CN1437019A - 香菇多糖分子量及分子量分布测定方法 - Google Patents

香菇多糖分子量及分子量分布测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明是建立一种普适校正法测定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布的方法。该方法，其特征在于：采用高效凝胶渗透色谱法－HPGPC；HPGPC的流动相可以是超纯水，0.1～0.5M硝酸钠，0.1～0.5M醋酸钠和磷酸盐缓冲溶液；HPGPC的分析柱可以选用适合多糖的色谱柱，可以用1～4根，分离范围为2,000,000～1000道尔顿的色谱柱组成；HPGPC分析柱的柱温可保持在30℃～55℃；HPGPC的流速可以为0.1ml/min～1.0ml/min；绘制HPGPC相对标准曲线的标准物质可以是Dextran或者Pullulan；绘制HPGPC普适校正曲线的标准物质为香菇多糖的分级分离产品。

Description

香菇多糖分子量及分子量分布测定方法
技术领域
本发明涉及一种分子量及分子量分布测定方法，具体地说是一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法。
背景技术
香菇多糖是目前广泛应用于抗肿瘤化疗及放疗的一种生物反应调节剂(Biological Response Modifier BRM)。特别是应用于胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌具有明显的化疗增效及降低化疗及放疗的毒副作用，对其他肿瘤的化疗均有不同程度的增效及降低毒副作用。香菇多糖是以β-D-(1→3)葡萄糖为主链，β-D-(1→6)葡萄糖为侧链的葡聚糖，为多分散性的高聚物。研究发现香菇多糖分子量与动物乃至临床抗肿瘤活性有着相关关系，因此，研究香菇多糖分子量的测定方法对控制香菇多糖内在质量具有重要意义。然而，目前测定大分子多糖分子量的方法所采用的标准物质往往与被测物质的化学结构不相同，由此建立的为相对标准曲线，所测结果为相对分子量，与所测物质的实际分子量有较大的误差。因此，需要建立一种适合工业生产的香菇多糖分子量及其分布的测定方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种普适校正法测定香菇多糖天然大分子高聚物分子量及其分布的方法。
本发明的原理系根据Mark-Houwink经验公式[η＝KMα]来进行的，式中η为特性粘数，M为分子量，K、α为系数。
一、本发明产品香菇多糖的分子量、分子式、化学结构式
1、分子量测定
经高效凝胶渗透色谱，采用普适校正曲线方法测定分子量大多在40～80万之间。
2、碳核磁共振谱(见表1)
                                  表1
    C  香菇多糖(天地欣)  日本产香菇多糖   解析
    1     104.6     104.6   β-D-(1→3)葡萄糖
    2     74.5     74.3   β-D-(1→3)葡萄糖
    3     87.7     87.7   β-D-(1→3)葡萄糖
    4     70.2     70.2   β-D-(1→3)葡萄糖
    5     77.8     77.9   β-D-(1→3)葡萄糖
    6     62.5     62.5   β-D-(1→3)葡萄糖
    1′     104.9     104.6   β-D-(1→6)葡萄糖
    6′     71.5     71.5   β-D-(1→6)葡萄糖
3、红外光谱图(见图1)
4、分子式
经微量元素分析结果表明，分子式为(C6H10O5)n
5、化学结构式
经高碘酸氧化及Smith降解等化学反应结合光谱分析法，香菇多糖的一级结构式如下：
Figure A0311290800071
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于：
采用高效凝胶渗透色谱法—HPGPC；
HPGPC的流动相可以是超纯水，0.1～0.5M硝酸钠，0.1～0.5M醋酸钠和磷酸盐缓冲溶液；
HPGPC的分析柱可以选用适合多糖的色谱柱，可以用一～四根，分离范围为2,000,000～1000道尔顿的色谱柱组成；
HPGPC分析柱的柱温可保持在30℃～55℃；
HPGPC的流速可以为0.1ml/min～1.0ml/min；
绘制HPGPC相对标准曲线的标准物质可以是Dextran或者Pullulan；
绘制HPGPC普适校正曲线的标准物质为香菇多糖的分级分离产品。
本发明的目的还可以通过以下措施来达到：
采用普适校正的标准曲线来测定香菇多糖的分子量及其分布；
采用碱液溶解香菇多糖；
所用碱液可以是氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸氢钠；
所用碱液的浓度可以是0.1～1MNaOH，0.1～1MKOH，0.5～1MNa2CO3，0.1～1MNaHCO3；
HPGPC的流动相选用0.1mol/L的醋酸钠和磷酸盐缓冲液为好；
所述的醋酸钠和磷酸盐的PH可以是6.0～8.0；
HPGPC的分析柱优化的组合方式为三根不锈柱串联，分离范围为2,000,000～1000道尔顿；
HPGPC分析柱的优选柱温以30℃为佳；
HPGPC的流速保持0.4ml/min为佳；
