CN105378063B - 红细胞的产生与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过将造血干细胞在诱导细胞存活和增殖的蛋白质存在下进行分化而从造血干细胞产生红细胞。

Description

红细胞的产生与用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请No.61/776,732和2013年3月12日提交的美国发明申请No.13/797,648的权益和优先权，这两个申请案以引用方式整体并入本文。
以ASCII文本文件提交序列表
以下ASCII文本文件提交的内容以引用方式整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：106417-0181_Seq_List.txt；记录日期：2013年3月10日，大小：9KB)。
技术领域
本发明涉及在体外从造血干细胞产生成熟红细胞的新方法，以及成熟红细胞在体内的治疗和诊断用途。
背景技术
红细胞(RBC)的输注常规上用于许多临床和手术应用。平均来说，每天需要39,000单位的血液，并且自2004年以来的数据表明，一年里有2900万单位的血液被输注(美国血库协会(American Association of Blood Banks)网站)。单单这个措施，在过去60年里就已挽救了许多人的生命。随着医学治疗的进步和人口老龄化，对这种输注的需求继续增加。
除了已得益于可供利用的红细胞输注的传统临床环境(如创伤患者的手术和治疗)之外，还有许多其中红细胞的输注会改变医护标准的独特情况。例如，在加勒比黑人血统的患者中有许多红细胞稀有表型(Douay et al.,Transfusion Medicine Reviews 21,91-100,2007(Douay等人，《输血医学评论》，第21卷，第91-100页，2007年))。它们被认为是稀有表型，因为缺乏抗原，如H或ABO血型。这类患者可发展对ABO血型抗原的中和抗体响应，使得他们不适合红细胞输注。实际上，这类患者必须接受来自同卵来源的输注以避免中和抗体响应，这在需要反复进行红细胞输注的病例(例如，镰状细胞患者等)中造成极大的挑战。
另外，患有多种基于抗体的自身免疫性疾病并经历自身免疫性溶血性贫血的患者也可从红细胞输注得益。但是，这在寻找其红细胞与患者的自身抗体相容的供者或有限的一组供者方面提出挑战。本质上，这些患者经历与稀有血表型患者相同的挑战。
此外，患有血红蛋白病和地中海贫血的患者具有导致他们的红细胞寿命较短的同类系突变(congenic mutation)。虽然采用输血来改善这些患者的生命与健康的想法早而有之，但所需要的输血频率造成重大问题。来自健康供者的红细胞的平均寿命为28天。这些患者所需要的输血次数多而频繁，并且造成医原性感染的风险显著增加。如果能够在体外产生红细胞并且提供平均寿命为120天的同步化红细胞的输注，则将大大减少这些患者所需要的输血次数并且真正改善他们的生活质量。
在红细胞用于创伤和手术的传统临床用途的情形中，从供者收集的红细胞的寿命问题也是重要的。红细胞浓缩物储藏长达一个月，可能会导致红细胞群体需要至少24小时才能恢复其输氧能力。另外，这些浓缩物中的许多坏死红细胞会在接受者体内引发炎性响应及由这种炎性响应导致的并发症。如果能够在体外产生红细胞的持续供应，则将使医护人员预期有新鲜红细胞可用并使他们能满足对新鲜红细胞的需求，并且还将使得不需要长期储藏红细胞浓缩物。
红细胞输注的另一个问题是红细胞输注的提供变得日益困难。这个日益困难的原因包括：由于已被证实通过输血传播的传染原的数目日益增多，适合输注的捐赠血的供应稳步下降；血红蛋白和氧转运体(全氟化碳)在临床环境中未能表现出作为红细胞替代品的功效；以及最近与促红细胞生成素(EPO)的使用相关的并发症。如果容易获得可产生确定的输注用红细胞产物的红细胞祖细胞连续供应，则将改变临床实践并使输血变成更安全更广泛使用的措施。但是，这种方法必须能够提供安全、有效且通用的红细胞供应。
虽然已作出了一些初步的尝试来在体外从原代造血干细胞(源自骨髓、脐带血或外周血)或胚胎干细胞获得红细胞，但迄今为止这些尝试都未取得成功，原因有很多，包括以下一个或多个原因：费用、方案的持续时间、步骤多、饲养细胞或血清的使用、劳动密集型、产率低或者不能完全分化为成熟的无核红细胞。在体外产生红细胞的尝试包括从原代造血干细胞(Neildez-Nguyen et al.,Nat Biotech 20,467-72,2002(Neildez-Nguyen等人，《自然生物技术》，第20卷，第467-72页，2002年))和胚胎干细胞(Lu et al.,Blood.2008Dec 1；112(12):4475-84(Lu等人，《血液》，2008年12月1日；第112卷，第12期，第4475-84页)；Lu et al.,Regen Med 3,693-704,2008(Lu等人，《再生医学》，第3卷，第693-704页，2008年))出发的方法。这些方法总体上也没有得到确定且连续的红细胞祖细胞来源。
对以上文献和研究的引述并不意在承认任何前述文献和研究是相关的现有技术。所有有关这些文献的内容的陈述是基于本申请人可获知的信息，并不构成对这些文献的内容的正确性的任何承认。
发明内容
因此，对于改进的用于体外产生完全成熟人红细胞的方法存在着需求。本发明提供通过在一种或多种能诱导细胞存活或增殖中的一者或多者的重组蛋白(如外源蛋白)、EPO及任选地IL-3存在下培养造血干细胞(HSC)来产生红细胞(RBC)群体的新方法。有利地，这些方法在约10天时间产生表现出成人红细胞表型的成熟无核红细胞，所述表型包括但不限于血型糖蛋白A(GPA)的表达、成人血红蛋白水平提高、CD71(转铁蛋白受体)水平降低和胎儿血红蛋白水平降低。此外，从可在体外无限地传代、可冷冻保藏和可恢复的条件性无限增殖化的人长期造血干细胞产生红细胞，会使得可以从确定的、得到充分表征的来源连续地产生完全分化的红细胞。另外，通过本发明的新方法产生的红细胞还可含有和/或表达一种或多种可用来治疗需要进行治疗的受试者的目的重组蛋白。
因此，本发明的某些方面涉及通过如下方式从造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法：在EPO和一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的第一重组蛋白或其生物活性片段存在下，在能诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的条件下，培养该造血干细胞，从而产生成熟红细胞的群体。在一些实施例中，该造血干细胞是条件性无限增殖化的造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞是蛋白质转导的造血干细胞，并且该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段是外源蛋白。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞是转基因造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段是一种或多种选自MYC多肽、ICN-1多肽、其同源物及其生物活性片段的多肽。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该MYC多肽是一种或多种选自n-Myc、c-Myc、l-Myc、v-Myc和s-Myc的MYC多肽。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段中的一者或多者含有蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、VPR和EPTD的蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段是TAT-MYC。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段作为弹丸(bolus)提供。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该至少一种或多种第一重组蛋白约每24小时、约每48小时或约每72小时作为弹丸提供。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该方法还包括在IL-3存在下培养该造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该方法还包括在饲养细胞和血清不存在下培养该造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该方法还包括在一种或多种能抑制凋亡的第二重组蛋白或其生物活性片段存在下培养该成熟红细胞群体。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段含有一种或多种Bcl-2同源结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种Bcl-2同源结构域是一种或多种选自BH1、BH2、BH3和BH4的Bcl-2同源结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第二重组蛋白是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL或Mcl-1中的一者或多者。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段是Bcl-2。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段中的一者或多者含有蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、VPR和EPTD的蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段是TAT-Bcl-2。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞还含有一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段是外源蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞含有一种或多种编码一种或多种选自以下蛋白质的转基因：该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段；该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段；以及一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段、该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段或者一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段中的一者或多者的表达或功能是可控制的。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段、该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段或者一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段中的一者或多者的表达或功能是可诱导的。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种转基因中的一者或多者编码抗生素应答元件或激素应答元件。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该抗生素应答元件或该激素应答元件是一种或多种选自雌激素应答元件、促性腺激素应答元件或四环素应答元件和糖皮质激素应答元件的应答元件。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种转基因过量表达一种或多种选自该一种或多种第一重组蛋白或其生物活性片段、该一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段和一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段的蛋白质中的一者或多者。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，与从在IL-3和EPO存在下培养八天、然后在饲养细胞和EPO存在下培养三天、最后在单独饲养细胞存在下培养10天的原代干细胞产生红细胞群体相比，该成熟红细胞群体的产生被加速至少45％。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体在约7至14天时间里产生。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体表现出一种或多种选自以下的特性：成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的细胞是无核的；成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的细胞表达GPA；成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的细胞表达成人血红蛋白；成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的细胞表现出CD71表达水平降低；成熟红细胞群体，其中约40％至约100％的细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞是人造血干细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞从具有稀有血型的患者分离。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该患者具有自身免疫性病症。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该造血干细胞从胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体是人细胞群体。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体具有一种或多种选自A+、A-、B+、B-、AB+、AB-、O+和O-的血型。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体是稀有血型。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体是非人动物细胞群体。
本发明的其他方面涉及体外分化的成熟红细胞的群体，该群体含有表达GAP、表达成人血红蛋白、表现出CD71表达水平降低和表现出胎儿血红蛋白表达水平降低的无核红细胞，其中：该群体中约40％至约100％的红细胞是无核的；该群体中约40％至约100％的红细胞表达GPA；该群体中约40％至约100％的红细胞表达成人血红蛋白；该群体中约40％至约100％的红细胞表现出CD71表达水平降低；并且该群体中约40％至约100％的红细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞含有一种或多种目的重组蛋白。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞具有稀有血型。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞是人红细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞是非人动物红细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该体外分化的成熟红细胞群体通过任何从任一前述实施例的造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法产生。
本发明的其他方面涉及含有体外分化的成熟红细胞群体和一种或多种药物可接受的赋形剂的药物组合物，其中该群体中约40％至约100％的红细胞是无核的，该群体中约40％至约100％的红细胞表达GPA，该群体中约40％至约100％的红细胞表达成人血红蛋白，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出CD71表达水平降低，并且该群体中约40％至约100％的红细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，其中该组合物还含有一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞群体含有一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段是外源蛋白。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞具有稀有血型。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞是人红细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞是非人动物红细胞。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该体外分化的成熟红细胞群体通过任何从任一前述实施例的造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法产生。
本发明的其他方面涉及通过如下方式治疗、预防或诊断以无核红细胞的缺乏为特征的疾病或失调的方法：给有需要的受试者提供体外分化的成熟红细胞群体，其中该群体中约40％至约100％的红细胞是无核的，该群体中约40％至约100％的红细胞表达GPA，该群体中约40％至约100％的红细胞表达成人血红蛋白，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出CD71表达水平降低，并且该群体中约40％至约100％的红细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该受试者是人。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该受试者是非人动物。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该红细胞群体含有一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段是外源蛋白。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该体外分化的成熟红细胞群体通过任何从任一前述实施例的造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法产生。
本发明的其他方面涉及通过如下方式延长体外成熟红细胞群体的半寿期的方法：将该红细胞群体保持在含有一种或多种能抑制凋亡的外源多肽、其同源物或其生物活性片段的培养基中。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种外源多肽、其同源物或其生物活性片段含有一种或多种Bcl2同源结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种Bcl-2同源结构域是一种或多种选自BH1、BH2、BH3和BH4的Bcl-2同源结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种外源多肽、其同源物或其生物活性片段是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL或Mcl-1中的一者或多者。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种外源多肽、其同源物或其生物活性片段是Bcl-2。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种外源多肽、其同源物或其生物活性片段中的一者或多者含有蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、VPR和EPTD的蛋白转导结构域。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该一种或多种外源多肽、其同源物或其生物活性片段是TAT-Bcl-2。在一些可与任何前述实施例进行组合的实施例中，该成熟红细胞群体通过任何从任一前述实施例的造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法产生。
附图说明
图1示出产生ctlt-HSC细胞系的一般方法。图1A示出用来以MYC-ER和Bcl-2转导原代鼠HSC细胞的反转录病毒构建体的示意图。图1B示出在以pMIG-MYC-ER和pMIG-Bcl-2进行转导后从经5-氟尿嘧啶处理的供者获得的HSC的流式细胞术分析。图1C示出移植了图1B中所示的经转导的HSC的小鼠中白血病发生的动力学。图1D示出来自白血病小鼠的骨髓的恢复后不久的ctlt-HSC的FACS分析。图1E示出已建立的ctlt-HSC细胞系的FACS分析。图1F示出来自野生型C57/BL6小鼠的骨髓的正常、未经操纵的Lt-HSC中干细胞标志物的FACS分析。
图2示出在移植ctlt-HSC后出现的成熟免疫细胞的表征。图2A示出移植后源自淋巴组织中的ctlt-HSC的细胞的频率。图2B示出骨髓中的GFP+髓样谱系细胞的检测。图2C示出脾脏中的外周成熟淋巴细胞的分析。图2D示出在ctlt-HSC的第二次连续传代后，移植物接受小鼠中的外周成熟淋巴细胞的分析。
图3示出三种人ctlt-HSC细胞系的表面表型。图3A、图3B和图3C显示来自三种已建立的人ctlt-HSC细胞系的经转导的(即GFP+)HSC的CD34+级分。图3D、图3E和图3F显示来自三种已建立的人ctlt-HSC细胞系的经转导的(即GFP+)HSC的c-kit+级分。图3G示出来自已建立的人ctlt-HSC细胞系的经转导的(即GFP+)HSC不表达CD45。图3H示出来自已建立的人ctlt-HSC细胞系的经转导的(即GFP+)HSC不表达Flk-2。图3I示出来自已建立的人ctlt-HSC细胞系的经转导的(即GFP+)HSC不表达CD150。
图4示出在NOD/SCID/β2M-/-小鼠中，人ctlt-HSC细胞系分化为成熟淋巴样细胞。图4A示出从对照小鼠(无移植物)获得的数据。图4B、图4C和图4D显示从在外周血中呈递成熟人淋巴样细胞的移植物接受小鼠获得的数据。
图5示出使用人ctlt-HSC作为来源在体外产生的人红细胞。图5A示出小鼠外周血的苏木精和伊红染色。图5B示出原代人胎儿脐带血的苏木精和伊红染色。图5C、图5D和图5E显示三种用IL-3和EPO处理12天的条件性转化的胎儿脐带血细胞系的苏木精和伊红染色。图5F显示图5E的细胞的放大视图，以显示红细胞形态。
图6示出体外产生的人红细胞能将小鼠从化学诱导的致死性贫血中挽救出来。
图7示出体外产生的人红细胞能将小鼠从出血性休克中挽救出来。
图8示出用于将蛋白质直接转导到细胞中的重组TAT-MYC和TAT-Bcl-2蛋白的表达和纯化。图8A示出TAT-MYC。图8B示出TAT-Bcl-2。
图9示出FACS分析，该分析显示经鼠蛋白转导的长期HSC细胞系(ptlt-HSC)的发育。图9A示出未染色的细胞。图9B示出用抗Sca1和c-Kit的抗体染色。图9C示出用抗B220和CD3的抗体染色。图9D示出所得的ptlt-HSC细胞系的表面表型。
图10示出FACS分析，该分析显示了用鼠ptlt-HSC细胞系重构Rag-1-/-小鼠体内的淋巴区室。图10A示出未染色的细胞。图10B示出B细胞标志物B220和IgM的染色。图10C示出T细胞标志物CD4和TCRβ的染色。图10D示出T细胞标志物CD8和TCRβ的染色。
图11示出在体外从ptlt-HSC发育为成熟鼠红细胞。图11A示出40倍物镜下未分化的鼠ptlt-HSC的苏木精和伊红染色。图11B示出40倍物镜下源自鼠ptlt-HSC的红细胞的苏木精和伊红染色。图11C示出100倍物镜下源自鼠ptlt-HSC的红细胞的苏木精和伊红染色。
图12示出源自脐带血的HSC的体外扩增。图12A示出将HSC在含有TAT-MYC和TAT-Bcl-2的培养基中培养3天后用抗CD38和CD34的抗体染色。图12B示出将HSC在含有TAT-MYC和TAT-Bcl-2的培养基中培养14天后用抗CD38和CD34的抗体染色。
图13示出在体外诱导红细胞的分化。图13A示出在含有IL-3和EPO的培养基中培养4天后的图12的未染色的HSC细胞。图13B示出将图12的HSC细胞在中性培养基中培养4天后用抗GPA和CD71的抗体染色。图13C示出将图12的HSC细胞在含有IL-3和EPO的培养基中培养4天后用抗GPA和CD71的抗体染色。
图14示出体外红细胞分化标志物的动态分析。图14A示出成熟人红细胞(+对照)用抗GPA、CD71和胎儿血红蛋白的抗体染色。图14B示出将图12的HSC细胞在含有IL-3和EPO的培养基中培养5天后用抗GPA、CD71和胎儿血红蛋白的抗体染色。图14C示出将图12的HSC细胞在含有IL-3和EPO的培养基中培养9天后用抗GPA、CD71和胎儿血红蛋白的抗体染色。
图15示出培养物中的去核情况的组织学分析。图15A示出图12的细胞在含有IL-3和EPO的培养基中培养3天后的苏木精和伊红染色。图15B示出图12的细胞在含有IL-3和EPO的培养基中培养7天后的苏木精和伊红染色。
图16示出在透气袋中人红细胞的产生。图16A示出将条件性无限增殖化的ptlt-HSC在含有IL-3和EPO的培养基中培养4天后从其分化出红细胞。图16B示出红细胞的苏木精和伊红染色，显示了该红细胞的成熟和去核。
图17示出从骨髓细胞产生小鼠红细胞。图17A示出来自骨髓的未经处理的(对照)小鼠造血干细胞的苏木精和伊红染色。图17B示出来自用IL3和EPO处理但没有用Tat-Myc或Tat-Bcl-2处理的骨髓的小鼠造血干细胞的苏木精和伊红染色。图17C示出来自用IL3、EPO和Tat-Myc处理但没有用Tat-Bcl-2处理的骨髓的小鼠造血干细胞的苏木精和伊红染色。图17D示出来自用IL3、EPO和Tat-Bcl-2处理但没有用Tat-Myc处理的骨髓的小鼠造血干细胞的苏木精和伊红染色。图17E示出来自用IL3、EPO、Tat-Bcl-2和Tat-Myc处理的骨髓的小鼠造血干细胞的苏木精和伊红染色。
图18示出Tat融合蛋白的产生和体外表征。图18A示出Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意图，包括HIV-1Tat的框内蛋白转导结构域及V5标签和6xHis标签的位置。图18B示出从大肠杆菌纯化、经SDS-PAGE分离和用考马斯染色后的重组蛋白。图18C示出暴露于纯化的重组Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未处理(NT)达两小时，然后用抗V5的单克隆抗体并用Hoechst 9934核染剂固定和染色的汇合3T3细胞的菌苔。Tat-Myc蛋白在这个时间范围主要定位于核区域，而Tat-Bcl-2保持在细胞质和核周空间。图18D示出经如下处理的源自人脐带血的HSC的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体)：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏1小时，洗涤，然后裂解(在指定的时间点)以将质膜和细胞质级分与核级分分离。图18E示出经如下处理的源自人脐带血的HSC的核级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体)：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏2小时，洗涤，然后裂解(在指定的时间点)以将质膜和细胞质级分与核级分分离。该蛋白质的大部分在24小时至48小时之间失去。在72小时后的任何时间点没有剩余可检测的蛋白质。
图19示出用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增源自人脐带血细胞的HSC的示意图。图19A示出在体外扩增14天的人脐带血细胞的表面表型的FACS分析的示意图(顶部各小图仅用细胞因子混合物；底部各小图用补加Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物)。图19B示出在两组条件下CD34+细胞的体外扩增的动力学的示意图。图19C示出源自人ptlt-HSC的、在甲基纤维素测定法中在支持髓类红细胞分化的条件下发育的三种不同集落类型的图像。图19D示出在接种了103个用细胞因子混合物培养的脐带血细胞(黑色柱)、103个用补加Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物培养的脐带血细胞(深灰色柱)或104个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(浅灰色柱)的甲基纤维素培养物中观察到的每种集落类型的定量的示意图。图19E示出再次平板接种图19D中所示的细胞时在甲基纤维素培养物中观察到的集落的数目的定量的示意图。
