CN104031270A - 可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用 - Google Patents
可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用，先对端甲氧基聚乙二醇进行胱胺化改性，利用其端氨基引发γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐开环聚合反应，接着利用2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯通过加成反应将开环聚合反应得到的产物与聚乙烯亚胺连接起来，得到目标产物。本发明方法合成的共聚物具有两亲性，可自组装形成纳米粒；该共聚物用作药物载体能够同时装载化疗药物和基因药物；且能够响应谷胱甘肽等还原性物质而完全解离崩溃，既利于载体从内涵体向细胞质逃逸，又能快速释放药物，提高治疗效果。本发明方法可控制嵌段共聚物中各段分子量和长度，反应条件温和，适用药物种类多。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是人类健康的主要威胁之一，对其治疗是世界性的难题。化疗，与外科手术和放疗一样，是目前恶性肿瘤治疗的主要手段。化疗是利用细胞毒药物杀死肿瘤细胞达到治疗目的的方法。然而，细胞毒药物，如阿霉素、紫杉醇、表阿霉素和多西紫杉醇等，通常水溶性差且无选择性，生物利用度低，可导致严重的毒副作用。况且，化疗过程中肿瘤细胞易产生多药耐药性，疗效不够理想。据美国癌症协会估计，90％以上的肿瘤患者死于不同程度的多药耐药性。这些已成为肿瘤化疗成功的主要障碍。因此，如何有效解决肿瘤治疗中多药耐药性和严重毒副作用问题是肿瘤化疗成功的关键因素。近些年的许多研究表明，利用高分子材料作为细胞毒药物的载体，将细胞毒药物装载于高分子材料内部形成各种形式的微纳米颗粒，尤其是纳米颗粒，可显著提高细胞毒药物的溶解能力，实现血液中长循环，并经肿瘤组织特有的“增强的渗透和治疗效应”的被动靶向作用富集于肿瘤组织中，从而提高肿瘤细胞对细胞毒药物或药物-载体复合体的摄取，有效提高药物效果和降低毒副作用。
随着肿瘤生物学和细胞生物学研究的不断发展，人们逐渐认识到恶性肿瘤是一种多因素多途径参与调控的复杂体系的结果，仅靠单一种药剂治疗恶 性肿瘤几乎不可能取得理想的治疗效果，而基于不同作用机制和不同结构的药物联合治疗肿瘤受到广泛关注。从根本上讲，恶性肿瘤更是一种基因病。因此，利用基因物质治疗恶性肿瘤被寄予更高的希望，近年得到快速发展。基因治疗是指将外源性基因物质(DNA或RNA)按照一定方式导入目标细胞，以纠正缺陷基因或促进/抑制特定基因/蛋白表达，从而达到治疗疾病目的的。目前，制约基因治疗临床应用的瓶颈问题是缺乏安全有效的体内递送载体。基因递送载体主要分为病毒类载体和非病毒类载体两类。其中，病毒类载体的突出优点是转染效率高，但这类载体存在潜在致病风险、免疫反应、基因装载量小、制备和纯化困难等问题。相比之下，非病毒类载体则具有制备简单、易化学改性、基因装载量大等优点。尽管非病毒类载体目前仍存在转染效率不够高，呈现分子量依赖性的转染效率和毒性问题，仍被认为是更为理想的基因递送载体，用于替代病毒类载体。非病毒类载体主要包括阳离子脂质体和阳离子聚合物，相对于前者，后者具有更高的基因装载能力和更加稳定的载体-基因复合物，已成为非病毒基因载体的主要研究对象。常见的非病毒基因载体主要包括聚乙烯亚胺、聚酰胺-胺、壳聚糖衍生物、聚赖氨酸、带伯胺/仲胺/叔胺基团的丙烯酰胺类聚合物等。其中，聚乙烯亚胺因具有高的基因压缩能力和高的转染效率，已成为非病毒基因载体的黄金标准。聚乙烯亚胺的基因转染效率随分子量增加而增大。但分子量的增加，其不可降解的烷基骨架结构将明显增加细胞毒性。因此，如何既提高聚乙烯亚胺的转染效率又呈现低的细胞毒性就成为研究的重点。目前，大多采用可响应肿瘤细胞特殊的还原性酸性微环境的化学键对低分子量聚乙烯亚胺进行交联，通过提高分子量增加基因转染效率，同时又能在肿瘤细胞内降解为低分子量的产物， 避免高分子量聚乙烯亚胺显著的细胞毒性问题。如申请号为201110327109.2的中国专利，公开了一种利用二元醛交联聚乙烯亚胺用作基因载体的方法，其中醛基和聚乙烯亚胺的氨基形成对酸敏感的亚胺键，以期在载体进入肿瘤细胞后响应酸性环境而降解。但这些亚胺键无法保证基因载体稳定性，可能在达到肿瘤组织进入细胞前已解离，转染效果难以保证。
临床恶性肿瘤中多采用序贯联合治疗方法，以克服单一药剂不满意的治疗效果。然而，这种联合治疗不能在微观水平上实现联合，需要重复多次用药，给病人带来不必要的麻烦。同时，这种联合治疗方法难以保证同一地点的联合用药，协同抗肿瘤治疗效果不易体现，临床疗效不够理想。为此，基于同一药物递送载体的联合治疗将可克服这一缺点，已成为目前药物递送体系开发的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物及其合成方法和应用，该方法能够灵活控制各聚合物组分分子量大小和链长度、反应条件温和、原料易得，合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物能够同时装载化疗药物和基因药物，而且还能提高药效，降低毒副作用。
为了达到上述目的，本发明的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，包括如下步骤：
1)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物的合成：
向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水有机溶剂，然后在氮气氛下加入γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐，接着于25℃～40℃反应48小时 ～72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇和γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的质量比为(1：1)～(1：4)；
2)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
将除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水有机溶剂中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应15小时～40小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：(10～40)；
3)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
将除水后的聚乙烯亚胺用无水有机溶剂溶解，然后加入除水后的聚乙烯亚胺质量2～6倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应18小时～36小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
所述的胱胺化mPEG由如下步骤合成：
1)将分子量为800-4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：(0.02～0.08)：(3～8)；
2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到胱胺化mPEG。
所述的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯由以下步骤合成：
1)将3,3'-二硫代二丙酸、乙醇和对甲苯磺酸加入甲苯中，回流反应8小时后除去溶剂；接着除去溶剂后的剩余物中加入质量浓度为85％的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为2：8的水和乙醇混合溶液重结晶，得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，3,3'-二硫代二丙酸、对甲苯磺酸以及水合肼水溶液中水合肼的摩尔比1：0.005：30；
2)将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于浓度为1mol/L的盐酸中，在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液，滴完后室温反应6小时，然后加入与盐酸等体积的苯，搅拌后分出苯相；苯相经干燥后在70℃下回流反应4小时，除去溶剂后即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10。
