CN109682893A - 香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

一种香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法，包括：采用高效液相色谱法对香菇多糖组合物样品供试溶液进行洗脱，然后进行香菇多糖含量的测定。该方法能够有效排除右旋糖酐等辅料对香菇多糖含量测定的影响，提高了含量测定的精确性，适用于各种香菇多糖制剂的含量测定。

Description

香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法

技术领域

本发明涉及香菇多糖组合物中香菇多糖的含量测定方法，特别涉及含有对定量测定有干扰的辅料的香菇多糖制剂的含量测定。

背景技术

香菇多糖(Lentinan)是从香菇中提取的具有生物活性的多糖，其一级结构是以β-(1→3)-连接的葡萄糖为主链，在部分葡萄糖基的6位取代有单个β-D-葡萄糖基侧链的葡聚糖。香菇多糖是一种免疫调节剂，用于恶性肿瘤的辅助治疗。香菇多糖对多种肿瘤有抑制作用，特别是消化道类的肿瘤。香菇多糖最早于1965年由日本的千原吴郎报道其具有抗肿瘤活性，1985年日本首先批准注射用香菇多糖作为抗肿瘤新药上市。

目前已上市的香菇多糖制剂主要为注射剂，特别是冻干粉针剂。多糖的含量测定方法常用蒽酮-硫酸分光光度法和滴定法，注射用香菇多糖国家标准采用滴定法测定其中香菇多糖的含量。

蒽酮-硫酸分光光度法的原理是多糖类遇浓硫酸水解并脱水生成糠醛或其衍生物，再与蒽酮试剂缩合产生呈色物质，反应后溶液呈蓝绿色或青绿色，在625nm处有最大吸收，吸光度与多糖含量呈线性关系。滴定法是基于将香菇多糖溶解后用滴定法测定还原糖的含量。

香菇多糖制剂中大多采用右旋糖酐等作为辅料，而且辅料的用量通常为主药的数倍乃至数十倍。右旋糖酐也是属于多糖类，会干扰蒽酮硫酸法的结果。而且，含有右旋糖酐等糖类辅料的制剂也不适合采用滴定法测定，因为右旋糖酐与香菇多糖一样会水解为单糖，滴定法并不能区分单糖是来自于香菇多糖还是右旋糖酐。

王国佳等(《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》，2012年第10期，第E057-591页)进行了香菇多糖注射制剂质量标准的系统化研究，采用蒽酮比色法测定香菇多糖注射液和注射用香菇多糖的含量，以及使用HPLC-RID法测定香菇多糖注射制剂中香菇多糖的含量，所用色谱柱为TSKgelG5000PWxl、G4000PWxl、G3000PWxl凝胶柱。

Chen等(《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》，2013年，第78-79卷第9期，第176-182页)使用HPSEC-RID-MALSD法测定香菇多糖注射制剂的含量，所用的色谱柱为TSKgelG6000PWxl和G4000PWxl凝胶柱。

研究发现，现有的方法均无法准确测定制剂中香菇多糖的含量，无法满足药品质量可控性要求，严重影响药品质量控制及安全性。因此，亟需开发一种能够准确、有效地测定香菇多糖制剂中香菇多糖的含量的方法。

发明内容

除右旋糖酐以外，香菇多糖制剂中还常用甘露醇、山梨醇等辅料。发明人经研究发现，在现有的上述测定方法中，山梨醇以及甘露醇辅料在测定中呈不同程度的显色，会抑制香菇多糖的显色，会严重干扰香菇多糖含量的测定。

发明人采用王国佳、Chen等披露的方法对香菇多糖制剂中香菇多糖的含量进行测定，仍无法获得准确的测量结果。

香菇多糖的平均分子量范围在30-70万之间，分子量在2-100万均有分布，与右旋糖酐等辅料分子量相互重叠。用于糖类分析的色谱柱包括：用于分析单、寡糖分析的氨基柱，阴离子交换柱和基于分子量大小的分子排阻色谱柱等。发明人研究发现，现有的方法无法使香菇多糖与右旋糖酐等辅料实现基线分离。因此，现有的方法无法准确地对注射用香菇多糖中的香菇多糖的含量进行测定。发明人尝试优化流动相，仍未能获得令人满意的测定结果。

发明人经反复研究发现，采用填料为一定孔径的、表面键合亲水薄膜的硅胶色谱柱进行层析时，香菇多糖与右旋糖酐等辅料可实现基线分离，能够准确、有效地对香菇多糖制剂中香菇多糖含量进行测定，从而完成了本发明。