图20示出源自人脐带血的蛋白转导长期(ptlt)-HSC的体内功能分析的示意图。图20A示出几群被给予如下移植物的经亚致死性辐照的NSG小鼠的骨髓的FACS分析的示意图：106个在细胞因子混合物中体外扩增的脐带血细胞(第一小图；FCB)，或106个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中扩增的脐带血细胞(第二小图；FCB TMTB)，或5×106个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第三小图；新鲜FCB)。图20B示出来自异种嵌合小鼠的骨髓、脾脏和胸腺细胞的FACS分析的示意图。对所有细胞的人CD45进行染色。对CD45+细胞设门，显示出骨髓中的人CD34+CD38lo细胞(第一小图；骨髓)；脾脏中的人CD19+和人CD3+淋巴细胞(第二小图；脾脏)；和胸腺中的人CD3+细胞(第三小图；胸腺)。图20C示出用CFSE标记并在抗人CD40和IgM的单克隆抗体存在下培养的人脾脏B细胞的FACS分析的示意图。在NSG异种嵌合小鼠中发育的人B细胞在用它们的抗原受体刺激后发生增殖。图20D示出来自从NSG异种嵌合小鼠的骨髓获得并在甲基纤维素上平板接种的人CD34+ CD38lo细胞的髓类红细胞集落的定量的示意图。图20E示出再次平板接种后髓类红细胞集落的发育的定量的示意图。图20F示出在细胞因子混合物(空心圆圈)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(黑色正方形)中体外扩增的CD45阳性骨髓细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化(CD11b、CD33、CD3和CD19表达)的定量的示意图。图20G示出在细胞因子混合物(空心圆圈)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(黑色正方形)中体外扩增的CD45阳性脾脏细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化(CD11b、CD33、CD3和CD19表达)的定量的示意图。
图21示出用Tat-Myc和Tat-Bcl-2体外扩增成人G-CSF动员的HSC的示意图。图21A示出人CD45+细胞的表面表型的示意图，显示了人CD34+级分和CD38+级分的富集。图21B示出在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下在培养物中进行体外细胞扩增18天时间的动力学的示意图。图21C示出示意图，显示了5×103个用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSFHSC在甲基纤维素中产生4个形态学上不同的集落类型。图21D示出FACS分析的示意图，显示了用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSF HSC在异种嵌合NSG小鼠中产生人造血细胞谱系。骨髓来自移植了用补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(第一小图；G-CSF+TMTB)或用新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第二小图；新鲜FCB)扩增的ptlt-HSC的NSG小鼠。图21E示出来自骨髓、脾脏和胸腺的细胞的FACS分析的示意图。骨髓细胞包括人CD45细胞(它们也是人CD34+和CD38+)(第一小图)；脾脏细胞包括人CD45细胞(也对它们的人CD3进行染色)(第二小图)；并且胸腺细胞包括人CD45细胞及CD3(第三小图)。图21F和图21G示出对植入了106个在补加Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中(黑色正方形)体外扩增的G-CSF动员细胞的一群异种嵌合小鼠进行髓样细胞和淋巴样细胞分化评估的示意图。对CD45阳性的骨髓细胞(图21F)和脾脏细胞(图21G)群体分析CD11、CD33、CD3和CD19的表达。
图22示出各种Myc融合蛋白构建体在活化T细胞活力测定中的活性。图22A示出一些代表性的Myc融合蛋白构建体的概略性比对。图22B示出在用代表性的Myc融合蛋白构建体处理后48小时活T细胞百分数的示意图。
图23示出各种Tat融合蛋白(各为50μg/ml)在活化T细胞活力测定中的活性。图23A示出来自未经处理的细胞(无处理)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门(live gate)的示意图。图23B示出来自经Tat-Cre处理的细胞(Tat-Cre对照)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图。图23C示出来自经Tat-Bcl-2处理的细胞(Tat-Bcl-2)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图。图23D示出来自经Tat-Myc处理的细胞(Tat-Myc)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图。
图24示出Tat-Myc多肽的一些实施例的氨基酸(SEQ ID NO:1)和核酸(SEQ ID NO:2)序列。
图25示出Bcl-2结构域多肽的一些实施例的氨基酸(SEQ ID NO:3)和核酸(SEQ IDNO:4)序列。
图26示出使用包含Tat-Myc的分化培养基，原代HSC也分化为成熟红细胞。图26A示出在第6天和第11天，对细胞进行GPAxCD71类红细胞表面标志物的评估；在第11天，还通过流式细胞术对细胞进行成人和胎儿血红蛋白表达的评估。图26B示出在第10天，将来自分化培养物的样品进行细胞离心(cytospun)到盖玻片上以进行苏木精和伊红染色。图像放大10倍和20倍。
具体实施方式
本发明特别涉及通过用促红细胞生成素(EPO)、任选的IL-3、以及一种或多种能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的重组蛋白或其生物活性片段，对造血干细胞(HSC)进行培养，来在体外从HSC产生红细胞。本文描述的分化过程不需要饲养细胞(例如成纤维细胞)和/或血清，并且在约7至14天导致成熟无核红细胞的产生。
本文描述的产生成熟红细胞的方法可用于包括但不限于骨髓、外周血、动员外周血、脐带血和胎盘的任何来源的HSC，以及从胚胎干细胞和诱导多能干细胞产生的HSC。从任何来源分离的HSC都可用来产生以下红细胞(但不限于这些红细胞)：万能供血者红细胞、稀有血型的红细胞、用于个性化医疗(例如自体输注，任选地用有效负载或遗传工程)的红细胞和被工程改造成包含一种或多种目的蛋白的红细胞。
使用本发明的方法进行的在体外从HSC产生成熟红细胞，可通过使用条件性无限增殖化的HSC来增强。增强可包括但不限于以下一者或多者：每个起始HSC所得的成熟红细胞数目增加、成熟红细胞群体的一种或多种特性改进、或产生成熟红细胞所需的天数减少。条件性无限增殖化的HSC可通过如下方式来产生：使用本领域知道的任何转基因方法和/或蛋白质转导方法中的一者或多者，使HSC暴露于能促进细胞增殖和/或细胞存活的第一蛋白和能抑制凋亡的第二蛋白。
本发明还特别涉及通过一种或多种本发明的方法产生的成熟红细胞群体。成熟红细胞群体可通过包括但不限于以下特性的一种或多种特性来表征：该群体中的至少约40％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的细胞为无核细胞、GPA表达水平提高、成人血红蛋白表达水平提高(经FACS测得为2个数量级或更高)、CD71(例如GPA+/CD71-)表达水平降低和胎儿血红蛋白表达水平降低(经FACS测得为1个数量级；即0-10)。成熟红细胞群体还可包含一种或多种目的重组蛋白。这些目的蛋白可用于预防、治疗或诊断一种或多种疾病或失调。
本发明还特别涉及包含通过一种或多种本文描述的方法产生的成熟红细胞群体的药物组合物。这些药物组合物还可包含一种或多种可用于预防、治疗或诊断一种或多种疾病或失调的外源目的蛋白。
本发明还特别涉及通过给有需要的受试者提供本发明的成熟红细胞群体，来治疗、预防或诊断以红细胞缺乏为特征的疾病或失调的方法。本发明还特别涉及通过将本发明的包含一种或多种目的蛋白的一种或多种红细胞群体或药物组合物给予受试者来治疗或预防疾病或失调的方法，其中该一种或多种目的蛋白可用于治疗或预防该疾病或失调。
本发明还特别涉及延长红细胞或红细胞群体在体外的寿命或半寿期的方法。红细胞的体外半寿期的延长能扩大血库储存血液并给有需要的患者(例如平民或军队)供应血液的能力。如本文所描述，将红细胞维持在含有一种或多种能抑制凋亡的外源多肽的培养基中，可延长红细胞群体的体外半寿期。
本发明的蛋白质
本发明的某些方面涉及通过在含有一种或多种能促进细胞存活和/或增殖和/或能抑制凋亡的重组蛋白(如外源蛋白)或其生物活性片段的培养基存在下培养造血干细胞(HSC)和/或红细胞来在体外从HSC产生红细胞群体，以及维持红细胞群体。本发明的另外的方面涉及含有、包含和/或表达一种或多种目的蛋白的本发明HSC和/或红细胞。
如本文所用，“能促进细胞存活和/或增殖”的蛋白质指其生物活性直接或间接地激活、诱导、增强、刺激、容许或提高细胞存活和/或细胞增殖的蛋白质。如本文所用，本发明的蛋白质(如能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质或能抑制凋亡的蛋白质)的“生物活性片段”，是本发明的全长蛋白质的能保持该全长蛋白质的至少一种活性和/或功能的片段。
如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白
本发明的某些方面涉及通过在含有一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白或生物活性片段的培养基存在下培养造血干细胞(HSC)，来在体外从HSC产生红细胞群体。
可以使用本领域知道的任何能促进细胞存活和/或增殖的合适的蛋白质。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白是癌肽(例如由原癌基因和/或癌基因编码的多肽)。合适的癌肽可以是任何合适类别的能诱导细胞无限增殖的癌肽。合适的能促进细胞存活和/或增殖的癌肽的例子包括但不限于生长因子和/或促分裂原(例如源自PDGF的生长因子如c-Sis)；受体酪氨酸激酶，特别是组成型活性受体酪氨酸激酶(例如表皮生长因子受体(EGFR)、源自凝血细胞的生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)和HER2/neu)；细胞质酪氨酸激酶(例如Src家族、Syk-ZAP-70家族和BTK家族的酪氨酸激酶)；细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶及它们的调节亚基(例如Raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、Akt家族的成员)；调节性GTP酶(例如Ras蛋白)；转录因子(例如MYC和HIF-1a)；端粒酶反转录酶(例如TERT或hTERT)；和/或能激活其他癌肽的因子(例如细胞周期蛋白，包括细胞周期蛋白A、B、D和/或E，如细胞周期蛋白D1和D3)。
在某些实施例中，能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的非限制性例子有MYC、mTOR、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、STAT3、STAT5、AML-ETO、AKT、ICN-1、hTERT、PDK-1、MLL-ENL、IL3受体β链、β-联蛋白、Hedgehog家族(Shh、Ihh、Dhh)、Bmi-1、c-Jun、Wnt、Bcl-2、Bcl-6、Bcl-10、表皮生长因子受体(EGFR、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配体家族；胰岛素样生长因子受体(IGFR)家族、IGF结合蛋白(IGFBP)、IGFR配体家族；源自血小板的生长因子受体(PDGFR)家族、PDGFR配体家族；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族、FGFR配体家族、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受体家族；TRK受体家族；肝配蛋白(EPH)受体家族；AXL受体家族；白细胞酪氨酸激酶(LTK)受体家族；TIE受体家族、促血管生成素1,2；受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR)受体家族；盘状结构域受体(DDR)家族；RET受体家族；KLG受体家族；RYK受体家族；MuSK受体家族；转化生长因子β(TGF-β)受体、TGF-β；细胞因子受体、I类(血细胞生成素家族)和II类(干扰素/IL-10家族)受体、肿瘤坏死(TNF)受体超家族(TNFRSF)、死亡受体家族；癌-睾丸(CT)抗原、谱系特异性抗原、分化抗原、α-辅肌动蛋白-4、ARTC1、断裂点簇区-Abelson(Bcr-abl)融合产物、B-RAF、胱天蛋白酶-5(CASP-5)、胱天蛋白酶-8(CASP-8)、β-联蛋白(CTNNB1)、细胞分裂周期27(CDC27)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸因子2(ELF2)、Ets变体基因6/急性髓细胞性白血病1基因ETS(ETC6-AML1)融合蛋白、纤连蛋白(FN)、GPNMB、低密度脂质受体/GDP-L岩藻糖：β-D半乳糖2-α-L岩藻糖基转移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2.HLA-A2基因中的α2结构域的α螺旋的第170位残基处的精氨酸-异亮氨酸交换(HLA-A*201-R170I)、HLA-A11、热激蛋白70-2突变蛋白(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2、黑素瘤遍在突变蛋白1、2、3(MUM-1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、neo-PAP、I类肌球蛋白、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras(KRAS2)、N-ras(NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、磷酸丙糖异构酶、BAGE、BAGE-1、BAGE-2、3、4、5、GAGE-1、2、3、4、5、6、7、8、GnT-V(异常的N-乙酰葡糖胺基转移酶V、MGAT5)、HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-1、LAGE、LAGE-1、黑素瘤上CTL识别的抗原(CAMEL)、MAGE-A1(MAGE-1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-3、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、黏蛋白1(MUC1)、MART-1/Melan-A(MLANA)、gp100、gp100/Pmell7(SILV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-1、HAGE、NA-88、NY-ESO-1、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-1,2,3,4、TRP2-INT2、癌胚胎抗原(CEA)、激肽释放酶4、乳腺球蛋白-A、OA1、前列腺特异性抗原(PSA)、TRP-1/gp75、TRP-2、亲脂素、干扰素诱导蛋白黑素瘤缺乏因子2(AIM-2)、BING-4、CPSF、细胞周期蛋白D1、表皮细胞黏着分子(Ep-CAM)、EphA3、成纤维细胞生长因子-5(FGF-5)、糖蛋白250(gp250)、EGFR(ERBB1)、HER-2/neu(ERBB2)、白细胞介素13受体α2链(ILI 3Rα2)、IL-6受体、肠羧酸酯酶(iCE)、α-胎蛋白(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUC1、p53(TP53)、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RNF43、RU2AS、SOX10、STEAP1、存活蛋白(BIRC5)、人端粒酶反转录酶(hTERT)、端粒酶、Wilms肿瘤基因(WT1)、SYCP1、BRDT、SPANX、XAGE、ADAM2、PAGE-5、LIP1、CTAGE-1、CSAGE、MMA1、CAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15q14、HCA661、LDHC、MORC、SGY-1、SPO11、TPX1、NY-SAR-35、FTHL17、NXF2、TDRD1、TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白独特型、Bence-Jones蛋白、雌激素受体(ER)、雄激素受体(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、癌抗原72-4(CA 72-4)、癌抗原15-3(CA 15-3)、癌抗原27-29(CA 27-29)、癌抗原125(CA 125)、癌抗原19-9(CA 19-9)、β-人绒毛膜促性腺激素、鳞状细胞癌抗原、神经元特异性烯醇酶、热激蛋白gp96、GM2、沙格司亭、CTLA-4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、被T细胞4识别的腺癌抗原(ART-4)、癌胚发生抗原肽-1(CAP-1)、钙激活氯通道-2(CLCA2)、亲环蛋白B(Cyp-B)、人印戒肿瘤-2(HST-2)、源自猿猴病毒40(SV40)的转化基因和蛋白、人乳头瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要衣壳抗原、其他)、Epstein-Barr病毒(EBV)蛋白(EBV潜伏膜蛋白--LMP1、LMP2；其他)、乙型或丙型肝炎病毒蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、它们的功能性同源物、功能性类似物或生物活性片段。
在一些实施例中，能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质是使细胞存活和/或增殖的内源拮抗剂(例如蛋白质和/或基因)受到抑制的蛋白质。例如，该蛋白质可为使能促进细胞存活和/或增殖的基因的表达受到阻抑的转录阻遏物的抑制剂。在某些实施例中，该转录阻遏物可拮抗本发明的调节能促进细胞存活和/或增殖的基因(如MYC)的表达的癌肽。例如，在一些实施例中，该蛋白质能抑制转录阻遏物的MAD家族的至少一个成员，例如MAD-1；或者细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如p16、p19、p21或p27)。
在其他实施例中，细胞存活和/或增殖通过使细胞存活和/或增殖的内源拮抗剂(例如蛋白质和/或基因)受到抑制的因子来促进。例如，该因子可以是遗传抑制剂或小分子抑制剂(如拮抗剂)。在一些实施例中，该因子可包括使能促进细胞存活和/或增殖的基因的表达受到阻抑的转录阻遏物的抑制剂。在某些实施例中，该转录阻遏物拮抗本发明的调节能促进细胞存活和/或增殖的基因(例如MYC)的表达的癌肽。例如，在一些实施例中，该因子能抑制转录阻遏物的MAD家族的至少一个成员，例如MAD-1。在某些其他实施例中，该因子是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(例如p16、p19、p21或p27)的抑制剂。
任何使相对于同一类型的野生型细胞而言能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的内源拮抗剂受到抑制的物质，都适合在本发明的方法中使用。作为能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的内源拮抗剂的抑制剂的因子，能在任何阶段或通过任何机制减少、抑制或降低该拮抗剂的活性或水平。例如，在一些情况中，这种因子会使拮抗能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的活性的因子的表达受到干扰，例如在翻译水平上或在转录水平上干扰。在某些实施例中，会使拮抗能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的活性的因子的表达受到干扰的因子，是能够进行RNA干扰的因子(RNAi分子)。在一些实施例中，RNAi分子通过切割或结合到编码多肽的mRNA来产生。RNAi分子通过任何合适的手段产生，包括通过小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)或小发夹RNA(shRNA)。在某些实施例中，会使拮抗能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的活性的因子的表达受到干扰的因子是小分子，例如有机小分子。
在其他实施例中，该因子会使拮抗细胞存活和/或增殖的蛋白质的活性或水平受到抑制。在一些实施例中，该因子直接作用于拮抗细胞存活和/或增殖的蛋白质。例如，该因子可结合于拮抗细胞存活和/或增殖的蛋白质并抑制其活性。因此，在某些实施例中，该因子是能结合于拮抗细胞存活和/或增殖的蛋白质并破坏其天然功能的抗体或小分子。
在其他实施例中，能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质还包含蛋白转导结构域(PTD)。
在一些实施例中，能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质作为弹丸提供。如本文所用，“弹丸”指一定量或浓度的蛋白质，其被给予受试者以提高该蛋白质在该受试者的血液中的浓度至有效水平。弹丸可通过本领域知道的任何合适的方法给予。在一些实施例中，该弹丸约每12小时、约每24小时、约每36小时、约每48小时、约每60小时或约每72小时提供。
在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白是MYC多肽、其同源物或其生物活性片段。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白是ICN-1多肽、其同源物或其生物活性片段。在某些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白是PTD-MYC融合蛋白。在某些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白是PTD-ICN-1融合蛋白。
MYC
本发明的MYC多肽包括但不限于任何具有MYC蛋白的活性的多肽或其片段。
如本文所用，“MYC”和“MYC蛋白”可互换使用，指属于bHLH(碱性螺旋-环-螺旋)转录因子的MYC家族的成员的蛋白质。本发明的MYC蛋白是能调节MYC应答基因的表达的转录因子，并且因此进入细胞的细胞核以发挥功能。MYC活性可激活某些MYC应答基因的表达，同时阻抑其他MYC应答基因的表达。MYC活性可调节各种细胞功能，包括但不限于细胞增殖、细胞生长、细胞存活和凋亡。
如本文所描述，在从HSC产生红细胞期间，与在MYC不存在下进行的产生相比，从外源或内源来源提供的MYC的瞬时表达可提高成熟红细胞的产率，可降低产生成熟红细胞所需的时间长度，可提高成熟红细胞在群体中的百分数，和/或可提高成熟红细胞的产生速率。不想受理论的约束，不过据信正是低水平的MYC的瞬时表达促进HSC分化为成熟红细胞，因为已证实MYC在胚胎干细胞中的延长的表达通过抑制分化来促进自我更新(例如Cartwright et al.,Development.2005Mar；132(5):885-96(Cartwright等人，《发育》，2005年3月，第132卷，第5期，第885-96页))。此外，低水平的MYC瞬时表达能够增强从HSC产生成熟红细胞，这是出乎意料的，因为最近有个发现是，异常高水平的MYC表达抑制了类红细胞祖细胞向无核红细胞的分化(Jayapal et al.,J Biol Chem.2010 Dec 17；285(51):40252-65(Jayapal等人，《生物化学杂志》，2010年12月17日，第285卷，第51期，第40252-65页))。
本发明的PTD-MYC融合蛋白通过MYC的外源添加使得可以提高HSC中的MYC活性，而不需要在HSC中过量表达内源MYC或者通过对HSC的遗传操纵来重组表达MYC。
本发明的MYC多肽包括但不限于全长MYC蛋白、保持全长MYC蛋白的活性的片段、其同源物及其类似物。本发明的MYC多肽可通过本领域知道的任何合适方法产生。例如，MYC多肽可从天然来源纯化，可重组表达，或者可化学合成。
MYC蛋白
适合在本发明的任何方法中使用的全长MYC蛋白的例子包括但不限于c-Myc、N-Myc、L-Myc、v-MYC和S-Myc。
在某些优选的实施例中，MYC多肽是全长c-Myc多肽。该c-Myc多肽可具有以下特征中的一者或多者：该多肽可为439个氨基酸的聚合物，该多肽可具有48.804kDa的分子量，该多肽可含有碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)结构域，或者该多肽可结合到含有CACGTG的序列(即E盒序列)。优选地，该c-Myc多肽是NCBI登录号为NP_002458.2的人c-Myc多肽。此外，本发明的c-Myc多肽可为未经历任何翻译后修饰的c-Myc多肽。作为另一种选择，本发明的c-Myc多肽可为已经历任何翻译后修饰的c-Myc多肽。
生物活性MYC片段
在其他实施例中，本发明的MYC多肽是全长MYC蛋白的保持全长MYC蛋白的至少一种活性的生物活性片段。该MYC多肽可为c-Myc、N-Myc、L-Myc或S-Myc的片段。
本发明的MYC片段可含有MYC蛋白的氨基酸序列的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个或更多个连续氨基酸残基。
MYC同源物和类似物
在其他实施例中，本发明的MYC多肽是MYC蛋白或其片段的保持全长MYC蛋白的至少一种活性的同源物或类似物。
例如，本发明的MYC多肽可包括与MYC蛋白或其片段具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。在某些实施例中，该MYC多肽是c-Myc、N-Myc、L-Myc、S-Myc或其片段的同源物或类似物。
本发明的MYC多肽还包括NCBI登录号为NP_002458.2的人c-Myc多肽或其片段的功能性同源物或类似物。在某些实施例中，该c-Myc同源物或类似物含有与NCBI登录号为NP_002458.2的c-Myc多肽序列或其片段具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述百分比例如为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或者约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。
在其他实施例中，该c-Myc同源物或类似物含有长度为至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸或更多个氨基酸并且与NCBI登录号为NP_002458.2的c-Myc多肽序列或其片段具有至少50％至100％同一性的多肽序列，所述百分比例如为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或者约50％至约100％同一性中的任何其他百分比。
如本文所用，“同源物”指具有参考序列和第二序列的至少一个片段之间的氨基酸序列相似性的蛋白质或多肽。同源物可通过本领域知道的任何方法来鉴定，优选地通过使用BLAST工具将参考序列与单个第二序列或某个序列的片段或者与序列数据库进行比较来鉴定。如下文所描述，BLAST将基于同一性和相似性百分比来比较序列。
在两个或更多个序列(例如氨基酸序列)的情形中，术语“相同的”或“同一性”百分比指两个或更多个同样的序列或子序列。当两个序列在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以便获得最大对应性时，如使用下述序列比较算法中的一种或通过手工比对和目视检查所测量，如果两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定的区域上，或者当没有指定时，在整个序列上，有29％同一性，任选地有30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性)，则这两个序列是实质上相同的。任选地，同一性在长度为至少约10个氨基酸的区域上存在，或者更优选地在长度为20、50、200或更多个氨基酸的区域上存在。
对于序列比较而言，通常一个序列充当参照序列，将测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入到计算机中，如果需要的话，指定子序列坐标，以及指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。当比较两个序列的同一性时，两个序列不必需是连续的，但任何空位会带来罚分，而罚分会降低总体同一性百分比。对于blastp，默认参数是空位开放罚分＝11，空位延伸罚分＝1。对于blastn，默认参数是空位开放罚分＝5，空位延伸罚分＝2。
