WO2023219164A1

WO2023219164A1 - 医薬、キット及びシステム

Info

Publication number: WO2023219164A1
Application number: PCT/JP2023/017950
Authority: WO
Inventors: 宏昭喜納; 一則片岡; 伸宏西山; 雄士本田; 周平長尾; 貴大野本
Original assignee: 公益財団法人川崎市産業振興財団
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-11-16

Abstract

哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用され、前記複合体を含有し、前記複合体が、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む、医薬。

Description

医薬、キット及びシステム

　本発明は、医薬、キット及びシステムに関する。
　本願は、２０２２年５月１３日に、日本に出願された特願２０２２－０７９７４１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

　遺伝性疾患は、遺伝子の変異によって引き起こされる病気である。現在アメリカでは、7000種類以上の希少疾患があり、アメリカ人の3000万人、つまり全人口の約10%が遺伝性疾患に罹患していると概算されている。全米希少疾患協会によると、世界中に数億人の患者がいるといわれており、全患者の3分の2は小児である。しかしながら、これらの患者の95％以上に対して有効な治療法はなく、遺伝性疾患に対して承認されている数少ない治療薬によって症状の進行を遅らせたり、多少回復させたりする程度である。これらの治療薬は、病気の根本的な原因である遺伝的要因には対処できないので、薬剤を生涯にわたって投与しなければならないのが現状である。したがって、このような遺伝性疾患に対する治療薬を開発し、単回投与で遺伝子の修復をすることによって生涯にわたって患者の症状を軽減または消失させることが望まれている。

　遺伝子治療は、例えば、非ウイルス性またはウイルス性のベクター等を用いて遺伝子を標的細胞に導入し、欠陥のある遺伝子を修正または補充することによって病気の治療及び／又は予防を行う方法である。遺伝子治療の利点は、繰り返し投与を必要とせず効果が持続的に継続し、生体外遺伝子治療であるex vivo および生体内遺伝子治療in vivo の両方を用いることができる点である。特定の遺伝子の欠損によって引き起こされるほとんどの疾患は、欠損した遺伝子を送達することによって改善することができる。このような利点から、遺伝子治療は単発性遺伝子疾患、がん、心血管疾患、神経変性疾患など多くの疾患に対する治療法として利用可能であり、非常に有望視されている。

　2012年11月に、遺伝子治療薬の第一号となるGlyberaが承認された。Glyberaは、血清型1のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、リポ蛋白質リパーゼ欠乏症 (LPLD : lipoprotein lipase deficiency) 患者を対象とした遺伝子治療薬である。また、2019年5月には、血清型9のアデノ随伴ウイルスベクターを用いたZolgensmaが脊髄性筋萎縮症の治療薬として承認された。
　このように、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた遺伝子導入ベクターは、その高い安全性と遺伝性疾患に対する治療効果から、多くの遺伝子治療試験で利用され、治療効果が実証されつつある。

　本発明者らは、これまでに、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質（例えばＡＡＶ）と、を含む複合体を開発している（特許文献１）。

国際公開第２０２０／２４１８１９号

　しかし、特許文献１に示されるような複合体の標的部位への送達の効率化については未だ検討の余地がある。

　本発明は、上記のような問題点を解消するためになされたものであり、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む複合体を含有し、標的部位への送達効率が向上した医薬を提供することを目的とする。
　また、前記医薬を備えるキット、およびシステムを提供することを目的とする。

　本発明は以下の態様を含む。

（１）　哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、
　前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用され、
　前記複合体を含有し、
　前記複合体が、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む、医薬。
（２）　前記複合体が、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質と、を含む、前記（１）に記載の医薬。
（３）　前記ジオール構造を有する化合物が、ポリフェノールである、前記（２）に記載の医薬。
（４）　前記ジオール構造を有する化合物が、タンニン酸、没食子酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一種である、前記（２）に記載の医薬。
（５）　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記バブルの投与時点から５分経過以後に行われる、前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の医薬。
（６）　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記超音波の照射時点から３時間経過以前に行われる、前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の医薬。
（７）　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記バブルの投与時点から２０分経過以後であり、前記工程Ａ１における前記超音波の照射時点から６０分経過未満である、前記（１）～（６）のいずれか一つに記載の医薬。
（８）　前記方法が、前記工程Ａ１及び前記工程Ｂの後に、前記哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の前記対象領域に超音波を照射する工程Ａ２を更に含む、前記（１）～（７）のいずれか一つに記載の医薬。
（９）　前記超音波が、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）である、前記（１）～（８）のいずれか一つに記載の医薬。
（１０）　前記バブルが、バブルリポソームである、前記（１）～（９）のいずれか一つに記載の医薬。
（１１）　前記複合化する物質が、ウイルスベクターである、前記（１）～（１０）のいずれか一つに記載の医薬。
（１２）　前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、前記（１１）に記載の医薬。
（１３）　前記（１）～（１２）のいずれか一つに記載の医薬と、バブルとを備える、キット。
（１４）　哺乳動物に超音波を照射する超音波照射装置と、前記（１）～（１２）のいずれか一つに記載の医薬と、を備えるシステム。

　本発明によれば、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む複合体を含有し、標的部位への送達効率が向上した医薬を提供できる。
　また、本発明によれば、前記医薬を備えるキット、およびシステムを提供できる。

実施形態の医薬に含有される複合体の、概略的な構成の一例を示す模式図である。実施形態の医薬に含有される複合体の、生体内における構成の一例を示す模式図である。実施例における各実験の手順を説明する模式図である。実施例において、各ＡＡＶ９サンプルを投与したマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発現比率を示すグラフである。図３に示される結果のうち、各ＡＡＶ９サンプルの脳／肝臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。実施例において、マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射後、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を示すグラフである。実施例において、マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射から１分後に、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を示すグラフである。実施例において、マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射から３０分後に、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を示すグラフである。実施例において、マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射から１時間後に、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を示すグラフである。図６Ａ～Ｃに示される結果のうち、脳及び肝臓における結果を抜粋し、ＡＡＶ９サンプルの種類毎に並べ替えたグラフである。図６Ａ～Ｃに示される結果の、各ＡＡＶ９サンプルの脳／肝臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。図６Ａ～Ｃに示される結果の、各ＡＡＶ９サンプルの脳／腎臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。図６Ａ～Ｃに示される結果の、各ＡＡＶ９サンプルの脳／心臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。実施例において、マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射から１時間後に、各ＡＡＶ９サンプルが投与され、２４時間後に再度マイクロバブル投与及びＨＩＦＵ照射されたマウスの各組織での、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を示すグラフである。図９に示される結果を含む、各ＡＡＶ９サンプルの脳／肝臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。図９に示される結果を含む、各ＡＡＶ９サンプルの脳／腎臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。図９に示される結果を含む、各ＡＡＶ９サンプルの脳／心臓での遺伝子発現量の値を示すグラフである。実施例において、マイクロバブルの投与の有無の違いによる、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度を比較した結果を示すグラフである。実施例の実験６における実験スケジュールを示す図である。実施例において、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの血中ＧＰＴ／ＡＬＴの経時変化を示すグラフである。実施例において、各ＡＡＶ９サンプルが投与されたマウスの血液パラメータの値を示すグラフである。実施例において、各ＡＡＶ９－ＧＦＰサンプルを投与されたマウスの脳水平断面の抗ＧＦＰ抗体染色像及びＨＥ染色像を示す。スケールバー：１０００μｍ。実施例において、各ＡＡＶ９－ＧＦＰサンプルを投与されたマウスの脳水平断面における各部位のGFP陽性細胞数を示す。実施例において、各ＡＡＶ９－ＧＦＰサンプルを投与されたマウスの脳における、ＡＡＶ９感染部位と各神経細胞マーカーの共局在を評価した免疫染色画像を示す。スケールバー：２０μｍ。

　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。

　本明細書において記載される高分子、ベクター、タンパク質、ペプチド、核酸及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。

　以下、本発明の医薬、キット及びシステムの実施形態を説明する。

≪医薬≫
　実施形態の医薬は、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用され、前記複合体を含有し、前記複合体が、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む。

　実施形態の医薬は、前記複合体を有効成分として含有することができる。有効成分としての複合体は、疾病に対する薬理効果を有することができる。そのような複合体としては、複合体における前記高分子と複合化する物質が薬理作用を有するものが挙げられる。この場合、高分子と複合化する物質が、実施形態の医薬の有効成分であるともいえる。当該物質としては、医薬的に活性な成分が挙げられ、例えば、薬理作用を有する任意のタンパク質；タンパク質型医薬；ベクター；ウイルスベクター等の治療用ウイルス；核酸；核酸医薬；低分子医薬等が挙げられる。これらの詳細については、後述する。

＜方法＞
　従来、バブルの投与と超音波照射とを組み合わせた方法は、薬剤の浸透性、及び／又は遺伝子導入の効率を向上させる技術として用いられてきた。

　当該方法は、血液脳関門（ＢＢＢ：blood-brain barrier）を開くための技術としても利用できる。血液脳関門（ＢＢＢ）は、脳毛細血管内皮細胞によって形成される、細胞の密着結合層である。血液脳関門（ＢＢＢ）は、高分子薬剤の１００％、低分子薬剤の９８％以上を脳から排除しているとされる。バブルの投与と、超音波（例えば、高密度焦点式超音波（HIFU : High Intensity Focused Ultrasound））の照射とを併用することにより、低侵襲で、血管及び血液脳関門を一時的に開口することができる。

　実施形態の医薬は、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂとを含む方法に使用されることで、当該方法に使用されずに前記複合体が対象の哺乳動物に投与された場合に比べ、前記複合体の標的部位への送達効率が向上する。

　複合体の標的部位への送達効率の向上は、標的部位である器官、組織、細胞等における、前記複合体の蓄積量、及び前記複合体に由来するタンパク質の発現量等を指標として、前記複合体の標的部位への送達量を確認することで評価できる。

　ここでの送達対象である標的部位は、前記工程Ａ１において超音波を照射した対象領域を含むことができる。標的部位は、超音波を照射する対象領域と同一領域であってもよい。あるいは、標的部位は、超音波と相互作用したバブルによる作用が及ぶ範囲であれば、更に対象領域外の部位を含んでいてもよい。当該作用としては、超音波照射によって生じるバブルの振動および圧壊が挙げられる。

　後述の実施例に示されるように、本発明者らは、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の脳に超音波を照射し、前記哺乳動物に複合体を投与することで、前記哺乳動物の脳において、複合体に由来する遺伝子発現を向上可能であることを見出した。

　また、複合体の送達効率の向上の一つの側面として、標的部位への送達の選択性の向上が挙げられる。

　後述の実施例に示されるように、本発明者らは、脳を標的部位として、上記の工程Ａ１の実施と、工程Ｂの実施との間に時間差を設けることで、複合体の標的部位への送達の選択性を向上可能であることを見出した。
　このような時間差を設けることにより、送達の選択性が向上されることは、予想外の事象である。このような時間差を設けることにより、複合化していない物質単体が投与された場合よりも、複合体が投与された場合で顕著に観察される。

　複合体の標的部位への選択性の向上は、標的部位外における前記複合体の送達量に対する、標的部位における前記複合体の送達量の比が、複合体化されていない上記タンパク質等の物質単体での前記送達量の比よりも向上されたことに基づき評価できる。

　ここで標的部位との比較対象とする標的部位外としては、送達対象としない哺乳動物の主要臓器が挙げられ、例えば、肝臓、腎臓、又は心臓を例示でき、肝臓又は腎臓が好ましい。

　例えば、後述の実施例においては、脳に超音波を照射した場合の、肝臓におけるＡＡＶ９複合体の送達量に対する、脳におけるＡＡＶ９複合体の送達量の比（脳／肝臓）が、ＡＡＶ９単体の前記送達量の比（脳／肝臓）よりも向上されたことが確認されている。

　以下、前記方法における各工程の詳細について説明する。

（工程Ａ１）
　工程Ａ１は、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程である。

・バブル
　実施形態に係る方法に用いられるバブルは、任意の気体を含む気泡であってよい。バブルは、投与対象の哺乳動物の血液中を循環可能であって、超音波のエネルギーと相互作用可能なものであれば特に限定されず、当分野で通常用いられるバブルを利用可能である。また、市販のバブル製剤を使用してもよい。

　バブルは、マイクロバブルであってもよく、ナノバブルであってもよい。バブルの平均粒子径は、投与対象の哺乳動物の血液中を循環可能なサイズであり、例えば、０．５～１０μｍであってよく、１～５μｍであってよい。

　バブルは、その特性から超音波造影剤としても好適に用いられており、実施形態に係る方法におけるバブルとして、超音波造影剤として使用されるバブル製剤を用いることもできる。

　バブルが含む気体としては、パーフルオロメタン、パーフルオロプロパン、パーフロオロブタン等のパーフルオロカーボンの他、空気、窒素、六フッ化硫黄等が挙げられ、超音波造影ガスとして好適に用いられるガスを含んでいてもよい。

　バブルは、任意の成分をシェルとして有することができ、当該シェルの内部に前記気体が内包されていてもよい。シェルを構成する成分としては、例えば、乳酸・グリコール酸共重合体、ポリアクリル酸、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリエチレングリコール、ポリオキサゾリン等のポリマー；アルブミン等のタンパク質；パルミチン酸等の脂肪酸、コレステロール、リン脂質等の脂質；ガラクトース等の糖類；界面活性剤などが挙げられる。

　バブルは、気体の封入及び保持の効率に優れるとの観点から、バブルリポソームであることが好ましい。バブルリポソームは、前記シェルとして脂質層、好ましくは脂質二重層を有し、該脂質膜の内部に気体を包含するものである。該脂質としてはホスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルグリセロール等のリン脂質が挙げられる。リン脂質の具体例としては、ジパミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルフォスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）等が挙げられる。

　バブルのシェルの表面は、シェルの構成成分とは異なる成分により更に修飾されていてもよい。例えば、ポリエチレングリコール等のポリマーで修飾されていてもよい。

　哺乳動物へ投与されたバブルは血液循環により全身投与されることが好ましい。バブルの投与は血管内投与であってよく、静脈又は動脈への注射又は点滴により行われることが好ましい。バブルは、注射用水等の媒体に懸濁された状態で投与されてよい。

・超音波照射
　超音波照射は、対象領域に超音波を照射可能な、超音波照射装置により実施することができる。超音波照射装置は、前記超音波を発生させる超音波振動子を有することができる。超音波照射装置は市販のものを使用可能である。

　超音波照射の条件は、対象領域の種類等に応じて適宜選定して実施可能である。

　前記超音波は、より局所的な照射が可能であることから、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）であることが好ましい。対象領域にＨＩＦＵを照射可能な超音波照射装置は、市販のものを使用可能である。

