CN109459523B - 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法 - Google Patents

一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109459523B
CN109459523B CN201710795513.XA CN201710795513A CN109459523B CN 109459523 B CN109459523 B CN 109459523B CN 201710795513 A CN201710795513 A CN 201710795513A CN 109459523 B CN109459523 B CN 109459523B
Authority
CN
China
Prior art keywords
content
molecular weight
soluble salt
average molecular
acidic sugar
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710795513.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109459523A (zh
Inventor
张真庆
曾洋洋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Suzhou University
Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201710795513.XA priority Critical patent/CN109459523B/zh
Application filed by Suzhou University, Shanghai Green Valley Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Suzhou University
Priority to SG11202003165TA priority patent/SG11202003165TA/en
Priority to US16/763,139 priority patent/US11366086B2/en
Priority to CA3085857A priority patent/CA3085857C/en
Priority to EP18854050.4A priority patent/EP3680654B1/en
Priority to PCT/CN2018/104326 priority patent/WO2019047887A1/zh
Priority to KR1020207009976A priority patent/KR102338499B1/ko
Priority to AU2018329025A priority patent/AU2018329025B2/en
Publication of CN109459523A publication Critical patent/CN109459523A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109459523B publication Critical patent/CN109459523B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/71—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited
    • G01N21/73—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light thermally excited using plasma burners or torches
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/74—Optical detectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/884—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample organic compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/78—Detectors specially adapted therefor using more than one detector

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于天然药物化学及其质量控制领域，涉及一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法，包括使用酸性糖可溶性盐中的金属离子含量对分子筛色谱结合多角度激光散射检测器SEC‑MALS测定酸性糖的重均分子量和含量结果进行校正。利用本发明方法可更快速、准确地测定酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量。

Description

一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法
技术领域
本发明属于天然药物化学以及其质量控制领域，具体地涉及酸性糖类物质的重均分子量和含量的测定和质量控制方法。
背景技术
多糖是天然来源的主要的生物活性化合物，可来自植物、真菌等。多糖的分子量大，结构复杂，因此，多糖的分子量的准确测定是一个挑战。
目前，中国药典中，高效液相凝胶渗透色谱法(Gel Permeation Chromatography,GPC)是测定分子量的常规做法，其是按照排阻色谱的原理，不同分子量的多糖按照其大小顺序先后流出色谱柱，通过一系列不同分子量标准多糖与保留时间的相关性测得的校正曲线并计算相应的待测多糖的相对分子量。但该常规方法必须要有相应的多糖标准品而有一定的局限性。
此外，多糖和寡糖含量测定的常用方法为硫酸咔唑法，该方法首先以浓度及单糖标准品的显色做标准曲线，再在标准曲线上读出待测样品的含量。但是酸性糖的单糖甘露糖醛酸并没有标准品出售，若以葡萄糖醛酸为标准品，其与酸性糖的结构及显色效率存在差异，不能对酸性糖进行精确定量。