如本文所用，“比较窗口”包括指这样一种区段，其连续位置的数目为包括但不限于20至600、通常约50至约200、更通常为约100至约150中的任一数目，其中，某序列当与具有相同数目的连续位置的参照序列进行最佳比对后，该序列可与该参照序列进行比较。对序列进行比对以进行比较的方法是本领域熟知的。将序列进行最佳比对以便进行比较，这可例如通过以下方式来进行：通过Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J Mol Biol 48(3):443-453(1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第3期，第443-453页)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)Proc Natl AcadSci USA 85(8):2444-2448(1998年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第8期，第2444-2448页)的相似性检索方法、通过这些算法的计算机化执行(威斯康星州麦迪逊市科学路575号的遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视检查[参见例如Brent et al.,(2003)Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(Ringbou Ed)(Brent等人，2003年，《分子生物学实验手册》，约翰·威利父子出版公司，Ringbou编辑)]
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个例子是BLAST算法和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第17期，第3389-3402页)和Altschul etal.(1990)J.Mol Biol 215(3)-403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第3期，第403-410页)中有描述。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这个算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字串来鉴定高分值序列对(HSP)，所述短字串当与数据库序列中相同长度的字串进行比对时匹配或满足一定的正值的阈分数T。T称为邻近字串分数阈值(neighborhood word score threshold)(Altschul等人，出处同上)。这些初始的邻近字串命中用作启动搜索的种子以找到含有它们的更长的HSP。字串命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累加比对分数不能增加为止。对于核苷酸序列，累加分数是使用参数M(一对匹配残基的奖分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累加分数。当在以下情况时暂停字串命中在每个方向上的延伸：累加比对分数从其最大达到的值下降数量X；由于一个或多个负分数的残基比对的积累，累加分数变为零或以下；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为：字长3、期望值(E)10、BLOSUM62打分矩阵[参见Henikoff and Henikoff,(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919(Henikoff和Henikoff，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第22期，第10915-10919页)]比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于核苷酸序列，BLASTN程序使用的默认值为：字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性统计分析(参见例如Karlin andAltschul,(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90(12):5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第12期，第5873-5877页))。BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率小于约0.2、更优选小于约0.01、最优选小于约0.001，则认为该测试核酸与该参照核酸相似。
除了以上提到的序列同一性百分比，两个多肽实质上相同的另一个指示是第一多肽与针对第二多肽产生的抗体发生免疫交叉反应。因此，例如在两个多肽的差别仅在于保守置换的情况下，其中一个多肽通常与第二多肽实质上相同。
如本文所公开，合适的MYC多肽还包括本发明的MYC多肽的保守修饰变体。如本文所用，“保守修饰变体”包括对所编码的氨基酸序列的各个置换、缺失或添加，使得氨基酸被化学上相似的氨基酸代替。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域熟知的。以下八个组含有互相属保守置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(《蛋白质》)，1984年)。
MYC下游的蛋白质
在其他实施例中，本发明的能促进细胞存活和/或增殖的合适蛋白质是能促进细胞存活和/或增殖并且在MYC途径中位于MYC下游的蛋白质。本领域知道的任何下游蛋白质都适合用于本发明的方法。能促进细胞存活和/或增殖并且在MYC下游的合适蛋白质的例子包括但不限于AKT蛋白和AKT相关蛋白，如PDK-1、mTORC2、PI3K-δ。位于MYC下游的能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质还可以是PTD融合蛋白。因此，在某些实施例中，位于MYC下游的能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质是AKT-PTD融合蛋白、PTD-PDK-1融合蛋白、PTD-mTORC2融合蛋白或PTD-PI3K-δ融合蛋白。
在其他实施例中，通过抑制拮抗细胞存活和/或增殖并且在MYC途径中位于MYC的下游的蛋白质，来促进本发明的HSC的细胞存活和/或增殖。拮抗细胞存活和/或增殖并且位于MYC下游的蛋白质的例子包括但不限于pTEN、PP2A、PHLPP、CTMP。因此，在某些实施例中，通过抑制pTEN、PP2A、PHLPP和/或CTMP来促进本发明的HSC的细胞存活和/或增殖。本领域知道的任何用于抑制蛋白质和/或基因表达、活性和/或功能的方法都可使用，包括但不限于本文中公开的方法。非限制性例子包括遗传抑制剂、小分子抑制剂、RNA干扰和抗体。
全长MYC蛋白的活性
在其他实施例中，本发明的MYC蛋白或PTD-MYC融合蛋白含有具有至少一种MYC活性的全长MYC多肽、保持全长MYC蛋白的至少一种活性的MYC蛋白片段、保持全长MYC蛋白的至少一种活性的MYC蛋白同源物或保持全长MYC蛋白的至少一种活性的MYC蛋白类似物。
本发明的全长MYC蛋白具有多种活性。这类活性的例子包括但不限于转录因子活性、蛋白结合活性、核酸结合活性、细胞增殖调节活性、细胞生长调节活性、凋亡调节活性、形态发生调节活性、发育调节活性和增强的造血区室重构活性。
在一些实施例中，本发明的MYC蛋白或PTD-MYC融合蛋白具有MYC活性，该MYC活性与EPO和任选的IL-3一起从HSC产生成熟红细胞。在其他实施例中，本发明的MYC蛋白或PTD-MYC融合蛋白具有使HSC条件性无限增殖化的MYC活性。有利地，以PTD-MYC融合蛋白的形式给予MYC导致在HSC中的瞬时MYC活性。在一些实施例中，瞬时MYC活性的水平足以增强HSC向成熟红细胞的分化。另外，本发明的PTD-MYC融合蛋白可提高HSC中的MYC胞内水平，这导致HSC的扩增。这个瞬时MYC活性可避免细胞中的长时间MYC活性的潜在负面效应，如细胞生长不受控制和癌性转化。此外，PTD-MYC融合蛋白的使用使得可以在HSC中诱导MYC活性而不用对细胞进行遗传修饰。
能抑制凋亡的外源蛋白
本发明的某些方面涉及通过在含有一种或多种能抑制凋亡的重组蛋白(如外源蛋白)的培养基存在下培养本发明的红细胞或红细胞群体，来在体外维持该红细胞或红细胞群体。本发明的其他方面还涉及进一步在含有一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白的培养基存在下培养本发明的HSC。如本文所用，“能抑制凋亡”的蛋白质或多肽指其功能直接或间接减少、防止或降低与凋亡相关的过程(即程序化细胞死亡)的蛋白质或多肽。
本领域知道的任何能抑制凋亡的合适蛋白质都可使用。在一些实施例中，能抑制凋亡的蛋白质是含有一个或多个Bcl-2同源结构域的蛋白质。含有一个或多个Bcl-2同源结构域的蛋白质的例子包括但不限于Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9、A1、Bfl-1和Bcl-w。
在一些实施例中，能抑制凋亡的蛋白质是能抑制本领域知道的任何促进凋亡的内源蛋白和/或基因的蛋白质。促进凋亡的蛋白质的例子包括但不限于Bcl-2家族成员、胱天蛋白酶以及受体的TNF家族蛋白质。
在其他实施例中，通过能抑制本领域知道的促进凋亡的内源蛋白和/或基因的因子来实现凋亡的抑制。例如，该因子可以是遗传抑制剂或小分子抑制剂(如拮抗剂)。本领域知道的任何用于抑制凋亡的遗传抑制剂或小分子抑制剂都可使用。在一些实施例中，该因子能干扰促进凋亡的蛋白质的表达。例如，该因子可在翻译水平上或转录水平上干扰促进凋亡的蛋白质的表达。在一些实施例中，使用RNA干扰来干扰促进凋亡的蛋白质的表达。在其他实施例中，该因子能抑制促进凋亡的蛋白质的活性或水平。在一些实施例中，该因子直接作用于促进凋亡的蛋白质。例如，该因子可结合到促进凋亡的蛋白质并抑制其活性。因此，在某些实施例中，该因子是结合到抑制凋亡的蛋白质并破坏其天然功能的抗体或小分子。
在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白是一种或多种含有一个或多个Bcl-2同源结构域的蛋白质。在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白还包含蛋白转导结构域(PTD)。在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白是PTD-Bcl-2融合蛋白。
Bcl-2
本发明的Bcl-2多肽包括但不限于任何具有Bcl-2蛋白的活性的多肽或其片段。
如本文所用，“Bcl-2”、“Bcl-2多肽”和“Bcl-2蛋白”可互换使用，指属于Bcl-2蛋白家族的具有一个或多个和/或全部Bcl-2同源(BH)结构域的成员的蛋白质，所述Bcl-2同源(BH)结构域如但不限于BH1、BH2、BH3和BH4。bcl-2蛋白家族的成员通常形成异型二聚体或同型二聚体，并起到凋亡的调节剂的作用。在某些优选的实施例中，本发明的Bcl-2多肽具有抗凋亡活性和/或在HSC的条件性无限增殖化的过程中有用的活性。
如本文所描述，与在Bcl-2不存在下保持相应的红细胞群体相比，将外源Bcl-2添加到红细胞群体可延长红细胞在体外保持生存的时间长度，可增加红细胞随时间推移保持活力的百分比，和/或可延迟和/或减少在体外随时间推移一种或多种红细胞功能特性的损失。在一些实施例中，外源Bcl-2是添加到红细胞贮存培养基。该一种或多种功能特性可包括但不限于以下一者或多者：携氧能力、血红蛋白的量、表达的血红蛋白的类型(成人血红蛋白还是胎儿血红蛋白)、在表面上表达的转铁蛋白受体的水平、或者一种或多种成熟红细胞标志物。
在另一个实施例中，与在Bcl-2不存在下进行的维持相比，在从HSC产生红细胞的最后几个阶段中从外源或内源来源提供的Bcl-2的瞬时上调，可延长红细胞在体外保持活力的时间长度，可增加红细胞随时间推移保持活力的百分比，和/或可延迟和/或减少在体外随时间推移一种或多种红细胞功能特性的损失。在一些实施例中，在从HSC产生红细胞的最后几个阶段中从外源或内源来源提供的Bcl-2的瞬时上调，是被设计来增强红细胞在红细胞贮存培养基中的维持。
在另一个实施例中，本发明涉及含有Bcl-2的红细胞贮存培养基。
本发明的PTD-Bcl-2融合蛋白使得可以通过Bcl-2的外源添加而提高HSC中的Bcl-2活性，而不需要在HSC中过量表达内源Bcl-2或通过对HSC的遗传操纵来重组表达Bcl-2。
本发明的Bcl-2多肽包括但不限于全长Bcl-2蛋白、保持全长Bcl-2蛋白的活性的片段、其同源物及其类似物。在一些实施例中，保持全长Bcl-2蛋白的活性的Bcl-2片段包括已被缺失了未结构化的(unstructured)环结构域的截短形式的Bcl-2(Anderson,M.,etal.(1999).Refolding,purification and characterization of a loop deletionmutant of human Bcl-2 from bacterial inclusion bodies.Prot Expr.Purif.15,162-70(Anderson,M.等人，1999年，“来自细菌内含体的人Bcl-2的环缺失突变体的再折叠、纯化和表征”，《蛋白质表达与纯化》，第15卷，第162-70页))。本发明的Bcl-2多肽可通过本领域知道的任何合适的方法产生。例如，Bcl-2多肽可从天然来源纯化，可重组表达或者可化学合成。
Bcl-2蛋白
适合在本发明的任何方法中使用的全长Bcl-2蛋白的例子包括但不限于Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9、Bcl-2相关蛋白A1、Bfl-1和Bcl-w。
在某些优选的实施例中，Bcl-2多肽是已被缺失了未结构化的环结构域的全长人Bcl-2多肽。该人Bcl-2多肽可具有以下特征中的一者或多者：该多肽可为239个氨基酸的聚合物，该多肽可具有大约26.3kDa的分子量，或者该多肽可含有至少一个Bcl-2同源性(BH)结构域，如BH1、BH2、BH3和BH4。优选地，人Bcl-2多肽是NCBI登录号为NP_000624.2的Bcl-2多肽。此外，本发明的Bcl-2多肽可为未进行任何翻译后修饰的Bcl-2多肽。作为另一种选择，本发明的Bcl-2多肽可为已进行翻译后修饰的Bcl-2多肽。
生物活性Bcl-2片段
在其他实施例中，本发明的Bcl-2多肽是全长Bcl-2蛋白的保持全长Bcl-2蛋白的至少一种活性的生物活性片段。该Bcl-2多肽可为Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9、Bcl-2相关蛋白A1、Bfl-1或Bcl-w的片段。
本发明的Bcl-2片段可含有Bcl-2蛋白的氨基酸序列的至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少210个、至少220个、至少230个或更多个连续氨基酸残基。
Bcl-2同源物和类似物
在其他实施例中，本发明Bcl-2多肽是Bcl-2蛋白或其片段的同源物或类似物。例如，本发明的Bcl-2多肽可包括与Bcl-2蛋白或其片段具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或者约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。在某些实施例中，该Bcl-2多肽是Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9、Bcl-2相关蛋白A1、Bfl-1、Bcl-w或它们的片段的同源物或类似物。
本发明的Bcl-2多肽还包括NCBI登录号为NP_00624.2的人Bcl-2多肽或其片段的功能性同源物或类似物。在某些实施例中，该Bcl-2同源物或类似物含有与NCBI登录号为NP_00624.2的Bcl-2多肽序列或其片段具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或者约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。
在其他实施例中，该Bcl-2同源物或类似物含有长度为至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸、至少100个氨基酸、至少110个氨基酸、至少120个氨基酸、至少130个氨基酸、至少140个氨基酸、至少150个氨基酸、至少160个氨基酸、至少170个氨基酸、至少180个氨基酸、至少190个氨基酸、至少200个氨基酸、至少210个氨基酸、至少220个氨基酸、至少230个氨基酸或更多个氨基酸并且与NCBI登录号为NP_00624.2的Bcl-2多肽或其片段具有至少50％至100％同一性的多肽序列，所述同一性百分比例如为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或者约50％至约100％同一性中的任何其他百分比。
如本文中所公开，合适的Bcl-2多肽还包括本发明的Bcl-2多肽的保守修饰变体。
促进凋亡的Bcl-2同源物
在一些实施例中，通过抑制含有一个或多个BH结构域并且促进凋亡的蛋白质来抑制凋亡。含有BH结构域的促进凋亡的蛋白质的例子包括但不限于Bcl-Xs、BIM、PUMA、NOXA、NOXA-2、DIVA、BAK、BAX、BIK、BAD、BID和EGL-1。因此，在某些实施例中，通过抑制Bcl-Xs、BIM、PUMA、NOXA、NOXA-2、DIVA、BAK、BAX、BIK、BAD、BID和/或EGL-1来抑制凋亡。本领域知道的任何用于抑制蛋白质和/或基因表达、活性和/或功能的方法都可使用，包括但不限于本文中公开的方法。非限制性例子包括遗传抑制剂、小分子抑制剂、RNA干扰和抗体。
全长Bcl-2蛋白的活性
在其他实施例中，本发明的Bcl-2蛋白或PTD-Bcl-2融合蛋白含有具有至少一种Bcl-2活性的全长Bcl-2多肽、保持全长Bcl-2蛋白的至少一种活性的Bcl-2蛋白片段、保持全长Bcl-2蛋白的至少一种活性的Bcl-2蛋白同源物或保持全长Bcl-2蛋白的至少一种活性的Bcl-2蛋白类似物。
本发明的全长Bcl-2蛋白具有多种活性。这类活性的例子包括但不限于凋亡调节活性、细胞存活调节活性、蛋白质结合活性、线粒体膜渗透性调节活性、胱天蛋白酶调节活性、电压依赖性阴离子通道调节活性、G2检查点调节活性、外线粒体膜通道(VDAC)调节活性、线粒体膜电势调节活性、蛋白质通道活性和细胞色素C调节活性。
在一些实施例中，本发明的Bcl-2蛋白或PTD-Bcl-2融合蛋白具有对以下方面有帮助的Bcl-2活性：从HSC产生成熟红细胞，红细胞或红细胞群体的维持，和/或HSC的无限增殖化。有利地，以PTD-Bcl-2融合蛋白的形式给予Bcl-2导致在HSC中的瞬时Bcl-2活性。这个瞬时Bcl-2活性可避免细胞中的长时间的Bcl-2活性的任何潜在负面效应。此外，PTD-Bcl-2融合蛋白的使用使得可以在红细胞和/或HSC中诱导Bcl-2活性而不用对细胞进行遗传修饰，并且使得可以在体外维持无核成熟红细胞。
目的蛋白
本发明的某些方面涉及在体外从HSC产生红细胞群体；红细胞或红细胞群体的体外维持；和/或将红细胞给予有需要的受试者，其中该红细胞或红细胞群体包括一种或多种目的蛋白。本发明的各方面还包括包含一种或多种目的蛋白的红细胞群体，以及包含这种红细胞群体的药物组合物。在一些实施例中，该一种或多种目的蛋白还包含蛋白转导结构域(PTD)。在一些实施例中，该目的蛋白是PTD-目的蛋白的融合蛋白。
目的蛋白可包括但不限于一种或多种生长因子、激素或其他可用于预防、诊断和/或治疗一种或多种疾病或失调的多肽。使用本发明的含有一种或多种目的蛋白的红细胞或红细胞群体是有利的，原因有多个，包括但不限于以下一者或多者：红细胞及它们将递送的编码蛋白的瞬时性质；完全成熟的无核细胞中遗传物质的缺乏；以及被来自个体发育的淋巴样区室耐受的“自我”血管的使用。
在一些实施例中，目的蛋白先在体外与红细胞膜缔合，然后再给予受试者(例如通过输注给予)。在一些实施例中，这种缔合是通过共价键或非共价键介导的。这种缔合的非限制性例子可包括巯基键和抗体-表位结合等。
在一些实施例中，目的蛋白被设置成通过掺入到体外产生的红细胞的外表面膜中来给予。在一些实施例中，在产生红细胞的过程中使用的HSC被工程改造成表达和/或过量表达一种或多种目的蛋白。任选地，目的蛋白可被工程改造成具有输出序列(exportsequence)、质膜保持元件或蛋白酶切割位点中的一者或多者。
在一些实施例中，目的蛋白被设置成通过使用包含蛋白转导结构域的融合蛋白掺入到本发明的红细胞或HSC中来给予。制备和使用这种PTD-目的蛋白融合蛋白的方法是本领域知道的并在本文中进行了描述，包括与用于Myc和Bcl-2的那些方法相似的方法等。
在一些实施例中，HSC是条件性无限增殖化的HSC。在一些实施例中，条件性无限增殖化的HSC是蛋白质转导的HSC，是通过使用诱导型转基因进行条件性无限增殖化的，和/或是通过一种或多种能促进无限增殖化的内源和/或外源基因的瞬时过量表达来进行无限增殖化的。能促进无限增殖化的基因是本领域熟知的(例如美国专利申请公开No.US 2007/0116691)。
在一些实施例中，条件性无限增殖化的HSC是万能供血者HSC。在一些实施例中，条件性无限增殖化的HSC来自稀有血型，或者来自需要治疗的个体。在一些实施例中，该个体可能遭受稀罕疾病、具有稀有血液表型或者难以找到同种异型匹配的血液表型。
编码目的蛋白的载体的构建
在本发明的一些方面，使用本领域知道的任何合适的对HSC进行转基因修饰的方法(例如Riviere et al.,Blood.2012 Feb 2；119(5):1107-16(Riviere等人，《血液》，2012年2月2日，第119卷，第2期，第1107-16页)，包括但不限于本文中公开的那些方法，来将目的蛋白掺入到本发明的HSC中。例如，可采用与本文描述的那些方法类似的方法将一种或多种目的蛋白掺入到HSC中以产生转基因的条件性无限增殖化的HSC(例如参见下文的“HSC细胞系”一节及实例部分)。
在一些实施例中，目的蛋白将由处于载体(如病毒载体)背景中的cDNA编码。用于将编码目的蛋白的cDNA掺入到病毒载体中的方法是本领域知道的，包括但不限于本文中描述的那些方法。
在一些实施例中，本发明的红细胞群体包含一种或多种被设计成在体内输注后从红细胞的表面上释放出来的目的蛋白。在一些实施例中，该载体还将包含与目的蛋白连接和/或融合的输出序列、质膜保持元件或蛋白酶切割位点中的一者或多者。
蛋白质输出序列是本领域熟知的。在一些实施例中，目的蛋白还将包含内质网信号序列，任选地在N末端。在一些实施例中，目的蛋白是Bcl-2。
质膜保持元件是本领域熟知的，包括但不限于以下一者或多者：GPI连接蛋白的胞质区，或者任选地一种或多种红细胞跨膜蛋白如CD40、CD25、IgG、FcRN、CD8和/或CD16。
蛋白酶切割位点是本领域熟知的。在一些实施例中，质膜保持元件可包括IgG的与目的蛋白连接的跨膜部分，其中该IgG跨膜和/或连接部分包括一个或多个IgG切割位点，任选地被哺乳动物蛋白酶识别。可选择蛋白酶切割位点以便容易在体内释放目的蛋白，任选地通过选择正常(内源)血清蛋白酶的底物。
在一些实施例中，红细胞群体包含一种或多种被设计成在体内输注后保持在红细胞的表面上的目的蛋白。因此，在一些实施例中，该载体包括输出序列和质膜保持元件中的一者或多者。在一些实施例中，融合蛋白的胞质部分和/或跨膜部分可源自诸如但不限于以下的来源：编码一种或多种红细胞跨膜蛋白如但不限于CD40、CD25、IgG、FcRN、CD8和/或CD16等的cDNA。
在一些实施例中，该红细胞群体包括一种或多种这样的目的蛋白质，其被设计成维持在红细胞的表面上，并被设置成在体内输注前在携带有效负载期间结合蛋白质或其他化合物。这在红细胞的有效负载选项方面容许更多的灵活性，包括避免潜在的毒性问题和/或对用于产生红细胞的HSC进行遗传工程碰到的困难。在一些实施例中，该载体还将包含输出序列、质膜保持元件或者结合位点或连键部分中的一者或多者。在一些实施例中，结合位点或连键部分可包括但不限于巯基部分、生物素-亲和素连键的一部分以及可逆和非可逆的交联剂(例如DSS、DSST、PEG等)。
在一些实施例中，明确地设想到在本发明的红细胞或红细胞群体中包含一种或多种目的蛋白。例如，HSC可被修饰成掺入寻靶分子、诱饵受体和/或蛋白质有效负载等。
示例性的目的蛋白
尽管并非旨在进行限制，本发明提供了目的蛋白及其用途的多个例子。在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以瞬时递送造血生长因子和分化因子，包括但不限于EPO、TPO和GM-CSF；或者可被利用来动员HSC的因子，如G-CSF。在一些实施例中，可使用能导致目的蛋白维持在红细胞的表面上的转基因方法，将靶标在造血区室中的目的蛋白掺入到红细胞中，从而限制目的蛋白被摄入到其他组织区室中，并且使得可以更快速地从系统清除。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以在患有急性炎性病症的患者体内递送能影响炎症途径的诱饵受体，包括但不限于IL-R-Fc、IL6R-Fc、TNFaR-FC、IFNaR-Fc和BAFFR-Fc。红细胞可被设计成具有这些被掺入到它们的质膜中的受体中的一者或多者。尽管不想受任何理论的约束，受体可能能够结合它们的关联配体并将这些配体从循环中移除，从而降低这些循环的炎症介质并改善急性炎性病症。在一些实施例中，可使用类似的诱饵受体方法来从血液中移除其他部分，包括例如病毒颗粒。
在一些实施例中，使用类似的方法，红细胞缔合的目的蛋白使得可以递送能竞争性地结合到与细胞因子风暴(cytokine storm)相关的受体的诱饵配体，包括但不限于IL-R-Fc、IL6R-Fc、TNFaR-FC、IFNaR-Fc和BAFFR-Fc，并且减轻与细胞因子风暴相关的临床征候。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以递送蛋白质编码毒素，包括但不限于霍乱毒素、志贺毒素、蓖麻毒素和白喉毒素。这种毒性有效负载可被设计用于治疗癌症，如高度血管化的实体瘤。在一些实施例中，目的蛋白可被工程改造成在这些红细胞上表达。在一些实施例中，HSC被工程改造成表达具有这样的外部部分的跨膜蛋白，该外部部分被设置成具有共价或非共价结合位点。例如，该外部部分可具有被设计用来形成二硫键、亲和素-生物素连键或任何其他容许期望的有效负载(例如蛋白质编码毒素，和任选地其他期望的有效负载)以后发生缔合的连键的巯基部分。例如，还可使用这些方法中的一者或多者将红细胞进行工程改造，以将膜结合的血管生成抑制剂递送到肿瘤的部位。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以将红细胞靶向目的组织和/或细胞。例如，在将红细胞送到肿瘤或送到肿瘤细胞方面，靶向是有用的，除此之外还有其他用途。在一些实施例中，可通过多种方法来实现靶向，包括但不限于在红细胞的表面上表达标志物、受体、配体和抗体，或者通过将这些部分中的一者或多者连接到红细胞的表面上。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以将促血管生成因子和/或淋巴血管生成因子递送到受血管调节障碍(如但不限于冻伤、癌症相关的血管收缩或风湿性关节等)影响的组织。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以在涉及血管收缩的急性病例中递送血管舒张肽，所述急性病例包括但不限于在急性心梗期间的血管收缩、分娩期间的助产用途以及急性和/或持续性偏头疼等。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以递送抗原以刺激终生免疫。该抗原可通过经遗传修饰的红细胞递送，该经遗传修饰的红细胞被设计用来将目的抗原(蛋白质)连同TLR配体一起在红细胞上呈递。
在一些实施例中，红细胞缔合的目的蛋白使得可以递送一种或多种目的蛋白以减轻血凝风险高的患者体内的血凝块形成。在一些实施例中，对血凝风险高的患者的输血可包括这样的红细胞，其具有对栓塞团块中的纤维化组织有特异性的膜结合蛋白酶，并且任选地具有靶向这类位置的寻靶分子。类似的方法可用于肺栓塞风险高的患者。
在一些实施例中，目的蛋白不包括Myc或Bcl-2。
蛋白转导结构域
如本文所用，术语“肽转导结构域”、“蛋白转导结构域”和“PTD”可互换使用，指蛋白质的能促进蛋白质渗透到哺乳动物细胞和/或哺乳动物细胞内的区室中的肽序列或结构域。在一个非限制性例子中，PTD促进偶联的肽和/或蛋白质渗透到细胞的细胞核中。
可通过任何本领域知道的分离蛋白质结构域的方法，如标准的分子生物学和生物化学技术，从含有PTD的蛋白质分离本发明的PTD。作为另一种选择，可合成本发明的PTD。本发明的合适的PTD可以是长度约8至约30个氨基酸残基，并且富含碱性氨基酸残基，如精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)。在一些实施例中，PTD可具有富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)并且任选地以α螺旋结构排列的短肽序列。
如本文所公开，本发明的PTD偶联(例如融合、缀合、交联等)到肽和/或蛋白质，以利于该肽和/或蛋白质渗透到哺乳动物细胞和/或哺乳动物细胞内的区室中。例如，在某些实施例中，本发明的PTD偶联到MYC蛋白和/或Bcl-2蛋白和/或目的蛋白。
适合在本发明的任何方法中使用的蛋白转导结构域包括本领域知道的任何PTD(例如美国专利公开No.US 2007/0116691和US 2010/0055129)。例如，合适的PTD可获自或源自蛋白质，包括但不限于慢病毒TAT(转录反式激活蛋白)蛋白、慢病毒VPR蛋白、疱疹病毒VP22蛋白和同源异型蛋白。
获自或源自慢病毒TAT蛋白的合适的PTD的例子包括但不限于来自含TAT蛋白的病毒的TAT蛋白的PTD，来自含TAT蛋白的慢病毒的TAT蛋白的PTD，来自HIV-1 TAT蛋白的PTD，来自HIV-2 TAT蛋白的PTD，来自SIV TAT蛋白的PTD，来自灵长类动物慢病毒TAT蛋白的PTD，来自绵羊慢病毒TAT蛋白的PTD，来自牛慢病毒TAT蛋白的PTD，来自马慢病毒TAT蛋白的PTD，来自猫慢病毒TAT蛋白的PTD，来自HIV、SIV、灵长类动物慢病毒、绵羊慢病毒、牛慢病毒、马慢病毒或猫慢病毒的亚变种的TAT蛋白的PTD，以及它们的同源物。在某些实施例中，PTD是HIV TAT蛋白的氨基酸残基48-57(TAT[48-57])。在其他实施例中，PTD是HIV TAT蛋白的氨基酸残基57-48(TAT[57-48])。