所述的步骤1)除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇、步骤2)除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚以及步骤3)除水后的聚乙烯亚胺均是氮气气氛下采用甲苯共沸除水的方式得到的，且共沸除水时的回流温度为110℃～120℃，共沸除水时的回流时间为2小时～6小时。
所述的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成：将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后浓缩，最后将浓缩后得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1：(0.35～0.4)。
所述的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
所述的步骤3)中除水后的聚乙烯亚胺的分子量为600～2000Da。
所述的方法合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物，包括聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺段，且聚乙二醇段与聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段之间、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段与阳离子聚乙烯亚胺段之间分别通过二硫键连接，其化学结构式为：
所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物作为装载化疗药物和基因药物的载体的应用。
所述的化疗药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱，基因药物为Pgp siRNA、bcl-2siRNA或DNA。
步骤1)中每100毫升无水有机溶剂中加入5g～15g的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐。
步骤2)中每100毫升无水有机溶剂中溶解5g～15g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物。
步骤3)中每100毫升无水有机溶剂溶解0.5g～2g除水后的聚乙烯亚胺。
每100毫升无水甲苯中溶解5g～30g的端甲氧基聚乙二醇。
每100毫升蒸馏水中溶解5g～20g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性 mPEG。
每100毫升无水四氢呋喃中加入5g～15g的L-谷氨酸-γ-苄酯。
本发明利用胱胺化端甲氧基聚乙二醇引发γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的开环聚合；然后键接含二硫键的二异氰酸酯，用于阳离子聚乙烯亚胺的连接，从而实现不同聚合物成分均通过二硫键连接，用于化疗药物和基因物质的同时装载。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物由实现隐形作用的聚乙二醇段、通过疏水作用装载化疗药物的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段和经静电作用负载基因药物的阳离子聚乙烯亚胺组成，因此，该共聚物能够同时装载化疗药物和基因药物，且为利用这两类药物协同抗肿瘤治疗提供有效的载体材料。
2)聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺依次通过二硫键连接，因此，负载药物的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物到达肿瘤细胞内部后响应肿瘤细胞内还原性环境而断裂，实现共聚物载体的完全解离，既可实现所载药物的快速释放，短时间内迅速提高药物有效浓度，又能促进药物从内涵体/溶酶体向细胞质的逃逸，从而提高药效，降低毒副作用。
3)本发明合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物载药后形成核壳的结构特点为，内核包埋疏水性细胞毒药物，高效的阳离子聚乙烯亚胺通过静电作用压缩荷负电的基因物质后覆盖于内核表面，外层为亲水的聚乙二醇外壳，这样的结构既提高了纳米载体的稳定性，有效 保护基因物质，还可具有血液中的长循环特性；可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物自身或载药后由于具有两亲性均可自组装形成纳米粒，赋予其经肿瘤组织‘增强的渗透和滞留效应’被动靶向的能力，富集于肿瘤组织内部，从而提高药物生物利用度，降低毒副作用；
4)本发明的合成方法可灵活控制聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺的分子量大小和链长度、反应条件温和、原料易得，合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物载体贮存稳定性好，基因装载高效低毒、药物装载方法简单、降解的产物为氨基酸且可被人体吸收等优点，此外还可通过控制阳离子段聚合物分子量大小，使其经循环系统排出体外。
附图说明
图1是本发明的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成路线示意图；
图2是实施例1获得的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的1H-NMR谱图；
图3是实施例1合成的载体装载阿霉素后自组装纳米粒的粒径分布图；
图4是实施例1合成的共载阿霉素和FAM标记siRNA的纳米粒进入乳腺癌细胞MCF-7内的激光共聚焦荧光照片；其中，a为DAPI染色的细胞核荧光照片，b为细胞核处的阿霉素荧光照片，c为FAM标记的siRNA进入细胞后的荧光照片，d为a-c的组合图。
具体实施方式
参见图1，本发明首先对端甲氧基聚乙二醇进行胱胺化改性，利用其端氨 基引发γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐开环聚合反应，得到含端氨基的聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；接着利用2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，通过加成反应将其与聚乙烯亚胺连接起来，得到可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
下面通过实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于此。
实施例1：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇(mPEG)合成：
1.1)将干燥的分子量为4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.06：8；每100毫升无水甲苯中溶解5g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；每100毫升蒸馏水中溶解5g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩，最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1:0.35； 每100毫升无水四氢呋喃中加入5g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于110℃共沸6小时进行除水；向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水二氯甲烷，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于30℃反应65小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：4，每100毫升无水二氯甲烷中加入10g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于115℃共沸3小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水氯仿中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:15，每100毫升无水氯仿中溶解5g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为1200Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于110℃共沸6小时除水；将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加 入聚乙烯亚胺质量3倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解1g除水后的聚乙烯亚胺。
