CN115177751A - 缀合物、其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

提供了缀合物、其制备方法和用途。缀合物，其具有通过接头连接的放射性核素和西罗珠单抗，其中接头由选自DFO、DOTA‑NHS‑酯、马来酰亚胺单酰胺DOTA、p‑SCN‑Bn‑DOTA的试剂形成。本申请以FAP单克隆抗体作为配体携带放射性核素。利用Zr‑89标记的西罗珠单抗进行PET成像，相比于前期的131I的γ照相机平面成像或SPECT成像，具有更高的分辨率。本申请筛选了不同的Lu‑177标记西罗珠单抗的方法，选取对抗体最温和且最稳定的标记方式，实现在低剂量的核素治疗下对肿瘤的抑制作用。

Description

缀合物、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及放射性药物领域，具体地涉及抗体药物缀合物。

背景技术

靶向放射性核素治疗(TRNT)通过使用合适的配体把放射性核素选择性的传送到肿瘤细胞和肿瘤微环境，以控制肿瘤并同时最大程度地降低毒性的治疗方法(Liu Z,ChenX.Simple bioconjugate chemistry serves great clinicaladvances:albumin as aversatile platform for diagnosis and precision therapy.Chemical SocietyReviews.2016；45:1432-1456；Müller C,Farkas R,Borgna F,Schmid RM,

M,Schibli R.Synthesis,radiolabeling,andcharacterization of plasma protein-binding ligands:potential tools for modulationof the pharmacokineticproperties of(radio)pharmaceuticals.BioconjugateChemistry.2017；28:2372-2383；

M,Umbricht CA,Schibli R,Müller C.Albumin-binding PSMA ligands:optimization of the tissue distribution profile.Molecular Pharmaceutics.2018；15:934-946；Borgna F,Deberle LM,Cohrs S,Schibli R,Müller C.Combinedapplication of albumin-binding[¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA-ALB-56 and fast-cleared PSMAinhibitors:optimization of the pharmacokinetics.Molecular Pharmaceutics.2020；17:2044-2053；Nilantha B,Orit J,Cedric M,Chen X,Rogers BE.Novel structuralmodification based on evans blue dye to improve pharmacokinetics of asomastostatin receptor based theranostic agent.Bioconjugate Chemistry.2018；29:2448-2454)。TRNT可对肿瘤细胞进行选择性的辐射，对周围健康组织产生最小的毒性。TRNT一般利用β粒子、α粒子和俄歇电子这三种辐射。其中β粒子是TRNT药物近年来使用最多的辐射粒子，相应的靶向放射性核素药物的临床应用也较为成熟(Lau J,Jacobson O,NiuG,Lin KS,Bénard F,Chen X.Bench to bedside:albumin binders for improved cancerradioligand therapies.Bioconjugate Chemistry.2019；30:487-502；Kuo HT,Lin KS,Zhang Z,et al.Novel¹⁷⁷Lu-labeled albumin-binder-conjugated PSMA-targetingagents with extremely high tumor uptake and enhanced tumor-to-kidney absorbeddose ratio.Journal of Nuclear Medicine.2021；62:521-527)。除了放射性核素本身的辐射作用外，要取得治疗肿瘤的良好效果，并且对肿瘤患者的其他正常组织的毒副作用最低，配体的靶向性至关重要。配体多为单克隆抗体、多肽或小分子化合物等，其靶向性主要利用抗原与抗体或配体与受体特异性结合的特点，分别形成了放射性核素-抗体和放射性核素-受体两大类药物。放射性核素-抗体药物治疗肿瘤早在20世纪50年代就已提出，经过几十年的发展，已有多种核素标记单抗用于淋巴瘤、肝癌、肺癌及结肠癌等癌症的治疗，如：治疗淋巴瘤的¹³¹I-tositumomab、⁹⁰Y-lymphocide、¹³¹I-Lym-1，治疗肺癌的¹³¹I-ch-TNT-1/B，治疗肝癌的¹³¹I-metuximab/Licartin等(Kramer V,Fernández R,Lehnert W,etal.Biodistribution and dosimetry of a single dose of albumin-binding ligand[¹⁷⁷Lu]Lu-PSMA-ALB-56in patients with mCRPC.European Journal of NuclearMedicine and Molecular Imaging.2021；48:893-903；Zhang J,Hao W,Weiss O J,ChengY,Chen X.Safety,pharmacokinetics and dosimetry of a long-acting radiolabeledsomatostatin analogue¹⁷⁷Lu-DOTA-EB-TATE in patients with advanced metastaticneuroendocrine tumors.Journal of Nuclear Medicine.2018；59:1699-1705；Hao W,Cheng Y,Zhang J,Jie Z,Chen X.Response to single low-dose¹⁷⁷Lu-DOTA-EB-TATEtreatment in patients with advanced neuroendocrine neoplasm:a prospectivepilot study.Theranostics.2018；8:3308-3316)。

靶向放射性核素治疗的机理为：具有肿瘤靶向性的配体将放射性核素带到肿瘤组织，利用放射性衰变过程产生的射线通过电离辐射生物效应导致肿瘤细胞DNA及其他功能性大分子的损伤，从而杀死肿瘤细胞。放射性核素进入肿瘤细胞后，其产生的射线除可作用于核素所在肿瘤细胞外，由于其穿透力较强，还可通过“旁观者效应”作用于周围无核素摄取的肿瘤细胞，同时肿瘤细胞间也可通过“交叉火力”进一步增强对肿瘤细胞的杀伤力，提升肿瘤治疗效果。靶向放射性核素治疗的优势在于靶向杀伤肿瘤细胞，对其他正常组织影响较小；可以提高肿瘤部位的照射剂量，对肿瘤细胞的杀伤力强，病人耐受性较好；无需特殊设备，治疗操作简便，易于规范化。

成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast activation protein，FAP)是肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)的特异性标志物之一，选择性地表达于90％以上的上皮恶性肿瘤的基质成纤维细胞表面，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、皮肤恶黑色素瘤等^1-3。良性及癌前病变等上皮肿瘤，如结直肠腺瘤、乳腺纤维腺瘤中FAP一般不表达，且在正常组织中一般不表达。FAP具有二肽基肽酶和胶原酶活性，可裂解基质中包括明胶和I型胶原在内的诸多二肽基肽酶活性的底物，参与ECM降解，促进肿瘤细胞从原发部位脱离，侵袭和转移，故选择性抑制FAP的酶活性将有助于减弱肿瘤细胞的侵袭和转移能力(Calais J.FAP:The next billion dollar nuclear theranostics target？Journal of Nuclear Medicine.2020；61:163-165；Lo A,Wang L-CS,Scholler J,etal.Tumor-promoting desmoplasia is disrupted by depleting FAP-expressingstromal cells.Cancer Research.2015；75:2800-2810；Fischer E,Chaitanya K,WüestT,et al.Radioimmunotherapy of fibroblast activation protein positive tumorsby rapidly internalizing antibodies.Clinical Cancer Research.2012；18:6208-6218；Jansen K,Heirbaut L,Verkerk R,et al.Extended structure–activityrelationship and pharmacokinetic investigation of(4-quinolinoyl)glycyl-2-cyanopyrrolidine inhibitors of fibroblast activation protein(FAP).Journal ofMedicinal Chemistry.2014；57:3053-3074；Loktev A,Lindner T,Mier W,et al.Atumor-imaging method targeting cancer-associated fibroblasts.Journal ofNuclear Medicine.2018；59:1423-1429；Lindner T,Altmann A,