鉴于此，本发明提供一种香菇多糖制剂中香菇多糖含量的测定方法。

本发明提供一种香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法，其特征在于，包括：

(1)采用高效液相色谱法将供试溶液进行洗脱；

(2)进行香菇多糖含量的测定；

其中，所述高效液相色谱的固定相包括：平均孔径为(优选平均孔径为或特别优选)的表面键合了亲水薄膜的硅胶固定相、以及聚甲基丙烯酸树脂交联羟基醚树脂的固定相；

可选地，所述固定相同时包括孔径为和的、表面键合了亲水薄膜的硅胶固定相；

可选地，所述高效液相色谱采用1-6根(优选为1-3根)色谱柱串联的色谱柱。

优选地，上述方法中步骤(1)中色谱柱采用SRT-SEC-500，优选色谱柱内径为4.6-22.1mm，更优选为21.2mm；优选色谱柱长度为150-600mm，更优选为300mm；优选色谱柱的粒径为5-13μm，更优选为5μm。

可选地，步骤(2)中采用蒽酮硫酸法、滴定法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法进行香菇多糖含量的测定。

可选地，所述香菇多糖组合物中含有选自右旋糖酐、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。

可选地，所述香菇多糖组合物的剂型为胶囊、颗粒、散剂、片剂、滴丸、乳剂、膏剂、香菇多糖冻干粉针剂或香菇多糖注射液。

可选地，所述高效液相色谱的流动相选自乙酸盐水溶液、磷酸盐水溶液或碱性水溶液；优选地，所述乙酸盐为乙酸钠；所述碱性水溶液为氢氧化钠水溶液；优选地，所述乙酸盐水溶液或磷酸盐水溶液的浓度为0.001mol/L至0.2mol/L；更优选为0.002mol/L；更优选流动相为0.002mol/L的乙酸钠水溶液；优选地，所述碱性水溶液的pH值为8.0-12.0，优选流动相为pH值为10.0的氢氧化钠水溶液。

可选地，所述高效液相色谱法流动相的流速为0.1-20mL/min，优选为0.2-15mL/min，更优选为0.5-10mL/min。

可选地，将供试溶液进行均质化处理后，再进行高效液相色谱法洗脱。

可选地，所述均质化处理步骤包括先用高速匀浆机处理，再用高压均质机处理。

可选地，所述高效液相色谱法采用示差折光检测器或蒸发光散射检测器；优选采用示差折光检测器。

可选地，所述含量测定方法包括以下步骤：

(1)取香菇多糖对照品，干燥称量，加水制成浓度为0.1-2.5mg/mL(优选为0.1-0.5mg/mL，更优选为0.5mg/mL)的对照品供试溶液；优选将对照品供试溶液进行均质化处理；

(2)取香菇多糖组合物，加水溶解制成浓度为0.1-1.0mg/mL(优选为0.1-0.5mg/mL，更优选为0.5mg/mL)的样品供试溶液；优选将样品供试溶液进行均质化处理；

(3)将所述对照品供试溶液和样品供试溶液分别采用微孔滤膜滤过，优选所述微孔滤膜的孔径为0.3μm、0.45μm、0.5μm或0.75μm，更优选为0.45μm；然后注入高效液相色谱仪进行对照品供试溶液和样品供试溶液洗脱，收集对照品待测液和样品待测液；

(4)采用蒽酮硫酸法、滴定法、苯酚-硫酸法或3,5-二硝基水杨酸法测定对照品待测液和样品待测液中香菇多糖的含量。

更具体地，香菇多糖组合物的含量测定方法包括以下步骤：

(1)对照品供试溶液的制备：取香菇多糖对照品100mg，以五氧化二磷为干燥剂在60℃减压干燥6h，称定后进行均质化，配制成浓度为0.5mg/mL的对照品供试溶液；

(2)样品供试溶液的制备：取注射用香菇多糖5支，将内容物全部转移至10mL量瓶中，加适量水洗样品瓶，并转移至同一量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.5mg/mL的样品供试溶液；

(3)取香姑多糖对照品供试溶液和样品供试溶液各1200μL，分别采用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，而后注入液相色谱仪，在以下条件下进行色谱分离：采用孔径为的、表面键合了亲水薄膜的硅胶(SRT-SEC-500)为固定相，色谱柱内径为21.2mm，长度为300mm，粒径为5μm；色谱柱柱温为25-35℃；以0.002mol/L乙酸钠溶液为流动相；流速为7mL/min；采用示差折光检测器，检测器温度为30℃；