近年来出现的尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(Size-ExclusionChromatography/Multi-Angle Laser Light Scattering，SEC-MALS)测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量在业界引起了广泛的关注。本领域中有研究人员将MALS和尺寸排阻色谱(SEC)联用，不必依赖泵的流速、校正曲线及其他错误的假设，即可直接求得分子量及分子量分布等数据。MALS利用色谱柱分离出的样品在不同角度的光散射量，由示差折光(RI)检测器得到洗脱液浓度及dn/dc值计算得到质量，综合两者即可计算出各个切片的分子量。该方法不需标准品校准，克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的相对分子量测定的误差。已有研究者采用这一方法测定了壳聚糖、透明质酸的平均分子量(Monica Fee,Neil Errington,Kornelia Jumel,et al.Correlation of SEC/MALLSwith ultracentrifμge and viscometric data for chitosans.Eur Biophys J(2003)32:457～464；Sanya Hokputsa,Kornelia Jumel,Catherine Alexander,etal.Comparison of molecular mass determination of Hyaluronic acid using SEC/MALLS and sedimentation equilibrium.Eur Biophys J(2003)32:450～456)，还有研究者采用该方法对天然中性多糖进行定量，(Kit-Leong Cheong,Ding tao Wu,Jing Zhao,etal.A rapid and accurate method for the quantitative estimation of naturalpolysaccharides and their fractions using high performance size exclusionchromatography coupled with multi-angle laser light scattering and refractiveindex detector.Journal of Chromatography A(2015)1400:98～106)。目前欧洲药典已经采用此方法作为羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布的测定方法(Europeanpharmacopoeia 8.0,p3307-3308,starches hydroxyethyl)。
综上，SEC-MALS可以测定中性多糖重均分子量及含量。
发明内容
但是，本发明的发明人发现，用SEC-MALS方法测定酸性糖类时常常无法准确获得的测定结果。为此，本发明的一个方面提供了一种准确且高效的酸性糖类重均分子量和含量的测定方法，包含以下步骤：
(1)使用SEC-MALS测定酸性糖可溶性盐样品中酸性糖的重均分子量和含量；
(2)测定酸性糖可溶性盐中成盐的金属离子的含量，由此对步骤(1)酸性糖的重均分子量和含量测定结果进行校正，即步骤(1)测得的重均分子量和含量分别除以酸性糖可溶性盐中糖链部分所占的质量分数，进而分别得到酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量。
在本发明的一个实施方案中，酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量应在其SEC-MALS结果的基础上按如下公式1、公式2进行校正：
Figure GDA0001439948500000031
以上公式(1)中：Mw1为SEC-MALS法直接得到酸性糖重均分子量(Da)；A为酸性糖可溶性盐中金属离子的含量；
Figure GDA0001439948500000032
以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；Y为进样的质量(μg)；A为酸性糖可溶性盐中金属离子的含量。
利用本发明提供的测定方法，可以精确测定酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量，成功解决了糖化学领域中酸性糖可溶性盐重均分子量测定偏差大、含量定量不准的问题。
附图说明
图1所示为溶剂(A)和甘露寡糖二酸钠盐(B)的SEC-ICP-MS谱图和甘露寡糖二酸钠盐的SEC-MALS示差谱图(C)。
图2所示为氢型肝素(Heparin H，2A)肝素钠(Heparin sodium，2B)、依诺肝素钠(Enoxaparin solium，2C)和那屈肝素钙(Nadroparin calcium，2D)的示差图(RI，虚线)、Na离子SEC-ICP-MS图(Na，实线)和Ca离子SEC-ICP-MS图(Ca，实线)。
图3所示为甘露寡糖二酸五糖钠的总离子流图(A)、质谱图(B)和甘露寡糖二酸五糖H型理论质量数列表(C)。
具体实施方式
定义
除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练技术人员所熟知的熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
如本文所用，术语“dn/dc”指折光指数增量，可使用本领域常用的方法进行测定(刘莉莉等.医用透明质酸钠凝胶的绝对分子量及其分布的测定方法[J]药物分析杂志2013，33(8)，1435-1438)；也可从本领域公开的相关技术文献中查询获得。