S,et al.Designand development of^99mTc-labeled FAPI Tracers for SPECT imaging and¹⁸⁸ReTherapy.Journal of Nuclear Medicine.2020；61:1507-1513)。FAP有望成为判断肿瘤预后的重要标志物，同时成为个体化治疗肿瘤的新靶点。F19是最早用于人体成像的鼠源FAP抗体，I-¹³¹标记的F19在结直肠癌症患者中显示出在病灶部位有明显摄取(Welt S,DivgiCR,Scott AM,Garin-Chesa P,Finn RD,Graham M,Carswell EA,Cohen A,Larson SM,OldLJ,et al.Antibody targeting in metastatic colon cancer:a phase I study ofmonoclonal antibody F19 against a cell-surface protein of reactive tumorstromal fibroblasts.J Clin Oncol.1994Jun；12(6):1193-203；Kratochwil C,FlechsigP,Lindner T,et al.⁶⁸Ga-FAPI PET/CT:Tracer uptake in 28 different kinds ofcancer.Journal of Nuclear Medicine.2019；60:801-805；Hofheinz RD,al-Batran SE,Hartmann F,et al.Stromal antigen targeting by a humanised monoclonalantibody:an early phase II trial of sibrotuzumab in patients with metastaticcolorectal cancer.Onkologie.2003 Feb；26(1):44-8；Lindner T,Loktev A,Altmann A,et al.Development of quinoline-based theranostic ligands for the targeting offibroblast activation protein.Journal of Nuclear Medicine.2018；59:1415-1422)。在剂量递增研究中，进一步的研究产生了人源化的F19，并最终生产和使用了西罗珠单抗(Sibrotuzumab)。西罗珠单抗是一种人源化的单克隆抗体，对FAP靶点具有高亲和力。该药最早被设计用来治疗各种恶性肿瘤，如结直肠癌，非小细胞肺癌，乳腺癌以及头颈癌。在一期临床实验中，¹³¹I-西罗珠单抗的γ照相机成像显示在患者中所有大于1.5cm的转移性病变中都能测量到大量示踪剂蓄积并且长时间滞留在病灶内，而在患者的肝脏、脾脏和其他正常器官中会跟随血池清除而清除。然而在二期临床实验中，由于该抗体在患者中的治疗效果不明显而中止(Scott AM,Wiseman G,Welt S,Adjei A,Lee FT,Hopkins W,Divgi CR,Hanson LH,Mitchell P,Gansen DN,Larson SM,Ingle JN,Hoffman EW,Tanswell P,Ritter G,Cohen LS,Bette P,Arvay L,Amelsberg A,Vlock D,Rettig WJ,Old LJ.APhase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced ormetastatic fibroblast activation protein-positive cancer.Clin Cancer Res.2003May；9(5):1639-47；Watabe T,Liu Y,Kaneda-Nakashima K,et al.Theranosticstargeting fibroblast activation protein in the tumor stroma:⁶⁴Cu-and²²⁵Ac-labeled FAPI-04 in pancreatic cancer xenograft mouse models.Journal ofNuclear Medicine.2020；61:563-569；Ballal S,Yadav MP,Kramer V,et al.Atheranostic approach of[⁶⁸Ga]Ga-DOTA.SA.FAPi PET/CT-guided[¹⁷⁷Lu]Lu-DOTA.SA.FAPi radionuclide therapy in an end-stage breast cancer patient:newfrontier in targeted radionuclide therapy.European Journal of NuclearMedicine and Molecular Imaging.2021；48:942-944)。虽然无法作为抗体药物直接用于肿瘤治疗，但是该抗体具有病灶区域分布集中，正常组织中低分布甚至无分布的特点，是优良的靶向放射性核素治疗的核素携带剂。然而，现有技术中关于携带核素的西罗珠单抗用于靶向放射性核素治疗或成像的报道很少。

本领域中仍然需要针对成纤维细胞活化蛋白的药剂以用于靶向放射性核素治疗或成像。

发明内容

发明人以FAP单克隆抗体西罗珠单抗作为配体携带放射性核素。利用Zr-89标记的西罗珠单抗进行PET成像，验证该抗体在动物体内的长时间分布，相比于前期的131I的γ照相机平面成像或SPECT成像，具有更高的分辨率。在14天的时间尺度内全面清晰的对抗体的药代进行了分析。此外，筛选了不同接头用Lu-177标记西罗珠单抗，选取对抗体最温和且最稳定的标记方式，对荷瘤小鼠进行靶向放射性核素治疗，实现在低剂量的核素治疗下对肿瘤的抑制作用。

在一方面，本发明提供了缀合物，其具有放射性核素-接头-抗体的结构。抗体可以是包含分别以SEQ ID NO.1-3显示的HC CDR 1-3和分别以SEQ ID NO.4-6显示的LC CDR1-3的抗体：

HC CDR1：EYTIH(SEQ IN No.1)；

HC CDR2：GINPN NGIPN YNQKF KG(SEQ IN No.2)；

HC CDR3：RRIAY GYDEG HAMDY(SEQ IN No.3)；

LC CDR1：KSSQS LLYSR NQKNY LA(SEQ IN No.4)；

LC CDR2：WASTR ES(SEQ IN No.5)；

LC CDR3：QQYFS YPLT(SEQ IN No.6)。

在一方面，本发明提供了缀合物，其具有放射性核素-接头-西罗珠单抗的结构。西罗珠单抗可以携带一个以上的接头。在一个实施方案中，接头与西罗珠单抗的比率为1:1以上，例如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1。缀合物也可以表示为[放射性核素-接头]n-抗体，其中n为1以上。本发明还可以提供组合物或混合物，其包含一种或多种上述缀合物。组合物或混合物可以进一步包含未缀合的抗体。

在一个实施方案中，接头以R1-R2-R3表示，其中R1是用于螯合放射性核素的部分；R2是C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基；C1-C6亚烷基C6-C12芳基；C1-C6亚烷基C6-C12杂芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-C3-C12环烷基；C1-C12亚烷基-C(＝O)-NH-C1-C12亚烷基，优选-CH2-C(＝O)-NH-CH2-CH2-；并且R3是

-C(＝O)-NR4-或-NR5-C(＝S)-NR6-，其中R4、R5和R6各自独立是H；C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；或C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基。

在一个实施方案中，接头是

并且放射性核素与接头螯合。

在一个实施方案中，接头与抗体的可变区外的区域，诸如Fc区中的一个或多个氨基或-SH基团连接(例如形成-S-、-NR4-或-NR6-连接)。在一个实施方案中，抗体是西罗珠单抗。

在一个实施方案中，放射性核素选自Lu-177、Zr-89、I-125、F-18、Sc-44、Ga-67、Ga-68、Tc-99m、In-111、Sc-47、Y-90、Sm-153、Ho-166、Re-188、Pb-212、Bi-213和Th-232。

在一个实施方案中，缀合物的结构为⁸⁹Zr-DFO-西罗珠单抗、¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗、¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗或¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚胺基-西罗珠单抗；其中DFO和DOTA分别为去铁胺和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸与抗体缀合后形成的基团。

在一个实施方案中，缀合物包含如下结构：

其中

表示放射性核素。

具体地，缀合物可以具有以下结构：

在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的缀合物和药学可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物还包含化疗剂。

在另一个方面，本发明提供了本发明的缀合物或药物组合物在制备用于受试者中的体内成像的药物中的用途。

在另一个方面，本发明提供了对受试者进行的体内成像的方法，包括施用本发明的缀合物或药物组合物。

在一个实施方案中，体内成像是针对受试者中的癌症的体内成像。

在一个实施方案中，癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌。

在另一个方面，本发明提供了本发明的缀合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的癌症。

在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，包括施用本发明的缀合物或药物组合物。

在一个实施方案中，癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌。

在另一个方面，本发明提供了本发明的缀合物或药物组合物在体外抑制癌细胞生长的用途。在一个实施方案中，癌细胞选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种制备本发明的缀合物的方法，其包括将试剂与抗体，诸如西罗珠单抗反应，例如以西罗珠单抗:试剂＝1:1-1:10当量反应以产生与接头连接的西罗珠单抗，然后添加放射性核素以使接头部分与放射性核素形成螯合物；其中所述试剂为：