　超音波の照射強度は、一例として、１００～３０００Ｗ／ｃｍ²であってよく、１５０～２０００Ｗ／ｃｍ²であってよい。別の側面としては、超音波の照射強度は１００～４５０Ｗ／ｃｍ²であってよい。

　工程Ａ１の１回あたりの超音波照射時間は、照射強度によっても適宜選定可能であり、一例として、５秒～６０分であってよく、７秒～５分であってよく、１０秒～１分であってよい。

　超音波の周波数は、対象領域の深度等によって適宜選定可能であり、一例として、０．１～１０ＭＨｚであってよく、０．８～３ＭＨｚであってよい。

　超音波を照射する対象領域としては、頭部を含むことが好ましく、脳を含むことがより好ましく、血液脳関門を含むことがさらに好ましい。

　哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の脳に超音波（好ましくはHIFU）を照射すると、脳血管を循環しているバブルに超音波が照射され、超音波エネルギーによってバブルが刺激され，安定した振動を発生する。これらの振動によってBBB透過性に関与する内皮細胞間のタイトジャンクション蛋白の一過性のダウンレギュレーションが引き起こされ、血液脳関門を一時的に開門させることができるとされる。血液脳関門を開門させることで、脳への複合体の透過性を向上させ、例えば脳疾患の効果的な治療が可能になる。

　哺乳動物としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ウマ等を例示できる。

（工程Ｂ）
　工程Ｂは、前記哺乳動物に複合体を投与する工程である。複合体の構成については、後に詳述する。

　哺乳動物へ投与された複合体は血液循環により全身投与されることが好ましい。複合体の投与は血管内投与であってよく、静脈又は動脈への注射又は点滴により行われることが好ましい。複合体は、注射用水等の媒体に懸濁された状態で投与されてよい。

　実施形態の医薬に係る前記方法において、工程Ａ１と工程Ｂとは同時に実施してもよいが、工程Ａ１と工程Ｂとの実施とに時間差を設けることが好ましい。工程Ａ１と工程Ｂとの実施の順序は、工程Ａ１の後に工程Ｂを実施してもよく、工程Ｂの後に工程Ａ１を実施してもよい。
　工程Ａ１の後に工程Ｂを実施、又は工程Ｂの後に工程Ａ１を実施することで、複合体の標的部位への送達の選択性を向上可能である。

　工程Ａ１の後に工程Ｂを実施する場合（即ち、哺乳動物へのバブルの投与と、前記哺乳動物の対象領域への超音波の照射とが完了した後に、前記哺乳動物に複合体を投与する場合）、工程Ａ１における複合体の標的部位への選択性を効果的に向上可能であるとの観点から、前記方法において、前記工程Ｂにおける複合体の投与が、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点から５分経過以後に行われることが好ましい。前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点から７分経過以後であってもよく、１０分経過以後であってもよく、１５分経過以後であってもよく、２０分経過以後であってもよく、２５分経過以後であってもよく、３０分経過以後であってもよく、３５分経過以後であってもよく、４０分経過以後であってもよく、４５分経過以後であってもよく、５０分経過以後であってもよく、５５分経過以後であってもよく、６０分経過以後であってもよく、２時間経過以後であってもよく、３時間経過以後であってもよい。

　前記工程Ｂにおける複合体の投与の、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点からの上記経過時間の上限値としては、工程Ａ１における超音波の照射時点からの経過時間を考慮して適宜定めてもよく、バブルの投与時点から４８時間経過以前であってよく、３６時間経過以前であってよく、２４時間経過以前であってよく、１２時間経過以前であってよく、３時間経過以前であってよく、６０分経過以前であってよく、６０分経過未満であってよく、５０分経過以前であってよく、４５分経過以前であってよい。

　上記投与間隔の数値範囲は、上記の上限及び下限として例示した数値を適宜組み合わせることができる。例えば、前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点から５分経過以後４８時間経過以前であってもよく、７分経過以後３６時間経過以前であってもよく、１０分経過以後２４時間経過以前であってもよく、１５分経過以後１２時間経過以前であってもよく、１５分経過以後３時間経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過未満であってもよく、２５分経過以後５０分経過以前であってもよく、２５分経過以後４５分経過以前であってもよい。

　本明細書において「経過以後」とは、経過した時点と、その時点よりも後の時点とを含む。例えば、バブルの投与時点から５分経過以後とは、バブルの投与時点から５分後及び５分後より後の時を意味する。
　本明細書において「経過以前」とは、経過した時点と、その時点よりも前の時点とを含む。例えば、バブルの投与時点から４８時間経過以前とは、バブルの投与時点から４８時間後及び４８時間後より前の時を意味する。
　本明細書において「経過未満」とは、経過した時点を含まず、その時点よりも前の時点を含む。例えば、バブルの投与時点から６０分経過未満とは、バブルの投与時点から６０分経過せず、６０分経過より前の時を意味する。

　バブルの投与から、複合体の投与までの間で時間差を設けることで、標的部位への複合体の送達の選択性を向上可能であることのメカニズムの詳細は明らかではない。しかし、投与されたバブルが次第に消失することを考慮すると、バブルの投与と、複合体の投与との間に時間差を設けることで、バブルと複合体との相互作用を防止でき、複合体本来の機能をより良好に発揮可能であると推察される。

　なお、前記工程Ａ１における哺乳動物への前記バブルの投与と、前記超音波の照射とは、同時に実施することが好ましいが、同時に実施しなくともよい。同時に実施しない場合には、哺乳動物にバブルを投与した後に、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射することが好ましい。

　バブルと超音波との相互作用を効果的に生じさせるとの観点からは、バブルの投与から超音波の照射までの間隔は短いほうがよく、バブルの投与時点から６０分経過以前であってよく、３０分経過以前であってよく、１０分経過以前であってよく、７分経過以前であってよく、５分経過以前であってよく、３分経過以前であってよく、１分経過以前であってよい。

　なお、工程Ａ１の後に工程Ｂを実施する場合、工程Ｂにおける複合体の投与は、工程Ａ１におけるバブル投与および超音波照射の後に実施されるよう、バブル投与と超音波照射との実施間隔を設定するものとする。即ち、バブルの投与時点から超音波の照射までの経過時間は、バブルの投与時点から複合体投与までの経過時間を超えない。
　例えば、バブルの投与と、前記超音波の照射との間に時間差を設ける場合、バブルの投与から５分後に超音波照射をする工程Ａ１を行い、バブルの投与時点から３０分後に、複合体を投与する工程Ｂを行うことができる。

　別の側面として、工程Ｂにおける複合体の投与は、超音波の照射時点を基準としてもよい。前記方法において、工程Ａ１の後に工程Ｂを実施する場合、前記工程Ｂにおける複合体の投与が、前記工程Ａ１における超音波の照射時点から５分経過以後に行われることが好ましい。前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１における超音波の照射時点から７分経過以後であってもよく、１０分経過以後であってもよく、１５分経過以後であってもよく、２０分経過以後であってもよく、２５分経過以後であってもよく、３０分経過以後であってもよく、３５分経過以後であってもよく、４０分経過以後であってもよく、４５分経過以後であってもよく、５０分経過以後であってもよく、５５分経過以後であってもよく、６０分経過以後であってもよく、２時間経過以後であってもよく、３時間経過以後であってもよい。

　一方、工程Ａ１においては、超音波の照射後から標的部位への送達効率の向上効果が発揮されると考えられる。そのため、前記工程Ｂにおける複合体の投与の、前記工程Ａ１における超音波の照射時点からの上記経過時間の上限値としては、超音波の照射時点から４８時間経過以前であってよく、３６時間経過以前であってよく、２４時間経過以前であってよく、１２時間経過以前であってよく、３時間経過以前であってよく、６０分経過以前であってよく、６０分経過未満であってよく、５０分経過以前であってよく、４５分経過以前であってよい。

　上記投与間隔の数値範囲は、上記の上限及び下限として例示した数値を適宜組み合わせることができる。例えば、前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１における超音波の照射時点から５分経過以後４８時間経過以前であってもよく、７分経過以後３６時間経過以前であってもよく、１０分経過以後２４時間経過以前であってもよく、１５分経過以後１２時間経過以前であってもよく、１５分経過以後３時間経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過未満であってもよく、２５分経過以後５０分経過以前であってもよく、２５分経過以後４５分経過以前であってもよい。

　より好ましくは、前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点から５分経過以後で超音波の照射時点から４８時間経過以前であってもよく、バブルの投与時点から７分経過以後で超音波の照射時点から３６時間経過以前であってもよく、バブルの投与時点から１０分経過以後で超音波の照射時点から２４時間経過以前であってもよく、バブルの投与時点から１５分経過以後で超音波の照射時点から１２時間経過以前であってもよく、バブルの投与時点から１５分経過以後で超音波の照射時点から３時間経過以前であってもよく、バブルの投与時点から２０分経過以後で超音波の照射時点から６０分経過以前であってもよく、バブルの投与時点から２０分経過以後で超音波の照射時点から６０分経過未満であってもよく、バブルの投与時点から２５分経過以後で超音波の照射時点から５０分経過以前であってもよく、バブルの投与時点から２５分経過以後で超音波の照射時点から４５分経過以前であってもよい。

　さらに好ましくは、前記工程Ｂにおける複合体の投与は、前記工程Ａ１におけるバブルの投与及び超音波の照射時点から５分経過以後４８時間経過以前であってもよく、７分経過以後３６時間経過以前であってもよく、１０分経過以後２４時間経過以前であってもよく、１５分経過以後１２時間経過以前であってもよく、１５分経過以後３時間経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過以前であってもよく、２０分経過以後６０分経過未満であってもよく、２５分経過以後５０分経過以前であってもよく、２５分経過以後４５分経過以前であってもよい。

　なお、ここまでは工程Ａ１の後に工程Ｂを実施する場合について説明したが、工程Ｂの後に工程Ａ１を実施してもよい。

　工程Ｂの後に工程Ａ１を実施する場合、工程Ａ１における複合体の標的部位への送達の選択性を向上可能であるとの観点から、例えば、前記方法において、工程Ａ１における超音波の照射は、前記工程Ｂにおける複合体の投与時点から８時間経過以後に行われることが好ましく、８時間経過以後７２時間経過以前に行われることがより好ましく、１２時間経過以後４８時間経過以前に行われることがより好ましく、１８時間経過以後３６時間経過以前に行われることがさらに好ましい。

　工程Ｂの後に工程Ａ１を実施する場合、複合体の投与から、超音波の照射までの間に時間差を設けることで、標的部位への送達の選択性を向上可能であることのメカニズムの詳細は明らかではないが、複合体化によって物質の血中滞留性が向上されているために、時間経過後に血中に滞留している複合体に対する超音波の照射による効果が、より効果的に発揮されるものと推察される。

（工程Ａ２）
　前記方法は、前記工程Ａ１及び前記工程Ｂの後に、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ２を更に含んでもよい。
　前記方法が工程Ａ２を更に含むことで、複合体の標的部位への送達の選択性をより一層向上可能である。

　前記方法が工程Ａ２を更に含む場合、例えば、工程Ａ１、工程Ｂ、及び工程Ａ２の順で各工程を実施してもよく、工程Ｂ、工程Ａ１、及び工程Ａ２の順で各工程を実施してもよい。

　工程Ｂの後に工程Ａ２を実施する場合、上記で説明した工程Ｂの後に工程Ａ１を実施する場合として例示した実施条件と同一の条件を採用することができる。

　一例として、工程Ａ１、工程Ｂ、及び工程Ａ２の順で各工程を実施する場合、前記工程Ｂにおける複合体の投与が、前記工程Ａ１におけるバブルの投与時点から５分経過以後、且つ前記工程Ａ１における超音波の照射時点から３時間経過以前で、工程Ａ２における超音波の照射は、前記工程Ｂにおける複合体の投与時点から８時間経過以後である場合を例示できる。

　工程Ａ２におけるバブルの投与及び超音波の照射は、上記の工程Ａ１で挙げた方法と同様の方法で実施することができる。工程Ａ２で用いられるバブルは、工程Ａ１で用いたものと同じであってもよく、異なってもよい。工程Ａ２で用いられる超音波は、工程Ａ１で用いたものと同じであってもよく、異なってもよい。工程Ａ２における対象領域は、工程Ａ１における対象領域と同じであってもよく、異なってもよいが、同じであることが好ましい。工程Ａ２における対象領域は、工程Ａ１における対象領域と重複した領域を含むことが好ましく、頭部を含むことが好ましく、脳を含むことがより好ましく、血液脳関門を含むことがさらに好ましい。

＜複合体＞
　複合体は、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む。

　複合体における前記高分子は、前記物質と複合体化され、生体に投与されて前記物質の体内動態を制御する役割を有する。

　高分子を含む複合体は、前記物質単体での場合に比べ、血中での安定性に優れるものとすることができ、実施形態に係る方法に使用される複合体として好適である。

　例えば、血中での安定性に優れる複合体は、工程Ｂの後に工程Ａ１を行い、工程Ｂと工程Ａ１との実施とに時間差を設ける場合であっても、標的部位への送達効率の向上の効果が良好に発揮される。

　複合体において、高分子は、高分子ミセルを形成していてもよく、高分子ベシクルの形態であってもよい。

　複合体における前記高分子は、生体分解性であることが好ましい。また、前記高分子は、生体適合性であることが好ましい。生体適合性とは、生体に投与した場合に、強い炎症反応や傷害等の著しい有害作用や悪影響を及ぼさない又は及ぼしにくいことを意味する。

　生体分解性とは、生体内で吸収又は分解され得る性質を意味する。生体分解性である生体適合性ポリマーとしては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等が挙げられる。

　本明細書において、高分子が生体分解性であるとは、高分子の少なくとも一部が生体分解性であることを意味する。したがって、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等から選択される少なくとも１種と、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリウレタン等から選択される少なくとも１種とが結合したブロックコポリマー等も生体分解性の生体適合性高分子に該当する。

　生体分解性である高分子を用いることにより、複合体の生体内への蓄積を抑制することができ、副作用を低減させることができる。

　本明細書において、生体安定性とは、生体内で即時に吸収又は即時に分解されることなく、存在可能であることを意味する。高分子が生体分解性且つ生体安定性を有する場合には、生体内で吸収又は分解されるまでの間、生体内で存在可能であることを意味する。例えば、生体分解性及び生体安定性を有する高分子は、生体に投与されてから標的部位に送達されるまでの時間、生体内で存在可能である。

　本明細書において、高分子が生体安定性であるとは、高分子の少なくとも一部が生体安定性であることを意味する。したがって、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等から選択される少なくとも１種と、ＰＥＧ、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリウレタン等から選択される少なくとも１種とが結合したブロックコポリマー等も生体安定性の生体適合性高分子に該当する。