本实施例合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物包括聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺，且聚乙二醇段与聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段之间、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段与阳离子聚乙烯亚胺之间分别通过二硫键连接，其化学结构式为：
1H-NMR谱图见图2。从图2可以看出，各个共聚物组分质子的化学位移均得到了很好的鉴定，表明该共聚物的合成是成功的。
本实施例合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物装载阿霉素后，呈现两亲性性质，在水中可自组装成为纳米粒，动态光散射法测得的粒径分布图见图3。由图3可以看出，粒径分布主要集中于100-200纳米，粒径分布范围窄，比较理想。
本实施例合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物能够同时装载化疗药物和基因药物，且化疗药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱，基因药物为Pgp siRNA、bcl-2siRNA或DNA。其装载方法是将基因药物和装载阿霉素后的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物混合，经涡旋振荡器混合形成复合物，实现基因药物的装载。
以可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物共装载阿霉素和Pgp siRNA为例，图4a中的B为DAPI染色的细胞核发出的荧光，图4b中的R为细胞核处的阿霉素发出的荧光，图4c中的G为FAM标记的Pgp siRNA进入细胞后发出的荧光；将图4a-4c组合后得到图4d，由图4d可以看出可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物共装载阿霉素和绿色荧光剂FAM标记的Pgp siRNA后形成的纳米粒可经胞吞作用有效进入乳腺癌细胞MCF-7内，阿霉素和Pgp siRNA均可有效进入乳腺癌细胞MCF-7内，分布于乳腺癌细胞MCF-7的细胞核周围，可见合成的载体可用于阿霉素和siRNA的共同装载和递送。
实施例2：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量1200Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.04：5，每100毫升无水甲苯中溶解25g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解20g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩，最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1:0.4，每100毫升无水四氢呋喃中加入15g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于115℃共沸5小时进行除水；向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水氯仿，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于30℃反应52小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：1，每100毫升无水氯仿中加入5g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于120℃共沸2小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水二氧六环中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:20；每100毫升无水二氧六环中溶解12g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为1200Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于120℃共沸2小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加入聚乙烯亚胺质量5倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解2g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例3：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量2000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.02：3，每100毫升无水甲苯中溶解10g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解5g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下 加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩，最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1:0.367；每100毫升无水四氢呋喃中加入10g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于115℃共沸4小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水氯仿，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于25℃反应72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：2，每100毫升无水氯仿中加入10g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于120℃共沸2小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水二氯甲烷中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:10，每100毫升无水二氯甲烷溶解5g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合 成：