依次收集香菇多糖组份于20mL量瓶中，准确收集溶液至刻度，得到对照品待测液和样品待测液；

(4)含量测定：量取0.2％蒽酮硫酸溶液5mL置试管中，试管置冰浴中冷却，分别加入对照品待测液和样品待测液各3mL，剧烈振摇混匀，立即放入水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，应在20～40分钟内，以水为空白，采用分光光度法(通则0401)在625nm波长处测定吸光度，按外标单点法计算。

技术效果：

采用本发明的高效液相色谱条件，能够将香菇多糖与右旋糖酐、甘露醇或山梨醇等辅料很好地达到基线分离，分离度在2.5左右，显著优于《中国药典-2010》规定1.5的基线分离标准。香菇多糖制剂经本发明高效液相色谱条件分离后，再测定香菇多糖的含量，能够有效排除右旋糖酐、甘露醇以及山梨醇等辅料的干扰，使得香菇多糖制剂剂含量测定更加准确。本发明香菇多糖制剂含量的测定方法具有简便、专属性强、准确度高等诸多优点，可以满足市场上现有不同处方香菇多糖制剂的含量测定，对药品的质量能够起到有效的控制，从而提高药品的有效性和安全性。

附图说明

图1为实施例1中样品供试溶液的高效液相色谱图；

图2为实施例2中样品供试溶液的高效液相色谱图；

图3为对比例1中样品供试溶液的高效液相色谱图(以东曹G3000-PWxl色谱柱，以硼酸盐溶液为流动相)；

图4为对比例1中样品供试溶液的高效液相色谱图(以东曹G3000-PWxl色谱柱，以乙酸钠溶液为流动相)；

图5为对比例1中样品供试溶液的高效液相色谱图(以2根东曹G3000-PWxl色谱柱串联，以乙酸钠溶液为流动相)；

图6为对比例1中样品供试溶液的高效液相色谱图(以4根东曹G3000-PWxl色谱柱串联，以乙酸钠溶液为流动相)；

图7为对比例2中样品供试溶液的高效液相色谱图；

图8为对比例3中样品供试溶液的高效液相色谱图；

图9为实施例3中样品供试溶液的高效液相色谱图；

图10为高效液相色谱进样浓度与比色测定时吸光度之间的线性曲线；

具体实施方式

测试例1辅料对蒽酮硫酸法香菇多糖含量测定结果的影响

原料、辅料及试剂：

香菇多糖原料药(四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司)，甘露醇、山梨醇、蒽酮均为AR级(国药试剂)

仪器：紫外分光光度计(日本岛津株式会社)，电炉

针对各待测液(具体见表1)，分别进行测定。量取0.2％蒽酮硫酸溶液5mL置试管中，试管置冰浴中冷却，加入供试液3mL，剧烈振摇混匀，立即放入水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，应在20～40分钟内，以水为空白，采用分光光度法(通则0401)在625nm波长处测定吸光度，按外标单点法计算。测试结果见表1。

表1不同辅料对蒽酮硫酸法香菇多糖含量测定结果的影响

实施例1香菇多糖冻干粉针剂的含量测定

1.仪器与试剂：

仪器：岛津20AD高效液相色谱系统；LCsolution色谱工作站；

试剂：无水乙酸钠(国药，分析纯)，水-高纯水

香菇多糖对照品(原料药)：批号：slen141101上海慈瑞医药科技有限公司

香菇多糖冻干粉针剂：批号：ZJXS161201上海慈瑞医药科技股份有限公司

2.测定方法与结果：

(1)对照品供试溶液的制备：取香菇多糖对照品100mg，以五氧化二磷为干燥剂在60℃减压干燥6h，称定后置预加20mL纯化水的50mL烧杯中，再加入30mL纯化水，4000转/分钟匀浆1分钟，再12000转/分钟匀浆3分钟，将溶液转移至100mL烧杯中，并用50mL纯化水剪切润洗50mL烧杯和剪切头，直至烧杯壁上无肉眼可见颗粒，润洗液合并至100mL烧杯中。将上述溶液约100mL倒入均质机的料杯中，200bar均质2次，500bar均质3次，将溶液转移至200mL量瓶中。另取纯化水约100mL，分两次，润洗烧杯，并倒入均质机的料杯中，均质漂洗3分钟，洗液转移至同一200mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.5mg/mL的对照品供试溶液；