　高分子としては、カチオン性ポリマーを含むことが好ましく、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリマーブロックとが結合したブロックコポリマーであることがより好ましく、ＰＥＧブロックとカチオン性ポリアミノ酸ブロックとが結合したブロックコポリマーであることがさらに好ましい。

　カチオン性ポリマーとしては、カチオン性単量体に由来する構成単位を有するポリマーが挙げられる。カチオン性単量体としては、特に限定されないが、例えば、非天然のカチオン性アミノ酸（例えば、修飾された天然のカチオン性アミノ酸）、または天然のカチオン性アミノ酸を用いることができる。天然のカチオン性アミノ酸としては、カチオン性基（例えば、アミノ基）を有するアミノ酸側鎖を有するものが好ましく、リシンおよびオルニチンから選択される１以上の天然のカチオン性アミノ酸が挙げられる。非天然のカチオン性アミノ酸としては、カチオン性側鎖で修飾されたグルタミン酸およびアスパラギン酸から選択される修飾された１以上の天然アミノ酸が挙げられる。カチオン性側鎖としては、例えば、５－アミノペンチル基、４－アミノブチル基、３－アミノプロピル基、２－アミノエチル基を有する基が挙げられ、これらの基においては、－ＣＨ_２－が－ＮＨ－により置き換えられていてもよい。カチオン性側鎖としてはまた、－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ_２（ジエチルトリアミン（ＤＥＴ）ということがある）、－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ_２（トリエチルテトラアミン（ＴＥＴ）ということがある）、および－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ＮＨ_２（テトラエチルペンタアミン（ＴＥＰ）ということがある）が挙げられる。カチオン性アミノ酸は、例えば、架橋の利便性を高めるために、その側鎖が２－イミノチオランまたはジメチル３，３’－ジチオビス（プロピオンイミダート）（ＤＴＢＰ）により修飾されていてもよい｛但し、カチオン性ポリマーに含まれる少なくとも一部または全部のアミノ酸はカチオン性を維持する｝。

　複合体における、前記高分子と複合化する「物質」としては、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、小胞、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられ、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種が好ましい。当該物質は、前記高分子との共有結合により複合化されていてもよい。当該各物質の詳細については後述する。

　以下、実施形態の医薬における好ましい複合体として、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質と、を含む複合体（以下「三元系複合体」ということがある）について説明する。
　なお、三元系とは、ボロン酸基を有する高分子、ジオール構造を有する化合物、及び結合体と複合化する物質の、これら三成分を少なくとも含むことを意味する。三元系複合体は、これらの三成分に該当しない成分を更に含んでもよい。

　三元系複合体は、血中滞留性に優れ、ｐＨ応答性を有する等の優れた特性を有し、実施形態に係る方法に使用される複合体として好適である。

　更には、三元系複合体は、それ自体の性質として脳への送達の選択性が向上されており、脳を対象領域として超音波を照射する実施形態に係る方法に使用されることにより、脳への送達の選択性をより一層向上可能である。

　三元系複合体では、工程Ａ１の後に工程Ｂを行い、工程Ａ１と工程Ｂとの実施の間に時間差を設ける場合での、送達の選択性の向上の効果が、非常に効果的に発揮される。この理由としては、ジオール構造を有する化合物とバブルとの相互作用により三元系複合体が解離しやすい状況にある可能性が考えられる。バブルの投与と、三元系複合体の投与との間に時間を設けることで、バブルと三元系複合体との相互作用を防止でき、三元系複合体本来の機能をより良好に発揮可能であるためと推察される。

　三元系複合体は、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質（以下、「複合要素」ということがある。）と、を含むものであってよく、前記高分子は生体適合性高分子であってよい。
　三元系複合体は、ボロン酸基を有する生体適合性高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質と、を含むものである。

　図１Ａは、三元系複合体の概略的な構成の一例を示す模式図である。三元系複合体１は、結合体１０と、結合体１０と複合化する物質４０と、を含む。

　結合体１０と複合化する物質４０としては、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、小胞、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられ、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種が好ましい。

　結合体と複合化する物質がＡＡＶベクター等のＡＡＶである場合、三元系複合体の一実施形態としてのＡＡＶ三元系複合体を例示できる。結合体とＡＡＶのカプシドを構成するタンパク質との複合化を想定し、ＡＡＶ三元系複合体を、以下のようなタンパク質複合体として説明できる。

　実施形態のタンパク質複合体は、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、タンパク質と、を含むものであってよい。本明細書において「ジオール構造」とは、２個の水酸基がそれぞれ異なる炭素原子に結合した構造を指し、２個の水酸基が隣り合う炭素原子にそれぞれ結合した構造であってよい。ジオール構造を有する化合物は、脂肪族化合物であってもよく、芳香族化合物であってもよい。

　図１Ａにおいて、結合体１０と複合化する物質４０がタンパク質４である場合、実施形態のタンパク質複合体１は、結合体１０、及びタンパク質４を含む。

　結合体１０は、ボロン酸基を有する高分子２と、ジオール構造を有する化合物３と、が結合したものである。例えば、下記式（１０ａ）で示されるジオール構造と、下記式（１０ｂ）で示されるボロン酸基とは、下記式（１０ｃ）で示されるボロン酸ジオール結合を形成可能である。すなわち、実施形態の複合体１における結合体１０は、ボロン酸基を有する高分子２と、ジオール構造を有する化合物３と、がボロン酸ジオール結合を形成した結合体であってよい。

　ジオール構造を有する化合物３は、ボロン酸基を有する高分子２と結合体１０を形成する一方で、図１Ａに示されるように、タンパク質４等の複合要素４０とも結合して三元系複合体を形成することができる。ジオール構造を有する化合物３とタンパク質４（複合要素４０）とは、疎水性相互作用及び／又は水素結合にて結合できるものと考えられ、タンパク質４（複合要素４０）に化学修飾を施さずとも複合体化が可能である。すなわち、タンパク質４（複合要素４０）には、ジオール構造を有する化合物３を介して（つまり、結合体１０のジオール構造を有する化合物３に由来する部分を介して）、ボロン酸基を有する高分子２が付加されたような格好となる。このことから、三元系複合体１では、タンパク質等の複合要素に対し化学修飾を施さずに、結合体１０と複合体を形成できる。

　上記で説明した三元系複合体の形成様式から、三元系複合体は、タンパク質等の複合要素をコアとして、その周囲に結合体がシェルの如く配されている形態をとり得る。より詳細には、タンパク質等の複合要素をコアとして、その周囲に結合体の一部としてジオール構造を有する化合物に由来する部分が配され、さらにその外側に高分子の部分が配されている形態をとり得る。そのため、複合要素が結合体によって内包され保護されるので、タンパク質等の複合要素が意図しない生体反応に関与することを抑制できる。意図しない生体反応の例としては、例えば免疫反応が挙げられる。

　ジオール構造を有する化合物の持つ性質として、タンパク質等と相互作用し易い性質があり、従来の技術では、ジオール構造を有する化合物により、生体内での意図しない相互作用が生じる可能性がある。一方、三元系複合体では、ジオール構造を有する化合物に由来する部分の外側に、高分子の部分が配されている形態をとり得るため、従来の技術と比較し、生体内での意図しない相互作用を抑制できるものと考えられ、ジオール構造を有する化合物をそのまま用いる場合よりも、物質送達の安定性に優れる。

　三元系複合体１においては、ボロン酸基を有する高分子２と、ジオール構造を有する化合物３とが結合して、ボロン酸ジオール結合を形成するので、三元系複合体１には、ボロン酸基及びジオール構造は含まれていなくともよい。

　当該ボロン酸ジオール結合は、可逆的な共有結合であり得る。上記ボロン酸基とジオール構造との結合はｐＨ条件に応じて可逆的で、低ｐＨへの移行でボロン酸ジオール結合が解離して、再びジオール構造（１０ａ）とボロン酸基（１０ｂ）とになり得る。

　図１Ｂは、三元系複合体の、生体内における構成の一例を示す模式図である。一般的に、血中のｐＨは７．４付近とされ、細胞内の（特に、エンドソーム、リソソーム等の酸性オルガネラ内の）ｐＨは５．５付近とされる。例えば、三元系複合体１は、血中（ｐＨ約７．４）では、結合体１０とタンパク質４（複合要素４０）とが複合体化され、血中滞留性や血中安定性を向上させることができる。、三元系複合体１は、細胞内（ｐＨ約５．５）や腫瘍周辺（ｐＨ約６．６）では、ボロン酸ジオール結合が解離することで、ボロン酸基を有する高分子２が脱離して、タンパク質４（複合要素４０）がリリースされる。これにより、タンパク質４（複合要素４０）本来の機能が発揮され易い状態とすることができる。

　また、ポリフェノール類等のジオール構造を有する化合物３は、細胞内でタンパク質４から解離することが知られている。

　このように、三元系複合体は、ｐＨ応答性を有することができる。本明細書において、三元系複合体のｐＨ応答性とは、周囲のｐＨ環境に応じて、三元系複合体を構成する結合体の、ジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離する性質をいう。前記ｐＨ応答性は、ｐＨが低くなるのに伴い、三元系複合体を構成する結合体の、ジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離する性質であってもよい。

　三元系複合体は、ＡＴＰ応答性を有することができる。本明細書において、三元系複合体が有してもよいＡＴＰ応答性とは、周囲のＡＴＰ濃度が高くなるのに伴い、三元系複合体を構成する結合体１０の、ジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離する性質をいう。
　三元系複合体がＡＴＰ応答性を有することで、三元系複合体は、血中（ｐＨ約７．４）では、結合体１０とタンパク質４（複合要素４０）とが複合体化され、血中滞留性や血中安定性を向上させることができる。三元系複合体は、細胞質内では、ボロン酸ジオール結合が解離することで、ボロン酸基を有する高分子２が脱離して、タンパク質４（複合要素４０）がリリースされる。これにより、タンパク質４（複合要素４０）本来の機能が発揮され易い状態とすることができる。

　上記結合とその解離は、例えば、アリザリンレッド法により測定できる。

　或いは、上記結合とその解離は、例えば、異なるｐＨ環境下での複合体粒子（複合体の一部又は全部の構成要素が解離したものも含む）の粒子径を測定することにより、評価することができる。あるｐＨ条件下よりも低ｐＨの条件下にて複合体粒子の粒子サイズが小さくなったことが確認できれば、その低ｐＨの条件下では、結合体のジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離しており、三元系複合体がｐＨ応答性を有すると判断できる。
　複合体粒子の粒子径の確認は、公知の方法で行うことができ、一例として、蛍光相関分光法や、動的光散乱法を用いることができる。
　本明細書における蛍光相関分光法により求められる複合体粒子の粒子径は、アインシュタイン－ストークスの式を用いて求められた粒径の個数基準の算術平均径である。
　本明細書における動的光散乱法により求められた複合体粒子の粒子径は、アインシュタイン－ストークスの式を用いて求められた粒径の個数基準の算術平均径である。

　上記解離は、ｐＨ環境下に存在する全ての三元系複合体で生じる必要はない。三元系複合体がｐＨ応答性を有するかどうかは、例えば、複数個の三元系複合体について解析した値（例えば平均値）に基づき判断することができる。

　複合要素を効率的に生体内の標的部位に送達するとの観点からは、三元系複合体は、例えば、ｐＨ７．４において複合要素と結合体とが複合体を形成し、例えば、ｐＨ７．４未満、ｐＨ６．６以下、ｐＨ５．５以下などで、上記ジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離するｐＨ応答性を有することが好ましい。

　タンパク質を効率的に生体内の標的部位に送達するとの観点からは、三元系複合体は、例えば、ｐＨ７．４においてタンパク質と結合体とが複合体を形成し、例えば、ｐＨ７．４未満、ｐＨ６．６以下、ｐＨ５．５以下などで、上記ジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合が解離するｐＨ応答性を有することが好ましい。

　三元系複合体は、例えば、ｐＨ７．４未満、ｐＨ６．６以下、ｐＨ５．５以下などで、当該ｐＨよりも高いｐＨ条件（例えばｐＨ７．４）と比較し、粒子サイズの低下を確認できる、ｐＨ応答性を有することが好ましい。

　上記のとおり、血中のｐＨ環境はｐＨ約７．４であることが知られ、腫瘍周辺のｐＨ環境はｐＨ約６．６であることが知られ、細胞内のｐＨ環境はｐＨ約５．５であることが知られている。
　ｐＨ７．４以上と比べてｐＨ７．４未満で、粒子サイズの低下を確認できるｐＨ応答性を有する三元系複合体は、血中で三元系複合体を形成して血中滞留性及び血中安定性に優れ、腫瘍周辺や細胞内といったタンパク質等の複合要素の送達先では、三元系複合体が解離してタンパク質等がリリースされるため、送達先でより効果的にタンパク質等の本来の機能が発揮される。
　ｐＨ７．４以上と比べてｐＨ６．６以下で、粒子サイズの低下を確認できるｐＨ応答性を有する三元系複合体は、血中で三元系複合体を形成して血中滞留性及び血中安定性に優れ、腫瘍周辺及び細胞内では、三元系複合体が解離してタンパク質等の複合要素がリリースされるため、腫瘍周辺及び細胞内でより効果的にタンパク質等の複合要素の本来の機能を発揮させることができる。
　ｐＨ７．４以上と比べてｐＨ５．５以下で、粒子サイズの低下を確認できるｐＨ応答性を有する三元系複合体は、血中で複合体を形成して血中滞留性及び血中安定性に優れ、細胞内では複合体が解離してタンパク質等の複合要素がリリースされるので、細胞内でより効果的にタンパク質等の複合要素の本来の機能を発揮させることができる。

　三元系複合体のｐＨ応答性に係るｐＨとして、上記を例示したが、ｐＨ応答性に係るボロン酸基のｐＫａは、ボロン酸基が結合する構造を改変すること等により適宜調整可能であるため、三元系複合体のｐＨ応答性に係るｐＨとしては上記に例示したものに限定されるものではない。
　また、結合体のジオール構造を有する化合物３とボロン酸基を有する高分子２との結合と解離や上記の粒子径の確認は、三元系複合体が使用される環境下に応じて適宜定めることができる。ある条件で上記解離が確認されない場合であっても、より長時間にわたり測定することや、より使用環境や送達環境に近い条件で確認をすることが推奨される。
　また、送達環境下でのｐＨ応答性の程度（例えば、三元系複合体の粒子サイズの低下率の程度）は、ｐＨ応答性に係るボロン酸基のｐＫａを調整することで任意に調整可能である。また、送達環境下での、ｐＨ応答性の程度（例えば、三元系複合体の粒子サイズの低下率の程度）が乏しい場合であっても、本三元系複合体の有用性が否定されるわけではない。むしろそのような三元系複合体は、タンパク質等の複合要素の徐放性を発揮できると考えられ、長期的な物質送達に好適に利用することが可能となり得る。