向分子量为600Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于120℃共沸2小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加入聚乙烯亚胺质量2倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解0.5g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例4：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃氮气氛下反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.02：4，每100毫升无水甲苯中溶解5g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解5g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩， 最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1:0.35，每100毫升无水四氢呋喃中加入10g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于110℃共沸6小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水四氢呋喃，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于25℃反应72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到mPEG-PBLG两嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：1.5，每100毫升无水四氢呋喃中加入7.5g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于110℃回流5小时除水，将得到的将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水二氯甲烷中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1:35，每100毫升无水二氯甲烷中溶解5g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合 成：
向分子量为2000Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于110℃回流5小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加入聚乙烯亚胺质量6倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解1g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例5：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量1200Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.03：5，每100毫升无水甲苯中溶解20g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解15g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩， 最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐。；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1:0.35，每100毫升无水四氢呋喃中加入10g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于115℃共沸4小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水四氢呋喃，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于30℃反应50小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：2.5，每100毫升无水四氢呋喃中加入10g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于120℃共沸3小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：10，每100毫升无水四氢呋喃溶解7.5g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为600Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于110℃共沸6小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加入聚乙烯亚胺质量2倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解0.5g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例6：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量2000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃氮气氛下反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.08：8，每100毫升无水甲苯中溶解12g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解18的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：
将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中形成悬浮体系，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后减压去除大部分溶剂使浓缩，最后将浓缩得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷 氨酸-N-羧基环内酸酐，其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为过量1:0.397，每100毫升无水四氢呋喃中加入10g的L-谷氨酸-γ-苄酯；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于110℃共沸4.5小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水二氧六环，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于40℃反应48小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到mPEG-PBLG两嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：4，每100毫升无水二氧六环中加入5g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于115℃共沸4小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水氯仿中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应24小时后浓缩，用干燥冷乙醚沉淀，真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比1：35，每100毫升无水氯仿中溶解12g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为2000Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于120℃ 共沸3小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氯甲烷溶解，再加入聚乙烯亚胺质量3.5倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应24小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氯甲烷中溶解2g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例7：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量800Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃氮气氛下反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.08：3，每100毫升无水甲苯中溶解30g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解18g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：与实施例6的步骤2)相同；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于120℃共沸2小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水二氧六环，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内 酸酐(BLG-NCA)，溶解后于40℃反应48小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到mPEG-PBLG两嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：3，每100毫升无水二氧六环中加入15g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮气气氛下于110℃共沸6小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水氯仿中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应15小时后浓缩，用干燥冷乙醚沉淀，真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比1：40，每100毫升无水氯仿中溶解15g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为2000Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于120℃共沸3小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水氯仿溶解，再加入聚乙烯亚胺质量3.5倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应36小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水氯仿中溶解2g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例8：
1)胱胺化端甲氧基聚乙二醇合成：
1.1)将干燥的分子量800Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气气氛下于85℃氮气氛下反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀3次，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：0.02：3，每100毫升无水甲苯中溶解30g的端甲氧基聚乙二醇；
1.2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到白色粉末状的胱胺化端甲氧基聚乙二醇；其中，每100毫升蒸馏水中溶解18g的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG；
2)γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐合成：与实施例6的步骤2)相同；
3)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物合成：
将胱胺化端甲氧基聚乙二醇置于反应容器中，向其中加入甲苯，并在氮气气氛下，于120℃共沸2小时除水，向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水二氧六环，然后在氮气氛下加入干燥的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐(BLG-NCA)，溶解后于40℃反应48小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤后得到mPEG-PBLG两嵌段共聚物；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇和BLG-NCA的质量比为1：3，每100毫升无水二氧六环中加入15g的BLG-NCA；
4)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
向端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物中加入甲苯并在氮 气气氛下于110℃共沸6小时除水，将得到的除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水氯仿中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应40小时后浓缩，用干燥冷乙醚沉淀，真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比1：40，每100毫升无水氯仿中溶解15g除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；
5)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
向分子量为2000Da的聚乙烯亚胺中加入甲苯，并在氮气气氛下于120℃共沸2小时除水，将得到的除水后的聚乙烯亚胺用无水二氧六环溶解，再加入聚乙烯亚胺质量3.5倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应18小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并干燥，得到黄色的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物；其中，每100毫升无水二氧六环中溶解2g除水后的聚乙烯亚胺。
实施例9：实施例9的步骤1)～步骤4)与实施例6的步骤1)～步骤4)相同，将实施例6中步骤5)的无水二氯甲烷替换成无水四氢呋喃，其他条件相同，合成可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
上述实施例1～8中2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯由以下步骤合成：
1)将3,3'-二硫代二丙酸、乙醇和对甲苯磺酸加入甲苯中，回流反应8小时后除去溶剂；接着除去溶剂后的剩余物中加入质量浓度为85％的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为2：8的水和乙醇混合溶液重结晶， 得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，3,3'-二硫代二丙酸、乙醇、对甲苯磺酸以及水合肼水溶液中水合肼的摩尔比1：20：0.005：30；
2)将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于浓度为1mol/L的盐酸中，在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液，滴完后室温反应6小时，然后加入与盐酸等体积的苯，搅拌后分出苯相；苯相经干燥后在70℃下回流反应4小时，除去溶剂后即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10。
干燥的冷乙醚的获得方法为，乙醚经氢化钙回流12小时后收集馏分，再在氮气氛下冷至零下20℃。冻干温度为-40℃，真空干燥温度在30℃；反应体系浓缩时，浓缩到原来体积的三分之一到二分之一。
本发明中2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯是申请号为201310229284.7的中国专利实施例4步骤2)的产物2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯。本发明中胱胺化端甲氧基聚乙二醇是申请号为201310229284.7的中国专利实施例4最终产物2-氨基乙基二硫乙氨酯聚乙二醇。