(2)样品供试溶液的制备：取香菇多糖冻干粉针剂5支，全部转移至10mL量瓶中，加适量水洗样品瓶，并转移至同一量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为0.5mg/mL的样品供试溶液；

(3)对照品待测液和样品待测液的制备：取香姑多糖对照品供试溶液和样品供试溶液各1200μL，分别采用孔径为0.45μm的微孔滤膜滤过，而后注入液相色谱仪，按分子排阻色谱法(通则0541)，在以下条件下进行色谱分离：采用孔径为的、表面键合了亲水薄膜的硅胶(SRT-SEC-500)为固定相，色谱柱内径为21.2mm，长度为300mm，粒径为5μm；色谱柱柱温为25-35℃；以0.002mol/L乙酸钠溶液为流动相；流速为7mL/min；采用示差折光检测器，检测器温度为30℃。(【色谱条件与系统适用性试验】：照分子排阻色谱法(通则0541)，按上述条件取右旋糖酐40约20mg，转移至20ml量瓶中用对照储备溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。量取1.2ml注入液相色谱仪，香菇多糖峰与紧邻右旋糖酐40峰的分离度大于1.5；或量取样品供试溶液1.2ml注入液相色谱仪，香菇多糖峰与紧邻右旋糖酐40峰的分离度大于1.5。)

依次收集香菇多糖组份于20mL量瓶中，准确收集溶液至刻度，分别作为对照品待测液和样品待测液。

样品供试溶液的高效液相色谱图见图1。在此条件下，样品中各组分达到基线分离，测得分离度为2.53。

(4)含量测定：量取0.2％蒽酮硫酸溶液5mL置试管中，试管置冰浴中冷却，分别加入对照品待测液和样品待测液各3mL，剧烈振摇混匀，立即放入水浴中加热，自振摇起计时，准确反应6分钟，将试管移至冰浴中冷却后，放至室温。自振摇起，应在20～40分钟内，以水为空白，按照分光光度法(通则0401)在625nm波长处测定吸光度，按外标单点法计算。香菇多糖冻干粉针剂ZJXS161201中香菇多糖的测定含量为99.7％。

实施例2

采用与实施例相同的仪器、试剂、以及测定方法，所不同的是高效液相色谱条件为：采用以SRT SEC-500与SRT SEC-300串联的色谱柱进行替代。样品供试溶液的高效液相色谱图见图2，分离度为1.73，香菇多糖冻干粉针剂ZJXS161201中香菇多糖的测定含量为98.9％。

对比例1-3

1.仪器与试剂同实施例1

2.测定方法与结果

(1)对照品供试溶液的制备：按实施例1步骤(1)的方法制得浓度为0.5mg/mL的对照品供试溶液；

(2)样品供试溶液的制备：按实施例1步骤(2)的方法制得浓度为0.5mg/mL的样品供试溶液。

(3)对照品待测液和样品待测液的制备：制备条件按照实施例1步骤(3)所述，所不同的是分别采用表2所述的高效液相色谱条件进行分离制备，具体的分离情况见表2，以及图3-8。

表2不同色谱柱对香菇多糖和右旋糖酐的分离效果

(4)含量测定：对比例1-3的香菇多糖分离情况均无法满足系统适用性要求，无法有效测定含量。

实施例3

按照实施1相同的方法依次制备并测定香菇多糖冻干粉针剂ZJXS161201中香菇多糖的含量，所不同的是：采用安捷伦高效液相色谱系统；示差检测器；色谱柱为聚甲基丙烯酸树脂交联羟基醚树脂的安捷伦PL-AQUAGEL-OH MIXED-H色谱柱。

色谱图见图9，分离度为2.51，香菇多糖冻干粉针剂ZJXS161201中香菇多糖的测定含量为100.5％。

方法学考察：

1.线性关系考察：

线性关系是指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度(2015版中国药典四部通则9101)。

在供试溶液浓度为0.5mg/mL的80％-120％的浓度范围内，比较均匀的分别取6个浓度点，具体浓度见表3。取批号为slen141101上海慈瑞医药科技有限公司的香菇多糖产品，按照实施例1步骤(2)所述方法配制表3中的供试溶液1-6，按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的测定方法进行含量测定，记录吸光度值，具体见表3。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标画一条曲线，如图10。

表3香菇多糖浓度与吸光度的线性关系

	浓度(mg/mL)	吸光度
			供试溶液1	0.39052	0.4113
供试溶液2	0.42056	0.4342
			供试溶液3	0.48064	0.4857
供试溶液4	0.51068	0.5113
			供试溶液5	0.54072	0.5327
供试溶液6	0.6008	0.5923