　複合体の平均粒径は、例えば、５ｎｍ以上２００ｎｍ以下が好ましく、１０ｎｍ以上１５０ｎｍ以下がより好ましく、１５ｎｍ以上１００ｎｍ以下がさらに好ましい。複合体の粒径は、動的光散乱法（DLS）又は蛍光相関分光法(FCS)により測定できる。
　複合体の粒径が上記の範囲であることにより、複合体の血中滞留性、腫瘍組織への集積性を適度に向上させ、また、肝臓等の正常組織への集積を防止できる。この結果、タンパク質等の複合要素を効率よく腫瘍組織に送達することが可能になる。
　複合体の腫瘍集積性は、腫瘍の亢進した血管漏出性を利用した腫瘍への選択的な集積、すなわちｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果（ＥＰＲ効果）により発揮されるものと考えられ、腫瘍への選択的な送達により、より優れた抗腫瘍効果を達成する。

　三元系複合体に含まれる、結合体１０と複合要素４０との比率は、特に制限されるものではないが、例えば、複合要素１分子あたり、１個以上の結合体と複合体化されていてもよく、２個以上の結合体と複合体化されていてもよく、５個以上の結合体と複合体化されていてもよく、１～１００個の結合体と複合体化されていてもよく、２～５０個の結合体と複合体化されていてもよく、５～２０個の結合体と複合体化されていてもよい。

　三元系複合体がタンパク質を含む場合、複合体に含まれる、結合体１０とタンパク質４との比率は、特に制限されるものではないが、例えば、タンパク質１分子あたり、１個以上の結合体と複合体化されていてもよく、２個以上の結合体と複合体化されていてもよく、５個以上の結合体と複合体化されていてもよく、１～１００個の結合体と複合体化されていてもよく、２～５０個の結合体と複合体化されていてもよく、５～２０個の結合体と複合体化されていてもよい。

　三元系複合体によれば、タンパク質等の複合要素に対し化学修飾を施さずに、結合体との複合体を形成でき、結合体の高分子による高分子化により、血中滞留性が向上されている。また当該結合体は、ボロン酸基を有する高分子と、ジオール構造を有する化合物とが結合したものであり、標的部位のｐＨ環境に応じて結合体が解離するｐＨ応答性を有している。
　そのため、三元系複合体は、血中滞留性に優れ、且つ、目的の送達先で選択的に結合体が解離して、タンパク質等の複合要素の機能発現が期待される、非常に画期的なものである。

　以下、三元系複合体に含まれる各要素の詳細について説明する。

（ジオール構造を有する化合物）
　本実施形態に係るジオール構造を有する化合物３は、ボロン酸基を有する高分子との結合体を形成するとともに、タンパク質等の複合要素との複合体を形成し、いわば両者の仲介役として、三元系複合体の形成に寄与する。

　本実施形態に係るジオール構造を有する化合物は、分子内に１以上のジオール構造を有するものであれば特に制限されず、結合安定性の観点から、分子内にカテコール構造及びガロイル構造からなる群より選択される構造を１個以上を有することが好ましい。当該化合物がカテコール構造及び／又はガロイル構造を有する場合には、該構造におけるベンゼン環との疎水性相互作用によって、タンパク質等の複合要素との複合体化がより促進されるため好ましい。

　カテコール構造としては、下記式（３ａ）で表される構造を例示できる。ガロイル構造としては、下記式（３ｂ）で表される構造を例示できる。下記に示される構造のうちでは、下記式（３ｂ）で表されるガロイル構造のほうが、水酸基との水素結合によって、タンパク質等の複合要素との複合体化がより促進されるため好ましい。

　本実施形態に係る化合物３の有するジオール構造（例えば、２個又は３個の水酸基が隣り合う炭素原子にそれぞれ結合した構造、具体例としてカテコール構造、ガロイル構造等）の個数は、１以上であり、２以上であってよく、５以上であってよい。本実施形態に係る化合物におけるジオール構造の個数の上限値は特に制限されるものではないが、一例として３０以下であってよく、１５以下であってよく、１３以下であってよい。本実施形態に係る化合物３の有するジオール構造の個数は、一例として、１～３０の整数であってよく、２～１５の整数であってよく、５～１３の整数であってよい。
　ジオール構造における解離と結合の平衡状態を考えたとき、化合物３が複数（２以上）のジオール構造を有することで、一方のジオール構造の結合が解離しても、他方のジオール構造が結合し得る。このように、本実施形態に係るジオール構造を有する化合物における、ジオール構造の個数が多いほど、ジオール構造を有する化合物とボロン酸基を有する高分子とでの、見かけの結合力は飛躍的に向上する。

　ボロン酸基を有する高分子とジオール構造を有する化合物とでの、上記結合力は、例えば、アリザリンレッド法により測定できる。

　前記ジオール構造を有する化合物としては、ポリフェノールに該当するものが挙げられる。ポリフェノールとしては、芳香族炭化水素において、２個以上の水素原子が、水酸基で置換された構造を有するものが挙げられる。ポリフェノールの天然のものは植物により生産されることが知られる。当該ポリフェノールとしては、没食子酸、カテキン類（カテキン及びその誘導体）、エピカテキン類（エピカテキン及びその誘導体）、プロアントシアニジン、アントシアニジン、ガロイル化カテキン類（ガロイル化カテキン及びその誘導体）、フラボノイド、イソフラボノイド、ネオフラボノイド、フラボン、タンニン、タンニン酸、それらの誘導体等が挙げられる。前記ジオール構造を有する化合物としては、タンニン酸、没食子酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一種であることが好ましい。上記の誘導体としては、ジオール構造を有する化合物において、１個以上の水素原子又は基が、それ以外の基（置換基）で置換されたものが挙げられる。また、ジオール構造を有する化合物において、水素原子が付加または脱離されたものであってもよい。ここで置換基としては、水酸基、アミノ基、炭素数１～４の１価の鎖状飽和炭化水素基、ハロゲン原子等が挙げられる。炭素数１～４の１価の鎖状飽和炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子等が挙げられる。

（ボロン酸基を有する高分子）
　以下、本実施形態に係るボロン酸基を有する高分子２について説明する。

　前記高分子は生体適合性高分子であってよい。生体適合性高分子とは、生体に投与した場合に、強い炎症反応や傷害等の著しい有害作用や悪影響を及ぼさない又は及ぼしにくいポリマーを意味する。

　ボロン酸基を有する生体適合性高分子としては、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアミノ酸、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリヌクレオチド、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリエステル、ポリウレタン、多糖類、これらのコポリマー等にボロン酸基が導入されたものが挙げられる。ボロン酸基を有する生体適合性高分子は、一部にその合成過程で導入された任意の基を有していてもよい。このような基としては、例えば重合開始剤の一部等が挙げられる。

　前記高分子の分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．０以上２．０未満が好ましく、１．０～１．５がより好ましく、１．０～１．３がさらに好ましい。三元系複合体が、優れた腫瘍集積性をより効果的に発揮するためには、高分子の分散度が上記範囲内にあることが好ましい。

　本明細書において、高分子の数平均分子量は、^１ＨＮＭＲスペクトルによるピーク積分値の比から算出した値を採用できる。算出方法としては、高分子鎖末端に存在する開始剤由来の構造のピーク積分値と、算出対象部分のモノマー由来の構造のピーク積分値との比から、モノマーの重合度を算出し、重合したモノマー由来の構造の合計分子量を開始剤由来の構造の分子量に加算することでボロン酸基が導入される前の高分子の数平均分子量を算出可能である。

　ボロン酸基を有する高分子の数平均分子量についても、^１ＨＮＭＲスペクトルによるピーク積分値の比から算出した値を採用できる。算出方法としては、高分子鎖末端に存在する開始剤由来の構造のピーク積分値と、算出対象部分のボロン酸基由来の構造のピーク積分値との比から、ボロン酸基の結合数を算出し、結合したボロン酸基由来の構造の合計分子量を高分子鎖の数平均分子量に加算することで算出可能である。

　ボロン酸基を有する高分子は、^１ＨＮＭＲにより算出された数平均分子量（Ｍｎ）が２，０００～２００，０００であることが好ましく、例えば５，０００～１００，０００であってもよく、１０，０００～５０，０００であってもよく、１２，０００～４５，０００であってもよい。

　ボロン酸基を有する高分子の数平均分子量が上記の範囲であることにより、三元系複合体の血中滞留性、腫瘍組織への集積性を適度に向上させ、また、肝臓等の正常組織への集積を防止できる。この結果、タンパク質等の複合要素を効率よく腫瘍組織に送達することが可能になる。
　三元系複合体の腫瘍集積性は、腫瘍の亢進した血管漏出性を利用した腫瘍への選択的な集積、すなわちｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果（ＥＰＲ効果）により発揮されるものと考えられ、腫瘍への選択的な送達により、より優れた抗腫瘍効果を達成する。

　また、三元系複合体において、ボロン酸基を有する高分子は、高分子ミセルを形成していてもよく、高分子ベシクルの形態であってもよい。

　ボロン酸基を有する高分子は、生体分解性であることが好ましい。

　本明細書において、ボロン酸基を有する高分子が生体分解性であるとは、ボロン酸基を有する高分子の少なくとも一部が生体分解性であることを意味する。したがって、ポリアミノ酸、ポリエステル、ポリヌクレオチド、多糖類等と、ＰＥＧ、アクリル系樹脂（（メタ）アクリル酸エステルに由来する構成単位を含む樹脂）、ポリアクリルアミド、ポリエーテル、ポリウレタン等とのブロックコポリマー等も生体分解性の生体適合性高分子に該当する。

　生体分解性であるポリマーを用いることにより、結合体又は複合体の生体内への蓄積を抑制することができ、副作用を低減させることができる。

　ボロン酸基を有する高分子は、第１の生体適合性高分子鎖と、第２の生体適合性高分子鎖とを有するものであってよい。なお、前記第１の生体適合性高分子鎖と第２の生体適合性高分子鎖とは異なるものであり、生体適合性高分子は、第１の生体適合性高分子鎖のブロックと第２の生体適合性高分子鎖のブロックとを含むブロック共重合体として提供できる。また、本実施形態に係る生体適合性高分子は、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖の他に、さらに別の高分子鎖を含むことができる。

　本実施形態において、「ブロック共重合体」とは、複数種類のブロック（同種の構成単位が繰り返し結合した部分構成成分）が結合した高分子である。ブロック共重合体を構成するブロックは、２種類であってもよく、３種類以上であってもよい。

　第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方は、生体適合性及び汎用性に優れるとの観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることが好ましい。

　第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方は、生体適合性及び生体安定性と生体分解性とのバランスに優れるとの観点から、ポリアミノ酸であることが好ましい。

　生体適合性高分子が含む第１の生体適合性高分子鎖と、第２の生体適合性高分子鎖との組み合わせとしては、例えば、第１の生体適合性高分子鎖がポリエチレングリコールであり、第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である組み合わせが好ましい。

　第１の生体適合性高分子鎖と第２の生体適合性高分子鎖とを含む生体適合性高分子の製造方法は、特に制限されない。例えば、第１の生体適合性高分子鎖を公知の重合反応により合成した後、第１の生体適合性高分子鎖に、第２の生体適合性高分子鎖の単量体を重合させる方法により製造することができる。重合反応によって得られた前記高分子鎖は、それぞれ前駆体（例えば保護基を有するもの）の状態であってもよく、重合反応によって得られた前駆体に対して当業者により選択された通常の処理を行い、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖を製造してもよい。
　或いは、予め重合体として提供された、第１の生体適合性高分子鎖又はその前駆体と、第２の生体適合性高分子鎖又はその前駆体とを、公知の反応によって結合させることができる。その際、反応性の官能基同士の結合を利用して、両者を結合させてもよい。前駆体を用いる場合には、両者を結合後に上記と同様に適宜処理を行い、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖を含む生体適合性高分子を製造することができる。

　三元系複合体における高分子は、ボロン酸基を有するものである。ボロン酸基は、上記式（１０ｂ）で示される構造であってよく、生体内環境等の中性付近のｐＨ条件下であっても、ボロン酸ジオール結合を効率的に形成可能であるとの観点から、前記ボロン酸基が、置換基を有してもよいフェニルボロン酸基、又は置換基を有してもよいピリジルボロン酸基であることが好ましい。フェニルボロン酸基及びピリジルボロン酸基については、既報（ＷＯ2013/073697、特開2018-142115等）に開示されたものも例示及び援用できる。

　前記ボロン酸基は、より効率的にボロン酸ジオール結合を形成可能であり、上記のｐＨ応答性をより容易に発現可能であるとの観点から、下記一般式（Ｉ）で表されるフェニルボロン酸基、又は下記一般式（ＩＩ）で表されるピリジルボロン酸基であることが好ましい。

（式中、Ｘはハロゲン原子又はニトロ基を表し、ｎ_ａは０～４の整数である。＊は結合手を表す。）。

　Ｘの前記ハロゲン原子は、Ｆ，Ｃｌ, Ｂｒ, Ｉ等の周期表において第１７族に属する元素であり、Ｆが好ましい。

　一般式（Ｉ）で表されるフェニルボロン酸基は、下記一般式（Ｉ－１）又は一般式（Ｉ－２）で表される基であることが好ましい。一般式（ＩＩ）で表されるピリジルボロン酸基は、下記一般式（ＩＩ－１）で表される基であることが好ましい。

（式中、Ｘはハロゲン原子又はニトロ基を表す。＊は結合手を表す。）

　一般式（Ｉ－１）及び一般式（Ｉ－２）において、Ｘが係る位置に結合していることで、Ｘは電子吸引性基として効果的に作用し、上記式（１０ｃ）で示されるボロン酸ジオール結合の安定化に寄与すると考えられる。そのため、生体内の中性付近のｐＨ環境においても、ボロン酸ジオール結合が形成されやすくなるため、上記のｐＨ応答性をより容易に発現可能とすることができる。

　一般式（Ｉ－１）で表される基は、下記一般式（Ｉ－１－１）で表される基であることが好ましく、一般式（Ｉ－２）で表される基は、下記一般式（Ｉ－２－１）で表される基であることが好ましい。一般式（ＩＩ－１）で表される基は、下記一般式（ＩＩ－１－１）で表される基であることが好ましい。

　上記一般式（Ｉ－１－１）、一般式（Ｉ－２－１）及び一般式（ＩＩ－１－１）で表される基がアミド結合を有していることにより、ボロン酸基の見かけのｐＫａを低下させる作用を奏する。