本发明的共聚物由实现隐形的聚乙二醇段、疏水的聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段和阳离子聚乙烯酰亚胺构成，可同时装载化疗药物和基因药物。通过将还原敏感的二硫键嵌入共聚物不同成分连接桥中，可实现负载药物的载体到达肿瘤细胞内部后响应其中的还原性环境而完全解离，不仅可促进药物从内涵体逃逸进入细胞质，避免溶酶体的酶解作用，而且可快速提高细胞内有效药物浓度，提高药物作用效果；该嵌段共聚物载药后形成核壳的结构特点为，内核包埋疏水性细胞毒药物，高效的阳离子聚乙烯亚胺通过静电作用压缩荷负电的基因物质后覆盖于内核表面，外层为亲水的聚乙二醇外壳，这样的结 构既提高了纳米载体的稳定性，有效保护基因物质，还可具有血液中的长循环特性；嵌段共聚物自身或载药后均可自组装形成纳米粒，赋予其经肿瘤组织‘增强的渗透和滞留效应’被动靶向的能力，富集于肿瘤组织内部，从而提高药物生物利用度，降低毒副作用；可同时装载细胞毒药物和基因物质，可为利用这两类药物协同抗肿瘤治疗提供有效的载体材料；另外，该载体还具有载体贮存稳定性好、分子量大小可控制、基因装载高效低毒、药物装载方法简单、降解的产物为氨基酸且可被人体吸收等优点，此外还可通过控制阳离子段聚合物分子量大小，使其经循环系统排出体外。
Claims (10)
1.可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物的合成：
向除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇中加入无水有机溶剂，然后在氮气氛下加入γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐，接着于25℃～40℃反应48小时～72小时，反应所得的产物用冷乙醚沉淀和洗涤，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物；其中，除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇和γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐的质量比为(1：1)～(1：4)；
2)异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物的合成：
将除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物溶于无水有机溶剂中，接着在氮气氛下加入2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯，然后回流反应15小时～40小时后浓缩，将浓缩得到的反应液用干燥冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空室温干燥后得到异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物；其中，除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚物与2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：(10～40)；
3)可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成：
将除水后的聚乙烯亚胺用无水有机溶剂溶解，然后加入除水后的聚乙烯亚胺质量2～6倍的异氰酸酯化mPEG-PBLG嵌段共聚物，接着回流反应18小时～36小时，反应液经浓缩后用冷乙醚沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物。
2.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的胱胺化mPEG由如下步骤合成：
1)将分子量为800-4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡和2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯溶于无水甲苯中，在氮气氛下于85℃反应48小时，然后将得到的反应体系在无水正己烷中沉淀，收集沉淀并真空干燥，得到2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性的mPEG；其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基锡以及2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯的摩尔比为1：(0.02～0.08)：(3～8)；
2)将2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯改性mPEG溶于蒸馏水中，于60℃反应6小时，反应体系在蒸馏水中透析、冻干后得到胱胺化mPEG。
3.根据权利要求1或2所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯由以下步骤合成：
1)将3,3'-二硫代二丙酸、乙醇和对甲苯磺酸加入甲苯中，回流反应8小时后除去溶剂；接着除去溶剂后的剩余物中加入质量浓度为85％的水合肼水溶液，回流反应4小时，然后用体积比为2：8的水和乙醇混合溶液重结晶，得到3,3'-二硫代二丙酰肼；其中，3,3'-二硫代二丙酸、对甲苯磺酸以及水合肼水溶液中水合肼的摩尔比1：0.005：30；
2)将3,3'-二硫代二丙酰肼溶于浓度为1mol/L的盐酸中，在冰盐水浴冷却下滴加亚硝酸钠水溶液，滴完后室温反应6小时，然后加入与盐酸等体积的苯，搅拌后分出苯相；苯相经干燥后在70℃下回流反应4小时，除去溶剂后即得2,2'-二硫代二乙基异氰酸酯；其中，3,3'-二硫代二丙酰肼与亚硝酸钠水溶液中的亚硝酸钠的摩尔比为1:10。
4.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于：所述的步骤1)除水后的胱胺化端甲氧基聚乙二醇、步骤2)除水后的端甲氧基聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)嵌段共聚以及步骤3)除水后的聚乙烯亚胺均是氮气气氛下采用甲苯共沸除水的方式得到的，且共沸除水时的回流温度为110℃～120℃，共沸除水时的回流时间为2小时～6小时。
5.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于，所述的γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐由以下步骤合成：将L-谷氨酸-γ-苄酯加入无水四氢呋喃中，接着在氮气氛下加入三光气，随后于50℃反应至形成澄清溶液后浓缩，最后将浓缩后得到的反应体系在无水正己烷中沉淀、重结晶，得到γ-苄酯-L-谷氨酸-N-羧基环内酸酐；其中，L-谷氨酸-γ-苄酯与三光气的摩尔比为1：(0.35～0.4)。
6.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于：所述的无水有机溶剂为无水二氯甲烷、无水氯仿、无水二氧六环或无水四氢呋喃。
7.根据权利要求1所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物的合成方法，其特征在于：所述的步骤3)中除水后的聚乙烯亚胺的分子量为600～2000Da。
8.如权利要求1～7中任意一项权利要求所述的方法合成的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物，其特征在于，包括聚乙二醇段、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段以及阳离子聚乙烯亚胺段，且聚乙二醇段与聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段之间、聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)段与阳离子聚乙烯亚胺段之间分别通过二硫键连接，其化学结构式为：
9.权利要求8所述的可完全解离型聚乙二醇-聚(L-谷氨酸-γ-苄酯)-聚乙烯亚胺共聚物作为装载化疗药物和基因药物的载体的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的化疗药物为阿霉素、紫杉醇或喜树碱，基因药物为Pgp siRNA、bcl-2siRNA或DNA。
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