线性方程斜率为0.853，截距：+0.075，相关系数(r)：0.999。

结论：香菇多糖的线性范围为：0.39052～0.6008mg/mL，符合验证方案要求(线性范围：至少在测试浓度的80％-120％的范围内)，在此范围内的相关系数r为0.999，符合验证方案要求(相关系数r的值不小于0.999)。

2.精密度试验：重复性

精密度系指在规定的条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性，(2015版中国药典四部通则9101)。要求测定6次的结果的RSD不得大于3.0％，证实方法具有良好的精密度。

取批号为：ZJXS161201，上海慈瑞医药科技股份有限公司的香菇多糖制剂，按照实施例1步骤(2)所述方法配制6份样品供试溶液，浓度见表4；取批号为151002，四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司的产品(原料药)，按照实施1步骤(1)所述方法配制对照品供试溶液，浓度见表4。然后按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的测定方法进行含量测定。具体结果见表4。

表4

结论：6次测定结果，香菇多糖平均含量为96.89％，含量的相对标准偏差RSD为2.46％，符合验证方案中的规定(重复性：RSD≤3.0％)，证实该方法具有一定的精密度。

3.准确度试验：准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示(2015版中国药典四部通则9101)。

准确度是通过配制80％、100％、120％三个不同浓度的样品供试溶液测得的回收率所得。通过测定不同浓度香菇多糖测定结果和理论值之间的回收率而实现的，要求回收率在92％-105％之间，以证实方法具有良好的准确度。

取批号为：ZJXS161201，上海慈瑞医药科技股份有限公司的香菇多糖制剂，按照实施例1步骤(2)所述方法配制浓度分别为0.4027mg/mL、0.4995mg/mL、0.6033mg/mL的3份样品供试溶液；取批号为151002，四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司的产品(原料药)，按照实施1步骤(1)所述方法配制浓度为0.5028mg/mL的对照品供试溶液。然后按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的测定方法进行含量测定，具体结果见表5。

表5

结论：三种浓度下，香菇多糖回收率在97.07％-101.91％之间，符合验证方案要求(92％-105％)，证实了该方法具有良好的准确度。

4.测试溶液的稳定性考察：考察香菇多糖测试溶液随时间的变化规律。在自然环境下，将供试溶液放置0h、1h、2h、4h、5h后，用现配制的标准供试溶液考察上述溶液检测结果的变化，要求RSD≤2％，为检测不同放置时间的供试溶液的测试提供依据。

取批号为：ZJXS161201，上海慈瑞医药科技股份有限公司的香菇多糖制剂，按照实施例1步骤(2)所述方法配制浓度为0.5mg/mL的样品供试溶液；取批号为151002，四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司的产品，按照实施1步骤(1)所述方法配制浓度为0.5028mg/mL的对照品供试溶液。然后按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的测定方法分别对上述放置时间的样品供试溶液进行含量测定，具体结果见表6。

表6

结论：从表中可以看出，样品供试溶液放置5h内，供试溶液RSD为1.11％，符合验证方案要求(规定：RSD≤2％)，证实了样品供试溶液在放置5h内，对香菇多糖含量的测试结果没有影响。

5.耐用性试验：耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于日常检验提供依据(2015版中国药典四部通则9101)。以下将通过略微改变不同的流速、不同的柱温、不同批次色谱柱来评估测定条件参数有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。要求各个变动的色谱条件参数下，香菇多糖的测定结果RSD关于2％，或回收率满足92％-105％。

取批号为：ZJXS161201，上海慈瑞医药科技股份有限公司的香菇多糖制剂，按照实施例1步骤(2)所述方法配制浓度为0.5mg/mL的样品供试溶液；取批号为151002，四川省宜宾五粮液集团宜宾制药有限责任公司的产品，按照实施1步骤(1)所述方法配制浓度为0.5mg/mL的对照品供试溶液。然后按照实施例1步骤(3)和步骤(4)所述的测定方法分别对上述供试溶液进行含量测定，具体结果见表7-13。表7-13中，样品供试溶液1和样品供试溶液2为采用同批次样品分别配制所得，分别进行测定，以保证测定结果准确性。对照品供试溶液1和对照品供试溶液2具有同样的解释。

(1)流动相浓度略微改变的影响

表7流动相浓度略微改变对测试结果的影响(0.0022mol/L乙酸钠)