　三元系複合体における高分子において、ボロン酸基は、高分子に１つ以上導入されていればよく、２つ以上導入されていてもよく、５つ以上導入されていてもよい。
　三元系複合体における高分子における、ボロン酸基の個数の上限値は特に制限されるものではないが、一例として１０００以下であってよく、１００以下であってよく、５０以下であってよい。三元系複合体における高分子の有するボロン酸基の個数は、一例として、１～１０００の整数であってよく、２～１００の整数であってよく、５～５０の整数であってよい。
　上記個数が上記下限値以上であることで、ボロン酸基による結合体の形成作用が良好に発揮され好ましい。

　ボロン酸基における解離と結合の平衡状態を考えたとき、高分子が複数（２以上）のボロン酸基を有することで、一方のボロン酸基の結合が解離しても、他方のボロン酸基が結合し得る。このように、本実施形態に係る高分子における、ボロン酸基の個数が多いほど、ボロン酸基を有する高分子とジオール構造を有する化合物とでの、見かけの結合力は飛躍的に向上する。

　よって、両者の結合力を向上させる観点から、２以上のジオール構造を有する化合物と、２以上のボロン酸基を有する高分子との組み合わせを用いることがより好ましい。ジオール構造及びボロン酸基の個数の２以上の各数については、各々上記で例示したものが挙げられる。

　前記ボロン酸基を有する高分子は、高分子に、ボロン酸基を導入して得ることができる。
　本実施形態の高分子において、ボロン酸基は、高分子のうちのいずれの箇所にも導入可能である。ボロン酸基は、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方又は両方に導入されていてもよい。

　例えば、高分子と「ボロン酸基を有する化合物」との互いの反応性の官能基同士の結合を利用してボロン酸基を導入してもよい。反応性の官能基は、高分子が元から有しているものでもよく、改変又は導入されたものであってもよい。

　高分子とボロン酸基を有する化合物との結合においては、ボロン酸基を有する化合物及び高分子は、それぞれ、本発明の効果が得られる限り、それらが結合するのに必要な構造の変化を受けてもよい。
　例えば、ボロン酸基を有する化合物は、高分子の有する官能基と結合してもよく、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖の有する官能基と結合してもよい。
　例えば、ボロン酸基を有する化合物は、高分子の側鎖の官能基と結合してもよく、第１の生体適合性高分子鎖及び／又は第２の生体適合性高分子鎖の側鎖の官能基と結合してもよい。

　前記ボロン酸基は、高分子の側鎖に２価の連結基を介して導入されたものであってよい。当該二価の連結基としては、例えば、アミド結合、カルバモイル結合、アルキル結合、エーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、スルホンアミド結合、ウレタン結合、スルホニル結合、チミン結合、ウレア結合、チオウレア結合が挙げられる。

　ここで、ボロン酸基が導入される対象となる高分子は、カチオン性ポリマーであることが好ましく、カチオン性基を有するものがより好ましく、カチオン性ポリアミノ酸であることがより好ましく、側鎖にカチオン性基を有するポリアミノ酸であることがさらに好ましい。ボロン酸基が高分子の側鎖に導入される場合であっても、ボロン酸基が導入されずに残った側鎖のカチオン性基は、上記式（１０ｃ）で示されるアニオン性基との相互作用により当該結合体の結合を安定化させることができる。

　したがって、三元系複合体における高分子は、ボロン酸基及びカチオン性基を有するものであってよく、第１の生体適合性高分子鎖及び第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方又は両方は、ボロン酸基及びカチオン性基を有するものであってよい。

　高分子が、ボロン酸基及びカチオン性基を有する場合、ボロン酸基とカチオン性基とのモル比（カチオン性基：ボロン酸基）は、１０：１～１：１０であってよく、１０：３～３：１であってよく、１０：８～８：１０であってよい。

　上記のカチオン性基としてはアミノ基が好ましい。側鎖にアミノ基を有することにより、水性媒体中において、該アミノ基がボロン酸のホウ素に配位し、該結合体の結合をより一層安定化させることができる。

　分子内にアミノ基を有する生体適合性高分子鎖としては、ポリアミノ酸や、ポリアクリルアミド、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等が挙げられ、ポリアミノ酸であることが好ましい。ポリアミノ酸は、カチオン性ポリアミノ酸が好ましく、側鎖にカチオン性基を有するものがより好ましく、側鎖にアミノ基を有するものがさらに好ましい。

　ボロン酸基が導入される対象となる生体適合性高分子がアミノ基を有する場合、当該アミノ基は、保護基で保護されたアミノ基であってもよい。

　アミノ基又は保護基で保護されたアミノ基を有しない生体適合性高分子鎖を用いる場合、エチレンジアミンおよびヒドラジンの導入、ベシャンプ還元、水酸基の直接アミノ化法、アミノリシス、Ｃｕｒｔｉｕｓ転移等を用いた公知の方法により、生体適合性高分子にアミノ基を導入することができる。

　上記アミノ基との結合を形成させる場合、アミノ基との結合安定性および合成容易性の観点から、上記のボロン酸基を有する化合物は、カルボキシル基を有するものであることが好ましい。ボロン酸基が導入される対象となる生体適合性高分子のアミノ基と、ボロン酸基を有する化合物のカルボキシル基と、でアミド結合を形成させて、生体適合性高分子にボロン酸基を導入させることができる。また形成されたアミド結合がボロン酸基の見かけのｐＫａを低下させる作用も奏する。

　ボロン酸基及びカルボキシル基を有する化合物としては、例えば、４－カルボキシ－フェニルボロン酸、３－カルボキシ－４－フルオロフェニルボロン酸、４－カルボキシ－２－フルオロフェニルボロン酸、４－カルボキシ－３－フルオロフェニルボロン酸（ＦＰＢＡ）、３－カルボキシ－４－クロロフェニルボロン酸、４－カルボキシ－２－クロロフェニルボロン酸、４－カルボキシ－３－クロロフェニルボロン酸等を用いることができる。

　カルボキシル基とアミノ基とでアミド結合を形成させる方法としては、例えば、アミノ基を有する生体適合性高分子鎖とボロン酸基及びカルボキシル基を有する化合物とを、ＤＭＴ－ＭＭ等の縮合剤の存在下で縮合反応させることが挙げられる。また、保護基で保護されたアミノ基を有する生体適合性高分子鎖の場合、公知の反応で保護基を脱保護し、アミノ基を有する生体適合性高分子鎖を得た後、同様に縮合反応させることができる。

　また、ボロン酸基は、第１の生体適合性高分子鎖又は第２の生体適合性高分子鎖のいずれか一方のみに導入されてもよい。例えば、ボロン酸基は、第２の生体適合性高分子鎖に導入することができる。図１Ａでは、ボロン酸基を有する生体適合性高分子２は、ボロン酸基を有する第２の生体適合性高分子鎖２２と、ボロン酸基を有しない第１の生体適合性高分子鎖２１とを含む。例えば、第２の生体適合性高分子鎖が側鎖を有するものであり、ボロン酸基が、第２の生体適合性高分子鎖の側鎖に導入されたものであってよい。

　本実施形態に係るボロン酸基を有する高分子の一例として、下記一般式（１）又は（１－１）で表される構造を含むものが挙げられる。

（式（１）～（１－１）中、Ａは、前記第１の生体適合性高分子鎖を表し、Ｌはリンカー部を表し、Ｂは、ボロン酸基を有する前記第２の生体適合性高分子鎖を表す。）

　前記リンカー部は、炭素原子数１～２０のアルキレン基であることが好ましく、炭素原子数１～２０の直鎖状のアルキレン基であることが好ましく、炭素原子数１～５の直鎖状のアルキレン基であることがより好ましい。該アルキレン基中の１個又は２個以上の－ＣＨ_２－は、それぞれ独立して－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｏ－、－ＣＯ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、又は－ＣＯＮＨ－によって置換されていてもよい。アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基等を例示できる。

　前記第２の生体適合性高分子鎖は、ポリアミノ酸であることが好ましく、カチオン性ポリアミノ酸であることがより好ましい。

　第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸であり、前記ボロン酸基が前記ポリアミノ酸の側鎖に導入されている場合、上記一般式（１）又は（１－１）におけるＢとしては、以下が好ましい。

　Ｂは、ボロン酸基を有する前記第２の生体適合性高分子鎖を表し、第２の生体適合性高分子鎖は、下記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含むことが好ましい。

（式（ｂ１）～（ｂ２）中、
　Ｒ^１は、アミノ酸側鎖を表し、
　Ｒ^２は、アミノ酸側鎖に前記ボロン酸基が導入されたものであり、
　ｎは（ｂ１）及び（ｂ２）の合計数を表し、ｎは１～１０００の整数であり、ｍは１～１０００の整数であり（ただしｍ≦ｎ）、ｎ－ｍが２以上である場合、複数個のＲ^１は互いに同一でも異なっていてもよく、ｍが２以上である場合、複数個のＲ^２は互いに同一でも異なっていてもよい。）。

　Ｒ^１及びＲ^２におけるアミノ酸側鎖が由来するアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸が好ましく、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、システイン、セリン、トレオニン、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン等を例示できる。

　アミノ酸側鎖とは、当分野における通常の意味で用いられ、ポリペプチドのアミド結合に関与するアミノ基とカルボキシ基以外の構造を指し、例えば、グリシンであれば水素原子であり、アラニンであればメチル基であり、バリンであればイソプロピル基である。

　第２の生体適合性高分子鎖が、（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造を含む場合、（ｂ１）と（ｂ２）の配列はランダムであってよい。ｍは第２の生体適合性高分子鎖における（ｂ２）の合計数を表し、ｎ－ｍは第２の生体適合性高分子鎖における（ｂ１）の合計数を表す。ｎ－ｍは０であってもよい（すなわち、第２の生体適合性高分子鎖は（ｂ１）及び（ｂ２）のうち、ボロン酸基が導入された（ｂ２）のみを有していてもよい。）。

　第２の生体適合性高分子鎖は、上記（ｂ２）で表される繰り返し構造、又は（ｂ１）で表される繰り返し構造及び（ｂ２）で表される繰り返し構造からなるものであってもよい。

　また、Ｒ^１のアミノ酸側鎖とＲ^２のアミノ酸側鎖とは、互いに同一でも異なっていてもよい。

　式（ｂ１）～（ｂ２）中、ｎは１～１０００の整数であり、１０～５００の整数であってよく、１５～１００の整数であってよい。上記ｎの値が上記範囲内であることで、第２の生体適合性高分子鎖の分子量の値が好適なものとなり好ましい。
　式（ｂ１）～（ｂ２）中、ｍは１～１０００の整数であり、３～１００の整数であってよく、５～５０の整数であってよい。上記ｍの値が上記下限値以上であることで、ボロン酸基による結合体の形成作用が良好に発揮され好ましい。
　ここでは、ｎがｍよりも大きい場合の数値範囲も例示しているが、ｎとｍとは同一の数であってよい。

　ポリアミノ酸へのボロン酸基の導入様式は、特に限定されるものではないが、ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖とボロン酸基を有する化合物との結合が好ましい。ポリアミノ酸のアミノ酸側鎖にボロン酸基を有する化合物を結合させる方法としては、アスパラギン酸側鎖又はグルタミン酸側鎖のカルボキシル基とのアミド結合、システインの側鎖のチオール基とのジスルフィド結合を形成させる方法などが挙げられる。ただし、上述のとおり、第２の生体適合性高分子鎖が側鎖にアミノ基を有することにより、水性媒体中において、該アミノ基は、ボロン酸のホウ素に配位し、結合体の結合をより一層安定化させることができるから、アミノ基を有するアミノ酸側鎖とボロン酸基及びカルボキシル基を有する化合物のカルボキシル基とのアミド結合を形成させる方法が好ましい。
　アミノ基を有するアミノ酸側鎖は、リシン側鎖、アルギニン側鎖、アスパラギン側鎖、又はグルタミン側鎖などの天然のアミノ酸側鎖のアミノ基であってもよく、任意のアミノ酸側鎖にアミノ基が導入されたものであってもよく、生体適合性等の観点からリシン側鎖が好ましい。

　上記式（ｂ２）で示される繰り返し構造は、Ｒ^２がカチオン性基を有するアミノ酸側鎖にボロン酸基が導入されたものである構造を構成単位として含むことが好ましく、Ｒ^２がアミノ基を有するアミノ酸側鎖にボロン酸基が導入されたものである構造を構成単位として含むことがより好ましく、Ｒ^２がリシン側鎖にボロン酸基が導入されたものである構造を構成単位として含むことがさらに好ましい。

　ｎ－ｍが１以上である場合、上記式（ｂ１）で示される繰り返し構造は、Ｒ^１がカチオン性基を有するアミノ酸側鎖である構造を構成単位として含むことが好ましく、Ｒ^１がアミノ基を有するアミノ酸側鎖である構造を構成単位として含むことがより好ましく、Ｒ^１がリシン側鎖である構造を構成単位として含むことがさらに好ましい。

　第１の生体適合性高分子鎖は、ポリエチレングリコールであることが好ましい。

　第１の生体適合性高分子鎖が、ポリエチレングリコールであり、第２の生体適合性高分子鎖がポリアミノ酸である場合、上記一般式（１）で表される構造としては、下記一般式（１－２）で表される構造が好ましい。

（式（１－２）中、
　ｌは１～１５００の整数であり、Ｂは、ボロン酸基を有する第２の生体適合性高分子鎖を表し、第２の生体適合性高分子鎖は、下記式（ｂ２）表される繰り返し構造を含むか、又は式（ｂ１）表される繰り返し構造及び式（ｂ２）表される繰り返し構造を含む。）

　式（１－２）中、ｌは１～１５００の整数であり、１０～１０００の整数であってよく、１００～５００の整数であってよい。

（式（ｂ１）～（ｂ２）中、Ｒ^１、Ｒ^２、ｎ、及びｍは前記と同一の意味を表す）。

（複合化する物質）
　複合体における、高分子と複合化する物質は、前記高分子と複合化可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。

　三元系複合体における、結合体と複合化する物質は、前記結合体と複合化して三元系複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。

　三元系複合体において、結合体と複合化する物質は、結合体のジオール構造を有する化合物に由来する部分を介して、前記結合体と複合化することができる。
　ある物質が、結合体のジオール構造を有する化合物に由来する部分を介して、前記結合体と複合化することができることは、例えば、該物質とジオール構造を有する化合物とを含む組成物において、両者が三元系複合体を形成可能であることで予備的に確認できる。例えば、タンパク質とポリフェノールを含む組成物において、両者が三元系複合体を形成可能であれば、タンパク質は、結合体のポリフェノールに由来する部分を介して、前記結合体と複合化する可能性が高い。複合化は、組成物に含まれる粒子の粒子サイズが、該物質単体の粒子サイズよりも大きくなったことで判断できる。

　ある物質が、結合体と複合化することは、例えば、該物質と結合体とを含む組成物において、両者が三元系複合体を形成可能であることを確認することで評価できる。三元系複合体の形成は、組成物に含まれる粒子の粒子サイズが、該物質単体の粒子サイズよりも大きくなったことで判断できる。