香菇多糖分级分离产品的重均分子量道尔顿分别为：1、62.4×104，2、53.4×104，3、18.4×104，4、10.6×104，5、7.72×104；
测得香菇多糖K值为0.0535～0.0543，α值为0.6～0.8；
优化的香菇多糖K值为0.0539，α值为0.607。
本发明采用普适校正曲线对香菇多糖分子量进行校正所获得的分子量及分子量分布与用光散射法所测结果相似，误差较小，精确度提高。
附图说明
图1是本发明的香菇多糖的红外光谱图；
图2是本发明HPGPC检测系统重现性显示图。
具体实施方式
本发明的实施步骤是采用市场上可购得的标准物质Pullulan系列或右旋糖酐(Dextran)系列分别测定相对标准曲线，并计算K、α值。
本发明进一步地采用香菇多糖分级分离产品测定其特性粘数，并用光散射法测定其分级分离品的分子量，建立普适校正曲线，建立以Dextran或Pullulan为标准的通用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定香菇多糖分子量及其分布的方法。
本发明是建立在二十五批香菇多糖(商品名：天地欣，下同)分子量及分子量分布(简称分布，下同)实验研究所得数据的基础上的。参见表2K、α值的数据统计表。
香菇多糖K、α值的测定：
为了测定香菇多糖K、α值，选取五个不同分子量的香菇多糖分级分离样品，用光散射法测定分子量：62.4×104、53.4×104、18.4×104、10.6×104、7.72×104。依据中国药典(2000年版)附录的规定，在0.1mol/L醋酸钠和磷酸盐缓冲液(PH7.8～8.0)、30℃条件下测定特性黏数，应用η＝KMα公式计算K、α值，共测定了25组K、α值(每次新配磷酸盐缓冲液并测定PH值，详细数值见下表)，分别计算K、α的算术平均值和标准偏差，用Grubbs检验法判断数值的取舍。
                   表2  K、α值的数据统计表
  次数     磷酸盐缓冲液PH值     K     α
    1     7.89     0.0540     0.605
    2     7.91     0.0538     0.607
    3     7.93     0.0540     0.606
    4     7.86     0.0538     0.607
    5     7.88     0.0541     0.609
    6     7.90     0.0536     0.604
    7     7.84     0.0535     0.609
    8     7.92     0.0537     0.610
    9     7.87     0.0539     0.609
    10     7.90     0.0537     0.609
    11     7.91     0.0540     0.608
    12     7.89     0.0537     0.609
    13     7.90     0.0536     0.610
    14     7.86     0.0536     0.608
    15     7.94     0.0540     0.608
    16     7.97     0.0542     0.607
    17     7.84     0.0538     0.605
    18     7.92     0.0540     0.605
    19     7.90     0.0538     0.602
    20     7.95     0.0540     0.608
    21     7.81     0.0543     0.608
    22     7.97     0.0538     0.607
    23     7.87     0.0538     0.610
    24     7.95     0.0537     0.606
    25     7.89     0.0540     0.607
 平均值     7.90     0.0539     0.607
 标准差     0.0404     0.000200     0.00201
本发明还采用激光光散射法直接测定6个批号香菇多糖重均分子量进行复核。结果表明两种方法所测的数据近似，误差较小。实施例1  仪器：高效凝胶渗透色谱仪为美国Waters公司工作站系统，510泵，410示差折光检测器，Millennium2010系统软件和GPC专用软件。其他具有上述配件及功能的高效液相色谱仪器亦可。(1)色谱柱  选用凝胶色谱柱时可选用分离范围为2,000,000～1000道尔顿的色谱柱，可采用三根不锈钢柱串联。例如：Ultrahydrogel1000，500和250。(2)流动相  先后以超纯水(电阻为18.2M)，0.1mol/L的醋酸钠和磷酸盐缓冲溶液(PH＝7.8，按照2000年版中国药典附录配制)为流动相，根据样品的溶解度、折光率、出峰时间和峰形等因素，优化选用磷酸盐缓冲溶液PH＝7.8为佳。(3)柱温  先后比较了30℃、35℃、45℃、55℃时的HPGPC图谱，其中以35℃、30℃较好，尤以30℃的图谱更佳。