如本文所用，术语“SEC-MALS”指尺寸排阻色谱联用多角度激光散射(Size-Exclusion Chromatography/Multi-Angle Laser Light Scattering)，近年来被广泛应用于测定样品绝对重均分子量、分子量分布和含量，具体测定方法可采用本领域公知的方法(Monica Fee,Neil Errington,Kornelia Jumel,et al.Correlation of SEC/MALLS withultracentrifuge and viscometric data for chitosans.Eur Biophys J(2003)32:457～464；Sanya Hokputsa,Kornelia Jumel,Catherine Alexander,et al.Comparison ofmolecular mass determination of Hyaluronic acid using SEC/MALLS andsedimentation equilibrium.Eur Biophys J(2003)32:450～456；Kit-Leong Cheong,Ding tao Wu,Jing Zhao,et al.A rapid and accurate method for the quantitativeestimation of natural polysaccharides and their fractions using highperformance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laserlight scattering and refractive index detector.Journal of Chromatography A(2015)1400:98～106)。
如本文所用，术语“ICP-MS”指电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupledplasma mass spectrometry)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点，具体测定方法可采用本领域公知的方法，例如冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)最新应用进展.中国无机化学分析.(2011)1:46～52所记载的方法。
如本文所用，术语“ICP-OES”指电感耦合等离子体发射光谱法(InductivelyCoupled Plasma Optical Emission Spectrometer)，是本领域用于测定金属离子含量的常用方法，具体测定方法可采用本领域公知的方法。
技术问题的发现
本申请的发明人发现，现有技术SEC-MALS在测定甘露寡糖二酸类样品时，计算得到纯度不合理，且样品后有未知峰，且MALS在此含量基础上得到的重均分子量存在偏差。另外，不仅是甘露寡糖二酸类，还发现在其他多种糖中也存在这个问题，例如聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、藻酸双酯钠、聚甘露糖醛酸硫酸酯、聚古罗糖醛酸硫酸酯、肝素等。申请人发现，这些糖均为含有酸性基团的糖，也即在糖结构中包含羧基、硫酸酯基、磷酸酯基等阴离子。本申请中将这样的糖称为酸性糖。
针对上述现象，通常认为是样品在柱子上发生吸附造成含量降低，但是发明人发现，这种情况在使用柱子多次分离后也未得到解决。为探索该问题，发明人对SEC-MALS测定酸性糖时的未知峰进行解析，结果发现该未知峰对于得到酸性糖可溶盐准确重均分子量和含量至关重要，从而获得一种高效、简单、稳定的检测酸性糖的重均分子量、含量的方法。
本发明的发明人发现，未知峰归属于酸性糖结构中的金属离子，因此，在将酸性糖转化成钠盐之后，通过测定方法调节由于钠盐所带来的分子量改变，由此调整所获得的糖的重均分子量，获得更加准确的测定值。
酸性糖
在本发明的一些实施方案中，所述的酸性糖可溶性盐选自结构中具有羧基、硫酸酯基或磷酸酯基一种或一种以上结构特征的。
在本发明的一些实施方案中，所述酸性糖可溶性盐选自具有以下糖链结构的：甘露寡糖二酸、聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、藻酸双酯钠、聚甘露糖醛酸硫酸酯、聚古罗糖醛酸硫酸酯、肝素、低分子量肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、PI88、或岩藻糖硫酸酯、卡拉胶、右旋糖酐硫酸酯。但可适用本发明方法的酸性糖包括但不限于上述的种类。
在本发明的一些实施方案中，所述酸性糖可溶性盐包括但不限于具有以下糖链结构的糖：甘露寡糖二酸、肝素或低分子量肝素。
金属离子含量的测定
在本发明的实施方案中，所述酸性糖可溶性盐中金属离子含量的测定方法选自：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法。优选ICP-MS、离子色谱法，更优选离子色谱法。这些测定方法如前文所描述。
电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)是当代元素组成测定技术中的重大发展，具有高灵敏度，干扰少、超痕量检测限、多元素同时分析等诸多优点(冯先进，屈太原.电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)最新应用进展.中国,无机化学分析.(2011)1:46～52)。发明人首次尝试将SEC与ICP-MS联用，成功确认了SEC-MALS测定酸性糖可溶性盐样品峰后的未知峰为金属离子，同时能够获得金属离子的种类及含量的相关数据。
在此基础上，通过测定离子的种类及其含量来以期对SEC-MALS法测定的重均分子量和含量进行校正：通过将测得的重均分子量和含量分别除以酸性糖可溶性盐中糖链部分所占的质量分数，进而分别得到酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量。
SEC-MALS方法测定分子量和含量
在本发明中，SEC-MALS方法用于测定酸性糖类的分子量和含量。在采用SEC-MALS方法进行解析时，酸性糖类的可溶性盐样品进入SEC柱分析时发生解离(可参见实施例1)，由此可知，SEC-MALS方法得到的是解离后不含金属离子的酸性糖的重均分子量和含量，因此酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量还应考虑金属离子含量的影响，目前的SEC-MALS方法中，还没有关于这方面的报道。