其中R7是不存在；H；C1-C12杂烷基，优选C1-C6杂烷基；C1-C12烷基，优选C1-C6烷基；C3-C12环烷基，优选C3-C8环烷基；C6-C20芳基，优选C6-C12芳基；C3-C12杂环烷基，优选C3-C8杂环烷基；C6-C20杂芳基，优选C6-C12杂芳基；C1-C12烷基C6-C20芳基；C1-C12杂烷基C6-C20芳基；R8为-N＝C＝S；C1-C12烷基-N＝C＝S；C1-C12杂烷基-N＝C＝S；C6-C20芳基-N＝C＝S或C3-C8杂环烷基-N＝C＝S；

R9是H；-O-；-NH-；C1-C12杂烷基，优选C1-C6杂烷基；C1-C12烷基，优选C1-C6烷基；C3-C12环烷基，优选C3-C8环烷基；C6-C20芳基，优选C6-C12芳基；C3-C12杂环烷基，优选C3-C8杂环烷基；C6-C20杂芳基，优选C6-C12杂芳基；C1-C12烷基C6-C20芳基；C1-C12杂烷基C6-C20芳基；氧基C1-C12烷基；氧基C1-C12杂烷基；亚氨基C1-C12烷基；或亚氨基C1-C12杂烷基；

R10是不存在、

或者

其中R11是C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基；C1-C6亚烷基C6-C12芳基；C1-C6亚烷基C6-C12杂芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)NH-；或C1-C12亚杂烷基-NH-C(＝S)NH-；

R12是-N＝C＝S；C1-C12亚烷基-N＝C＝S；C1-C12亚杂烷基-N＝C＝S；C3-C12亚环烷基-N＝C＝S；C6-C20亚芳基-N＝C＝S；C6-C20亚杂芳基-N＝C＝S；或C3-C12亚杂环烷基-N＝C＝S。

在一个实施方案中，试剂可以选自

本发明的优点包括：

1.选择了靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的单克隆抗体西罗珠单抗搭载治疗性核素，增强治疗性核素在FAP阳性肿瘤的摄取与驻留，从而达到良好的治疗效果；

2.筛选了不同的方法搭载治疗核素，选择出最温和且稳定的标记方法，结合抗体优异的靶向功能和治疗核素的杀伤能力，开发出治疗能力强且副作用小的抗体缀合物；和

3.发明人发现对于西罗珠单抗，p-SCN-Bn-DOTA相对于其它接头类型在连接放射性核素中是优选的，例如具有更高的稳定性，在肿瘤中的摄取量高，在正常组织中的摄取量少，适合于用于肿瘤治疗。

附图说明

图1显示了Lu-177标记FAP单克隆抗体西罗珠单抗用于肿瘤的诊断成像和靶向放射性核素治疗。A图显示了Lu-177标记FAP单克隆抗体西罗珠单抗的合成路线。B图显示了Lu-177标记FAP单克隆抗体西罗珠单抗对癌细胞的杀伤作用的示意图。

图2显示了⁸⁹Zr标记西罗珠单抗的示意图。

图3显示了⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗在荷瘤小鼠中的成像。

图4显示了⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗在小鼠的肿瘤、血液和肌肉中的摄取值。

图5显示了不同接头的西罗珠单抗缀合物的成像：177Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗(左)、177Lu-DOTA-马来酰亚氨-西罗珠单抗(中间)和177Lu-DOTA-NCS--西罗珠单抗(右)。

图6显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在肿瘤小鼠和在阴性小鼠中的SPECT成像。图6的上部图中，左侧为HT-1080-载剂组；右侧为HT-1080-FAP组。图6的下部图中为HT-1080-载剂组。

图7显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在肿瘤小鼠中的SPECT成像。

图8显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在肿瘤小鼠中的生物分布研究。

图9显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚胺-西罗珠单抗在活体内的长时间代谢规律的图。

图10显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP肿瘤模型小鼠的治疗效果。

图11显示了Radio-HPLC检测结果。标记之后的抗体缀合物在radio-HPLC检测下的峰面积占比都在95％以上，说明放射性纯度都在95％以上。

图12显示了稳定性结果，从左至右，分别为¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗、¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗和¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚氨-西罗珠单抗。三种¹⁷⁷Lu标记的抗体缀合物的长时间的稳定性如图所示，¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚氨基-西罗珠单抗在24小时的放射纯度已经下降到了80％，¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗和¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的稳定性较为一致。原因可能为这两种结构具有相似性。但是¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的稳定性更好一些，经过七天的体外37度孵育后，稳定性保持在90％以上。

图13显示了SEC检测结果。标记之后的抗体缀合物在280nm检测下都为单峰，说明没有团聚现象产生。

图14和图15显示了抗体与接头部分的示意图。

图16显示了MALDI-TOF检测的西罗珠单抗分子量为149840道尔顿。

图17显示了mAb-NCS-DOTA(p-SCN-Bn-DOTA修饰的单克隆抗体)的分子量为150548.03道尔顿。

图18显示了mAb-NHS-DOTA(DOTA-NHS-酯修饰的西罗珠单抗)的分子量为150137。

图19显示了mAb-DFO(DFO修饰的单克隆抗体，实施例1制备)的分子量为151644。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对发明权利要求的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。虽然相信本领域普通技术人员充分了解以下术语，但仍陈述以下定义以有助于说明本发明所公开的主题。

如本文所使用，术语“一种”、“一个”、和“所述/该”当用于本申请(包括权利要求书)中时是指“一种(个)或多种(个)”。

除非另外指明，否则在说明书和权利要求书中所用的表示大小、反应条件等等的量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在本说明书和所附权利要求书中所阐述的数字参数是近似值，取决于通过本发明所公开的主题获得的所需特性，该近似值可以而变化。

如本文所使用，当提到大小(即，直径)、重量、浓度或百分含量的值或量时，术语“约”旨在包括一个实施例中，相对于规定量，改变±20％或±10％，在另一实施例中改变±5％，在另一实施例中改变±1％，并且在又另一实施例中改变±0.1％，因此，这些改变适于进行所公开的方法。

如本文所使用，当在实体的清单的情况下使用时，术语“和/或”是指单独或组合形式存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括独立地A、B、C及D，而且还包括A、B、C及D的任何及所有组合和子组合。

如本文所使用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括端点在内或是开放式的，并且不排除额外的未叙述的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的技术术语，意思指存在所述要素，但也可以增加其它要素并且仍形成在所述权利要求范围内的构造或方法。

如本文所使用，短语“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。

术语“抗体”(Ab)指具有特异性结合抗原的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任一种的衍生物。本发明的抗体可以包含免疫球蛋白的Fc结构域和抗原结合区。抗体一般含有两个CH2-CH3区和一个连接区，例如铰链区，例如至少一个Fc结构域。因此，本发明的抗体可以包含Fc区和抗原结合区。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区或“Fc”区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分，例如C1q，补体活化的经典途径中的第一成分。如本文使用的，除非与上下文相矛盾，否则免疫球蛋白的Fc区通常至少含有免疫球蛋白CH的CH2结构域和CH3结构域，并且可以包含连接区，例如铰链区。Fc区通常经由例如连接两个铰链区的二硫桥和/或两个CH3区之间的非共价相互作用而呈二聚化形式。二聚体可以是同二聚体(其中两个Fc区单体氨基酸序列是等同的)，或异二聚体(其中两个Fc区单体氨基酸序列在一个或多个氨基酸中不同)。优选地，二聚体是同二聚体。如本领域中众所周知的，全长抗体的Fc区片段可以例如通过用木瓜蛋白酶消化全长抗体来生成。除Fc区和抗原结合区之外，如本文定义的抗体可以进一步包含免疫球蛋白CH1区和CL区之一或两者。在本文中，抗体可以是具有单克隆抗体F19(ATCC登录号HB8269)的6个互补决定区的抗体。在一个实施方案中，抗体是具有HCCDR1-3序列为SEQ ID No.1-3和LC CDR1-3为SEQ ID No.4-6的抗体。或者，抗体可以是西罗珠单抗。