可获自或源自慢病毒VPR蛋白的合适的PTD的例子包括但不限于来自含VPR蛋白的病毒的VPR蛋白的PTD，来自含VPR蛋白的慢病毒的VPR蛋白的PTD，来自HIV-1 VPR蛋白的PTD，来自HIV-2 VPR蛋白的PTD，来自SIV VPR蛋白的PTD，来自灵长类动物慢病毒VPR蛋白的PTD，来自绵羊慢病毒VPR蛋白的PTD，来自牛慢病毒VPR蛋白的PTD，来自马慢病毒VPR蛋白的PTD，来自猫慢病毒VPR蛋白的PTD，来自HIV、SIV、灵长类动物慢病毒、绵羊慢病毒、牛慢病毒、马慢病毒或猫慢病毒的亚变种的VPR蛋白的PTD，以及它们的同源物。
可获自或源自疱疹病毒VP22蛋白的合适的PTD的例子包括但不限于来自人疱疹病毒1(HSV-1)VP22蛋白的PTD、来自人疱疹病毒2(HSV-2)VP22蛋白的PTD、来自BHV-1VP22蛋白的PTD、来自鹦鹉(Psittacid)疱疹病毒1VP22蛋白的PTD、来自马疱疹病毒1VP22蛋白的PTD、来自马疱疹病毒4VP22蛋白的PTD、来自格利德原鸡属(Gallid)疱疹病毒2VP22蛋白的PTD、来自水痘-带状疱疹病毒VP22蛋白的PTD，以及它们的同源物。
可获自或源自同源异型结构域转录因子的合适的PTD的例子包括但不限于来自果蝇(Drosophila)触角足(Antp)蛋白的同源异型结构域(HD)、来自果蝇(Drosophila)Fushitarazu(Ftz)蛋白的HD、来自果蝇(Drosophila)Engrailed(En)蛋白的HD、来自鸡Engrailed-2蛋白的HD、来自哺乳动物同源异型蛋白的HD、来自人同源异型蛋白的HD、来自人Hox-A5同源异型蛋白的HD、来自人Hox-A4同源异型蛋白的HD、来自人Hox-B5同源异型蛋白的HD、来自人Hox-B6同源异型蛋白的HD、来自人Hox-B7同源异型蛋白的HD、来自人HOX-D3同源异型蛋白的HD、来自人GOX同源异型蛋白的HD、来自人MOX-2同源异型蛋白的HD、来自人Hoxc-8同源异型蛋白的HD、来自人Islet-1(Isl-1)同源异型蛋白的HD，以及它们的同源物。
另外，合适的PTD包括但不限于源自Kaposi-FGF(K-FGF或FGF-4)的PTD、源自FGF-2的PTD、源自FGF-1的PTD、以及源自蛋白质的FGF家族的其他成员的PTD。
其他合适的PTD包括合成的PTD(例如Beerens,AMJ et al.Curr GeneTher.2003Oct；3(5):486-94)(Beerens,AMJ等人，《当代基因疗法》，2003年10月，第3卷，第5期，第486-94页)。在一些实施例中，合成的PTD可包括EPTD，其是一种经优化的蛋白转导结构域(YARAAARQARA)(Ho,A.et al.,Cancer Res.(2001)61:474-477)(Ho,A.等人，《癌症研究》，2001年，第61卷，第474-477页)。
另外合适的PTD包括但不限于CHARIOTTM肽(艾跃生物公司(Active Motif)，美国加州卡尔斯巴德市(Carlsbad,CA))。
在一些实施例中，本发明的PTD通过重组法产生，而在其他实施例中，PTD通过合成法产生或者从天然来源纯化得到。
PTD融合蛋白修饰
在一些实施例中，本发明的PTD融合蛋白含有一个或多个将PTD与多肽连接的分子，所述多肽例如本发明的能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白、本发明的能抑制凋亡的外源蛋白或者本发明的目的蛋白。在另外的实施例中，该一个或多个连接分子是氨基酸肽。
本发明的PTD融合蛋白还可含有至少一个有利于融合蛋白的纯化的氨基酸序列。例如，PTD融合蛋白可含有蛋白质标签如聚组氨酸标签。作为另一种选择或除此之外，PTD-MYC融合蛋白可含有表位标签，如V5表位标签。
因此，在某些实施例中，本发明的PTD融合蛋白还含有聚组氨酸标签。在一些实施例中，聚组氨酸标签是6组氨酸标签。在一些实施例中，组氨酸标签含有序列HHHHHH。另外，可通过本领域知道的任何合适的方法，将组氨酸标签添加到本发明的PTD融合蛋白。例如，可将PTD融合蛋白序列克隆到编码聚组氨酸标签的表达载体中。作为另一种选择，可通过PCR添加聚组氨酸标签(即，PCR引物含有聚组氨酸序列)。
此外，本发明的PTD融合蛋白还可含有至少一个蛋白质标签。在一些实施例中，该至少一个蛋白质标签是表位标签。优选地，该表位标签是V5表位标签。在一些实施例中，V5表位标签含有氨基酸序列：GKPIPNPLLGLDST，而在其他实施例中，V5表位标签含有氨基酸序列：IPNPLLGLD。氨基酸可为D构型或L构型。在一些实施例中，第一多个氨基酸为D构型，第二多个氨基酸为L构型。另外，可通过本领域知道的任何合适的方法，将本发明的V5表位标签添加到本发明的PTD融合蛋白。例如，可将PTD融合蛋白序列克隆到编码V5表位标签的表达载体中。作为另一种选择，可通过PCR添加V5表位标签(即，PCR引物含有V5表位序列)。
在某些优选的实施例中，本发明的PTD融合蛋白还含有聚组氨酸标签和表位标签。优选地，PTD融合蛋白含有6-组氨酸标签和V5表位标签。
PTD融合蛋白的构建
在一些实施例中，本发明的PTD融合蛋白可通过本领域知道的任何合适的方法构建(例如美国专利申请公开No.US 2010/0055129)。
在一个非限制性的例子中，编码本发明的能促进细胞存活和/或增殖的PTD-重组蛋白(例如PTD-MYC融合蛋白、PTD-ICN-1融合蛋白等)的核酸序列可通过PCR产生。在某些实施例中，编码PTD-MYC融合蛋白的核酸序列通过PCR产生。这可通过设计MYC序列的正向引物和该MYC序列的反向引物来完成，该正向引物含有框内PTD序列，如TAT的RKKRRQRRR 9氨基酸序列，该反向序列被设计来移除终止密码子。然后可将使用这种引物进行PCR反应得到的PCR产物克隆到本领域知道的任何合适的表达载体中。
在一个非限制性的例子中，编码本发明的能抑制凋亡的PTD-外源蛋白(例如PTD-Bcl-2融合蛋白、PTD-Bcl-w融合蛋白、PTD-Bcl-X融合蛋白、PTD-Bcl-Xl融合蛋白、PTD-Mcl-1融合蛋白等)的核酸序列可通过PCR产生。在某些实施例中，编码PTD-Bcl-2融合蛋白的核酸序列通过PCR产生。这可通过设计Bcl-2序列的正向引物和该Bcl-2序列的反向引物来完成，该正向引物含有框内PTD序列，如TAT的RKKRRQRRR 9氨基酸序列，该反向序列被设计来移除终止密码子。然后可将使用这种引物进行PCR反应得到的PCR产物克隆到本领域知道的任何合适的表达载体中。可使用定点诱变试剂盒从BCL-2编码序列移除Bcl-2未结构化的环。
在一个非限制性的例子中，编码本发明的PTD-目的蛋白融合蛋白的核酸序列可通过PCR产生。这可通过设计目的蛋白序列的正向引物和该目的蛋白序列的反向引物来完成，该正向引物含有框内PTD序列，如TAT的RKKRRQRRR 9氨基酸序列，该反向序列被设计来移除终止密码子。然后可将使用这种引物进行PCR反应得到的PCR产物克隆到本领域知道的任何合适的表达载体中。
造血干细胞
本发明的其他方面涉及通过用EPO、任选的IL-3、及一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白或其生物活性片段培养造血干细胞(HSC)(其任选地经条件性无限增殖化和/或经遗传工程改造以包含一种或多种目的蛋白)，来在体外产生红细胞群体。这个过程可在饲养细胞和血清存在或不存在下进行。在某些优选的实施例中，该过程在饲养细胞和/或血清不存在下进行。
适用于本发明方法的HSC可从胚胎干(ES)细胞和/或诱导多能干细胞(iPS)细胞产生。本领域知道的任何从ES细胞和/或iPS细胞产生HSC的方法都可使用(例如Keller,G.Genes Dev.2005 19:1129-1155(Keller,G.，《基因与发育》，2005年，第19卷，第1129-1155页)；和Papapetrou Sadelain,F1000 Med Rep.2010 Jun 16；2(PapapetrouSadelain，《F1000医学报道》，2010年6月16日，第2卷))。例如，通过模仿早期胚胎中的造血定向来引导ES细胞培养物的造血发育(例如Keller,G.Genes Dev.2005 19:1129-1155(Keller,G.，《基因与发育》，2005年，第19卷，第1129-1155页))，从ES细胞产生HSC。
另外，适用于本发明方法的HSC可通过本领域知道的任何合适的技术获得。例如，HSC可存在于供者的骨髓，包括股骨、髋骨、肋骨、胸骨和其他骨骼。可使用本领域知道的任何用于提取或收获骨髓细胞的方法。在一个非限制性例子中，可使用针和注射器从髋骨的骨髓腔抽吸细胞，来从该骨髓腔直接获得HSC。可通过进行多次的小量抽吸，从髋骨获得大量的骨髓。
作为另一种选择，可从供者的血液中存在的外周血细胞获得合适的HSC，任选地在用能诱导HSC从供者的骨髓区室中释放的细胞因子如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)预处理后获得。还可从为了富集HSC而进行了单采血液成分术的外周血获得HSC。本领域知道的任何单采血液成分术都可使用。在某些实施例中，单采血液成分术是白细胞单采术。
另外，可从脐带血、胎盘和动员外周血获得合适的HSC。对于实验目的而言，动物的胎儿肝脏、胎儿脾脏和AGM(主动脉-性腺-中肾区)也是HSC的有用来源。另外，可从这样的来源获取HSC，该来源是从供者的骨髓、外周血、脐带或胎儿组织获得HSC。
在一些实施例中，从人脐带或胎盘获得HSC。另一种可以利用的HSC来源是动物胎儿的发育中的造血组织。在人类中，到约12至18周为止可在人胎儿的循环血中发现HSC。在一些实施例中，人HSC从任何来源获得，例如A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+和AB-血型的供者的骨髓、脐带、外周血或胎儿血组织。在其他实施例中，人HSC从任何来源获得，例如万能供血者或具有稀有血型的供者的骨髓、脐带、外周血或胎儿血组织。稀有血型是本领域知道的，包括但不限于Oh、CDE/CDE、CdE/CdE、CwD-/CwD-、-D-/-D-、Rhnull、Rh:-51、LW(a-b+)、LW(a-b-)、S-s-U-、S-s-U(+)、pp、Pk、Lu(a+b-)、Lu(a-b-)、Kp(a+b-)、Kp(a-b-)、Js(a+b-)、Ko、K:-11、Fy(a-b-)、Jk(a-b-)、Di(b-)、I-、Yt(a-)、Sc:-1、Co(a-)、Co(a-b-)、Do(a-)、Vel-、Ge-、Lan-、Lan(+)、Gy(a-)、Hy-、At(a-)、Jr(a-)、In(b-)、Tc(a-)、Cr(a-)、Er(a-)、Ok(a-)、JMH-和En(a-)。
在其他实施例中，人HSC从任何来源获得，例如具有自身免疫性失调、免疫缺陷或任何其他会得益于HSC移植和/或输血的疾病或失调的供者的骨髓、脐带、外周血或胎儿血组织。这种供者也可以是接受者。有利地，从这种供者获得的HSC可用于个性化HSC和/或血液疗法。
在一个非限制性例子中，可通过对干细胞供者进行麻醉，用针穿刺髂后上棘并用注射器进行骨髓细胞抽吸，来获得人HSC。在另一个非限制性例子中，可从供者的外周血获得HSC，其中在从外周血收获干细胞前几天，给供者注射G-CSF以将干细胞动员到外周血。
因此，在一些实施例中，从自体供者获得HSC，自体供者即该供者也将是HSC和/或源自这种HSC的红细胞的接受者。本领域知道的和本文描述的任何方法都可用于从自体供者获得HSC。然后将HSC和/或任何从其中衍生或产生的治疗产物如红细胞移植、给予和/或输注回该原始供者。类似地，可从同种异体供者如需要HSC移植和/或输血的受试者的兄弟姐妹、父母或其他亲戚获得HSC。在一个非限制性例子中，通过从不同的血型或主要组织相容性复合体(MHC)或人白细胞抗原(HLA)匹配来源收集HSC来获得同种异体HSC。可在供血后的任何时间，如几天后、几个月后或者甚至几年后，进行自体和/或同种异体HSC移植和/或输血。在需要HSC和/或血液移植和/或输血的受试者对移植和/或输注来自任何其他供者(包括同种异体供血者和/或万能供血者)的HSC和/或血液会有负面的、有害的或有毒的反应的情况中，自体供血可以是特别有用的。可得益于自体供血和/或同种异体供血的患者的例子是本领域熟知的，包括但不限于那些遭受自身免疫失调、血液疾病或失调、免疫疾病或失调或者其他相关疾病或病症的患者。
从例如骨髓、外周血或脐带血获得的细胞通常在提取或收获后进行加工。本领域知道的任何用于加工提取的或收获的细胞的方法都可使用。加工步骤的例子包括但不限于过滤，离心，筛查血液病理，筛查病毒和/或微生物感染，红血球去除，T细胞去除(以减少同种异体干细胞移植接受者体内的移植物抗宿主病的发病率)，体积减少，细胞分离，在培养基或适合后续加工的缓冲液中将细胞重新悬浮，干细胞与非干细胞分离(例如干细胞富集)，用生长因子、细胞因子和/或激素进行离体或体外干细胞扩增，以及冻存。
可以使用本领域知道的任何合适的干细胞富集方法。干细胞富集方法的例子包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)和磁性激活细胞分选(MACS)。
因此，在某些实施例中，适合在本发明的方法中使用的HSC是人HSC。
从供者获得的HSC可通过本领域知道的任何合适的干细胞鉴定和富集方法进行鉴定和/或富集，如通过采用某些表型标志物或基因型标志物进行。例如，在一些实施例中，HSC的鉴定包括使用与HSC相关或具体地讲与系统的终末分化细胞相关的细胞表面标志物。合适的表面标志物可包括但不限于以下一者或多者：c-kit、Sca-1、CD4、CD34、CD38、Thy1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、CD135、ABCG2、NK1.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCP1、内皮唾液黏蛋白(Endomucin)、Gr-1、CD46、Mac-1、Thy1.1及受体的信号转导淋巴细胞激活分子(SLAM)家族。SLAM受体的例子包括但不限于CD150、CD48和CD244。
另外，可通过本领域知道的任何合适的方法，包括但不限于荧光激活细胞分选(FACS)和磁性激活细胞分选(MACS)，将从供者获得的HSC与非干细胞分离。
在一个非限制性例子中，将人外周血细胞与识别c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thy1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCP1、内皮唾液黏蛋白或Gr-1的抗体一起温育。将CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119和Gr-1的抗体与磁珠缀合。将表达CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119或Gr-1的细胞保持在被配备用来捕集磁珠和与磁珠缀合抗体连接的细胞的柱子中。对不被MACS柱捕获的细胞进行FACS分析。将c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thy1的抗体与本领域知道的荧光材料缀合。借助于与CD34+、CD38低/-、c-kit-/低、Thy1+的细胞缔合的荧光抗体的类型，将这些细胞与样品的其余部分分离。这些细胞作为适用于本发明的任何方法的人长期HSC来提供。
在另一个非限制性例子中，将从受试者获得的细胞用与以上所描述相同的一组磁珠缀合抗体(抗CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-1l9或Gr-l中的一者或多者的抗体)和荧光缀合的CD150、CD244和/或CD48抗体进行标记。在从样品移出被磁珠缀合抗体捕获的细胞后，通过FACS分析样品，将CD150+、CD244-和CD48-细胞作为长期HSC保留。
在一些实施例中，在本发明的方法中采用的HSC含有以下标志物中的一者或多者：c-kit+、Sca-l+、CD34低/-、CD38+、Thy1+/低、CD34+、CD38低/-、c-kit-/低和/或Thy1+。在一些实施例中，在本发明的方法中采用的HSC缺乏以下标志物中的一者或多者：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-1l9和/或Gr-l。在某些实施例中，本发明的方法中采用的HSC为A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+或AB-型。
作为另一种选择，合适的HSC可从非人来源获得。合适的非人HSC可从非人动物的股骨、髋骨、肋骨、胸骨和其他骨骼获得，所述非人动物包括但不限于实验动物/研究动物、啮齿动物、宠物、牲畜、农场动物、劳役动物、驮运动物、稀有或濒危物种、竞赛动物和动物园动物。合适的非人动物的更多的例子包括但不限于猴子、灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡。例如，可通过将鼠骨髓细胞与识别细胞表面分子的抗体一起温育来从该骨髓细胞获得HSC，所述细胞表面分子例如以下一者或多者：c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thy1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCP1、内皮唾液黏蛋白或Gr-1。将CD2、CD3、CD4、CD5、CDS、NK1.I、B220、Ter-119和Gr-1的抗体与磁珠缀合。在MACS设备中，在其表面上携带CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119或Gr-1的细胞被保持在被配备用来捕集磁珠和与磁珠缀合抗体连接的细胞的柱子中。对不被MACS柱捕获的细胞进行FACS分析。对于FACS分析，将表面分子如c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thy1的抗体与荧光材料缀合。借助于与c-kit+、Sca-1+、CD34l低/-、CD38+、Thy1+/低的细胞缔合的荧光抗体的类型，将该细胞与样品的其余部分分离。这些细胞作为适用于本发明的任何方法的鼠长期HSC提供。在其他实施例中，使用不同组的标志物来使鼠长期HSC与骨髓、脐带血、胎儿组织和外周血的细胞分离。
在一些实施例中，从骨髓获得HSC包括首先用5-氟尿嘧啶(5-FU)注射HSC供者(如小鼠或其他非人动物)以诱导HSC增殖，从而在供者的骨髓中富集HSC。
此外，适用于本发明的任何方法的HSC，无论是获自或存在于脐带血、骨髓、外周血或其他来源，都可在任何合适的市售或定制的化学成分确定的培养基中进行生长或扩增(例如Hartshorn et al.,Cell Technology for Cell Products,pages 221-224,R.Smith,Editor；Springer Netherlands,2007(Hartshorn等人，《用于细胞产物的细胞技术》，第221-224页，R.Smith编辑，荷兰施普林格出版社，2007年))。例如，无血清培养基可采用白蛋白和/或转铁蛋白，白蛋白和/或转铁蛋白已被证实对CD34+细胞在无血清培养基中的生长或扩增是有用的。另外，还可包括细胞因子，如Flt-3配体、干细胞因子(SCF)和促血小板生成素(TPO)等。还可在容器如生物反应器中生长HSC(例如Liu et al.,Journal ofBiotechnology 124:592-601,2006(Liu等人，《生物技术杂志》，第124卷，第592-601页，2006年))。适合于HSC的离体扩增的培养基还可含有HSC支持细胞如基质细胞(例如淋巴网状基质细胞)，所述支持细胞可例如源自淋巴组织的解聚，并且已被证实能支持HSC及其后代的体外、离体和体内维持、生长和分化。
HSC生长或扩增可根据本领域知道的常规技术在体外或体内进行测量。例如，WO2008/073748描述了用于测量HSC的体内和体外扩增和用于将潜在异质的群体(例如骨髓)中HSC的生长/扩增与其他细胞(包括例如中间祖细胞)的生长/扩增进行区分的方法。
HSC细胞系
在其他实施例中，适用于本发明的任何方法的HSC还可源自HSC细胞系。合适的HSC细胞系包括本领域知道的任何培养的造血干细胞。非限制性例子包括美国专利公开No.US2007/0116691和US 2010/0047217中描述的条件性无限增殖化的长期干细胞系。
在某些实施例中，适用于本发明的方法的HSC在分化为红细胞之前先条件性无限增殖化。在一些实施例中，适用于本发明的方法的HSC还可在分化为红细胞之前进行修饰以包含一种或多种目的蛋白。在一些实施例中，可通过本领域知道的和本文描述的任何方法，如转基因方法、蛋白质转导方法或增强内源蛋白的表达的方法，来实现条件性无限增殖化和/或一种或多种目的蛋白的包含。
可用于使HSC条件性无限增殖化的蛋白质
在一些实施例中，通过将在本发明的方法中用于产生红细胞的HSC与含有一种或多种能促进细胞存活和/或细胞增殖的重组蛋白并任选地含有一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白的组合物接触，来使该HSC条件性无限增殖化。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白还任选地能抑制凋亡。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白是本发明的MYC多肽、其生物活性片段或其同源物。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白还包含蛋白转导结构域(PTD)。在一些实施例中，该一种或多种能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白是PTD-MYC融合蛋白。在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白是包含Bcl-2同源结构域的蛋白质。在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白还包含蛋白转导结构域(PTD)。在一些实施例中，该一种或多种能抑制凋亡的外源蛋白是PTD-Bcl-2融合蛋白。
本发明的PTD-MYC融合蛋白和PTD-Bcl-2融合蛋白通过MYC和Bcl-2的外源添加使得可以提高HSC中的MYC和Bcl-2活性，而不需要过量表达编码MYC和Bcl-2的内源基因，或者通过遗传操纵重组表达MYC和Bcl-2。但是，本文明确地设想到对HSC进行操纵以诱导这种内源基因的过量表达，任选地通过转基因HSC的产生以及其他技术以产生条件性无限增殖化的干细胞。
在一些实施例中，还用一种或多种所公开的目的蛋白转导待分化为红细胞的HSC(和/或该红细胞)。在一些实施例中，这些一种或多种目的蛋白质不是Myc或Bcl-2。在一些实施例中，目的蛋白是包含本发明的PTD结构域的融合蛋白。在一些实施例中，PTD结构域是TAT。
转基因方法
在一些实施例中，使用本领域知道的任何转基因方法来建立在本发明的方法中使用的条件性无限增殖化的HSC(例如美国专利申请公开No.US 2007/0116691和US 2010/0047217)。例如，可通过以下步骤使HSC无限增殖化：获得扩增的HSC群体，用编码可调节的(例如可诱导的和/或可控制的)、能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白的载体转染(转导)该HSC，用编码能抑制凋亡的重组蛋白的载体转染(转导)该HSC，并且在干细胞生长因子的组合存在下、在能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白被诱导和/或有活性的条件下扩增被转染的HSC。
该能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白是可调节的(例如可诱导的或可控制的)，使得该重组蛋白可按需被激活和失活(即打开或关闭)，以将HSC维持在无限增殖化的状态或让它分化为期望的细胞类型，如红细胞。该能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白可为本发明的任何能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质。在某些优选的实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质是MYC。类似地，能抑制凋亡的重组蛋白可为本发明的任何能抑制凋亡的蛋白质。在某些优选的实施例中，该能抑制凋亡的蛋白质是Bcl-2。
在一些实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白和/或该能抑制凋亡的重组蛋白已被修饰，使得活性是可诱导的或可阻遏的。例如，该重组蛋白还可含有诱导型受体。在某些实施例中，该重组蛋白含有雌激素受体(ER)。在某些实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖且含有雌激素受体的重组蛋白是MYC-ER多肽。在某些实施例中，该能抑制凋亡且含有雌激素受体的重组蛋白是Bcl-2-ER多肽。在某些实施例中，该含有雌激素受体的重组蛋白由4-羟基他莫昔芬(4-OHT)诱导。作为另一种选择，该重组蛋白可含有糖皮质激素受体(GR)，例如对米非司酮(MIFEPREX)敏感的糖皮质激素受体。在某些实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖且含有糖皮质激素受体的重组蛋白是MYC-GR多肽。在某些实施例中，该能抑制凋亡且含有糖皮质激素受体的重组蛋白是Bcl-2-GR多肽。
本领域知道的任何用于获得扩增的HSC群体的方法都可使用。例如，可用一种或多种能促进细胞增殖和/或细胞分裂的生长因子来培养HSC。
优选地，载体是整合型载体，其具有整合到细胞的基因组中的能力(例如，反转录病毒载体)。可使用任何合适的转染细胞特别是哺乳动物细胞的方法，包括使用各种技术的组合，以载体转染和/或转导HSC。合适的载体的例子包括但不限于反转录病毒载体、慢病毒载体、细小病毒载体、痘苗病毒载体、冠状病毒载体、杯状病毒载体、乳头瘤病毒载体、黄病毒载体、正黏病毒载体、披膜病毒载体、小核糖核酸病毒载体、腺病毒载体以及经修饰的和经减毒的疱疹病毒载体。任何这种病毒载体可进一步用能将这些载体靶向HSC的特异性表面表达分子进行修饰，所述表面表达分子例如膜结合的SCF或其他干细胞特异性生长因子配体。其他转染哺乳动物细胞的方法包括但不限于哺乳动物表达载体的直接电穿孔，如通过使用NUCLEOFECTORTM技术(AMAXA Biosystems公司)。对于大多数的原代细胞和对于难以转染的细胞系来说，这个技术是非常有效的非病毒基因转移方法，这是对基于使用电流和溶液的细胞类型特异性组合来将聚阴离子大分子直接转移到细胞核中的早为人知的电穿孔方法的一个改进。另外，合适的转染方法可包括本领域知道的任何用细菌进行、用酵母进行或其他用人工进行的基因递送方法。
在一些实施例中，使用与针对条件性无限增殖化的HSC的产生所描述的那些方法类似的方法，将所述目的蛋白中的一者或多者掺入到一种或多种适合在本发明的方法中使用的HSC(例如原代细胞系或条件性无限增殖化的细胞系)中。
内源表达的增强
在一些实施例中，可通过增强能促进细胞存活和/或增殖的内源蛋白的表达，来建立供在本发明的方法中使用的条件性无限增殖化的HSC，所述能促进细胞存活和/或增殖的内源蛋白包括但不限于本发明的任何能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质。例如，可增强本发明的内源癌肽、MYC多肽、ICN-1多肽、其同源物和/或其类似物的表达。另外，还可通过增强能抑制凋亡的内源蛋白的表达，来建立供在本发明的方法中使用的条件性无限增殖化的HSC，所述能抑制凋亡的内源蛋白包括但不限于本发明的任何能抑制凋亡的蛋白质。例如，可增强本发明的含有一个或多个本发明的Bcl-2同源结构域的内源蛋白、Bcl-2多肽、Bcl-x多肽、Bcl-XL多肽、Mcl-1多肽、CED-9多肽、Bcl-2相关蛋白A1多肽、Bfl-1多肽、Bcl-w多肽、其同源物和/或其类似物的表达。
在一些实施例中，使用与针对例如MYC和/或Bcl-2的增强的产生所描述的那些方法类似的方法，在一种或多种适合在本发明的方法中使用的HSC(例如原代细胞系或条件性无限增殖化的细胞系)中提高所述目的蛋白中的一者或多者的表达。
蛋白转导方法
在一些实施例中，可用能促进细胞存活和/或增殖的基因产物，包括但不限于本发明的任何能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白(例如癌肽、MYC、ICN-1、其同源物、其类似物及其生物活性片段)，和/或用本发明的能抑制HSC的凋亡的蛋白质(例如含有一个或多个Bcl-2同源结构域的蛋白质、Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-1、CED-9、Bcl-2相关蛋白A1、Bfl-1、Bcl-w、其同源物、其类似物及其生物活性片段)(例如美国专利申请公开No.US 2007/0116691)，对通过本文公开的任何方法获得和/或产生的HSC进行处理。在一些实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质是含有PTD的融合蛋白。在一些实施例中，该能抑制凋亡的蛋白质是含有PTD的融合蛋白。在一些实施例中，可用一种或多种使得本发明的能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白的至少一种功能在细胞中能够瞬时上调的化合物(任选地为外源蛋白)，对通过本文公开的任何方法获得和/或产生的HSC进行处理。在一些实施例中，该能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白是PTD-MYC融合蛋白和/或ICN-1融合蛋白。在某些实施例中，该PTD-MYC融合蛋白是TAT-MYC和/或ICN-1融合蛋白。
