例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39;Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3);Ferrara & Alitalo(1999)Nature Medicine5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。
“病症”指将会从使用本发明的组合物或方法进行的处理中获益的任何疾患或疾病。这包括慢性和急性病症,或者包括那些使哺乳动物趋向于所讨论病症的病理状况的疾病。可使用本发明的抗体和抗体片段来治疗的病症的非限制性例子包括本文中在“定义”下提供的多种疾病和病症。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中,细胞增殖性病症指癌症。
“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
肿瘤可以是实体瘤或者是非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的例子包括白血病(例如慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成人急性成淋巴细胞性白血病(adult acutelymphoblastic leukemia)、急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia)、成熟B细胞急性成淋巴细胞性白血病(mature B-cell acute lymphoblastic leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)、多形核细胞性白血病(polymphocyticleukemia)、或毛细胞性白血病(hairy cell leukemia))、或淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、或何杰金氏病(Hodgkin’s disease))。实体瘤包括血液、骨髓、或淋巴系统以外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分成上皮细胞起源的那些和非上皮细胞起源的那些。实体瘤的例子包括结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、胃肠道、肛门、胆囊、唇(labium)、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官、膀胱、和皮肤的肿瘤。非上皮起源的实体瘤包括肉瘤、脑瘤、和骨瘤。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌,淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端黑素瘤、结节性黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的)和梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖、脑瘤和脑癌、以及头颈癌、及相关转移。在某些实施方案中,适合于通过本发明的变体IgG来治疗的癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、类癌(carcinoid carcinoma)、头颈癌、卵巢癌、间皮瘤、和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中,癌症选自下组:小细胞肺癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌(CRC)、和肝细胞癌。还有,在一些实施方案中,癌症选自下组:非小细胞肺癌、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤和乳腺癌,包括那些癌症的转移性形式。
术语癌症涵盖增殖性病症的集合,包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、恶性肿瘤和休眠的肿瘤。良性肿瘤仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位。恶性肿瘤会侵入并损害它们周围的其它组织。它们还能获得脱离起源部位并传播至身体其它部分(转移)(通常经由血流或在淋巴结所处位置经由淋巴系统)的能力。休眠的肿瘤指静止肿瘤,其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明显。原发性肿瘤以发生它们的组织类型来分类;转移性肿瘤以衍生癌细胞的组织类型来分类。随着时间消逝,恶性肿瘤的细胞变得越来越异常,而且表现出更不像正常细胞。癌细胞外观的这种变化称作肿瘤等级(tumorgrade),而且将癌细胞描述为完全分化的(weIl-differentiated)、中度分化的(moderately-differentiated)、不良分化的(poorly-differentiated)、或未分化的(undifferentiated)。完全分化的细胞相当正常,表现为和类似它们起源的正常细胞。未分化的细胞指已经变得如此异常以致于不再可能确定其起源的细胞。
上皮癌症一般自良性肿瘤进展至侵入前阶段(例如原位癌),至恶性癌症,其渗透基底膜并侵入上皮下基质。
“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。在某些实施方案中,发育异常是高级的或癌前的。
“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤,渗透入淋巴和血管,经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶(转移)中生长。转移可以是局部的或远端的。转移是一个连续过程,视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位,该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为,而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。
“微转移”指自原发性肿瘤传播至身体其它部分的少数细胞。微转移在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言,非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。
将肿瘤或癌症称作“0期”、“I期”、“II期”、“III期”、或“IV期”指示使用本领域已知的整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)方法对肿瘤或癌症的分类。虽然实际的癌症阶段取决于癌症的类型,一般而言,0期癌症为原位病灶,I期癌症为小的局限性肿瘤,II期和III期癌症是局部高级的肿瘤,其展现出涉及局部淋巴结,而IV期癌症代表转移性癌症。每类肿瘤的具体阶段是熟练临床医生已知的。
“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症,而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。
“良性肿瘤”或“良性癌”指仍然局限于起源部位且没有能力渗透、侵入、或转移至远端部位的肿瘤。
“癌症复发”在本文中指癌症在治疗后复发,而且包括癌症在原发性器官中的复发,以及远端复发,即癌症在原发性器官以外复发。
“肿瘤休眠”指一种延长的静止状态,其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明显。休眠的肿瘤在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。
“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。
“肿瘤数目”指肿瘤的数目。
适合用本发明的抗体和抗体片段治疗的非新生物状况包括但不限于例如不想要的或异常的肥大,良性前列腺肥大,关节炎,类风湿性关节炎(RA),银屑病关节炎,神经变性性疾病(例如阿尔茨海默(Alzheimer)氏病,AIDS相关痴呆,帕金森(Parkinson)氏病,肌萎缩侧索硬化,视网膜色素变性,脊髓性肌萎缩和小脑变性),自身免疫性疾病,银屑病,银屑病斑块,结节病,动脉粥样硬化,动脉粥样硬化斑块,桥本(Hasimoto)氏甲状腺炎,血管发生性病症,眼的疾病诸如假定的眼组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosissyndrome),视网膜血管形成,糖尿病性视网膜病和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病,糖尿病性肾病,晶状体后显微组织增生,新生血管性青光眼,老年性黄斑变性,糖尿病性黄斑水肿,角膜新血管形成,角膜移植片新血管形成,角膜移植片排斥,视网膜/脉络膜新血管形成,眼角的新血管形成(发红),眼新血管疾病,血管病,涉及血管上皮细胞异常增殖的状况,血管再狭窄,格-巴(Guillain-Barre)综合征,息肉诸如结肠息肉、家族性腺瘤息肉病、鼻息肉或胃肠息肉,胃肠溃疡,婴儿肥厚性幽门狭窄,泌尿阻塞综合征,门内特里埃(Menetrier)氏病,分泌型腺瘤或蛋白质流失综合征(protein loss syndrome),纤维腺瘤,呼吸疾病,胆囊炎,神经纤维瘤病,动静脉畸形(AVM),脑膜瘤,血管瘤,血管纤维瘤,甲状腺增生(包括格雷夫斯(Grave)氏病),角膜和其它组织移植,炎性疾病,慢性炎症,肺的炎症,急性肺损伤/ARDS,败血病/脓毒症,慢性阻塞性肺病,原发性肺动脉高压,恶性肺部积液,粥样斑,烧伤、外伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿,心肌梗死所致水肿,缺血损伤,脑缺血事件后的损伤,脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部损伤/外伤有关的),由血小板聚集引起的血栓,纤维变性性或水肿性疾病诸如肝硬化,肺纤维化,carcoidosis,throiditis,系统性高粘滞综合征,滑膜炎症(synovial inflammation),RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成,骨相关病理学,诸如骨关节炎(OA)、佝偻病和骨质疏松,顽固性腹水,骨或关节发炎,骨髓发育异常综合征(Myelodysplastic Syndrome),再生障碍性贫血,肾或肝的;T细胞介导的超敏感性疾病,佩吉特(Paget)氏病,多囊性肾病,第三空间流体病(3rdspacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、慢性炎症诸如IBD(克莱恩(Crohn)氏病和溃疡性结肠炎),肾病症,肾同种异体移植物排斥,移植物抗宿主病或移植物排斥,炎性肠病,急性和慢性肾病(包括增殖性肾小球肾炎和糖尿病诱发的肾病),肾病综合征,不希望有的或异常的组织块生长(非癌症),肥胖,脂肪组织块生长,血友病性关节,肥厚性瘢痕,毛发生长的抑制,奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler Weber-Rendu)综合征,脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生,硬皮病,沙眼,血管粘连,滑膜炎,皮肤的超敏反应,皮肤病症包括银屑病和皮炎,湿疹,光老化(例如由UV照射人皮肤引起的),肥厚性瘢痕形成,生殖疾患,诸如子宫内膜异位、卵巢过刺激综合征、多囊性卵巢病、先兆子痫、功能障碍性子宫出血、或月经频多,子宫类纤维瘤,早产,腹水,心包积液(诸如与心包炎有关的),胸腔积液,内毒素性休克和真菌感染,某些微生物感染,包括选自腺病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的微生物病原体,和精神病学病症(例如精神分裂症、双相型抑郁、孤独症、和注意力缺陷障碍)。
“呼吸病”涉及呼吸系统,包括慢性支气管炎、哮喘包括急性哮喘和变应性哮喘、囊性纤维化、支气管扩张、变应性或其它鼻炎或鼻窦炎、α1-抗胰蛋白酶缺陷、咳嗽、肺气肿、肺纤维化或过度反应性气道、慢性阻塞性肺病、和慢性阻塞性肺疾病。
“自身免疫性疾病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或病症。自身免疫性疾病或病症的例子包括但不限于炎症应答,诸如炎性皮肤病,包括银屑病和皮炎(例如特应性皮炎和接触性皮炎);系统性硬皮病和硬化;与炎性肠病有关的应答(诸如克罗恩氏(Crohn)病和溃疡性结肠炎);呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合征(ARDS));皮炎;脑膜炎;脑炎;葡萄膜炎;结肠炎;肾小球肾炎;过敏状况,诸如湿疹和哮喘及涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况;动脉粥样硬化;白细胞粘着缺陷;类风湿性关节炎;系统性红斑狼疮(SLE);糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病);多发性硬化;雷诺氏(Reynaud)综合征;自身免疫性甲状腺炎;变应性脑脊髓炎;斯耶格伦氏(Sjogren)综合征;幼发型糖尿病;通常在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答;恶性贫血(阿狄森氏(Addison)病);涉及白细胞渗出的疾病;中枢神经系统(CNS)炎性病症;多器官损伤综合征;溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯氏(Coombs)阳性贫血);重症肌无力;抗原-抗体复合物介导的疾病;抗肾小球基膜病;抗磷脂综合征;过敏性神经炎;格雷夫斯氏(Graves)病;朗-伊二氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征;大疱性类天疱疮;天疱疮;自身免疫性多种内分泌腺病;莱特氏(Reiter)病;僵人综合征;贝切特氏(Behcet)病;巨细胞动脉炎;免疫复合物肾炎;IgA肾病;IgM多神经病;免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
“血管疾病或病症”在本文中指影响血管系统,包括心血管系统的各种疾病或病症。此类疾病的例子包括动脉硬化、血管再阻塞、动脉粥样硬化、手术后血管狭窄、再狭窄、血管闭塞或颈动脉阻塞性疾病、冠状动脉病、心绞痛、小血管病、高胆固醇血、高血压、和涉及血管上皮细胞增殖或功能异常的状况。
在用于本文时,“治疗”(及变化形式,诸如“处理”或“处置”)指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预,可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中,本发明的变体IgG用于延迟疾病或病症的发生/发展,或用于减缓疾病或病症的进展。
“个体”、“受试者”、或“患者”为脊椎动物。在某些实施方案中,脊椎动物为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家畜(诸如牛)、运动动物、宠物(诸如猫、犬、和马)、灵长类、小鼠和大鼠。在某些实施方案中,哺乳动物为人。
术语“药物配制剂”或“药物组合物”指其形式容许活性成分的生物学活性是有效的,且不含对会施用该配制剂的受试者产生不可接受的毒性的别的成分的制备物。此类配制剂是可以无菌的。还可参见标题为剂量、配制剂、和持续时间的部分。
“无菌”配制剂是无菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。
术语“有效量”或“治疗有效量”指在受试者中有效治疗疾病或病症的药物量。在某些实施方案中,有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本发明的物质/分子的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量涵盖该物质/分子的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。在癌症的情况中,有效量的药物可减少癌细胞的数目;缩小肿瘤的尺寸;抑制(即一定程度的减缓,典型的是阻止)癌细胞浸润入周围器官;抑制(即一定程度的减缓,典型的是阻止)肿瘤转移;一定程度的抑制肿瘤生长;容许治疗肿瘤;和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度,它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。
“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然,由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的,因此预防有效量会低于治疗有效量。
在癌前、良性、早期或晚期肿瘤的情况中,血管发生抑制剂的治疗有效量可减少癌细胞数;缩小原发性肿瘤尺寸;抑制(即一定程度的减缓,优选停止)癌细胞浸润到周围器官中;抑制(即一定程度的减缓,优选停止)肿瘤转移;一定程度的抑制或延迟肿瘤生长或肿瘤进展;和/或一定程度的减轻与病症有关的一种或多种症状。就药物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言,它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的。
术语“功效”在本文中以最广义使用,而且指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白产生期望效果的能力。在某些实施方案中,功效指在饱和水平对免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白观察到的最大效果。在某些实施方案中,功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白的EC50。在某些实施方案中,功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白的效力。在某些实施方案中,功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白对疾病的过程或持续时间产生有益效果的能力,包括本文所述临床好处。
“EC50”指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白诱导介于基线和最大值之间半途的响应的浓度。在某些实施方案中,EC50代表如下的免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白浓度,此时观察到其最大效果的50%。在某些实施方案中,EC50代表获得50%最大体内效果所需要的血浆或血清浓度。
在治疗癌症中的功效可通过检测本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物抑制或降低癌性细胞生长或转移或改善或减轻一种或多种与癌症有关的症状的能力来证明。若施用本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物后有例如癌性细胞生长或转移的降低、一种或多种与癌症有关的症状的改善、或死亡率和/或发病率的降低,则认为处理是治疗性的。还可在体外、离体、和体内测定法中对本发明的抗体、融合蛋白或组合物测试它们降低肿瘤形成的能力。对于癌症疗法,体内功效还可以例如通过评估存活的持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应的持续时间、和/或生活质量来测量。还可参见题为治疗功效的部分。
在治疗炎性病症中的功效可通过检测本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物减轻或抑制动物中的炎症或改善或减轻一种或多种与炎性病症有关的症状的能力来证明。若施用本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物后有例如炎症的减轻或一种或多种症状的缓解,则认为该处理是治疗性的。
在治疗或预防病毒感染中的功效可通过检测本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物抑制病毒复制,抑制传播或预防病毒在其宿主中存在下来,或预防、改善或减轻一种或多种与病毒感染有关的症状的能力来证明。若施用本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物后有例如病毒载量的降低、一种或多种症状的改善或死亡率和/或发病率的降低,则认为该处理是治疗性的。还可在体外和体内测定法中对本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物测试它们抑制病毒复制或降低病毒载量的能力。
在治疗或预防细菌感染中的功效可通过检测本发明的抗体、融合蛋白或组合物抑制细菌复制,或者预防、改善或减轻一种或多种与细菌感染有关的症状的能力来证明。若施用本发明的抗体、融合蛋白或组合物后有例如细菌数目的减少、一种或多种症状的改善或死亡率和/或发病率的降低,则该处理被认为是治疗性的。
临床好处可以通过评估各种终点来测量,例如一定程度地抑制疾病进展,包括减缓和完全阻滞;减少疾病发作和/或症状的数目;缩小损害尺寸;抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病细胞浸润入临近周围器官和/或组织;抑制(即减轻、减缓或完全终止)疾病扩散;减轻自身免疫应答,其可以但非必然导致疾病损害的消退或消融;一定程度地减轻与病症有关的一种或多种症状;治疗后无疾病呈现(例如无进展存活)的长度延长;总体存活延长;响应率升高;和/或治疗后给定时间点的死亡率降低。
“降低或抑制”指与参照相比降低活性、功能、和/或量。在某些实施方案中,“降低或抑制”指引起20%或更多的总体降低的能力。在另一个实施方案中,“降低或抑制”指引起50%或更多的总体降低的能力。在又一个实施方案中,“降低或抑制”指引起75%、85%、90%、95%、或更多的总体降低的能力。降低或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或尺寸、原发性肿瘤的尺寸、或血管发生性病症中血管的尺寸或数目。
“可手术的”癌症指局限于原发性器官且适合于手术的癌症。
“存活”(survival)指患者保持存活,包括无疾病存活(disease free survival)(DFS)、无进展存活(progress free survival)(PFS)和总体存活(overall survival)(OS)。存活可通过Kaplan-Meier法来评估,而且存活的任何差异可使用分层时序检验(stratified log-rank test)来计算。