短语“西罗珠单抗”是一种针对成纤维细胞活化蛋白的商品化人源化单克隆抗体，例如购自勃林格殷格翰药业或者由药明康德定制。

术语“缀合物”是指抗体通过接头与放射性核酸连接形成的物质。在本文中，接头可以以R1-R2-R3表示，其中R1是用于螯合放射性核素的部分；R2是C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基；C1-C6亚烷基C6-C12芳基；C1-C6亚烷基C6-C12杂芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-C3-C12环烷基；并且R3是-C(＝O)-NR4-或-NR5-C(＝S)-NR6-，其中R4、R5和R6各自独立是H；C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；或C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基。

在一个实施方案中，接头部分可以螯合放射性核素。1个接头部分可以螯合1个放射性核素。在一个实施方案中，本发明的缀合物可以通过包括以下步骤的方法制备：按照西罗珠单抗:试剂＝1:1-1:10当量，例如1:4当量，试剂是p-SCN-Bn-DFO或DOTA-NHS-酯，使西罗珠单抗与试剂反应，例如于室温(例如，25-37℃加热块中)反应，例如1小时。对反应液加入放射性核素溶液，例如⁸⁹Zr溶液或Lu-177溶液(例如它们的盐溶液，例如草酸溶液)。可以置于室温(例如25-37℃)中反应，例如60分钟。将反应得到的缀合物纯化。例如将上述的反应溶液通过PD-10凝胶排阻柱；淋洗(例如通过加入0.9％生理盐水至总体积为2.5mL)；收集产品；任选地将上述注射用水溶液通过0.22μm无菌滤膜，制得产品制剂，例如⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗。在一个实施方案中，本发明的缀合物可以通过包括以下步骤的方法制备：将西罗珠单抗(例如1毫克)，TCEP溶液(例如15微升)，缓冲液(0.025M硼酸钠，0.025M氯化钠，50mMEDTA，例如150微升)反应(例如，37℃加热块中1小时)。按照西罗珠单抗:DOTA＝1:4当量称取马来酰亚氨-单酰胺-DOTA溶于DMSO中，加入到反应液中反应。例如，将EP管放在37℃加热块中反应1小时。任选地，将反应液放入超滤离心管中，加入PBS超滤浓缩，例如使浓缩液的体积为0.1mL。对反应液加入放射性核素溶液，例如⁸⁹Zr溶液或Lu-177溶液(例如它们的盐溶液，例如草酸溶液)。可以置于室温(例如25-37℃)中反应，例如60分钟。将反应得到的缀合物纯化。例如将上述的反应溶液通过PD-10凝胶排阻柱；淋洗(例如通过加入0.9％生理盐水至总体积为2.5mL)；收集产品；任选地将上述注射用水溶液通过0.22μm无菌滤膜，制得产品制剂。

在一个实施方案中，西罗珠单抗-接头缀合物上接的NCS-DOTA与西罗珠单抗数量比为1:1-4:1，例如3:1或2:1。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物为混合物，其中构成混合物的缀合物中NCS-DOTA与西罗珠单抗数量比各自为4:1、3:1、2:1或1:1，以及包含未缀合的抗体。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物中，NCS-DOTA与抗体数量比为1.28:1。

在一个实施方案中，西罗珠单抗-接头缀合物上接的NHS-DOTA与西罗珠单抗数量比为1:1-4:1，例如3:1或2:1。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物为混合物，其中构成混合物的缀合物中NHS-DOTA与西罗珠单抗数量比各自为4:1、3:1、2:1或1:1，以及包含未缀合的抗体。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物中，NHS-DOTA与西罗珠单抗数量比为0.77:1。

在一个实施方案中，西罗珠单抗-接头缀合物上接的DFO与西罗珠单抗数量比为1:1-4:1，例如3:1或2:1。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物为混合物，其中构成混合物的缀合物中DFO与西罗珠单抗数量比各自为4:1、3:1、2:1或1:1，以及包含未缀合的抗体。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物中，DFO与西罗珠单抗数量比为2.39:1。

在一个实施方案中，西罗珠单抗-接头缀合物上接的马来酰亚氨-单酰胺-DOTA与西罗珠单抗数量比为1:1-4:1，例如3:1或2:1。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物为混合物，其中构成混合物的缀合物中DFO与西罗珠单抗数量比各自为4:1、3:1、2:1或1:1，以及包含未缀合的抗体。在一个实施方案中，本申请制备的西罗珠单抗-接头缀合物中，DFO与西罗珠单抗数量比为2.06:1。

可适用于本发明的放射性核素可以从I、F、Tc、Re、Ga、In、Zr、Y、Ho、Sm以及Lu组成的组中选择，例如均可包括诊断用放射性同位元素I-125、F-18、Sc-44、Ga-67、Ga-68、Zr-89、Tc-99m或In-111等、或者治疗用放射性同位元素Sc-47、Y-90、Sm-153、Ho-166、Lu-177、Re-188、Pb-212、Bi-213或Th-232等。然而，可适用于本发明的放射性核素并不限于此，而是可以不受限制地包括作为用于治疗癌症等的治疗用放射性同位元素α射线放射性核素和β射线放射性核素，以及作为用于诊断的诊断用放射性同位元素的正电子放射性核素和γ射线放射性核素。所述放射性元素M优选为I或者F。

术语“癌症”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、黑素瘤、白血病和其它淋巴增殖性病症、及各种类型的头和颈癌。

“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支化的烃链基团，不含不饱和度，具有一至十二个碳原子(C1-C12烷基)、一至八个碳原子(C1-C8烷基)或一至六个碳原子(C1-C6烷基)，并且其通过单键连接至分子其余部分，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非特别在说明书中另有说明，烷基是任选经取代的。

“亚烷基”是指将分子其余部分连接至残基的直链或支化的二价烃链，仅由碳和氢组成，不含不饱和度，并且具有1-12个或1-6个碳原子，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键连接至分子其余部分并且通过单键连接至残基。亚烷基链与分子其余部分的连接点和与残基的连接点能够通过链中的一个碳或任何两个碳。除非说明书中特别另有说明，亚烷基是任选经取代的。

如本文所使用的术语“杂烷基”是指烷基中一个或多个(例如一到四个)环碳原子被选自-O-、-S-或-N-的基团取代的基团。

亚杂烷基指亚烷基中的一个或多个碳原子为氮、氧、硫等杂原子替代。亚杂烷基可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20碳原子。

“烷氧基”是指式-ORa基团，其中Ra是如前文所定义的含有1至12个或1至6个碳原子的烷基。除非说明书中特别另有说明，烷氧基是任选经取代的。

“环烷基”是指稳定的非芳族单环或多环碳环，其可以包括稠合的或桥连的环系，具有三至十五个碳原子，优选具有三至十个碳原子，并且其是饱和的或不饱和的和通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基包括例如环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。多环环烷基包括例如金刚烷基，降莰烷基，十氢萘基，7,7-二甲基-二环-[2.2.1]庚烷基等。除非说明书中特别另有说明，环烷基是任选经取代的。“杂环烷基”是指环烷基中的一个或多个碳原子被选自氮、氧和硫的杂原子替换的基团。

“芳基”是指环系包含至少一个碳环芳族环。在某些实施方案中，芳基包含6至18个碳原子。芳基环可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系。芳基包括但不限于衍生自下述的芳基：醋蒽，苊，醋菲烯，蒽，薁，苯，荧蒽，芴，不对称引达省，对称引达省，茚满，茚，萘，非那烯，菲，七曜烯，芘和三亚苯。除非说明书中特别另有说明，芳基是任选经取代的。

“杂芳基”是指5-至14-元环系统包含一至十三个碳原子，一至六个选自氮、氧和硫的杂原子，和至少一个芳族环。出于本公开的某些实施方式的意图，杂芳基残基可以是单环、双环、三环或四环的环系，其可以包括稠合的或桥连的环系；和杂芳基残基中的氮、碳或硫原子可以任选被氧化；氮原子可以任选被季铵化。实例包括但不限于氮杂卓基，吖啶基，苯并咪唑基，苯并噻唑基，苯并吲哚基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并呋喃基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并噻二唑基，苯并[b][1,4]二氧杂卓基，1,4-苯并二噁烷基，苯并萘并呋喃基，苯并噁唑基，苯并二氧杂环戊二烯基，苯并二氧杂环己二烯基，苯并吡喃基，苯并吡喃酮基，苯并呋喃基，苯并呋喃酮基，苯并噻吩基(苯并噻吩基)，苯并三唑基，苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基，苯并噁唑啉酮基，苯并咪唑亚硫酰基，咔唑基，噌啉基，二苯并呋喃基，二苯并噻吩基，呋喃基，呋喃酮基，异噻唑基，咪唑基，吲唑基，吲哚基，吲唑基，异吲哚基，吲哚啉基，异吲哚啉基，异喹啉基，吲嗪基，异噁唑基，萘啶基，噁二唑基，2-氧代氮杂卓基，噁唑基，氧化乙烯基，1-氧化吡啶基，1-氧化嘧啶基，1-氧化吡嗪基，1-氧化哒嗪基，1-苯基-1H-吡咯基，吩嗪基，吩噻嗪基，吩噁嗪基，酞嗪基，蝶啶基，蝶啶酮基，嘌呤基，吡咯基，吡唑基，吡啶基，吡啶酮基，吡嗪基，嘧啶基，嘧啶酮基，哒嗪基，吡咯基，吡啶并[2,3-d]嘧啶酮基，喹唑啉基，喹唑啉酮基，喹喔啉基，喹喔啉酮基，喹啉基，异喹啉基，四氢喹啉基，噻唑基，噻二唑基，噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-酮基，噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-酮基，三唑基，四唑基，三嗪基，和噻吩基(也即噻吩基)。除非说明书中特别另有说明，杂芳基是任选经取代的。

如本文所使用的术语“杂环烷基”或“杂环基”是指其中一个或多个(例如一到四个)环碳原子被选自-O-、-S-或-N-的基团置换的(完全饱和或部分饱和的)3到15元环烷基(例如杂环烯基)，例如上文所定义的那些环烷基。

如本文所使用的“亚基(-ylene)”是指一个化合物从形式上消去两个单价或一个双价的原子或基团，剩余的部分称为亚基。

如本文所使用的“亚芳基基团”可以指前述芳基基团的具有两个自由价的基团。

如本文所使用的术语“亚杂芳基”可以指前述杂芳基的具有两个自由价的基团。

如本文所用的术语“用于螯合放射性核素的部分”是指能够在缀合反应步骤中与放射性核素形成非共价键，从而形成稳定的放射性核素螯合物的部分。该部分可以是螯合剂的一部分。如本文所用的术语“螯合剂”是指包含官能团的有机部分，所述官能团能够在方法的反应步骤中与放射性核素形成非共价键，从而形成稳定的放射性核素螯合物。例如，螯合剂可以是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸(DO3A)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、p-SCN-Bn-DFO、p-SCN-Bn-HOPO或它们的混合物，优选DOTA。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN^TM)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ΦI1，参见例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994)；dynemicin包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(Adriamycin^TM)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；

雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(

Bristol-MyersSquibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他塞(docetaxel)(

Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)(Gemzar^TM)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)(Navelbine^TM)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。

如本文所用，“施用”是指向受试者给予一定剂量的化合物(例如，免疫检查点抑制剂)的方法。在一些方面，本文方法中使用的组合物是静脉内施用的。本文描述的方法中使用的组合物可以，例如，肌内地、静脉内地、皮内地、经皮地、动脉内地、腹腔内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、外用地、肿瘤内地、腹膜地、皮下地、结膜下地、囊内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、口服地、外用地、局部地、通过吸入、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接灌洗靶细胞、通过导管、通过灌洗、以乳剂或以脂质组合物的形式来施用。施用方法可以根据多种因素而变化(例如，待施用的化合物或组合物以及待治疗的病症、疾病或疾患的严重程度)。

使用方法

本文还提供了治疗、预防或改善受试者中癌症的方法或者用于诊断癌症的方法。该方法包括向受治疗者施用治疗有效量的一种或多种本文所述的缀合物或组合物。本文所述的缀合物或组合物可用于治疗人类(如儿科和老年人群)和动物(例如兽医应用)中的癌症。所公开的方法可任选地包括鉴定患有癌症或者可能需要治疗癌症的患者。本文所述缀合物或组合物可治疗的癌症类型的示例包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌。另外的示例包括肛门、胆管、骨、骨髓、肠(包括结肠和直肠)、眼、胆囊、肾、口腔、喉、食道、胃、睾丸、子宫颈、间皮瘤、神经内分泌、阴茎、皮肤、脊髓、甲状腺、阴道、外阴、子宫、肝、肌肉、血液细胞(包括淋巴细胞和其它免疫系统细胞)的癌症和/或肿瘤。本文所述缀合物或组合物可治疗的癌症的另外示例包括癌、卡波济氏肉瘤、黑素瘤、间皮瘤、软组织肉瘤、胰腺癌、肺癌、白血病(急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病及其它)、以及淋巴瘤(何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤)和多发性骨髓瘤。在一些示例中，癌症可选自乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。

本文所述的治疗或预防癌症的方法还可包括用一种或多种附加试剂(例如化疗剂或电离辐射)治疗。如本文所述的一种或多种附加试剂以及缀合物或组合物可以任何次序施用，包括同时施用，以及以最多至相隔数天的时间相间隔次序施用。该方法还可包括一次以上施用如本文所述的一种或多种附加试剂和/或缀合物或组合物。如本文所述的一种或多种附加试剂以及缀合物或组合物可通过相同或不同的途径施用。当用一种或多种附加试剂治疗时，可将如本文所述的缀合物或组合物结合到包含一种或多种附加试剂的药物组合物中。

例如，可将如本文所述的缀合物或组合物结合到具有上述化疗剂的药物组合物中。

本文还描述了抑制受试者中肿瘤生长的方法。该方法包括使肿瘤的至少一部分与治疗有效量的本文所述的缀合物或组合物接触的步骤。

本文还公开了在受试者体内或周围对癌症部位成像的方法。该方法可包括向受试者施用一定量的如本文所述的缀合物或组合物；并且对缀合物或组合物进行检测。该检测可包括本领域已知的方法，例如，正电子发射断层显像(PET)。此类成像方法可用于例如评估疾病的程度和/或治疗剂的靶标。

如本文所述的缀合物或组合物可用于预防性和治疗性治疗两者。如本文所用，术语治疗或处理包括预防；延缓发作；发病后病征或症状恶化的消减、消除或延缓；以及预防复发。为了预防性应用，将如本文所述的治疗有效量的缀合物或组合物在发病前(例如，在疾病或障碍的明显迹象之前)、早期发作期间(例如，在疾病或障碍的初始迹象和症状之时)、或疾病或障碍发展确立后施用给受治疗者。预防性施用可在疾病或障碍症状显现前数天至数年发生。治疗性治疗包括在诊断出疾病或障碍之后，向受治疗者施用治疗有效量的如本文所述的缀合物或组合物。

所公开的缀合物或组合物体内施用可通过本领域技术人员目前或预期已知的任何合适的方法和技术来实现。例如，可将所公开的缀合物或组合物以生理上或药学上可接受的形式进行配制，并且通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括例如经口、经鼻、经直肠、局部和经肠胃外施用途径。如本文所用，术语肠胃外包括例如通过注射皮下、真皮内、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内施用。所公开的化合物或组合物的施用可为单次施用，或以如本领域的技术人员可容易确定的连续或不同的间隔施用。

本文所公开的缀合物或组合物可根据制备药学上可接受的组合物的已知方法进行配制。制剂在本领域技术人员公知且易得的大量资料中详细描述。例如，E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Science(1995)描述了可与所公开的方法结合使用的制剂。一般来讲，本文所公开的缀合物或组合物可被配制成使得治疗有效量的缀合物或组合物与合适的赋形剂相混合，从而有利于缀合物或组合物的有效施用。所用组合物也可呈多种形式。这些包括例如固体、半固体和液体剂型，例如片剂、丸剂、粉末、液体溶液或悬浮液、栓剂、注射和输注溶液、以及喷剂。优选的形式取决于预期施用模式和治疗应用。该组合物还优选包括本领域技术人员已知的常规药学上可接受的载体和稀释剂。与缀合物或组合物一起使用的载体或稀释剂的示例包括乙醇、二甲基亚砜、甘油、氧化铝、淀粉、盐水、以及等同形式的载体和稀释剂。

适于施用的制剂包括例如含水无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期受体的血液等渗的溶质；以及含水和非水无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可在使用之前在仅需要无菌液体载体(例如注射用水)条件的冷冻干燥(冻干)条件下储存。临时注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒剂、片剂等制备。应当理解，除了上文具体提及的赋形剂之外，本文所公开的缀合物或组合物还可包括关系到所考虑制剂类型的本领域常规的其它试剂。

在某些示例中，可将本文所公开的缀合物或组合物任选地与药学上可接受的载体如惰性稀释剂联合在一个或多个解剖位置如不希望的细胞生长部位(诸如肿瘤部位或良性皮肤生长物，例如注射或局部施用于肿瘤或皮肤生长物)进行局部施用。可将本文所公开的缀合物或组合物任选地与药学上可接受的载体(诸如惰性稀释剂)或用于口服递送的可同化的食用载体例如经静脉内或经口联合全身性施用。其可被包封在硬或软壳明胶胶囊中，可被压制成片剂，或者可直接随患者饮食中的食物引入。对于口服治疗性施用，可将缀合物或组合物和一种或多种赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂、气溶胶喷雾等形式使用。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含以下物质：粘合剂，诸如黄蓍胶、金合欢、玉米淀粉或明胶；稀释剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、果糖、乳糖或天冬甜素，或者可添加调味剂，诸如胡椒薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当单位剂型为胶囊时，除了以上类型的材料之外，其还可包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其它材料可作为包衣存在或以其它方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、药丸或胶囊可涂覆有明胶、蜡、紫胶、或糖等。糖浆或酏剂可包含活性化合物、蔗糖或果糖(作为甜味剂)、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(作为防腐剂)、染料和调味剂，如樱桃或橙风味剂。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应当在所用的量下是药学上可接受的并且基本上无毒。

本文所公开的化缀合物或组合物可通过输注或注射经静脉内、肌内、或腹膜内施用。可在任选地与无毒表面活性剂混合的水中制备缀合物或组合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯和它们的混合物以及油中制备分散体。在常规储存和使用条件下，这些制剂可包含用于防止微生物生长的防腐剂。

适于注射或输注的药物剂型可包括含有活性成分的无菌水溶液或分散体或无菌粉末，其适用于临时制备任选地胶囊包封于脂质体中的无菌可注射或可输注溶液或分散体。最终剂型应当为无菌流体并且在制造和储存条件下很稳定。液体载体或媒介物可为溶剂或液体分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯、以及它们的适宜混合物。适当的流动性可例如通过形成脂质体，通过在分散体情况下维持所需粒度，或通过使用表面活性剂来维持。任选地，微生物作用的防止可由各种其它抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠等达到。在许多情况下，优选地包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。可注射组合物的长效吸收可通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶达到。

无菌可注射溶液如下制备：根据需要将本文所公开的化合物和/或试剂以所需量与各种其它以上列举的成分一起引入适当溶剂中，然后进行过滤灭菌。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其得到活性成分与先前无菌过滤的溶液中存在的任何附加期望成分的粉末。

还公开了在一个或多个容器中包含本文所公开的缀合物或组合物的试剂盒。所公开的试剂盒可任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一个实施方案中，试剂盒包括如本文所述的一种或多种其它组分、助剂或辅剂。在另一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种抗癌剂，诸如本文所述的那些化疗剂。在一个实施方案中，试剂盒包括说明如何施用试剂盒中缀合物或组合物的说明书或包装材料。试剂盒的容器可为任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并为任何合适的尺寸、形状或构造。在一个实施方案中，本文所公开的化合物和/或试剂在试剂盒中提供为固体，例如片剂、丸剂或粉末形式。在另一个实施方案中，本文所公开的化合物和/或试剂在试剂盒中提供为液体或溶液。在一个实施方案中，试剂盒包括安瓿或注射器，所述安瓿或注射器包含液体或溶液形式的本文所公开的化合物和/或试剂。

已经描述了本发明的多个实施方案。然而应当理解，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可以作出各种修改。相应地，其他实施方案在以下权利要求的范围内。

以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。

实施例

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外指明，所列出的所有量均基于总重以重量份数描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。

实施例1：⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗的制备

DFO修饰的单克隆抗体的合成

1.用氢氧化钠调节配制pH为9.0的PBS缓冲液，用醋酸调节配制pH为5.5的醋酸钠缓冲液。

2.按照西罗珠单抗(药明康德定制)：DFO＝1:4当量称取p-SCN-Bn-DFO溶于DMSO中。

3.用移液器吸取1mg单克隆抗体加入到4mL截留分子量50KDa的超滤离心管中，并加入PBS，超滤离心纯化至50-100μl。

4.将纯化好的抗体溶液移到1.5mL的蛋白质低结合(protein low-bind)EP管中，加入pH为9.0的PBS缓冲液到1mL，测其pH值，使pH值在8.8-9.0之间，慢慢加入p-SCN-Bn-DFO溶液。

5.将EP管放在37℃加热块中反应1小时。

6.将反应液放入超滤离心管中，加入PBS超滤浓缩，使浓缩液的体积为0.1mL。

⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗的制备

1.准备用于标记的⁸⁹Zr草酸溶液，测定其体积活度(活度大于2mCi/mL可用)，用0.2M碳酸钠和HEPES缓冲溶液调节pH到7.0左右。

2.取上一步的浓缩液，加入调好pH的⁸⁹Zr4+溶液(1mL)。

3.将离心管置于室温(37℃)中反应60分钟；

4.将上述的反应溶液通过PD-10凝胶排阻柱；

5.加入0.9％生理盐水至总体积为2.5mL淋洗；

6.后继续加入2.0mL 0.9％生理盐水收集产品；

7.将上述注射用水溶液通过0.22μm无菌滤膜，制得产品制剂。

8.radio-HPLC检测产品的放射性纯度与比活度，使用尺寸排除色谱柱(SEC)检测抗体是否有团聚。图11中显示了Radio-HPLC检测结果。标记之后的抗体缀合物在radio-HPLC检测下的峰面积占比都在95％以上，说明放射性纯度都在95％以上。图13显示了SEC检测结果。标记之后的抗体缀合物在280nm检测下都为单峰，说明没有团聚现象产生。

实施例2：⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗在荷瘤小鼠中的成像

1.将HT-1080-FAP或HT-1080细胞消化后置于PBS中，密度为10⁷细胞/毫升。

2.在5周龄雌性Nu/Nu小鼠的肩部皮下接种50微升的细胞溶液。

3.当肿瘤达到100～150mm³时，用于Micro-PET成像或者治疗实验。

取4只HT-1080-hFAP荷瘤鼠模型，经尾静脉注射5.55MBq⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗，在注射后3h到336h时间段内每天进行扫描，在异氟烷气氛(2％异氟烷-30％氧气/空气)下麻醉，在Mediso PET上进行显像研究，扫描时间为15分钟。成像时间点分别为3，6，18，24，36，48，72，96，120，144，168，192，216，240，264，288，312，336小时。

Micro-PET显像：如图3和图4中显示，PET成像显示抗体缀合物⁸⁹Zr-dfo-西罗珠单抗的肿瘤摄取显著高于其他器官。肿瘤摄取随时间不断升高，其他器官的摄取不断减小，其中肿瘤摄取值在最高为SUVmax＝18.36±2.28(192小时)，肝脏最高为SUV＝2.07±0.31(1小时)。

实施例3：¹⁷⁷Lu-177标记抗体的制备

选择三种不同的螯合剂分别为：DOTA-NHS-酯、马来酰亚氨-单酰胺-DOTA和p-SCN-Bn-DOTA，制备¹⁷⁷Lu-177标记的西罗珠单抗。

1)DOTA-NHS-酯修饰西罗珠单抗。

1.用氢氧化钠调节配制pH为9.0的PBS缓冲液，用醋酸调节配制pH为5.5的醋酸钠缓冲液。

2.按照西罗珠单抗：DOTA＝1:4当量称取DOTA-NHS-酯溶于DMSO中。

3.用移液器吸取1mg西罗珠单抗加入到4mL截留分子量50KDa的超滤离心管中，并加入PBS，超滤离心纯化至50-100μl。

4.将纯化好的抗体溶液移到1.5mL的蛋白质低结合EP管中，加入pH为9.0的PBS缓冲液到1mL，测其pH值，使pH值在8.8-9.0之间，慢慢加入步骤二中的DOTA-NHS-酯溶液。

5.将EP管放在37℃加热块中反应1小时。

6.将反应液放入超滤离心管中，加入PBS超滤浓缩，使浓缩液的体积为0.1mL。

2)马来酰亚氨-单酰胺-DOTA修饰单克隆抗体

1.配制1mM TCEP水溶液，反应缓冲液:0.025M硼酸钠，0.025M氯化钠，50mM EDTA。

2.用移液器吸取1mg西罗珠单抗加入到4mL截留分子量50KDa的超滤离心管中，并加入PBS，超滤离心纯化至50-100μl。

3. 1毫克西罗珠单抗，15微升TCEP溶液，150微升缓冲液，37℃加热块中反应1小时。

4.按照西罗珠单抗:DOTA＝1:4当量称取马来酰亚氨-单酰胺-DOTA溶于DMSO中，加入到反应液中。

5.将EP管放在37℃加热块中反应1小时。

6.将反应液放入超滤离心管中，加入PBS超滤浓缩，使浓缩液的体积为0.1mL。

3)p-SCN-Bn-DOTA修饰单克隆抗体

1.用氢氧化钠调节配制pH为9.0的PBS缓冲液，用醋酸调节配制pH为5.5的醋酸钠缓冲液。

2.按照西罗珠单抗：DOTA＝1:4当量称取p-SCN-Bn-DOTA溶于DMSO中。

3.用移液器吸取1mg西罗珠单抗加入到4mL截留分子量50KDa的超滤离心管中，并加入PBS，超滤离心纯化至50-100μl。

4.将纯化好的抗体溶液移到1.5mL的蛋白质低结合EP管中，加入pH为9.0的PBS缓冲液到1mL，测其pH值，使pH值在8.8-9.0之间，慢慢加入p-SCN-Bn-DOTA溶液。

5.将EP管放在37℃加热块中反应1小时。

6.将反应液放入超滤离心管中，加入PBS超滤浓缩，使浓缩液的体积小为0.1mL。

¹⁷⁷Lu标记的西罗珠单抗的制备

1.取上一步中所有的浓缩液(DOTA-NHS-酯修饰的西罗珠单抗，马来酰亚氨-单酰胺-DOTA修饰的单克隆抗体，p-SCN-Bn-DOTA修饰的单克隆抗体)，加入0.5毫升0.2M PH＝5的醋酸钠缓冲液。

2.加入10mCi活度的Lu-177溶液

3.将离心管置于室温(37℃)中反应60分钟；

4.将上述的反应溶液通过PD-10凝胶排阻柱；

5.加入0.9％生理盐水至总体积为2.5mL淋洗；

6.后继续加入2.0mL 0.9％生理盐水收集产品；

7.将上述注射用水溶液通过0.22μm无菌滤膜，制得产品制剂。

抗体与接头比率的测定

使用MALDI-TOF检测方法测量抗体和抗体-接头缀合物的分子量，得到二者的差值，从而确定抗体与接头比率。

如MALDI-TOF检测，西罗珠单抗分子量为149840道尔顿(图16)。mAb-NCS-DOTA(p-SCN-Bn-DOTA修饰的单克隆抗体)的分子量为150548.03道尔顿(图17)，则抗体-接头缀合物上接的NCS-DOTA与抗体数量比为(150548.03-149840.27)/551:1＝1.28:1(可接入的接头大于mAb-NHS-DOTA，表明能够负载更多的核素)。

mAb-NHS-DOTA(DOTA-NHS-酯修饰的西罗珠单抗)的分子量为150137(图18)，抗体-接头缀合物上接的NHS-DOTA与抗体数量比为(150137-149840)/387.19:1＝0.77:1。

mAb-DFO(DFO修饰的单克隆抗体，实施例1制备)的分子量为151644(图19)，抗体-接头缀合物上接的DFO与抗体数量比为(151644-149840)/752.9:1＝2.39:1。

以上缀合物与西罗珠单抗的连接位点为抗体的赖氨酸的氨基位点，为非特异性偶联。

mAb-maleimide-DOTA(马来酰亚氨-单酰胺-DOTA修饰的单克隆抗体)的分子量为150928.51，抗体缀合物上接的maleimide-DOTA与抗体数量比为(150928.51-149840.27)/527:1＝2.06:1。

该缀合物与抗体的连接位点为铰链区的半胱氨酸位点。

实施例4：¹⁷⁷Lu-DOTA-西罗珠单抗在荷瘤小鼠中的成像

1.将HT-1080-FAP或HT-1080细胞消化后置于PBS中，密度为10⁷细胞/毫升。

2.在5周龄雌性Nu/Nu小鼠的左肩皮下接种50微升的细胞溶液。

3.当肿瘤达到100～150mm³时，用于Micro-PET成像或者治疗实验。

取4只HT-1080-hFAP荷瘤鼠模型，经尾静脉注射18.5MBq不同形式的¹⁷⁷Lu-DOTA-西罗珠单抗，即¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗，¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚氨-西罗珠单抗，¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗，在注射后24h和48时进行扫描，在异氟烷气氛(2％异氟烷-30％氧气/空气)下麻醉，在Mediso SPECT上进行显像研究，扫描时间为20分钟。

Micro-SPECT显像：如图5中显示，从成像结果明显看出¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚氨-西罗珠单抗由于在修饰抗体过程中经过TCEP还原，打断了铰链区二硫键，导致单克隆抗体的结构被破环，在体内的代谢受到了极大的影响。¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗和177Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在动物体内的代谢无较大差别，这是由于NHS和NCS基团都是与抗体裸露的氨基进行反应，且反应条件一致。但是，¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的稳定性更好，经过七天的体外37度孵育后，稳定性保持在90％以上(图12)。因此，成像和治疗实验采用¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗。

实施例5：¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP和HT-1080肿瘤鼠的SPECT成像

1.将HT-1080-FAP(委托药明康德构建，其表达FAP基因)或HT-1080细胞消化后置于PBS中，密度为10⁷细胞/毫升。

2.在5周龄雌性Nu/Nu小鼠的左肩皮下接种50微升的HT-1080细胞溶液，右肩接种50微升的HT-1080-FAP细胞溶液。

为了验证¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的靶点特异性，在一只小鼠的左右两侧分别接种了阴性和阳性肿瘤细胞(HT-1080-FAP和HT-1080)。双侧肿瘤体积为200立方毫米时进行成像，尾静脉注射18.5MBq¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗，在注射后24小时和48小时进行扫描，在异氟烷气氛(2％异氟烷-30％氧气/空气)下麻醉，在Mediso SPECT上进行显像研究，扫描时间为20分钟。

图6中显示了扫描结果，表明在阳性肿瘤和阴性肿瘤的摄取差异非常明显。为了进一步排除由于阳性肿瘤的摄取太高，导致阴性肿瘤摄取不高。在只有阴性肿瘤的小鼠上进行了成像。结果如图6所示。结果证明在阴性肿瘤中，¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗基本无摄取，从而说明¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗针对FAP靶点有优异的特异性。