在本发明采用的SEC-MALS方法中，可以使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.1-0.5mL/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH4Ac、NaAc、NaCl、NaNO3或Na2SO4，盐溶液的浓度为0.02-0.5mol/L。
在本发明的另一优选实施方案中，SEC-MALS测定采用20％甲醇+80％80mmol/LNH4Ac作为流动相；其流速为0.1mL/min。
在本发明的另一优选实施方案中，所述的测定方法还包括测定酸性糖类的折光指数增量(dn/dc)的步骤。
在本发明的另一优选实施方案中，所述的酸性糖类的折光指数增量(dn/dc)的测定包含以下步骤：
(1)使用与SEC-MALS测定相同的流动相溶解酸性糖类样品，并将样品稀释，得到0.1mg/ml-2mg/ml浓度区间内的5-6个浓度点的系列溶液；
(2)用示差折光检测器(例如Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次进样流动相、步骤2中制备的样品溶液，并采集信号；
(3)由Astra软件计算得到dn/dc。
在本发明的一个实施方案中，酸性糖类物质的重均分子量和含量应按如下方法进行测定：
步骤1：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法测定酸性糖类中金属离子的重量百分含量A。
步骤2：测定酸性糖类的dn/dc：
(1)称定恒重的样品，加入流动相溶解，配置成0.1-5mg/ml，优选0.2-2mg/ml的系列溶液，该系列溶液的浓度可以是例如0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml；使用醇+盐的溶液作为流动相；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH4Ac、NaAc、NaCl、NaNO3或Na2SO4，盐溶液的浓度为0.02-0.5mol/L。
(2)用示差折光检测器(例如Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次进样流动相、步骤(1)配制的系列溶液，并采集信号，
(3)由Astra软件计算得到dn/dc。
步骤3：SEC-MALS测定酸性糖类分子量和含量
(1)根据预估待测酸性糖分子量的范围，选择适合的色谱柱；
(2)配制待测酸性糖样品的梯度溶液，其浓度范围为2-500mg/ml，分3-10个梯度；例如约为2、10、50、100、300mg/ml(浓度＝重量/体积)的溶液。
(3)使用醇+盐的溶液作为流动相；其流速可能为0.1-0.5mL/min；其中，所述流动相中醇的含量为0-20％。所述醇可为甲醇、乙醇、丙醇、环己醇或其混合物，所述盐选自NH4Ac、NaAc、NaCl、NaNO3或Na2SO4，盐溶液的浓度为0.02-0.5mol/L，检测器采用十八角激光检测器和示差折光检测器；
(4)使用SEC-MALS法直接得到的酸性糖类重均分子量Mw1；
(5)使用图谱处理软件计算得到的样品中酸性糖类的质量X；
(6)使用以下公式进行计算，分别得到酸性糖类的重均分子量和含量：
Figure GDA0001439948500000101
以上公式(1)中：Mw1为SEC-MALS法直接得到酸性糖类的重均分子量(Da)；A为酸性糖类中金属离子的含量；
Figure GDA0001439948500000102
以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量；Y为进样的质量；A为酸性糖类中金属离子的含量。
SEC-MALS法测定重均分子量和含量的具体操作条件可以根据常规的实验方案进行。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
(1)对酸性糖可溶性盐样品SEC-MALS分析中的未知峰进行解释。
(2)可以精确测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量，重复性好。
(3)重均分子量和含量可在一次分析中得到，操作简单。
(4)提高了测量酸性糖可溶性盐的准确性，有助于更准确地研究多糖的分子结构。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例部分所使用的仪器包括：
LC：Agilent 1260液相色谱仪
18角度激光检测器：Wyatt DAWN HELEOS II
示差折光检测器：Wyatt Optilab T-rEX
ICP-MS：Agilent 7900ICP-MS
离子色谱：瑞士万通
ICP-OES：美国Perkin-Elmer公司Optima7000DV电感耦合等离子发射光谱仪
火焰原子吸收：北京瑞利WFX-120B型火焰原子吸收光谱仪
实施例1 SEC与ICP-MS揭示酸性糖在尺寸排阻色谱的分离机理
(1)测试的样品为甘露寡糖二酸钠盐，将样品溶于水中，浓度2mg/ml，进样0.1ul。通过SEC色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125
Figure GDA0001439948500000111
SEC 1.7um 4.6×300mm柱(购自Waters)，流动相为20mmol/L NH4Ac，流速0.1mL/min；将SEC与ICP-MS联用，采集23Na的信号。同时，使用溶剂水作为对照。
(2)将SEC与MALS联用，样品甘露寡糖二酸钠盐溶于流动相中，浓度10mg/ml，进样20ul。
附图1示出了溶剂水(图1A)和甘露寡糖二酸钠盐(图1B)的SEC-ICP-MS谱图，以及甘露寡糖二酸钠盐的SEC-MALS示差谱图(图1C)。结果显示，在SEC-ICP-MS谱图中，相比于阴性对照，甘露寡糖二酸钠盐在a处有明显Na盐峰，比较图1B和图1C可知，甘露寡糖二酸钠盐在SEC-ICP-MS谱图a处的Na盐峰与示差谱图b处的峰出峰位置一致，说明示差谱图b处的未知峰为钠盐峰，这意味着甘露寡糖二酸进入SEC柱分析时发生解离，SEC-MALS方法得到是解离后不含金属离子的甘露寡糖二酸的重均分子量和含量，提示为了准确计算出酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量，采用SEC-MALS方法时，必须考虑酸性糖可溶性盐中的金属离子进行校正，具体计算见公式1、公式2。