溶液名称	浓度mg/ml	回收率
			样品供试溶液1	0.5	101.48％
样品供试溶液2	0.5	101.04％

表8流动相浓度改变对测试结果的影响(0.0018mol/L乙酸钠)

溶液名称	浓度mg/ml	回收率
			样品供试溶液1	0.5	99.93％
样品供试溶液2	0.5	102.06％

结论：当方法中流动相浓度发生微小变化时，RSD为0.89％，回收率符合要求，对含量测定结果没有影响。

(2)流动相流速略微改变对测试结果的影响

表9流速6.8ml/min

表10流速7.2ml/min

结论：当方法中流速发生微小变化时，RSD％为0.44％，回收率符合要求，对含量测定结果没有影响。

(3)柱温略微变化对测试结果的影响

表11柱温27.5℃

表12柱温32.5℃

结论：当方法中柱温发生微小变化时，RSD为1.46％，回收率符合要求，对含量测定结果没有影响。

(4)不同批次的色谱柱对测试结果的影响：

表13更换色谱柱对测定结果的影响(采用与实施例1相同，但生产批次不同的色谱柱)

结论：当方法中使用不同批次色谱柱时，制剂含量符合要求，对含量测定结果没有影响。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法，其特征在于，包括：

(1)采用高效液相色谱法将供试溶液进行洗脱；

(2)进行香菇多糖含量的测定；

其中，所述高效液相色谱的固定相包括：平均孔径为(优选平均孔径为或特别优选)的表面键合了亲水薄膜的硅胶固定相、以及聚甲基丙烯酸树脂交联羟基醚树脂的固定相；

可选地，所述固定相同时包括平均孔径为和的、表面键合了亲水薄膜的硅胶固定相；

可选地，所述高效液相色谱采用1-6根(优选为1-3根)色谱柱串联的色谱柱。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中采用蒽酮硫酸法、滴定法、苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法进行香菇多糖含量的测定。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述香菇多糖组合物中含有选自右旋糖酐、甘露醇、山梨醇中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定方法，其特征在于，所述香菇多糖组合物的剂型为胶囊、颗粒、散剂、片剂、滴丸、乳剂、膏剂、香菇多糖冻干粉针剂或香菇多糖注射液。

5.根据权利要求1-4任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱的流动相选自乙酸盐水溶液、磷酸盐水溶液或碱性水溶液；优选地，所述乙酸盐为乙酸钠；所述碱性水溶液为氢氧化钠水溶液；优选地，所述乙酸盐水溶液或磷酸盐水溶液的浓度为0.001mol/L至0.2mol/L；更优选为0.002mol/L；更优选流动相为0.002mol/L的乙酸钠水溶液；优选地，所述碱性水溶液的pH值为8.0-12.0，优选流动相为pH值为10.0的氢氧化钠水溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法流动相的流速为0.1-20mL/min，优选为0.2-15mL/min，更优选为0.5-10mL/min。

7.根据权利要求1-6任一项所述的测定方法，其特征在于，将供试溶液进行均质化处理后，再进行高效液相色谱法洗脱。

8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述均质化处理步骤包括先用高速匀浆机处理，再用高压均质机处理。

9.根据权利要求1-8任一项所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用示差折光检测器或蒸发光散射检测器；

优选地，采用示差折光检测器。

10.根据权利要求1-9任一项所述的测定方法，其特征在于，所述含量测定方法包括以下步骤：

(1)取香菇多糖对照品，干燥称量，加水制成浓度为0.1-2.5mg/mL(优选为0.1-0.5mg/mL，更优选为0.5mg/mL)的对照品供试溶液；优选将对照品供试液进行均质化处理；

(2)取香菇多糖组合物，加水溶解制成浓度为0.1-1.0mg/mL(优选为0.1-0.5mg/mL，更优选为0.5mg/mL)的样品供试溶液；优选将样品供试溶液进行均质化处理；

(3)将所述对照品供试溶液和样品供试溶液分别采用微孔滤膜滤过，优选所述微孔滤膜的孔径为0.3μm、0.45μm、0.5μm或0.75μm，更优选为0.45μm；然后注入高效液相色谱仪进行对照品供试溶液和样品供试溶液的洗脱，收集对照品待测液和样品待测液；

(4)采用蒽酮硫酸法、滴定法、苯酚-硫酸法或3,5-二硝基水杨酸法测定对照品待测液和样品待测液中香菇多糖的含量。