(4)流速  比较了0.2ml/min、0.4ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min时的HPGPC图谱均可，但以0.4ml/min为优。(5)进样量  比较了100μl、200μl、300μl的HPGPC的图谱较好，但以200μl为优。(6)相对标准曲线的绘制  选用标准物质Dextran系列五个，其分子量为17.5×105、74.95×104、41.00×104、27.3×104、4.86×104；或Pullulan系列：74.9×104、38×104、21.2×104、10×104、4.8×104、2.37×104亦可。上述标准物质Dextran其在30口的特性粘数分别为74.8、57.1、48.6、35.5、23.0。根据公式η＝KMα，计算标样Dextran的K、α值。根据Dextran的K、α值绘制相对标准曲线。(7)普适校正曲线的绘制  用5个已知分子量和特性粘数的Dextran标样，配成1mg/ml浓度的溶液，注入高效液相仪，按公式lgη＝lgK+αlgM，计算出K和α值。输入计算机，由GPC软件绘制lg[η]M-V0(淋出体积)的标准曲线，将香菇多糖的K值、α值输入计算机，得到普适校正曲线，香菇多糖的K值及α值由下述(8)叙述。(8)香菇多糖分级分离产品及其分子量的测定  1)香菇多糖分级产品的分离、纯化参见Nature1965 222 687-8页。所得纯化的分级产品用光散射法(由国家技术监督局标准物质研究中心测定)测得五个产品的分子量分别为：62.4×104、53.4×104、18.4×104、10.6×104、7.72×104。上述分级分离产品分别按中国药典2000年版二部附录38页VI G第三法测定其特征粘数。2)香菇多糖K、α值的测定。根据公式η＝KMα，测得香菇多糖在上述流动相体系下的K值为0.0539，α值为0.607。香菇多糖K、α值根据25组实验测定的数据确定的。参见表2。
(9)香菇多糖HPGPC法测定分子量及其分布  香菇多糖供试品5mg加0.5mol/L的氢氧化钠溶液0.5ml溶胀，再用0.5mol/L的盐酸调PH至7.0～8.0，用水定容至5ml摇匀，用0.45μ滤膜过滤即得。吸取上述香菇多糖供试品溶液200μl，注入凝胶色谱仪，流速0.4ml/min，记录色谱图。即得普适校正曲线校正后的香菇多糖分子量及其分布图谱。见表3、4。
  表3  香菇多糖(天地欣)一批分子量累积重量分布曲线分片统计表
              Slice Table showing40 of 3877 slices
#     Cumulative％(％)     Mol Wt(Daltons)   Retention Time(min)
    1     0.061     1707673     33.333
    2     0.449     1496554     34.140
    3     3.015     1311536     34.948
    4     9.061     1149391     35.755
    5     15.813     1007293     36.562
    6     21.926     882762     37.370
    7     27.394     773626     38.178
    8     32.402     677983     38.985
    9     37.043     594164     39.792
    10     41.387     520708     40.600
    11     45.514     456333     41.407
    12     49.470     399917     42.215
    13     53.210     350476     43.022
    14     56.786     307146     43.830
    15     60.219     269174     44.637
    16     63.554     235896     45.445
    17     66.759     206732     46.252
    18     69.813     181174     47.060
    19     72.661     158776     47.867
    20     75.277     139146     48.675
    21     77.721     121944     49.482
    22     79.946     106868     50.290
    23     82.033     93656     51.097
    24     83.981     82077     51.905
    25     85.793     71930     52.712
    26     87.524     63037     53.520
    27     89.191     55244     54.327
    28     90.757     48414     55.135
    29     92.273     42429     55.942
    30     93.713     37183     56.750
    31     94.999     32586     57.557