Figure GDA0001439948500000121
以上公式(1)中：Mw1为SEC-MALS法直接得到酸性糖重均分子量(Da)；A为金属离子的含量。
Figure GDA0001439948500000122
以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量(μg)；Y为进样的质量(μg)；A为金属离子的含量。
实施例2 SEC-MALS用于测定肝素、低分子量肝素的重均分子量和含量
样品：肝素钠(Heparin sodium)、依诺肝素钠(Enoxaparin solium)、那屈肝素钙(Nadroparin calcium)和氢型肝素(Heparin H)，将样品配制成溶液。
步骤1：SEC-ICP-MS测定金属离子的含量
(1)使用色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH200
Figure GDA0001439948500000123
SEC 1.7um4.6×150mm柱，80mmol/L NH4Ac为流动相，流速0.1mL/min。
(2)将SEC与ICP-MS联用：将样品溶于水中，浓度0.02mg/ml，进样20ul，采集23Na,43Ca,44Ca的信号。将信号与分别配置的浓度为0.1ppm,0.5ppm,1.0ppm,5.0ppm和10.0ppm的Na和Ca离子标准溶液，并以外标法计算样品中金属离子的重量含量(A值)。
步骤2：测定dn/dc
(1)称定恒重的样品20mg至10ml容量瓶中，加入步骤3中的流动相溶解，振摇，即得母液。分别取母液0.2、0.4、0.8、1.2、1.8ml，用流动相稀释至2ml，得0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml的一系列溶液。
(2)用示差折光检测器(Wyatt，Optilab T-rEX(WTREX-08)分别依次手动进样所述流动相、所述0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml样品溶液，并采集信号，dn/dc由Astra软件计算得到，如下表所示。
样品 dn/dc(mL/g)
肝素钠 0.1311
依诺肝素钠 0.1341
那屈肝素钙 0.1382
肝素H 0.1310
步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量
(1)使用色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH200
Figure GDA0001439948500000132
SEC 1.7um4.6×150mm柱，80mmol/L NaCl为流动相，流速0.1mL/min。
(2)将SEC与MALS联用，样品溶于流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul，即公式中Y值为200ug。
实施例2结果见表1和图2。
表1：肝素和低分子量肝素金属离子含量及校正前后的重均分子量和含量
Figure GDA0001439948500000131
Y值为200ug；
*：采用实施例1中的公式校正；
a为Na％；b为Ca％。
实施例2的结果见图2和表1。比较2A和2B(氢型肝素和肝素钠)，发现两者示差图一致，但在示差的倒峰处(因流动性和样品溶剂的影响，在盐峰位置示差图可呈现正峰、倒峰)，氢型肝素无Na信号，而肝素钠有Na信号、且2C和2D(依诺肝素钠和那屈肝素钙)也均有Na或Ca信号，说明氢型肝素不含Na，而肝素钠、依诺肝素钠和那屈肝素钙这三种酸性糖金属盐在SEC柱上发生解离，金属离子延后出峰。从表1可知，肝素钠和肝素H的Mw1相近，说明SEC-MALS法直接测得为糖部分的重均分子量；通过ICP测定金属离子含量得到A值后，采用实施例1中的公式校正，发现二者的差异明显增加；肝素H的X/Y％接近100％，而肝素钠校正后含量近于100％，表明SEC-MALS法直接测得为糖部分的含量；同法计算依诺肝素钠和那屈肝素钙的重均分子量和含量。综上，经过校正后，SEC-MALS可以准确计算出肝素盐和低分子量肝素盐的重均分子量和含量。
实施例3 SEC-MALS方法和质谱方法互证
样品：甘露寡糖二酸五糖(Na型)
(1)色谱柱Waters ACQUITY UPLC@BEH125
Figure GDA0001439948500000141
SEC 1.7um4.6×300mm柱，20％甲醇+80％80mmol/L NH4Ac为流动相，流速0.1mL/min。
(2)将SEC与MALS联用，样品溶于流动相中，浓度10mg/ml，进样20ul。
(3)将SEC与质谱联用，样品溶于水中，浓度10mg/ml，进样10ul。
(4)离子色谱测定酸性糖中金属离子的含量。
Na离子标准溶液配置为25、10、12.5、6.25、3.125ppm。样品浓度为2mg/ml。离子色谱条件：预柱：Metrosep C4Guard/4.0；分离柱：Metrosep C5-150/4.0；流动相：5mM硝酸的超纯水溶液；流速：0.9ml/min；进样量20ul。以外标法进行金属离子含量的测定。
按实施例1进行甘露寡糖二酸五糖(Na型)金属离子含量(A)的测定。
实施例3的结果见图3和表2。
图3中，质谱图B为总离子流图中出峰位置a段的累积质谱图，从图B和表C可知，质谱测得的甘露寡糖二酸五糖的质量数同理论质量数一致，即甘露寡糖二酸五糖(H型)分子量为854-914Da。
表2甘露寡糖二酸五糖(Na型)的SEC-MALS结果
Figure GDA0001439948500000151
Y为200ug，*：指采用实施例1中的公式校正
由表2甘露寡糖二酸五糖钠的SEC-MALS结果可知，SEC-MALS测定的重均分子量为908Da；液质联用结果详见图3(A为甘露寡糖二酸五糖钠总离子流图、B为质谱图、C为理论质量数列表)，质谱结果显示，分子量为854-914Da，经过归属发现其为甘露寡糖二酸五糖H型的分子量，与SEC-MALS测定的结果一致，进一步说明SEC-MALS的计算结果是不含金属离子的氢型甘露寡糖二酸五糖的重均分子量和含量，与实施例1的结论一致。经校正，甘露寡糖二酸五糖(Na型)的重均分子量为1035Da，含量为97.7％。
实施例4 SEC-MALS用于测定PI88的重均分子量和含量