“无疾病存活(DFS)”指患者自治疗启动或自初始诊断起保持一定时期活着且癌症没有复发,诸如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年、等。在本发明的一个方面,DFS依照治疗意图原则来分析,即在其指派疗法的基础上评估患者。DFS分析中使用的事件可包括局部、区域性和远端癌症复发,继发性癌症发生,及在没有在先事件(例如乳腺癌复发或第二原发性癌症)的患者中死于任何原因。
“总体存活”指患者自治疗启动或自初始诊断起保持一定时期活着,诸如约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约10年、等。
“延长存活”意味着使接受治疗的患者的DFS和/或OS相对于未接受治疗的患者或相对于对照治疗方案(诸如只用化疗剂的治疗)有延长。存活在治疗启动之后或在初始诊断之后监测至少约6个月、或至少约1年、或至少约2年、或至少约3年、或至少约4年、或至少约5年、或至少约10年、等。
术语“并行”在本文中用于指使用两种或更多种治疗剂,其中至少部分施用在时间上交叠。因而,并行施用包括如下的剂量给药方案,一种或多种药剂的施用中断后施用一种或多种其它药剂。
“单一疗法”意指如下的治疗方案,其在治疗期的过程期间只包括单一治疗剂来治疗癌症或肿瘤。在某些实施方案中,使用变体IgG的单一疗法意味着在治疗期期间在没有别的抗癌疗法的情况中施用所述变体IgG。
“维持疗法”意指为了降低疾病复发或进展的可能性而给予的治疗方案。维持疗法可提供任意长度的时间,包括长至受试者终身的延长的时段。维持疗法可在初始疗法之后或与初始或别的疗法联合提供。用于维持疗法的剂量可变化,而且可包括与其它类型的疗法使用的剂量相比降低的剂量。
“新辅助疗法(neoadjuvant therapy)”或“术前疗法”在本文中指在手术之前给予的疗法。新辅助疗法的目标是提供立即的系统治疗,若遵循手术后进行系统治疗的标准顺序,潜在根除的微转移反而会增殖。新辅助疗法还可帮助缩小肿瘤尺寸,由此容许完全切除起初可不切除的肿瘤或保留部分器官及其功能。另外,新辅助疗法容许体内评估药物功效,这可指导后续治疗的选择。
“辅助疗法”在本文中指在手术之后给予的疗法,其中检测不到残余疾病的迹象,从而来降低疾病复发的风险。辅助疗法的目标是预防癌症复发,及因此降低癌症相关死亡的机会。
在本文中,“标准护理(standard of care)”化疗指常规使用来治疗特定癌症的化疗剂。
“确定性手术”如该术语在医学界内使用的那样使用。确定性手术包括例如导致肿瘤清除或切除的规程、手术或其它,包括那些导致所有明显可见肿瘤清除或切除的。确定性手术包括例如肿瘤的完全的或治愈性的切除或完全总体切除。确定性手术包括以一个或多个阶段进行的规程,而且包括例如多阶段手术规程,其中在切除肿瘤之前实施一次或多次手术或其它规程。确定性手术包括清除或切除肿瘤,包括累及的器官、部分器官和组织,以及周围的器官,诸如淋巴结、部分器官、或组织的规程。
与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括同时(共同)施用和/或任何次序的序贯施用。
“长期”施用指与短期模式相反,以连续模式施用药剂,从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗,而是本质上周期性的。
“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂,它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常,生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇;成盐反荷离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的,可用于对哺乳动物投递药物(诸如变体IgG)的小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式,与生物膜的脂质排列相似。
术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物,其包含至少一种活性治疗剂,例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如erlotinib(TARCEVATM)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如GLEEVECTM(Imatinib Mesylate))、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。该术语意图包括:放射性同位素,例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、pb212和Lu的放射性同位素;化疗剂,例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂;酶及其片段,诸如溶核酶;抗生素;和毒素,诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,包括其片段和/或变体;及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。在某些实施方案中,变体IgG可以偶联有细胞毒剂。
“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),);β-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素类(colchicines);白桦脂酸(betulinic acid);喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan),)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱);苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinic acid);替尼泊苷(teniposide);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海绵抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard);亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素Y 1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));CDP323,一种口服α-4整联蛋白抑制剂;蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU);考布他汀(combretastatin);叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,诸如亚叶酸(folinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptinium acetate);epothilone;依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);二胺硝吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲兰(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine) 达卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”);塞替派(thiotepa);类紫杉醇(taxoids),例如帕利他塞(paclitaxel)清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chlorambucil);6-硫鸟嘌呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶呤(methotrexate);铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如)和卡铂(carboplatin);长春药类(vincas),其阻止微管蛋白聚合形成微管,包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);亚叶酸(leucovorin);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);类维A酸(retinoids),诸如维A酸(retinoic acid),包括贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、依替膦酸钠(etidronate)NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)(例如依洛替尼(erlotinib));和降低细胞增殖的VEGF-A;疫苗,诸如疫苗和基因疗法疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;拓扑异构酶1抑制剂(例如);rmRH(例如);BAY439006(sorafenib;Bayer);SU-11248(sunitinib,Pfizer);哌立福辛(perifosine),COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白体抑制剂(例如PS341);bortezomibCCI-779;tipifarnib (R11577);orafenib,ABT510;Bcl-2抑制剂,诸如oblimersen sodiumpixantrone;EGFR抑制剂;酪氨酸激酶抑制剂;丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂,诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,);法尼基转移酶抑制剂,诸如lonafamib(SCH6636,SARASARTM);及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物;以及两种或更多种上述各项的组合,诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写),及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合。
本文中所定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”,其作用于调节、降低、阻断、或抑制能促进癌症生长的激素的效果。它们自身可以是激素,包括但不限于:抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene);抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole)、来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制涉及异常(abherant)细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸,诸如例如PKC-α、Raf和H-Ras;核酶,诸如VEGF表达抑制剂(例如核酸)和HER2表达抑制剂;疫苗,诸如基因疗法疫苗,例如疫苗、疫苗和疫苗;rIL-2;拓扑异构酶1抑制剂;rmRH;长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(见美国专利No.4,675,187);及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物;以及两种或多种上述物质的组合。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞(诸如表达VEGF的细胞)生长的化合物或组合物。因此,生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(诸如表达VEGF的细胞)百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂,诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞,例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fiuorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编,《The MolecularBasis of Cancer》,第1章,题为“Cell cycle regulation,oncogenes,andantieioplastic drugs”,Murakaini等人,WB Saunders,Philadelphia,1995,例如第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定,导致对细胞中有丝分裂的抑制。
“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤,以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会,本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予,而典型的剂量范围为每天10-200个单位(戈瑞(Gray))。
疾病的“病理”包括所有危及患者康乐的现象。例如,这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长、转移、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、炎性或免疫学应答的抑制或恶化、等。
“小分子”在本文中定义为具有小于约500道尔顿的分子量。
术语“静脉内输注”指以超过约5分钟的一段时间,优选30-90分钟,将药物导入动物或人患者的静脉,尽管依照本发明,静脉内输注或可施用10小时或更短。
术语“静脉内推注”或“静脉内快速注射”指在约15分钟内或更短,优选5分钟或更短,将药物施用到动物或人的静脉中使得机体接受药物。
术语“皮下施用”指通过自药物容器的相对较慢的、持续投递,将药物导入动物或人患者的皮肤下,优选在皮肤和皮下组织间的袋内。所述袋可通过夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。
术语“皮下输注”指以一段时间,包括但不限于30分钟或更短,或者90分钟或更短,通过自药物容器的相对较慢的、持续投递,将药物导入动物或人患者的皮肤下,优选在皮肤和皮下组织间的袋内。任选的是,输注可通过植入动物或人患者皮肤下的药物投递泵的皮下植入来进行,其中所述泵以预定的一段时间,诸如30分钟、90分钟、或跨越治疗方案持续时间的一段时间,投递预定量的药物。
术语“皮下推注”指将药物施用至动物或人患者的皮肤下,其中推注药物投递优选短于约15分钟,更优选短于5分钟,最优选短于60秒。施用优选在皮肤和皮下组织间的袋内,其中所述袋可通过例如夹起或拉起皮肤并远离皮下组织来创建。
术语“标记物”在用于本文时指与多肽直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物),或者在酶标记物的情况中,可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
抗体
抗体是对特定抗原展现出结合特异性的蛋白质。天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过共价二硫键连接一条重链,而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着多个恒定域。每条轻链具有一端的一个可变域(VL)和另一端的一个恒定域;轻链的恒定域与重链的第一恒定域并列,而轻链可变域与重链可变域并列。认为特定氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面。
根据其重链恒定区的氨基酸序列,抗体或免疫球蛋白可归至不同的类。有五大类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,而且这些中的几项可进一步分成亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4;IgA1和IgA2。多种人IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4同种异型已有记载(综述见M.-P.LeFranc and G.LeFranc in:″The Human IgG Subclasses,″F.Shakib(ed.),pp.43-78,Pergamon Press,Oxford(1990))。IgG类的不同同种型,包括IgG1、IgG2s、IgG3、和IgG4,具有独特的物理、生物、和临床特性。人IgG1是最常用于治疗目的的抗体,而且大多数工程改造研究在此背景中构建。
本申请致力于包括氨基酸修饰的变体IgG免疫球蛋白,该氨基酸修饰改变IgG的生物学特性。本申请的变异免疫球蛋白包括包含经修饰Fc区的抗体,其展示与野生型抗体相比要长的体内半衰期。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长至少50%。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人IgG Fc区的IgG的半衰期相比延长至少75%。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期与具有野生型人JgG Fc区的IgG的半衰期相比延长至少100%。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约15天。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约20天。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约25天。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约30天。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约35天。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是至少约40天。在某些实施方案中,变体IgG是变体IgG1。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是在人类中测量的半衰期。在某些实施方案中,本发明的变体IgG的半衰期是在猕猴中测量的半衰期。
抗体片段
本发明涵盖抗体片段。特别感兴趣的是包含Fc区、Fc融合物和重链恒定区的抗体。在某些实施方案中,抗体片段是包含F区的变异免疫球蛋白(IgG)片段。抗体片段可以通过传统手段来生成,诸如酶促消化,或者通过重组技术来生成。
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992);及Brennan等,Science 229:81(1985))。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌,如此容许容易地生成大量的这些片段。可从噬菌体抗体库中分离抗体片段。在某些实施方案中,可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。在某些实施方案中,人源化抗体是相对于野生型IgG在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰的人源化变体IgG。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如,人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基,它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988)),即用(非人)高变区序列替代人抗体的对应序列。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567),其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中,人源化抗体通常是如下人抗体,其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法,用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(参见例如Sims等,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(参见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。
一般还希望的是,抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的,依照一种方法,通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型,这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样,可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合,从而得到期望的抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言,高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
人抗体
在某些实施方案中,本发明的人抗体是相对于野生型IgG在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰的人变体IgG。人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者,可以通过杂交瘤方法来生成人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载,例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boemer等,J.Immunol.,147:86(1991).
例如,现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature 362:255-258(1993);Bruggermann等,Year in Immunol.7:33(1993)。
基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体,其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法,它也称为“表位印记”(epitopeimprinting),如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域用人V结构域基因全集替换,产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离,其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点,即表位决定(印记(imprint))人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时,得到人抗体(参见PCT WO 93/06213,公布于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同,此技术提供完全人的抗体,它们不含非人起源的FR或CDR残基。
双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中,双特异性抗体是相对于野生型抗体在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰的双特异性抗体。在某些实施方案中,双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中,结合特异性之一针对VEGF,结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中,双特异性抗体可结合VEGF的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达VEGF的细胞。这些抗体拥有VEGF结合臂和结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。在某些抗体中,结合特异性是对于IL-4和IL-13的。可将双特异性抗体制备成全长抗体或包含Fc区的抗体片段。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上,双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达,其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等,EMBOJ.10:3655(1991)。
依照一种不同的方法,将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如,与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中,在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和,在需要时,免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
在该方法的一个实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径,因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。
依照另一种方法,可改造一对抗体分子间的界面,以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域CH3结构域。在该方法中,将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换,在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如,异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联,另一种抗体与生物素偶联。例如,此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980),及用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的,连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。
Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链恒定域(VH)和轻链恒定域(VL),所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此,迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对,由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
涵盖具有超过两个效价的抗体。例如,可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
多价抗体
多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中,二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中,抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中,多价抗体包含(或由其组成)三个至大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中,多价抗体包含(或由其组成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链),其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如,多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变域,VD2是第二可变域,Fc是Fc区的一条多肽链,X1和X2代表氨基酸或多肽,而n是0或1。例如,多肽链可包含:VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链;或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域,且任选进一步包含CL结构域。
单域抗体
在有些实施方案中,本发明的抗体是包含Fc区的单域抗体(single-domainantibody)。在某些实施方案中,单域抗体相对于野生型IgG在Fc区中具有一处或多处氨基酸修饰。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。
抗体修饰
在某些实施方案中,涵盖本文所述免疫球蛋白的氨基酸序列修饰。在某些实施方案中,修饰包含对本发明变体IgG的一处或多处氨基酸修饰。在某些实施方案中,可能希望进一步改变本发明变体IgG的结合亲和力、体内半衰期和/或其它生物学特性。在某些实施方案中,氨基酸修饰包含本文中未描述的Fc区中的一处或多处氨基酸修饰。变体IgG的经修饰氨基酸序列可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物,倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”,如Cunningham和Wells(1989)Science 244:1081-1085中所述。这里,鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基,诸如arg、asp、his、lys、和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换,以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它修饰,推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此,尽管用于引入氨基酸序列修饰的位点是预先决定的,然而突变本身的本质不必预先决定。例如,为了分析指定位点处突变的后果,在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变,并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合,长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入修饰包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此,多肽中这些三肽序列中的任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
可改变附着于变体IgG之Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的、双触角的寡糖,其一般通过N-连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如Wright等(1997)TIBTECH 15:26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸,以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对本发明变体IgG中的寡糖进行修饰以创建具有某些别的改善特性的变体IgG。在某些实施方案中,变体IgG进一步包含第297位变成丙氨酸的氨基酸替代。
例如,提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构(直接地或间接地)附着于Fc区的抗体修饰。此类修饰可具有改善的ADCC功能(参见例如美国专利申请号US 2003/0157108(Presta,L.);US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体修饰的出版物的例子包括:US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US2004/0110704;US 2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US 2003/0157108A1,Presta,L;及WO 2004/056312A1,Adams等,尤其是实施例11)和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107)。
进一步提供了具有等分寡糖的抗体修饰,例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体修饰的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等);美国专利No.6,602,684(Umana等);及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体修饰。此类抗体修饰可具有改善的CDC功能。此类抗体修饰记载于例如WO 1997/30087(Patel等);WO 1998/58964(Raju,S.);及WO 1999/22764(Raju,S.)。
在某些实施方案中,本发明涵盖了如下抗体修饰,其具有一些但非所有效应器功能,这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中,测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合(从此有可能缺乏ADCC活性),但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例(还可参见Hellstrom,I.,etal.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986);Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985);5,821,337;Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可采用非放射性测定方法(参见例如ACTITM非放射性细胞毒性测定法,其用于流式细胞术(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA);和非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活,可进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
提供了另一类具有一处或多处氨基酸替代的抗体修饰。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区,但是也涵盖FR改变。表1中“优选替代”栏显示了保守替代。表1中提供了称为“例示替代”的更实质变化,或如下文参照氨基酸分类进一步描述的。可以将氨基酸替代掺入感兴趣抗体,并筛选产物,例如筛选期望的活性,诸如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC、等等。
表1
原始残基 | 例示替代 | 优选替代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Asp,Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu;Asn | Glu |
Cys(C) | Ser;Ala | Ser |
Gln(Q) | Asn;Glu | Asn |
Glu(E) | Asp;Gln | Asp |
Gly(G) | Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
原始残基 | 例示替代 | 优选替代 |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸 | Leu |
Leu(L) | 正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Tyr |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Val;Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸 | Leu |
对抗体生物学特性的修饰可通过选择对影响以下方面的替代来实现:(a)替代区域中多肽主链的结构,例如(折叠)片或螺旋构象,(b)靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性,可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,于Biochemistry,第2版,pp.73-75,Worth Publishers,New York(1975)):
(1)非极性的:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电荷的、极性的:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性的:Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者,根据共同的侧链特性,天然存在残基可如下分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性、亲水性的:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性的:Asp、Glu;
(4)碱性的:His、Lys、Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly、Pro;
(6)芳香族的:Trp、Tyr、Phe。
非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点,或导入剩余(非保守)位点。
一类替代修饰涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。在某些实施方案中,亲本抗体是野生型对应的变体IgG(例如在其氨基酸序列中没有任何别的改变的本发明变体IgG)。通常,选择用于进一步开发的所得抗体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的(例如改进的)生物学特性。例示性的替代修饰是亲和力成熟的抗体,其可使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术而便利地生成。简而言之,将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变,在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上,作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的抗体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可进行扫描诱变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外,分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术(包括本文详述的技术)进行替代的候选位点。一旦产生这样的经修饰抗体,使用本领域已知的技术(包括本文所述的技术)对该组抗体进行筛选,可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
编码经修饰抗体(例如经修饰变体IgG)氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列修饰的情况中),或者通过对较早制备的经修饰抗体或未修饰型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
依照此描述和本领域的教导,涵盖在某些实施方案中,本发明的抗体修饰与野生型对应的变体IgG(例如在其氨基酸序列中没有任何别的改变的本发明变体IgG)相比可包含一处或多处改变。与野生型对应的变体IgG相比,包含别的改变的这些抗体修饰仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。在某些实施方案中,野生型对应的变体IgG是贝伐单抗变体。
另一方面,本发明提供了在包含Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体修饰,其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入隆起(protuberance)和在第二Fc多肽中导入空腔(cavity),其中所述隆起可位于所述空腔中,从而促进第一与第二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的,例如记载于美国专利No.5,731,168。
又一方面,可能期望创建半胱氨酸改造抗体,例如“thioMAb”,其中用半胱氨酸残基替代抗体的一个或多个残基。在某些实施方案中,被替代的残基位于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点,并可用于将抗体与其它模块(诸如药物模块或接头-药物模块)偶联,如本文中进一步描述的。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代一个或多个以下残基:轻链的V205(Kabat编号方式);重链的A118(EU编号方式);和重链Fc区的S400(EU编号方式)。
抗体衍生物
在某些实施方案中,可进一步修饰本发明的变体IgG以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。在某些实施方案中,变体IgG可偶联细胞毒剂。在某些实施方案中,结合细胞毒剂的变体IgG被细胞内化,导致偶联物在杀死它结合的癌细胞方面具有升高的治疗功效。在一个实施方案中,细胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。
在某些实施方案中,适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中,提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中,该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的,包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
生成变体IgG
变体IgG可通过本领域已知的任何方法来生成。在某些实施方案中,使用变体IgG序列来创建编码成员序列的核酸,然后可克隆入宿主细胞,表达并测定,如果需要的话。这些实践使用公知规程来进行,而且可使用的多种方法记载于Molecular Cloning--ALaboratory Manual,3rd Ed.(Maniatis,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork,2001),及Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons),都通过述及而完整收录。可将编码变体IgG的核酸掺入表达载体以表达蛋白质。表达载体通常包括与控制或调节序列、选择标志、任何融合配偶、和/或别的原件可操作连接(就是说,以功能相关性放置)的蛋白质。变体IgG可如下生成,即在适宜条件下培养经含有编码变体IgG的核酸的核酸(优选表达载体)转化的宿主细胞以诱导或引起蛋白质表达。可使用极其多种适宜的宿主细胞,包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞、和酵母。例如,可使用的多种细胞系记载于ATCC细胞系产品目录,可得自美国典型培养物保藏中心,通过述及完整收入本文。将外源核酸导入宿主细胞的方法是本领域公知的,而且会随所使用的宿主细胞而变化。
在某些实施方案中,在表达后纯化或分离变体IgG。可以以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化抗体。标准纯化方法包括层析技术、电泳、免疫学、沉淀、透析、过滤、浓缩、和层析聚焦技术。正如本领域公知的,多种天然蛋白质结合抗体,例如细菌蛋白A、G、和L,而且这些蛋白质可用于纯化。通常,纯化可使用特定融合配偶来实现。例如,蛋白质可使用谷胱甘肽树脂(如果采用GST融合的话)、Ni+2亲和层析(如果采用His标签的话)、或固定的抗flag抗体(如果使用flag标签的话)来纯化。对于合适纯化技术的一般指导,参见Antibody Purification:Principles and Practice,3rd Ed.,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994,通过述及完整收入本文。
筛选变体IgG
本发明的变体IgG可使用多种方法来筛选,包括但不限于那些使用体外测定法、体内和基于细胞的测定法、和选择技术。自动化和高通量筛选技术可用于筛选规程。筛选可采用使用融合配偶或标记物,例如免疫标记物、同位素标记物、或小分子标记物诸如荧光或量热染料。
在某些实施方案中,在体外测定法中筛选变体IgG的功能和/或生物物理特性。在某些实施方案中,对蛋白质筛选功能性,例如其催化反应的能力或其对其靶物的结合亲和力。
一类筛选方法是那些选择文库的有利成员的。所述方法在本文中称作“选择方法”,而且这些方法在本发明中用于筛选变体IgG。当使用选择方法筛选蛋白质文库时,只有那些有利的,即达到一些选择标准的文库成员得到扩增、分离、和/或观察。多种选择方法是本领域已知的,可以在本发明中用于筛选蛋白质文库。其它可用于本发明的选择方法包括不依赖展示的方法,诸如体内方法。称作“直接进化”方法的一个选择方法亚类是那些在选择期间包括交配或繁殖有利序列、并有时掺入新突变的那些方法。
在某些实施方案中,变体IgG使用一种或多种基于细胞的或体内测定法来筛选。对于此类测定法,通常外源添加纯化的或未纯化的蛋白质,使得细胞暴露于属于文库的各变体或变体集合。这些测定法通常但非总是基于变体IgG的功能;就是说,变体IgG结合其靶物及介导一些生物化学事件,例如效应器功能、配体/受体结合抑制、凋亡、等等的能力。此类测定法常常涉及监测细胞对IgG的响应,例如细胞增殖、细胞迁移、血管发生、细胞存活、细胞死亡、细胞形态改变、或转录激活诸如天然基因或报告基因的细胞表达。例如,此类测定法可测量IgG变体引发ADCC、ADCP、或CDC的能力。对于一些测定法,可能需要添加靶细胞之外的别的细胞或成分,例如血清成分或效应细胞诸如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞、等等。此类别的细胞可以来自任何生物体,优选人类、小鼠、大鼠、家兔、和猴。在某些实施方案中,抗体可抑制血管发生,而且用于监测此类活性的方法是本领域公知的。在又一个实施方案中,抗体可引起某些表达靶物的细胞系凋亡,或者它们可介导已经添加至测定体系的免疫细胞对靶细胞的攻击。用于监测细胞死亡或存活力的方法是本领域已知的,而包括使用染料、免疫化学、细胞化学、和放射性试剂。转录激活也可充当用于在基于细胞的测定法中测定功能的方法。或者,基于细胞的筛选使用已经用编码变体的核酸转化或转染的细胞来实施。就是说,不对细胞外源添加变体IgG。
变体IgG的生物学特性可在细胞、组织、和全生物体实验中表征。常常在动物中测试药物,所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、犬、猫、猪、和猴,以测量药物治疗疾病或疾病模型的功效或测量药物的药动学、毒性、和其它特性。所述动物可称作疾病模型。治疗剂常常在小鼠中测试,包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植物小鼠、和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。此类实验可提供有意义数据来确定蛋白质用作治疗剂的潜力。任何生物体,优选哺乳动物,可用于测试。例如,由于其与人类的遗传相似性,猴可以是合适的治疗模型,且如此可用于测试变体IgG的功效、毒性、药动学、或其它特性。在人类中的测试是批准作为药物最终需要的,如此当然涵盖这些实验。如此,变体IgG可在人类中测试以测定其治疗功效、毒性、免疫原性、药动学、和/或其它临床特性。
变体IgG的治疗用途
变体IgG可用于极其多种产品。在某些实施方案中,IgG变体是治疗剂、诊断剂、或科研试剂。变体IgG可用于抗体组合物,其是单克隆的或多克隆的。在某些实施方案中,变体IgG用于阻断、拮抗或激动靶抗原,诸如VEGF。在某些实施方案中,变体IgG用于阻断或中和VEGF活性。在一个实施方案中,VEGF活性是血管发生。
变体IgG可用于多种治疗目的,包括但不限于治疗具有本文中“定义”下定义的新生物和/或非新生物疾病的患者。在某些实施方案中,新生物疾病是癌症。在某些实施方案中,患者首先用野生型IgG治疗,稍后用变体IgG治疗。在一个实施方案中,患者首先用贝伐单抗治疗,然后稍后用变体IgG(例如贝伐单抗变体)治疗。在某些实施方案中,患者用贝伐单抗治疗约6个月,然后稍后用变体IgG(例如贝伐单抗变体)治疗。
批准使用的、正在临床试验中的、或正在开发中的许多抗体和Fc融合物在本文中称作“临床产品和候选物”。在某些实施方案中,本发明的变体IgG可用于一系列临床产品和候选物。可修饰的抗体的例子包括但不限于能结合下述靶抗原的抗体:诸如VEGF、EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、CD20、IgE、CD11、低密度脂蛋白(LDL)、白介素4(IL-4)、白介素13(IL-13)、丙肝的表位、A-β、IL-17A、IL-17F、DR6、DR5、人巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌的表位、组织因子、α4β7整联蛋白、α5β1整联蛋白、CTLA4、CD3、RSV的表位、NFα、CD147、IL8、MUC18、MUC1、α4β1(VLA-4)整联蛋白、淋巴毒素α受体、淋巴毒素β受体(LTBR)、TGF-β2、IL-12、TGFβ1、Eotaxin 1、BAFF、TRAIL-R1、IL15、Heparanase I;CD40、CD154、CD80、CD23、巨噬细胞迁移因子(MIF)、KDR、flk-1、VE钙粘蛋白、癌胚抗原(CEA)、CD22、CTLA4、CD30、细胞间粘附分子-1、抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)、γ-干扰素、IL-12、Ep-CAM抗体和β2整联蛋白。
可修饰的临床产品和候选物的例子包括但不限于抗VEGF抗体(贝伐单抗,Genentech)(参见例如美国专利No.7,169,901,通过述及而完整收录);人源化抗HER2单克隆抗体(曲妥单抗,Genentech)(参见例如美国专利No.6,489,447,通过述及而完整收录);嵌合抗CD20抗体(利妥昔单抗,IDEC/Genentech/Roche);抗IgE抗体(omalizumab,Genentech);其它抗CD20抗体;抗CD 11a抗体(efalizumab,Genentech/Xoma);抗Her2抗体(pertuzumab,Genentech);抗oxLDL抗体(参见例如美国公开No.20040202653和WO2004030607,都通过述及而完整收录);抗CD4抗体MTRX1011A(参见例如WO 02/102853,通过述及而完整收录);靶抗原是IL-4和IL-13的双特异性抗体;抗HCV抗体;抗IL-17A/F抗体;抗A-β抗体;抗DR6抗体;抗人巨细胞病毒(HCMV)抗体;抗HER受体家族抗体;抗组织因子抗体;MLN-02抗体,针对α4β7整联蛋白的人源化IgG1单克隆抗体(以前的LDP-02,Genentech/Millennium Pharmaceuticals);人源化抗CD18F(ab′)2抗体;和人源化抗IgE IgG1抗体rhuMab-E25(Genentech/Norvartis/TanoxBiosystems)。
别的可如此修饰的临床产品和候选物包括但不限于批准用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的一种嵌合抗CD20抗体;一种抗CD20抗体HuMax-CD20(Genmab);抗CD20抗体AME-133(参见例如美国专利No.5,500,362,通过述及而完整收录,Applied MolecularEvolution);hA20(Immunomedics,Inc.),HumaLYM(Intracel),和PRO70769(PCT/US2003/040426,通过述及而完整收录)。靶向表皮生长因子受体家族成员,包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)的许多抗体也可受益于本发明所述对Fc区的修饰。例如,IgG变体可用于与下述实质性相似的抗体:(cetuximab,Imclone)(美国专利No.4,943,533;WO 96/40210,都通过述及而完整收录);在临床试验中用于多种癌症的一种嵌合抗EGFR抗体;ABX-EGF(美国专利No.6,235,883,通过述及而完整收录,Abgenix/Immunex/Amgen);HuMax-EGFr(美国流水号10/172,317,通过述及而完整收录,Genmab);425,EMD55900,EMD62000,和EMD72000(Merek KGaA)(美国专利No.5,558,864;Murthy et al.1987,Arch Biochem Biophys.252(2):549-60;Rodeck et al.,1987,JCell Biochem.35(4):315-20;Kettleborough et al.,1991,Protein Eng.4(7):773-83,都通过述及而完整收录);ICR62(Institute of Cancer Research)(WO 95/20045;Modjtahedi et al.,1993,J.Cell Biophys.1993,22(1-3):129-46;Modjtahedi et al.,1993,Br J Cancer.1993,67(2):247-53;Modjtahedi et al,1996,Br J Cancer,73(2):228-35;Modjtahedi et al,2003,Int J Cancer,105(2):273-80,都通过述及而完整收录);TheraCIM hR3(YM Biosciences,Canada和Centro de Immunologia Molecul ar,Cuba(美国专利No.5,891,996;6,506,883;Mateo et al,1997,Immunotechnology,3(1):71-81),都通过述及而完整收录);mAb-806(Ludwig Institute for Cancer Research,Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth et al.2003,Proc Natl Acad Sci USA.100(2):639-44);KSB-102(KS Biomedix,通过述及而完整收录);MR1-1(IVAX,National CancerInstitute)(WO 0162931A2,通过述及而完整收录);和SC100(Scancell)(WO 01/88138,通过述及而完整收录)。在某些实施方案中,本发明的IgG变体可用于(alemtuzumab,Genzyme Corporation),当前批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的一种人源化单克隆抗体。本发明的IgG变体可用于与其它临床产品和候选物实质性相似的多种抗体或Fc融合物,包括但不限于VEGF-Trap(Regeneron);muromonab-CD3(Orthoclone),一种抗CD3抗体(Ortho Biotech/Johnson & Johnson);抗CD20抗体(ibritumomab tiuxetan,IDEC/S chering AG);抗CD33抗体一种(p67蛋白)抗体gemtuzumab ozogamicin(Celltech/Wyeth);一种抗LFA-3Fc融合物抗体(alefacept,Biogen);(abciximab,Centocor/Lilly);(basiliximab,Novartis);(palivizumab,MedImmune);抗TNFα抗体(infliximab,Centocor);抗TNFα抗体(adalimumab,Abbott);人源化IgG4抗TNF抗体(Celltech);抗TNFα Fc融合物(etanercept,Immunex/Amgen);抗CD147抗体ABX-CBL(Abgenix);抗IL8抗体ABX-IL8(Abgenix);抗MUC18抗体ABX-MA1(Abgenix);一种抗MUC1抗体pemtumomab(R1549,90Y-muHMFG 1)(Antisoma);抗MUC 1抗体therex(R1550)(Antisoma);AngioMab(AS1405)(Antisoma);HuBC-1(Antisoma);Thioplatin(AS1407)(Antisoma);(以前的natalizumab),一种抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体(Biogen);抗VLA-1整联蛋白抗体VLA-1mAb(Biogen);抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体LTBR mAb(Biogen);抗TGF-β2抗体CAT-152(Cambridge Antibody Technology);J695,一种抗IL-12抗体(Cambridge AntibodyTechnology/Abbott);CAT-192,一种抗TGFβ1抗体(Cambridge Antibody Technology/Genzyme);CAT-213,一种抗Eotaxin 1抗体(Cambridge Antibody Technology);一种抗Blys抗体(Cambridge Antibody Technology/Human GenomeSciences Inc.;TRAIL-R1mAb,一种抗TRAIL-R1抗体(Cambridge Antibodv Technology/Human Genome Sciences,Inc.);HuMax-CD4,一种抗CD4抗体(Genmab);HuMax-IL15,一种抗IL15抗体(Genmab/Amgen);HuMax-Inflam(Genmab/Medarex);HuMax-Cancer,一种抗Heparanase I抗体(Genmab/Medarex/Oxford GlycoSciences);HuMax-淋巴瘤(Genmab/Amgen);HuMax-TAC(Genmab);IDEC-131,一种抗CD40L抗体(IDEC Pharmaceuticals);IDEC-151(clenoliximab),一种抗CD4抗体(IDEC Pharmaceuticals);IDEC-114,一种抗CD80抗体(IDEC Pharmaceuticals);IDEC-152,一种抗CD23抗体(IDEC Pharmaceuticals);抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体(IDEC Pharmaceuticals);BEC2,一种抗独特型抗体(Imclone);IMC-1C11,一种抗KDR抗体(Imclone);DC101,一种抗flk-1抗体(Imclone);抗VE钙粘蛋白抗体(Imclone);(labetuzumab),一种抗癌胚抗原(CEA)抗体(Immunomedics);(Epratuzumab),一种抗CD22抗体(Immunomedics);AFP-Cide(Immunomedics);MyelomaCide(Immunomedics);LkoCide(Immunomedics);ProstaCide(Immunomedics);MDX-010,一种抗CTLA4抗体(Medarex);MDX-060,一种抗CD30抗体(Medarex);MDX-070(Medarex);MDX-018(Medarex);(IDM-1),一种抗Her2抗体(Medarex/Immuno-Designed Molecules);CNTO 148,一种抗TNFα抗体(Medarex/Centocor/J&J);CNTO 1275,一种抗细胞因子抗体(Centocor/J&J);MOR101和MOR102,抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1,也称作CD54)抗体(MorphoSys);MOR201,一种抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体(MorphoSys);(visilizumab),一种抗CD3抗体(Protein DesignLabs);一种抗γ-干扰素抗体(Protein Design Labs);针对α5β1整联蛋白的抗体(Protein Design Labs);抗IL-12(Protein Design Labs);ING-1,一种抗Ep-CAM抗体(Xoma);和MLN01,一种抗β2整联蛋白抗体(Xoma),这一段中的所有上文所述参考文献通过述及明确收入本文。
本发明的在IgG Fc区中有修饰的变体IgG可引入上述临床候选物和产品,或被引入与它们实质性相似的抗体和Fc融合物。本发明的变体IgG还可引入上述临床候选物和产品的人源化、亲和力成熟、工程改造、或以一些其它方式修饰的形式。
在某些实施方案中,本发明的变体IgG可用于治疗良性、癌前、或非转移性癌症;用于治疗休眠的肿瘤或微转移;用于预防肿瘤复发或再生长;或用于在处于形成癌症风险的受试者中治疗或预防癌症。例如,包含本文所述Fc修饰的变体IgG可以在确定性手术之后用于辅助疗法,用于治疗具有非转移性癌症的受试者,或者用于新辅助疗法,用于治疗具有可手术癌症的受试者,其中该疗法在手术清除受试者中的可手术癌症之前提供。虽然治疗性应用在预防、新辅助疗法、和辅助疗法下分开,但是熟练技术人员会领会这些范畴并非必然互相排斥的。
肿瘤的分类
癌症分期系统描述癌症在解剖学上已经传播了多远,而且试图将具有相似预后和处理的患者置于相同分期组中。可实施数项测试来帮助癌症分期,包括活检和某些成像测试诸如胸部x-射线、乳房x射线照片、骨扫描、CT扫描、和MRI扫描。验血和临床评估也用于评估患者的整体健康和检测癌症是否已经传播至某些器官。
为了对癌症分期,美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer)首先使用TNM分类系统将癌症(特别是实体瘤)置于字母分类中。给癌症指派字母T(肿瘤尺寸)、N(可触知的结节)、和/或M(转移)。T1、T2、T3、和T4描述渐增的原发性病灶尺寸;N0、N1、N2、N3指示渐进发展中的结节累及;而M0和M1反映远端转移的存在与否。
在第二种分期方法中,也称作整体阶段分组(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging),将癌症分成0期至IV期,掺入了原发性病症的尺寸以及结节传播和远端转移的存在。在这种系统中,将病例分组成四期,以罗马数字I至IV表示,或者归类为“复发”。对于有些癌症,0期称作“原位”或“Tis”,诸如乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级腺瘤也可归类为0期。一般而言,I期癌症是小的局限性癌症,其通常是可治愈的,而IV期通常代表不能手术治疗的或转移性的癌症。II期和III期癌症通常是局部晚期的和/或展现出涉及局部淋巴结。一般而言,较高期数指示更严重的(extensive)疾病,包括更大的肿瘤尺寸和/或癌症传播至邻近原发性肿瘤的附近淋巴结和/或器官。这些阶段有精确定义,但是定义对每一种癌症是不同的,而且是熟练技术人员已知的。
许多癌症登记诸如NCI的“监视,流行病学和最终结果程序”(Surveillance,Epidemiology,and End Results Program)(SEER)使用概括分期(summary staging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病例分成五大类:
原位指只存在于它开始的细胞层中的早期癌症。
局限性的指癌症限于它开始的器官,没有传播的证据。
区域性的指癌症已经传播超出起源(原发性)部位至附近的淋巴结或器官和组织。
远端的指癌症自原发性部位传播至远端器官或远端淋巴结。
未知的用于描述没有足够信息来指明阶段的病例。
另外,癌症在原发性肿瘤被清除后几个月或几年复现是常见的。在所有可见的肿瘤都被根除后复现的癌症称作复发性疾病。在原发性肿瘤的区域中复现的疾病是局部复发的,而作为转移复现的疾病称作远端复发。休眠的肿瘤指以静止状态存在的肿瘤,其中肿瘤细胞存在但肿瘤进展在临床上不明显。微转移指自原发性肿瘤传播至身体其它部分的许多细胞或小转移。微转移在筛选或诊断测试中可以检测得到或检测不到。本发明的方法可用于预防休眠的肿瘤或微转移的发生或肿瘤的复发,例如在休眠的肿瘤或微转移存在但在临床上可检测得到或检测不到的情况下。
本发明的方法还可用于治疗早期癌症,包括但不限于良性、癌前、或非转移性肿瘤。这包括任何0、I、或II期肿瘤;任何非转移性II期肿瘤;通常在癌症前发生或发展成癌症的任何状况,包括但不限于发育异常;及保持局限于发源部位且尚未浸润、侵入、或转移至远端部位的任何肿瘤。良性、癌前、或非转移性肿瘤的例子包括息肉、腺瘤、纤维瘤、脂肪瘤、胃泌素瘤、胰岛素瘤、软骨瘤、骨瘤、血管瘤、淋巴管瘤、脑脊膜瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、鳞状细胞乳头状瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、胆管囊瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、沙眼、肉芽肿、错构瘤、移行细胞乳头状瘤、唾液腺的多形腺瘤、硬纤维瘤、皮样囊乳头状瘤、囊腺瘤、灶性结节性增生、和结节再生性增生。
因为血管发生涉及原发性肿瘤生长和转移二者,所以本发明提供的抗血管发生治疗能够抑制原发性位点处肿瘤的新生物生长以及预防继发性位点处肿瘤的转移,因此容许其它治疗攻击肿瘤。
别的关于辅助和新辅助疗法及早期肿瘤治疗的信息披露于美国申请No.12/002,605和PCT申请PCT/US2007/088000,通过述及明确这些专利申请的内容收入本文。
预防
在某些实施方案中,变体IgG可用于治疗良性、癌前、或早期癌症,或者用于治疗或预防肿瘤复发。在某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中,变体IgG是贝伐单抗变体。在一个实施方案中,变体IgG包含贝伐单抗的互补决定区。在另一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在又一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:7)和轻链可变域(SEQ ID NO:8)。
所述方法可用于治疗癌症自身或者预防癌症进展成转移性或侵入性阶段或更高级别或阶段。例如,本发明的方法可用于治疗具有0期癌症或息肉的受试者以预防进展成I期或更高阶段肿瘤。类似地,在具有II期癌症的患者中,所述方法可用于预防癌症进展成III期或IV期癌症。
变体IgG还可用于预防肿瘤复发。例如,如果肿瘤已经鉴定并治疗(例如用化疗或手术清除)的话,变体IgG可用于预防结肠直肠肿瘤的复发,或是局部的或是结肠直肠癌肿瘤的转移。对于预防肿瘤复发,变体IgG可用于例如治疗休眠的肿瘤或微转移,或者预防休眠的肿瘤或微转移生长或再生长,其在临床上可以是检测得到的或检测不到的。
在某些实施方案中,变体IgG可用于在从未具有癌症的受试者或处于癌症形成风险的受试者中预防癌症。已知有多种风险因子与癌症有关,本文描述了它们中的许多。另外,已知具有遗传癌症综合征的受试者被认为是处于癌症形成的风险。
新辅助疗法
本发明提供了受试者(例如人类患者)中可手术癌症的手术清除之前的新辅助疗法的方法,包括对患者(例如其中患者已经诊断有肿瘤和/或癌症)施用有效量的变体IgG。在某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中,变体IgG是贝伐单抗变体。在一个实施方案中,变体IgG包含贝伐单抗的互补决定区。在另一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在又一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:7)和轻链可变域(SEQ ID NO:8)。
在某些实施方案中,所述变体IgG与至少一种化疗剂组合施用。还可以与本文所述新辅助疗法一起采用在手术之后对受试者施用有效量的变体IgG的额外步骤以预防癌症复发。对于包括在手术之后对受试者施用有效量的变体IgG的额外步骤的方法,可使用任何本文所述辅助方法。
例如,一种方法包括治疗受试者中的癌症,其包括下述步骤:a)第一阶段,包括多个治疗周期,其中每个周期包括以预定间隔对受试者施用有效量的变体IgG,任选和至少一种化疗剂;b)确定性手术,由此清除癌症;和任选地,c)第二阶段,包括多个维持周期,其中每个周期包括以预定间隔在有或无任何化疗剂的情况中对受试者施用有效量的变体IgG。
在施用进度表的一个实施方案中,新辅助疗法包括第一步,其中在多个新辅助疗法周期中对患者施用变体IgG和一种或多种化疗剂,接着是决定性地清除肿瘤的手术。在某些实施方案中,新辅助疗法在手术之前持续不到1年,在一个实施方案中,不到6个月。
辅助疗法
本发明提供了辅助疗法的方法,包括对具有非转移性癌症的受试者在确定性手术之后施用变体IgG。在某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在一个实施方案中,变体IgG是贝伐单抗变体。在一个实施方案中,变体IgG包含贝伐单抗的互补决定区。在另一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ ID NO:2)。在又一个实施方案中,变体IgG包含重链可变域(SEQ ID NO:7)和轻链可变域(SEQ ID NO:8)。
例如,一种方法可包括下述步骤:a)第一阶段,包括多个处理周期,其中每个周期包括以预定间隔对受试者施用有效量的变体IgG,任选和至少一种化疗剂;和b)第二阶段,包括多个维持周期,其中每个周期包括以预定间隔在没有任何化疗剂的情况中对受试者施用有效量的变体IgG;其中组合的第一和第二阶段在初始手术后处理之后持续至少一年。在一个实施方案中,第一阶段包括第一多个处理周期,其中施用变体IgG和第一化疗方案,接着是第二多个处理周期,其中施用变体IgG和第二化疗方案。
变体IgG一般在受试者自手术恢复一段时间之后施用。此时间段可包括伤口愈合或手术切口愈合所需要的时段、降低伤口开裂的风险所需要的时段、或受试者回到与手术前的健康水平相比本质上相似或更好的健康水平所需要的时间段。确定性手术完成和第一次施用变体IgG之间的时段还可包括药物假期所需要的时段,其中受试者在各治疗方案之间需要或要求一段时间。一般地,确定性手术完成和变体IgG疗法开始之间的时间段可包括小于1周、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、或更多。在一个实施方案中,确定性手术和施用变体IgG之间的时间段大于4周(28天)且小于1年
在一个施用方案中,辅助疗法包括第一阶段,其中在多个处理周期中对患者施用变体IgG和一种或多种化疗剂;和第二阶段,其中在多个维持周期中作为单一药剂使用变体IgG。在某些实施方案中,变体IgG是贝伐单抗的变体,而且处理周期可以是8周,这意味着患者每8周接受一剂化疗和一剂变异贝伐单抗。在某些实施方案中,处理周期还可以是12周,这意味着患者每12周接受一剂化疗和一剂变异贝伐单抗。在某些实施方案中,辅助疗法自治疗启动起持续至少1年,而且会在该时间后跟踪患者的进展。所述疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
剂量、配制剂、和持续时间
变体IgG组合物会以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及施用。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。对于疾病的预防或治疗,本发明变体IgG(例如抗体)的适宜剂量(在单独使用或联合一种或多种其它别的治疗剂时)会取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。合适的是,一次性或通过一系列治疗将变体IgG施用于患者。
本文中的药物配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物,优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是,此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。
要施用的变体IgG(例如抗体)的“治疗有效量”会由本文中讨论的考虑事项来决定,而且是预防、改善、或治疗疾病或病症所必需的最小量。在某些实施方案中,要施用的变体IgG的“治疗有效量”是预防、改善、或治疗、或稳定良性、癌前、或早期癌症;或者治疗或预防肿瘤、休眠的肿瘤、或微转移发生或复发(例如在新辅助疗法或辅助疗法的情况中)所必需的最小量。变体IgG不是必须的(即任选可以)与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的变体IgG的量、病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些一般以与以前所用相同的剂量和施用路径来使用,或者以以前所采用剂量的约1-99%施用。通常,疾病或病症的改善或治疗涉及与疾病或病症有关的一种或多种症状或医学问题的减轻。在癌症的情况中,治疗有效量的药物可实现下述的一项或组合:减少癌细胞的数目;缩小肿瘤尺寸;抑制(即一定程度地降低和/或终止)癌细胞浸润入周围器官;抑制肿瘤转移;一定程度地抑制肿瘤生长;和/或一定程度地减轻与癌症有关的一种或多种症状。就药物可阻止癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言,它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。在一些实施方案中,本发明的组合物可用于预防受试者或哺乳动物中疾病或病症的发作或复发。
在某些实施方案中,治疗的持续时间会持续像医嘱指示的那样长时间或直到实现想要的治疗效果(例如本文所述那些)。在某些实施方案中,变体IgG疗法持续2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或长至受试者终身的时段。
通常,良性、癌前、或早期癌症的改善或治疗或者癌症(良性的或恶性的)的辅助或新辅助疗法涉及减轻一种或多种与癌症有关的症状或医学问题。治疗有效量的药物能实现下述的一项或下述的任意组合:减少(例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更多)肿瘤中癌细胞的数目;缩小肿瘤的尺寸;降低肿瘤负荷;抑制(即一定程度地降低和/或终止)癌细胞浸润如周围器官;降低肿瘤中的血管密度;抑制肿瘤转移;降低或抑制肿瘤生长或肿瘤细胞增殖;降低或预防休眠的肿瘤生长;降低或预防微转移生长或增殖;降低或预防肿瘤在治疗或清除后再生长(例如在辅助疗法中);提高或延长怀疑或诊断有良性、癌前、或非转移性肿瘤或恶性肿瘤的受试者的DFS或OS;缩小肿瘤的尺寸以容许手术(例如在新辅助疗法中);和/或一定程度地减轻一种或多种与癌症有关的症状。在一些别的实施方案中,变体IgG可用于预防受试者中癌症发生或复发。
对于疾病的预防或治疗,本发明的变体IgG的适宜剂量(在单独使用或联合一种或多种其它别的治疗剂时)会取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和进程、施用所述变体IgG是出于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对变体IgG的响应、及主治医师的判断。在某些实施方案中,合适的是,一次性或通过一系列治疗将变体IgG施用于患者。根据疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-15mg/kg)变体IgG可作为初始候选剂量施用于患者,无论例如通过一次或多次分开的施用或通过持续输注。一个典型的日剂量范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多,这取决于上文所述因素。对于几天或更长时间里的重复施用,根据状况,治疗一般会持续直到发生想要的对疾病症状的遏制。在一个实施方案中,根据状况,治疗为持续直到癌症得到治疗,如通过本文所述或本领域已知方法测量的。变体IgG的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围中。如此,一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg(或其任意组合)可施用于患者。此类剂量可间歇施用,例如每三周、每八周或每十二周(例如使得患者接受约2剂至约20剂、或例如约6剂抗体)。在某些实施方案中,可施用一个较高的初始加载剂量(loading dose),接着是一个或多个较低的剂量。在某些实施方案中,剂量方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量,接着是每周一次的约2mg/kg抗体的维持剂量。然而,其它剂量方案可以是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
在某些实施方案中,变体IgG是抗VEGF抗体。在某些实施方案中,变体IgG是贝伐单抗变体。
在某些实施方案中,由于变体IgG延长的半衰期,变体IgG的施用频率与野生型IgG的施用频率相比降低。在某些实施方案中,施用所述变体IgG的频率比野生型IgG的推荐或规定剂量频率要低。
在某些实施方案中,其中变体IgG是贝伐单抗变体,变体IgG可每4周或以更长间隔施用。在另一个实施方案中,变体IgG可每6周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可每8周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可每10周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可每12周或更长间隔地施用。
在某些实施方案中,变体IgG可以首先每2周施用,随后每4周或以更长间隔施用。在另一个实施方案中,变体IgG可以首先每2-3周施用,随后每6周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可以首先每2-4周施用,随后每8周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可以首先每2-5周施用,随后每10周或更长间隔地施用。在另一个实施方案中,变体IgG可以首先每2-6周施用,随后每12周或更长间隔地施用。在某些实施方案中,变体IgG(例如贝伐单抗变体)首先以贝伐单抗的规定剂量频率施用,稍后以比贝伐单抗的规定剂量频率要低的频率施用。在某些实施方案中,首先以规定剂量频率施用贝伐单抗,稍后以比贝伐单抗的规定剂量频率要低的频率施用贝伐单抗变体。
在某些实施方案中,所述变体IgG每14天或以更长间隔施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每21天或更长间隔地施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每28天或更长间隔地施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每60天或更长间隔地施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每月或以更长间隔施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每俩月或更长间隔地施用。在某些实施方案中,所述变体IgG每仨月或更长间隔地施用。
在某些实施方案中,患者用变体IgG和一种或多种其它治疗剂的组合来治疗。组合施用包括共施用或并行施用,其施用分开的配制剂或单一药物配制剂。所述组合施用还包括任一次序的序贯施用,其中任选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。与变体IgG组合施用的治疗剂的有效量会由内科医师或兽医斟酌。进行剂量施用和调整来实现对要治疗状况的最大管理。剂量另外会取决于诸如要使用的治疗剂的类型和所治疗的具体患者等因素。在某些实施方案中,变体IgG的合适剂量就是其野生型IgG当前使用的那些剂量,而且可以由于延长的半衰期和/或所用变体IgG和别的治疗剂的组合作用(协同作用)而降低。在某些实施方案中,抑制剂的组合加强单一抑制剂的功效。术语“加强”指治疗剂在其常用或批准剂量时功效改善。
在某些实施方案中,本文中讨论的剂量方案与化疗方案组合使用。在某些实施方案中,化疗方案涉及传统的高剂量间歇施用。在某些实施方案中,化疗剂使用更小且更频繁的剂量来施用,没有排定的中断(“节拍疗法”(metronomic therapy))。
在某些实施方案中,患者用变体IgG和一种或多种化疗剂的组合来治疗。在某些实施方案中,化疗剂可在施用变体IgG之前或之后施用。在一个实施方案中,化疗剂的至少一次施用和变体IgG的至少一次施用之间的时间是大约1个月或不足1个月。在一个实施方案中,化疗剂的至少一次施用和变体IgG的至少一次施用之间的时间是大约2周或不足2周。或者,化疗剂和变体IgG在单一配制剂或分开的配制剂中并行施用于患者。用化疗剂和变体IgG的组合进行的治疗可对患者产生导致协同或大于叠加的治疗好处。
如果施用的话,化疗剂通常以其已知剂量施用,或任选由于药物的组合作用或可归于抗代谢物化疗剂施用的负面副作用而降低。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的使用说明来使用或由熟练从业人员凭经验确定。
本文中公开了可组合的多种化疗剂,例如在“定义”部分所述的。要与变体IgG组合的化疗剂的例子包括但不限于例如类紫杉醇(taxoid)(包括多西他赛(docetaxel)和帕利他赛(paclitaxel))、长春药(vinca)(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine))、铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin))、芳香酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrazole)、或依西美坦(exemestane))、抗雌激素(例如氟维司群(fulvestrant)或他莫西芬(tamoxifen))、依托泊苷(etoposide)、塞替派(thiotepa)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、脂质体多柔比星(liposomal doxorubicin)、PEG化脂质体多柔比星、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、或蛋白体抑制剂(例如PS342)。可施用不同化疗剂的“鸡尾酒”。
本发明的疗法的进展易于通过常规技术和测定法来监测。
在某些实施方案中,对肿瘤、休眠的肿瘤、或微转移发生或复发的治疗或预防涉及预防肿瘤或转移形成,一般在肿瘤的初始治疗或消除(例如使用抗癌疗法诸如手术、化学疗法、或放射疗法)之后。手术可留下残余的肿瘤细胞、或休眠的微转移性小节,其有潜力再激活“血管发生程序”及推动更多的指数式肿瘤生长。虽然使用临床测量或筛选并非必然能检测到休眠的肿瘤或微转移的存在,但是治疗有效量是使用临床医生已知的技术足以预防或降低可检测的休眠的肿瘤、微转移、转移、或肿瘤复发的量。在一个例子中,通过手术消除肿瘤来治疗肿瘤的受试者然后用变体IgG来治疗,并随时间监测对休眠的肿瘤、微转移、或肿瘤复发的检测。变体IgG(例如抗VEGF抗体)可以与另一抗癌疗法(例如在变体IgG之前、一起、或之后)组合施用,而且两种疗法之一或二者可继续用作维持疗法。
癌症治疗中治疗功效的别的检测方法记载于美国专利申请公开号20050186208。
本发明的变体IgG(和任何别的治疗剂)可通过任何合适的手段来施用,包括胃肠外、皮下、腹膜内、脑脊髓内、肺内、和鼻内,以及视局部治疗需要,损伤内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。在某些实施方案中,变体IgG(例如抗体)适于通过脉冲式输注来施用,特别是使用递减剂量的变体IgG。部分取决于施药是短期的还是长期的,可以通过任何合适的途径例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射来决定给药剂量方案。在某些实施方案中,将所述变体IgG静脉内施用于受试者,例如作为推注或通过一段时间的持续输注。
在制备和施用本发明的变体IgG(例如抗体)时可考虑变体IgG的结合靶的位置。当变体IgG的结合靶位于脑中时,本发明的某些实施方案提供了穿过血脑屏障的变体IgG。存在着一些用于转运分子穿过血脑屏障的本领域已知办法,包括但不限于物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法、及基于受体和通道的方法。
将变体IgG(例如抗体)转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射入脑中(参见例如Papanastassiou et al.,Gene Therapy 9:398-406(2002))、间质输注/对流增强的递送(convection-enhanced delivery)(参见例如Bobo et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))和在脑中植入递送装置(参见例如Gill et al.,Nature Med.9:589-595(2003);Gliadel WafersTM,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(例如通过施用高渗的甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1 & 2,Plenum Press,N.Y.(1989)))、通过例如缓激肽或透化剂A-7透化(参见例如美国专利号5,112,596,5,268,164,5,506,206和5,686,416)和用含有编码变体IgG的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经元(参见例如美国专利公开号2003/0083299)。
基于脂质的将变体IgG(例如抗体)转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于将变体IgG包囊入偶联有与血脑屏障的血管内皮上受体结合的抗体结合片段的脂质体中(参见如美国专利申请公开号20020025313),及将变体IgG包被在低密度脂蛋白颗粒(参见如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E(参见如美国专利申请公开号20040131692)中。
基于干细胞的将变体IgG(例如抗体)转运穿过血脑屏障的方法需要遗传工程改造神经祖细胞(NPC)以表达感兴趣抗体,然后将干细胞植入要治疗的个体的脑中。参见Behrstock et al.(2005)Gene Ther.15 Dec.2005提前在线公开(报告了经遗传工程改造而表达神经营养因子GDNF的NPC在植入啮齿类和灵长类模型的脑中后降低了帕金森病的症状)。
基于受体和通道的将变体IgG(例如抗体)转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的透过性(参见如美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695、和2005/0124533);激活钾通道(参见如美国专利申请公开号2005/0089473),抑制ABC药物运载体(参见如美国专利申请公开号2003/0073713);用转铁蛋白包被抗体并调控一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见如美国专利申请公开号2003/0129186),及阳离子化抗体(参见如美国专利号5,004,697)。
包含本发明的变体IgG(例如抗体)的药物配制剂通过将具有期望纯度的变体IgG与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备,以水溶液、冻干或其它干燥配制剂的形式贮存(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,而且包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵;氯化己烷双胺;苯扎氯铵、苄索氯铵;酚、丁醇或苯甲醇;对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯;邻苯二酚;间苯二酚;环己醇;3-戊醇;和间甲酚);低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖类,诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇;成盐相反离子,诸如钠;金属复合物(如Zn-蛋白质复合物);和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington:The Science and Practice of Pharmacy 20th edition(2000)。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易地通过使用无菌滤膜过滤来实现。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质,该基质以定型产品的形式存在,例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)、及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化免疫球蛋白在体内长时间维持时,它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫-二硫化物互换而形成分子间S-S键,那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
治疗功效
变体IgG的功效可以多种方式来测量,包括但不限于本文中在“定义”下描述的方法。例如,在治疗肿瘤中的功效可通过检测变体IgG抑制或降低肿瘤生长或转移的能力来测量。在某些实施方案中,如果与使用野生型IgG的治疗所实现的肿瘤生长相比,变体IgG能够降低肿瘤生长速率的话,变体IgG具有与野生型IgG相比更高的功效。在某些实施方案中,如果变体IgG能在比野生型IgG实现对肿瘤生长的最大抑制所需要的剂量要低的IgG剂量实现相同的对肿瘤生长的最大抑制的话,变体IgG具有与野生型IgG相比更高的功效。在某些实施方案中,如果变体IgG在比野生型IgG所需要的剂量要低的IgG剂量具有抑制或降低癌性细胞生长或转移的能力的话,变体IgG具有与野生型IgG相比更高的功效。在某些实施方案中,本发明的变体IgG具有与野生型IgG相比相等或更高的功效。在某些实施方案中,本发明的变体IgG不具有与野生型IgG相比要低的功效。
本发明的治疗的功效还可通过在评估新生物或非新生物病症中常用的多种终点来测量。例如,癌症治疗可通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、总体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。因为本文所述某些药剂,诸如抗血管发生剂,靶向肿瘤血管结构,而非必然是新生物细胞本身,所以它们代表一类独特的抗癌药物,并且因此可需要独特的对药物的临床响应的测量和定义。例如,二维分析中大于50%的肿瘤缩小是宣称有响应的标准截留。然而,本发明的抑制剂可引起对转移性扩散的抑制但没有原发性肿瘤的缩小,或者可仅仅发挥肿瘤抑制效果。因而,可采用测定治疗功效的办法,包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物及经由放射学成像来测量响应。
组合疗法
本文所述治疗可以与其它治疗并行施用,即本文所述治疗可以与其它疗法或治疗剂,包括例如小分子、其它生物制品、放射疗法、手术、等一起共施用。
在某些实施方案中,IgG变体是对患者施用的唯一治疗活性剂。在某些实施方案中,IgG变体与一种或多种其它治疗剂,包括但不限于抗血管发生剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、细胞毒剂、保心药、或其它治疗剂组合施用。IgG变体可以与一种或多种别的治疗方案并行施用。在某些实施方案中,IgG变体可以与一种或多种抗体(其可以是或不是IgG变体)联合施用。在某些实施方案中,IgG变体可以与还有其它治疗技术诸如手术组合采用。
在某些实施方案中,别的药剂,例如抗癌剂或治疗剂,或抗血管发生剂,也可与变体IgG组合施用以治疗各种新生物或非新生物状况。在一个实施方案中,新生物或非新生物状况特征在于与异常或不想要的血管发生有关的病理病症。本发明的变体IgG可以与对那些目的有效的另一药剂序贯或组合施用,或是在同一组合物中或是作为分开的组合物,使用相同或不同的施用路径。
与癌症有关的抗血管发生疗法是致力于抑制提供营养以支持肿瘤生长所需要的肿瘤血管形成的癌症治疗策略。在某些实施方案中,因为血管发生涉及原发性肿瘤生长和转移二者,所以本发明提供的抗血管发生治疗能够抑制肿瘤在原发性位点的新生物生长以及预防肿瘤在继发性位点的转移,因此容许由其它治疗攻击肿瘤。在本发明的一个实施方案中,抗癌剂或抗癌治疗是抗血管发生剂。在另一个实施方案中,抗癌剂是化疗剂。
本领域已经鉴定和知道许多抗血管发生剂,包括本文中列出的那些,例如在“定义”部分列出的,及例如Carmeliet and Jain,Nature 407:249-257(2000);Ferrara etal.,Nature Reviews:Drug Discovery,3:391-400(2004);Sato Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。还可参加US Patent Publication No.20030055006。在某些实施方案中,在本发明的变体IgG以外,两种或更多种血管发生抑制剂可任选共施用于患者。
在某些实施方案中,对变体IgG的组合肿瘤疗法有用的其它治疗剂包括涉及肿瘤生长的其它因子(诸如EGFR、ErbB2(也称作Her2)、ErbB3、ErbB4、或TNF)的拮抗剂。在某些实施方案中,变体IgG可以与靶向一种或多种酪氨酸激酶受体诸如VEGF受体、FGF受体、EGF受体和PDGF受体的小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKI)组合使用。许多治疗性小分子RTKI是本领域已知的,包括但不限于vatalanib(PTK787)、erlotinibOSI-7904、ZD6474ZD6126(ANG453)、ZD1839、sunitinibsemaxanib(SU5416)、AMG706、AG013736、ImatinibMLN-518、CEP-701、PKC-412、Lapatinib(GSK572016)、AZD2171、sorafenibXL880、和CHIR-265。
本发明的特征还在于两种或更多种本发明变体IgG的组合或至少一种变体IgG与一种或多种别的抗癌疗法的组合的用途。抗癌疗法的例子包括但不限于手术、放射疗法(放疗)、生物疗法、免疫疗法、化学疗法、或这些疗法的组合。在一个实施方案中,用于前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌的抗癌疗法可以是激素疗法。另外,细胞毒剂、抗血管发生剂和抗增殖剂可以与变体IgG组合使用。在某些实施方案中,IgG变体连同化学疗法、放射疗法、或化学疗法和放射疗法二者一起施用于患者。
在某些实施方案中,变体IgG在确定性手术之后作为辅助疗法用于治疗非转移性癌症。在此例子中,变体IgG可以在有或无至少一种别的化疗剂的情况中提供。
在某些实施方案中,变体IgG在手术之前作为新辅助疗法用于治疗可手术的癌症。在此例子中,变体IgG可在有或无至少一种别的化疗剂的情况中中在手术之前提供。
在某些实施方案中,变体IgG和一种或多种其它治疗剂可同时或序贯施用,施用的量和时间足以降低或消除肿瘤、休眠的肿瘤、或微转移的发生或复发。变体IgG和一种或多种其它治疗剂可作为维持疗法来施用以预防肿瘤复发或降低肿瘤复发的可能性。
在某些实施方案中,本发明的特征在于变体IgG与一种或多种化疗剂(例如混合物)的用途。化疗剂的非限制性例子如本文中定义下所述。此类化疗剂的制备和给药方案可依照制造商的使用说明或如熟练从业人员凭经验确定的那样来使用,还可参加标题为剂量、配制剂、和持续时间的部分。
制品
在本发明的另一个方面,提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述紊乱的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成,诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或联合其它组合物有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物,而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患。在某些实施方案中,制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器,其中所述组合物包含本发明的变体IgG;和(b)其中装有组合物的第二容器,其中所述组合物包含其它细胞毒剂或其它类型的治疗剂。所述制品还可包括指示该组合物可用于治疗特定疾患的包装插页。或者/另外,所述制品还可包括第二(或第三)容器,其中装有制药学可接受的缓冲剂,诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
在某些实施方案中,变体IgG可单独地或与其它治疗性化合物组合地包装成试剂盒。在一个实施方案中,治疗性化合物是抗癌剂。所述试剂盒可包括帮助对患者施用单位剂量的任选成分,诸如用于重建粉剂形式的管形瓶、用于注射的注射器、定制IV投递系统、吸入器、等。另外,单位剂量试剂盒可含有关于制备和施用组合物的使用说明。试剂盒可制造成用于一名患者的一次使用单位剂量、用于一名特定患者的多次使用(以恒定的剂量或其中各种化合物的效力可随治疗进展而变化);或者,所述试剂盒可含有适合于对多名患者施用的多剂(“大量包装”)。试剂盒成分可在纸盒、泡罩包、瓶、管、等等中装配。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解,鉴于上文提供的一般描述,可以实施各种其它实施方案。
实施例1:抗VEGF(贝伐单抗)变体的生成
将野生型抗VEGF(贝伐单抗)IgG1重链和轻链的Fv区分开克隆入两个基于pRK的瞬时转染质粒,其含有人IgG1恒定域。然后使用基于Kunkel的定点诱变来生成所有抗VEGFIgG1变体,其中突变CH2和CH3域中的残基。此研究中生成的抗VEGF变体汇总于下文表2。每种变体含有CH2和CH3域中的单一、双重或三重突变。变体是依照Kabat中的EU索引编号的。
表2
通过(Roche,Basel,Switzerland)依照制造商的方案将含有变体的重链和野生型轻链的质粒共转染入经腺病毒转化的人胚肾细胞系293。与转染复合物一起温育24小时后,然后将经转染细胞用补充有10mg/L胰岛素和痕量元素的无血清培养基PSO4培养5天,或用含5mM谷氨酰胺的1.3XGEM N培养基培养。收集上清液,并用1M TRIS pH 8.0和5M氯化钠(NaCl)条件化,给出终浓度30mM TRIS和50mM NaCl。然后使用蛋白A层析来纯化经条件化的上清液。用0.1M甘氨酸缓冲液pH 3.0自蛋白A柱洗脱结合的IgG1。接着,将经纯化的IgG1浓缩,并注射到Superdex-200大小排阻层析柱上以除去任何聚集体。将单体IgG1级分合并到一起,稍后用于结合研究。使用280nM处的吸光度读数来计算抗VEGF野生型和抗VEGF变体IgG1浓度,而且吸光度1.5估算为1mg/ml IgG1。
实施例2:人和猕猴FcRn的生成
人FcRn是α链和β2-微球蛋白亚基的异二聚体。将这两种亚基分开克隆入两个基于pRK的瞬时转染质粒。使用(Roche,Basel,Switzerland)依照制造商的方案将含有α链和β2-微球蛋白的质粒共转染入293细胞。与转染复合物一起温育24小时后,然后将经转染细胞更换成补充有10mg/L胰岛素和痕量元素的无血清培养基PSO4达5天。将收集的上清液过滤,并用1M氢氯酸和5M NaCl条件化,给出终pH 6.0和浓度50mM NaCl。使用IgG-Sepharose层析来纯化经条件化的上清液。使用含有30mM TRIS和150mM NaCl的pH8.0缓冲液自所述柱洗脱结合的FcRn。使用Superdex-75大小排阻层析柱进一步纯化洗脱的FcRn以除去任何聚集体。使用280nM处的吸光度读数来计算FcRn浓度,而且吸光度1.9对应于1mg/ml FcRn。猕猴FcRn的生成和纯化与人FcRn相似,只是使用含有猕猴α链和猕猴β2-微球蛋白的质粒进行转染。
实施例3:FcRn结合研究:将IgG1变体注射到FcRn上
使用BIAcore 3000仪器(GE healthcare,Piscataway,NJ)通过表面等离振子共振研究抗VEGF变体对人FcRn的结合。使用胺偶联试剂盒将人FcRn偶联至传感器芯片。具体地,将CM5传感器芯片用EDC/NHS以5μl/min活化7分钟。将100μg/ml人FcRn以流速10μl/min注射到经活化的芯片上达30秒钟至2分钟,给出最大结合响应单位(RU)50至200。偶联后,通过以5μl/min注射35μl 1M盐酸乙醇胺来封闭FcRn偶联芯片。
测定了在pH 6.0或pH 7.4抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF变体对人FcRn的结合。用于结合实验的运行缓冲液是含有0.01%P20和0.02%叠氮化钠的PBS pH 6.0或pH 7.4。将抗VEGF(贝伐单抗)WT和抗VEGF变体更换缓冲液至pH 6.0或pH 7.4运行缓冲液。所有实验在25C实施。对于pH 6.0运行,使变体(浓度范围15μM至0.7nM)以30μl/min流过FcRn包被芯片达各种时间以实现稳态,然后容许自芯片解离5分钟。对于pH 7.4运行,将变体(浓度范围30μM至30nM)以20μl/min注射到FcRn包被芯片上达各种时间以实现稳态,然后释放2分钟。还让变体流过传感器芯片上未偶联的点以容许自对FcRn偶联的芯片的结合扣除背景非特异性结合。在各注射间用0.1M TRIS pH 8.3的30秒脉冲再生芯片。在每个注射阶段结束时记录每次注射的稳态RU,并稍后作为实现50%最大RU的IgG浓度来评估表观解离常数(表观KD)。
源自两次不同运行的图1A和1B中的结果显示了所有变体在pH 6具有比野生型改良的FcRn亲和力。表观解离常数(KD)的评估显示于图2。因为两次运行的FcRn偶联密度不同,所以亲合水平不同,导致同一变体的表观KD值略有不同。然而,不同运行中这些变体的亲和力评级(ranking)保持相同。图3显示了所有测试的抗VEGF变体展现出与野生型相比更高的在中性pH对人FcRn的结合。变体基于pH 7.4结合的亲和力评级与使用pH 6结合确定的亲和力评级一致。
表3
使用此测定形式进一步评估了表3中所示抗VEGF野生型(WT)和抗VEGF变体的人和猕猴FcRn结合。将人或猕猴FcRn包被到传感器芯片上。在25℃在pH 6.0或pH 7.4缓冲液中将抗VEGF野生型和抗VEGF变体注射到FcRn包被芯片上。记录稳态响应单位,并作为注射浓度的函数绘图。所有抗VEGF变体在pH 6.0和pH 7.4都显示出比抗VEGF野生型改良的对人和猕猴FcRn的结合(见图4A-4D)。在此测定法中为抗VEGF变体确定的亲和力评级与使用单价KD确定的评级相同。
还使用此测定形式进一步评估了图26中所示抗HER2野生型(WT)和抗HER2变体的人FcRn结合。图26中研究的变体是L251A、L314A、L314D、L314K、E430A、E430K、L251D/N434H和L314D/N434H。将人FcRn包被到传感器芯片上。在25℃在pH范围为6.0至7.2的缓冲液中将抗HER2野生型和抗HER2变体注射到FcRn包被芯片上。为每种pH记录稳态响应单位,并作为注射浓度的函数绘图。然后为每种注射pH评估野生型和每种变体的亲和力,并在图26将变体对野生型的亲和力之比作为pH的函数绘图。变体E430A、E430K和L251D/N434H的亲和力之比随pH升高而降低;而所有其它变体的亲和力之比随pH升高而升高。
还使用类似的测定形式评估了抗HER2(曲妥单抗)IgG1野生型、变体T307Q/N434A、变体L251D/T307Q/N434H和变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I在pH 6.0(图27A)、pH7.1(图27B)、和pH 7.4(图27C)针对人FcRn的结合。在25℃在pH 6.0、pH 7.1或pH 7.4缓冲液中将抗HER2野生型和抗HER2变体注射到FcRn包被芯片上。为每种变体记录稳态响应单位,并作为注射浓度的函数绘图。结果显示了在pH 6.0(图27A),变体L251D/T307Q/N434H具有与野生型相似的FcRn亲和力,而变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I具有与变体T307Q/N434A相似的FcRn亲和力。在pH 7.1(图27B),变体L251D/T307Q/N434H具有比野生型低得多的FcRn亲和力;而变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I具有与野生型相似的FcRn亲和力和比变体T307Q/N434A低得多的FcRn亲和力。在pH 7.4(图27C),变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I具有比野生型和变体T307Q/N434A低的FcRn亲和力。
实施例4:FcRn结合研究:将人或猕猴FcRn注射到IgG1变体上
在使用BIAcore 3000仪器(GE healthcare,Piscataway,NJ)的结合形式中,使用胺偶联试剂盒将抗VEGF野生型(贝伐单抗)和抗VEGF变体偶联至传感器芯片的不同流动室。具体地,将CM5传感器芯片用EDC/NHS以5μl/min活化7分钟。将10-50μg/ml抗体以流速10μl/min注射到经活化的芯片上达30秒钟至2分钟,给出最大结合响应单位(RU)50至200。偶联后,通过以5μl/min注射35μl 1M盐酸乙醇胺来封闭FcRn偶联芯片。
用于结合实验的运行缓冲液是PBS pH 6.0/0.01%P20/0.02%叠氮化钠(NaN3)。在25℃将20μM至0.15nM的可溶性人或猕猴FcRn稀释液以流速30μl/min注射到抗体包被传感器芯片上达10分钟。在注射结束时记录稳态RU。用0.1M TRIS pH 8.5/0.15M NaCl的30秒脉冲再生芯片。为了背景扣除,还将FcRn注射到未偶联的表面上。使用BIAevaluation软件(GE healthcare,Piscataway,NJ)计算动力学参数和单价平衡结合常数(KD)。
图5和图6中的结果显示了所有抗VEGF变体在pH 6.0具有比野生型改良的对人和猕猴FcRn二者的FcRn亲和力。亲和力改良是由于结合速率常数的升高和解离速率常数的降低二者。总之,使用不同结合测定法,抗VEGF变体比野生型的FcRn亲和力改良情况汇总于图8。图8显示了V308P/N434A变体具有表3所列变体中最高的FcRn亲和力,接着是T307Q/E380A/N434S、T307Q/N434S、和T307Q/N434A。N434H变体具有最小量的比野生型的FcRn亲和力改良。
实施例5:抗VEGF和抗HER2变体在不同pH的解离速率
为了测量在各种pH的解离速率,首先在PBS pH 6.0/0.01% P20/0.02% NaN3中以30μl/min将200nM至2μM人或猕猴FcRn注射到抗体偶联流动室上达5分钟以实现稳态。然后,将pH范围为6至7.4的PBS缓冲液以30μl/min注射到流动室上达8分钟以容许复合物解离。为了背景扣除,还将FcRn注射到未偶联的表面上。通过使用BIAevaluation软件(GEhealthcare,Piscataway,NJ)拟合传感器的解离阶段来确定解离速率常数。图7中的结果显示了变体针对人FcRn(图7A)和猕猴FcRn(图7B)二者的koff随pH升高而升高,而且每种变体的koff升高速率是相似的。
类似地测量抗HER2变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I在不同pH针对人FcRn的解离速率(koff)。在图28中将抗HER2变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I针对人FcRn的koff作为pH的函数绘图。为了比较,还在图28中绘制来自图7的抗VEGF变体T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434S和V308P/N434A针对人FcRn的koff。为每种变体将在不同pH的koff值对pH进行拟合,以产生最佳拟合线的斜率(方程:log(koff)=斜率x pH+y-截距)。抗VEGF变体的斜率的范围为0.75至0.84;而抗HER2变体L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I的斜率为约1.2。
实施例6:针对人VEGF的结合
使用胺偶联试剂盒将VEGF-A109的重组形式偶联到CM5芯片上。具体地,将CM5传感器芯片用EDC/NHS以5μl/min活化7分钟。将1-2μg/mlVEGF-A109以流速10μl/min注射到经活化的芯片上达30秒钟,给出最大结合响应单位(RU)100至400。偶联后,通过以5μl/min注射35μl1M盐酸乙醇胺来封闭FcRn偶联芯片。在37℃在PBS/0.05% Tween/0.02% NaN3中将100nM至6nM的抗体两倍稀释液注射到VEGF偶联芯片上达4分钟。容许复合物解离解离18分钟。用20mM氢氯酸的30秒脉冲再生所述芯片。为了背景扣除,还将抗体注射到未偶联的表面上。图9中的结果显示了Fc突变不改变VEGF结合,而且所有变体具有与野生型相同的结合响应。
实施例7:对细胞增殖的体外抑制
将多种浓度的抗VEGF野生型(贝伐单抗)和抗VEGF变体与重组人VEGF一起于室温预温育1小时。抗VEGF野生型(贝伐单抗)和抗VEGF变体的浓度的范围为33nM至0.05nM。重组人VEGF的浓度为0.26nM。然后将复合物呈递给在37℃和5%CO2培养的人脐带血管内皮细胞(HUVEC)。如下所述评估培养4天后HUVEC的存活力,即将所述细胞与20%ALAMAR染料(Trek Diagnoshc Systems,Cleveland,OH)一起在37℃和5%CO2温育6小时。然后用Molecular Devices(Sunnyvale,CA)微量板读数仪检测ALAMAR的荧光。如图10所示,所有变体具有与野生型和相同水平的增殖抑制,再次证实了Fc突变不影响变体中和VEGF的能力。
实施例8:猕猴中的药动学研究
将36只雄性和36只雌性首次实验猕猴(在研究前体格检查时重量2-5kg且2-7岁)指派至6个处理组,每个组由6只雄性和6只雌性组成。使用为实现对处理组而言的体重平衡而设计的计算机化模块化程序将动物指派至处理组。只有表现为健康且没有明显异常的动物才在研究中使用。在第1天所有动物经隐静脉接受单剂静脉内推注,接着是0.9%盐水冲洗。所有组的剂量水平是5mg/kg。在给药前及给药后0.5,2,4,8小时、1,2,4,7,10,14,21,28,35,42,49,56和70天自股静脉收集血液样品(大约1.0mL)。使用n=11至12只动物每组的均值血清浓度构建所有组的血清浓度-时间曲线。使用实施例9中描述的ELISA方案分析此实验中收集的血清样品。
实施例9:通过ELISA检测猕猴血清中的抗体浓度
将Maxisorp ELISA板(Thermo Fisher Scientific,Rochester,NY)用含0.5μg/ml重组人VEGF的50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6于4℃包被过夜。将板用PBS,0.5%BSA,10ppmProclin,pH 7.2于室温封闭1小时,然后用清洗缓冲液(PBS/0.05%Tween 20/pH 7.2)清洗。将在含有0.5%牛血清清蛋白、0.05%Tween 20、5mM EDTA pH 8.0、0.25%CHAPS、0.2%牛γ球蛋白、10ppmProclin和0.35M NaCl的PBS缓冲液中2倍连续稀释的标准品(抗VEGFIgG1野生型(贝伐单抗))以及3倍连续稀释的猕猴血清样品(始于1∶10)添加至经封闭的板,并在摇动中于室温温育2小时。将板清洗6次,并用在测定缓冲液(PBS,pH 7.4,0.5% BSA,0.05% Tween 20,10ppm Proclin)中1∶10K稀释的绵羊抗人IgG(Fc特异性)-HRP(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)在摇动中于室温检测结合的药物1小时。然后再次将板清洗6次,接着为了显色,添加四甲基联苯胺底物(Moss,Pasadena,MD)。20分钟后通过添加1M磷酸(H3PO4)来终止反应。在Molecular Devices微量板读数仪上以波长450-620nm对板读数。单剂IV 5mg/kg后野生型和五种抗VEGF变体在猕猴中的血清概况显示于图11。所有五种变体展现出与野生型相比降低的清除和延长的半衰期。
实施例10:药动学数据分析
使用5.1.1版WinNonLin-Enterprise(Pharsight Corporation;Mountain View,CA)评估PK参数。使用两隔室模型及IV-推注输入、一级消除(first-order elimination)、和微速率常数(micro-rate constant)(模型7)来描述观察到的数据。使用迭代再加权(预测至能力n=-1(predicted to power n=-1))和Gauss-Newton极小化算法及Levenberg和Hartley修正对浓度加权。使用WinNonLin莫型7报告下述PK参数:AUC∞=以外推至无穷的浓度-时间曲线下面积定义的总药物暴露;t1/2,α=α阶段的半衰期(α半衰期);t1/2,β=β阶段的半衰期(β半衰期);Cmax=最大观察浓度;CL=清除;V1=中央隔室的体积;Vss=稳态时的分布体积。
对于所有剂量组,模型选择基于每只动物观察对预测血清浓度-时间概况的目测检查、加权残差平方和的检查、及每种参数的标准误差和变异系数的检查的拟合优度。PK参数呈现为每个组的均值±标准偏差(SD)。
图12显示了抗VEGF野生型和五种变体即N434H、T307Q/N434A、T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434S和V308P/N434A在单剂IV 5mg/kg给猕猴后的列表药动学参数。变体的β(终末)半衰期比野生型的半衰期要长约1.6至2.2倍,其中T307Q/N434A变体具有最长的半衰期即24.9天。就我们所知,变体T307Q/434A的半衰期即约25天是至今报告的最长的人IgG在猕猴中的半衰期。
半衰期与FcRn亲和力之间的相关性显示于图13。pH 6.0FcRn亲和力的适度升高导致延长的终末半衰期,如N434H和T307Q/N434A变体证明的。然而,pH 6.0FcRn亲和力的另外升高(T307Q/N434S、T307Q/E380A/N434A和V308P/N434A)不进一步改良半衰期,因为在中性pH减慢的解离速率和升高的亲和力可抵消酸性pH亲和力升高带来的好处。取而代之的是,在pH 6.0在较高的FcRn亲和力时有缩短半衰期的趋势。
实施例11:转基因小鼠中的药动学研究
在研究中使用的小鼠品系是Mu.VEGFhuX.KI.RI.B6.129。MuVEGFhuMUTX(+/+)敲入、RAG2(-/-)敲除小鼠含有人源化形式VEGF的两个等位基因,其能被野生型抗VEGF抗体(贝伐单抗)中和。RAG2(-/-)小鼠是免疫缺陷的,而且不生成功能性T和B细胞。人肿瘤能在表达人源化形式VEGF的这些小鼠中培养,没有针对肿瘤细胞的明显免疫应答。如此,自人肿瘤和小鼠基质细胞衍生的VEGF会被不中和小鼠VEGF的野生型抗VEGF抗体(贝伐单抗)中和。评估在这些不携带肿瘤的转基因小鼠中评估抗VEGF野生型和抗VEGF变体T307Q/N434A的PK。
实施了两项不同PK研究。第一项研究是单剂PK研究。有4个组,每个组8-9只动物,每只接受单剂静脉内含0.3或5mg/kg野生型和变体T307Q/N434A的PBS。要施用的剂量体积在5至15ml/kg变化,取决于给药溶液的浓度和每只动物的重量。IV给药是经尾静脉进行的。在每个时间点采血来自3只小鼠的样品,并在给药后15分钟、8小时、24小时、2天、4天、7天、10天、14天、21天和28天收集约125uL血液样品供PK分析用。血液样品是在麻醉下经眼眶周围的窦收集的。在sac时间点,在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺对小鼠采血。
第二项研究是多剂PK研究。每个组有9只动物。每只动物在第0、3、6、和9天接受含0.3或5mg/kg变体T307Q/N434A的PBS。注射和样品收集方法与单剂PK研究相似。然而,在第一剂后15分钟、第3天(给药前(pre-dose))、第6天(给药前)、第9天(给药前)、第9天给药后15分钟、第11天、第14天、第21天、第28天和第35天收集血液样品。
使用实施例13中描述的ELISA分析自PK研究收集的血清样品。图14A和14B分别显示了使用VEGF捕捉(图14A)或人Fc捕捉(图14B)ELISA测定的野生型和变体T307Q/N434A的药动学概况。变体T307Q/N434A在单剂IV0.3或5mg/kg后具有与野生型相似的PK概况。图15证实了野生型和T307Q/N434A变体在转基因小鼠中的半衰期相当。然而,观察到非线性PK应答,因为以0.3mg/kg服用的抗体具有比以5mg/kg服用的抗体要短的半衰期,可能是由于抗原依赖性清除。图16显示了变体T307Q/N434A在多剂0.3或5mg/kg后的在人源化VEGF转基因小鼠中的药动学概况,而且PK参数汇总于图17。结果显示了以实验测量的血清浓度与使用单剂PK参数通过模拟预测的浓度非常一致。
实施例12:体内功效研究
自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)获得人HT-55、Colo-205(结肠直肠癌)和Calu-6(肺癌)细胞。人结肠直肠癌HM-7细胞系是LS 174T的一种衍生物。Calu-6和HM-7在Ham氏F12、低葡萄糖DMEM 1∶1中培养。Colo-205和HT-55在RPMI 1640培养基中培养。两种培养基都补充有10% v/vFBS、1% v/v青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)和1μg/ml FUNGIZONETM(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将细胞于37℃在5% CO2中培养至汇合,收获,并在无菌Matrigel中以50x106个细胞每ml重悬浮。通过背部侧面s.c.注射5x106个细胞每只小鼠在6至8周龄RAG2 KO;hum-X VEGF KI双重纯合小鼠(Genentech,South San Francisco,CA)中建立异种移植物,并容许其生长。每周两次剂量5、0.5和0.05mg/kg的i.p.抗体处理在接种肿瘤细胞后24小时启动。每周两次如所述地延最长轴和垂直轴测量移植的肿瘤。对于测量肿瘤的每一天,计算每只小鼠的肿瘤体积,并在P<0.05水平通过Student氏t检验比较来自对照抗体组(抗豚草)和每个抗VEGF组的均值肿瘤体积。当肿瘤体积达到2,000mm3时杀死小鼠。
来自第一项HM-7异种移植物研究的结果显示于图18。图18A和18B显示了变体T307Q/N434A能够在0.5mg/kg以及5mg/kg处理组二者实现对肿瘤生长的最大抑制。虽然野生型确实在两个剂量都抑制肿瘤生长,但是它在0.5mg/kg没有实现对肿瘤生长的最大抑制。这些结果提示T307Q/N434A变体在0.5mg/kg在处理HM-7异种移植物方面比野生型更有效,尽管血清IgG浓度水平相似(图18C)。一项显示于图19的HM-7异种移植物重复功效研究证实了T307Q/N434A变体在0.5和0.05mg/kg处理组比野生型更有效。确实,T307Q/N434A变体在所有处理组中显示出与野生型相比要大的对肿瘤生长的抑制(图19A和19B)。升高的功效可能是由于T307Q/N434A处理组与相比野生型更高的肿瘤中血液标准化抗体浓度(图19E)。第三项显示于图20的HM-7异种移植物功效研究进一步验证了T307Q/N434A在0.5和0.05mg/kg处理组比野生型卓越的功效。
对于HT-55异种移植物研究,T307Q/N434A变体在0.05mg/kg处理组中显示出与相比野生型要大的对肿瘤生长的抑制(图21),提示T307Q/N434A在0.05mg/kg处理组比野生型更有效。对于Colo-205研究,图22B显示了0.5mg/kg野生型与0.5mg/kg T307Q/N434A变体之间的生长曲线显著差异。图22A和22B还显示了T307Q/N434A在0.5和0.05mg/kg处理组中对肿瘤生长的抑制的增强,提示T307Q/N434A在0.5和0.05mg/kg组中略微更高的功效。一项显示于图23的重复Colo-205研究指出了T307Q/N434A在处理Colo-205异种移植物方面比野生型略微更有效。最后,T307Q/N434A变体和野生型在Calu-6异种移植物研究中的功效是相似的。
Fc变体升高的功效可能有多种可能的原因。例如,变体升高的效力可能是由于由某些肿瘤(例如HM-7)中表达的人FcRn介导的变体抗体保留和/或再循环延长。这可导致阻断局部生成的VEGF的质量作用效应(mass-action effect)增大,或可提供肿瘤中VEGF降解增强的一种机制。然而,我们发现在HM-7肿瘤中检测到的相对于HT-55和Calu-6肿瘤升高的变体浓度与细胞FcRn表达水平没有直接关联,因为HM-7细胞表达比HT-55或Calu-6细胞要低的FcRn量(图25)。肿瘤微环境中的其它因素诸如肿瘤pH、生长速率、和其它肿瘤成分也可能在决定IgG分布方面发挥与FcRn合作的作用。例如,肿瘤微环境大多是酸性的,pH范围为6.0至7.6(中值=7.1),而正常组织的pH范围为7.3至7.8(中值=7.55),参见Song,C.W.etal.,″Influence of Tumor pH on Therapeutic Response″in Cancer Drug Resistance,21-42(2007)。另外,不同类型的肿瘤可具有广泛的pH,原因在于异质血管供应和血液流注,参见Song,C.W.et al.,Cancer Drug Resistance,21-42(2007),supra;Gillies,R.J.etal.,J Magn Reson Imaging 16,430-450(2002)。多项体外研究指出了细胞结合Fc/IgG的量在细胞于酸性pH温育时增多,参见Praetor,A.et al.,Journal of cell science 112(Pt 14),2291-2299(1999);McCarthy,K.M.,Yoong,Y.&Simister,N.E.Bidirectionaltranscytosis of IgG by the rat neonatal Fc receptor expressedin a rat kidneycell line:a system to study protein transport acro ss epithelia.Journal ofcell science 113(Pt 7),1277-1285(2000);Tesar,D.B.et al.,Traffic 7,1127-1142(2006)。因此,会想到所测试的肿瘤系中的pH差异可影响每种肿瘤内的累积抗体水平。另外,酸性肿瘤微环境还激活VEGF表达(参见Song,C.W.et al.,Cancer Drug Resistance,21-42(2007),supra),这能特异性介导这些抗VEGF抗体的保留。另外,小鼠中的HM-7肿瘤先前显示出具有稀疏的基质(参见Liang,W.C.et al.,J Biol Chem 281,951-961(2006)),而Calu-6肿瘤诱导强宿主基质应答且是相对富含基质的(参见Tejada,M.L.et al.,ClinCancer Res 12,2676-2688(2006))。表达鼠FcRn的小鼠基质细胞的存在可掩蔽人肿瘤细胞对IgG变体改良的再循环。这可导致具有较大的小鼠基质成分的人异种移植物例如Calu-6中较低的浓缩效应。
实施例13:转基因小鼠通过ELISA检测血清和肿瘤中的抗体浓度
使用在板上包被两种不同抗体捕捉试剂任一(VEGF或抗人IgG1 Fc)的两种不同ELISA测定形式来检测转基因小鼠中的抗体浓度。将MaxisorpELISA板(Thermo FisherScientific,Rochester,NY)用含0.5μg/ml重组人VEGF或0.25μg/ml(Fab’2)家兔抗人IgG1Fc(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)的50mM碳酸盐缓冲液pH 9.6于4℃包被过夜。将板用PBS,0.5%BSA,10ppm Proclin,pH 7.2于室温封闭1小时,然后用清洗缓冲液(PBS/0.05%Tween 20/pH 7.2)清洗。将在含有0.5%牛血清清蛋白、0.05%Tween 20、5mMEDTA pH 8.0、0.25% CHAPS、0.2% 牛γ清蛋白、10ppm Proclin和0.35M NaCl的PBS缓冲液中2倍连续稀释至12.5ng/ml的标准品(用于VEGF形式的贝伐单抗或用于Fc形式的人IgG1)以及3倍连续稀释的猕猴血清样品(始于1∶10)添加至经封闭的板,并在摇动中于室温温育2小时。将板清洗6次,并用在测定缓冲液(PBS,pH 7.4,0.5%BSA,0.05%Tween 20,10ppm Proclin)中1∶20K至1∶60K稀释的山羊(Fab’2)抗人IgG(Fc特异性)-HRP偶联物(Jackson)在摇动中于室温检测结合的药物1小时。然后再次将板清洗6次,接着为了显色,添加四甲基联苯胺底物(Moss,Pasadena,MD)。20分钟后通过添加1M磷酸(H3PO4)来终止反应。在Molecular Devices微量板读数仪上以波长450-620nm对板读数。
实施例14:具有胜过野生型的各种亲和力改良的IgG1 Fc变体及其体内药动学性
能
将显示于图24的别的Fc突变组合掺入人抗HER2(曲妥单抗)以构建IgG变体。使用实施例1中描述的方法表达IgG1变体。如实施例4所述测量野生型抗HER2 IgG1和抗HER2IgG1变体的解离常数,而且结果显示于图24。结果显示了通过组合不同突变,我们能构建能够以一位数纳摩尔亲和力(代表胜过野生型IgG1的约450倍改良)结合人FcRn的IgG变体,诸如M252Y/\308P/N434Y。
然而,高亲和力变体并非必然在体内具有改良的药动学性能。例如,将两种Fc突变即N434A和N434W掺入一种不同人抗体以构建两种IgG1变体。两种IgG1变体即N434A变体和N434W变体分别导致在pH 6.0与野生型抗体相比要高大约3倍和40倍的FcRn亲和力,如图24所示。如实施例8和9所述在猕猴中评估了它们的药动学性能,并与野生型(大约6至9天相比)比较。N434W的半衰期(约9.7+/-2.4天)的改良比适度亲和力改良的变体N434A(约14.5+/-2.2天)要少。这些结果提示FcRn亲和力的太多升高对Fc变体的半衰期可具有有害影响,而且难以预先预测具有改良的FcRn亲和力的Fc变体是否会具有改良的半衰期。
实施例15:使用高亲和力IgG1变体的FcRn免疫沉淀
通过在含有1%Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1% SDS、2mM EDTA、150mMNaCl和1X蛋白酶抑制剂(Pierce,Rockland,IL)的25mM磷酸钠缓冲液pH 6.0中于4℃温育1小时来裂解HM-7、HT-55、Calu-6或Raii(B细胞淋巴瘤)系每一种的5x106个细胞。将裂解的细胞以12,000g于4℃离心30分钟,然后将50nM曲妥单抗Fc变体M252Y/V308P/N434Y(Yeunget al.,submitted)添加至上清液以捕捉FcRn。于4℃温育过夜后,添加Protein-L(Pierce)树脂,并容许于4℃结合复合物4小时。然后将树脂用溶胞缓冲液清洗5次,并用2X加载缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)洗脱结合的蛋白质。将蛋白质在4-12%BIS-TRIS凝胶(Invitrogen)上分开,并印迹到硝酸纤维素膜(Invitrogen)上。将膜用含3%脱脂奶粉的PBS封闭,并用1ng/ml家兔抗人FcRn抗体(Santa Cruz,Santa Cruz,CA)于室温探查1小时,然后用1∶104稀释的山羊抗家兔IgG-过氧化物酶偶联物(Pierce)于室温探查1小时。在封闭与抗体温育捕捉间用PBS/0.05%Tween清洗膜。通过ECL检测试剂盒(GE Healthcare,Piscataway,NJ)显现FcRn蛋白。见图25。
结果和讨论
在每种pH即pH 6.0和pH 7.4用不同抗VEGF变体实施了两项分开的结合实验。pH6.0和pH 7.4的稳态结合响应单位(RU)作为浓度的函数分别在图1和图2中绘图。自图1评估pH 6.0的解离常数(KD),并汇总于图2。自两次不同运行为同一变体计算的解离常数略微不同。例如,变体N434A在第一次运行中具有550nM的KD,但是它来自第二次运行的KD是250nM。差异是由于涉及使二价抗体流过FcRn偶联芯片的测定形式中的亲合效应。亲合贡献对解离常数的水平取决于偶联到芯片上的FcRn水平,较高的FcRn偶联水平导致较大的亲合。这可能解释了在第二次运行中观察到的较高的亲和力,它具有比第一次运行要高约两倍的RU。虽然测定设置中有亲合效应,但是这种形式最像细胞内部的天然结合过程,那里容许被胞饮的二价抗体结合膜结合的FcRn。虽然绝对KD可能在各运行间不同,但是这些变体的亲和力评级是一致的,即使FcRn偶联水平不同。图1和图2都显示了V308P/N434A一致地具有所测试的变体中最高的亲和力,而且所有测试的变体在pH 6.0具有改良的对FcRn的结合。
抗VEGF变体在pH 7.4对FcRn的亲和力比它们在pH 6.0的亲和力要低得多。因为在pH 7.4的结合亲和力很低,所以没有测定变体在pH 7.4的解离常数。然而,图3显示了这些变体在pH 7.4的亲和力评级与在pH 6.0的评级相同,指示变体在pH 6.0和pH 7.4对FcRn的结合是有联系的。因为变体的pH 6.0结合得到改良,所以在pH 7.4的结合也如此。在pH 6.0和7.4对FcRn的结合如何影响变体的半衰期之间有精巧的平衡。提示在pH 6.0改良的结合在变体的体内半衰期方面具有有益作用,因为较高亲和力变体能较好地结合FcRn,并由此被FcRn更多地再循环。另一方面,提出在pH 7.4实质性的高结合对变体的半衰期是不利的,因为如果结合太紧的话,FcRn结合的抗体可能不能容易地释放回循环。
在高pH升高的亲和力可抵消在低pH升高的亲和力的有力影响。例如,Dall’Acquaet al.,J Immunol 169(9),5171-5180,2002显示了人IgG1变体诸如M252Y/S254T/T256E和G385D/Q386P/N389S在小鼠中不具有改良的半衰期,显然是因为它们对小鼠FcRn的高pH结合亲和力。因此,不清楚在仍然改良它们的药动学半衰期的同时,IgG1变体能耐受多大程度的在高pH结合方面的改良。
尽管为了清楚理解的目的已经通过举例说明的方式较为详细地描述了上述发明,说明书和实施例不应解释为限制该发明范围。本文通过述及而明确地完整收录本文中所引用的所有专利和科学文献的公开内容。
Claims (18)
1.一种变体IgG,其包含如下的人IgG Fc区,相对于野生型人IgG Fc区包含两个或更多个氨基酸替代,其中所述变体IgG在pH 6.0具有比在pH 7.4更高的对FcRn的结合亲和力,且其中所述Fc区包含氨基酸307处用谷氨酰胺进行的氨基酸替代和氨基酸436处用异亮氨酸进行的氨基酸替代,依照Kabat中的EU索引编号。
2.权利要求1的变体IgG,其具有比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的对FcRn的结合亲和力。
3.权利要求1的变体IgG,其具有相等的或比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的功效。
4.权利要求3的变体IgG,其具有比具有野生型人IgG Fc区的IgG更高的功效。
5.权利要求1的变体IgG,其是人的或人源化的IgG。
6.权利要求5的变体IgG,其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
7.权利要求1的变体IgG,其中所述IgG Fc区是IgG1Fc区。
8.权利要求1的变体IgG,其中所述变体IgG是抗VEGF抗体。
9.权利要求1的变体IgG,其中所述变体IgG是贝伐单抗的变体。
10.权利要求1的变体IgG,其包含重链可变域(SEQ ID NO:1)和轻链可变域(SEQ IDNO:2)。
11.一种药物组合物,其包含权利要求1的变体IgG和药学可接受载体。
12.一种试剂盒,其包含容器中的权利要求1的变体IgG和使用说明。
13.权利要求1的变体IgG在制备药物中的用途,所述药物用于一种治疗受试者中的肿瘤的方法,所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1的变体IgG。
14.权利要求1的变体IgG在制备药物中的用途,所述药物用于一种抑制受试者中的VEGF活性的方法,所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1的变体IgG。
15.权利要求14的用途,其中所述VEGF活性是血管发生。
16.权利要求1的变体IgG在制备药物中的用途,所述药物用于一种调控受试者中的血管通透性的方法,所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1的变体IgG。
17.权利要求1的变体IgG在制备药物中的用途,所述药物用于一种抑制或预防受试者中的癌细胞生长的方法,所述方法包括对所述受试者施用有效量的权利要求1的变体IgG。
18.权利要求13-17的用途,其中每4周或每4周以上时间对所述受试者施用所述变体IgG。
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