　前記高分子又は前記結合体と複合化する物質のサイズは、特に制限されるものではないが、一例として、該物質の粒径が５００ｎｍ以下であってよく、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であってよく、０．２ｎｍ以上１００ｎｍ以下であってよく、０．３ｎｍ以上５０ｎｍ以下であってよい。粒径は、動的光散乱法（DLS）又は蛍光相関分光法(FCS)により測定できる。

　前記高分子又は前記結合体と複合化する物質の一例として、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、小胞、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種を例示できる。ここで例示した概念に含まれる物質は、複数の前記概念に包含されるものであってよい。

・タンパク質
　複合体におけるタンパク質は、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。

　複合体は、生体内での薬物送達用途に好適に利用可能であることから、複合体におけるタンパク質は、生理活性タンパク質であることが好ましい。生理活性タンパク質は、薬理作用を有することが好ましく、タンパク質型医薬を含むことが好ましい。

　タンパク質型医薬としては、タンパク質又はタンパク質を構成要素として含む成分を有効成分とする医薬であり、例えば、ハーセプチン、アバスチン、サイラムザ等の抗体医薬や、ヒアルロニダーゼ等の各種酵素、インスリン、サイトカイン、インターフェロン、ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、アデノ随伴ウイルス（AAV）を含むもの等を例示できる。

　また本明細書において、タンパク質とはペプチドを包含する概念とする。ペプチドとして、膜透過性ペプチドも好適に例示できる。

　なかでも三元系複合体は、脳への送達の選択性が向上されており、腫瘍集積性を発揮可能であることから、三元系複合体におけるタンパク質型医薬は、脳疾患の治療効果又は抗腫瘍作用を有するものであることが好ましい。

　タンパク質型医薬としては、例えば、抗体医薬、インターフェロン、ウイルスベクター等が挙げられる。

・ウイルス
　複合体におけるウイルスは、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。
　複合体は、生体内での薬物送達用途に好適に利用可能であることから、複合体におけるウイルスは、ウイルスベクターとして疾患の治療（ウイルス療法）に用いられる治療用ウイルスであることが好ましい。ここでの疾患の治療には、遺伝子治療も含まれる。

　なかでも三元系複合体は、脳への送達の選択性が向上されており、腫瘍集積性を発揮可能であることから、三元系複合体におけるウイルスは、脳疾患又は癌の治療に用いられる治療用ウイルスであることがより好ましい。
　治療用ウイルスは、ウイルスベクターに薬理作用を有する核酸を含むものであってもよく、薬理作用を有するタンパク質をコードする核酸を含むものであってもよく、遺伝子改変のための核酸を含むものであってもよい。
　治療用ウイルスは、疾患の治療用に導入される核酸を含むものであってもよく、脳疾患又は癌の治療用に導入される核酸を含むものであってもよい。
　上記核酸には、該核酸に含まれる配列を発現させるため、作動可能に連結したプロモーター配列を含むことができる。

　治療用ウイルスとしては、ヒトへのウイルスベクターとして使用可能な各種ウイルス又は人工ウイルスが挙げられ、ウイルスベクターのウイルス種としては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等を例示できる。
　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１等を例示できる。
　脳疾患の治療に用いられる場合のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）としては、特に、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９が好ましい。ＡＡＶは、脳での遺伝子発現が向上されるよう改変された、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ等のＡＡＶであってもよい。

・ベクター
　複合体におけるベクターは、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。
　ベクターとしては、遺伝子治療に用いられる遺伝子治療用ベクターが好ましく、上記に例示したウイルスベクターの他、プラスミド、リポソーム、バクテリアベクター等が挙げられる。
　遺伝子治療用ベクターは、薬理作用を有する核酸を含むものであってもよく、薬理作用を有するタンパク質をコードする核酸を含むものであってもよく、遺伝子改変のための核酸を含むものであってよい。
　遺伝子治療用ベクターは、疾患の治療用に導入される核酸を含むものであってもよく、脳疾患又は癌の治療用に導入される核酸を含むものであってもよい。
　上記核酸には、該核酸に含まれる配列を発現させるため、作動可能に連結したプロモーター配列を含むことができる。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用される、前記複合体を含む遺伝子治療剤を提供する。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法における、遺伝子治療剤としての、前記複合体の使用を提供する。

・無機粒子
　複合体における無機粒子は、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。
　無機粒子としては、無機材料を含む粒子であり、金粒子、銀粒子、白金粒子、鉄粒子、酸化チタン粒子等の金属粒子；シリカ粒子；量子ドット等の半導体粒子；カーボンナノチューブ、グラフェン等を含有する炭素粒子等を例示できる。
　無機粒子は、ナノ粒子であることが好ましい。ナノ粒子とは、粒径が１～１００ｎｍの粒子をいう。粒子の粒径は、動的光散乱法（DLS）又は蛍光相関分光法(FCS)により測定できる。
　無機粒子は、さらに上記のタンパク質、ウイルス、ベクター、核酸、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種で修飾されたものであってもよい。

・核酸
　複合体における核酸は、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。

　複合体は、生体内での薬物送達用途に好適に利用可能であることから、複合体における核酸は、生理活性を有する核酸であることが好ましい。生理活性を有する核酸は、薬理作用を有することが好ましく、核酸医薬を含むことが好ましい。
　複合体における複合要素としての核酸は、疾患の治療に用いられる核酸医薬であることが好ましく、遺伝子治療に用いられる核酸医薬であることが好ましい。

　なかでも三元系複合体は、脳への送達の選択性が向上されており、腫瘍集積性を発揮可能であることから、三元系複合体における核酸は、脳疾患又は癌の治療に用いられる核酸医薬であることが好ましい。

　核酸医薬としては、ヒトの体内で生理活性を有する各種核酸が挙げられ、ＤＮＡ；ＲＮＡ；ＬＮＡ等の人工核酸等を例示できる。核酸医薬の種類としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、リボザイム等を例示できる。

　抗腫瘍作用を有する核酸としては、ＴＵＧ１（taurine upregulated gene 1）アンチセンス核酸、ＰＬＫ１(polo-like kinase 1) siRNA、VEGF (vascular endothelial growth factor) siRNA等を例示できる。

・小胞
　複合体における小胞は、前記高分子又は前記結合体と複合化して複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。
　小胞としては、脂質膜を有し、好ましくはリン脂質二重層を有するものである。小胞は、人為的に製造されたリポソーム等であってもよく、細胞から生産される細胞外小胞等であってもよい。細胞外小胞としては、エクソソーム、マイクロベシクル等が挙げられる。

・低分子医薬
　複合体における低分子医薬は、前記高分子又は複合体を形成可能であれば、特に制限されず、いかなるものであってもよい。

　複合体は、生体内での薬物送達用途に好適に利用可能である。
　本明細書における「低分子医薬」とは、分子量１０００以下の医薬を意味し、分子量５００以下の医薬が好ましく、例えば分子量２００～１０００の医薬であってよく、分子量３００～５００の医薬であってよい。

　抗腫瘍作用を有する低分子医薬としては、エピルビシン、ビンブラスチン、ブレオマイシン又はそれらの塩等の抗癌剤、ローズベンガル等の音響増感剤、chlorin e6等の光増感剤、ホウ素クラスター等の放射線増感剤等を例示できる。

　本発明の医薬の一実施形態として、複合体を有効成分として含有する脳疾患治療剤を提供する。本発明の一実施形態として、脳疾患の治療のための複合体を提供する。本発明の一実施形態として、脳疾患治療薬を製造するための複合体の使用を提供する。複合体は脳疾患治療効果を有することができる。該実施形態の医薬は、複合体におけるタンパク質等の物質が有効成分であって、脳疾患の治療作用を有する場合に好適であり、有効成分としては、例えば、脳疾患の治療効果を発揮できる種々のタンパク質、タンパク質型医薬、治療用ウイルス、核酸、核酸医薬、低分子医薬等を用いることができる。

　脳疾患としては、脳腫瘍、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、脳動脈瘤、脳血管障害、脳神経疾患、認知症、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、脊髄性筋萎縮症、もやもや病、片頭痛、テイ－サックス病、サンドホフ病などが挙げられる。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用される、前記複合体を含む脳疾患治療剤を提供する。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法における、脳疾患治療剤としての、前記複合体の使用を提供する。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用される、前記複合体を含む脳疾患の遺伝子治療剤を提供する。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法における、脳疾患の遺伝子治療剤としての、前記複合体の使用を提供する。

　実施形態の脳疾患治療剤は、さらに他の脳疾患治療効果を発揮する成分を含んでいてもよい。かかる構成により、脳疾患の治療に対する相乗効果が期待できる。

　本発明の医薬の一実施形態として、複合体を有効成分として含有する癌治療剤を提供する。本発明の一実施形態として、癌の治療のための複合体を提供する。本発明の一実施形態として、癌治療薬を製造するための複合体の使用を提供する。複合体は癌治療効果を有することができる。該実施形態の医薬は、複合体におけるタンパク質等の物質が有効成分であって、抗腫瘍作用を有する場合に好適であり、有効成分としては、例えば、抗腫瘍効果を発揮できる種々のタンパク質、タンパク質型医薬、治療用ウイルス、核酸、核酸医薬、低分子医薬等を用いることができる。

　癌治療効果が期待される対象疾患としては、例えば血液がん、固形がん等が挙げられ、複合体が腫瘍集積性を有する場合、固形がんに好適である。ヒトの固形がんとしては、例えば、脳がん、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞がん、非小細胞がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肺がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、卵巣がん、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、腎盂・尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、睾丸がん、胎児性がん、ウイルムスがん、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユ－イング腫、軟部肉腫などが挙げられる。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用される、前記複合体を含む癌治療剤を提供する。

　一実施形態として、哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法における、癌治療剤としての、前記複合体の使用を提供する。

　実施形態の癌治療剤は、さらに他の抗がん剤等を含んでいてもよい。かかる構成により、がん治療に対する相乗効果が期待できる。

　本実施形態の医薬における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用される経口剤が挙げられる。
　または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。

　錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤；結晶性セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤；ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液が挙げられ、補助薬としては、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール）、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ－５０等と併用してもよい。

　油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えばベンジルアルコール、フェノール）、酸化防止剤を配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。

　患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。医薬の好適な投与時期については、上記の＜方法＞で例示している。その他の、投与量、投与方法の詳細は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

　以上に説明した本実施形態の医薬は、工程Ａ１と、工程Ｂと、を含む方法に使用されることで、標的部位への送達効率を向上可能な、非常に有用なものである。

　また、本実施形態の医薬によれば、使用される方法において、工程Ａ１の実施と、工程Ｂの実施との間に時間差を設けることで、標的部位への送達の選択性を向上可能である。これにより、本実施形態の医薬は、例えば、肝臓や腎臓等への複合体の送達割合を従来法よりも大幅に抑制しつつ、脳への複合体の送達割合を大幅に向上可能であり、肝毒性および腎毒性を抑制しつつ、標的部位へと医薬を送達可能であるという、非常に優れたものである。

　特に、遺伝子治療を目的とする場合では、高濃度でベクターを投与する場合がある。そのため、送達の選択性が向上された実施形態の医薬は、遺伝子治療剤、特に脳疾患への遺伝子治療剤としてベクターを含む複合体を使用する場合に好適である。

≪キット≫
　本実施形態のキットは、上記実施形態の医薬と、バブルとを備える。
　医薬における複合体については、上記の≪医薬≫で例示したものを採用でき、ここでの説明を省略する。

　複合体としては、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質と、を含むものが好ましい。

　結合体と複合化する物質としては、タンパク質、ウイルス、ベクター、無機粒子、核酸、小胞、及び低分子医薬からなる群から選択される少なくとも一種を例示できる。

　バブルについても、上記の≪医薬≫で例示したものを採用でき、ここでの説明を省略する。前記バブルは、バブルリポソームであることが好ましい。

　本実施形態のキットは、溶液や、バッファー等の試薬類、反応容器、取扱い説明書等をさらに備えていてもよい。

　本実施形態のキットによれば、実施形態の医薬とバブルとを組み合わせることで、上記で説明した工程Ａ１及び工程Ｂを含む方法に使用可能であり、医薬の送達効率を向上可能である。

≪システム≫
　本実施形態のシステムは、哺乳動物に超音波を照射する超音波照射装置と、上記実施形態の医薬と、を備えるものである。

　医薬における複合体については、上記の≪医薬≫で例示したものを採用でき、ここでの説明を省略する。

　超音波照射装置および照射される超音波としては、上記の≪医薬≫で例示したものを採用でき、ここでの説明を省略する。
　前記超音波としては、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）であることが好ましい。

　超音波照射装置による超音波照射について、超音波照射装置は、上記の≪医薬≫における＜方法＞で例示した、複合体の投与およびバブルの投与との時間関係を満たすよう、哺乳動物に超音波を照射することができる。

　実施形態のシステムによれば、超音波照射装置と、実施形態の医薬とを組み合わせることで、上記で説明した工程Ａ１及び工程Ｂを含む方法に適用可能であり、医薬の送達効率を向上可能である。

　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例では、PEG-P[Lys(FPBA)_m]_nを、単に「Polymer」と表記する場合がある。
　また、AAV9とタンニン酸(TA)とを添加して得られた溶液及び複合体を、AAV9/TA溶液、及びAAV9/TA複合体、或いは単に「AAV9/TA」等と表記する場合がある。
　AAV9とタンニン酸(TA)とPEG-P[Lys(FPBA)_m]_nとを添加して得られた溶液や複合体を、AAV9/TA/Polymer溶液及びAAV9/TA/Polymer複合体、或いは単に「AAV9/TA/Polymer」、「AAV9複合体」、「AAV9三元系複合体」、又は「三元系複合体」等と表記する場合がある。
　また、AAV9を含むこれら単体及び複合体の総称として、「AAV9サンプル」と表記する場合がある。

　本実施例では、マウスにおけるＡＡＶ９三元系複合体の遺伝子発現を、生体内分布試験により評価した。具体的には、正常マウスに各ＡＡＶ９サンプルを尾静脈投与し、各臓器でのルシフェラーゼ遺伝子発現量を評価した。Ｈｉｇｈ　Ｆｏｃｕｓｅｄ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ（ＨＩＦＵ）の手法を用い、ＨＩＦＵを脳に照射することによって、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ　Ｂａｒｒｉｅｒ）の細胞の密着結合層を開門させ、脳内へのＡＡＶ９三元系複合体の取り込み量、及び脳での遺伝子発現量を評価した。

・実験試薬
　特に記述のない試薬は市販品をそのまま使用した。PEG-P[Lys (FPBA)₁₀]₂₀は、国際公開第２０２０／２４１８１９号に記載の方法により製造した。
　・AAV9-CMV-Luc：SignaGen Laboratories.
　・PEG-P[Lys (FPBA)₁₀]₂₀(Mn=14,000)
　・タンニン酸 (Mw=1,701)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
　・D-PBS (-)：Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.
　・VivoGlo(TM)Luciferin, In Vivo Grade：Promega Corporation.
　・Passive Lysis Buffer：Promega Corporation.
　・マイクロバブル：Microbubble Contrast Agent for Small animal Ultrasound Imaging、TRUST BIO SONICS Usphere Prime (#TBS-Prime ネッパジーン)（気体：パーフルオロブタン、平均粒子径：1.2±0.2μm、シェルの構成成分：リン脂質）

・ＨＩＦＵ照射装置
本体
　製品名：ソニトロンGTS ベースステーション(フットスイッチ付) ネッパジーン
　品番：ST-GTS
FUS プローブ
　製品名:HIFUトランスデューサーモジュール3.5MHz 深度20mm, 20mmφ
　品番：ST-FM3.5-20-20

・動物
　・BALB/c mice：Charles River Japan Inc.