PI88为一种含有磷酸根和硫酸根的酸性糖。其制备方法可参见Guangli Yu,NurSibel Gunay,Robert J.Linhardt,et al.Preparation and anticoagulant activity ofthe phosphosulfomannan PI-88[J].European Journal of Medicinal Chemistry 37(2002)783-791。
步骤1：ICP-OES测定金属离子含量：
采集Na 589nm的分析谱线，配制1mg/L、5mg/L、10mg/L的Na标准溶液；样品溶液浓度配制为20mg/L。采用ICP-OES测定金属离子含量。
步骤2：测定PI88的dn/dc
方法同实施例2步骤2。
步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量
方法同实施例2步骤3。
实施例4的结果见表3。
表3：PI88金属离子含量、dn/dc及校正前后的重均分子量和含量
Figure GDA0001439948500000161
Y为200ug，*:采用实施例1中的公式校正
从表3可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出含有磷酸根和硫酸根的寡糖PI88的重均分子量和含量：重均分子量为2450Da，含量为97.8％。
实施例5SEC-MALS用于测定硫酸软骨素钠的重均分子量和含量
步骤1：火焰原子吸收法测定金属离子含量：
采集Na 330.2nm的谱线，配制1mg/L、10mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L的Na标准溶液；外标法计算样品中金属离子的浓度(即A值)，样品溶液浓度配制为200mg/L。
步骤2：SEC-MALS测定重均分子量和含量
(1)色谱柱TSK G3000PWXL 7.8×300mm柱，0.3mol/L Na2SO4为流动相，流速0.5mL/min，柱温35℃。
(2)将SEC与MALS联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量25ul。
实施例5的结果见表4。
表4硫酸软骨素钠金属离子含量、dn/dc及校正前后的重均分子量和含量
Figure GDA0001439948500000171
Y为200ug，*:采用实施例1中的公式校正
表4中dn/dc来自于文献(宋玉娟,任丽萍,范慧红。硫酸软骨素钠分子质量及其分布的测定[J].中国新药杂志，2011年，20(18)，1795-1797)报道，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出含有硫酸根和羧酸根的多糖硫酸软骨素钠的重均分子量和含量：重均分子量为18.7kDa，含量为99.7％。
实施例6 SEC-MALS用于测定几种多糖可溶性盐的重均分子量和含量
聚甘露糖醛酸钠和聚古罗糖醛酸钠含有羧基；聚甘露糖醛酸硫酸酯钠盐、聚古罗糖醛酸硫酸酯钠盐和藻酸双酯钠含有羧基和硫酸酯基；硫酸角质素和岩藻聚糖硫酸酯含有硫酸酯基。
步骤1：ICP-MS测定金属离子的含量
经文献查证，以上样品中的多糖均为Na盐，故采集23Na的信号。样品溶于水中，浓度0.02mg/ml；配制Na标准溶液，浓度为0.1ppm,0.5ppm,1.0ppm,5.0ppm and 10.0ppm。
步骤2：测定dn/dc
方法同实施例2步骤2。
步骤3：SEC-MALS测定重均分子量和含量
(1)色谱柱：具体见表5。
(2)将SEC与MALS联用，样品溶液流动相中，浓度为10mg/ml，进样量20ul。
实施例6的结果见表5。
表5：几种多糖的金属离子含量、dn/dc、所用柱子、校正前后的重均分子量和含量
Figure GDA0001439948500000181
Figure GDA0001439948500000191
Y为200ug，*:采用实施例1中的公式校正
从表5可以看出，经过校正，SEC-MALS可以准确计算出酸性多糖可溶性盐的重均分子量，且含量在96-101％之间。

Claims (4)

1.一种酸性糖可溶性盐的重均分子量和含量的测定方法，其特征在于，所述测定方法包含以下步骤：
(1)使用尺寸排除色谱联用多角度激光散射测定酸性糖可溶性盐样品中酸性糖的重均分子量和含量；
(2)测定酸性糖可溶性盐中成盐的金属离子的重量百分含量A，由此对步骤(1)酸性糖的重均分子量和含量测定结果进行校正，所述校正按公式1、公式2计算：
Figure FDA0003744466120000011
以上公式(1)中：Mw1为尺寸排除色谱联用多角度激光散射法直接得到酸性糖重均分子量(Da)；A为酸性糖可溶性盐中金属离子的含量；
Figure FDA0003744466120000012
以上公式(2)中：X为图谱处理软件计算得到的质量；Y为进样的质量；A为酸性糖可溶性盐中金属离子的含量，
其中所述酸性糖可溶性盐的糖链结构包括甘露寡糖二酸、聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、聚甘露糖醛酸硫酸酯、聚古罗糖醛酸硫酸酯、肝素、低分子量肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸、PI88、岩藻聚糖硫酸酯、卡拉胶、右旋糖酐硫酸酯；或者所述酸性糖可溶性盐为藻酸双酯钠。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述酸性糖可溶性盐中金属离子含量的测定方法选自：ICP-MS、ICP-OES、原子吸收或离子色谱法。
3.如权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述的酸性糖可溶性盐具有羧基、硫酸酯基或磷酸酯基中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述酸性糖可溶性盐的糖链结构选自：甘露寡糖二酸、肝素或低分子量肝素。
CN201710795513.XA 2017-09-06 2017-09-06 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法 Active CN109459523B (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710795513.XA CN109459523B (zh) 2017-09-06 2017-09-06 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法