    32     96.067     28558     58.365
    33     96.971     25027     59.172
    34     97.721     21933     59.980
    35     98.338     19222     60.787
    36     98.839     16845     61.595
    37     99.277     14763     62.402
    38     99.624     12938     63.210
    39     99.875     11338     64.017
    40     100.000     9936     64.825
(10)普适校正曲线的可靠性和准确性评价  见表4。
表4 HPGPC法与激光光散射法测定香菇多糖分子量结果比较表
原料批号   重均分子量(Mw)(单位：万) 相对偏差(％)
  HPGPC法   光散射法
    1     60.0     57.5     2.1
    2     50.2     53.0     2.7
    3     70.4     71.8     1.0
    4     56.6     61.0     3.7
    5     57.7     59.7     1.7
    6     54.9     52.2     2.5
(11)HPGPC检测系统重现性考察为考察HPGPC系统的重现性，将一批注射用香菇多糖(天地欣)重复进样5次，其结果见图2和表5。
表5  某批注射用香菇多糖重复5次的HPGPC图谱参数比较
Figure A0311290800141
(12)数据处理采用Waters公司提供的Millennium2010系统软件和GPC专用软件，以上软件均获美国FDA认可。

Claims (13)

1、一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于：
采用高效凝胶渗透色谱法—HPGPC；
HPGPC的流动相可以是超纯水，0.1～0.5M硝酸钠，0.1～0.5M醋酸钠和磷酸盐缓冲溶液；
HPGPC的分析柱可以选用适合多糖的色谱柱，可以用一～四根，分离范围为2,000,000～1000道尔顿的色谱柱组成；
HPGPC分析柱的柱温可保持在30℃～55℃；
HPGPC的流速可以为0.1ml/min～1.0ml/min；
绘制HPGPC相对标准曲线的标准物质可以是Dextran或者Pullulan；
绘制HPGPC普适校正曲线的标准物质为香菇多糖的分级分离产品。
2、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于采用普适校正的标准曲线来测定香菇多糖的分子量及其分布。
3、根据权利要求2所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于采用碱液溶解香菇多糖。
4、据权利要求3所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于所用碱液可以是氢氧化钠，氢氧化钾，碳酸钠，碳酸氢钠。
5、根据权利要求4所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于所用碱液的浓度可以是0.1～1MNaOH，0.1～1MKOH，0.5～1MNa2CO3，0.1～1MNaHCO3。
6、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于HPGPC的流动相选用0.1mol/L的醋酸钠和磷酸盐缓冲液为好。
7、根据权利要求6所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于所述的醋酸钠和磷酸盐的PH可以是6.0～8.0。
8、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于HPGPC的分析柱优化的组合方式为三根不锈铜柱串联，分离范围为2,000,000～1000道尔顿。
9、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于HPGPC分析柱的优选柱温以30℃为佳。
10、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于HPGPC的流速保持0.4ml/min为佳。
11、根据权利要求1所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于香菇多糖分级分离产品的重均分子量道尔顿分别为：1、62.4×104，2、53.4×104，3、18.4×104，4、10.6×104，5、7.72×104。
12、根据权利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于采用香菇多糖分级分离产品测得香菇多糖K值为0.0535～0.0543，α值为0.6～0.8。
13、根据权利要求11所述的香菇多糖分子量及分子量分布测定方法，其特征在于优化的香菇多糖K值为0.0539，α值为0.607。
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