在一些实施例中，可用一种或多种使得本发明的能抑制凋亡的重组蛋白的至少一种功能在细胞中能够瞬时上调的化合物(任选地为外源蛋白)，对通过本文公开的任何方法获得的HSC进行处理。在一些实施例中，该能抑制HSC的凋亡的外源蛋白是PTD-Bcl-2融合蛋白。在一些实施例中，该PTD-Bcl-2融合蛋白是TAT-Bcl-2融合蛋白。
在一些实施例中，使用与针对使用PTD融合蛋白产生条件性无限增殖化的HSC所描述的那些方法相似的方法，将所述目的蛋白中的一者或多者掺入到一种或多种适合在本发明的方法中使用的HSC(例如原代细胞系或条件性无限增殖化的细胞系)中。
在其他实施例中，将适合在本发明的任何方法中使用的HSC与包含这样的融合蛋白的组合物接触，该融合蛋白含有与PTD融合的本发明的能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质(例如PTD-MYC融合蛋白和/或PTD-ICN-1融合蛋白)。在另外的实施例中，该组合物还包含含有与PTD融合的本发明能抑制凋亡的蛋白质的融合蛋白(例如PTD-Bcl-2融合蛋白)。在一些实施例中，使HSC与含有PTD-MYC融合蛋白和/或PTD-ICN-1融合蛋白的组合物和含有PTD-Bcl-2融合蛋白的第二组合物接触。
在其他实施例中，适合在本发明的任何方法中使用的HSC在分化为红细胞之前，先在含有与PTD融合的本发明能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质的融合蛋白(例如TAT-MYC融合蛋白和/或TAT-ICN-1融合蛋白)存在下进行扩增。在另外的实施例中，还将HSC在含有与PTD融合的本发明能抑制凋亡的蛋白质的融合蛋白(例如TAT-Bcl-2融合蛋白)存在下进行扩增。例如，可通过将HSC细胞在PTD-MYC融合蛋白和/或PTD-ICN-1融合蛋白存在下，任选地在PTD-Bcl-2融合蛋白和另外的细胞因子和/或生长因子存在下，培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天、至少九天、至少十天、至少十一天、至少十二天、至少十三天、至少十四天或更多天，来扩增HSC。
因此，可从胚胎干细胞(ES细胞)、胎儿干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)、骨髓，从单采血液成分术，从外周血细胞，从已进行了白细胞单采术的外周血细胞，从脐带血，从羊水、从胎盘、从培养的HSC细胞，从无限增殖化的HSC细胞系或从条件性无限增殖化的HSC细胞系获得适合在本发明的任何方法中使用的HSC。
红细胞的产生
本发明的某些方面涉及通过如下方式从HSC产生成熟红细胞群体的方法：将HSC在EPO、任选的IL-3、及一种或多种本发明的能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白存在下，在能诱导HSC分化为成熟红细胞的条件下进行培养，从而产生该成熟红细胞群体。该重组蛋白可外源提供或通过对HSC的转基因操纵来提供。作为另一种选择，该能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质可为被诱导而过量表达的内源蛋白。在一些实施例中，该重组的、被诱导的和/或外源的蛋白质是本发明的癌肽、MYC、ICN-1、其同源物、其类似物和/或其生物活性片段。任选地，该能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质可形成融合蛋白的一部分。在一些实施例中，该融合蛋白包括PTD、表位标签或蛋白质纯化标签中的一者或多者。在一些实施例中，HSC在分化为红细胞之前被修饰成包含一种或多种目的蛋白。在一些实施例中，可通过本领域知道的和本文描述的任何方法，如转基因方法、蛋白质转导方法或增强内源蛋白的表达的方法，来实现条件性无限增殖化和/或一种或多种目的蛋白的包含。
在本发明方法的一些实施例中，在EPO和任选的IL-3及其他组分存在下培养条件性无限增殖化的HSC的步骤期间给予含有这样的融合蛋白的组合物，该融合蛋白含有与PTD融合的本发明的能促进细胞存活和/或增殖的蛋白质(例如PTD-MYC融合蛋白和/或PTD-ICN-1融合蛋白)。在一些实施例中，将HSC在饲养细胞和血清存在或不存在下进行培养。在某些优选的实施例中，将HSC在饲养细胞和/或血清不存在下进行培养。
在一些实施例中，在至少0.5μ/ml、至少0.6μ/ml、至少0.7μ/ml、至少0.8μ/ml、至少0.9μ/ml、至少1μ/ml、至少2μ/ml、至少3μ/ml、至少4μ/ml、至少5μ/ml、至少6μ/ml、至少7μ/ml、至少8μ/ml、至少9μ/ml、至少10μ/ml、至少15μ/ml、至少20μ/ml、至少25μ/ml、至少30μ/ml、至少35μ/ml、至少40μ/ml、至少45μ/ml、至少50μ/ml、至少55μ/ml、至少60μ/ml、至少65μ/ml、至少70μ/ml、至少75μ/ml、至少80μ/ml、至少85μ/ml、至少90μ/ml、至少95μ/ml或至少100μ/ml的能促进细胞存活和/或增殖的重组蛋白(例如MYC、ICN-1、其同源物、其类似物和/或其生物活性片段)存在下培养HSC。
在一些实施例中，在至少0.5μ/ml、至少0.6μ/ml、至少0.7μ/ml、至少0.8μ/ml、至少0.9μ/ml、至少1μ/ml、至少2μ/ml、至少3μ/ml、至少4μ/ml、至少5μ/ml、至少6μ/ml、至少7μ/ml、至少8μ/ml、至少9μ/ml、至少10μ/ml、至少15μ/ml、至少20μ/ml、至少25μ/ml、至少30μ/ml、至少35μ/ml、至少40μ/ml、至少45μ/ml、至少50μ/ml、至少55μ/ml、至少60μ/ml、至少65μ/ml、至少70μ/ml、至少75μ/ml、至少80μ/ml、至少85μ/ml、至少90μ/ml、至少95μ/ml或至少100μ/ml MYC存在下培养HSC。
在某些实施例中，在至少0.5μ/ml、至少0.6μ/ml、至少0.7μ/ml、至少0.8μ/ml、至少0.9μ/ml、至少1μ/ml、至少2μ/ml、至少3μ/ml、至少4μ/ml、至少5μ/ml、至少6μ/ml、至少7μ/ml、至少8μ/ml、至少9μ/ml、至少10μ/ml、至少15μ/ml、至少20μ/ml、至少25μ/ml、至少30μ/ml、至少35μ/ml、至少40μ/ml、至少45μ/ml、至少50μ/ml、至少55μ/ml、至少60μ/ml、至少65μ/ml、至少70μ/ml、至少75μ/ml、至少80μ/ml、至少85μ/ml、至少90μ/ml、至少95μ/ml或至少100μ/ml ICN-1存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在某些实施例中，在至少1.0单位/毫升EPO、至少1.2单位/毫升EPO、至少1.4单位/毫升EPO、至少1.6单位/毫升EPO、至少1.8单位/毫升EPO、至少2.0单位/毫升EPO、至少2.2单位/毫升EPO、至少2.4单位/毫升EPO、至少2.6单位/毫升EPO、至少2.8单位/毫升EPO、至少3.0单位/毫升EPO、至少3.2单位/毫升EPO、至少3.4单位/毫升EPO、至少3.6单位/毫升EPO、至少3.8单位/毫升EPO、至少4.0单位/毫升EPO或更多的EPO存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在某些实施例中，进一步地在至少1ng/ml IL-3、至少2ng/ml IL-3、至少3ng/mlIL-3、至少4ng/ml IL-3、至少5ng/ml IL-3、至少6ng/ml IL-3、至少7ng/ml IL-3、至少8ng/ml IL-3、至少9ng/ml IL-3、至少10ng/ml IL-3、至少11ng/ml IL-3、至少12ng/ml IL-3、至少13ng/ml IL-3、至少14ng/ml IL-3、至少15ng/ml IL-3、至少16ng/ml IL-3、至少17ng/mlIL-3、至少18ng/ml IL-3、至少19ng/ml IL-3、至少20ng/ml IL-3、至少21ng/ml IL-3、至少22ng/ml IL-3、至少23ng/ml IL-3、至少24ng/ml IL-3、至少25ng/ml IL-3或更多的IL-3存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在某些实施例中，在至少1ng/ml IL-3、至少2ng/ml IL-3、至少3ng/ml IL-3、至少4ng/ml IL-3、至少5ng/ml IL-3、至少6ng/ml IL-3、至少7ng/ml IL-3、至少8ng/ml IL-3、至少9ng/ml IL-3、至少10ng/ml IL-3、至少11ng/ml IL-3、至少12ng/ml IL-3、至少13ng/ml IL-3、至少14ng/ml IL-3、至少15ng/ml IL-3、至少16ng/ml IL-3、至少17ng/ml IL-3、至少18ng/ml IL-3、至少19ng/ml IL-3、至少20ng/ml IL-3、至少21ng/ml IL-3、至少22ng/ml IL-3、至少23ng/ml IL-3、至少24ng/ml IL-3、至少25ng/ml IL-3或更多的IL-3；并且至少1.0单位/毫升EPO、至少1.2单位/毫升EPO、至少1.4单位/毫升EPO、至少1.6单位/毫升EPO、至少1.8单位/毫升EPO、至少2.0单位/毫升EPO、至少2.2单位/毫升EPO、至少2.4单位/毫升EPO、至少2.6单位/毫升EPO、至少2.8单位/毫升EPO、至少3.0单位/毫升EPO、至少3.2单位/毫升EPO、至少3.4单位/毫升EPO、至少3.6单位/毫升EPO、至少3.8单位/毫升EPO、至少4.0单位/毫升EPO或更多的EPO存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在另外的实施例中，在EPO和任选的IL-3存在下，将HSC、任选地为条件性无限增殖化的HSC培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天、至少九天、至少十天或更长时间。
在另外的实施例中，进一步地在约1至500ng/ml FLT-3、约1至500ng/ml SCF、约1至500ng/ml GM-CSF和/或约1至500ng/ml TPO存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。可进一步地在FLT-3、SCF、GM-CSF和/或TPO存在下将HSC、任选地为条件性无限增殖化的HSC培养至少一天、至少两天、至少三天、至少四天、至少五天、至少六天、至少七天、至少八天、至少九天、至少十天或更长时间。可在HSC分化为成熟红细胞期间的任何时间点和/或在已产生了成熟红细胞后，将FLT-3、SCF、GM-CSF和/或TPO添加到培养基。
在另外的实施例中，进一步地在至少1ng/ml FLT-3、至少2ng/ml FLT-3、至少3ng/ml FLT-3、至少4ng/ml FLT-3、至少5ng/ml FLT-3、至少6ng/ml FLT-3、至少7ng/ml FLT-3、至少8ng/ml FLT-3、至少9ng/ml FLT-3、至少10ng/ml FLT-3、至少15ng/ml FLT-3、至少20ng/ml FLT-3、至少25ng/ml FLT-3、至少30ng/ml FLT-3、至少35ng/ml FLT-3、至少40ng/ml FLT-3、至少45ng/ml FLT-3、至少50ng/ml FLT-3、至少55ng/ml FLT-3、至少60ng/mlFLT-3、至少65ng/ml FLT-3、至少70ng/ml FLT-3、至少75ng/ml FLT-3、至少80ng/ml FLT-3、至少85ng/ml FLT-3、至少90ng/ml FLT-3、至少95ng/ml FLT-3、至少100ng/ml FLT-3、至少150ng/ml FLT-3、至少200ng/ml FLT-3、至少250ng/ml FLT-3、至少300ng/ml FLT-3、至少350ng/ml FLT-3、至少400ng/ml FLT-3、至少450ng/ml FLT-3、至少500ng/ml FLT-3或更多的FLT-3存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在另外的实施例中，进一步地在至少1ng/ml SCF、至少2ng/ml SCF、至少3ng/mlSCF、至少4ng/ml SCF、至少5ng/ml SCF、至少6ng/ml SCF、至少7ng/ml SCF、至少8ng/mlSCF、至少9ng/ml SCF、至少10ng/ml SCF、至少15ng/ml SCF、至少20ng/ml SCF、至少25ng/ml SCF、至少30ng/ml SCF、至少35ng/ml SCF、至少40ng/ml SCF、至少45ng/ml SCF、至少50ng/ml SCF、至少55ng/ml SCF、至少60ng/ml SCF、至少65ng/ml SCF、至少70ng/ml SCF、至少75ng/ml SCF、至少80ng/ml SCF、至少85ng/ml SCF、至少90ng/ml SCF、至少95ng/mlSCF、至少100ng/ml SCF、至少150ng/ml SCF、至少200ng/ml SCF、至少250ng/ml SCF、至少300ng/ml SCF、至少350ng/ml SCF、至少400ng/ml SCF、至少450ng/ml SCF、至少500ng/mlSCF或更多的SCF存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在另外的实施例中，进一步地在至少1ng/ml GM-CSF、至少2ng/ml GM-CSF、至少3ng/ml GM-CSF、至少4ng/ml GM-CSF、至少5ng/ml GM-CSF、至少6ng/ml GM-CSF、至少7ng/ml GM-CSF、至少8ng/ml GM-CSF、至少9ng/ml GM-CSF、至少10ng/ml GM-CSF、至少15ng/mlGM-CSF、至少20ng/ml GM-CSF、至少25ng/ml GM-CSF、至少30ng/ml GM-CSF、至少35ng/mlGM-CSF、至少40ng/ml GM-CSF、至少45ng/ml GM-CSF、至少50ng/ml GM-CSF、至少55ng/mlGM-CSF、至少60ng/ml GM-CSF、至少65ng/ml GM-CSF、至少70ng/ml GM-CSF、至少75ng/mlGM-CSF、至少80ng/ml GM-CSF、至少85ng/ml GM-CSF、至少90ng/ml GM-CSF、至少95ng/mlGM-CSF、至少100ng/ml GM-CSF、至少150ng/ml GM-CSF、至少200ng/ml GM-CSF、至少250ng/ml GM-CSF、至少300ng/ml GM-CSF、至少350ng/ml GM-CSF、至少400ng/ml GM-CSF、至少450ng/ml GM-CSF、至少500ng/ml GM-CSF或更多的GM-CSF存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
在另外的实施例中，进一步地在至少1ng/ml TPO、至少2ng/ml TPO、至少3ng/mlTPO、至少4ng/ml TPO、至少5ng/ml TPO、至少6ng/ml TPO、至少7ng/ml TPO、至少8ng/mlTPO、至少9ng/ml TPO、至少10ng/ml TPO、至少15ng/ml TPO、至少20ng/ml TPO、至少25ng/ml TPO、至少30ng/ml TPO、至少35ng/ml TPO、至少40ng/ml TPO、至少45ng/ml TPO、至少50ng/ml TPO、至少55ng/ml TPO、至少60ng/ml TPO、至少65ng/ml TPO、至少70ng/ml TPO、至少75ng/ml TPO、至少80ng/ml TPO、至少85ng/ml TPO、至少90ng/ml TPO、至少95ng/mlTPO、至少100ng/ml TPO、至少150ng/ml TPO、至少200ng/ml TPO、至少250ng/ml TPO、至少300ng/ml TPO、至少350ng/ml TPO、至少400ng/ml TPO、至少450ng/ml TPO、至少500ng/mlTPO或更多的TPO存在下培养HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。
目前的从原代HSC产生红细胞的方法(例如参见Giarratana et al.,(2005)NatBiotech 23,69-74(Giarratana等人，2005年，《自然生物技术》，第23卷，第69-74页))需要至少三周(21天)来产生红细胞。但是，本发明的从条件性无限增殖化的HSC产生红细胞群体的方法在约10天就产生红细胞。与目前的方法的至少21天相比，本文公开的方法的10天表明加速大约52％。因此，在一些实施例中，与从在IL-3和EPO存在下培养八天、然后在饲养细胞和EPO存在下培养三天、最后在单独饲养细胞存在下培养十天的原代干细胞产生红细胞群体相比，成熟红细胞群体的产生加速至少45％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多(参见Giarratana etal.,(2005)Nat Biotech 23,69-74(Giarratana等人，2005年，《自然生物技术》，第23卷，第69-74页))。
在其他实施例中，成熟红细胞群体在约7至14天产生。在其他实施例中，成熟红细胞群体在约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天或约14天产生。
在本发明的方法的其他实施例中，所产生的红细胞群体是完全成熟红细胞群体。在另外其他实施例中，成熟红细胞群体中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的细胞是无核的。在又其他实施例中，成熟红细胞群体从条件性无限增殖化的HSC连续产生。
在本发明的方法的其他实施例中，成熟红细胞群体中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的细胞表达血型糖蛋白(Glycophrin)A(GPA)。在另外的实施例中，成熟红细胞群体中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的细胞表现出CD71(转铁蛋白受体)表达水平降低。在另外的实施例中，成熟红细胞群体中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。在另外的实施例中，成熟红细胞群体中至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％的细胞表达成人血红蛋白。
在其他实施例中，所产生的成熟红细胞群体是人细胞群体。在另外的实施例中，所产生的成熟红细胞群体是非人动物细胞群体，包括但不限于来自以下动物的细胞的群体：实验动物/研究动物、啮齿动物、宠物、牲畜、农场动物、劳役动物、驮运动物、稀有或濒危物种、竞赛动物、动物园动物、猴子、灵长类动物、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡。
本发明的方法还可采用从获自具有A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+或AB-血型的供者的人HSC衍生的HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC。因此，从该HSC产生的红细胞将具有A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+或AB-血型。
另外，本发明的方法还可采用从获自具有稀有血型的供者的人HSC衍生的HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC，所述稀有血型包括但不限于Oh、CDE/CDE、CdE/CdE、CwD-/CwD-、-D-/-D-、Rhnull、Rh:-51、LW(a-b+)、LW(a-b-)、S-s-U-、S-s-U(+)、pp、Pk、Lu(a+b-)、Lu(a-b-)、Kp(a+b-)、Kp(a-b-)、Js(a+b-)、Ko、K:-11、Fy(a-b-)、Jk(a-b-)、Di(b-)、I-、Yt(a-)、Sc:-1、Co(a-)、Co(a-b-)、Do(a-)、Vel-、Ge-、Lan-、Lan(+)、Gy(a-)、Hy-、At(a-)、Jr(a-)、In(b-)、Tc(a-)、Cr(a-)、Er(a-)、Ok(a-)、JMH-和En(a-)。因此，在一些实施例中，从该HSC产生的红细胞群体将具有稀有血型，包括但不限于Oh、CDE/CDE、CdE/CdE、CwD-/CwD-、-D-/-D-、Rhnull、Rh:-51、LW(a-b+)、LW(a-b-)、S-s-U-、S-s-U(+)、pp、Pk、Lu(a+b-)、Lu(a-b-)、Kp(a+b-)、Kp(a-b-)、Js(a+b-)、Ko、K:-11、Fy(a-b-)、Jk(a-b-)、Di(b-)、I-、Yt(a-)、Sc:-1、Co(a-)、Co(a-b-)、Do(a-)、Vel-、Ge-、Lan-、Lan(+)、Gy(a-)、Hy-、At(a-)、Jr(a-)、In(b-)、Tc(a-)、Cr(a-)、Er(a-)、Ok(a-)、JMH-和En(a-)。
另外，本发明的方法还可采用从具有如下疾病或失调的供者衍生的HSC，任选地为条件性无限增殖化的HSC：自身免疫失调、免疫缺陷或任何其他会得益于HSC移植和/或输血(以产生可用于个性化治疗的成熟红细胞群体)的疾病或失调。例如，该成熟红细胞群体可从获自自体供者或同种异体供者的HSC产生。有利地，在需要输血和/或用红细胞治疗的受试者对用源自或获自任何其他供者(包括同种异体供血者和/或万能供血者)的红细胞进行的治疗会有负面的、有害的或有毒的反应的情况中，自体红细胞可以是特别有用的。可得益于用从源自自体供者和/或同种异体供者的HSC所产生的红细胞进行的治疗的患者的例子是本领域熟知的，包括但不限于那些遭受自身免疫失调、血液疾病或失调、免疫疾病或失调或者其他相关疾病或病症的患者。
在某些实施例中，从可在体外无限地传代、可冻存和可恢复的条件性无限增殖化的HSC产生红细胞群体。因此，这种条件性无限增殖化的HSC使得可以从确定的、得到充分表征的来源连续地产生完全分化的红细胞。
本发明的方法可采用来自任何来源的HSC，包括但不限于来自脐带血、胎盘、外周血、骨髓或动员血的原代造血干细胞。本发明明确设想到源自胚胎干细胞、胎儿血细胞或诱导多能干细胞的造血干细胞，以及条件性无限增殖化的造血干细胞，如转基因的和蛋白质转导的条件性无限增殖化的细胞。
红细胞群体
本发明的某些方面涉及任选地通过一种或多种本发明的方法产生的红细胞如成熟红细胞群体。红细胞群体还可包含一种或多种本发明的目的蛋白。这些目的蛋白可用于预防、治疗和/或诊断一种或多种本文公开的疾病或失调。
在一些方面，红细胞群体可通过包括但不限于以下特性的一种或多种特性来表征：该群体中的至少约40％、至少45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或约100％的细胞为无核细胞，表达GPA，表达成人血红蛋白(经FACS测得为2个数量级或更高)，表现出CD71表达水平降低(例如GPA+/CD71-)和/或表现出胎儿血红蛋白水平降低(经FACS测得为1个数量级；即0-10)。红细胞群体还可包含一种或多种目的重组蛋白。这些目的蛋白可用于预防、治疗和/或诊断一种或多种本文公开的疾病或失调。
在一些实施例中，红细胞群体还可包含本发明的能抑制凋亡的外源蛋白，如含有Bcl-2同源结构域的蛋白质。该外源蛋白还可以是含有PTD的融合蛋白。在一些实施例中，该外源蛋白是Bcl-2、其同源物、其类似物和/或其生物活性片段。在某些实施例中，该外源蛋白是Bcl-2，任选地为PTD-Bcl-2。在一些实施例中，将红细胞群体维持在包含本发明的能抑制凋亡的蛋白质(如含有Bcl-2同源结构域的蛋白质)的贮存培养基中。在一些实施例中，贮存培养基中的该外源蛋白是Bcl-2、其同源物、其类似物和/或其生物活性片段。在某些实施例中，贮存培养基中的该外源蛋白是Bcl-2，任选地为PTD-Bcl-2 Bcl-2。
药物组合物
本发明的某些方面涉及包含一种或多种本发明的红细胞群体及一种或多种药物可接受的赋形剂的药物组合物。可以使用任何本领域知道的适用于红细胞的药物可接受赋形剂。在一个非限制性例子中，药物可接受赋形剂是pH平衡的盐水溶液。
在一些实施例中，该组合物还包含一种或多种本发明的目的蛋白。
该红细胞群体任选地通过一种或多种本发明的方法产生和/或表现出一种或多种本发明的特性，包括但不限于该群体中约40％至约100％的红细胞是无核红细胞，该群体中约40％至约100％的红细胞表达成人血红蛋白，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出成人血红蛋白表达提高，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出CD71表达水平降低，以及该群体中约40％至约100％的红细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。另外，该红细胞群体可具有稀有血型。在一些实施例中，该红细胞是人红细胞。作为另一种选择，该红细胞是本发明的源自任何非人动物的非人红细胞。
该红细胞群体还可包含一种或多种本发明的目的蛋白。在一些实施例中，该一种或多种目的蛋白在该红细胞的表面上缔合。
本发明的含有一种或多种本发明的红细胞群体及一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物(其中该红细胞任选地含有一种或多种本发明的目的蛋白)可被配制用于体内给予，如通过输注给予。可以使用任何本领域知道的用于体内给予含有红细胞群体的药物组合物的制剂。
治疗用途
本文描述的和/或根据本发明的任何用于从HSC(任选地为条件性无限增殖化的HSC)产生成熟红细胞群体的方法产生的红细胞，也可用于治疗应用。
将红细胞输注用于因为多种原因和失调而需要这种治疗的患者是本领域熟知的，并且各种方法是标准的医疗规范。可使用目前用于输血的相同方法和条件，将本文描述的和/或根据本发明的方法产生的红细胞用于治疗患者。
在某些实施例中，本发明涉及通过向具有以红细胞缺乏为特征的失调的受试者给予本发明的或通过本发明的任何方法制备的红细胞群体，来治疗、预防或诊断以红细胞的缺乏为特征的疾病或失调的方法。在一些实施例中，该群体中约40％至约100％的红细胞是无核红细胞，该群体中约40％至约100％的红细胞表达成人血红蛋白，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出成人血红蛋白表达提高，该群体中约40％至约100％的红细胞表现出CD71表达水平降低，并且该群体中约40％至约100％的红细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。
如本文所用，“红细胞的缺乏”指这样的受试者，其红细胞数量比具有正常红细胞数量的受试者体内的红细胞数量低约20％至约900％；或者其红细胞数量比具有正常红细胞数量的受试者体内的红细胞数量低约10倍至约1000倍。
以红细胞的缺乏为特征的失调可包括但不限于贫血(例如先天性贫血、再生障碍性贫血、恶性贫血、缺铁性贫血、镰状细胞性贫血、球形红细胞症、溶血性贫血、无铜蓝蛋白血症、腺苷脱氨酶提高的活性-ADA-、腺苷酸激酶缺乏、醛缩酶缺乏、α-地中海贫血-性状或携带者、转铁蛋白缺乏症、常染色体显性铁粒幼红细胞性贫血、常染色体隐性铁粒幼红细胞性贫血、β-地中海贫血-性状或携带者、重型(和中度)β地中海贫血、CDA伴血小板减少症(GATA I突变)、复合杂合性镰状形成病症、先天性棘红细胞增多症、先天性红细胞生成异常性贫血I型、先天性红细胞生成异常性贫血II型、先天性红细胞生成异常性贫血III型、δβ-地中海贫血、Diamond-Blackfan贫血、DMT1缺乏性贫血、家族性再生障碍性贫血、范可尼贫血、γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶缺乏症、GLRX5相关铁幼粒细胞性贫血、葡萄糖磷酸异构酶缺乏症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、谷胱甘肽还原酶缺乏症、谷胱甘肽合成酶缺乏症、血红蛋白C疾病、血红蛋白D疾病、血红蛋白E疾病、血红蛋白H疾病、血红蛋白Lepore、血红蛋白M伴贫血、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性持续性胎儿血红蛋白、遗传性球形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多症、己糖激酶缺乏症、胎儿水肿、Imerslund-综合征、铁难治性缺铁性贫血、Kearns-Sayre综合征、卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症、线粒体肌病铁粒幼细胞贫血、地中海贫血、先天性红细胞生成不良性贫血、全血细胞减少症伴畸形、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、Pearson综合征、磷酸果糖激酶缺乏症、磷酸甘油酸激酶缺乏症、嘧啶5核苷酸酶缺乏症、丙酮酸激酶缺乏症、镰状细胞性贫血、镰状细胞性状、铁粒幼细胞贫血伴共济失调、SLC25A38相关铁粒幼细胞贫血、硫胺响应性巨幼红细胞性贫血、磷酸丙糖异构酶缺乏症、不稳定的血红蛋白、Wolfram综合征和X联锁铁粒幼细胞贫血)、高雪氏病、溶血、嗜中性白细胞减少症、血小板减少症、粒细胞减少症、血友病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡状淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性髓细胞性白血病、前B急性淋巴细胞白血病、前T急性淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、难治性白血病或者它们的组合。
在某些情况中，以红细胞的缺乏为特征的失调(部分地或完全地)由化学疗法、化学品暴露、放射疗法和/或放射暴露中的一者或多者导致。在一些实施例中，将通过本发明的任何方法产生的红细胞群体与化学疗法和/或放射疗法或一种或多种目的蛋白一起进行共给予。
在一些实施例中，将本发明的和/或根据本发明的任何方法产生的红细胞群体给予或输注到有需要(例如遭受失血)的受试者体内。失血可能是例如内部流血或外部流血、出血、创伤或手术等的结果。
用本发明的一种或多种红细胞群体进行的治疗还可用于一些与出血有关的传染病，如但不限于与病毒性出血热有关联的RNA病毒家族(砂粒病毒科、布尼亚病毒科、线状病毒科和黄病毒科)。病毒性出血热的例子包括但不限于拉沙热、埃博拉热、马堡热、裂谷热、登革热和黄热病。
在其中需要立即输血的实施例中，将大量的本文描述的和/或根据本发明的任何方法制备的红细胞给予个体。在其他实施例中，将所产生的红细胞群体的持续输注给予个体。
对于一些疾病、失调和/或病症的治疗而言，有用的是给予适于作为一种或多种本发明的目的蛋白的递送系统的红细胞。可以使用本领域知道的和本文公开的任何能使红细胞适于作为蛋白质的递送系统的方法。任何本领域知道的和本文公开的会得益于用所公开的目的蛋白进行的治疗的疾病、失调和/或病症都可用本发明的方法进行治疗，包括但不限于需要造血生长因子的受试者、急性炎性病症、细胞因子风暴病症、与细胞因子风暴有关的临床征候、癌症、血管调节障碍(例如冻伤、癌症相关的血管收缩或风湿性关节等)、急性心梗、分娩期间的助产用途、急性和/或持续性偏头疼、需要免疫增强(immunity booster)的受试者、具有凝血高风险的受试者、具有肺栓塞高风险的受试者、心血管病、免疫疾病和/或失调以及自身免疫疾病和/或失调。
要通过本发明的任何方法进行治疗的“受试者”、“患者”或“宿主”可以是任何需要这种治疗的人或非人动物，如本文所公开的任何非人动物。例如，受试者可能有红细胞的缺乏、有自身免疫缺乏、贫血、癌症或本领域知道的和本文公开的任何其他可通过本发明的红细胞和/或本发明的一种或多种目的蛋白进行治疗的疾病、失调或病症。
本文提及的文献和研究的引用并不意在承认任何这些文献和研究是相关的现有技术。所有与这些文献的内容相关的陈述都是基于本申请人所能获知信息，并不构成任何关于这些文件的内容的正确性的承认。
以下实例仅仅是示例性的，并不意在以任何方式限制本发明的任何方面。
实例
以下实例描述将鼠和人条件性转化的长期造血干细胞系(clt-HSC)和蛋白质转导的长期造血干细胞(ptlt-HSC)在体外分化为红细胞(RBC)的结果。
所描述的方法有利于快速产生任选地携带一种或多种目的蛋白有效负载的成熟无核红细胞群体。另外，产生条件性无限增殖化的HSC作为起始材料，可以产生和维持万能供血者血液或多种主要血型以及稀有血型甚至个性化血液，以解决稀有血型患者多年来所面临的血液持续短缺的问题。此外，这个技术可用来提供恒定的、可预测的红细胞供应以供输注，所述红细胞源自确定的、可被认证为无病原体的来源，并且具有延长的货架期使得可以建立足够的红细胞储备供应。
实例1：条件性转化的长期重构性造血干细胞系的产生
通过用5-氟尿嘧啶(5FU)处理小鼠以除去增殖的细胞，来制备富集HSC的骨髓(BM)细胞。通过将来自经处理的小鼠的离体骨髓细胞在如先前记述的(Van Parijs et al.,Immunity 11,763-770,1999(Van Parijs等人，《免疫》，第11卷，第763-770页，1999年))含有IL-3、IL-6和SCF的培养基中培养，来进一步富集HSC。然后用编码癌蛋白和绿色荧光蛋白的pMIG-MYC-ER病毒和pMIG-Bcl-2病毒(图1A)对细胞进行三轮的离心感染(spininfection)(Refaeli et al.,J.Exp.Med.196,999-1005,2002(Refaeli等人，《实验医学杂志》，第196卷，第999-1005页，2002年))。产生pMSCV骨架的变体，以编码人MYC-ER或Bcl-2以及IRES元件和报道基因(EGFP)的cDNA。所得的病毒产生双顺反子转录物，使得报道基因表达水平与第一cDNA的表达水平相关联。
如通过在建立了初始培养物后的96小时时表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞的频率所测定，这个处理产生大约33.7％的反转录病毒转导率(图1B)。将105个经转导的HSC移植到几群幼年的、经致死性辐照的雄性C57/BL6小鼠体内，并在移植后10天开始，给这些小鼠每周注射4-羟基他莫昔芬(4-OHT)，数量为每周每只小鼠1毫克。这些小鼠中超过90％发展了白血病，潜伏期一致地为四周(图1C)。图1C中的曲线表示在4-OHT注射开始(图中的第0天)后在给定的时间点存活的小鼠的百分比。在约40天后，所有的小鼠一律死于AML样白血病(图1C)。图1中显示的数据来自代表4个独立实验的一个实验。白血病的发展需要连续给予4-OHT。
尽管所提供的该具体实例涉及使用Myc和Bcl-2对HSC进行条件性无限增殖化，但将使用类似的方法来将其他目的蛋白掺入到HSC中并且任选地控制目的蛋白的表达。在一些实施例中，HSC将包括条件性无限增殖化的HSC或蛋白质转导的HSC。
实例2：条件性转化的HSC细胞系表现出Lt-HSC表面表型
为评估在实例1中发展的细胞系的表型和同质性，分析了多种表面标志物的细胞表达。用抗c-kit、Sca-1、CD34和Flk-2的抗体对细胞进行染色。另外，对细胞的特定谱系进行染色：CD19和B220用于B谱系细胞，Thy1.2用于T谱系细胞，Mac-1用于髓样细胞，Gr-1用于嗜中性粒细胞，Ter-119用于红细胞祖细胞。如图1D-1F中所示，一致地观察到的表型为谱系阴性的(CD19-,B220-)，但Sca-1+、c-kit+、CD34-和Flk-2-。这个标志物表达模式与先前对鼠原代Lt-HSC报道的模式一致(Cheshier et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 96,3120-3125,1999(Cheshier等人，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第3120-3125页，1999年))。还注意到，当将ctlt-HSC细胞系长时间维持在培养物中时，细胞c-kit表达降低(图1E)。这个变化与体内或体外功能的可检测变化不相关。此外，还发现，当将细胞在没有SCF的情况下培养过夜时，c-Kit水平恢复，这提示SCF驱动其受体的调节。
具体地讲，图1D显示了在恢复后不久从白血病小鼠的骨髓获得的ctlt-HSC。在这些样品中，大约42.2％的细胞为Sca-1+和c-kit+；大约100％的细胞为CD34-和Flk-2-；并且大约99.8％的细胞为B220-和CD19-(图1D)。
图1E显示长时间维持在培养物中的ctlt-HSC细胞系。在这些样品中，大约7.79％的细胞为Sca-1+和c-kit+；大约51.2％的细胞为Sca-1+但呈c-kit-；大约100％的细胞为CD34-和Flk-2-；并且大约99.4％的细胞为B220-和CD19-(图1E)。
图1F显示从野生型C57/BL6小鼠的骨髓获得的正常、未经操纵的Lt-HSC。在这些样品中，仅大约1.84％的细胞为Sca-1+和c-kit+，大约8.03％的细胞为Sca-1-和c-kit+，而大部分的细胞(大约88.5％)对Sca-1和c-kit两者均为阴性(图1F)。另外，虽然大约100％的细胞为CD34-，但并不是所有的细胞为Flk-2-(图1F)。
此外，如图1D中所示，在建立ctlt-HSC细胞系的过程的早期阶段，细胞主要表达高水平的c-kit和Sca-1，并不表达Flk-2、CD34或谱系标志物如CD19和B220。对所建立的ctlt-HSC细胞系的FACS分析显示，一旦ctlt-HSC细胞系被扩增和冻存，它保持稳定的表面表型。这些细胞表达高水平的Sca-1，但具有降低的c-Kit表面水平，并且保持Flk-2、CD34、B220、CD19和其他谱系标志物呈阴性(图1E)。c-kit水平从表面的降低似乎是连续信号转导的结果，因为它们需要SCF来保持它们的HSC样表型。将ctlt-HSC细胞系的结果与来自野生型C57/BL6小鼠骨髓的正常、未经操纵的长期HSC进行比较。如图1F中所示，用抗c-kit、sca-1、Flk-2和CD34的抗体对细胞进行染色，以比较来自正常HSC和来自ctlt-HSC细胞系的标志物蛋白的表达水平。
实例3：通过移植ctlt-HSC将小鼠从致死性辐照中挽救出来
本实例证明ctlt-HSC细胞系产生分化的红细胞(RBC)的能力。这个能力，以及长时间维持活性HSC区室的能力，对于把ctlt-HSC的身份建立为Lt-HSC是至关重要的。以两种方式研究了ctlt-HSC细胞系重构经致死性辐照的动物的造血区室的能力。首先，将103个ctlt-HSC细胞随3×105个来自Rag-1-/-小鼠的全骨髓细胞转移到经致死性辐照的幼年C57/BL6小鼠体内。“载体”Rag-1-/-细胞的添加确保接受者能在被转移的HSC重新建立红细胞生成所需要的时间期间产生红细胞。通常将全“载体”骨髓细胞的补充与HSC重构联用，以使得移植物接受者可以在辐照后现有红细胞发生损失的情况下也能存活下来(Uchida et al.,J.Exp.Med.175,175-184,1992(Uchida等人，《实验医学杂志》，第175卷，第175-184页，1992年))。因此，设计实验，使得成熟淋巴样细胞的唯一可能来源是移植的ctlt-HSC细胞。在这个方法的一个变型中，不用载体骨髓，将103个ctlt-HSC细胞移植到经亚致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内。在移植后6或12周将接受ctlt-HSC的小鼠行安乐死，收获淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓组织分析重构情况。用谱系特异性抗体对所得的细胞悬浮物进行染色，以查明重构的程度。借助于反转录病毒编码的报道基因GFP，对从ctlt-HSC发育的细胞进行体内跟踪。
ctlt-HSC细胞系产生骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结组织，在骨髓、胸腺、脾脏和淋巴结中有高频率的GFP+细胞(占活的恢复的细胞的70-80％)(图2A)。这些直方图来源于代表一群五只小鼠中每只的一只小鼠的器官。具体地讲，大约78％的骨髓细胞为GFP+，大约72％的胸腺细胞为GFP+，大约80％的脾脏细胞为GFP+，并且大约79％的淋巴结(LN)细胞为GFP+(图2A)。
如图2B中所示，对从骨髓获得的细胞的Mac-1和Gr-1进行染色。虽然骨髓中存在的髓样细胞并非全部都表达GFP，但大部分为GFP+并且因此源自ctlt-HSC。具体地讲，大约14.8％的细胞为Mac-1+，大约24％的细胞为GFP+和Mac-1+两者。因此，大约61.8％的Mac-1+细胞源自ctlt-HSC(图2B)。另外，大约32％的细胞为Gr-1+，大约18.7％的细胞为GFP+和Gr-1+两者。因此，大约58.4％的Mac-1+细胞源自ctlt-HSC(图2B)。
如图2C中所示，通过流式细胞术分析从嵌合Rag-1-/-小鼠的脾脏组织获得的细胞以确定成熟T细胞和B细胞的存在。Rag-1-/-小鼠和野生型小鼠用作对照。对细胞进行染色以确定CD4或CD8单阳性的TCRαβT细胞的存在。另外，对细胞进行染色以确定在其表面上表达IgM和IgD的CD19+B细胞的存在。
具体地讲，来自嵌合Rag-1-/-小鼠的脾脏细胞样品具有大约25.8％的TCRαβ+和CD4+细胞，大约16.8％的TCRαβ+和CD8+细胞，以及大约7.8％的IgM+和CD19+细胞(图2C)。将这与来自没有TCRαβ+和CD4+细胞、TCRαβ+和CD8+细胞或IgM+和CD19+细胞的对照Rag-1-/-小鼠的脾脏细胞样品，以及来自具有大约24％的TCRαβ+和CD4+细胞、大约16.1％的TCRαβ+和CD8+细胞以及大约28.7％的IgM+和CD19+细胞的野生型小鼠的脾脏细胞样品进行比较(图2C)。
如在图2C中可见，虽然脾脏中的成熟T细胞的频率与在野生型的未经操纵的C57/BL6小鼠中存在的频率相当，但B细胞的发育延迟。
然后确定ctlt-HSC是否能够在移植后自我更新。将从第一群的ctlt-HSC移植物接受小鼠获得的骨髓细胞连续移植到第二群的经致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内。在6或12周后分析重构情况。
如图2D中所示，该第二次移植也能够产生成熟谱系。从该群嵌合小鼠收集脾脏，制备单细胞悬浮物并用于FACS分析。比较存在于接受小鼠、对照Rag-1-/-小鼠和对照野生型C57/BL6小鼠的成熟T细胞和B细胞的频率。该分析显示脾脏中存在成熟CD4和CD8单阳性TCRαβT细胞的频率与野生型小鼠相似。CD19+、IgM+和IgD+B细胞也存在，尽管比在野生型小鼠中的频率低。
具体地讲，来自第二次移植物接受Rag-1-/-小鼠的脾脏细胞样品具有大约41.3％的TCRαβ+和CD4+细胞、大约34.3％的TCRαβ+和CD8+细胞以及大约10.2％的IgM+和CD19+细胞(图2D)。将这与来自具有大约0.7％的TCRαβ+和CD4+细胞、大约0.4％的TCRαβ+和CD8+细胞以及0.5％的IgM+和CD19+细胞的对照Rag-1-/-小鼠的脾脏细胞样品及来自具有大约36.9％的TCRαβ+和CD4+细胞、大约37.7％的TCRαβ+和CD8+细胞以及大约16.9％的IgM+和CD19+细胞的野生型小鼠的脾脏细胞样品进行比较(图2D)。
随后进行七次相继的连续移植，观察到从初始的103个ctlt-HSC重构成熟谱系，没有肿瘤形成的迹象(表1)。对于这个实验，将一百万个全骨髓细胞移植到经致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内。如针对NSG小鼠所描述进行向Rag1-/-小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratory))体内的移植，例外的是Rag1-/-小鼠在就要经尾静脉注射骨髓细胞之前接受两个后续剂量(相隔2至3小时)的450拉德辐照。
表1
外周血(PB) 标准偏差 外周血(PB) 标准偏差
移植 重复小鼠数目 平均T％ 平均B％
1 8 29.300 14.106 15.190 12.834
2 9 48.910 17.396 15.230 16.619
3 4 36.900 7.230 6.955 5.206
4 3 21.560 9.415 7.683 4.657
5 4 32.93<sup>0</sup> 13.968 7.140 1.373
6 7 16.051 5.582 0.7629 0.472
7 5 15.174 8.99 0.239 0.156
8 6 0.8 0.341 0.044 0.044
实例4：人ctlt-HSC细胞系和携带人造血区室的嵌合小鼠的开发
先前已开发了用于使鼠长期HSC条件性无限增殖化的方法。将这个方法扩展到使人长期HSC条件性无限增殖化，以确定负责使鼠HSC条件性无限增殖化的机制是通用于任何HSC还是仅特别针对鼠细胞。为了验证这个想法，获得了成人骨髓或脐带血的CD34+级分(最初从加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市的干细胞技术公司(Stem Cell Technologies,Vancouver,BC)获得，然后从UCHSC脐带血库获得)。将细胞在针对人HSC开发的、补加有人重组IL-3、IL-6和SCF的专门培养基(Stemline II培养基，西格玛公司(Sigma)，美国密苏里州圣路易斯市)中进行培养。然后用编码MYC-ER或Bcl-2及GFP报道基因的反转录病毒对人HSC进行转导。该反转录病毒为实例1中使用的相同pMSCV变体。但是，这些反转录病毒被修饰成用双嗜性包膜进行包装，以使得能够转导到人细胞中。将经转导的人HSC移植到经亚致死性辐照的NOD/SCID/β2M-/-小鼠体内，或者在IL-3、IL-6和SCF细胞因子混合物及4-OHT存在下在体外维持于长期培养物中。这两个不同的方法都得到人ctlt-HSC细胞系。已将一组完全在体外产生的人ctlt-HSC细胞系维持在连续培养物中达14个月。三种经反转录病毒转导的细胞系的初始表面表型显示出CD34+级分的大量富集。所述细胞相对于HSC的初始频率而言富集了CD34+级分达10,000倍(图3A-3C)。
进行FACS分析以确定三种所建立的人ctlt-HSC细胞系的表面表型。如图3中所示，经扩增和冻存的人ctlt-HSC细胞系保持了所展现的稳定表面表型。经转导的(即GFP+)细胞被证实表达高水平的CD34(图3A-3C)。具体地讲，这3种不同的ctlt-HCS细胞系是5.23％、5.09％和4.03％的GFPxCD34双阳性细胞。这3种ctlt-HSC细胞系也是25.3％、94.7和92.1cKitxGFP双阳性(图3D-3F)。同样这3种ctlt-HSC细胞系对于谱系标志物CD45、Flk-2和CD150而言也保持非常少。示出了其中一种ctlt-HSC细胞系的流式细胞术表征，其具有12.3％的CD45xGFP双阳性细胞(图3G)、0.77％的Flk-2xGFP双阳性细胞(图3H)和0.55％的CD150xGFP双阳性细胞(图3I)；以及B220、CD19和其他谱系标志物(thy1.2、Gr-1、Mac-1和Ter-119)。虽然就这三种所建立的不同的人ctlt-HSC细胞系间的表面标志物表达水平而言可能存在一定的异质性(heterogeneity)，但据信该异质性是先前已报道的成体HSC区室中的固有异质性(McKenzie et al.,Nat Immunol 7,1225-33,2006(McKenzie等人，《自然免疫学》，第7卷，第1225-33页，2006年))的结果。
为了研究所建立的人ctlt-HSC细胞系的多能性，使用了已知的异种移植物模型(Dick et al.,Stem Cells15 Suppl 1,199-203,1997(Dick等人，《干细胞》，第15卷增刊1，第199-203页，1997年))。这个模型涉及对NOD/SCID/β2M-/-小鼠进行辐照，并将ctlt-HSC移植到经辐照的小鼠体内。将几群NOD/SCID/β2M-/-小鼠进行亚致死性辐照(300拉德)，并将104个CD34+人ctlt-HSC细胞移植到小鼠体内。该细胞在移植之前维持在培养物中10周。该小鼠在移植后6周或12周进行放血。用对人白细胞抗原具有特异性的抗体对人源化嵌合NOD/SCID/β2M-/-小鼠的外周血中存在的淋巴细胞进行染色。具体地讲，用抗CD19、CD20和CD3的抗体对样品进行染色。
如图4中所示，与没有接受干细胞移植物的对照小鼠相比，在嵌合NOD/SCID/β2M-/-小鼠的外周血中检测到人B细胞(hIgM+细胞)和人CD45+T细胞。具体地讲，对照小鼠的外周血具有0.075％的hIgM+/hCD45+细胞(图4A)，第一嵌合小鼠的外周血具有31％的hIgM+/hCD45+细胞(图4B)，第二嵌合小鼠的外周血具有77.1％的hIgM+/hCD45+细胞(图4C)，并且第三嵌合小鼠的外周血具有49.5％的hIgM+/hCD45+细胞(图4D)。
实例5：在体外从人ctlt-HSC产生成熟红细胞
使用已确立的类红细胞谱系表面标志物来证明人ctlt-HSC在体外产生成熟红细胞的能力。将人ctlt-HSC在液体培养基(Stemline II培养基)中温育，并用EPO和IL-3处理12天。如图5中所示，在对培养物接种EPO和IL-3 10天后进行的苏木精和伊红染色分析显示在培养物中有大量的无核细胞。通过流式细胞术对无核细胞群体进行检查，显示了表达类红细胞表面标志物血型糖蛋白A、CD71和CD41的细胞群体。另外，这些细胞缺乏CD45表达或其他非类红细胞谱系标志物的表达。
具体地讲，图5A显示了对照小鼠外周血的苏木精和伊红染色。图5B显示原代人胎儿脐带血的苏木精和伊红染色。图5C、5D和5E显示三种用IL-3和EPO处理12天的条件性转化的胎儿脐带血细胞系的苏木精和伊红染色；并且图5F显示图5E的细胞的放大视图以显示红细胞形态。
实例6：源自ctlt-HSC的人红细胞的体内功能表征
通过测试在体外从ctlt-HSC产生的红细胞将小鼠从致死性贫血中挽救出来的能力，来测定该红细胞的功能性。由于使用的是人红细胞，因此选择用于这些实验的小鼠是免疫受损的小鼠。将两种不同品系的免疫受损小鼠用于这些研究。这两种小鼠品系通常用于这类研究(Hogan et al.,Biol Blood Marrow Transplant 3,236-46,1997(Hogan等人，《血液和骨髓移植的生物学》，第3卷，第236-46页，1997年))。这两种品系为NOD/SCID小鼠和Rag-1-/-/γc-/-小鼠。体内功能研究的操作原理是诱导某种形式的贫血，该贫血对于所述小鼠将是致死性的，除非所述小鼠被提供了功能性红细胞群体。
所使用的一种方案改编自Hiroyama的方案(参见Hiroyama,PloS One 2,e1544,2008)。这个方案使用苯肼来通过体内溶血诱导贫血。然后，经处理的小鼠在第二天被给予红细胞，或者不作进一步的处理。接着4天后第二次注射该药物。如果在第一轮的化学诱导溶血后没有提供功能性红细胞，则动物们在第二轮致死性攻击后不久即死亡。如果提供功能性红细胞，则将小鼠从致死性贫血攻击中挽救出来。
在初始接种后十天，使用本文描述的方法从人ctlt-HSC群体体外衍生107个人红细胞。获得一群NOD/SCID小鼠并在第0天用80mg/kg的苯肼进行处理。在第1天，通过尾静脉注射，将107个人红细胞转移到该群经处理的小鼠中一半的小鼠体内。在第6天进行第二次苯肼攻击。然后在第二次苯肼攻击后，观察小鼠的存活情况9天。
如图6中所示，源自ctlt-HSC的人红细胞能够将小鼠从化学诱导的致死性贫血中挽救出来。具体地讲，用苯肼处理(Phenyl)但不用源自人ctlt-HSC的红细胞处理(无AT)的小鼠仅有大约20％存活，而既用苯肼处理(Phenyl)也用源自人ctlt-HSC的红细胞处理(AT)的小鼠100％存活(图6)。这与不用苯肼处理的野生型小鼠(WT)相当。
另一种用来测试源自ctlt-HSC的人红细胞的体内功能性的方法包括通常用来评估红细胞内稳态的方案。在这个情况中，将小鼠大量放血(500μl，或者血液总体积的约17％)，然后放在饲养箱中进行观察。但是，发现正常的小鼠不用进一步干预即从这个损伤中恢复过来。因此推断，为了延迟红细胞区室从出血性休克中恢复归来，将需要使类红细胞祖细胞失能。
因此，为了影响红细胞恢复速率，在进行400μl尾部放血之前用450拉德对免疫受损的小鼠进行亚致死性辐照。在这个情况中，小鼠在48小时内死亡，除非通过尾静脉注射提供1×107个类红细胞的输注。在一群Rag-1-/-/γc-/-小鼠中诱导这个形式的致死性贫血，该群中一半的小鼠接受了使用本文描述的方法在体外源自人ctlt-HSC群体的1×107个类红细胞。在诱导急性贫血和移植类红细胞后，监测小鼠的存活情况9天。如图7中所示，在体外源自ctlt-HSC的人红细胞能够将Rag-1-/-/γc-/-小鼠从由复合损伤诱导的致死性贫血中挽救出来。具体地讲，Rag-1-/-/γc-/-小鼠仅有大约10％从由复合损伤诱导的致死性贫血(创伤无AT)中存活下来，而用源自人ctlt-HSC的红细胞挽救(创伤AT)的小鼠则100％存活(图7)。这与没有经历由复合损伤诱导的致死性贫血的野生型小鼠(WT)相当。
实例7：TAT-MYC融合蛋白和TAT-Bcl-2融合蛋白向HSC中的直接蛋白质转导
与采用MYC-ER和/或Bcl-2-ER来产生ctlt-HSC细胞系的方法有关的风险之一是病毒序列随机整合到宿主细胞的基因组中。这是一个问题，因为任何有核ctlt-HSC在用于输注的红细胞制剂中的存留会对接受这些细胞的患者造成不期望的风险。本实例描述的实验证明了一种用于产生ctlt-HSC细胞系而不使病毒序列引入到宿主细胞的基因组中的替代方法。
为了不经遗传操纵(即病毒转导)而将蛋白质引入到细胞中，这个替代方法依赖于HIV-1 TAT(TAT)蛋白跨过生物膜并将蛋白质货物递送到细胞中的能力(Schwarze et al.,Trend Pharmacol Sci 21,45-8,2000(Schwarze等人，《药理科学趋势》，第21卷，第45-8页，2000年))。产生了多个编码与MYC或Bcl-2融合的TAT片段的质粒。然后将这些质粒转化到细菌细胞中，并在对数生长期用IPTG诱导这些细胞。3小时后收集经诱导的细胞，在镍柱上纯化蛋白质。然后通过Bradford测定法分析所得级分的蛋白质含量，并在SDS-PAGE凝胶上跑胶，再用考马斯蓝对所述凝胶染色(图8)。如图8A中所示，级分E2-E11含有TAT-MYC，其中级分E3-E5含有最多的TAT-MYC。如图8B中所示，级分E1-E6含有TAT-Bcl-2，其中级分E2含有最多的TAT-Bcl-2。
测试了使用TAT-MYC和TAT-Bcl-2来直接转导鼠Lt-HSC的想法，以便不用MYC-ER和Bcl-2的反转录病毒基因转导就产生ptlt-HSC细胞系。从C57/BL6小鼠的骨髓收集5FU富集的HSC，并在补加有重组IL-3、IL-6和SCF的培养基中温育。另外，将细胞与在低内毒素条件下制备的纯化的重组5μg/ml TAT-MYC和10μg/ml TAT-Bcl-2蛋白一起温育。每48小时更换培养基和TAT融合蛋白，将细胞维持在培养物中21天。然后使用ptlt-HSC细胞系的等分试样通过流式细胞术表征鼠ptlt-HSC细胞系的表型。用抗干细胞标志物c-kit和sca-1以及谱系标志物CD3、B220和Ter119的抗体对细胞进行染色。如图9中所示，这些培养物中的c-kit+、sca-1+、lin-细胞群体优先得到扩增。这是与原代鼠Lt-HSC中所见到的表型相似的表型(Cheshier et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 96,3120-3125,1999(Cheshier等人，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第3120-3125页，1999年))。具体地讲，77.5％的细胞为c-kit+和sca-1+(图9B)，而98.1％的细胞为CD3-和B220-(图9C)，并且99.4％的细胞为Ter119-(图9D)。
为了表征源自TAT-MYC和TAT-Bcl-2的ptlt-HSC细胞系的体内多能性，将104个细胞移植到经亚致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内。移植后四周，通过静脉穿刺从接受小鼠收集外周血。然后通过流式细胞术评估PBMC的B细胞标志物B220和IgM及T细胞标志物CD4、CD8和TCRβ。将经染色的细胞与未经染色的细胞进行比较。如图10中所示，将鼠ptlt-HSC细胞系移植到经亚致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内导致了淋巴样区室的重构。具体地讲，大约10.7％的PBMC为B220+和IgM+，而对照Rag-1-/-小鼠中为0％(图10B)；大约13.5％的PBMC为CD4+和TCRβ+，而对照Rag-1-/-小鼠中为大约0.09％(图10C)；并且大约6.8％的PBMC为CD8+和TCRβ+，而对照Rag-1-/-小鼠中为大约0.011％(图10D)。
实例8：从用TAT-MYC融合蛋白和TAT-Bcl-2融合蛋白转导的鼠ptlt-HSC发育红细 胞
成熟无核红细胞也源自通过用TAT-MYC融合蛋白和TAT-Bcl-2融合蛋白转导而产生的鼠ptlt-HSC细胞系，与在人ctlt-HSC中观察到的情况相似(图5)。在这个实验中，将鼠ptlt-HSC在存在和不存在IL-3、EPO和TAT-MYC这两种情况下进行培养。在培养物中10天后，通过苏木精和伊红染色评估细胞分化情况(图11)。发现用IL-3、EPO和TAT-MYC处理的鼠ptlt-HSC导致了高频率的完全无核鼠红细胞(图11B和11C)，而对照细胞不分化为红细胞(图11A)。另外，通过流式细胞术表征鼠红细胞，发现它们表达的血型糖蛋白A水平提高而CD71水平减低。
实例9：源自人ptlt-HSC的红细胞的产生
以下实例描述从人蛋白转导长期HSC(ptlt-HSC)细胞系体外产生人成熟无核红细胞及其表征。有利地，在不需要使用经遗传修饰的HSC、动物血清或动物饲养细胞的培养条件下，人红细胞可以可靠地在10天内产生。另外，所产生的红细胞是完全分化和成熟的、无核的人红细胞，其表达血型糖蛋白A(GPA)，并且表达的CD71和胎儿血红蛋白水平降低。CD71标志物是转铁蛋白受体，其通常在红血球(即红细胞)祖细胞中以高水平表达，但在成熟红血球中被下调。GPA标志物通常在成熟红血球中以高水平表达，作为膜成熟的标志。
ptlt-HSC细胞系的体外产生和扩增
转基因的和蛋白质转导的条件性无限增殖化造血干细胞先前已有描述(参考文献)。在本实验中，使用先前所描述的用TAT-MYC融合蛋白和TAT-Bcl-2融合蛋白进行的蛋白质转导来产生ptlt-HSC细胞系。这些融合蛋白含有源自HIV-1 TAT(TAT)蛋白的TAT肽。
从本地的脐带血库获得了一单位的人脐带血。然后，通过如下方式分离来自脐带血的有核细胞群体：用磷酸缓冲盐水(PBS)以1:1稀释细胞。将20ml的经稀释的脐带血细胞小心地覆盖到20ml淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque Plus)(安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences))上。然后将细胞在900×重力加速度下离心60分钟。离心后，用玻璃吸管移取血沉棕黄层并用PBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在伊思考夫改良杜尔贝可培养基中并进行培养，该培养基补加有15％的人血浆、100单位/ml的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3、50ng/ml的IL-6、50ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的GM-CSF、20ng/ml的TPO、20ng/ml的Flt3-L、5g/ml的TAT-MYC和5μg/ml的TAT-Bcl-2。
初始的细胞群体(第0天)为0.12％CD34+/CD38lo。在培养物中3天后，CD34+/CD38lo细胞的频率已上升到1.24％(图12A)。在培养物中14天后，45.2％的细胞群体为CD34+/CD38lo(图12B)。此外，在培养物中14天后，细胞的总数目有净增长。HSC在TAT-MYC和TAT-Bcl-2存在下在培养物中扩增21天后形成细胞系。将这个细胞系指定为蛋白转导长期HSC(ptlt-HSC)细胞系。然后使用这个细胞系作为细胞来源进行红细胞(RBC)分化和表征。
源自ptlt-HSC的红细胞的体外产生
然后使用体外产生的人ptlt-HSC来产生人无核成熟红细胞。然后对这些源自ptlt-HSC的人红细胞进行表征。使用FACS分析来测量人血型糖蛋白A(GPA)、人CD71(转铁蛋白受体)和人胎儿血红蛋白的表达水平和模式。
通过将源自脐带血的ptlt-HSC在补加有3.2ng/ml的IL-3和100单位/毫升的EPO及15％的人血浆和100单位/毫升的Penn/Strep的DMEM培养基中进行培养，来诱导红细胞分化。然后将细胞培养至少9天。
如图13中所示，在将ptlt-HSC培养物转移到红细胞分化条件(IL-3和EPO)时，细胞在4天后开始高水平表达GPA和CD71。维持在含有TAT-MYC和TAT-Bcl2但缺乏IL-3和EPO的培养基中的细胞不表现出这些变化(图12)。使用培养物的样品进行血型糖蛋白A(GPA)和CD71(转铁蛋白受体)的细胞表面表达的FACS分析。如图13中所示，将通过在IL-3和EPO存在下培养而被诱导到红细胞分化程序中的ptlt-HSC进行染色确定GPA和CD71表达，并且与未经染色的细胞和在含有TAT-MYC和TAT-Bcl2但缺乏IL-3和EPO的中性培养基中培养的ptlt-HSC进行比较。结果显示，到用IL-3和EPO培养的第4天为止，大约42％的细胞为CD71+/GPA+(图13C)，相比之下，未经染色的对照中有大约0.366％的CD71+/GPA+细胞(图13A)，而在该中性培养基中培养4天的细胞中有大约0.222％的CD71+/GPA+细胞(图13B)。
另外，在将ptlt-HSC转变为分化培养物后9天，发育中的红细胞开始减少其转铁蛋白受体(CD71)的表达，而在其表面上保持高水平的GPA(图14)。CD71的表达的这一转变与培养物中的无核人红细胞的频率提高同时发生(图14和15)。也对这些细胞的胎儿血红蛋白进行染色。
图14显示，随着发育中的红细胞从GPA/CD71双阳性转变为GPA+/CD71lo，它们也从表达高水平的人胎儿血红蛋白转变为表达低水平的胎儿血红蛋白。不想受理论的约束，但据信具有低水平的胎儿血红蛋白的GPA+/CD71lo细胞具有相应地高水平的成人血红蛋白。
在诱导后的三个时间点(第7天、第12天和第22天)，对来自红细胞分化培养物的细胞进行FACS分析。该FACS分析测量GPA和CD71的细胞表面表达。还对该细胞监测胎儿和成人血红蛋白的表达。使用从外周血获得的原代人红细胞作为阳性对照(图14；对照，顶行)。结果显示在第7天有许多GPA/CD71双阳性细胞(图14；顶部第1小图)。结果还显示，到第12天为止，细胞已大部分转变为GPA+/CD71lo(图14；顶部第2小图)。第12天的细胞还表达高水平的胎儿血红蛋白(图14；底部第2小图)。到分化培养基中第22天为止，细胞保持为GPA+/CD71lo，但胎儿血红蛋白的表达水平下调，而成人血红蛋白的表达提高(图14；顶部和底部第3小图)。成熟标志物表达的这些动态变化与人和小鼠中的正常红细胞分化期间在骨髓中观察到的变化相一致。具体地讲，将ptlt-HSC细胞在诱导培养基(IL-3和EPO)中培养7天后，大约60.9％的细胞为GPA+/CD71+，大约1％的细胞为GPA+/CD71-，并且71.4％的细胞表达胎儿血红蛋白(图14B)。将ptlt-HSC细胞在诱导培养基(IL-3和EPO)中培养22天后，GPA+/CD71+已转变为GPA+/CD71-。与对照血液相似，76％的GPA阳性细胞表达成人血红蛋白，并且仅20.3％的细胞表达胎儿血红蛋白(图14；底行第2和第3小图)。
另外，通过用苏木精和伊红对第3天和第7天的红细胞分化培养物样品进行染色，对培养物中的无核情况进行组织学分析(图15)。使用细胞离心装置将细胞置于载片上。然后用苏木精和伊红对载片进行染色，使用倒置显微镜和光摄影术获得照片。早在第3天就观察到出现小的无核细胞(图15A)，到第7天为止发现数量增加(图15B)。
实例10：源自ptlt-HSC的红细胞的扩大生产
以下实例描述将源自人ptlt-HSC的红细胞的体外生产扩大到临床上相关的生产水平。
在透气袋中生产源自ptlt-HSC的红细胞
还使用透气袋扩大源自人ptlt-HSC的红细胞的体外生产(图16)。
将在细胞接触一侧具有基于特氟龙的涂层的透气袋进行优化以用于源自ptlt-HSC的红细胞的体外生产(图16A)。用在透气袋(傲锐基因公司(Origene))中在中性条件下与TAT-MYC和TAT-Bcl-2温育5天的人ptlt-HSC开始培养。然后将培养物转移到含有IL-3和EPO的培养基中以诱导红细胞分化。图16A中显示的照片是在红细胞分化培养基中温育4天后拍照的。图16B显示透气培养袋中红细胞的成熟和无核化。从图16A中所示的袋中获取细胞样品，并用细胞离心装置固定到玻璃载片上。然后用苏木精和伊红对载片进行染色，使用倒置显微镜和光摄影术获得照片。
体外ptlt-HSC分化培养物的连续传代
本实例描述在红细胞分化培养基中培养的ptlt-HSC可在体外连续产生红细胞的时间长度。这是开发用于生产临床上相关的量的供人输注的红细胞(1011个细胞/单位)的工艺中的一个重要因素。
第一组实验涉及ptlt-HSC在体外在类红细胞分化条件(即用IL-3和EPO进行培养)下的连续传代。将Ctlt-HSC以3×106、106、3×105和105的密度接种在6孔平板中。将细胞在补加有10％的人血浆、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3、50ng/ml的IL-6、50ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的GM-CSF、20ng/ml的TPO和20ng/ml的Flt3-L的伊思考夫改良杜尔贝可培养基中进行培养。然后将起始的ptlt-HSC群体进行人HSC和类红细胞标志物(GPA、CD71和胎儿血红蛋白)染色。目视监测和通过FACS分析监测培养物的成熟红细胞发育情况。在建立了初始培养物后10天，取细胞等分试样经聚蔗糖(Ficoll)梯度离心以将有核活细胞与红细胞分离。通过FACS对这两个细胞级分分析HSC和类红细胞谱系的细胞表面标志物的表达。还使用类似的方法来分析每个10天的循环结束时的培养物。
将聚蔗糖梯度的中间相中存在的有核细胞在新鲜PBS和培养基中洗涤，然后在相同条件下再次接种。证实了至少一个ctlt-HSC细胞系能够从单一浓度的ctlt-HSC开始，在三次连续传代后产生成熟红细胞。在一些实施例中，将ctlt-HSC细胞系扩增，然后在PTD-Myc存在下暴露于红细胞分化培养基。在大约9至28天中分离红细胞后，将剩余的非红细胞再次置于分化培养基中，并且在大约9至28天中分离红细胞。这个过程可重复至少3次，并且预期可无限地连续进行。
结果表明，源自ptlt-HSC的类红细胞祖细胞可连续产生2至4代红细胞。
在培养物生物反应器系统中大规模生产源自ptlt-HSC的红细胞
本实例描述对四个不同的系统测试从ptlt-HSC大规模体外生产成熟无核人红细胞。
最初测试了两个系统(柔性塑料容器(设计用于细胞培养)和透气袋)。这些系统得到的结果表明，可通过对组织培养容器作出设计上的变化和更改培养条件，来优化人红细胞的大规模生产。
为了探索更为有效的产生大量红细胞的方法，将以上描述的用于从人ptlt-HSC体外产生红细胞的一步方案进行改编以适合旋转烧瓶生物反应器(例如TAP Biosystems公司的Ambr微型生物反应器和ATMI公司的Integrity PadReactor反应器)、透气袋(Origene系统)、透气组织培养瓶(Wilson Wolf G-rex透氧瓶)或设计用于细胞培养的柔性塑料容器(GE Wave系统)。这些实验确定在体外从ptlt-HSC大规模生产人红细胞的可行性。
用于在体外从人ptlt-HSC产生红细胞的基本方案是从获得源自脐带血的HSC开始。通过如下方式分离来自脐带血的有核细胞群体：用磷酸缓冲盐水(PBS)以1:1稀释细胞。将20ml的经稀释的脐带血细胞小心地覆盖到20ml淋巴细胞分离液(安玛西亚生物科技公司)上。然后将细胞在900×重力加速度下离心60分钟。离心后，用玻璃吸管移取血沉棕黄层并用PBS洗涤两次。然后将细胞重新悬浮在伊思考夫改良杜尔贝可培养基中，该培养基补加有10％的人白蛋白、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3、50ng/ml的IL-6、50ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的GM-CSF、20ng/ml的TPO、20ng/ml的Flt3-L、5g/ml的TAT-MYC和5μg/ml的TAT-Bcl2。将细胞维持在这些培养条件下12至30天，取决于期望的CD34+/CD38-群体富集程度以及所需的总细胞数目。当将培养基改变为补加有15％的人白蛋白、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3和3.2单位/毫升的EPO的DMEM时，红细胞分化被诱导。将细胞再培养11天。然后使用抗GPA、CD71和胎儿血红蛋白的抗体，通过FACS监测细胞的红细胞分化。还进行苏木精和伊红的组织学染色。
将体外红细胞生产方案进行改编以适合在之前用来生长大量源自脐带血单位的人造血细胞的、基于旋转烧瓶的生物反应器中进行大规模生产。这个系统涉及使用两种不同的旋转烧瓶生物反应器系统。首先，使用Ambr微型生物反应器系统(TAP Biosystems公司)。这是一个在小规模模拟经典生物反应器的特性的旋转烧瓶的条件下装载10至15ml的培养物的装置。这个装置使用一次性微型反应器腔室并且以自动方式控制。其中一个重要优点是它允许24种不同条件的同时培养(Genetic Engineering and BiotechnologyNews,Nov 1,2010,Vol.30,N.19)(《遗传工程和生物技术新闻》)，2010年11月1日，第30卷，第19期)。这个方法能将体内红细胞发育条件进行快速优化并适合于基于生物反应器的形式。一旦优化了条件，就将工艺转变到大规模系统(Integrity PadReactor,ATMI)。PadReactor系统是单次使用的生物反应器，其由如下组成：允许使用者在不同体积的袋子中同时生长细胞的驱动单元，支撑其中生长细胞的袋子并能够移动到模块化制造空间中的可移动罐，以及生物反应器容器，该容器是具有桨叶的单次使用的细胞袋，桨叶在袋中旋转时允许进行非侵入式混合(non-invasive mixing)。这个系统提供改进的混合，而剪切力却下降，适合于悬浮细胞，并且能在小体积中生长细胞。
透气袋
如上所描述，使用基本的透气袋(傲锐基因公司)来在体外生产红细胞。这些袋子具有内部特氟龙涂层，该涂层也能够从容器的整个表面积交换气体。但是，该系统可进行优化以在一旦细胞达到临界密度时连续提供培养基更换。因此，可设计出能使培养基在两腔室的透气袋系统中连续流动的新系统。除了使细胞损失减至最低之外，该系统还能够提供其中培养基和废物透过外腔室灌流的连续流动系统。这个系统还允许将ptlt-HSC培养物从HSC生长条件转变为红细胞分化条件。
测试ptlt-HSC以确定该细胞是否能够在双袋系统中繁殖。用107个人ptlt-HSC接种袋子并与TAT-MYC和TAT-Bcl-2一起维持在补加有10％的人白蛋白、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3、50ng/ml的IL-6、50ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的GM-CSF、20ng/ml的TPO和20ng/ml的Flt3-L的伊思考夫改良杜尔贝可培养基中。这些条件是允许ptlt-HSC细胞繁殖并保持其多能性的中性条件。然后在10天后，用抗人干细胞表面标志物的抗体对初始的ptlt-HSC进行染色，确定在这些条件下ptlt-HSC扩增的程度。
一旦在支撑ptlt-HSC在中性条件下的扩增方面对该双袋进行了测试，将用ptlt-HSC接种双袋系统以进行红细胞生产。所使用的孔大小为大约5千道尔顿截留值，以防止在培养基的循环过程中逐出红细胞。该双袋系统将接种107个ctlt-HSC，并且该细胞将用补加有10％的人白蛋白、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3、50ng/ml的IL-6、50ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的GM-CSF、20ng/ml的TPO和20ng/ml的Flt3-L的伊思考夫改良杜尔贝可培养基连同TAT-MYC和TAT-Bcl-2进行培养。在培养3天后，将培养基换成补加有10％的人白蛋白、100单位/毫升的Penn/Strep、20ng/ml的IL-3和50ng/ml的EPO的伊思考夫改良杜尔贝可培养基。每3天从生物反应器收集样品。这个时间范围是需要用含细胞因子的培养基补充一些培养基的结果。然后通过计数以及通过如以上各实例中所描述的FACS和显微镜方法分析收集到的细胞。在该双袋系统被报道支撑细胞扩增的时间段(10-12天)测定红细胞的总产量。另外，还测定在第1天被用来接种该膜管(cartridge)的ptlt-HSC的命运。理想地，ptlt-HSC在该双袋系统中经2至4轮培养仍保持有活性，使得可以收获红细胞并且剩余的ptlt-HSC可再次接种在新鲜培养基中以产生另外的红细胞。将目前用于从获自患者的外周血进行红细胞分离的连续离心方法用于收集在该双袋系统中产生的红细胞。
柔性塑料袋容器
如上所描述，还使用设计用于细胞培养的柔性塑料袋容器(GE Wave)来体外产生红细胞。但是，可对该系统进行优化以减少起始ptlt-HSC群体的过早和不受控制的分化。
在将红细胞分化培养基置于柔性塑料袋容器中时，将从标准的通气组织培养瓶中的静止培养物获得的大量ptlt-HSC转移到红细胞分化培养基中。通过使用FACS分析来测量CD71、GPA和胎儿血红蛋白的表达水平，研究无核化速率和红细胞成熟动力学。还使用组织学分析来证实成熟状态。然后将该柔性塑料容器的内部用少量ptlt-HSC包被，该ptlt-HSC在同一容器中扩增并转到红细胞分化培养基。
透气组织培养烧瓶
除了用两种不同的基于袋的生物反应器系统及旋转烧瓶装置进行实验以外，还对透气组织培养烧瓶测试ptlt-HSC和RBC的扩大生产。
对透气烧瓶(Wilson Wolf)同时测试以下两方面：少量的ptlt-HSC扩大生产成临床上相关数量的细胞，以及ptlt-HSC在受调节下分化为红细胞。整个程序在单个烧瓶中进行。该烧瓶使细胞与氧气和营养物的接触要比现有的设备好得多。此外，该烧瓶的使用要容易得多。该烧瓶在标准的培养箱中发挥功能，并且使用标准的实验室设备。该烧瓶的底部由独特的二甲基硅氧烷透气膜制成，该膜提供比任何现有的透气设备更好的氧气渗透性(Lapteva和ad Ver，《国际干细胞电子版》(Stem Cells Int,Epub)，2011年9月11日)。细胞因重力沉降到这个透气膜，在膜上细胞浸没在培养基中的深度要比现有的设备可能允许的深度要大得多。在这些条件下，细胞按需接受氧气和营养物，而不用进行经常的送料或经受任何来自培养基混合设备的搅动。
实例11：人ptlt-HSC细胞系的体外和体内表征
以下实例描述实例9中产生的人ptlt-HSC细胞系的表面表型表征以及体外和体内多能性。本节中描述的实验在体外使用标准的甲基纤维素分化测定法和在体内使用异种移植物小鼠模型来测定谱系潜能。
至少4种人ptlt-HSC细胞系用于本实例中讨论的研究中。选定的人ptlt-HSC细胞系是基于以下四个标准选择的。第一，该细胞系具有类似于原代人Lt-HSC(CD34+,CD133+.CD48+,CD150+,lin-)的表面表型。第二，人ptlt-HSC在实例9中描述的条件下在培养物中旺盛繁殖，并且保持对外源添加的TAT-MYC的依赖性以在体外繁殖。第三，人ptlt-HSC能够迅速地从冻存中恢复，同时保持其表面表型和生长特性。第四，一种细胞系选自以下基因型中的每一者：A rh-、B rh-、AB rh-、O rh-，以产生一组人ptlt-HSC，该组人ptlt-HSC则产生临床上使用的红细胞的主要形式。
将10、102或103个人ptlt-HSC细胞系接种在先前已描述的甲基纤维素分化培养基(Dick et al.,Stem Cells 15 Suppl 1,199-203,1997(Dick等人，《干细胞》，第15卷，增刊1，第199-203页，1997年))中。具体使用补加有旨在促使HSC朝髓样细胞谱系(Dick et al.,Stem Cells 15 Suppl 1,199-203,1997(Dick等人，《干细胞》，第15卷，增刊1，第199-203页，1997年))、髓样细胞-类红细胞谱系或前B细胞谱系(Cheshier et al.,Proc.NatlAcad.Sci.USA 96,3120-3125,1999(Cheshier等人，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第3120-3125页，1999年)；和Hogan et al.,Biol Blood Marrow Transplant 3,236-46,1997(Hogan等人，《血液和骨髓移植的生物学》，第3卷，第236-46页，1997年))分化的细胞因子的培养基。然后针对集落数目、形态及集落发育动力学方面评估各个板的集落形成情况，作为前体频率的度量。然后鉴定多能的Ptlt-HSC细胞系，所谓多能由该细胞系在所测试的不同条件的每种条件下产生特定集落的能力定义。
一旦证明了所讨论的ptlt-HSC细胞系有能力在体外产生多个造血谱系，则研究它们的体内多能性。然后使用这些ptlt-HSC细胞移植到几群经亚致死性辐照的NOD/SCID小鼠体内，每群10只小鼠，如先前对原代人Lt-HSC所进行那样(Dick et al.,Stem Cells 15Suppl 1,199-203,1997(Dick等人，《干细胞》，第15卷，增刊1，第199-203页，1997年)；和Hogan et al.,Biol Blood Marrow Transplant 3,236-46,1997(Hogan等人，《血液和骨髓移植的生物学》，第3卷，第236-46页，1997年))。给经辐照的小鼠移植104个已在实例9中描述的培养条件下维持的ptlt-HSC。然后通过静脉穿刺将小鼠放血以收集外周血样品进行分析。将红细胞裂解，并对PBMC进行人CD3和CD19的染色。一旦在外周血中检测到人淋巴样细胞，通过CO2窒息和颈椎脱位对小鼠行安乐死。然后从小鼠收获淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓。从这些器官产生单细胞悬浮液，用对人CD3、CD19、CD4、CD8、Mac-1、Gr-1和Ter-119具有特异性的抗体对细胞进行染色。检测到人造血细胞的多个谱系则证明人ptlt-HSC细胞系的多能性。包括了两个对照。使用不经操纵的小鼠或经亚致死性辐照但不移植人ptlt-HSC细胞的小鼠作为阴性对照。使用一群经亚致死性辐照并用实例4中产生的人ctlt-HSC细胞系移植的小鼠作为阳性对照。
实例12：在源自ctlt-HSC的人红细胞中表达的血红蛋白类型的分析
以下实例通过测定红细胞的特定种类的血红蛋白(胎儿、成人等)，来描述实例9中产生的人红细胞(RBC)的分化状态(例如分化为类红细胞谱系的程度，以及发育状态)。
通过两种平行的方法测定实例11中使用本文描述的方法产生的人红细胞中所表达血红蛋白的性质。首先，从用来产生人红细胞的培养物中存在的红细胞前体获得mRNA。另外，从健康匿名志愿者获得的原代人红细胞也用作阳性对照。将人ctlt-HSC在补加有IL-3和EPO的Stemline II培养基中温育，如实例7中所描述。连续10天，每48小时收集部分细胞。一部分的细胞用于流式细胞术分析确定细胞表面表型和类红细胞分化标志物。还对细胞进行人CD71和GPA染色。样品中的其余细胞用于获得mRNA以产生cDNA。所得的cDNA用作三种球蛋白基因(血红蛋白α、β和γ)和两种看家基因(β-肌动蛋白和GAPDH)的半定量RT-PCR(Q-PCR)的模板。使用几组引物来扩增在胎儿红细胞中正常表达的血红蛋白转录物。还分离了来自阳性对照的mRNA。预期，在体外从ctlt-HSC产生的人红细胞及其祖细胞能表达成人球蛋白基因。通过使用单克隆抗体和FACS分析验证mRNA结果。
通过先前描述的灌注层析和HPLC(Honig et al.,J Biol Chem 265,126-32,1990(Honig等人，《生物化学杂志》，第265卷，第126-32页，1990年))验证血红蛋白在源自ctlt-HSC的人红细胞中的存在。收集从以上描述的体外培养物获得的红细胞，在0.9％NaCl中洗涤3次，然后悬浮在9体积的水中，用皂苷裂解，通过在600×g下离心澄清。使用先前描述的MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)质谱仪(Bruker Omniflex)(Honig et al.,Am.J.Hematol 34,199-203,1990(Honig等人，《美国血液学杂志》，第34卷，第199-203页，1990年))获得球蛋白的质谱图。ZipTips购自密理博公司(Millipore)，装有C18和C4树脂以制备分别用于肽和蛋白质的MS分析的溶液。氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和芥子酸(SA)分别用作肽和蛋白质的基质。使用基质溶液(3至10mg CHCA或SA在1ml含有0.1％TFA的50％乙腈水性溶液中)的等分试样(1.3ml)从ZipTips洗脱肽/蛋白质并点滴到MALDI-TOF靶标上。使用配有337nm脉冲氮气激光器的LC/MS/MS系统(Agilent 1200系列HPLC模组、Agilent HPLC芯片接口、Agilent 6510四极杆飞行时间质谱仪)分析样品。使用m/z 16952的鸽子细胞色素c、m/z 12362的脱辅基肌红蛋白和m/z 39212的醛缩酶(adolase)(兔肌肉)的混合物的各峰进行外部质量校准。
还研究了在胎儿红细胞中正常表达的球蛋白基因的mRNA水平，以与在源自ctlt-HSC的人红细胞中表达的球蛋白基因比较。
实例13：源自ctlt-HSC的人红细胞的氧结合特性的分析
以下实例通过测量红细胞的氧平衡曲线，来描述实例9中产生的人红细胞(RBC)中所表达的血红蛋白的功能性质。
氧平衡曲线按先前的描述(Honig et al.,Am.J.Hematol 34,199-203,1990(Honig等人，《美国血液学杂志》，第34卷，第199-203页，1990年)；Maurer et al.,Nature227,388-90,1970(Maurer等人，《自然》，第227卷，第388-90页，1970年)；和Lee et al.,Rapid Commun Mass Spectrom 19,2629-35,2005(Lee等人，《质谱学快讯》，第19卷，第2629-35页，2005年))进行测量。所使用的方法是采用双波长分光光度计(Hemox分析仪，TCS公司)的连续方法。将红细胞悬浮在37℃和pH 7.4下的含有140mM NaCl的50mM bis-Tris缓冲液中。通过在1mm光学比色皿中将溶液进行闪光光解研究血红蛋白的结合性质。简单地讲，按先前的描述(Honig et al.,Am.J.Hematol 34,199-203,1990(Honig等人，《美国血液学杂志》，第34卷，第199-203页，1990年)；Maurer et al.,Nature 227,388-90,1970(Maurer等人，《自然》，第227卷，第388-90页，1970年)；和Lee et al.,Rapid Commun MassSpectrom 19,2629-35,2005(Lee等人，《质谱学快讯》，第19卷，第2629-35页，2005年))用10ns的532nm脉冲进行光解后，在436nm下分析CO与胞内血红蛋白四聚体的再结合的动力学。
还分析了源自ctlt-HSC的人红细胞的氧结合特性。
实例14：源自ctlt-HSC的人红细胞的细胞形状和柔韧性的分析
以下实例描述了通过测量红细胞的柔韧性来确定实例9中产生的人红细胞(RBC)是否能在体内微血管系统的背景中伸长和发挥功能。
按先前的描述(Kaul et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol 295,2008(Kaul等人，《美国生理学杂志：心脏和循环生理学》，第295卷，2008年))研究源自ctlt-HSC的人红细胞和从外周血获得的原代红细胞的变形性。简单地讲，使从实例9中描述的体外ctlt-HSC培养物和从健康成人的外周血获得的红细胞制品穿过脱白细胞过滤器(deleukocyting filter)(Leucolab LCG2,Macopharma)。然后通过细胞变形计量术(ekacytometry)检查去核的细胞。将红细胞悬浮在4％聚乙烯吡咯烷酮溶液中，然后暴露于细胞变形计量仪(Technicon，拜耳公司(Bayer))中的递增的渗透压梯度(从60至450mosM)。记录在这个设置下红细胞的激光衍射的变化。该光度测定产生被称为变形性指数(DI)的信号。DI曲线的分析提供细胞膜动态变形性与在170达因/cm2恒定施加剪切应力下的摩尔渗透压浓度的函数关系的量度。DI最大值与细胞的平均表面积有关。
实例15：源自ctlt-HSC的人红细胞的寿命的分析
以下实例描述实例9中产生的人红细胞(RBC)的平均无损伤寿命，以查明它们是否与原代人红细胞相当。原代人红细胞的平均寿命估计为120天。由于从外周血收集的红细胞的龄期各异，供临床使用的红细胞浓缩物的货架期通常为28天。据信如能够使红细胞的体外产生同步化，则可以显著延长供临床使用的红细胞浓缩物的货架期。
在一些实施例中，使用本文描述的方法在7至30天时间里产生红细胞。在一些实施例中，使用本文描述的方法产生的红细胞在同一天或大约同一天收集，例如在或大约在第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天、第23天、第24天、第25天、第26天、第27天或第28天收集。然后使用已知的方法，包括本文描述的那些方法，评估红细胞随时间推移的活力。
在一些实施例中，红细胞将被维持在红细胞贮存培养基中。在一些实施例中，红细胞贮存培养基还包括Bcl-2，任选地为PTD-Bcl-2。Bcl-2(任选地为PTD-Bcl-2)可作出初始弹丸提供，可连续提供，或者间隔地提供(例如每24小时、48小时、72小时、96小时等)。所提供的Bcl-2的浓度可包括0.5μg/ml至100μg/ml或更高。在一些实施例中，可提供1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml的Bcl-2(任选地为TAT-Bcl-2)到贮存培养基。然后使用已知的方法，包括本文描述的那些方法，评估红细胞随时间推移的活力。
为了测定源自ctlt-HSC的人红细胞的平均无损伤寿命，使用三个可通过流式细胞术定量和测量的标准(criteria)。第一，在一段时间里计数培养物中存在的活红细胞的数目，以测量相对于已知的起始数目的耗损率(attrition rate)。第二，测量源自ctlt-HSC的人红细胞的表面上的CD47水平。第三，测量源自ctlt-HSC的人红细胞的表面上暴露的磷脂酰丝氨酸(PS)水平。所有三个标准都是使用流式细胞术方法测量。将前向和侧向散射特性与活体染料(LDS-751)联合使用，以查明在特定的时间点培养物中存在的活的无核红细胞的数目。使用与荧光染料APC缀合的单克隆抗体测量红细胞的表面上存在的CD47的水平。如先前所描述(Holovati et al.,Transfusion 48,1658-68,2008(Holovati等人，《输血》，第48卷，第1658-68页，2008年))，用膜联蛋白V-FITC测量红细胞的表面上暴露的PS的水平。
如实例9中所描述，在IL-3和EPO存在下建立ctlt-HSC的培养物。在培养的第8至10天开始出现红细胞。收集来自ctlt-HSC培养物的红细胞并使其穿过脱白细胞过滤器(Leucolab LCG2,Macopharma)。从健康匿名供者获得原代人红细胞。两组细胞都在Stemline II培养基中建立在培养物中，并将培养物维持在37℃。还将细胞等分试样在通常用来贮存红细胞浓缩物的柠檬酸缓冲液(Lagerberg et al.,Transfusion 47,2242-9,2007(Lagerberg等人，《输血》，第47卷，第2242-9页，2007年)中4℃贮存。每组条件用1010个细胞建立。
为了测定来自任一来源的红细胞的无损伤存活率，每4天取等分试样，用活体染料(LDS-751)、抗人CD47-APC和膜联蛋白V FITC对细胞进行染色。然后使用BD FACSCalibur流式细胞仪分析细胞。持续分析等分试样直到在特定条件下不再有活细胞留下，或者持续分析等分试样达120天，以先到者为准。在Stemline II培养基中37℃下维持的红细胞培养物每7天补充培养基。
实例16：从经5-FU处理的骨髓分化红细胞的方法的比较
以下实例描述从小鼠骨髓产生红细胞。
用在200μl杜尔贝可氏PBS中的5mg 5-氟尿嘧啶(Genera Medix目录号NDC 10139-063-11)对C57BL/6(杰克逊实验室，编号003548)小鼠进行静脉注射。五天后，从C57BL/6小鼠的胫骨和股骨收获骨髓细胞。
使收获的骨髓细胞沉淀并重新悬浮于5ml无菌TAC缓冲液(135mM NH4CL,17mMTris Ph 7.65)中以裂解红细胞。让细胞在TAC缓冲液中静置1至2分钟，然后在1200RPM下离心细胞5分钟。用25ml的D10培养基洗涤细胞。将细胞沉淀重新悬浮于10ml的骨髓培养基(500ml瓶装DMEM，含有90ml热失活FBS、6ml Penn/Strep(Gibco目录号15140)、6ml MEMNEAA(Gibco目录号11140)、6ml L-谷氨酰胺(Gibco目录号25030)、6ml Hepes(Gibco目录号15630)和60ml的细胞因子混合物(IL3、IL6和SCF))。