US16/763,139 US11366086B2 (en) 2017-09-06 2018-09-06 Method for determining weight-average molecular weight and content of soluble salt of acidic carbohydrates
CA3085857A CA3085857C (en) 2017-09-06 2018-09-06 A method for determining the weight average molecular weight and the content of soluble salts of acidic saccharides
EP18854050.4A EP3680654B1 (en) 2017-09-06 2018-09-06 Method for determining weight-average molecular weight and content of soluble salt of acidic sugar
SG11202003165TA SG11202003165TA (en) 2017-09-06 2018-09-06 A method for determining the weight average molecular weight and the content of soluble salts of acidic saccharides
PCT/CN2018/104326 WO2019047887A1 (zh) 2017-09-06 2018-09-06 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法
KR1020207009976A KR102338499B1 (ko) 2017-09-06 2018-09-06 중량평균 분자량 및 산성 당의 가용성 염의 함량 측정방법
AU2018329025A AU2018329025B2 (en) 2017-09-06 2018-09-06 Method for determining weight-average molecular weight and content of soluble salt of acidic sugar

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710795513.XA CN109459523B (zh) 2017-09-06 2017-09-06 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109459523A CN109459523A (zh) 2019-03-12
CN109459523B true CN109459523B (zh) 2022-11-08

Family

ID=65605934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710795513.XA Active CN109459523B (zh) 2017-09-06 2017-09-06 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11366086B2 (zh)
EP (1) EP3680654B1 (zh)
KR (1) KR102338499B1 (zh)
CN (1) CN109459523B (zh)
AU (1) AU2018329025B2 (zh)
CA (1) CA3085857C (zh)
SG (1) SG11202003165TA (zh)
WO (1) WO2019047887A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114324722A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 辰欣药业股份有限公司 一种离子色谱法测定依诺肝素钠游离硫酸盐的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0200507D0 (sv) * 2002-02-21 2002-02-21 Biovitrum Ab Chromatographic method
CN1245623C (zh) 2003-03-04 2006-03-15 南京康海药业有限公司 香菇多糖分子量及分子量分布测定方法
GB0413868D0 (en) * 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
CN101059483B (zh) * 2007-05-25 2010-11-24 南京生命能科技开发有限公司 糖-氢氧化铁复合物分子量及分子量分布测定方法
FR2969618B1 (fr) * 2010-12-28 2014-05-16 Pf Medicament Procede de preparation de chondroitine sulfate de sodium
EP2885642B1 (en) * 2012-08-14 2019-05-15 Baxalta GmbH Methods and systems for screening compositions comprising non-anticoagulant sulfated polysaccharides
CN103063754B (zh) * 2012-11-16 2014-05-14 烟台安德利果胶股份有限公司 一种低聚合度果胶分子量的测定方法
CN103018364A (zh) * 2012-12-10 2013-04-03 山东大学 用于测定肝素及其盐相对分子量及分子量分布的对照品
EP3019861A4 (en) * 2013-07-11 2017-02-22 Scinopharm Taiwan, Ltd. Analytical method for detecting sulfated oligosaccharides
CN103954716A (zh) * 2014-04-24 2014-07-30 上海慈瑞医药科技有限公司 一种香菇多糖分子量及分子量分布测定方法