・溶液の調製
　・AAV9-CMV-Luc（単に「AAV9」と略す）：1.0 × 10¹² vL/mL
　・タンニン酸（単に「TA」と略す）：2.0 × 10^-2 mg/mL
　・PEG-P[Lys(FBPA)₁₀]₂₀（単に「Polymer」と略す）：2.2 × 10^-1 mg/mL
　　これらはそれぞれ、D-PBS (-)に溶解させ調製した。
　・マイクロバブル：800μLのバブルを2000μLのD-PBS (-)で希釈して調製した。

実験１．（参考例）マウスにおけるAAV9三元系複合体の遺伝子発現評価
　本実験では、ＨＩＦＵを使用せずにＡＡＶ９サンプルをマウスに投与し、マウスにおける各臓器での各AAV9サンプルの遺伝子発現量を評価した。ルシフェラーゼ遺伝子を搭載したAAV9を使用し、AAV9単体、AAV9/TA複合体、AAV9/TA/Polymer三元系複合体をマウスに尾静脈投与し、マウスの各臓器でのルシフェラーゼ遺伝子発現量を測定することによって、AAV9三元系複合体の送達を評価した。

・実験操作
　図２に、本実験の手順の概要を説明する模式図を示す。マウスに対して、上記の各AAV9サンプル（AAV9、AAV9/TA、AAV9/TA/Polymer）の調製溶液100μlを尾静脈投与した(各AAV9サンプルの投与量：1.0×10¹¹VG/mouse, VGはベクターゲノムを表す)。AAV9サンプル投与から21日後に解剖し、臓器を回収した。臓器は、それぞれの重量を測り、１～３倍重量のPassive Lysis Buffer加えた後、ホモジナイズを行った。
　ホモジナイズした懸濁液20μlにLuciferin溶液を100μl加え、発光測定装置を用いて、各臓器のルシフェラーゼ遺伝子発現量を測定した(n=5)。

・結果
　図３に各AAV9サンプルを投与したマウスの各組織のルシフェラーゼ発光強度の測定結果を示した。各臓器のルシフェラーゼ遺伝子の発現量について、各臓器のAAV9単体でのLuc遺伝子発現量を100%とした遺伝子発現比率の結果を示す。

　図３に示す結果のとおり、ほぼ全ての組織において、AAV9/TA/Polymerは、AAV9単体と比較して大幅に遺伝子発現量が低下した。特にAAV9の集積によって毒性が生じやすい肝臓では、AAV9/TA/Polymerを投与した場合の遺伝子発現量は、AAV9単体を投与した場合の遺伝子発現量の約50分の1の値を示した。AAV9/TA/Polymerの使用によって各臓器での遺伝子発現が大幅に抑制されることを確認した。
　一方で、AAV9/TAおよびAAV9/TA/Polymerを投与した場合の脳における遺伝子発現量は、AAV9単体を投与した場合の遺伝子発現量の約6割を示しており、他の組織と比較して遺伝子発現量の下り幅が少なかった。このことから、AAV9の三元系複合体による、脳への選択的なAAV9送達が確認された。

　図４に、上記図３に示される結果のうち、各AAV9サンプルの(脳での遺伝子発現量)/(肝臓での遺伝子発現量)の値を示す。AAV9/TA/Polymer投与による肝臓での遺伝子発現量に対する脳での遺伝子発現量は、AAV9単体およびAAV9/TAと比較して約23倍に増加し、脳への選択的な遺伝子発現の向上が示された。AAV9を三元系複合体とすることによって、脳での遺伝子発現はAAV9単体と比較して約6割程度に低下するが、肝臓での遺伝子発現は約50分の1以下になるので、結果的に脳への選択性が大幅に向上していることが分かる。

実験２. HIFUの使用によるAAV9三元系複合体の遺伝子発現評価
　上記の実験１において、バブル投与及びマウス頭蓋へのHIFU照射後、各AAV9サンプルを尾静脈投与した以外は、上記の実験１と同様にして、各臓器への遺伝子発現を評価した。実験１と同様に、ルシフェラーゼ遺伝子を搭載したAAV9を使用し、AAV9単体、AAV9/TA複合体、又はAAV9/TA/Polymer三元系複合体をマウスに尾静脈投与し、マウス各臓器のルシフェラーゼ遺伝子発現量を測定することによって、AAV9三元系複合体の送達を評価した。

・実験操作
　図２に、本実験の手順の概要を説明する模式図を示す。また、AAV9/TA/Polymer三元系複合体を用いた場合に該当する工程（工程Ａ１及び工程Ｂ）を示す。
　イソフルラン吸入麻酔によってマウスを眠らせ、マウスの頭蓋に除毛クリームを塗布して完全に除毛した。
　除毛したマウスの頭蓋及びHIFUプローブにゲルを塗布して馴染ませた。この時、ゲルに気泡の混入がないことを確認した。気泡がある場合は、ピペットで吸引して取り除いた。
　マウスの尾静脈に、マイクロバブル100μLを投与した。この際、マイクロバブルは転倒混和してから投与した。マイクロバブルの投与と同時にマウス頭蓋のゲルにプローブを接触させ、超音波を照射した。照射条件は、Time 1:00 min、Intensity 1.5 kW/cm²、Duty 10% On 1 mS Off 9 mSだった。
　照射後はゲルをキムワイプで拭き取った。
　マイクロバブルの投与及びHIFU照射から3分後（バブルの投与及び超音波の照射時点から３分経過後）に各AAV9サンプルを尾静脈投与した。

・結果
　図５にマウスの各臓器の発光強度の測定結果を示した。図５では、各臓器のLuc遺伝子発現量を対数軸で示した。
　また、HIFUを照射した群については、「（AAV9サンプル）HIFU」と表記した。

　図５に示す結果から、脳でのルシフェラーゼ遺伝子発現量は、AAV9 HIFUはAAV9と比較して約50倍、AAV9/TA/Polymer HIFUはAAV9/TA/Polymerと比較して約20倍向上したことが確認された。ただし、脳以外の肝臓及び腎臓でも、同様のルシフェラーゼ遺伝子発現量の向上が確認された。

実験３. AAV9の投与条件を変更した場合の遺伝子発現評価
　そこで本実験では、上記の実験２で行なった評価において、HIFU照射から各AAV9サンプル投与までの時間間隔を変更した場合の、各臓器におけるルシフェラーゼ遺伝子発現量の評価を行なった。

・実験操作
　図２に、本実験の手順の概要を説明する模式図を示す。また、AAV9/TA/Polymer三元系複合体を用いた場合に該当する工程（工程Ａ１及び工程Ｂ）を示す。
　イソフルラン吸入麻酔によってマウスを眠らせ、マウスの頭蓋に除毛クリームを塗布して完全に除毛した。
　除毛したマウスの頭蓋及びHIFUプローブにゲルを塗布して馴染ませた。この時、ゲルに気泡の混入がないことを確認した。気泡がある場合は、ピペットで吸引して取り除いた。
　マウスの尾静脈に、マイクロバブル100μLを投与した。この際、マイクロバブルは転倒混和してから投与した。マイクロバブルの投与と同時にマウス頭蓋のゲルにプローブを接触させ、超音波を照射した。照射後はゲルをキムワイプで拭き取った。
　マイクロバブルの投与及びHIFU照射から（i）1分後、（ii）30分後、又は（iii）1時間後、（バブルの投与及び超音波の照射時点から（i）1分経過後、（ii）30分経過後、又は（iii）1時間経過後）の各投与間隔で各AAV9サンプルを尾静脈投与した。

・結果
　測定結果を図６Ａ～Ｃに示した。各臓器のルシフェラーゼ遺伝子発現量を対数軸で示した。
　また、HIFUを照射した群については、「HIFU→#分後(AAV9サンプル投与時間)（AAV9サンプル名）」と表記した。

　上記図６Ａ～Ｃに示した結果のうち、図７に、脳及び肝臓における結果の一部を抜粋し、ＡＡＶ９サンプルの種類毎に並べ替えたグラフを示す。

　図６Ａ～Ｃ及び図７に示した結果を参照すると、AAV9単体では、マイクロバブル投与及びHIFUを照射してから1分後の投与群が最も高い遺伝子発現量を示したのに対して、AAV9/TA、及びAAV9/TA/Polymerで脳における遺伝子発現量が最も高い値を示したのは、マイクロバブル投与及びHIFUを照射してから30分後の投与群であることが分かる。

　図８Ａ～Ｃに、主要臓器（肝臓・腎臓・心臓）について、AAV9、AAV9/TA、又はAAV9/TA/Polymerを投与した場合の各臓器と脳でのルシフェラーゼ遺伝子発現量を「脳での遺伝子発現量/各臓器の遺伝子発現量」値として示し、臓器への選択性を評価した。
　マイクロバブル投与及びHIFUを照射してから30分後の群において、AAV9単体を投与した場合と比較して、AAV9/TA/Polymerの該当の臓器に対する脳での遺伝子発現の向上が確認され、肝臓では約4倍、腎臓では約2倍の値であった。

実験４. HIFUを2回照射した場合のAAV9三元系複合体の遺伝子発現評価
　本実験では、上記の実験２で行なった評価において、HIFU照射から各AAV9サンプル投与までの時間間隔、及びHIFUの照射回数を変更した場合の、各臓器におけるルシフェラーゼ遺伝子発現量の評価を行なった。

・実験操作
　図２に、本実験の手順の概要を説明する模式図を示す。また、AAV9/TA/Polymer三元系複合体を用いた場合に該当する工程（工程Ａ１、工程Ｂ及び工程Ａ２）を示す。
　イソフルラン吸入麻酔によってマウスを眠らせ、マウスの頭蓋に除毛クリームを塗布して完全に除毛した。
　除毛したマウスの頭蓋及びHIFUプローブにゲルを塗布して馴染ませた。この時、気泡がないことを確認した。気泡がある場合は、ピペットで吸引して取り除いた。
　マウスの尾静脈に、マイクロバブル100μLを投与した。この際、マイクロバブルは転倒混和してから投与した。マイクロバブルの投与と同時にマウス頭蓋のゲルにプローブを接触させ、超音波を照射した。照射後はゲルをキムワイプで拭き取った。
　マイクロバブルの投与及びHIFU照射から1時間後（バブルの投与及び超音波の照射時点から１時間経過後）に各AAV9サンプル投与し、更に1回目のマイクロバブルの投与及びHIFU照射から24時間後（複合体の投与時点から２３時間経過後、１回目のバブルの投与及び超音波の照射時点から２４時間経過後）に再度マイクロバブルの投与及びHIFU照射を行った。

・結果
　HIFU照射回数を2回にした場合のマウスの各組織のルシフェラーゼ発光強度の測定結果を図９に示した。図中では、各臓器のルシフェラーゼ遺伝子発現量を対数軸で示した。
　また、HIFUを２回照射した群については、「HIFU→#分後(AAV9サンプル投与時間)（AAV9サンプル名）→#分後HIFU」と表記した。

　また、図１０Ａ～Ｃに、マイクロバブル投与及びHIFU照射から1時間後にAAV9サンプルを投与した群と、更に24時間後に再度マイクロバブル投与及びHIFU照射をした群について、主要臓器（肝臓・腎臓・心臓）における、AAV9、AAV9/TA、又はAAV9/TA/Polymerを投与した場合の各臓器と脳でのルシフェラーゼ遺伝子発現量を「脳での遺伝子発現量/各臓器の遺伝子発現量」値として示し、臓器への送達の選択性を評価した。

　図１０Ａ～Ｃに示す結果から、いずれの臓器においてもマイクロバブル投与及びHIFU照射から1時間後にAAV9サンプル投与、24時間後に再度マイクロバブル投与及びHIFU照射をした条件が最も高い値を示しており、24時間後の再度のマイクロバブル投与及びHIFU照射が、脳への遺伝子発現の選択性を向上させることが分かった。特にAAV9/TA/Polymerではいずれの臓器においても、24時間後の再度のマイクロバブル投与及びHIFU照射を行わなかった条件より10倍以上の脳への選択性を示していた。これは、２４時間後時点でのAAV9/TA/Polymerの血中滞留性が、AAV9単体及びAAV9/TAよりも高いことから、血中を滞留している三元系複合体が24時間後のHIFU照射の際に再び脳内へ移行することによるものと考えられる。

実験５. AAV9三元系複合体の遺伝子発現効率における、マイクロバブルによる影響の評価
　本実験では、マイクロバブルの投与から１分後に、各AAV9サンプルを尾静脈投与した群（Bubble(+)）と、マイクロバブルは投与せず、各AAV9サンプルを尾静脈投与した群（Bubble(-)）とで、脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現量の比較を行なった。
　その他の実験条件および操作については、上記実験１と同様である。

・結果
　結果を図１１に示す。図１１では、各ＡＡＶサンプルの（Bubble(-)）の発光強度を１００％とした場合の値を示している。
　ＡＡＶ単体を投与した場合では、（Bubble(-)）群と（Bubble(+)）群とで、遺伝子発現の値はほとんど変わらなかった。一方、AAV/TAを投与した場合、及びAAV/TA/polymerを投与した場合では、（Bubble(-)）に比べて（Bubble(+)）での遺伝子発現の値が大幅に低下しており、血中内でのマイクロバブルとAAV9三元系複合体との相互作用が示唆された。

　以上に示した結果により、AAV9/TA/Polymerの投与と、マイクロバブル投与及びHIFU照射とを組み合わせることにより、マイクロバブル投与及びHIFU照射を行わない場合に比べ、脳でのAAV9由来の遺伝子発現量が顕著に増加することが示された。
　また、マイクロバブル投与及びHIFU照射時点から、所定の時間間隔を設けてAAV9/TA/Polymerの投与を行うことにより、脳での遺伝子発現の選択性が向上することが示された。
　また、AAV9/TA/Polymerの投与から、所定の時間間隔を設けてマイクロバブル投与及びHIFU照射を行うことによっても、脳での遺伝子発現の選択性が向上されることが示された。