计数这些重新悬浮的细胞，并以每孔1ml培养基中1×106个细胞的密度接种在24孔的簇培养皿(cluster dish)的各孔中。注意：如果5FU处理起作用，则每只小鼠应产生1至1.2×10^6个骨髓细胞，相比之下，未经处理的小鼠产生10×10^6个。
用在20μl人血清白蛋白(Grifols NDC 68516-5216-2)中稀释的5单位的TAT-MYC和5单位的TAT-Bcl2处理每个含有1ml培养基的孔。每2天更换培养基以更新细胞因子和TAT融合蛋白。在大约14至17天开始，Sca-1×cKit群体将开始在培养物中占优势。
在6孔板的每孔中接种2×105个Sca-1xcKit细胞。用1号红细胞分化培养基(IMDM，补加15％热失活FBS、10％含IL3的培养基以及100单位/毫升的EPO、100mM的地塞米松和25μg/ml的全转铁蛋白)置换骨髓培养基。为分离测试孔，加入以下测试融合蛋白：5单位/毫升的TAT-MYC、5单位/毫升的TAT-Bcl-2、或同时5单位/毫升的TAT-MYC和5单位/毫升的TAT-Bcl-2。
前6天，每2天更新1号红细胞分化培养基和融合蛋白。然后用2号红细胞培养基(IMDM，补加15％热失活FBS、10％含IL3的培养基以及100单位/毫升的EPO和25μg/ml的全转铁蛋白)置换1号红细胞培养基。继续每两天更新2号红细胞培养基和融合蛋白，直到约9至12天出现红细胞。
如图17中所示，与未经处理的对照(图17A)、在单独IL3和EPO中分化(图17B)或IL3和EPO添加TAT-Bcl-2(图17D)或TAT-Bcl-2和TAT-Myc组合(图17E)相比，在红细胞分化期间添加TAT-Myc(图17C)导致红细胞产生数目和百分比提高。
实例17：使鼠红细胞携带有效负载
如先前所描述收集源自经5FU富集的骨髓的HSC。在用5FU处理小鼠后5天收集细胞，并与IL-3、IL-6、SCF及TAT-MYC和TAT-Bcl-2进行培养。在培养的前2天，用pMSCV-hCD122-IRES-GFP或pMSCV-IRES-GFP中的一者或多者对细胞进行反转录病毒转导。转导后，将细胞在含有IL-3、IL-6、SCF、TAT-MYC和TAT-Bcl-2的培养基中再扩增14天。
通过FACS表征细胞的c-kit、sca-1、谱系标志物(B220、CD3、ter-119、Mac-1、Gr-1)的表面水平，以及GFP表达和表面hCD122。然后，经扩增的也表达GFP和hCD122的鼠LSK群体将被转换到之前所描述的使用含有IL-3、EPO和低浓度TAT-MYC的培养基的红细胞分化条件。14-28天后，培养物将被继续监测并表征CD71、GPA、成人和胎儿血红蛋白以及GFP和hCD122的表达，如之前所描述。
实例18：生物活性TAT-Myc融合蛋白和TAT-Bcl-2融合蛋白的产生
产生了具有HIV-1 TAT蛋白转导结构域(PTD)并具有人Myc的ORF或人Bcl-2的截短形式任一者的融合蛋白，所述人Bcl-2的截短形式已被缺失掉未结构化的环结构域(Anderson,M.,et al.(1999).Prot Expr.Purif.15,162-70(Anderson,M.等人，1999年，《蛋白质表达与纯化》，第15卷，第162-70页))。该重组蛋白还编码V5肽标签和6组氨酸标签，以利于检测和纯化(图18A)。TAT-MYC融合蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列在图24中示出。TAT-Bcl-2Δ融合蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列在图25中示出。
pTAT-Myc-V5-6xHis(AmpR)和pTAT-Bcl2Δ-V5-6xHis(AmpR)：通过使用编码HIV的框内TAT蛋白转导结构域(RKKRRQRRR)的正向引物对编码人cMyc或人Bcl2的cDNA进行PCR扩增来产生质粒。将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司(Invitrogen))载体中。使用Quick Change定点诱变试剂盒(Stratagene#200521-5)，从BCL-2编码序列去除未结构化的环(第27至80号氨基酸)。
在大肠杆菌(E.coli)中合成蛋白质并纯化至均质。SDS-PAGE电泳和考马斯染色揭示了用于我们的研究的最终产物的纯度水平(图18B)。将pTAT-Myc-V5-6xHis转化到BL21-STAR(DE3)细胞(英杰公司)中，用0.5mM IPTG在37℃下诱导蛋白质3小时。将细胞在裂解缓冲液(8M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris pH至7.0、10mM咪唑，pH 7.2)中进行裂解。将裂解物稀释至6M尿素并转至450mM NaCl、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH 7.0。用全能核酸酶(Benzonase)(500单位)在室温下处理裂解物1小时，通过在12,000RPM下离心60分钟进行澄清，并滤过0.22μM过滤器。使用GE AKTA纯化器10FPLC，在镍亲和柱(GE)上纯化Myc-V5-6xHis。通过将Myc-V5-6xHis透析到透析缓冲液(450mM NaCl、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH7.0、5％甘油、1mM DTT)中使其再折叠。通过使纯化的蛋白质穿过Acticlean Etox柱(Sterogen)减少内毒素。
Bcl2Δ-V5-6xHis蛋白如上所描述进行诱导。将细胞在50mL的裂解缓冲液(200mMNaCl、200mM KCL、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH 7.0、5％甘油、1mM DTT)中进行裂解，该裂解缓冲液补加有500单位的全能核酸酶、1mM的PMSF、2μg/ml的亮抑蛋白酶肽、0.015单位/毫升的抑蛋白酶肽(aprotinin)、5μM的鸡卵溶菌酶(HEL)每1L的诱导蛋白，并立即将细胞置于冰上1小时。将细胞在冰上进行超声处理(负载循环＝50％，输出＝5)2次，每次2分钟。裂解物通过在12,000RPM下离心60分钟进行澄清并滤过0.22μM过滤器。在镍亲和柱(GE)上纯化Bcl2Δ-V5-6xHis并如上所描述去除内毒素。
实例19：TAT融合蛋白的适当定位的确认
该融合蛋白定位到适当的胞内区室(图18C)。将NIH 3T3细胞接种到六孔板中的盖玻片上并生长至30至40％汇合度。每个孔用10μg/ml的TAT-Myc或TAT-Bcl-2转导，或者不进行处理以作为阴性对照。在蛋白质转导后2小时，将细胞在4％多聚甲醛-PBS中在室温(RT)下固定10分钟。将细胞在补加有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Triton X-100的PBS中在室温下进行透化处理3分钟。将细胞与在PBS-1％BSA中稀释(1:1000)的V5小鼠单克隆抗血清(英杰公司)一起温育45分钟。将细胞洗涤并与山羊抗小鼠Alexa 488二抗(InvitrogenA21121)一起温育30分钟。将盖玻片装到具有10μl的50％甘油滴的载玻片上，该甘油滴含有1μg/ml的Hoechst。在Zeiss Imager Z1荧光显微镜上获取图象。
TAT-Myc快速定位到原代人HSC的细胞核(图18D)。TAT融合蛋白在HSC中72小时后完全降解(图18E)。用TAT-Myc和TAT-Bcl2Δ转导胎儿脐带血细胞1小时，然后进行3次PBS洗涤。转导后两小时，收获5×106个细胞并分离细胞核级分和细胞质级分。接着5天，每24小时收获细胞(5×106个)。通过将细胞在10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl2、3mM CaCl2和0.5％NP40中裂解，制备细胞核蛋白和细胞质蛋白。使细胞核沉淀，并用三氯乙酸(TCA)沉淀含细胞质的上清液级分。进行了SDS-PAGE后，用抗V5抗体(英杰公司)、抗人β肌动蛋白(艾博抗公司(abcam))和山羊抗兔IgG-HRP或山羊抗小鼠IgG-HRP(圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology))探测蛋白质印迹。
实例20：用TAT-Myc和TAT-Bcl-2扩增源自人脐带血的HSC
从被本地脐带血库废弃的样品获得新鲜的脐带血细胞。所有的人细胞均去除身份标识，免除机构审查委员会(IRB)的监督。脐带血包括O+、O-、A+、A-、B+、B-和AB+，它们都表现出大约相同的扩增状况。
将总脐带血体积分成20ml等分试样并在PBS中1:1稀释。将经稀释的脐带血(20ml)小心地覆盖在20ml的淋巴细胞分离液(安玛西亚生物科技公司目录号17-1440-03)上。将细胞在900×重力加速度下离心60分钟。用玻璃吸管移取血沉棕黄层并用PBS洗涤两次。将细胞重新悬浮在FCB培养基(伊思考夫培养基(Gibco))中，该培养基补加有以上描述的10％人血浆、100单位/毫升的Penn/Strep、30ml的含SCF、IL3和IL6的培养基及30ml的含TPO、FLT3-L和GM-CSF的培养基。FCB培养基在就要添加到胎儿脐带血(FCB)细胞之前还补加5μg/ml的重组TAT-Myc和10μg/ml的重组TAT-Bcl-2。在扩增期间每3天更换培养基。
该细胞因子混合物含有IL3、IL6、TPO、Flt3-L、SCF和GM-CSF，这在该六种细胞因子的组合方面不同于先前报道的培养基(Suzuki,T.,et al.(2006)Stem Cells 24,2456-65(Suzuki,T.等人，2006年，《干细胞》，第24卷，第2456-65页))，重组TAT-Myc和TAT-Bcl-2的添加也不同。对体外扩增的人HSC的表面表型的评估表明，人HSC在TAT-Myc和TAT-Bcl-2存在下长期培养后保持其表面特性(图19A)。这组条件导致在培养14天中CD34+细胞的数目增加86.4倍，并且在培养21天中源自未经分级分离的脐带血的人CD34+细胞的数目增加103.8倍(图19B)。
实例21：TAT-Myc和TAT-Bcl-2扩增的人脐带血HSC在体外和体内具有生物活性
将体外扩增的人HSC接种在MethoCult Optimum(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))上，检查其产生特定的集落类型的能力。体外扩增的人HSC能够产生CFU-G、CFU-M、CFU-GM和BFU-E集落(图19C和19D)。另外，虽然在TAT-Myc和TAT-Bcl-2存在下扩增的HSC的表面表型在培养中保持，但它们的集落形成单位含量在这些条件下显著富集(图19D)。在TAT-Myc和TAT-Bcl-2存在下扩增的CD34+细胞还能够产生新的BFU-E、CFU-M、CFU-G和CFU-GM集落，而在单独培养基中培养的CD34+细胞不产生新的集落(图19E)。
对于测试体外扩增的人CD34+细胞在体内产生成熟人造血谱系的能力的实验，使用NOD/SCID/gc-/-小鼠(NSG)作为接受小鼠。这是有记载的可用于这个目的的小鼠模型(Tanaka,S.,et al.(2012).Development of mature and functional huamn myeloidsubsets in hematopoietic stem cell-engrafted NOD/SCID/IL2rgKO mice.J Immunol188,6145-55(Tanaka,S.等人，2012年，《在植入了造血干细胞的NOD/SCID/IL2rgKO小鼠体内发育成熟和功能性人髓样细胞亚群)，《免疫学杂志》，第188卷，第6145-55页)。
将胎儿脐带血细胞(FCB)注射到在就要进行注射之前接受了180拉德的辐照的NOD/SCID/gc-/-小鼠(NSG)(杰克逊实验室)体内。将扩增的FCB在PBS中洗涤3次，并在200μlPBS中通过尾静脉注射。移植后八周，小鼠经尾静脉放血，以使用以下抗体通过流式细胞术评估重构情况：抗人CD3(hCD3)(Biolegend目录号300312)、抗人CD19(hCD19)(Biolegend目录号302208)和抗人CD45(hCD45)(Biolegend目录号304028)。
在用1×107个未经分级分离的脐带血细胞产生的NSG嵌合小鼠中观察到表达人CD45+的T细胞和B细胞的短期发育。但是，通过用TAT-Myc和TAT-Bcl-2培养14天在体外产生的1×106个蛋白转导长期(ptlt)-HSC的引入，导致了异种嵌合NSG小鼠中出现更高频率的人CD45+细胞。另外，在移植后在小鼠的外周血中可观察到人CD45+细胞达20周之久(图20A)。在异种嵌合小鼠的骨髓中发现人CD45+、CD34+ CD38lo HSC(图20B)，在脾脏中发现人CD45+/CD3+和人CD45+/CD19+淋巴样细胞，并且在胸腺中发现人CD45+、CD3+淋巴样细胞。
用CFSE标记来自异种嵌合NSG小鼠的脾脏的人CD45+CD19+细胞，并用抗人CD40和IgM的单克隆抗体激活。在72小时时通过流式细胞术分析细胞的CFSE稀释情况。图20C显示在异种嵌合NSG小鼠体内发育的人B细胞的增殖状况。
使用来自异种嵌合NSG小鼠的骨髓的人CD45+、CD34+ CD38lo HSC在MethoCultOptimum中接种。这些细胞在MethoCult平板中产生集落(图20D)，并且一些集落在连续再次平板接种后仍可观察到(图20E)。在这两种情况下，用与TAT-Myc和TAT-Bcl-2培养14天的人脐带血细胞重构的NSG小鼠的集落数目都比从用新鲜的、未经操纵的人脐带血细胞重构的NSG小鼠获得的细胞要显著地更高。
另外，对一群植入了106个之前在补加有TAT-Myc和TAT-Bcl-2的细胞因子混合物中体外扩增的脐带血细胞的异种嵌合小鼠(黑色正方形)评估了髓样细胞和淋巴样细胞分化。对骨髓细胞(图20F)和脾脏细胞(图20G)的CD45阳性群体分析CD11b、CD33、CD3和CD19表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。
实例22：用TAT-Myc和TAT-Bcl-2扩增人G-CSF动员的外周血HSC
G-CSF动员的细胞被接收在来自5名为了自体HSC移植而进行了G-CSF动员的患者的1ml体积的经淘洗血液中。所有G-CSF样品均去除身份标识，并且没有另外的身份标识信息与用于这些研究的细胞相关。将细胞滴加到10ml的FCB培养基。将细胞在FCB培养基中洗涤两次，并且用10ml体积的5μg/ml重组TAT-Myc和10μg/ml重组TAT-Bcl-2处理。根据生产商的推荐，将细胞(5×106个)接种在G-Rex 100细胞扩增装置(Wilson Wolf Manufacturing)中。
将细胞在补加有细胞因子及TAT-Myc和TAT-Bcl2的培养基中扩增14天。扩增的HSC的FACS谱显示hCD45+、CD34+、CD38hi、CD133+细胞的独特群体(图21A)。细胞扩增的动力学在图21B中示出。
然后将扩增的成人GCS-F动员的HSC接种在MethoCult Optimum上以表征它们的体外分化潜力。获得了四种通常在支持髓类红细胞分化的培养基中观察到的集落类型(图21C)，并且这些集落类型中的一些在连续再次平板接种时也观察到。
扩增的成人HSC能够重构经亚致死性辐照的NSG小鼠。图21D显示12周前用106个扩增的G-CSF和TAT-Myc/TAT-Bcl-2动员的HSC(第一小图)或5×106个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第二小图)移植的NSG小鼠的骨髓的CD45+染色的FACS分析。
将由用TAT-Myc和TAT-Bcl-2培养的G-CSF动员细胞所产生的NSG异种嵌合小鼠行安乐死，并且收集骨髓、脾脏和胸腺作进一步分析。对来自用扩增的成人HSC重构的异种嵌合NSG小鼠的淋巴器官的分析表明，在这些小鼠的骨髓中有人CD45+、CD34+ CD38lo细胞(图21E；第一小图)；在脾脏(图21E；第二小图)和胸腺(图21E；第三小图)中有人CD45+、CD3+淋巴样细胞。这些数据合在一起证明了可以成功地扩增从人G-CSF动员的成人血液获得的HSC群体。
对植入了106个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中(黑色正方形)体外扩增的G-CSF动员的细胞的一群异种嵌合小鼠评估髓样细胞和淋巴样细胞分化。对CD45阳性的骨髓细胞(图21F)和脾脏细胞(图21G)群体分析CD11、CD33、CD3和CD19的表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。
这个方法能够产生根据当前的方法移植中等体形成人(Sideri,A.,et al.(2011).Hematologica 96,1213-20(Sideri,A.等人，2011年，《血液学》，第96卷，第1213-20页))所需的足够数量的HSC。
实例23：生物活性Myc融合蛋白的产生
除了实例18中描述的TAT-Myc融合蛋白以外，还使用本文描述的相同方法产生并纯化了五种Myc融合蛋白。通过使用含有框内N末端PTD氨基酸序列的正向引物和移除终止密码子的反向引物对编码区进行PCR扩增来制备质粒。然后将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司)载体中，该载体包括C末端V5表位和6×组氨酸纯化标签。图22A显示与实例18的TAT-Myc相比该Myc融合蛋白的示意图。在每个融合蛋白中，蛋白转导(PTD)在Myc多肽之前或之后框内融合。
蛋白转导结构域包括TAT、EPTD和VPR。EPTD是经优化的蛋白转导结构域(YARAAARQARA)，取自于Ho,A.et al.(Synthetic protein transduction domains:enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res.(2001)61:474-477)(Ho,A.等人，“合成的蛋白转导结构域：增强的体外和体内转导潜力”，《癌症研究》，2001年，第61卷，第474-477页)。VPR转导结构域由Taguchi,T.等人鉴定(Nucleartrafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from VPR of humanimmunodeficiency virus type-1.Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)320(1):18-26(“通过源自人免疫缺陷病毒1型的VPR的寡肽进行大分子的核运输”，《生物化学与生物物理学研究通讯》，2004年，第320卷，第1期，第18-26页))。
Myc为实例1中描述的多肽的ORF，或者为先前由Huang,Z.等人(Negative controlof the Myc protein by the stress-responsive kinase Pak-2.Mol Cell Biol(2004)24(4):1582-94(“胁迫响应性激酶Pak-2对Myc蛋白的负控制”，《分子细胞生物学》，2004年，第24卷，第4期，第1582-94页))描述的3AMyc序列的ORF。该重组蛋白还编码V5肽标签和6组氨酸标签以利于检测和纯化。(图22A)。
实例24：活化T细胞存活测定
在活化T细胞活力测定中测试了实例23中描述的Myc融合蛋白(TAT-Myc、TAT-3AMyc、EPTD-Myc、VPR-Myc和Myc-VPR)的Myc生物活性(图22B)。从一只C57BL.6j(Jackson)小鼠收获脾脏，并通过金属丝网进行机械解离。去除红细胞，用1μg/ml抗CD3(2c11)活化T细胞。将细胞以每孔1ml培养基中3×10^6个细胞的密度接种到24孔的簇培养皿(clusterdish)中。48小时后，将活细胞捕集在聚蔗糖垫层(Ficol cushion)上，洗涤并以每孔1至1.5×10^6个细胞的密度接种在24孔的簇培养皿中。将PTD-Myc蛋白以0.5、1、5、10、25或50μg/ml滴定到T细胞上。PTD-Myc蛋白处理后48小时，通过流式细胞术(前向加侧向散射)评估细胞的活力。在图22B中，给出的数据是针对25μg/ml蛋白处理。
如图22B中所示，除了TAT-3AMyc以外，所有经测试的构建体在48小时后均导致比未经处理的对照更大的T细胞活力。但是，没有一个构建体导致比实例1中描述的TAT-Myc更大的T细胞活力。
在类似的实验中，下表5中显示了不同浓度的TAT-Myc和TAT-Bcl-2的活性。用1μg/ml的抗CD3(2c11)活化来自C57BL.6j(Jackson)小鼠的脾脏的T细胞。活化后(48小时后)，将细胞洗涤，以约1至1.5×106个细胞/孔的密度接种，并添加不同浓度(0.5、1、5、10、25或50μg/ml)的融合蛋白(TAT-Myc或TAT-Bcl-2)。48小时后，通过流式细胞术(前向加侧向散射)测定活细胞的百分比，如下表5中所示。
表5
浓度[μg/ml] TAT-Myc(活细胞％) TAT-Bcl2(活细胞％)
0 8.5 3.1
0.5 9.5 5
1 11.4 7.68
5 21.1 14.3
10 22.4 24.4
25 31.9 25
50 32.8 19.8
对于TAT-Myc和TAT-Bcl-2两者，并且在所有的测试浓度下，与在任一融合蛋白不存在下温育的细胞相比，细胞活力和/或增殖提高。
在使用相同方法的另一实验中，图23提供了用50μg/ml的融合蛋白处理的活化T细胞的活门(live gate)的FACS数据；TAT-Bcl-2和TAT-Myc与对照(TAT-Cre或无处理)比较。如图所示，TAT-Myc处理和TAT-Bcl-2处理均导致显著改进的T细胞存活和/或增殖。
实例25：Bcl-2的评估
用TAT-Bcl2转导3T3细胞1小时，然后进行3次PBS洗涤。转导后两小时，将细胞进行胰蛋白酶消化，计数，并收获5×106个细胞。分离细胞核级分和细胞质级分。接着5天，每24小时收获5×106个细胞。通过将细胞在10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl2、3mM CaCl2和0.5％NP40中裂解，制备细胞核蛋白和细胞质蛋白。使细胞核沉淀，并用三氯乙酸(TCA)沉淀含细胞质的上清液级分。用抗V5抗体(英杰公司)和山羊抗小鼠IgG-HRP(圣克鲁斯生物技术公司)探测蛋白质印迹。
在24和48小时，在细胞质级分中观察到TAT-Bcl2。到转导后72小时为止，信号开始减弱，并且在96小时时间点不再观察到信号。
产生了表达TAT-Bcl2、TAT-Bcl2Δ、EPTD-Bcl2、VPR-Bcl2、VPR-Bcl2Δ和VPR-BclXL的质粒。pPTD-Bcl2-V5-6xHis(AmpR)：通过使用编码框内PTD(TAT、EPTD或VPR)蛋白转导结构域的正向引物对编码人Bcl2的cDNA进行PCR扩增来产生质粒。将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司)载体中。为产生Bcl2Δ，使用Quick Change定点诱变试剂盒(Stratagene#200521-5)从BCL-2编码序列去除未结构化的环(第27至80号氨基酸)。VPR-BclXL按与以上描述的PTD-Bcl2相似的方式制备，但使用人BclXL的cDNA而不是Bcl2的cDNA。
TAT-Bcl-2Δ的氨基酸序列和核酸序列在图25中显示。
实例26：从HSC产生成熟红细胞
使用Dynal CD34阳性选择珠粒，根据生产商的方案，从动员的外周血纯化CD34+细胞。将CD34+细胞用在补加有15％人血浆和100单位/毫升penn strep的伊思考夫培养基中的5μg/ml TAT-MYC和5μg/ml TAT-Bcl2在37℃下处理1小时。用TAT-MYC和TAT-Bcl2处理后，以1200rpm将细胞离心沉淀5分钟，并且将培养基从细胞沉淀中除去。将经处理的原代CD34+细胞接种在类红细胞分化培养基(补加有15％人血浆、100单位/毫升penn strep、100单位/毫升EPO和3.2ng/ml IL3的伊思考夫培养基)中，从而将它们的细胞编程从HSC转向类红细胞，因为在红细胞培养基中存在IL3和EPO细胞因子。
用这个单一弹丸TAT-MYC和TAT-Bcl2处理纯化的CD34+细胞，会以两种方式改进这些分化培养物。第一，用TAT融合蛋白处理的原代CD34+细胞在其分化期间表现出改进的活力，从而导致产生更大数目的成熟红细胞。第二，用TAT-MYC和TAT-Bcl2处理并在红细胞分化培养基中接种的原代CD34+细胞表现出更好的分化定向性，分化为类红细胞谱系而不是分化为其他髓样细胞。
在TAT-MYC和TAT-Bcl2处理后，将CD34+细胞在上述红细胞分化培养基中以5×10^4个细胞每孔的密度接种在24孔的簇培养皿的各孔中。让细胞分化11天。在第6天和第11天，评估细胞的GPAxCD71类红细胞表面标志物(图26A)。74％和87.6％的GPAxCD71双阳性细胞(图26A；分别在第6天和第11天)表明经TAT-Myc和TAT-Bcl2处理的细胞分化为类红细胞。另外，78.8％的细胞唯一地表达成人血红蛋白而19.8％的细胞表达胎儿血红蛋白(图26A；第11天hBxfhB小图)表明，这些类红细胞继续表达成人血红蛋白多于表达胎儿血红蛋白。
在第10天，将来自分化培养物的样品进行细胞离心(cytospun)到盖玻片上以进行苏木精和伊红染色。图像为10X和20X放大(图26B)。观察到已变成无核的血红蛋白表达细胞，这由染红色的细胞的中央缺乏染深色的细胞核所表明(图26B)。

Claims (21)

1.一种从造血干细胞产生成熟红细胞群体的方法，所述方法包括：
在包含EPO和一种或多种促进细胞存活和增殖的第一重组蛋白的培养基中，
在诱导造血干细胞分化为成熟红细胞的条件下，培养造血干细胞，从而产生成熟红细胞群体，
其中所述第一重组蛋白包含MYC多肽或其生物活性片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述MYC多肽或其生物活性片段包含蛋白转导结构域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、VPR和EPTD的蛋白转导结构域。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述MYC多肽或其生物活性片段是TAT-MYC。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述MYC多肽或其生物活性片段作为弹丸约每24小时、约每48小时或约每72小时提供。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中培养所述造血干细胞包括在IL-3存在下培养所述造血干细胞。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中培养所述造血干细胞包括在饲养细胞和血清不存在下培养所述造血干细胞。
8.根据权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在一种或多种抑制凋亡的第二重组蛋白或其生物活性片段存在下培养所述成熟红细胞群体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段包含一种或多种Bcl-2同源结构域。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2同源结构域是一种或多种选自BH1、BH2、BH3和BH4的Bcl-2同源结构域。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL或Mcl-1中的一者或多者。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段是Bcl-2。
13.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段中的一者或多者包含蛋白转导结构域。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是一种或多种选自TAT、VPR和EPTD的蛋白转导结构域。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种第二重组蛋白或其生物活性片段是TAT-Bcl-2。
16.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述造血干细胞还包含一种或多种目的重组蛋白或其生物活性片段。
17.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述成熟红细胞群体在7至14天产生。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述成熟红细胞群体表现出一种或多种选自以下的特性：成熟红细胞群体，其中40％至100％的所述细胞是无核的；成熟红细胞群体，其中40％至100％的所述细胞表达GPA；成熟红细胞群体，其中40％至100％的所述细胞表达成人血红蛋白；成熟红细胞群体，其中40％至100％的所述细胞表现出CD71表达水平降低；成熟红细胞群体，其中40％至100％的所述细胞表现出胎儿血红蛋白表达水平降低。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述造血干细胞是人造血干细胞。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述成熟红细胞群体是人细胞群体。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述成熟红细胞群体是非人动物细胞群体。
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