实施例6：¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP肿瘤小鼠中的SPECT成像

为了观察¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在活体内的长时间代谢规律，在HT1080-FAP荷瘤小鼠(n＝4)中进行SPECT成像，尾静脉注射37MBq¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗，在注射后3，4，6，10天等时间段内进行扫描，在异氟烷气氛(2％异氟烷-30％氧气/空气)下麻醉，在MedisoSPECT上进行显像研究，扫描时间为20分钟。

结果显示：¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗主要分布在小鼠的肿瘤部位，长时间成像与PET成像一致，如图7中显示。

实施例7：¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP肿瘤小鼠中的生物分布研究

为了观察¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在活体内的长时间代谢规律，对荷瘤小鼠尾静脉注射1.85MBq¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗，在第1，4，7，10天对荷瘤小鼠进行生物分布研究。

结果显示：如下表1和图8所示，生物分布显示第1，4，7，10天肿瘤的摄取分别为23.04±5.11，33.2±6.36，19.87±6.84，19.02±5.90％ID/g，肝脏中的摄取为11.13±3.11，10.29±3.23，9.36±2.98，4.78±1.17％ID/g。

表1¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的体内分布

不同时间点肿瘤与不同器官的比值如下，肿瘤与肾脏的比值在第1，4，7，10天分别为5.89，16.4，13.4，34.6；肿瘤与血液的比值在第1，4，7，10天分别为3.90，146，129，169；肿瘤与肌肉的比值在第1，4，7，10天分别为24.5，213，207，173；肿瘤与肝脏的比值在第1，4，7，10天分别为2.07，3.22，2.12，3.98。图9显示了上述结果的柱状图。

实施例8：¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP肿瘤模型小鼠的治疗效果

Lu-177治疗实验中：尾静脉注射对照组(生理盐水)、西罗珠单抗抗体组和缀合物组，在第17和第16天到达死亡终点，¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗的四组治疗剂量(18.5MBq、11.1MBq、7.4MBq、3.7MBq)均都能对肿瘤生长完全抑制至肿瘤消失，且持续观察两个月无复发情况出现。图10显示了¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗在HT-1080-FAP肿瘤模型小鼠的治疗效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列

实施例中的西罗珠单抗重链序列

(抗体中的偶联位点为铰链区的半胱氨酸位点，粗体标记)。

实施例中的西罗珠单抗轻链序列

序列表

<110> 北京药明博锐生物科技有限公司

<120> 缀合物、其制备方法和用途

<130> C21P0218

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC CDR1

<400> 1

Glu Tyr Thr Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC CDR2

<400> 2

Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HC CDR3

<400> 3

Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC CDR1

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC CDR2

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC CDR3

<400> 6

Gln Gln Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 重链序列

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 8

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 轻链序列

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

115 120 125

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

130 135 140

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

145 150 155 160

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

165 170 175

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

180 185 190

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

195 200 205

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215 220

Claims (15)

1.缀合物，其具有放射性核素-接头-抗体的结构，其中抗体是西罗珠单抗，优选地包含分别以SEQ ID NO.1-3显示的HC CDR 1-3和分别以SEQ ID NO.4-6显示的LC CDR1-3的抗体，其中接头以R1-R2-R3表示，其中R1是用于螯合放射性核素的部分；R2是C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基；C1-C6亚烷基C6-C12芳基；C1-C6亚烷基C6-C12杂芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)-NH-C3-C12环烷基；C1-C12亚烷基-C(＝O)-NH-C1-C12亚烷基，优选-CH2-C(＝O)-NH-CH2-CH2-；并且R3是

-C(＝O)-NR4-或-NR5-C(＝S)-NR6-，其中R4、R5和R6各自独立是H；C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；或C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中接头是

并且放射性核素与接头螯合。

3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中接头与抗体的可变区外的区域，诸如Fc区中的氨基酸的一个或多个氨基或-SH基团连接。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的缀合物，其中所述放射性核素选自Lu-177、Zr-89、I-125、F-18、Sc-44、Ga-67、Ga-68、Tc-99m、In-111、Sc-47、Y-90、Sm-153、Ho-166、Re-188、Pb-212、Bi-213和Th-232。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其结构为⁸⁹Zr-DFO-西罗珠单抗、¹⁷⁷Lu-DOTA-NCS-西罗珠单抗、¹⁷⁷Lu-DOTA-NHS-西罗珠单抗或¹⁷⁷Lu-DOTA-马来酰亚胺基-西罗珠单抗，优选地，其中接头-核素部分与西罗珠单抗的比率为1:1以上。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其包含如下结构：

其中

表示放射性核素。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的缀合物，其具有以下结构：

8.药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物和药学可接受的载体；优选地，药物组合物还包含化疗剂。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物或根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于受试者中的体内成像的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述体内成像是针对受试者中的癌症的体内成像，优选地，其中所述癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌。

11.根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物或根据权利要求8所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防受试者中的癌症。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述癌症选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物或根据权利要求8所述的药物组合物在体外抑制癌细胞生长的用途，优选地，癌细胞选自膀胱癌、脑癌、乳腺癌、结肠直肠癌、宫颈癌、胃肠癌、泌尿生殖道癌、头颈癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、皮肤癌、黑素瘤和睾丸癌细胞。

14.一种制备根据权利要求1-7中任一项所述的缀合物的方法，其包括将试剂与抗体，诸如西罗珠单抗反应，例如以西罗珠单抗:试剂＝1:1-1:10当量反应以产生与接头连接的西罗珠单抗，然后添加放射性核素以使接头部分与放射性核素形成螯合物；其中所述试剂为：

其中R7是不存在；H；C1-C12杂烷基，优选C1-C6杂烷基；C1-C12烷基，优选C1-C6烷基；C3-C12环烷基，优选C3-C8环烷基；C6-C20芳基，优选C6-C12芳基；C3-C12杂环烷基，优选C3-C8杂环烷基；C6-C20杂芳基，优选C6-C12杂芳基；C1-C12烷基C6-C20芳基；C1-C12杂烷基C6-C20芳基；R8为-N＝C＝S；C1-C12烷基-N＝C＝S；C1-C12杂烷基-N＝C＝S；C6-C20芳基-N＝C＝S或C3-C8杂环烷基-N＝C＝S；

R9是H；-O-；-NH-；C1-C12杂烷基，优选C1-C6杂烷基；C1-C12烷基，优选C1-C6烷基；C3-C12环烷基，优选C3-C8环烷基；C6-C20芳基，优选C6-C12芳基；C3-C12杂环烷基，优选C3-C8杂环烷基；C6-C20杂芳基，优选C6-C12杂芳基；C1-C12烷基C6-C20芳基；C1-C12杂烷基C6-C20芳基；氧基C1-C12烷基；氧基C1-C12杂烷基；亚氨基C1-C12烷基；或亚氨基C1-C12杂烷基；

R10是不存在、

或者

其中R11是C1-C12亚烷基，优选C1-C6亚烷基；C1-C12亚杂烷基，优选C1-C6亚杂烷基；C3-C12亚环烷基，优选C3-C8亚环烷基；C3-C12亚杂环烷基，优选C3-C8亚杂环烷基；C6-C20亚芳基，优选C6-C12亚芳基；C6-C20亚杂芳基，优选C6-C12亚杂芳基；C1-C6亚烷基C6-C12芳基；C1-C6亚烷基C6-C12杂芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12芳基；C1-C6亚杂烷基C6-C12杂芳基；C1-C12亚烷基-NH-C(＝S)NH-；或C1-C12亚杂烷基-NH-C(＝S)NH-；且

R12是-N＝C＝S；C1-C12亚烷基-N＝C＝S；C1-C12亚杂烷基-N＝C＝S；C3-C12亚环烷基-N＝C＝S；C6-C20亚芳基-N＝C＝S；C6-C20亚杂芳基-N＝C＝S；或C3-C12亚杂环烷基-N＝C＝S。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述试剂选自

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