＜考察＞
　実験１の図３に示されるとおり、AAV9/TA/Polymer投与群では、AAV9単体およびAAV9/TAと比較して肝臓や腎臓・心臓などの臓器での遺伝子発現量が大幅に減少した。これは、PEG-P[Lys₁₀/(Lys-FPBA)₁₀]₂₀で被覆することによって各臓器細胞に発現しているAAV9受容体がAAV9を認識しにくくなったからであると考えられる。肝臓には、肝類洞内皮細胞(LSEC)が存在し、様々な受容体が発現している。その受容体によって、体内に投与された薬剤の多くはクリアランスされてしまう。AAVのようなウイルスベクターもLSECによって異物認識され、クリアランスされてしまい、標的組織への送達効率が制限されてしまう。さらに、この異物認識機構による肝臓毒性が生じる可能性もある。

　実験３に示されるとおり、マイクロバブル投与＋HIFU照射後から、３０分後にAAV9/TA/Polymerを投与した群で、主要組織に対する脳における遺伝子発現量の顕著な向上を示した。このことは、マイクロバブル投与とAAV9/TA/Polymeの投与とに時間差を設けたことで、実験５に示されるような血中内でバブルリポソームとAAV9三元系複合体のTAが相互作用を起こすことが防止され、脳以外の主要組織の発現量の低減を含めたAAV9三元系複合体としての本来の機能が効果的に発揮されたからであると考えられる。即ち、AAV9/TA/Polymerの複合体化が効果的に維持されたことにより、各組織に発現しているAAV9に対する受容体のAAV9への認識が阻害され、上記の遺伝子発現が抑制されたと考えられる。
　また、脳における発現量のみに着目した場合でも、AAV9/TA/Polymer + HIFUの群の脳での遺伝子発現量は、HIFUを照射していないAAV9/TA/Polymerの群の遺伝子発現量と比較して、HIFU照射から30後に各AAV9サンプルを投与した場合で約10倍の遺伝子発現量を示し、検討した時間条件の中で最も高い遺伝子発現量を示していた。
　この結果により、HIFUを照射してから30分後に最も多くのAAV9/TA/Polymerが血液脳関門を通過し、脳内に侵入すると考えられる。

　さらに、実験４に示されるとおり、HIFUを照射してから1時間後にAAV9サンプルを投与し、24時間後に再びHIFUを照射した条件では、HIFUを照射してから1時間後にAAV9サンプル投与のみをした場合よりも約3倍の遺伝子発現量を示していた。これは、投与後各組織に取り込まれずに血液内を循環しているAAV9/TA/Polymerが、再びHIFUを照射することによって開いた血液脳関門を通過することによって遺伝子発現量が増加するからであり、AAV9/TA/Polymerの24時間における血中滞留性がAAV9単体と比較して大幅に向上している結果を反映しているものと考えられる。

　従来、AAV9の正常組織で大幅な遺伝子発現抑制を示したキャリアの報告はない。従って、本発明を適用した上記の各実施例は、HIFUを用いて全身に投与された遺伝子含有薬剤の脳内への導入を示しつつ、正常組織への大幅な遺伝子発現抑制が期待できる、初めてのデリバリーシステムである。
　本発明を適用したAAV9複合体（AAV9/TA/Polymer）は、遺伝子治療の大きな障壁とされている中和抗体による不活性化および正常組織への集積を抑制しつつ、脳へと効率的にAAVを送達できるキャリアであることが示された。AAV9三元系複合体は、各成分を水中で混ぜるだけで自己会合して複合体を形成し、遺伝子治療の大きな障壁とされている中和抗体による不活性化および正常組織への集積を抑制可能である。さらに、AAV9三元系複合体は細胞内環境に応答して、内包したAAVをリリースする機能も示しており、まさに近年のDDS研究に求められるシンプル&スマートかつ高機能な分子設計を達成している。このように、本発明を適用したAAV9三元系複合体は、遺伝子治療薬としても極めて有用である。

実験６. AAV9三元系複合体によるAAV9の毒性回避の評価
　本実験では、HIFUを使用せずにAA9サンプルを高用量でマウスに投与し、投与から３日目及び７日目にグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT）値を測定し、投与から１４日目に各種血液パラメータを測定することにより、AAV9三元系複合体によるAAV9の毒性回避を評価した。

・実験操作
　図１２に、実験スケジュールを示す。雌性7週齢のBALB/cマウスに高用量AAV9サンプル（AAV9用量：3.0×10¹² vg（1.5×10¹² vgを2日間で2回）/マウス）を尾静脈注射した。最初の注射から3日目及び7日目に尾静脈から25μLの血液を採取し、GPT値を測定した。最初の注射から14日目に、マウスを屠殺し、血液を採取した。血液検査は、血液を遠心分離（5,000rpm、10分）して血漿を得、その血中グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ／アラニンアミノトランスフェラーゼ（GPT/ALT）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ／アスパラギン酸トランスアミナーゼ（GOT／AST）、血液尿素窒素（BUN）、及びクレアチニン（CRE）量を、富士ドライケム（富士フィルム、東京、日本）を用いて分析した。白血球（WBC）、赤血球（RBC）、及び血小板（PLT）の量は、Automatic Multiple Blood Cell Counter(POCH-100IVDIFF (Sysmex) Linconshire, IL)を用いて測定した。

・結果
　図１３に、各AAV9サンプルを投与したマウスにおけるGPT/ALT値の変動を示した。図１４に、各AAV9サンプルを投与したマウスにおける血液パラメータの測定結果を示した。

　AAV9単体を投与したマウス及びAAV9/TAを投与したマウスのGPT値は、14日目にPBSを投与したマウスのGPT値と比較して明らかに上昇していた。この結果は、AAV9およびAAV9/TAが肝毒性を誘導することを示し、先行研究(Wang, L. et al., (2010). Molecular Therapy, 18(1), 118-125.)とよく一致していた。AAV9投与マウスおよびAAV9/TA投与マウスの肝臓組織切片には、門脈付近の炎症細胞由来の黒点がいくつか見られた。

　AAV9投与マウスおよびAAV9/TA投与マウスでは、AAV9の肝毒性により、D-PBS(-)投与マウスと比較して血小板（PLT）レベルが有意に低下していた。TAは生体組織に損傷を与えることが報告されており（Honda, Y., et al., (2021). ACS Applied Materials and Interfaces, 13(46), 54850-54859.）、TAコーティングはAAV9の肝毒性を増強する可能性がある。AAV9およびAAV9/TAは、D-PBS(-)と比較して、LDH濃度およびGOT濃度を上昇させる傾向を示した。

　AAV9/TA/Polymer投与マウスでは、GPT値及びPLT値等の血液パラメータ値がD-PBS(-)投与マウスと同程度であった。AAV9/TA/Polymer投与マウスの肝臓組織切片では、黒い斑点が観察されなかった。これらの結果から、AAV9/TA/Polymer三元系複合体は肝臓へのAAV9による遺伝子導入が減少することにより、AAV9の肝毒性を抑制している可能性が考えられた。

実験７. AAV9三元系複合体の脳内局在の評価
　ルシフェラーゼ遺伝子の代わりにGFP遺伝子を搭載したAAV9（以下「AAV9-GFP」ともいう）を使用したこと以外は、上記実験４と同様にして、バブル投与、HIFU照射、及び各AAV9-GFPサンプルの投与を行い、AAV9-GFPの脳内局在を評価した。

・実験操作
　実験４と同様の方法（図２参照）で、マウスに対して、バブル投与、HIFU照射、及び各AAV9-GFPサンプル投与を行った。AAV9-GFPサンプルの投与から21日後に、マウスを灌流固定し、固定した脳サンプルを採取した。脳サンプルは7μｍで凍結摘出し、anti-GFP(Anti-GFP (Green Fluorescent Protein) mAb-Alexa Fluor^TM 488 MBL社：D153-A48)(AAV9-GFP発現細胞)、anti-NeuN(NeuN rabbit mAb：CST社24307 S)(神経細胞マーカー)、anti-GFAP(CST:12389 S)(グリア細胞マーカー)、anti-Iba1(abcam:ab178846)(マイクログリアマーカー)、又はanti-MAG1(CST9043 S)(オリゴデンドロサイトマーカー)で染色した。取り出した脳は、4％パラホルムアルデヒド及び0.1％グルタルアルデヒド溶液の静脈内注射の還流によって固定された。その後、全脳を回収し、4%パラホルムアルデヒド及び0.1%グルタルアルデヒド溶液で24時間固定した。組織は、１０％及び１５％スクロース含有PBSで6時間、その後２０％スクロース含有PBSで一晩置いた。最後に、組織をOCTコンパウンドに包埋した。免疫蛍光染色のために、凍結組織切片を上記の一次抗体とインキュベートし、SignalStain Boost IHC検出試薬で染色した。検出には、TSA plus fluorescein system kit (PerkinElmer)を使用した。凍結組織切片を洗浄し、カバースリップしたBZ-X700（KEYENCE、東京、日本）を用いてサンプルを観察した（Ex/Em：450-490/500-550 nm）。

・結果
　結果を図１５Ａ～Ｃに示す。HIFU(+)はHIFU照射した群を表し、HIFU(-)は、HIFU照射しなかった群を表す。
　図１５Ａに、マウスの脳水平断面の抗GFP抗体染色像及びヘマトキシリン・エオジン（HE）染色像を示す。図１５Ｂに、脳水平断面における各部位のGFP陽性細胞数を示す（n=3）。

　AAV9-GFP投与マウスでは、特に海馬（Hippocampus）で強いGFP遺伝子発現を示した。AAV9-GFP/TA投与マウスおよびAAV9-GFP/TA/Polymer投与マウスでも、海馬で同様の強いGFP発現を示していた。AAV9-GFP/TA/PolymerのpH応答性から、AAV9-GFP/TA/Polymerは、内皮細胞内のエンドソームの酸性pH（～5.5）に反応してAAV9-GFPを放出し、その過程でトランスサイトーシスすると推測された。したがって、AAV9-GFPは、トランスサイトーシスにより脳内に移行する際には裸の状態であると考えられ、AAV9-GFPと同様に海馬で遺伝子導入挙動を示した。全てのAAV9-GFPサンプル処理マウスにおいて、HIFU照射により、脳全体のGFP発現量が増加した。AAV9-GFP単体では、HIFU照射により、特に海馬（Hippocampus）と線条体（striatum）の組織でGFP発現量の増加が見られた。AAV9-GFP/TAおよびAAV9-GFP/TA/Polymerも、HIFU照射により、海馬（Hippocampus）と線条体（striatum）の両方でGFP発現の上昇が見られた。AAV9-GFP/TAおよびAAV9-GFP/TA/Polymerは、大脳皮質（Cortex）でも比較的高いGFP発現を示した。

　図１５Ｃは、AAV9感染部位（抗GFP抗体による染色）と各神経細胞マーカー（抗NeuN抗体：ニューロン、抗GFAP抗体：グリア、抗Iba-1抗体：ミクログリア、抗MAG-1抗体：オリゴデンドロサイト）の共局在を評価した免疫染色画像を示す。AAV9-GFPと各種神経細胞マーカーとの共局在を観察するために、組織切片中の脳細胞を抗体（抗NeuN抗体：ニューロン、抗GFAP抗体：グリア、抗Iba-1抗体：ミクログリア、抗MAG-1抗体：オリゴデンドロサイト）を用いて染色した。GFP及び染色細胞が共局在していない部分の組織は、白質である可能性がある。GFPの蛍光（緑）と各種マーカーに対する抗体の蛍光（赤）が重なる部分は、黄色又はオレンジ色に変化した。表１に、図１５Ｃの結果から、二重染色強度を評価した結果を示す。表１中の記号は以下の二重染色強度を示す。
　－：０％、＋：１～２％、＋＋：２～５％、＋＋＋：５～１０％、＋＋＋＋：１０～１５％。

　AAV9-GFP単体では、抗GFAPの蛍光は、GFPの蛍光と強く重なる領域が観察された。抗NeuN抗体の蛍光も、GFPの蛍光と重なる領域が観察された。一方、GFPの蛍光は、抗Iba-1抗体の蛍光及び抗MAG-1抗体の蛍光との共局在は観察されなかった。これらの結果から。AAV9－GFPは、ミクログリア細胞（抗Iba-1抗体）及びオリゴデンドロサイト細胞（抗MAG-1抗体）では、効果的にGFP発現していないことが示された。
　AAV9-GFP/TAおよびAAV9-GFP/TA/Polymerでは、AAV9-GFP単体と同様にグリア細胞との共局在を示したが、共局在効率はAAV9と比較して若干低下した。
　HIFUを照射すると、AAV9-GFPの脳内蓄積量が増加したためか、すべてのAAV9-GFPサンプルのニューロンおよびグリア細胞との共局在化効果が向上した。これらの結果から、HIFU照射は、AAV9およびAAV9三元系複合体の遺伝子導入特性を維持できることが示された。

　各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。

　１　　複合体
　２　　ボロン酸基を有する高分子
　３　　ジオール構造を有する化合物
　４０　結合体と複合化する物質（複合要素）
　４　　タンパク質
　１０　結合体

Claims

　哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の対象領域に超音波を照射する工程Ａ１と、
　前記哺乳動物に複合体を投与する工程Ｂと、を含む方法に使用され、
　前記複合体を含有し、
　前記複合体が、高分子と、前記高分子と複合化する物質とを含む、医薬。
　前記複合体が、ボロン酸基を有する高分子、及びジオール構造を有する化合物、が結合した結合体と、前記結合体と複合化する物質と、を含む、請求項１に記載の医薬。
　前記ジオール構造を有する化合物が、ポリフェノールである、請求項２に記載の医薬。
　前記ジオール構造を有する化合物が、タンニン酸、没食子酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項２に記載の医薬。
　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記バブルの投与時点から５分経過以後に行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記超音波の照射時点から３時間経過以前に行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記方法において、前記工程Ｂにおける前記複合体の投与が、前記工程Ａ１における前記バブルの投与時点から２０分経過以後であり、前記工程Ａ１における前記超音波の照射時点から６０分経過未満である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記方法が、前記工程Ａ１及び前記工程Ｂの後に、前記哺乳動物にバブルを投与し、前記哺乳動物の前記対象領域に超音波を照射する工程Ａ２を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記超音波が、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記バブルが、バブルリポソームである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記複合化する物質が、ウイルスベクターである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬。
　前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載の医薬。
　請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬と、バブルとを備える、キット。
　哺乳動物に超音波を照射する超音波照射装置と、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬と、を備えるシステム。