FR3044314B1 (fr) * 2015-12-01 2017-11-10 Michelin & Cie Composition de caoutchouc a base de caoutchouc naturel ayant une distribution de masse moleculaire, vue en sec-mals, bimodale, procede de preparation et composant de pneumatique
CN106290614A (zh) * 2016-07-27 2017-01-04 浙江景嘉医疗科技有限公司 一种医用透明质酸钠凝胶分子量和分子量分布系数的检测方法
CN106940348A (zh) * 2016-12-20 2017-07-11 南京艾德凯腾生物医药有限责任公司 一种测定羧基麦芽糖铁分子量及其分布的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018329025B2 (en) 2022-02-24
KR102338499B1 (ko) 2021-12-14
CN109459523A (zh) 2019-03-12
SG11202003165TA (en) 2020-05-28
US20210010984A1 (en) 2021-01-14
CA3085857C (en) 2021-10-19
KR20200097239A (ko) 2020-08-18
WO2019047887A1 (zh) 2019-03-14
EP3680654B1 (en) 2022-07-27
EP3680654A1 (en) 2020-07-15
EP3680654A4 (en) 2021-06-16
AU2018329025A1 (en) 2020-04-23
CA3085857A1 (en) 2019-03-14
US11366086B2 (en) 2022-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Holzgrabe et al. Quantitative NMR spectroscopy—applications in drug analysis
KR20160030963A (ko) 황산화 올리고당을 검출하기 위한 분석 방법
CN109459523B (zh) 一种测定酸性糖可溶性盐重均分子量和含量的方法
Ouyang et al. Qualitative and quantitative analysis of heparin and low molecular weight heparins using size exclusion chromatography with multiple angle laser scattering/refractive index and inductively coupled plasma/mass spectrometry detectors
CN103604879B (zh) 云芝及含有云芝的制剂的检测方法
CN109459503B (zh) 一种测定肝素类药物重均分子量和含量的方法
CN109459505B (zh) 一种测定甘露糖醛酸类物质重均分子量和含量的方法
CN109374779A (zh) 一种蔗糖含量的快速检测方法
CN113341028A (zh) 一种体积排阻色谱法测定玻璃酸钠分子量与分子量分布的方法
CN109459504B (zh) 一种测定聚古罗糖醛酸硫酸酯盐重均分子量和含量的方法
Sommers et al. Heparin and homogeneous model heparin oligosaccharides form distinct complexes with protamine: light scattering and zeta potential analysis
CN112005110B (zh) 一种达肝素钠亚硝酸降解产物的分析方法及其应用
CN101620210B (zh) 一种快速测定多糖硫酸酯中硫含量的方法
CN110274972A (zh) 一种串联凝胶色谱法测定金钗石斛多糖分子量分布的方法
CN107219317B (zh) 一种快速测定聚乙二醇衍生物的分子量及其分布和杂质含量的方法
CN106442799B (zh) 一种低分子肝素分子量及分子量分布检测方法
de Freitas et al. Characterization of stability, aggregation, and equilibrium properties of modified natural products; The case of carboxymethylated chitosans
CN114853824A (zh) 一种石斛寡糖的制备方法
Maksimova et al. Gold Determination by Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry After Preconcentration Using Natural Deep Eutectic Solvent Based on Menthol and Camphor
CN102243215A (zh) 一种水溶性葡甘露聚糖的检测方法
Mashru et al. Development and validation of spectrophotometric method for simultaneous estimation of brinzolamide and brimonidine tartrate
CN113075320B (zh) 一种阿奇霉素颗粒杂质的检测方法及一致性评价方法
WO2022206806A1 (zh) 一种采用lc-ms/ms检测adc中dtpa含量的方法
Yokubbayev et al. INVESTIGATION OF ELECTROSTATIC EFFECTS IN SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY OF POLYSACCHARIDES
CN114487153A (zh) 一种人参多糖分子量的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant