JP7291825B2 - 赤血球の産生及び使用 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１１日出願の米国特許仮出願第６１／７７６，７３２号及び２０１３年３月１２日出願の米国実用特許出願第１３／７９７，６４８号の利益と優先権を主張するものであり、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる以下の提出内容、すなわち、コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１０６４１７－０１８１＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０１３年３月１０日、サイズ：９ＫＢ）は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、インビトロにおいて造血幹細胞から成熟赤血球を産生させる新規方法、並びにインビボにおけるその治療的かつ診断的使用に関する。
背景
赤血球（ＲＢＣ）の輸血は、多くの臨床的及び外科的適用に日常的に使用されている。平均して、毎日３９，０００単位の血液が必要とされ、２００４年のデータから、年間２９百万単位の血液が輸血されていることがわかる（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓウェブサイト（非特許文献1））。この処置単独で、過去６０年にわたって多くの命を救っている。かかる輸血に対する需要は、治療法の進歩及び高齢化人口の増加に伴って増え続けている。
赤血球輸血の存在によって恩恵を受けている従来の臨床状況、例えば手術及び外傷患者の処置に加え、赤血球輸血が標準的治療を変え得る多くの特有の例がある。例えば、アフロカリビアン系患者では、多くのまれなＲＢＣの表現型がある（Ｄｏｕａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１，９１～１００，２００７（非特許文献2））。Ｈ又はＡＢＯ式血液型などの抗原を欠くことによる。まれな表現型であると考えられている。このような患者は、ＡＢＯ式血液型抗原に応答する中和抗体を産生できるため、ＲＢＣ輸血に不適格となる。実際に、このような患者は、中和抗体応答を避けるために同一源から輸血を受けなくてはならず、繰り返して赤血球輸血を必要とする症例（例えば、鎌状血球患者など）では非常に困難である。
更に、様々な抗体系自己免疫疾患を患い、自己免疫性溶血性貧血を経験している患者も、赤血球輸血の恩恵を受ける場合がある。しかしながら、ドナーを見つけるのが困難であったり、ＲＢＣが患者の自己抗体に適合するドナーが限られたりする。基本的には、これら患者は、まれな血液表現型を有するものと同じ困難に直面する。
更に、異常ヘモグロビン症及びサラセミアを患っている患者は、ＲＢＣの寿命が短くなる、遺伝的背景が同一の突然変異を有する。これら患者の生命及び健康状態を輸血によって改善する考え方は古いものであるが、必要な輸血頻度が主な問題となる。健康なドナーのＲＢＣの平均寿命は２８日間である。これら患者に必要とされる輸血回数は多く、頻回であり、医原性感染のリスクを顕著に高める。インビトロでＲＢＣを産出し、１２０日間の平均寿命を有する同調ＲＢＣを輸血することができると、これら患者が必要とする輸血回数を大きく減少させ、生活の質を真に改善し得る。
ドナーから採取したＲＢＣの寿命の問題は、外傷及び外科的処置に対するＲＢＣの従来の臨床使用という意味でも重要である。ＲＢＣ濃縮物を最大１ヶ月保管すると、酸素の輸送能の回復に少なくとも２４時間を要するＲＢＣ集団をもたらす場合がある。加えて、これら濃縮物中の多くの壊死ＲＢＣが、レシピエント中で炎症反応と、同時にかかる炎症反応に起因する合併症を引き起こす場合がある。インビトロにおいてＲＢＣの安定供給をもたらす能力によって、医療従事者は新鮮ＲＢＣの必要量を予測し、それに応じることができ、ＲＢＣ濃縮物を長期間保管する必要もなくなる。
赤血球輸血に関連する別の問題点は、赤血球輸血の難しさが増していることである。この難しさが増している理由として、輸血を介して感染することがわかっている感染因子の数の増加によって、輸血に適する献血の供給が着実に低下していること、ヘモグロビン及び酸素運搬体（パーフルオロカーボン）が、臨床現場でＲＢＣ代用物として有効であると示せなかったこと、最近のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の使用に伴う合併症が挙げられる。輸血のために限定したＲＢＣ生成物を産出できる、ＲＢＣ前駆細胞の継続的供給が利用しやすくなれば、医療施設での診療を変え、輸血をより安全に、かつより幅広く使用される処置になるであろう。しかしながら、このような取り組みは、安全で、有効で、かつ、汎用的なＲＢＣの供給が可能でなくてはならない。
初期の試みの一部は、初代造血幹細胞（骨髄、臍帯血、又は末梢血由来）又は胚性幹細胞から、インビトロでＲＢＣを誘導させて行われているが、今まで、費用、手順の長さ、複数工程、フィーダー細胞若しくは血清の使用、労働力の大きさ、低収率、又は、成熟した無核赤血球に完全に分化しなかったことなど、１つ又は２つ以上の様々な理由によって成功していない。インビトロでＲＢＣを算出させる試みとして、初代造血幹細胞（Ｎｅｉｌｄｅｚ－Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０，４６７～７２，２００２（非特許文献3））及び胚性幹細胞（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ｄｅｃ １；１１２（１２）：４４７５～８４（非特許文献4）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ ３，６９３～７０４，２００８（非特許文献5））から出発する方法が挙げられる。またこれらの方法は、一般的には、限定した継続的ＲＢＣ前駆細胞源を可能にしない。
上記文書及び試験の引用は、上記のうち任意のものが適切な従来技術であると認めることを意図しない。これら文書の内容に関する全ての記載は、出願人が利用できる情報に基づいており、これら文書の内容の正確さをなんら認めることにはならない。
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋｓウェブサイト Ｄｏｕａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２１，９１～１００，２００７ Ｎｅｉｌｄｅｚ－Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０，４６７～７２，２００２ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ｄｅｃ １；１１２（１２）：４４７５～８４ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ ３，６９３～７０４，２００８
概要
したがって、完全に成熟したヒト赤血球のインビトロ生成に対する、改良された方法が必要である。本開示は、細胞の生存又は増殖の一方または両方を誘導する、外因性タンパク質などの１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質と、ＥＰＯと、任意でＩＬ－３との存在下で造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養することによって、赤血球（ＲＢＣ）集団を産生する新たな方法を提供する。有利には、これらの方法は、約１０日間で、グリコホリンＡ（Glycophrin A）（ＧＰＡ）の発現、成人型ヘモグロビンレベルの上昇、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）レベルの減少、及び胎児型ヘモグロビンレベルの減少を非限定的に含む、成人型赤血球の表現型を呈する成熟無核赤血球を産生する。更に、インビトロで無期限に継代し、凍結保存し、その後戻すことができる条件的不死化ヒト長期ＨＳＣからのＲＢＣの産生は、確定され、特徴がはっきりした供給源からの、完全に分化した赤血球の継続的生産を可能にする。更に、本開示の新規方法によって産生されたＲＢＣは、必要とする対象の治療に使用できる、１つ又は２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質を含有及び／又は発現することもできる。
したがって、本開示の特定の態様は、造血幹細胞の成熟赤血球への分化を誘発しそれによって成熟赤血球の集団を産生する条件において、ＥＰＯと、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質又はこれらの生物学的に活性な断片との存在下で造血幹細胞を培養し、造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する方法に関する。いくつかの実施形態では、造血幹細胞は、条件的不死化造血幹細胞である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞は、タンパク質を形質導入した造血幹細胞であり、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、外因性タンパク質である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞はトランスジェニック造血幹細胞である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、ＭＹＣポリペプチド、ＩＣＮ－１ポリペプチド、これらのホモログ、及びこれらの生物学的に活性な断片から選択される１つ又は２つ以上のポリペプチドである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、ＭＹＣポリペプチドは、ｎ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、ｖ－Ｍｙｃ、及びｓ－Ｍｙｃから選択される、１つ又は２つ以上のＭＹＣポリペプチドである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち１つ又は２つ以上は、タンパク質形質導入ドメインを含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤから選択される１つ又は２つ以上のタンパク質形質導入ドメインである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、ＴＡＴ－ＭＹＣである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片はボーラスで提供される。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質は、約２４時間毎、約４８時間毎、又は約７２時間毎にボーラスで提供される。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、この方法は、造血幹細胞をＩＬ－３の存在下で培養することを更に含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、この方法は、造血幹細胞をフィーダー細胞及び血清の非存在下で培養することを更に含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、この方法は、成熟赤血球の集団を、アポトーシスを阻害する１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片の存在下で培養することを更に含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインを含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインは、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４から選択される１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２組み換えタンパク質は、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｗ、Ｂｃｌ－Ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、又はＭｃｌ－１のうち１つ又は２つ以上である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片はＢｃｌ－２である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち１つ又は２つ以上は、タンパク質形質導入ドメインを含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤから選択される１つ又は２つ以上のタンパク質形質導入ドメインである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を更に含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、外因性タンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞は、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；及び、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片から選択される、１つ又は２つ以上のタンパク質をコードする１つ又は２つ以上の導入遺伝子を含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；又は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち、１つ又は２つ以上の発現又は機能は制御可能である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；又は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち、１つ又は２つ以上の発現又は機能は誘導可能である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の導入遺伝子のうち１つ又は２つ以上は、抗生物質応答配列又はホルモン応答配列をコードする。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、抗生物質応答配列又はホルモン応答配列は、エストロゲン応答配列、ゴナドトロピン応答配列、又はテトラサイクリン応答配列、及び糖質コルチコイド応答配列から選択される、１つ又は２つ以上の応答配列である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の導入遺伝子は、１つ若しくは２つ以上の第１組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；１つ若しくは２つ以上の第２組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片；及び、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片から選択される、１つ又は２つ以上のタンパク質を過剰発現する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団の産生は、ＩＬ－３及びＥＰＯの存在下で８日間、その後、フィーダー細胞及びＥＰＯの存在下で３日間、最後にフィーダー細胞単独の存在下で１０日間培養した初代幹細胞からの赤血球の集団の産生と比べて、少なくとも４５％速められる。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団は約７～１４日間で産生される。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団は、約４０％～約１００％の細胞が無核化されている成熟赤血球の集団；約４０％～約１００％の細胞がＧＰＡを発現している成熟赤血球の集団；約４０％～約１００％の細胞が成人型ヘモグロビンを発現している成熟赤血球の集団；約４０％～約１００％の細胞がＣＤ７１の発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団；約４０％～約１００％の細胞が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団、から選択される、１つ又は２つ以上の特徴を呈する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞はヒト造血幹細胞である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞は、まれな血液型を有する患者から単離された。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、患者は自己免疫性状態を有する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、造血幹細胞は胚性幹細胞から産生され、又は多能性幹細胞から誘導された。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団はヒト細胞の集団である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団は、Ａ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、ＡＢ＋、ＡＢ－、Ｏ＋、及びＯ－から選択される、１つ又は２つ以上の血液型を有する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団はまれな血液型である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団は非ヒト動物細胞の集団である。
本開示の他の態様は、ＧＰＡを発現し、成人型ヘモグロビンを発現し、ＣＤ７１の発現レベルの低下を呈し、かつ、胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈する無核赤血球を含み、インビトロで分化した成熟赤血球の集団に関し、このとき、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が無核化されており；集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＧＰＡを発現しており；集団中の約４０％～約１００％の赤血球が成人型ヘモグロビンを発現しており；集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＣＤ７１の発現レベルの低下を呈しており；かつ、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球は１つ又は２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質を含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球はまれな血液型を有する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球はヒト赤血球である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球は非ヒト動物赤血球である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、インビトロで分化した成熟赤血球の集団は、上記任意の実施形態の造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する任意の方法によって産生される。
本開示の他の態様は、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が無核化されており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＧＰＡを発現しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が成人型ヘモグロビンを発現しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＣＤ７１の発現レベルの低下を呈しており、かつ、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している、インビトロで分化した成熟赤血球の集団と、１つ又は２つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、組成物は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を更に含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球の集団は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、外因性タンパク質である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球はまれな血液型を有する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球はヒト赤血球である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球は非ヒト動物赤血球である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、インビトロで分化した成熟赤血球の集団は、上記任意の実施形態の造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する任意の方法によって産生される。
本開示の他の態様は、インビトロで分化した成熟赤血球の集団が必要な対象にこれらを提供することによる、無核赤血球の欠乏を特徴とする疾病又は疾患の治療、予防、又は診断方法に関し、このとき、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が無核化されており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＧＰＡを発現しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が成人型ヘモグロビンを発現しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＣＤ７１の発現レベルの低下を呈しており、かつ、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、対象はヒトである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、対象は非ヒト動物である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、赤血球の集団は、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片は、外因性タンパク質である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、インビトロで分化した成熟赤血球の集団は、上記任意の実施形態の造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する任意の方法によって産生される。
本開示の他の態様は、アポトーシスを阻害する、１つ又は２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片を含有する培地中で、赤血球の集団を維持することによって、成熟赤血球の集団のインビトロでの半減期を延長する方法に関する。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片は、１つ又は２つ以上のＢｃｌ２ホモロジードメインを含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインは、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４から選択される１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片は、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｗ、Ｂｃｌ－Ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、又はＭｃｌ－１のうち１つ又は２つ以上である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片はＢｃｌ－２である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片のうち１つ又は２つ以上は、タンパク質形質導入ドメインを含む。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤから選択される１つ又は２つ以上のタンパク質形質導入ドメインである。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、１つ若しくは２つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ又はこれらの生物学的に活性な断片は、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２である。上記任意の実施形態と組み合わせ得るいくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団は、上記任意の実施形態の造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する任意の方法によって産生される。
[本発明1001]
造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生する方法であって、以下の段階を含む、方法：
前記造血幹細胞の成熟赤血球への分化を誘発し、それによって成熟赤血球の集団を産生する条件において、
ＥＰＯと、細胞の生存及び／又は増殖を促進する1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質又はこれらの生物学的に活性な断片との存在下で、造血幹細胞を培養する段階。
[本発明1002]
前記1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、外因的に供給される、内因性発現の誘導によって産生される、又は、遺伝子導入で発現される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、ＭＹＣポリペプチド、ＩＣＮ－1ポリペプチド、これらのホモログ、及びこれらの生物学的に活性な断片からなる群から選択される1つ又は2つ以上のポリペプチドである、本発明1001又は1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち1つ又は2つ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1001～1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記タンパク質形質導入ドメインが、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤからなる群から選択される1つ又は2つ以上のタンパク質形質導入ドメインである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、ＴＡＴ－ＭＹＣである、本発明1001～1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記1つ若しくは2つ以上の第1組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、約24時間毎、約48時間毎、又は約72時間毎にボーラスで提供される、本発明1001～1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記造血幹細胞を培養する段階が、前記造血幹細胞をＩＬ－3の存在下で培養することを含む、本発明1001～1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記造血幹細胞を培養する段階が、前記造血幹細胞をフィーダー細胞及び血清の非存在下で培養することを含む、本発明1001～1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記成熟赤血球の集団を、アポトーシスを阻害する1つ若しくは2つ以上の第2組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片の存在下で培養することを更に含む、本発明1001～1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記1つ若しくは2つ以上の第2組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、1つ又は2つ以上のＢｃｌ－2ホモロジードメインを含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記1つ又は2つ以上のＢｃｌ－2ホモロジードメインが、ＢＨ1、ＢＨ2、ＢＨ3、及びＢＨ4からなる群から選択される1つ又は2つ以上のＢｃｌ－2ホモロジードメインである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記1つ又は2つ以上の第2組み換えタンパク質が、Ｂｃｌ－2、Ｂｃｌ－ｗ、Ｂｃｌ－Ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、又はＭｃｌ－1のうち1つ又は2つ以上である、本発明1011又は1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記1つ若しくは2つ以上の第2組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、Ｂｃｌ－2である、本発明1011～1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記1つ若しくは2つ以上の第2組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち1つ又は2つ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1011～1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記タンパク質形質導入ドメインが、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤからなる群から選択される1つ又は2つ以上のタンパク質形質導入ドメインである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記1つ若しくは2つ以上の第2組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片が、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－2である、本発明1011～1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記造血幹細胞が、1つ若しくは2つ以上の関心対象の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を更に含む、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記成熟赤血球の集団が約7～14日間で産生される、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記成熟赤血球の集団が、約40％～約100％の細胞が無核化されている成熟赤血球の集団；約40％～約100％の細胞がＧＰＡを発現している成熟赤血球の集団；約40％～約100％の細胞が成人型ヘモグロビンを発現している成熟赤血球の集団；約40％～約100％の細胞がＣＤ71の発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団；約40％～約100％の細胞が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団からなる群から選択される1つ又は2つ以上の特徴を呈する、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記造血幹細胞がヒト造血幹細胞である、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記成熟赤血球の集団がヒト細胞の集団である、本発明1001～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記成熟赤血球の集団が非ヒト動物細胞の集団である、本発明1001～1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
インビトロで分化した成熟赤血球の集団であって、ＧＰＡを発現している、成人型ヘモグロビンを発現している、ＣＤ71の発現レベルの低下を呈している、及び胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している、無核赤血球を含み、
前記集団中の約40％～約100％の赤血球が無核化されており、
前記集団中の約40％～約100％の赤血球がＧＰＡを発現しており、
前記集団中の約40％～約100％の赤血球が成人型ヘモグロビンを発現しており、
前記集団中の約40％～約100％の赤血球がＣＤ71の発現レベルの低下を呈しており、
前記集団中の約40％～約100％の赤血球が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している、集団。
[本発明1025]
前記赤血球が、1つ又は2つ以上の関心対象の組み換えタンパク質を含む、本発明1024の集団。
[本発明1026]
前記赤血球がヒト赤血球である、本発明1024又は1025のいずれかの集団。
[本発明1027]
前記赤血球が非ヒト動物赤血球である、本発明1024又は1025のいずれかの集団。
[本発明1028]
本発明1024～1027のいずれかのインビトロで分化した成熟赤血球の集団と、1つ又は2つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1029]
本発明1024～1027のいずれかのインビトロで分化した成熟赤血球の集団を必要とする対象に、それらを提供する段階を含む、無核赤血球の欠乏を特徴とする疾病又は疾患の、治療、予防、又は診断の方法。
[本発明1030]
前記対象がヒトである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記対象が非ヒト動物である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
アポトーシスを阻害する1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片を含む培地中で前記赤血球の集団を維持する段階を含む、インビトロでの成熟赤血球の集団の半減期を延長する方法。
[本発明1033]
前記1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片が、1つ又は2つ以上のＢｃｌ2ホモロジードメインを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記1つ又は2つ以上のＢｃｌ－2ホモロジードメインが、ＢＨ1、ＢＨ2、ＢＨ3、及びＢＨ4からなる群から選択される1つ又は2つ以上のＢｃｌ－2ホモロジードメインである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片が、Ｂｃｌ－2、Ｂｃｌ－ｗ、Ｂｃｌ－Ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、又はＭｃｌ－1のうち1つ又は2つ以上である、本発明1032～1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片が、Ｂｃｌ－2である、本発明1032～1034のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片のうち1つ又は2つ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1032～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記タンパク質形質導入ドメインが、ＴＡＴ、ＶＰＲ、及びＥＰＴＤからなる群から選択される1つ又は2つ以上のタンパク質形質導入ドメインである、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記1つ若しくは2つ以上の外因性ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片が、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－2である、本発明1032～1038のいずれかの方法。
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を作る一般的な手法を示す。図１Ａは、初代マウスＨＳＣ細胞にＭＹＣ－ＥＲ及びＢｃｌ－２を形質導入するのに用いられる、レトロウイルス構築物の模式図を示す。図１Ｂは、ｐＭＩＧ－ＭＹＣ－ＥＲ及びｐＭＩＧ－Ｂｃｌ－２の形質導入後、５－フルオロウラシルで処理したドナーから得られたＨＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。図１Ｃは、図１Ｂに示される形質導入されたＨＳＣを移植したマウスにおける、白血病誘発の速度を示す。図１Ｄは、白血病マウスの骨髄から回収した直後のｃｔｌｔ－ＨＳＣのＦＡＣＳ分析を示す。図１Ｅは、樹立されたｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のＦＡＣＳ分析を示す。図１Ｆは、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスの骨髄からの正常で操作されていないＬｔ－ＨＳＣ中の、幹細胞マーカーのＦＡＣＳ分析を示す。 ｃｔｌｔ－ＨＳＣの移植後に生じた成熟免疫細胞の特徴を示す。図２Ａは、移植後のリンパ組織中ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来の細胞の発生頻度を示す。 ｃｔｌｔ－ＨＳＣの移植後に生じた成熟免疫細胞の特徴を示す。図２Ｂは、骨髄中のＧＦＰ＋骨髄系細胞の検出を示す。 ｃｔｌｔ－ＨＳＣの移植後に生じた成熟免疫細胞の特徴を示す。図２Ｃは、脾臓中の末梢成熟リンパ球の分析を示す。 ｃｔｌｔ－ＨＳＣの移植後に生じた成熟免疫細胞の特徴を示す。図２Ｄは、ｃｔｌｔ－ＨＳＣの２回目の連続継代後の移植レシピエントマウス中の、末梢成熟リンパ球の分析を示す。 ３種類のヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の表面表現型を示す。図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃは、３種類の樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）ＨＳＣの、ＣＤ３４＋画分を示す。図３Ｄ、図３Ｅ、及び図３Ｆは、３種類の樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）ＨＳＣの、ｃ－ｋｉｔ＋画分を示す。図３Ｇは、樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）ＨＳＣがＣＤ４５を発現していないことを示す。図３Ｈは、樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）ＨＳＣがＦｌｋ－２を発現していないことを示す。図３Ｉは、樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）ＨＳＣがＣＤ１５０を発現していないことを示す。 ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウスにおける、ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の成熟リンパ系細胞への分化を示す。図４Ａは、対照マウス（移植なし）から得られたデータを示す。図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、末梢血中に成熟ヒトリンパ系細胞が存在する移植レシピエントマウスから得られたデータを示す。 ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣを供給源として用いてインビトロで産生されたヒト赤血球を示す。図５Ａは、マウス末梢血のＨＥ染色を示す。図５Ｂは、初代ヒト胎児臍帯血のＨＥ染色を示す。図５Ｃ、図５Ｄ、及び図５Ｅは、１２日間、ＩＬ－３及びＥＰＯで処理した、３種類の条件的に形質転換された胎児臍帯血細胞株のＨＥ染色を示す。図５Ｆは、赤血球の形態を示すため、図５Ｅの細胞の拡大図を示す。 インビトロで産生したヒトＲＢＣが、マウスを化学的に誘発した致死的貧血から救出できることを示す。 インビトロで産生したヒトＲＢＣが、マウスを出血性ショックから救出できることを示す。 細胞へのタンパク質の直接形質導入のための、組み換えＴＡＴ－ＭＹＣ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２タンパク質の発現及び精製を示す。図８Ａは、ＴＡＴ－ＭＹＣを示す。図８Ｂは、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を示す。 マウスタンパク質を形質導入した長期ＨＳＣ細胞株（ｐｔｌｔ－ＨＳＣ）の発達を示している、ＦＡＣＳ分析を示す。図９Ａは、非染色細胞を示す。図９Ｂは、Ｓｃａ１及びｃ－Ｋｉｔに対する抗体による染色を示す。図９Ｃは、Ｂ２２０及びＣＤ３に対する抗体による染色を示す。図９Ｄは、得られたｐｔｌｔ－ＨＳＣ株の表面表現型を示す。 Ｒａｇ－１－／－マウスにおける、マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株によるリンパ系区画の再構成を示している、ＦＡＣＳ分析を示す。図１０Ａは、非染色細胞を示す。図１０Ｂは、Ｂ細胞のマーカーであるＢ２２０及びＩｇＭの染色を示す。図１０Ｃは、Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ４及びＴＣＲβの染色を示す。図１０Ｄは、Ｔ細胞のマーカーであるＣＤ８及びＴＣＲβの染色を示す。 ｐｔｌｔ－ＨＳＣからのインビトロでの成熟マウス赤血球の発達を示す。図１１Ａは、４０倍の対物レンズ下での、未分化マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣのＨＥ染色を示す。図１１Ｂは、４０倍の対物レンズ下での、マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来赤血球のＨＥ染色を示す。図１１Ｃは、１００倍の対物レンズ下での、マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来赤血球のＨＥ染色を示す。 インビトロでの臍帯血由来ＨＳＣの増殖を示す。図１２Ａは、ＴＡＴ－ＭＹＣ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含有する培地中で３日間ＨＳＣを培養した後の、ＣＤ３８及びＣＤ３４に対する抗体による染色を示す。図１２Ｂは、ＴＡＴ－ＭＹＣ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含有する培地中で１４日間ＨＳＣを培養した後の、ＣＤ３８及びＣＤ３４に対する抗体による染色を示す。 インビトロでの赤血球分化の誘導を示す。図１３Ａは、ＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で４日間培養した後の、図１２の非染色ＨＳＣ細胞を示す。図１３Ｂは、図１２のＨＳＣ細胞を中性培地中で４日間培養した後の、ＧＰＡ及びＣＤ７１に対する抗体による染色を示す。図１３Ｃは、図１２のＨＳＣ細胞をＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で４日間培養した後の、ＧＰＡ及びＣＤ７１に対する抗体による染色を示す。 インビトロでの赤血球分化マーカーの動的解析を示す。図１４Ａは、成熟ヒトＲＢＣ細胞のＧＰＡ、ＣＤ７１、及び胎児型ヘモグロビンに対する抗体による染色を示す（＋対照）。図１４Ｂは、図１２のＨＳＣ細胞をＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で５日間培養した後の、ＧＰＡ、ＣＤ７１、及び胎児型ヘモグロビンに対する抗体による染色を示す。図１４Ｃは、図１２のＨＳＣ細胞をＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で９日間培養した後の、ＧＰＡ、ＣＤ７１、及び胎児型ヘモグロビンに対する抗体による染色を示す。 培養中の除核の組織学的分析を示す。図１５Ａは、ＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で３日間培養した後の、図１２の細胞のＨＥ染色を示す。図１５Ｂは、ＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で７日間培養した後の、図１２の細胞のＨＥ染色を示す。 ガス透過性バッグ中でのヒト赤血球の産生を示す。図１６Ａは、ＩＬ－３及びＥＰＯを含有する培地中で４日間培養した後の、条件的不死化ｐｔｌｔ－ＨＳＣから分化した赤血球を示す。図１６Ｂは、赤血球の成熟及び除核を示している、赤血球のＨＥ染色を示す。 骨髄細胞からのマウス赤血球の産生を示す。図１７Ａは、骨髄の未処理（対照）マウス造血幹細胞のＨＥ染色を示す。 骨髄細胞からのマウス赤血球の産生を示す。図１７Ｂは、ＩＬ３及びＥＰＯで処理し、Ｔａｔ－Ｍｙｃ又はＴａｔ－Ｂｃｌ－２で処理していない、骨髄のマウス造血幹細胞のＨＥ染色を示す。 骨髄細胞からのマウス赤血球の産生を示す。図１７Ｃは、ＩＬ３、ＥＰＯ及びＴａｔ－Ｍｙｃで処理し、Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２で処理していない、骨髄のマウス造血幹細胞のＨＥ染色を示す。 骨髄細胞からのマウス赤血球の産生を示す。図１７Ｄは、ＩＬ３、ＥＰＯ、及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２で処理し、Ｔａｔ－Ｍｙｃで処理していない、骨髄のマウス造血幹細胞のＨＥ染色を示す。 骨髄細胞からのマウス赤血球の産生を示す。図１７Ｅは、ＩＬ３、ＥＰＯ、Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２、及びＴａｔ－Ｍｙｃで処理した骨髄のマウス造血幹細胞のＨＥ染色を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の産生とインビトロでの特徴確認を示す。図１８Ａは、ＨＩＶ－１ Ｔａｔ及びＶ５及び６×Ｈｉｓタグのインフレームタンパク質形質導入ドメインの位置を含む、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質の図を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の産生とインビトロでの特徴確認を示す。図１８Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クマシーで染色した、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した後の組み換えタンパク質を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の産生とインビトロでの特徴確認を示す。図１８Ｃは、精製した組み換えＴａｔ－Ｍｙｃ、Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２に２時間曝露し、又は未処理のまま（ＮＴ）とし、固定後、Ｖ５に対するモノクローナル抗体と、Ｈｏｅｃｈｓｔ ９９３４核染色液で染色したコンフルエントな３Ｔ３細胞の叢を示す。この時間では、Ｔａｔ－Ｍｙｃタンパク質のほとんどは核領域に局在しているが、Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２は細胞質及び核周囲空間に留まっている。 Ｔａｔ融合タンパク質の産生とインビトロでの特徴確認を示す。図１８Ｄは、１時間Ｔａｔ－Ｍｙｃに１度曝露して、洗浄し、その後溶解して（示した時点において）、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来ＨＳＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析（Ｖ５及びβ－アクチンに対するモノクローナル抗体）を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の産生とインビトロでの特徴確認を示す。図１８Ｅは、２時間Ｔａｔ－Ｍｙｃに１度曝露して、洗浄し、その後溶解して（示した時点において）、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来ＨＳＣの核画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析（Ｖ５及びβ－アクチンに対するモノクローナル抗体）を示す。タンパク質の大部分は２４時間と４８時間との間になくなっている。７２時間後のいずれのポイントにおいて、検出可能なタンパク質は残っていない。 Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を有するヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の図を示す。図１９Ａは、インビトロで１４日間増殖させた、ヒト臍帯血細胞の表面表現型（上図はサイトカイン混合物のみ；下図はＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物）のＦＡＣＳ分析の図を示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を有するヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の図を示す。図１９Ｂは、両条件下インビトロでのＣＤ３４＋細胞の増殖速度のグラフを示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を有するヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の図を示す。図１９Ｃは、骨髄赤血球分化を補助する条件下でのメチルセルロースアッセイで現像された、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来の３つの異なるコロニータイプの画像を示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を有するヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の図を示す。図１９Ｄは、サイトカイン混合物と共に培養された１０３個の臍帯血細胞（黒色）、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物と共に培養された１０３個の臍帯血細胞（濃灰色）、又は１０４個の新鮮な未操作の臍帯血細胞（明灰色）のいずれかを播種した、メチルセルロース培養で観察された各コロニータイプを定量したグラフを示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を有するヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の図を示す。図１９Ｅは、図１９Ｄに示す細胞を再プレーティングして、メチルロース培養で観察されたコロニー数を定量したグラフを示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ａは、サイトカイン混合物中において、インビトロで増殖（１つ目の図；ＦＣＢ）、若しくはＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物中で増殖（２つ目の図；ＦＣＢ ＴＭＴＢ）された１０６個の臍帯血細胞、又は５×１０６個の新鮮な未操作の臍帯血細胞（３つ目の図；新鮮ＦＣＢ）を移植した、致死量以下で照射されたＮＳＧマウスの骨髄コホートのＦＡＣＳ分析の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｂは、異種キメラマウスの骨髄、脾臓、及び胸腺細胞のＦＡＣＳ分析の図を示す。細胞は全てヒトＣＤ４５で染色した。ＣＤ４５＋細胞に対するゲーティングにより、骨髄中にヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ細胞（１つ目の図；ＢＭ）；脾臓中にヒトＣＤ１９＋及びヒトＣＤ３＋リンパ球（２つ目の図；脾臓）；並びに、胸腺中にヒトＣＤ３＋細胞（３つ目の図；胸腺）が示された。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｃは、ＣＦＳＥで標識され、ヒトＣＤ４０及びＩｇＭに対するモノクローナル抗体の存在下で培養された、ヒト膵臓Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析の図を示す。ＮＳＧ異種キメラマウスで発生したヒトＢ細胞は、抗原受容体の刺激後増殖した。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｄは、ＮＳＧ異種キメラマウスの骨髄から得られ、メチルセルロース上にプレーティングされた、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ細胞由来の骨髄赤血球コロニーを定量したグラフを示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｅは、再プレーティング後の骨髄赤血球コロニーの発育を定量したグラフを示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｆは、インビトロでサイトカイン混合物（白丸）又はＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物（黒四角）中で増殖された骨髄細胞のＣＤ４５陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現）を定量したグラフを示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣの機能解析の図を示す。図２０Ｇは、インビトロでサイトカイン混合物（白丸）又はＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物（黒四角）中で増殖された脾臓細胞のＣＤ４５陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現）を定量したグラフを示す。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ａは、ヒトＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋画分の濃縮を示すヒトＣＤ４５＋細胞の表面表現型の図を示す。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｂは、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２が存在する培養液中における、インビトロでの１８日間にわたる細胞増殖速度のグラフを示す。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｃは、５×１０３個のヒト成人型Ｇ－ＣＳＦ ＨＳＣ（Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共にインビトロで増殖）が、メチルセルロース中で４種類の形態学的に異なるコロニータイプを生じさせることを示しているグラフを示す。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｄは、ヒト成人型Ｇ－ＣＳＦ ＨＳＣ（Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共にインビトロで増殖）が、異種キメラＮＳＧマウスにおいてヒト造血性系統を生じさせることを示しているＦＡＣＳ分析の図を示す。骨髄は、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物（１つ目の図；Ｇ－ＣＳＦ＋ＴＭＴＢ）又は新鮮な未操作の臍帯血細胞（２つ目の図；新鮮ＦＣＢ）と共に増殖させたｐｔｌｔ－ＨＳＣを移植したＮＳＧマウス由来のものであった。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｅは、骨髄、脾臓、及び胸腺由来細胞のＦＡＣＳ分析の図を示す。骨髄細胞は、ヒトＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋でもあるヒトＣＤ４５細胞を含み（１つ目の図）、脾臓細胞はヒトＣＤ３でも染色されるヒトＣＤ４５細胞を含み（２つ目の図）、胸腺細胞はヒトＣＤ４５細胞並びにＣＤ３を含んでいた（３つ目の図）。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｆ及び図２１Ｇは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物と共に増殖させた１０６個のＧ－ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価したグラフを示す。骨髄細胞（図２１Ｆ）及び脾臓細胞（図２１Ｇ）のＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。 成人型ヒトＧ－ＣＳＦで動員したＨＳＣをインビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２と共に増殖させた図を示す。図２１Ｆ及び図２１Ｇは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでＴａｔ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物と共に増殖させた１０６個のＧ－ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価したグラフを示す。骨髄細胞（図２１Ｆ）及び脾臓細胞（図２１Ｇ）のＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。 活性化Ｔ細胞の生死判別アッセイにおける、様々なＭｙｃ融合タンパク質構築物の活性を示す。図２２Ａは、Ｍｙｃ融合タンパク質構築物の一部の代表例の配列図を示す。図２２Ｂは、代表的なＭｙｃ融合タンパク質構築物による処理４８時間後の生存Ｔ細胞の割合のグラフを示す。 活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおける、様々なＴａｔ－融合タンパク質（それぞれ５０μｇ／ｍＬ）の活性を示す。図２３Ａは、未処理細胞（処理なし）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の図を示す。図２３Ｂは、Ｔａｔ－Ｃｒｅ処理細胞（Ｔａｔ－Ｃｒｅ対照）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の図を示す。図２３Ｃは、Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２処理細胞（Ｔａｔ－Ｂｃｌ－２）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の図を示す。図２３Ｄは、Ｔａｔ－Ｍｙｃ処理細胞（Ｔａｔ－Ｍｙｃ）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の図を示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸（配列番号１）及び核酸（配列番号２）の配列を示す。 Ｂｃｌ－２ドメインポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸（配列番号３）及び核酸（配列番号４）の配列を示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃを含む分化培地を用いて、初代ＨＳＣが成熟赤血球にも分化することを示す。図２６Ａは、フローサイトメトリーによって、６日目、１１日目において、細胞をＧＰＡ×ＣＤ７１赤血球系表面マーカーについて評価し、１１日目において、細胞を成人型及び胎児型ヘモグロビンの発現について評価したものを示す。 Ｔａｔ－Ｍｙｃを含む分化培地を用いて、初代ＨＳＣが成熟赤血球にも分化することを示す。図２６Ｂは、１０日目において、ＨＥ染色のため、分化培養からのサンプルをカバーガラス上にサイトスピンしたものを示す。画像の倍率は１０倍及び２０倍である。
詳細な説明
本開示は、特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、エリスロポエチン（ＥＰＯ）と、任意でＩＬ－３と、細胞の生存又は増殖の一方または両方を促進する１つ若しくは２つ以上の組み換えタンパク質又はこれらの生物学的に活性な断片とを共に培養することによる、ＨＳＣからの赤血球のインビトロ産生に関する。本明細書に記載する分化プロセスは、フィーダー細胞（例えば、線維芽細胞）及び／又は血清を必要とせず、約７～１４日間で成熟無核赤血球の産生をもたらす。
本明細書に記載する成熟赤血球の産生方法は、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、臍帯血、及び胎盤を非限定的に含む任意の供給源由来のＨＳＣ、並びに、胚性幹細胞及び誘導済み多能性幹細胞から生成されるＨＳＣによって利用できる。任意の供給源から単離されたＨＳＣを用いて、非限定的に、万能ドナーの赤血球、まれな血液型の赤血球、オーダーメイド医療用の赤血球（例えば、自家輸血、任意に負荷又は遺伝子操作を行う）、及び１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含むように操作された赤血球を産生できる。
本開示の方法を用いるインビトロでのＨＳＣからの成熟赤血球の産生は、条件的不死化ＨＳＣを使用することによって増強できる。増強として、出発ＨＳＣ当たりの成熟赤血球数の増加、成熟赤血球集団の１つ若しくは２つ以上の特徴の改善、又は成熟赤血球を産生するまでの日数の減少のうち、１つ又は２つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。条件的不死化ＨＳＣは、当該技術分野において既知である、１つ若しくは２つ以上の任意の遺伝子導入法及び／又はタンパク質形質導入法を用いて、細胞増殖及び／又は細胞の生存を促進する第１タンパク質、並びに、アポトーシスを阻害する第２タンパク質にＨＳＣを曝露することによって生成することができる。
本開示は更に、特に、本開示の方法のうち１つ又は２つ以上によって産生される成熟赤血球集団に関する。成熟赤血球集団は、集団中の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は１００％の細胞が、無核細胞である、ＧＰＡレベルの増加、成人型ヘモグロビン（ＦＡＣＳによる第２対数以上）レベルの増加、ＣＤ７１（例えば、ＧＰＡ＋／ＣＤ７１－）レベルの低下、及び胎児型ヘモグロビン（ＦＡＣＳによる第１対数；０～１０）レベルの低下を呈していることが挙げられるが、これらに限定されない、１つ又は２つ以上の特徴によって特徴付けることができる。成熟赤血球集団は、１つ又は２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質も含んでよい。これらの関心対象のタンパク質は、１つ又は２つ以上の疾病若しくは疾患の予防、治療、又は診断に有用であり得る。
本開示は更に、特に、本明細書に記載する方法のうち１つ又は２つ以上によって産生される成熟赤血球集団を含む、医薬組成物に関する。これらの医薬組成物は、１つ又は２つ以上の疾病若しくは疾患の予防、治療、又は診断に有用な１つ又は２つ以上の関心対象の外因性タンパク質を含んでもよい。
本開示は更に、特に、本開示の成熟赤血球の集団を必要とする対象にそれらを提供することによって、赤血球の欠乏を特徴とする疾病又は疾患を治療、予防、又は診断する方法に関する。本開示は更に、特に、１つ若しくは２つ以上の赤血球の集団又は１つ若しくは２つ以上の関心対象のタンパク質を含む本開示の医薬組成物を対象に投与することによって、疾病又は疾患を治療又は予防する方法に関し、このとき、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は疾病又は疾患の治療又は予防に有用である。
本開示は更に、特に、赤血球又は赤血球集団のインビトロでの生存期間、つまり半減期を延長する方法に関する。インビトロでの赤血球半減期が延長によって、必要としている患者（例えば、一般市民及び武装部隊）に対して、血液を保管及び供給するための血液銀行の能力が拡大される。本明細書に記載されるように、アポトーシスを阻害する１つ又は２つ以上の外因性ポリペプチドを含有する培地中で赤血球を維持すると、赤血球の集団のインビトロでの半減期が延長する。
本開示のタンパク質
本開示の特定の態様は、細胞の生存及び／若しくは増殖を促進し、並びに／又はアポトーシスを阻害する、１つ若しくは２つ以上の組み換えタンパク質（例えば、外因性タンパク質）、又はこれらの生物学的に活性な断片を含有する培地の存在下で、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は赤血球を培養することによる、ＨＳＣから赤血球の集団をインビトロで産生すること、赤血球の集団を維持することに関する。本開示の更なる態様は、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含有する、含む、及び／又は発現する本開示のＨＳＣ及び／又は赤血球に関する。
本明細書で使用されるとき、「細胞の生存及び／又は増殖を促進する」タンパク質は、その生物学的活性が、直接的又は間接的に、細胞の生存及び／又は細胞の増殖を活性化する、誘導する、増強する、刺激する、可能にする、又は増加するタンパク質を指す。本明細書で使用されるとき、細胞の生存及び／若しくは増殖を促進するタンパク質、又はアポトーシスを阻害するタンパク質などの、本開示のタンパク質の「生物学的に活性な断片」は、全長タンパク質の少なくとも１つの活性及び／又は機能を保持している、本開示の全長タンパク質の断片である。
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、自然発生型アミノ酸ポリマー、並びに、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が非自然発生型アミノ酸、例えば、アミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書で使用されるとき、この用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する組み換えタンパク質
本開示の特定の態様は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ若しくは２つ以上の組み換えタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片を含有する培地の存在下で、造血幹細胞（ＨＳＣ）を培養することによる、ＨＳＣから赤血球の集団をインビトロで産生することに関する。
細胞の生存及び／又は増殖を促進する当該技術分野において既知の任意の好適なタンパク質を使用してよい。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、癌ペプチド（例えば、癌原遺伝子及び／又は癌遺伝子によってコードされるポリペプチド）である。好適な癌ペプチドは、不死細胞を誘発する任意の好適なクラスであってよい。細胞の生存及び／又は増殖を促進する好適な癌ペプチドの例として、成長因子及び／若しくは分裂促進因子（例えば、ｃ－ＳｉｓなどのＰＤＧＦ由来成長因子）；受容体型チロシンキナーゼ、特に常時活性型受容体型チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、及びＨＥＲ２／ｎｅｕ）；細胞質型チロシンキナーゼ（例えば、Ｓｒｃファミリー、Ｓｙｋ－ＺＡＰ－７０ファミリー、及びＢＴＫファミリーのチロシンキナーゼ）；細胞質型セリン／スレオニンキナーゼ及びそれらの調節サブユニット（例えば、Ｒａｆキナーゼ、サイクリン依存性キナーゼ、Ａｋｔファミリーのメンバー）；調節性ＧＴＰアーゼ（例えば、Ｒａｓタンパク質）；転写因子（例えば、ＭＹＣ及びＨＩＦ－１ａ）；テロメラーゼ逆転写酵素（例えば、ＴＥＲＴ若しくはｈＴＥＲＴ）；並びに／又は、別の癌ペプチドを活性化する因子（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｄ、及び／若しくはＥを含むサイクリン、サイクリンＤ１及びＤ３など）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、非限定として、ＭＹＣ、ｍＴＯＲ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ３、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＡＭＬ－ＥＴＯ、ＡＫＴ、ＩＣＮ－１、ｈＴＥＲＴ、ＰＤＫ－１、ＭＬＬ－ＥＮＬ、ＩＬ３受容体β鎖、β－カテニン、ヘッジホッグファミリー（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｄｈｈ）、Ｂｍｉ－１、ｃ－Ｊｕｎ、Ｗｎｔ、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－６、Ｂｃｌ－１０、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ１）、ＥｒｂＢ－２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ－３／ＨＥＲ３、ＥｒｂＢ－４／ＨＥＲ４、ＥＧＦＲリガンドファミリー；インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）ファミリー、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＩＧＦＲリガンドファミリー；血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）ファミリー、ＰＤＧＦＲリガンドファミリー；線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリー、ＦＧＦＲリガンドファミリー、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）ファミリー、ＶＥＧＦファミリー；ＨＧＦ受容体ファミリー；ＴＲＫ受容体ファミリー；エフリン（ＥＰＨ）受容体ファミリー；ＡＸＬ受容体ファミリー；白血球チロシンキナーゼ（ＬＴＫ）受容体ファミリー；ＴＩＥ受容体ファミリー、アンジオポエチン１、２；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体（ＲＯＲ）受容体ファミリー；ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）ファミリー；ＲＥＴ受容体ファミリー；ＫＬＧ受容体ファミリー；ＲＹＫ受容体ファミリー；ＭｕＳＫ受容体ファミリー；形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）受容体、ＴＧＦ－β；サイトカイン受容体、クラスＩ（ヘマトポイエチンファミリー）及びクラスＩＩ（インターフェロン／ＩＬ－１０ファミリー）受容体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）、細胞死受容体ファミリー；癌－精巣（ＣＴ）抗原、系統特異的抗原、分化抗原、α－アクチニン－４、ＡＲＴＣ１、切断点クラスター領域－Ａｂｅｌｓｏｎ（Ｂｃｒ－ａｂｌ）融合生成物、Ｂ－ＲＡＦ、カスパーゼ－５（ＣＡＳＰ－５）、カスパーゼ－８（ＣＡＳＰ－８）、β－カテニン（ＣＴＮＮＢ１）、細胞分裂周期２７（ＣＤＣ２７）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＯＡ－１、ｄｅｋ－ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ－２、伸長因子２（ＥＬＦ２）、Ｅｔｓ変異体遺伝子６／急性骨髄性白血病１遺伝子ＥＴＳ（ＥＴＣ６－ＡＭＬ１）融合タンパク質、フィブロネクチン（ＦＮ）、ＧＰＮＭＢ、低密度脂質受容体／ＧＤＰ－Ｌフコース：β－Ｄガラクトース２－α－Ｌフコシルトランスフェラーゼ（ＬＤＬＲ／ＦＵＴ）融合タンパク質、ＨＬＡ－Ａ２．ＨＬＡ－Ａ２遺伝子中α２－ドメインのα－ヘリックスの１７０番目の残基のアルギニンのイソロイシンへの変換（ＨＬＡ－Ａ＊２０１－Ｒ１７０Ｉ）、ＨＬＡ－Ａ１１、ヒートショックタンパク質７０－２変異体（ＨＳＰ７０－２Ｍ）、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＡＲＴ２、メラノーマ遍在性変異体１、２、３（ＭＵＭ－１、２、３）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、ネオ－ＰＡＰ、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ＯＧＴ、ＯＳ－９、ｐｍｌ－ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ－ｒａｓ（ＫＲＡＳ２）、Ｎ－ｒａｓ（ＮＲＡＳ）、ＨＲＡＳ、ＲＢＡＦ６００、ＳＩＲＴ２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ－ＳＳＸ１若しくは－ＳＳＸ２融合タンパク質、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＢＡＧＥ、ＢＡＧＥ－１、ＢＡＧＥ－２、３、４、５、ＧＡＧＥ－１、２、３、４、５、６、７、８、ＧｎＴ－Ｖ（異常性Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ、ＭＧＡＴ５）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＫＫ－ＬＣ、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ、ＬＡＧＥ－１、メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原（ＣＡＭＥＬ）、ＭＡＧＥ－Ａ１（ＭＡＧＥ－１）、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ムチン１（ＭＵＣ１）、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（ＭＬＡＮＡ）、ｇｐ１００、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌｌ７（ＳＩＬＶ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、ＴＲＰ－１、ＨＡＧＥ、ＮＡ－８８、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－２、ＳＡＧＥ、Ｓｐ１７、ＳＳＸ－１，２，３，４、ＴＲＰ２－ＩＮＴ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、カリクレイン４、マンマグロビン－Ａ、ＯＡ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ－１／ｇｐ７５、ＴＲＰ－２、アディポフィリン、メラノーマ２には含まれないインターフェロン誘導性タンパク質（ＡＩＭ－２）、ＢＩＮＧ－４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、上皮細胞接着分子（Ｅｐ－ＣＡＭ）、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞成長因子－５（ＦＧＦ－５）、糖タンパク質２５０（ｇｐ２５０）、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（ＥＲＢＢ２）、インターロイキン１３受容体α２鎖（ＩＬＩ ３Ｒα２）、ＩＬ－６受容体、腸カルボキシエステラーゼ（すなわち、α－胎児タンパク質（ＡＦＰ）、Ｍ－ＣＳＦ、ｍｄｍ－２、ＭＵＣ１、ｐ５３（ＴＰ５３）、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ－１、ＲＮＦ４３、ＲＵ２ＡＳ、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、サバイビン（ＢＩＲＣ５）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、テロメラーゼ、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＳＹＣＰ１、ＢＲＤＴ、ＳＰＡＮＸ、ＸＡＧＥ、ＡＤＡＭ２、ＰＡＧＥ－５、ＬＩＰ１、ＣＴＡＧＥ－１、ＣＳＡＧＥ、ＭＭＡ１、ＣＡＧＥ、ＢＯＲＩＳ、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＡＦ１５ｑ１４、ＨＣＡ６６１、ＬＤＨＣ、ＭＯＲＣ、ＳＧＹ－１、ＳＰＯ１１、ＴＰＸ１、ＮＹ－ＳＡＲ－３５、ＦＴＨＬ１７、ＮＸＦ２、ＴＤＲＤ１、ＴＥＸ１５、ＦＡＴＥ、ＴＰＴＥ、免疫グロブリンイディオタイプ、ベンス－ジョーンズタンパク質、エストロゲン受容体（ＥＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、癌抗原７２－４（ＣＡ７２－４）、癌抗原１５－３（ＣＡ１５－３）、癌抗原２７－２９（ＣＡ２７－２９）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、扁平細胞癌関連抗原、神経細胞特異的エノラーゼ、ヒートショックタンパク質ｇｐ９６、ＧＭ２、サルグラモスチム、ＣＴＬＡ－４、７０７アラニンプロリン（７０７－ＡＰ）、Ｔ細胞によって認識される腺癌抗原４（ＡＲＴ－４）、癌胚形成性抗原ペプチド－１（ＣＡＰ－１）、カルシウム活性化型クロライドチャネル－２（ＣＬＣＡ２）、シクロフィリンＢ（Ｃｙｐ－Ｂ）、ヒト印環腫瘍－２（ＨＳＴ－２）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来形質転換遺伝子及びタンパク質、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質（ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶ－Ｅ７、主若しくは副カプシド抗原、その他）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質（ＥＢＶ潜伏膜タンパク質－ＬＭＰ１、ＬＭＰ２；その他）、Ｂ型肝炎若しくはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質、機能的ホモログ、機能的アナログ、又はこれらの生物学的に活性な断片である。
いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、細胞の生存及び／又は増殖の内因性拮抗物質（例えば、タンパク質及び／又は遺伝子）を阻害するタンパク質である。例えば、このタンパク質は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する遺伝子の発現を抑える転写抑制因子の阻害物質であってよい。特定の実施形態では、転写抑制因子は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する遺伝子の発現を制御する、本開示の癌ペプチド、例えばＭＹＣを拮抗できる。例えば、いくつかの実施形態では、このタンパク質は、ＭＡＤファミリーである転写抑制因子の少なくとも１つのメンバー、例えば、ＭＡＤ－１；又は、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質（例えば、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、又はｐ２７）を阻害する。
別の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖は、細胞の生存及び／又は増殖の内因性拮抗物質（例えば、タンパク質及び／又は遺伝子）を阻害する因子によって促進される。例えば、この因子は、遺伝的阻害物質又は小分子阻害物質（例えば、拮抗物質）であってよい。いくつかの実施形態では、この因子は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する遺伝子の発現を抑える転写抑制因子の阻害物質を含んでよい。特定の実施形態では、転写抑制因子は、細胞の生存及び／又は増殖を促進する遺伝子の発現を制御する、本開示の癌ペプチド、例えばＭＹＣを拮抗する。例えば、いくつかの実施形態では、この因子は、ＭＡＤファミリーである転写抑制因子の少なくとも１つのメンバー、例えば、ＭＡＤ－１を阻害する。特定の別の実施形態では、この因子は、サイクリン依存性キナーゼ阻害物質（例えば、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、又はｐ２７）の阻害物質である。
同種の野生型細胞に対して、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質の内因性拮抗物質を阻害する任意の因子が、本開示の方法での使用に好適である。細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質の内因性拮抗物質の阻害物質である因子は、任意の段階で、又は任意の機構によって、拮抗物質の活性又は濃度を低下させる、阻害する、又は減少させる。例えば、場合によっては、かかる因子は、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質の活性を拮抗する因子の発現を、例えば、翻訳レベルで、又は転写レベルで妨げる。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質の活性を拮抗する因子の発現を妨げる因子は、ＲＮＡ干渉可能な因子（ＲＮＡｉ分子）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、あるポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの切断、又はｍＲＮＡへの結合によって生成される。ＲＮＡｉ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などの、任意の好適な手段によって生成される。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質の活性を拮抗する因子の発現を妨げる因子は、低分子、例えば有機小分子である。
別の実施形態では、この因子は、細胞の生存及び／又は増殖を拮抗するタンパク質の活性又は濃度を阻害する。いくつかの実施形態では、この因子は、細胞の生存及び／又は増殖を拮抗するタンパク質に直接作用する。例えば、この因子は、細胞の生存及び／又は増殖を拮抗するタンパク質に結合し、活性を阻害できる。したがって、特定の実施形態では、この因子は、細胞の生存及び／又は増殖を拮抗するタンパク質に結合し、元々の機能を妨害する抗体又は低分子である。
別の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を更に含む。
いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質はボーラス量として提供される。本明細書で使用されるとき、「ボーラス量」は、対象の血中タンパク質濃度を有効濃度まで上昇させる、対象に投与されるタンパク質の量又は濃度を指す。ボーラス量は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法で投与されてよい。いくつかの実施形態では、ボーラス量は、約１２時間毎、約２４時間毎、約３６時間毎、約４８時間毎、約６０時間毎、又は約７２時間毎に提供される。
いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、ＭＹＣポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片である。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、ＩＣＮ－１ポリペプチド、これらのホモログ、又はこれらの生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質である。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、ＰＴＤ－ＩＣＮ－１融合タンパク質である。
ＭＹＣ
本開示のＭＹＣポリペプチドとして、ＭＹＣタンパク質の活性を有する任意のポリペプチド、又はこれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「ＭＹＣ」及び「ＭＹＣタンパク質」は互換的に使用され、ｂＨＬＨ（塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス）を持つＭＹＣファミリー転写因子のメンバーである、タンパク質を指す。本開示のＭＹＣタンパク質は、ＭＹＣ応答遺伝子の発現を制御し、そのため細胞の核内に入って機能する転写因子である。ＭＹＣ活性は、別のＭＹＣ応答遺伝子の発現を抑制しながら、特定のＭＹＣ応答遺伝子の発現を活性化できる。ＭＹＣ活性は、細胞増殖、細胞成長、細胞の生存、及びアポトーシスを非限定的に含む、様々な細胞機能を制御できる。
本明細書に記載する様に、ＨＳＣから赤血球の産生中に、外因性又は内因性源によってもたらされるＭＹＣの一過性発現によって、成熟赤血球の産生量を増加でき、成熟赤血球の産生時間を短縮でき、集団中の成熟赤血球の割合を増加でき、及び／又は、ＭＹＣ非存在下での産生と比較して、成熟赤血球の産生率を増加できる。理論に束縛されるものではないが、胚性幹細胞中でのＭＹＣの遷延発現が、分化を阻害することによる自己複製を促進することが示されている（例えば、Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００５ Ｍａｒ；１３２（５）：８８５～９６）ことから、ＨＳＣの成熟赤血球への分化を促進するのは、低レベルＭＹＣの一過性発現であると考えられる。更に、驚くべきことに、低レベルＭＹＣの一過性発現が、ＨＳＣからの成熟赤血球の産生を増強する能力は、異所的な高レベルＭＹＣ発現が、赤血球系前駆細胞の無核赤血球への分化を阻害するという最近の発見（Ｊａｙａｐａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０ Ｄｅｃ １７；２８５（５１）：４０２５２～６５）によって与えられている。
本開示のＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、ＨＳＣ中の内因性ＭＹＣの過剰発現、又は、ＨＳＣの遺伝子操作によるＭＹＣの組み換え発現の必要がなく、ＭＹＣを外から追加することによってＨＳＣ中のＭＹＣ活性の増加を可能にする。
本開示のＭＹＣポリペプチドとして、全長ＭＹＣタンパク質、全長ＭＹＣタンパク質の活性を保持する断片、これらのホモログ、及びこれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。本開示のＭＹＣポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって作製できる。例えば、ＭＹＣポリペプチドを天然源から精製してよく、組み換え的に発現させてよく、又は、化学的に合成してもよい。
ＭＹＣタンパク質
本開示の任意の方法で使用するのに好適な全長ＭＹＣタンパク質の例として、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、ｖ－ＭＹＣ、及びＳ－Ｍｙｃが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の好ましい実施形態では、ＭＹＣポリペプチドは、全長ｃ－Ｍｙｃポリペプチドである。ｃ－Ｍｙｃポリペプチドは、ポリペプチドが４３９個のアミノ酸のポリマーであり得る、ポリペプチドが４８．８０４ｋＤａの分子量を有し得る、ポリペプチドが塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス、ロイシンジッパー（ｂＨＬＨ／ＬＺ）ドメインを含有し得る、又は、ポリペプチドがＣＡＣＧＴＧ（すなわち、Ｅボックス配列）を含む配列に結合し得る、のうち、１つ又は２つ以上の特徴を有し得る。好ましくは、ｃ－Ｍｙｃポリペプチドは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２４５８．２を有するヒトｃ－Ｍｙｃポリペプチドである。更に、本開示のｃ－ＭＹＣポリペプチドは、翻訳後修飾を全く受けていないｃ－Ｍｙｃポリペプチドであってよい。あるいは、本開示のｃ－ＭＹＣポリペプチドは、翻訳後修飾を受けたｃ－Ｍｙｃポリペプチドであってよい。
生物学的に活性なＭＹＣ断片
別の実施形態では、本開示のＭＹＣポリペプチドは、全長ＭＹＣタンパク質の少なくとも１つの活性を保持している、全長ＭＹＣタンパク質の生物学的に活性な断片である。ＭＹＣポリペプチドは、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、又はＳ－Ｍｙｃの断片であってよい。
本開示のＭＹＣ断片は、ＭＹＣタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、又はそれ以上の連続アミノ酸残基を含み得る。
ＭＹＣホモログ及びアナログ
別の実施形態では、本開示のＭＹＣポリペプチドは、全長ＭＹＣタンパク質の少なくとも１つの活性を保持している、ＭＹＣタンパク質のホモログ又はアナログ、又はこれらの断片である。
例えば、本開示のＭＹＣポリペプチドは、ＭＹＣタンパク質又はその断片に、少なくとも４０％～１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含んでよい。特定の実施形態では、ＭＹＣポリペプチドは、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｓ－Ｍｙｃ、又はこれらの断片のホモログ又はアナログである。
本開示のＭＹＣポリペプチドは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２４５８．２を有するヒトｃ－Ｍｙｃポリペプチド、又はこの断片の機能的ホモログ又はアナログも含む。特定の実施形態では、ｃ－Ｍｙｃホモログ又はアナログは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２４５８．２のｃ－Ｍｙｃポリペプチド配列又はその断片に、少なくとも４０％～１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ｃ－Ｍｙｃホモログ又はアナログは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００２４５８．２のｃ－Ｍｙｃポリペプチド配列又はその断片に、少なくとも５０％～１００％同一である、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約５０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一である、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも３５０個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、又はそれ以上の長さのポリペプチド配列を含む。
本明細書で使用されるとき、「ホモログ」は、参照配列と第２配列の少なくとも断片との間に、アミノ酸配列の類似性を有するタンパク質又はポリペプチドを指す。ホモログは、当該技術分野において既知の任意の方法によって、好ましくは、単一の第２配列若しくは配列の断片、又は配列データベースと参照配列を比較するための、ＢＬＡＳＴツールを用いることによって同定できる。以下に記載するように、ＢＬＡＳＴは、同一性及び類似性パーセントに基づいて配列を比較する。
２つ以上の配列（例えば、アミノ酸配列）に関連する用語、「同一」又は「同一性」パーセントは、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうち１つを用いて、又は、手動で整列させて目視で調べることによって測定する際、比較ウィンドウ、つまり、指定領域にわたって最大に一致するように比較し、整列させるとき、２つの配列が、同じ（すなわち、特定の領域にわたって、又は、特定されない場合は全配列にわたって、２９％同一、任意に３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一）である、特定の割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、２つの配列は実質的に同一である。所望により、長さが少なくとも約１０個のアミノ酸の領域にわたって、又はより好ましくは長さが２０個、５０個、２００個、又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたって同一性が存在する。
配列比較において、典型的には１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してよく、又は、別のパラメータを指定してもよい。配列比較アルゴリズムは、続いて、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。同一性について２つの配列を比較するとき、配列が近接している必要はないが、ギャップがあると、全体的な同一性パーセントを低下し得るペナルティをもたらす。ｂｌａｓｔｐでは、デフォルトパラメータは、開始ギャップペナルティ＝１１、伸長ギャップペナルティ＝１である。ｂｌａｓｔｎでは、デフォルトパラメータは、開始ギャップペナルティ＝５、伸長ギャップペナルティ＝２である。
本明細書で使用されるとき、「比較ウィンドウ」は、非限定的に２０～６００、多くは約５０～約２００、更に多くは約１００～約１５０の連続位置数のうち任意の１つのセグメントに対する参照を含み、ここである配列は、２つの配列を最も適切に整列させた後に、同じ数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアライメント法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎによる局所ホモロジーアルゴリズム（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８（３）：４４３～４５３によるホモロジーアライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２４４４～２４４８による類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は手動アライメント及び目視［例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｉｎｇｂｏｕ Ｅｄ）参照］によって実施できる。
配列同一性パーセント及び配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの例の２つは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９～３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（３）－４０３～４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから公開されている。このアルゴリズムは、まず、クエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたとき、一致するか、又は、一定の正の閾値スコアＴを満たすかのいずれかである、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔを、隣接ワードスコア閾値と称する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．上記参照）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見つけるための初期検索シードの役割をする。累積アライメントスコアが増加可能である限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に延ばす。ヌクレオチド配列において、累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基ペアのリワードスコア、常に＞０）及びＮ（一致しない残基のペナルティスコア、常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの延長は、累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘ減少したとき、１つ若しくは２つ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積によって、累積スコアがゼロ以下になったとき、又は、いずれかの配列の末端に到達したときに、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。アミノ酸配列において、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長は３、期待値（Ｅ）は１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス［Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５～１０９１９参照］アライメント（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。ヌクレオチド配列において、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）は１１、期待値（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（１２）：５８７３～５８７７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計可能性値（Ｐ（Ｎ））であり、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる可能性の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較する際の最小合計可能性値が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１の場合、核酸は参照配列と類似するとみなされる。
上記の配列同一性パーセント以外の、２つのポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドに対して産生された抗体と、免疫学的交差反応性を有することである。したがって、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なるとき、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと典型的には実質的に同一である。
本明細書で開示されるように、好適なＭＹＣポリペプチドは、本開示のＭＹＣポリペプチドの保存的に修飾された変異体も含む。本明細書で使用するとき、「保存的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸への置換をもたらすコード化アミノ酸配列への、個々の置換、欠失、又は付加を含む。機能的に類似するアミノ酸をもたらす保存的置換表は当該技術分野において周知である。次の８つのグループ、すなわち、１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）参照）。
ＭＹＣの下流のタンパク質
別の実施形態では、本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進する好適なタンパク質は、ＭＹＣ経路においてＭＹＣの下流にある細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質である。当該技術分野において既知の任意の下流タンパク質が、本開示の方法で使用するのに好適である。細胞の生存及び／又は増殖を促進し、ＭＹＣの下流にある好適なタンパク質の例として、ＡＫＴ及びＡＫＴ関連タンパク質、例えば、ＰＤＫ－１、ｍＴＯＲＣ２、ＰＩ３Ｋ－δが挙げられるが、これらに限定されない。細胞の生存及び／又は増殖を促進するＭＹＣの下流タンパク質は更に、ＰＴＤ－融合タンパク質であってよい。したがって、特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するＭＹＣの下流タンパク質は、ＡＫＴ－ＰＴＤ融合タンパク質、ＰＴＤ－ＰＤＫ－１融合タンパク質、ＰＴＤ－ｍＴＯＲＣ２融合タンパク質、又はＰＴＤ－ＰＩ３Ｋ－δ融合タンパク質である。
別の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を拮抗し、ＭＹＣ経路においてＭＹＣの下流にあるタンパク質を阻害することによって、本開示のＨＳＣにおいて細胞の生存及び／又は増殖が促進される。細胞の生存及び／又は増殖を拮抗し、ＭＹＣの下流にあるタンパク質の例として、ｐＴＥＮ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、ＣＴＭＰが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、特定の実施形態では、ｐＴＥＮ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、及び／又はＣＴＭＰを阻害することによって、本開示のＨＳＣにおいて細胞の生存及び／又は増殖が促進される。本明細書に開示される方法を非限定的に含む、タンパク質及び／又は遺伝子の発現、活性、及び／又は機能を阻害する任意の当該技術分野において既知の方法を用いてよい。非限定例として、遺伝的阻害物質、小分子阻害物質、ＲＮＡ干渉、及び抗体が挙げられる。
全長ＭＹＣタンパク質の活性
別の実施形態では、本開示のＭＹＣタンパク質又はＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、少なくとも１つのＭＹＣ活性を有する全長ＭＹＣポリペプチド、全長ＭＹＣタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＭＹＣタンパク質の断片、全長ＭＹＣタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＭＹＣタンパク質のホモログ、又は、全長ＭＹＣタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＭＹＣタンパク質のアナログを含む。
本開示の全長ＭＹＣタンパク質は多くの活性を有する。かかる活性の例として、転写因子活性、タンパク質結合活性、核酸結合活性、細胞増殖制御活性、細胞成長制御活性、アポトーシス制御活性、形態形成制御活性、発達制御活性、及び増強された造血性区画再構成活性が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のＭＹＣタンパク質又はＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、ＥＰＯ、及び所望により、ＩＬ－３と共に、ＨＳＣから成熟赤血球を産生するＭＹＣ活性を有する。別の実施形態では、本開示のＭＹＣタンパク質又はＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、ＨＳＣを条件的に不死化するＭＹＣ活性を有する。有利には、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質の形態のＭＹＣを投与することで、ＨＳＣ中に一過性のＭＹＣ活性をもたらす。いくつかの実施形態では、一過性ＭＹＣ活性のレベルは、ＨＳＣの成熟赤血球への分化を増強するのに十分である。更に、本開示のＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、ＨＳＣ中の細胞内ＭＹＣレベルを増加させることができ、ＨＳＣの増殖をもたらす。この一過性のＭＹＣ活性によって、細胞中の長引くＭＹＣ活性による潜在的な悪影響、例えば、制御されない細胞成長及び癌化が避けられる。更に、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質を使用することによって、細胞の遺伝子操作を行わずに、ＨＳＣ中のＭＹＣ活性を誘導できる。
アポトーシスを阻害する外因性タンパク質
本開示の特定の態様は、アポトーシスを阻害する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質（例えば、外因性タンパク質）を含む培地の存在下で赤血球又は赤血球の集団を培養することによる、本開示の赤血球又は赤血球の集団のインビトロでの維持に関する。本開示の他の態様は、アポトーシスを阻害する１つ又は２つ以上の外因性タンパク質を含む培地の存在下で本開示のＨＳＣを更に培養することにも関する。本明細書で使用されるとき、「アポトーシスを阻害する」タンパク質又はポリペプチドは、その機能が、直接的又は間接的に、アポトーシス（すなわち、プログラム細胞死）に関連するプロセスを低下させる、阻害する、又は減らす、タンパク質又はポリペプチドを指す。
アポトーシスを阻害する当該技術分野において既知の任意の好適なタンパク質を使用してよい。いくつかの実施形態では、アポトーシスを阻害するタンパク質は、１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインを含むタンパク質である。１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインを含むタンパク質の例として、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、ＣＥＤ－９、Ａ１、Ｂｆｌ－１、及びＢｃｌ－ｗが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、アポトーシスを阻害するタンパク質は、アポトーシスを促進する当該技術分野において既知の任意の内因性タンパク質及び／又は遺伝子を阻害するタンパク質である。アポトーシスを促進するタンパク質の例として、Ｂｃｌ－２ファミリーメンバー、カスパーゼ、ＴＮＦファミリーの受容体であるタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、アポトーシスの阻害は、アポトーシスを促進する当該技術分野において既知の内因性タンパク質及び／又は遺伝子を阻害する因子によって達成される。例えば、この因子は、遺伝的阻害物質又は小分子阻害物質（例えば、拮抗物質）であってよい。アポトーシスを阻害するため、当該技術分野において既知の任意の遺伝的阻害物質又は小分子阻害物質を使用してよい。いくつかの実施形態では、この因子は、アポトーシスを促進するタンパク質の発現を妨げる。例えば、この因子は、アポトーシスを促進するタンパク質の発現を、翻訳レベルで、又は転写レベルで妨げることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉を用いて、アポトーシスを促進するタンパク質の発現を妨げる。別の実施形態では、この因子は、アポトーシスを促進するタンパク質の活性又はレベルを阻害する。いくつかの実施形態では、この因子は、アポトーシスを促進するタンパク質に直接作用する。例えば、この因子は、アポトーシスを促進するタンパク質に結合し、活性を阻害できる。したがって、特定の実施形態では、この因子は、アポトーシスを阻害するタンパク質に結合し、元々の機能を妨害する抗体又は低分子である。
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、１つ又は２つ以上のＢｃｌ－２ホモロジードメインを含む１つ又は２つ以上のタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質である。
Ｂｃｌ－２
本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドとして、Ｂｃｌ－２タンパク質の活性を有する任意のポリペプチド、又はこれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「Ｂｃｌ－２」、「Ｂｃｌ－２ポリペプチド」、及び「Ｂｃｌ－２タンパク質」は互換的に用いられ、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４などであるがこれらに限定されない、１つ若しくは２つ以上の、及び／又は全てのＢｃｌ－２ホモロジー（ＢＨ）ドメインを有する、Ｂｃｌ－２タンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質を指す。ｂｃｌ－２タンパク質ファミリーのメンバーは、典型的にはヘテロ二量体又はホモ二量体を形成し、アポトーシスの制御因子として働く。特定の好ましい実施形態では、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、抗アポトーシス活性及び／又はＨＳＣの条件的不死化プロセスにおいて有用な活性を有する。
本明細書に記載されるように、外因性Ｂｃｌ－２を赤血球の集団に追加すると、Ｂｃｌ－２の非存在下で維持された対応する赤血球の集団と比較して、赤血球がインビトロで生存する時間を延長でき、時間と共に生存する赤血球の割合を増加でき、並びに／又は、時間と共に１つ若しくは２つ以上の赤血球の機能的特徴のインビトロでの損失を遅延、及び／若しくは低下できる。いくつかの実施形態では、外因性Ｂｃｌ－２の追加は、赤血球保存培地に対してである。１つ又は２つ以上の機能的特徴として、酸素運搬能、ヘモグロビン量、発現されるヘモグロビンの種類（成人型対胎児型）、表面に発現されるトランスフェリン受容体のレベル、又は、１つ若しくは２つ以上の成熟赤血球マーカーのうち、１つ又は２つ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、Ｂｃｌ－２非存在下での維持と比較して、ＨＳＣからの赤血球産生の最終段階中に外因性又は内因性源によってもたらされるＢｃｌ－２の一過性上方制御は、赤血球がインビトロで生存する時間を延長でき、時間と共に生存する赤血球の割合を増加でき、並びに／又は、時間と共に１つ若しくは２つ以上の赤血球の機能的特徴のインビトロでの損失を遅延、及び／若しくは低下できる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣからの赤血球産生の最終段階中に外因性又は内因性源によってもたらされるＢｃｌ－２の一過性上方制御は、赤血球保存培地中でのＲＢＣ維持を増強するように設計される。
別の実施形態では、本開示は、Ｂｃｌ－２を含む赤血球保存培地に関心が寄せられる。
本開示のＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質は、ＨＳＣ中の内因性Ｂｃｌ－２の過剰発現、又は、ＨＳＣの遺伝子操作によるＢｃｌ－２の組み換え発現の必要がなく、Ｂｃｌ－２を外から追加することによってＨＳＣ中のＢｃｌ－２活性の増加を可能にする。
本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドとして、全長Ｂｃｌ－２タンパク質、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の活性を保持する断片、これらのホモログ、及びこれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の活性を保持するＢｃｌ－２断片として、非構造化ループドメインが除去されている切断型Ｂｃｌ－２が挙げられる（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｏｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂｃｌ－２ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１５，１６２～７０）。本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって作製できる。例えば、Ｂｃｌ－２ポリペプチドを天然源から精製してよく、組み換え的に発現させてよく、又は、化学的に合成してもよい。
Ｂｃｌ－２タンパク質
本開示の任意の方法で使用するのに好適な全長Ｂｃｌ－２タンパク質の例として、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、ＣＥＤ－９、Ｂｃｌ－２関連タンパク質Ａ１、Ｂｆｌ－１、及びＢｃｌ－ｗが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の好ましい実施形態では、Ｂｃｌ－２ポリペプチドは、非構造化ループドメインが除去されている全長ヒトＢｃｌ－２ポリペプチドである。ヒトＢｃｌ－２ポリペプチドは、以下の特徴、すなわち、ポリペプチドが２３９個のアミノ酸のポリマーであり得る、ポリペプチドが約２６．３ｋＤａの分子量を有し得る、又は、ポリペプチドが少なくとも１つのＢｃｌ－２ホモロジー（ＢＨ）ドメイン、例えばＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４を含み得る、のうち、１つ又は２つ以上を有してよい。好ましくは、ヒトＢｃｌ－２ポリペプチドは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００６２４．２を有するＢｃｌ－２ポリペプチドである。更に、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、翻訳後修飾を全く受けていないＢｃｌ－２ポリペプチドであってよい。あるいは、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、翻訳後修飾を受けたＢｃｌ－２ポリペプチドであってよい。
生物学的に活性なＢｃｌ－２断片
別の実施形態では、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の少なくとも１つの活性を保持している、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の生物学的に活性な断片である。Ｂｃｌ－２ポリペプチドは、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、ＣＥＤ－９、Ｂｃｌ－２関連タンパク質Ａ１、Ｂｆｌ－１、又はＢｃｌ－ｗの断片であってよい。
本開示のＢｃｌ－２断片は、Ｂｃｌ－２タンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２１０、少なくとも２２０、少なくとも２３０、又はそれ以上の連続アミノ酸残基を含み得る。
Ｂｃｌ－２ホモログ及びアナログ
別の実施形態では、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、Ｂｃｌ－２タンパク質又はこれらの断片のホモログ又はアナログである。例えば、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、Ｂｃｌ－２タンパク質又はその断片に、少なくとも４０％～１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含んでよい。特定の実施形態では、Ｂｃｌ－２ポリペプチドは、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、ＣＥＤ－９、Ｂｃｌ－２関連タンパク質Ａ１、Ｂｆｌ－１、Ｂｃｌ－ｗ、又はその断片の、ホモログ又はアナログである。
本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６２４．２を有するヒトＢｃｌ－２ポリペプチド、又はこの断片の機能的ホモログ又はアナログも含む。特定の実施形態では、Ｂｃｌ－２ホモログ又はアナログは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６２４．２のＢｃｌ－２ポリペプチド配列又はその断片に、少なくとも４０％～１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、Ｂｃｌ－２ホモログ又はアナログは、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００６２４．２のＢｃｌ－２ポリペプチド配列又はその断片に、少なくとも５０％～１００％同一である、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約５０％～約１００％の任意のその他パーセンテージで同一である、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくとも１２０個のアミノ酸、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なくとも１４０個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸、少なくとも１８０個のアミノ酸、少なくとも１９０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２１０個のアミノ酸、少なくとも２２０個のアミノ酸、少なくとも２３０個のアミノ酸、又はそれ以上の長さのポリペプチド配列を含む。
本明細書で開示されるように、好適なＢｃｌ－２ポリペプチドは、本開示のＢｃｌ－２ポリペプチドの保存的に修飾された変異体も含む。
アポトーシスを促進するＢｃｌ－２ホモログ
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のＢＨドメインを含み、アポトーシスを促進するタンパク質を阻害することによって、アポトーシスが阻害される。アポトーシスを促進するＢＨドメイン含有タンパク質の例として、Ｂｃｌ－Ｘｓ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＮＯＸＡ－２、ＤＩＶＡ、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、及びＥＧＬ－１が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、特定の実施形態では、Ｂｃｌ－Ｘｓ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＮＯＸＡ－２、ＤＩＶＡ、ＢＡＫ、ＢＡＸ、ＢＩＫ、ＢＡＤ、ＢＩＤ、及び／又はＥＧＬ－１を阻害することによって、アポトーシスが阻害される。本明細書に開示される方法を非限定的に含む、タンパク質及び／又は遺伝子の発現、活性、及び／又は機能を阻害する任意の当該技術分野において既知の方法を用いてよい。非限定例として、遺伝的阻害物質、小分子阻害物質、ＲＮＡ干渉、及び抗体が挙げられる。
全長Ｂｃｌ－２タンパク質の活性
別の実施形態では、本開示のＢｃｌ－２タンパク質又はＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質は、少なくとも１つのＢｃｌ－２活性を有する全長Ｂｃｌ－２ポリペプチド、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＢｃｌ－２タンパク質の断片、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＢｃｌ－２タンパク質のホモログ、又は、全長Ｂｃｌ－２タンパク質の少なくとも１つの活性を保持するＢｃｌ－２タンパク質のアナログを含む。
本開示の全長Ｂｃｌ－２タンパク質は多くの活性を有する。かかる活性の例として、アポトーシス制御活性、細胞の生存制御活性、タンパク質結合活性、ミトコンドリア膜透過性制御活性、カスパーゼ制御活性、電位依存性アニオンチャネル制御活性、Ｇ２チェックポイント制御活性、ミトコンドリア外膜チャネル（ＶＤＡＣ）制御活性、ミトコンドリア膜電位制御活性、タンパク質チャネル活性、及びシトクロムＣ制御活性が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のＢｃｌ－２タンパク質又はＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質は、ＨＳＣからの成熟赤血球の産生、赤血球若しくは赤血球の集団の維持、及び／又は、ＨＳＣの不死化を助けるＢｃｌ－２活性を有する。有利には、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質の形態のＢｃｌ－２を投与することで、ＨＳＣ中に一過性のＢｃｌ－２活性をもたらす。この一過性のＢｃｌ－２活性によって、細胞中の長引くＢｃｌ－２活性による潜在的な悪影響が避けられる。更に、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質を使用することによって、細胞の遺伝子操作を行わずに、赤血球及び／又はＨＳＣ中のＢｃｌ－２活性を誘導でき、インビトロで無核の成熟赤血球を維持できる。
関心対象のタンパク質
本開示の特定の態様は、ＨＳＣから赤血球の集団のインビトロ産生；赤血球若しくは赤血球の集団インビトロ維持、及び／又は、赤血球のそれを必要とする対象への投与に関し、このとき赤血球又は赤血球の集団は１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む。本開示の態様は、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む赤血球の集団と、かかる赤血球の集団を含む医薬組成物と、も含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を更に含む。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、ＰＴＤと関心対象のタンパク質との融合タンパク質である。
関心対象のタンパク質として、１つ若しくは２つ以上の成長因子、ホルモン、又は、１つ若しくは２つ以上の疾病若しくは疾患の予防、診断及び／若しくは治療に有用なその他ポリペプチドを挙げてよいが、これらに限定されない１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む本開示の赤血球又は赤血球の集団を使用すると、赤血球及びそれらが運ぶコード化タンパク質の１つ又は２つ以上の一過性の性質、完全に成熟した無核細胞の中の遺伝物質の欠如、並びに、個体発生からリンパ系区画によって許容されている「自己」血管の使用を非限定的に含む、様々な理由によって有利である。
いくつかの実施形態では、例えば輸血による対象内への投与に先立ち、関心対象のタンパク質は、インビトロで赤血球膜に結合する。いくつかの実施形態では、かかる結合は、共有結合又は非共有結合によって媒介される。かかる結合の非限定例として、特に、スルフヒドリル結合及び抗体－エピトープ結合を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、インビトロ産生赤血球の外膜内に組み込まれることによって、投与されるように構成される。いくつかの実施形態では、赤血球産生プロセスで使用されるＨＳＣは、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を発現及び／又は過剰発現するように操作される。所望により、関心対象のタンパク質は、輸送配列、細胞膜保留エレメント、又はプロテアーゼ切断部位のうち、１つ又は２つ以上によって操作されてよい。
いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、タンパク質形質導入ドメインを含む融合タンパク質を用いて、本開示の赤血球又はＨＳＣ内に組み込まれることによって、投与されるように構成される。かかるＰＴＤと関心対象のタンパク質との融合タンパク質の作製及び使用方法は、当該技術分野において既知であって、本明細書に記載されており、特に、Ｍｙｃ及びＢｃｌ－２で使用したものに類似の方法が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは条件的不死化ＨＳＣである。いくつかの実施形態では、条件的不死化ＨＳＣは、タンパク質を形質導入したＨＳＣであり、誘導性導入遺伝子の利用によって条件的に不死化されており、並びに／又は、不死化を促進する１つ若しくは２つ以上の内因性及び／若しくは外因性遺伝子の一過性過剰発現によって不死化されている。不死化を促進する遺伝子は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１６６９１号）。
いくつかの実施形態では、条件的不死化ＨＳＣは万能ドナーＨＳＣである。いくつかの実施形態では、条件的不死化ＨＳＣは、まれな血液型由来、又は、治療を必要とする個体由来である。いくつかの実施形態では、個体は、まれな疾患を患っている、まれな血液表現型又は一致するアロタイプを見つけるのが困難な血液表現型を有している場合がある。
関心対象のタンパク質をコードするベクターの構築
本開示のいくつかの態様では、関心対象のタンパク質は、本明細書に開示される方法を非限定的に含む、当該技術分野において既知の、ＨＳＣを遺伝子組み換えによって改変する任意の好適な方法を用いて、本開示のＨＳＣ内に組み込まれる（例えば、Ｒｉｖｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｆｅｂ ２；１１９（５）：１１０７～１６）。例えば、本明細書に記載するものに類似の方法を利用して、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質をＨＳＣ内に組み込み、遺伝子組み換え条件的不死化ＨＳＣを生成できる（例えば、以下の「ＨＳＣ細胞株」及び実施例参照）。
いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、ウイルスベクターなどのベクター構成中でｃＤＮＡによってコードされる。関心対象のタンパク質をコードするｃＤＮＡをウイルスベクター内に組み込む方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書の開示される方法を非限定的に含む。
いくつかの実施形態では、本開示の赤血球の集団は、輸血後にインビボで赤血球の表面から放出されるように設計される、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、関心対象のタンパク質と連結及び／若しくは融合されている、輸送配列、細胞膜保留エレメント、又はプロテアーゼ切断部位のうち、１つ又は２つ以上を更に含む。
タンパク質輸送配列は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、任意にＮ末端において、小胞体シグナル配列を更に含む。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質はＢｃｌ－２である。
細胞膜保留エレメントは当該技術分野において周知であり、ＧＰＩ結合タンパク質、又は任意に１つ若しくは２つ以上の赤血球膜貫通型タンパク質、例えばＣＤ４０、ＣＤ２５、ＩｇＧ、ＦｃＲＮ、ＣＤ８及び／若しくはＣＤ１６などの、細胞質領域の１つ又は２つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
プロテアーゼ切断部位は、当該技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、プラズマ保留エレメントは、関心対象のタンパク質に結合したＩｇＧの膜貫通部分を含んでよく、このときＩｇＧの膜貫通及び／又はリンカー部分は、任意に哺乳類プロテアーゼによって認識される１つ又は２つ以上のＩｇＧ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位は、任意に正常な（内因性）血清プロテアーゼの基質の選択を通じて、インビボでの関心対象のタンパク質の放出しやすさについて選択されてよい。
いくつかの実施形態では、赤血球の集団は、輸血後にインビボで赤血球の表面に維持されるように設計される、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、輸送配列及び細胞膜保留エレメントのうち１つ又は２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の細胞質及び／又は膜貫通部分は、特に、ＣＤ４０、ＣＤ２５、ＩｇＧ、ＦｃＲＮ、ＣＤ８及び／又はＣＤ１６などであるがこれらに限定されない１つ又は２つ以上の赤血球膜貫通型タンパク質をコードするｃＤＮＡなどであるがこれらに限定されない供給源由来であってよい。
いくつかの実施形態では、赤血球の集団は、赤血球の表面に維持されるように設計され、インビボへの輸血前のペイロード中にタンパク質又は他の化合物を結合するように構成される、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含む。これによって、ペイロードが、毒性的問題の可能性を避けること、及び／又は、赤血球の産生に使用されるＨＳＣの遺伝子操作が困難であることなどの選択肢を赤血球に与える限り、より柔軟性を持たせることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、輸送配列、細胞膜保留エレメント、又は結合部位、つまり連結部分のうち１つ又は２つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、結合部位、つまり連結部分として、スルフヒドリル部分、ビオチン－アビジン結合の一部、並びに、可逆性及び非可逆性架橋剤（例えば、ＤＳＳ、ＤＳＳＴ、ＰＥＧなど）を挙げてよいが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示の赤血球又は赤血球の集団中に１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含めることが、はっきりと意図される。例えば、ＨＳＣを改変して、特に、標的分子、デコイ受容体、及び／又はタンパク質ペイロードを組み込むことができる。
代表的な関心対象のタンパク質
限定することを意図しないが、関心対象のタンパク質の様々な例とその利用が提供される。いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質によって、ＥＰＯ、ＴＰＯ、及びＧＭ－ＣＳＦを非限定的に含む造血性成長因子及び分化因子；又は、Ｇ－ＣＳＦなどのＨＳＣの誘導に利用され得る因子の一過性送達を可能にする。いくつかの実施形態では、造血性区画中の標的を有する関心対象のタンパク質を、遺伝子組み換え法を用いて赤血球内に組み込むことができ、これにより、関心対象のタンパク質を赤血球の表面に維持することによって、関心対象のタンパク質の別の組織区画内への取り込みを制限し、系からのより迅速なクリアランスを可能にする。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、ＩＬ－Ｒ－Ｆｃ、ＩＬ６Ｒ－Ｆｃ、ＴＮＦａＲ－ＦＣ、ＩＦＮａＲ－Ｆｃ、及びＢＡＦＦＲ－Ｆｃを非限定的に含む急性炎症性状態の患者における炎症性経路に影響するデコイ受容体の送達を可能にする。赤血球は、細胞膜中に１つ又は２つ以上のこれらの受容体を組み込んで設計されてよい。いかなる理論に束縛されることを意図しないが、受容体は、それらの同族リガンドを結合し、循環からリガンドを除去することができることによって、これらの循環している炎症性メディエーターを減少させ、急性炎症性状態を回復させる。いくつかの実施形態では、同様のデコイ受容体によるアプローチを用いて、例えば、ウイルス粒子などの別の部分を血液から除去できる。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、サイトカインストームに関連する、ＩＬ－Ｒ－Ｆｃ、ＩＬ６Ｒ－Ｆｃ、ＴＮＦａＲ－ＦＣ、ＩＦＮａＲ－Ｆｃ、及びＢＡＦＦＲ－Ｆｃを非限定的に含む受容体に競合的に結合できるデコイリガンドの送達を可能にし、同様のアプローチを用いて、サイトカインストームに関連する臨床症状を緩和する。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、コレラトキシン、シゲラトキシン、リシン、及びジフテリアトキシンを非限定的に含むタンパク質コード化トキシンの送達を可能にする。かかるトキシン性ペイロードは、高度に血管新生されている固形腫瘍などの癌の治療のために設計されてよい。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質を操作して、これらの赤血球に発現させることができる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣを操作して、共有性又は非共有性結合部位を伴って構成される外部部分を有する膜貫通型タンパク質を発現させる。例えば、外部部分は、ジスルフィド結合を形成するように設計されるスルフヒドリル部分、アビジン－ビオチン結合、又は任意のその他結合を有してよく、所望のペイロード（例えば、タンパク質コード化トキシン、及び任意にその他所望のペイロード）のその後の会合を可能にする。例えば、１つ又は２つ以上のこれらのアプローチを用いて赤血球を操作し、膜結合型血管新生阻害物質を腫瘍部位に送達してもよい。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、赤血球の対象とする組織及び／又は細胞へのターゲティングを可能にする。例えば、ターゲティングは、数ある用途の中でも特に、赤血球を腫瘍に、つまり腫瘍細胞に導くのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ターゲティングは、マーカー、受容体、リガンド、及び抗体の赤血球の表面での発現、又は、１つ若しくは２つ以上のこれら部分の赤血球の表面への結合を非限定的に含む、様々な方法によって達成できる。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、凍傷、癌関連血管収縮、又はリウマチ性関節などであるがこれらに限定されない血管調節異常の影響を受けた組織への、血管新生促進及び／又はリンパ脈管新生因子の送達が可能である。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、特に、急性心筋梗塞中の血管収縮、分娩中の産科的用途、並びに、急性及び／又は持続性片頭痛を非限定的に含む血管収縮に関連する急性症例に対して、血管拡張性ペプチドの送達が可能である。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、生涯にわたる免疫性を高めるための抗原の送達が可能である。この抗原は、対象とする抗原（タンパク質）を、ＴＬＲリガンドと共に赤血球上に呈示するよう設計される、遺伝子操作された赤血球によって送達できる。
いくつかの実施形態では、関心対象の赤血球結合タンパク質は、血栓のリスクが高い患者において血栓形成を軽減する、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質の送達が可能である。いくつかの実施形態では、血栓のリスクが高い患者への輸血は、栓子中の線維性組織に特異的な膜結合プロテアーゼを有し、任意にかかる場所への標的分子を有する赤血球を含んでよい。同様のアプローチが、肺塞栓症のリスクが高い患者にも有用であり得る。
いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質はＭｙｃ又はＢｃｌ－２を含まない。
タンパク質形質導入ドメイン
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド形質導入ドメイン」、「タンパク質形質導入ドメイン」、及び「ＰＴＤ」は、互換的に使用され、哺乳類細胞内及び／又は哺乳類細胞内の区画内へのタンパク質の透過を促進する、タンパク質のペプチド配列又はドメインを指す。１つの非限定例では、ＰＴＤは、結合したペプチド及び／又はタンパク質の細胞の核内への透過を促進する。
本開示のＰＴＤは、標準的な分子生物学的生化学的手法などの当該技術分野において既知のタンパク質ドメインを単離する任意の方法によって、ＰＴＤを含むタンパク質から単離できる。あるいは、本開示のＰＴＤを合成してよい。好適な本開示のＰＴＤは、約８～約３０個の長さのアミノ酸残基であって、アルギニン（argentine）（Ａｒｇ）及びリジン（Ｌｙｓ）などの塩基性アミノ酸残基が豊富であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、塩基性アミノ酸（アルギニン及びリジン）が豊富で、任意にα－らせん構造に配列されている、短いペプチド配列を有してよい。
本明細書で開示されるように、本開示のＰＴＤは、ペプチド及び／又はタンパク質の哺乳類細胞及び／又は哺乳類細胞内の区画への透過を促進するために、ペプチド及び／又はタンパク質に結合される（例えば、融合、抱合、架橋など）。例えば、特定の実施形態では、本開示のＰＴＤは、ＭＹＣタンパク質及び／又はＢｃｌ－２タンパク質及び／又は関心対象のタンパク質に結合される。
本開示の任意の方法での使用に好適なタンパク質形質導入ドメインとして、当該技術分野において既知の任意のＰＴＤが挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１６６９１号及び同第２０１０／００５５１２９号）。例えば、好適なＰＴＤは、レンチウイルスＴＡＴ（Ｔｒａｎｓ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）タンパク質、レンチウイルスＶＰＲタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質、及びホメオタンパク質を非限定的に含むタンパク質から得られてよく、又は由来であってよい。
レンチウイルスＴＡＴタンパク質から得られる、又は由来である好適なＰＴＤ例として、ＴＡＴタンパク質含有ウイルスのＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ＴＡＴタンパク質含有レンチウイルスのＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ－１ＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ－２ ＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ＳＩＶ ＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、霊長類レンチウイルスＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ヒツジレンチウイルスＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ウシレンチウイルスＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ウマレンチウイルスＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ネコレンチウイルスＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、霊長類レンチウイルス、ヒツジレンチウイルス、ウシレンチウイルス、ウマレンチウイルス、又はネコレンチウイルスの変異体サブタイプのＴＡＴタンパク質のＰＴＤ、及びこれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＰＴＤは、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアミノ酸残基４８～５７（ＴＡＴ［４８～５７］）である。別の実施形態では、ＰＴＤは、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のアミノ酸残基５７～４８（ＴＡＴ［５７～４８］）である。
レンチウイルスＶＰＲタンパク質から得られる、又は由来である好適なＰＴＤ例として、ＶＰＲタンパク質含有ウイルスのＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ＶＰＲタンパク質含有レンチウイルスのＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ－１ ＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ－２ ＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ＳＩＶ ＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、霊長類レンチウイルスＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ヒツジレンチウイルスＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ウシレンチウイルスＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ウマレンチウイルスＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ネコレンチウイルスＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、ＨＩＶ、ＳＩＶ、霊長類レンチウイルス、ヒツジレンチウイルス、ウシレンチウイルス、ウマレンチウイルス、又はネコレンチウイルスの変異体サブタイプのＶＰＲタンパク質のＰＴＤ、及びこれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない。
ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質から得られる、又は由来である好適なＰＴＤ例として、ヒトヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、ヒトヘルペスウイルス２（ＨＳＶ－２）ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、ＢＨＶ－１ ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、オウム科ヘルペスウイルス１ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、ウマヘルペスウイルス１ ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、ウマヘルペスウイルス４ ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、七面鳥ヘルペスウイルス２ ＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、水痘帯状疱疹ウイルスＶＰ２２タンパク質のＰＴＤ、及びこれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない。
ホメオドメイン転写因子から得られる、又は由来である好適なＰＴＤ例として、ドロソフィラアンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質のホメオドメイン（ＨＤ）、ドロソフィラフシタラズ（Ｆｔｚ）タンパク質のＨＤ、ドロソフィラＥｎｇｒａｉｌｅｄ（Ｅｎ）タンパク質のＨＤ、ニワトリＥｎｇｒａｉｌｅｄ－２タンパク質のＨＤ、哺乳類ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘ－Ａ５ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘ－Ａ４ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘ－Ｂ５ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘ－Ｂ６ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘ－Ｂ７ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨＯＸ－Ｄ３ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＧＯＸホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＭＯＸ－２ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＨｏｘｃ－８ホメオタンパク質のＨＤ、ヒトＩｓｌｅｔ－１（Ｉｓｌ－１）ホメオタンパク質のＨＤ、及びこれらのホモログが挙げられるが、これらに限定されない。
更に、好適なＰＴＤとして、カポジ－ＦＧＦ（Ｋ－ＦＧＦ又はＦＧＦ－４）由来のＰＴＤ、ＦＧＦ－２由来のＰＴＤ、ＦＧＦ－１由来のＰＴＤ、ＦＧＦファミリーの別のメンバーのタンパク質のＰＴＤが挙げられるが、これらに限定されない。
その他好適なＰＴＤとして、合成ＰＴＤ（例えば、Ｂｅｅｒｅｎｓ，ＡＭＪ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｏｃｔ；３（５）：４８６～９４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、合成ＰＴＤとして、ＥＰＴＤという、最適化タンパク質形質導入ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）を挙げてよい（Ｈｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）６１：４７４～４７７）。
更に好適なＰＴＤとして、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）ペプチド（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本開示のＰＴＤは組み換えで産生されるが、一方他の実施形態では、ＰＴＤは、合成で産生され、又は天然源から精製される。
ＰＴＤ融合タンパク質の改変
いくつかの実施形態では、本開示のＰＴＤ融合タンパク質は、ポリペプチド、例えば、細胞の生存及び／又は増殖を促進する本開示の組み換えタンパク質、アポトーシスを阻害する本開示の外因性タンパク質、又は本開示の関心対象のタンパク質に、ＰＴＤを結合する１つ又は２つ以上の分子を含む。更なる実施形態では、１つ又は２つ以上のリンカー分子はアミノ酸ペプチドである。
本開示のＰＴＤ融合タンパク質は更に、融合タンパク質の精製を促進する少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでよい。例えば、ＰＴＤ融合タンパク質は、タンパク質タグ、例えばポリヒスチジンタグを含んでよい。あるいは、又は加えて、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、エピトープタグ、例えばＶ５エピトープタグを含んでよい。
したがって、特定の実施形態では、本開示のＰＴＤ融合タンパク質は更に、ポリヒスチジンタグを含む。いくつかの実施形態では、ポリヒスチジンタグは６－ヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、ヒスチジンタグはＨＨＨＨＨＨの配列を含む。更に、ヒスチジンタグは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって、本開示のＰＴＤ融合タンパク質に追加することができる。例えば、ＰＴＤ融合タンパク質配列を、ポリヒスチジンタグをコードする発現ベクターにクローニングしてよい。あるいは、ポリヒスチジンタグを、ＰＣＲによって（すなわち、ＰＣＲプライマーがポリヒスチジン配列を含む）追加してよい。
更に、本開示のＰＴＤ融合タンパク質は、少なくとも１つのタンパク質タグも含んでよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタンパク質タグはエピトープタグである。好ましくは、エピトープタグはＶ５エピトープタグである。いくつかの実施形態では、Ｖ５エピトープタグはアミノ酸配列：ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴを含み、一方他の実施形態では、Ｖ５エピトープタグはアミノ酸配列：ＩＰＮＰＬＬＧＬＤを含む。アミノ酸は、Ｄ体又はＬ体のいずれであってもよい。いくつかの実施形態では、第１の複数のアミノ酸はＤ体であり、第２の複数のアミノ酸はＬ体である。更に、本開示のＶ５エピトープタグは、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって、本開示のＰＴＤ融合タンパク質に追加することができる。例えば、ＰＴＤ融合タンパク質配列を、Ｖ５エピトープタグをコードする発現ベクターにクローニングしてよい。あるいは、Ｖ５エピトープタグを、ＰＣＲによって（すなわち、ＰＣＲプライマーがＶ５エピトープ配列を含む）追加してよい。
特定の好ましい実施形態では、本開示のＰＴＤ融合タンパク質は更に、ポリヒスチジンタグ及びエピトープタグを含む。好ましくは、ＰＴＤ融合タンパク質は、６－ヒスチジンタグ及びＶ５エピトープタグを含む。
ＰＴＤ融合タンパク質の構築
いくつかの実施形態では、本開示のＰＴＤ融合タンパク質は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００５５１２９号）によって構築されてよい。
１つの非限定例では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する本開示のＰＴＤ－組み換えタンパク質（例えば、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質、ＰＴＤ－ＩＣＮ－１融合タンパク質など）をコードする核酸配列をＰＣＲによって産生させてよい。特定の実施形態では、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質をコードする核酸配列は、ＰＣＲによって産生される。これは、インフレームＰＴＤ配列、例えば、ＴＡＴのＲＫＫＲＲＱＲＲＲの９つのアミノ酸配列を含むＭＹＣ配列に対するフォワードプライマー、及び、終止コドンを除くように設計されるＭＹＣ配列に対するリバースプライマーを設計することによって達成され得る。かかるプライマーを用いるＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物を、続いて、当該技術分野において既知の任意の好適な発現ベクターにクローニングしてよい。
１つの非限定例では、アポトーシスを阻害する本開示のＰＴＤ－外因性タンパク質（例えば、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－ｗ融合タンパク質、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－Ｘ融合タンパク質、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－Ｘｌ融合タンパク質、ＰＴＤ－Ｍｃｌ－１融合タンパク質など）をコードする核酸配列を、ＰＣＲによって産生させてよい。特定の実施形態では、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質をコードする核酸配列は、ＰＣＲによって産生される。これは、インフレームＰＴＤ配列、例えば、ＴＡＴのＲＫＫＲＲＱＲＲＲの９つのアミノ酸配列を含むＢｃｌ－２配列に対するフォワードプライマー、及び、終止コドンを除くように設計されるＢｃｌ－２配列に対するリバースプライマーを設計することによって達成され得る。かかるプライマーを用いるＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物を、続いて、当該技術分野において既知の任意の好適な発現ベクターにクローニングしてよい。Ｂｃｌ－２非構造化ループは、部位特異的突然変異誘発キットを用いてＢＣＬ－２コード配列から除去されてよい。
１つの非限定例では、本開示のＰＴＤと関心対象のタンパク質との融合タンパク質をコードする核酸配列をＰＣＲによって産生させてよい。これは、インフレームＰＴＤ配列、例えば、ＴＡＴのＲＫＫＲＲＱＲＲＲの９つのアミノ酸配列を含む関心対象のタンパク質配列に対するフォワードプライマー、及び、終止コドンを除くように設計される関心対象のタンパク質配列に対するリバースプライマーを設計することによって達成され得る。かかるプライマーを用いるＰＣＲ反応によるＰＣＲ産物を、続いて、当該技術分野において既知の任意の好適な発現ベクターにクローニングしてよい。
造血幹細胞
本開示の他の態様は、任意に条件的に不死化され、及び／又は、１つ若しくは２つ以上の関心対象のタンパク質を含むように遺伝的に操作された、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、ＥＰＯと、任意でＩＬ－３と、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ若しくは２つ以上の組み換えタンパク質又はこれらの生物学的に活性な断片とを共に培養することによる、赤血球の集団のインビトロ産生に関する。このプロセスは、フィーダー細胞及び血清の存在下、又は非存在下で行われてよい。特定の好ましい実施形態では、このプロセスは、フィーダー細胞及び／又は血清の非存在下で行われる。
本開示の方法と共に使用するのに好適なＨＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞及び／又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から産生されてよい。当該技術分野において既知のＥＳ細胞及び／又はｉＰＳ細胞からＨＳＣを産生するには、任意の方法を使用してよい（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００５ １９：１１２９～１１５５；及びＰａｐａｐｅｔｒｏｕ Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｆ１０００ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１０ Ｊｕｎ １６；２）。例えば、初期胚中の造血性決定においてＥＳ細胞培養の造血細胞の発達をパターニングすることによって、ＨＳＣをＥＳ細胞から産生できる（例えば、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００５ １９：１１２９～１１５５）。
更に、本開示の方法と共に使用するのに好適なＨＳＣは、当該技術分野において既知の任意の好適な手法によって得ることができる。例えば、大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨、及びその他の骨を含む、ドナーの骨髄中にＨＳＣを見出してよい。骨髄細胞を抽出し、回収するための当該技術分野において既知の任意の方法を使用してよい。１つの非限定例では、髄腔から細胞を吸引する針及び注射器を用いて、寛骨の髄腔から直接的にＨＳＣを得てもよい。少量の吸引を複数回行うことによって、寛骨から豊富な骨髄を得ることができる。
あるいは、好適なＨＳＣは、任意に、ドナーの骨髄区画から放出されるようにＨＳＣを誘導するＧ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）などのサイトカインで前処理した後の、ドナーの血液中にある末梢血細胞から得ることができる。ＨＳＣはまた、ＨＳＣを濃縮するためにアフェレーシスを受けた末梢血から得ることもできる。当該技術分野において既知の任意のアフェレーシス法を使用してよい。特定の実施形態では、アフェレーシス法は白血球除去法である。
更に、好適なＨＳＣは、臍帯血、胎盤、及び動員済み末梢血から得ることができる。実験目的で、胎児肝臓、胎児脾臓、及び動物のＡＧＭ（大動脈・性腺・中腎）も有用なＨＳＣ源である。更に、ドナーの骨髄、末梢血、臍帯、又は胎児組織のＨＳＣから得られた供給源より、ＨＳＣを獲得してよい。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ヒト臍帯又は胎盤から得られる。使用可能なＨＳＣの別の供給源は、胎生期動物の発達中の血液産生組織である。ヒトでは、ＨＳＣは、約１２～１８週齢までのヒト胎児の循環血中に見出され得る。いくつかの実施形態では、ヒトＨＳＣは、任意の供給源、例えば、骨髄、臍帯、末梢血、又は胎児組織のＡ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、Ｏ＋、Ｏ－、ＡＢ＋、及びＡＢ－型のドナーの血液から得られる。別の実施形態では、ヒトＨＳＣは、任意の供給源、例えば、骨髄、臍帯、末梢血、又は胎児組織の万能ドナーの血液、若しくはまれな血液型を有するドナーの血液から得られる。まれな血液型は、当該技術分野において既知であり、Ｏｈ、ＣＤＥ／ＣＤＥ、ＣｄＥ／ＣｄＥ、ＣｗＤ－／ＣｗＤ－、－Ｄ－／－Ｄ－、Ｒｈｎｕｌｌ、Ｒｈ：－５１、ＬＷ（ａ－ｂ＋）、ＬＷ（ａ－ｂ－）、Ｓ－ｓ－Ｕ－、Ｓ－ｓ－Ｕ（＋）、ｐｐ、Ｐｋ、Ｌｕ（ａ＋ｂ－）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）、Ｋｐ（ａ＋ｂ－）、Ｋｐ（ａ－ｂ－）、Ｊｓ（ａ＋ｂ－）、Ｋｏ、Ｋ：－１１、Ｆｙ（ａ－ｂ－）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）、Ｄｉ（ｂ－）、Ｉ－、Ｙｔ（ａ－）、Ｓｃ：－１、Ｃｏ（ａ－）、Ｃｏ（ａ－ｂ－）、Ｄｏ（ａ－）、Ｖｅｌ－、Ｇｅ－、Ｌａｎ－、Ｌａｎ（＋）、Ｇｙ（ａ－）、Ｈｙ－、Ａｔ（ａ－）、Ｊｒ（ａ－）、Ｉｎ（ｂ－）、Ｔｃ（ａ－）、Ｃｒ（ａ－）、Ｅｒ（ａ－）、Ｏｋ（ａ－）、ＪＭＨ－、及びＥｎ（ａ－）が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、ヒトＨＳＣは、任意の供給源、例えば、骨髄、臍帯、末梢血、又は胎児組織の自己免疫疾患、免疫不全症、又はＨＳＣ移植及び／若しくは輸血の恩恵を受け得る任意のその他疾病若しくは疾患を有するドナーの血液から得られる。かかるドナーはレシピエントでもあり得る。有利には、かかるドナーから得られたＨＳＣを、オーダーメイドＨＳＣ及び／又は血液療法に使用できる。
１つの非限定例では、幹細胞ドナーに麻酔をかけ、上後腸骨稜を針で穿刺し、注射器で骨髄細胞の吸引を行うことによって、ヒトＨＳＣを得ることができる。別の非限定例では、幹細胞を末梢血に動員するために、末梢血から幹細胞を回収する数日前にＧ－ＣＳＦが注入されたたドナーの末梢血から、ＨＳＣを得ることができる。
したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ドナーがＨＳＣ及び／又はかかるＨＳＣ由来の赤血球のレシピエントでもある、自家ドナーから得られる。当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される任意の方法を用いて、自家ドナーからＨＳＣを得ることができる。ＨＳＣ及び／又はそれら由来の、若しくはそれらから産生される任意の治療用生成物、例えば赤血球を、続いて元のドナーに移植、投与、及び又は輸血して戻す。同様に、ＨＳＣを、ＨＳＣ移植及び／又は輸血を必要とする対象の同胞、親、又はその他親類など、同種ドナーから得てもよい。１つの非限定例では、同種ＨＳＣは、異なる血液型又は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の適合源からＨＳＣを採取することによって得られる。自家及び／又は同種ＨＳＣの移植及び／又は輸血は、献血後の任意の時期に、例えば数日後、数ヶ月後、又は更に数年後に行ってよい。自家献血は、ＨＳＣ及び／又は血液の移植及び／又は輸血を必要とする対象が、同種及び／又は万能ドナーなど、任意の他のドナーからのＨＳＣ及び／又は血液の移植及び／又は輸血に対して、陰性反応、有害反応、又は中毒反応を示す症例において、特に有用であり得る。自家及び／又は同種献血から利益を得る患者の例は、当該技術分野において周知であり、自己免疫疾患、血液病又は疾患、免疫病又は疾患、又は他の関連疾患若しくは病気を患っている患者が挙げられるが、これらに限定されない。
例えば、骨髄、末梢血、又は臍帯血から得られる細胞は、典型的には抽出又は回収後処理される。抽出された又は回収された細胞を処理するための任意の当該技術分野において既知の方法を使用してよい。処理工程の例として、濾過、遠心分離、血液病理学的スクリーニング、ウイルス及び／又は微生物感染に関するスクリーニング、赤血球枯渇、同種幹細胞の移植レシピエントにおける移植片対宿主病の発生率を減少させるＴ細胞枯渇、体積減少、細胞分離、後続の処理に好適な培養培地又は緩衝液への細胞の再懸濁、非幹細胞からの幹細胞の分離（例えば、幹細胞濃縮）、成長因子、サイトカイン及び／又はホルモンによるエクスビボ又はインビトロでの幹細胞増殖、並びに、凍結保存が挙げられるが、これらに限定されない。
当該技術分野において既知の任意の好適な幹細胞濃縮法を使用してよい。幹細胞濃縮法の例として、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）及び磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、特定の実施形態では、本開示の方法での使用に好適なＨＳＣはヒトＨＳＣである。
ドナーから得られるＨＳＣは、当該技術分野において既知の任意の好適な幹細胞同定及び濃縮法、例えば、特定の表現型又は遺伝子型マーカーを利用することによって、同定及び／又は濃縮されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＳＣの同定は、ＨＳＣと関連する、又は、その系の高度分化細胞に特に関連する細胞表面マーカーを使用することを含む。好適な表面マーカーとして、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５、ＡＢＣＧ２、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、Ｆｌｋ－２、ＣＤＣＰ１、Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ、Ｇｒ－１、ＣＤ４６、Ｍａｃ－１、Ｔｈｙ１．１、及びｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＳＬＡＭ）ファミリーの受容体のうち、１つ又は２つ以上を挙げてよいが、これらに限定されない。ＳＬＡＭ受容体の例として、ＣＤ１５０、ＣＤ４８、及びＣＤ２４４が挙げられるが、これらに限定されない。
更に、ドナーから得られるＨＳＣは、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）及び磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）を非限定的に含む、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって非幹細胞から分離されてよい。
１つの非限定例では、ヒト末梢血細胞は、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、Ｆｌｋ－２、ＣＤＣＰ１、Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ、又はＧｒ－１を認識する抗体とインキュベートされる。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、及びＧｒ－１の抗体を、磁気ビーズと結合する。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、又はＧｒ－１を発現している細胞は、磁気ビーズ、及び磁気ビーズ結合抗体に付着した細胞を捕捉するように準備されたカラム内に保持される。ＭＡＣＳカラムに捕捉されない細胞は、ＦＡＣＳ分析にかけられる。ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ１の抗体は、当該技術分野において既知の蛍光物質と結合する。ＣＤ３４＋、ＣＤ３８ｌｏｗ／－、ｃ－ｋｉｔ－／ｌｏｗ、Ｔｈｙ１＋の細胞は、細胞と結合する蛍光抗体の種類によって、残りのサンプルから分離される。これらの細胞は、本開示の任意の方法での使用に好適なヒト長期ＨＳＣとして提供される。
別の非限定例では、対象から得られる細胞を、上記と同じセットの磁気ビーズ結合抗体（ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、又はＧｒ－１のうち１つ又は２つ以上に対する抗体）、並びに、蛍光物質を結合したＣＤ１５０、ＣＤ２４４及び／又はＣＤ４８抗体で標識する。サンプルから磁気ビーズ結合抗体によって捕捉された細胞を除去した後、サンプルをＦＡＣＳによって分析し、ＣＤ１５０＋、ＣＤ２４４－及びＣＤ４８－細胞を長期ＨＳＣとして保存する。
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用されるＨＳＣは、ｃ－ｋｉｔ＋、Ｓｃａ－１＋、ＣＤ３４ｌｏｗ／－、ＣＤ３８＋、Ｔｈｙ１＋／ｌｏｗ、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８ｌｏｗ／－、ｃ－ｋｉｔ－／ｌｏｗ、及び／又はＴｈｙ１＋のうち、１つ又は２つ以上のマーカーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用されるＨＳＣは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、及び／又はＧｒ－１のうち、１つ又は２つ以上のマーカーを欠く。特定の実施形態では、本開示の方法で使用されるＨＳＣは、Ａ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、Ｏ＋、Ｏ－、ＡＢ＋、又はＡＢ－型のものである。
あるいは、好適なＨＳＣは、非ヒト源から得られてよい。好適な非ヒトＨＳＣは、実験室／実験用動物、げっ歯類、愛玩動物、家畜、畜産動物、労働用動物、運送用動物、希少又は絶滅危惧種、競技用動物、及び動物園の動物を非限定的に含む、非ヒト動物の大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨、及びその他骨から単離されてよい。好適な非ヒト動物の更なる例として、サル、霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＨＳＣを、細胞表面分子、例えば、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、Ｆｌｋ－２、ＣＤＣＰ１、Ｅｎｄｏｍｕｃｉｎ、又はＧｒ－１のうち１つ又は２つ以上を認識する抗体と骨髄細胞をインキュベートすることによって、マウス骨髄細胞から得ることができる。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、及びＧｒ－１の抗体を、磁気ビーズと結合する。ＭＡＣＳ装置では、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ－１１９、又はＧｒ－１をその表面に持っている細胞は、磁気ビーズ、及び磁気ビーズ結合抗体に付着した細胞を捕捉するように準備されたカラム内に保持される。ＭＡＣＳカラムに捕捉されない細胞は、ＦＡＣＳ分析にかけられる。ＦＡＣＳ分析では、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ３４、ＣＤ３８、Ｔｈｙ１などの表面分子の抗体を、蛍光物質と結合する。ｃ－ｋｉｔ＋、Ｓｃａ－１＋、ＣＤ３４ｌｏｗ／－、ＣＤ３８＋、Ｔｈｙ１＋／ｌｏｗの細胞は、細胞と結合する蛍光抗体の種類によって、残りのサンプルから分離される。これらの細胞は、本開示の任意の方法での使用に好適なマウス長期ＨＳＣとして提供される。別の実施形態では、異なるセットのマーカーを用いて、骨髄、臍帯血、胎児組織、及び末梢血の細胞からマウス長期ＨＳＣを分離する。
いくつかの実施形態では、骨髄からのＨＳＣの獲得は、最初に、マウス又は他の非ヒト動物などのＨＳＣドナーに、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）を注射し、ドナーの骨髄中のＨＳＣを濃縮するために、ＨＳＣの増殖を誘発させることを含む。
更に、本開示の任意の方法で使用するのに好適なＨＳＣ（臍帯血、骨髄、末梢血、又はその他の供給源から得るもの又は存在するものいずれでも）は、任意の好適な市販又は特別に合成した培地で成長又は増殖させてよい（例えば、Ｈａｒｔｓｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｐａｇｅｓ ２２１～２２４，Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄｉｔｏｒ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，２００７）。例えば、血清を含まない培地は、アルブミン及び／又はトランスフェリンを利用する場合があり、これらは、血清を含まない培地中でＣＤ３４＋細胞を成長及び増殖させるのに有用であることが分かっている。また、特に、Ｆｌｔ－３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）などのサイトカインを含めてよい。ＨＳＣは、バイオリアクターなどの容器中でも成長できる（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２４：５９２～６０１，２００６）。ＨＳＣのエクスビボ増殖に好適な培地は、間質細胞（例えば、リンパ細網間質細胞）などのＨＳＣ支持細胞を含有することもできるが、この細胞は、例えば、リンパ組織の脱凝集体由来であってよく、ＨＳＣ、並びにそれらの子孫のインビトロ、エクスビボ、及びインビボでの維持、成長、及び分化を支持することが示されている。
ＨＳＣの成長又は増殖は、当該技術分野において既知の所定の手技によってインビトロ又はインビボで測定できる。例えば、国際公開第２００８／０７３７４８号は、ＨＳＣのインビボ及びインビトロ増殖を測定し、例えば中間前駆細胞を含む潜在的に不均一な集団（例えば、骨髄）において、ＨＳＣの成長／増殖と他の細胞の成長／増殖との間を区別する方法について記載している。
ＨＳＣ細胞株
別の実施形態では、本開示の任意の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、ＨＳＣ細胞株由来であってもよい。好適なＨＳＣ細胞株として、当該技術分野において既知の任意の培養造血性幹細胞株が挙げられる。非限定例として、米国特許出願公開第２００７／０１１６６９１号及び同第２０１０／００４７２１７号に記載される条件的不死化長期幹細胞株が挙げられる。
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、赤血球に分化される前に条件的に不死化されている。いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、赤血球に分化される前に、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含むように改変することもできる。いくつかの実施形態では、条件的不死化及び／又は１つ若しくは２つ以上の関心対象のタンパク質の包含は、当該技術分野において既知であり本明細書に記載される任意の方法、例えば、遺伝子導入法、タンパク質形質導入法、又は内因性タンパク質の発現増強法のうち１つ又は２つ以上によって達成できる。
ＨＳＣの条件的不死化に有用なタンパク質
いくつかの実施形態では、赤血球の産生に対する本開示の方法で使用されるＨＳＣは、ＨＳＣを、細胞の生存及び／又は細胞増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質、及び所望により、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質を含有する組成物と接触させることにより、条件的に不死化された。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、任意にアポトーシスも阻害する。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、本開示のＭＹＣポリペプチド、その生物学的に活性な断片、又はそのホモログである。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を更に含む。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の組み換えタンパク質は、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、Ｂｃｌ－２ホモロジードメインを含むタンパク質である。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質である。
本開示のＰＴＤ－ＭＹＣ及びＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質は、ＭＹＣ及びＢｃｌ－２をコードする内因性遺伝子の過剰発現、又は、遺伝子操作によるＭＹＣ及びＢｃｌ－２の組み換え発現の必要がなく、ＭＹＣ及びＢｃｌ－２を外から追加することによってＨＳＣ中のＭＹＣ及びＢｃｌ－２活性の増加を可能にする。しかしながら、所望により、遺伝子組み換えＨＳＣの作製、並びに条件的不死化幹細胞を作製するその他の手技による、かかる内因性遺伝子の過剰発現を誘導するためのＨＳＣの操作は、本明細書で明らかに想定される。
いくつかの実施形態では、赤血球に分化されるＨＳＣ（及び／又は赤血球）は、１つ又は２つ以上の開示される関心対象のタンパク質を更に形質導入される。いくつかの実施形態では、これら１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は、Ｍｙｃ又はＢｃｌ－２以外のものである。いくつかの実施形態では、関心対象のタンパク質は、本開示のＰＴＤドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＤドメインはＴＡＴである。
遺伝子導入法
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用するための条件的不死化ＨＳＣは、当該技術分野において既知の任意の遺伝子導入法（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１６６９１号及び同第２０１０／００４７２１７号）を用いて確立されている。例えば、増殖させたＨＳＣ集団を得て、ＨＳＣに、調節可能な（例えば、誘導可能及び／又は制御可能な）、細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質をコードするベクターを形質移入（形質導入）し、ＨＳＣに、アポトーシスを阻害する組み換えタンパク質をコードするベクターを形質移入（形質導入）し、細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質が誘導される及び／又は活性である条件において、幹細胞成長因子の組み合わせの存在下で形質移入したＨＳＣを増殖させることによって、不死化できる。
細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質は、調節可能（例えば、誘導可能又は制御可能）であり、組み換え（precombinant）タンパク質が、所望に応じて活性化及び非活性化（すなわち、スイッチオン又はオフ）されて、ＨＳＣを不死化状態に維持するか、又は、所望の細胞型、例えば赤血球に分化可能にできる。細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質は、任意の本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質であってよい。特定の好ましい実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質はＭＹＣである。同様に、アポトーシスを阻害する組み換えタンパク質は、任意の本開示のアポトーシスを阻害するタンパク質であってよい。特定の好ましい実施形態では、アポトーシスを阻害するタンパク質はＢｃｌ－２である。
いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／若しくは増殖を促進する組み換えタンパク質、並びに／又は、アポトーシスを阻害する組み換えタンパク質は、活性が誘導可能又は抑制可能であるように改変されている。例えば、組み換えタンパク質は、誘導性受容体を更に含んでよい。特定の実施形態では、組み換えタンパク質はエストロゲン受容体（ＥＲ）を含む。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進し、エストロゲン受容体を含む組み換えタンパク質は、ＭＹＣ－ＥＲポリペプチドである。特定の実施形態では、アポトーシスを阻害し、エストロゲン受容体を含む組み換えタンパク質は、Ｂｃｌ－２－ＥＲポリペプチドである。特定の実施形態では、エストロゲン受容体を含む組み換えタンパク質は、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）によって誘導される。あるいは、組み換えタンパク質は、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、例えば、ミフェプリストン（ＭＩＦＥＰＲＥＸ）感受性の糖質コルチコイド受容体を含んでよい。特定の実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進し、糖質コルチコイド受容体を含む組み換えタンパク質は、ＭＹＣ－ＧＲポリペプチドである。特定の実施形態では、アポトーシスを阻害し、糖質コルチコイド受容体を含む組み換えタンパク質は、Ｂｃｌ－２－ＧＲポリペプチドである。
当該技術分野において既知の増殖したＨＳＣの集団を得るための当該技術分野において既知の任意の方法を使用してよい。例えば、ＨＳＣを、細胞増殖及び／又は細胞分裂を促進する１つ又は２つ以上の成長因子と共に培養してよい。
好ましくは、ベクターは、細胞のゲノム内に組み込む能力を有する組み込みベクター（例えば、レトロウイルスベクター）である。ＨＳＣは、細胞、特に哺乳類細胞に形質移入する任意の好適な方法（これらの手法の組み合わせを用いることによるものを含む）を用いて、ベクターによって形質移入及び／又は形質導入されてよい。好適なベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、コロナウイルスベクター、カリシウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、フラビウイルスベクター、オルトミクソウイルスベクター、トガウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、アデノウイルスベクター、並びに、変異及び弱毒化ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。任意のかかるウイルスベクターは、これらをＨＳＣに標的化させる、膜結合型ＳＣＦ、又はその他幹細胞特異的成長因子のリガンドなどの特定の表面発現分子によって更に修飾されてよい。哺乳類細胞の他の形質移入法として、例えばＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）技術（ＡＭＡＸＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる、哺乳類発現ベクターの直接的エレクトロポレーション法が挙げられるが、これらに限定されない。この技術は、ほとんどの初代細胞及び形質移入しにくい細胞株に対する、非常に効率的な非ウイルス遺伝子の導入法であり、ポリアニオン性巨大分子を核内に直接移入させるために、細胞型特異的な電流と溶液の組み合わせの使用をベースとする、長く知られているエレクトロポレーション法を改良したものである。更に、好適な形質移入法として、当該技術分野において既知である、任意の細菌、酵母、又はその他人工的な遺伝子送達法を挙げてよい。
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は、条件的不死化ＨＳＣの産生について記載したものと類似の方法を用いて、本開示の方法における使用に好適な１つ又は２つ以上のＨＳＣ（例えば、初代細胞株又は条件的不死化細胞株）内に取り込まれる。
内因性発現の増強
いくつかの実施形態では、本開示の方法で使用するための条件的不死化ＨＳＣは、任意の本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質を非限定的に含む、細胞の生存及び／又は増殖を促進する内因性タンパク質の発現を増強することによって樹立できる。例えば、本開示の内因性癌ペプチド、ＭＹＣポリペプチド、ＩＣＮ－１ポリペプチド、これらのホモログ、及び／又はこれらのアナログの発現を、増強してよい。更に、本開示の方法で使用するための条件的不死化ＨＳＣは、任意の本開示のアポトーシスを阻害するタンパク質を非限定的に含む、アポトーシスを阻害する内因性タンパク質の発現を増強することによっても樹立できる。例えば、本開示のＢｃｌ－２ホモロジードメイン、Ｂｃｌ－２ポリペプチド、Ｂｃｌ－ｘポリペプチド、Ｂｃｌ－ＸＬポリペプチド、Ｍｃｌ－１ポリペプチド、ＣＥＤ－９ポリペプチド、Ｂｃｌ－２関連タンパク質Ａ１ポリペプチド、Ｂｆｌ－１ポリペプチド、Ｂｃｌ－ｗポリペプチド、これらのホモログ、及び／又はこれらのアナログのうち１つ又は２つ以上を含む本開示の内因性タンパク質の発現を、増強してよい。
いくつかの実施形態では、例えば、ＭＹＣ及び／又はＢｃｌ－２の産生増強について記載されたものと類似の方法を用いて、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質の発現が、本開示の方法における使用に好適な１つ又は２つ以上のＨＳＣ（例えば、初代細胞株又は条件的不死化細胞株）において増加する。
タンパク質形質導入法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法によって得られた及び／又は産生されたＨＳＣを、本開示の細胞の生存及び／若しくは増殖を促進する任意の組み換えタンパク質（例えば、癌ペプチド、ＭＹＣ、ＩＣＮ－１、これらのホモログ、これらのアナログ、及びこれらの生物学的に活性な断片）を非限定的に含む、細胞の生存及び／若しくは増殖を促進する遺伝子産物、並びに／又は、本開示のＨＳＣのアポトーシスを阻害するタンパク質（例えば、Ｂｃｌ－２ホモロジードメイン、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘ、Ｂｃｌ－ＸＬ、Ｍｃｌ－１、ＣＥＤ－９、Ｂｃｌ－２関連タンパク質Ａ１、Ｂｆｌ－１、Ｂｃｌ－ｗ、これらのホモログ、これらのアナログ、及びこれらの生物学的に活性な断片のうち１つ又は２つ以上を含むタンパク質）（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１６６９１号）によって処理してもよい。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、ＰＴＤを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、アポトーシスを阻害するタンパク質は、ＰＴＤを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法によって得られた及び／又は産生されたＨＳＣを、細胞中の本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質の少なくとも１つの機能の一過性上方調節が可能な、１つ又は２つ以上の化合物（任意に外因性タンパク質）によって処理してもよい。いくつかの実施形態では、細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質タンパク質は、ＰＴＤ－ＭＹＣ及び／又はＩＣＮ－１融合タンパク質である。特定の実施形態では、ＰＴＤ－ＭＹＣ融合タンパク質は、ＴＡＴ－ＭＹＣ及び／又はＩＣＮ－１融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意の方法で得られたＨＳＣを、細胞中の本開示のアポトーシスを阻害する組み換えタンパク質の少なくとも１つの機能の一過性上方調節が可能な、１つ又は２つ以上の化合物（任意に外因性タンパク質）によって処理してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＣのアポトーシスを阻害する外因性タンパク質は、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質はＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質である。
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は、ＰＴＤ－融合タンパク質を用いる条件的不死化ＨＳＣの産生について記載したものと類似の方法を用いて、本開示の方法における使用に好適な１つ又は２つ以上のＨＳＣ（例えば、初代細胞株又は条件的不死化細胞株）内に取り込まれる。
別の実施形態では、本開示の任意の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、ＰＴＤに融合された本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質（例えば、ＰＴＤ－ＭＹＣ及び／又はＰＴＤ－ＩＣＮ－１融合タンパク質）を含む、融合タンパク質を含有する組成物と接触する。更なる実施形態では、組成物は、ＰＴＤに融合された本開示のアポトーシスを阻害するタンパク質（例えば、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質）を含む、融合タンパク質を更に含有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、ＰＴＤ－ＭＹＣ及び／又はＰＴＤ－ＩＣＮ－１融合タンパク質を含有する組成物と、ＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質を含有する第２の組成物に接触する。
別の実施形態では、本開示の任意の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、赤血球への分化に先立ち、ＰＴＤに融合された本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質（例えば、ＴＡＴ－ＭＹＣタンパク質及び／又はＴＡＴ－ＩＣＮ－１タンパク質融合体）を含む、融合タンパク質の存在下で増殖される。更なる実施形態では、ＨＳＣは、ＰＴＤに融合された本開示のアポトーシスを阻害するタンパク質（例えば、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質）を含む、融合タンパク質の存在下でも増殖される。例えば、ＨＳＣを、ＰＴＤ－ＭＹＣ及び／又はＰＴＤ－ＩＣＮ－１融合タンパク質の存在下で、並びに任意にＰＴＤ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質及び追加的サイトカイン及び／又は成長因子の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、又はそれ以上の期間、細胞を培養することによって増殖できる。
したがって、本開示の任意の方法で使用するのに好適なＨＳＣは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎生幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、骨髄より、アフェレーシス法によって、末梢血細胞より、白血球除去を受けた末梢血細胞より、臍帯血より、羊水より、胎盤より、培養ＨＳＣ細胞より、不死化ＨＳＣ細胞株より、又は条件的不死化ＨＳＣ細胞株より得ることができる。
赤血球の産生
本開示の特定の態様は、ＨＳＣの成熟赤血球への分化を誘発する条件において、ＥＰＯと、任意でＩＬ－３と、細胞の生存及び／又は増殖を促進する１つ又は２つ以上の本開示の組み換えタンパク質との存在下でＨＳＣを培養し、それによって成熟赤血球の集団を産生することによる、ＨＳＣから成熟赤血球の集団を産生する方法に関する。組み換えタンパク質は、外因的に提供されても、又は、ＨＳＣの遺伝子組み換え操作によって提供されてもよい。あるいは、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、過剰発現するように誘発される内因性タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、組み換えられた、誘発された、及び／又は外因性のタンパク質は、本開示の癌ペプチド、ＭＹＣ、ＩＣＮ－１、これらのホモログ、これらのアナログ、及び／又はこれらの生物学的に活性な断片である。任意に、細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質は、融合タンパク質の一部を形成してよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＰＴＤ、エピトープタグ、又はタンパク質精製タグのうち、１つ又は２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、赤血球に分化される前に、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を含むように改変される。いくつかの実施形態では、条件的不死化及び／又は１つ若しくは２つ以上の関心対象のタンパク質の包含は、当該技術分野において既知であり本明細書に記載される任意の方法、例えば、遺伝子導入法、タンパク質形質導入法、又は内因性タンパク質の発現増強法のうち、１つ又は２つ以上によって達成できる。
いくつかの本開示の方法の実施形態では、ＰＴＤに融合された本開示の細胞の生存及び／又は増殖を促進するタンパク質（例えば、ＰＴＤ－ＭＹＣタンパク質及び／又はＰＴＤ－ＩＣＮ－１タンパク質融合体）を含む、融合タンパク質を含有する組成物を、ＥＰＯ、任意にＩＬ－３及びその他成分の存在下での条件的不死化ＨＳＣの培養工程中に投与する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、フィーダー細胞及び／又は血清の存在下又は非存在下で培養される。特定の好ましい実施形態では、ＨＳＣは、フィーダー細胞及び／又は血清の非存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、少なくとも０．５μ／ｍＬ、少なくとも０．６μ／ｍＬ、少なくとも０．７μ／ｍＬ、少なくとも０．８μ／ｍＬ、少なくとも０．９μ／ｍＬ、少なくとも１μ／ｍＬ、少なくとも２μ／ｍＬ、少なくとも３μ／ｍＬ、少なくとも４μ／ｍＬ、少なくとも５μ／ｍＬ、少なくとも６μ／ｍＬ、少なくとも７μ／ｍＬ、少なくとも８μ／ｍＬ、少なくとも９μ／ｍＬ、少なくとも１０μ／ｍＬ、少なくとも１５μ／ｍＬ、少なくとも２０μ／ｍＬ、少なくとも２５μ／ｍＬ、少なくとも３０μ／ｍＬ、少なくとも３５μ／ｍＬ、少なくとも４０μ／ｍＬ、少なくとも４５μ／ｍＬ、少なくとも５０μ／ｍＬ、少なくとも５５μ／ｍＬ、少なくとも６０μ／ｍＬ、少なくとも６５μ／ｍＬ、少なくとも７０μ／ｍＬ、少なくとも７５μ／ｍＬ、少なくとも８０μ／ｍＬ、少なくとも８５μ／ｍＬ、少なくとも９０μ／ｍＬ、少なくとも９５μ／ｍＬ、又は少なくとも１００μ／ｍＬの、細胞の生存及び／又は増殖を促進する組み換えタンパク質（例えば、ＭＹＣ、ＩＣＮ－１、これらのホモログ、これらのアナログ、及び／又はこれらの生物学的に活性な断片）の存在下で培養される。
いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、少なくとも０．５μ／ｍＬ、少なくとも０．６μ／ｍＬ、少なくとも０．７μ／ｍＬ、少なくとも０．８μ／ｍＬ、少なくとも０．９μ／ｍＬ、少なくとも１μ／ｍＬ、少なくとも２μ／ｍＬ、少なくとも３μ／ｍＬ、少なくとも４μ／ｍＬ、少なくとも５μ／ｍＬ、少なくとも６μ／ｍＬ、少なくとも７μ／ｍＬ、少なくとも８μ／ｍＬ、少なくとも９μ／ｍＬ、少なくとも１０μ／ｍＬ、少なくとも１５μ／ｍＬ、少なくとも２０μ／ｍＬ、少なくとも２５μ／ｍＬ、少なくとも３０μ／ｍＬ、少なくとも３５μ／ｍＬ、少なくとも４０μ／ｍＬ、少なくとも４５μ／ｍＬ、少なくとも５０μ／ｍＬ、少なくとも５５μ／ｍＬ、少なくとも６０μ／ｍＬ、少なくとも６５μ／ｍＬ、少なくとも７０μ／ｍＬ、少なくとも７５μ／ｍＬ、少なくとも８０μ／ｍＬ、少なくとも８５μ／ｍＬ、少なくとも９０μ／ｍＬ、少なくとも９５μ／ｍＬ、又は少なくとも１００μ／ｍＬの、ＭＹＣの存在下で培養される。
特定の実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも０．５μ／ｍＬ、少なくとも０．６μ／ｍＬ、少なくとも０．７μ／ｍＬ、少なくとも０．８μ／ｍＬ、少なくとも０．９μ／ｍＬ、少なくとも１μ／ｍＬ、少なくとも２μ／ｍＬ、少なくとも３μ／ｍＬ、少なくとも４μ／ｍＬ、少なくとも５μ／ｍＬ、少なくとも６μ／ｍＬ、少なくとも７μ／ｍＬ、少なくとも８μ／ｍＬ、少なくとも９μ／ｍＬ、少なくとも１０μ／ｍＬ、少なくとも１５μ／ｍＬ、少なくとも２０μ／ｍＬ、少なくとも２５μ／ｍＬ、少なくとも３０μ／ｍＬ、少なくとも３５μ／ｍＬ、少なくとも４０μ／ｍＬ、少なくとも４５μ／ｍＬ、少なくとも５０μ／ｍＬ、少なくとも５５μ／ｍＬ、少なくとも６０μ／ｍＬ、少なくとも６５μ／ｍＬ、少なくとも７０μ／ｍＬ、少なくとも７５μ／ｍＬ、少なくとも８０μ／ｍＬ、少なくとも８５μ／ｍＬ、少なくとも９０μ／ｍＬ、少なくとも９５μ／ｍＬ、又は少なくとも１００μ／ｍＬの、ＩＣＮ－１の存在下で培養される。
特定の実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも４．０単位／ｍＬのＥＰＯ、又はそれ以上のＥＰＯの存在下で培養される。
特定の実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１６ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１８ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、又はそれ以上のＩＬ－３の存在下で更に培養される。
特定の実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１６ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１７ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１８ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも１９ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２３ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２４ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、又はそれ以上のＩＬ－３；及び、少なくとも１．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも１．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも２．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．０単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．２単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．４単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．６単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも３．８単位／ｍＬのＥＰＯ、少なくとも４．０単位／ｍＬのＥＰＯ、又はそれ以上のＥＰＯの存在下で培養される。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、ＥＰＯ、及び任意にＩＬ－３の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、又はそれ以上の期間培養される。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、約１～５００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、約１～５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約１～５００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、及び／又は約１～５００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯの存在下で更に培養される。ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、ＦＬＴ－３、ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び／又はＴＰＯの存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、又はそれ以上の期間更に培養されてよい。ＦＬＴ－３、ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び／又はＴＰＯは、ＨＳＣが成熟赤血球に分化しているとき、及び／又は成熟赤血球が産生された後の期間中任意の時点で培地に加えてよい。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも５５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも６５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも８５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも３５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも４５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ－３、又はそれ以上のＦＬＴ－３の存在下で更に培養される。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも５５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも６５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも８５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも３５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも４５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、又はそれ以上のＳＣＦの存在下で更に培養される。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣ、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも５５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも６５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも８５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも３５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも４５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、又はそれ以上のＧＭ－ＣＳＦの存在下で更に培養される。
更なる実施形態では、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも２ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも３ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも４ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも６ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも７ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも８ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも９ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも５５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも６５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも７５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも８５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも９５ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも１５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも２００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも２５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも３００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも３５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも４００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも４５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、少なくとも５００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、又はそれ以上のＴＰＯの存在下で更に培養される。
初代ＨＳＣから赤血球を産生する現在の方法は、例えばＧｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，６９～７４などが参照され、赤血球の産生に少なくとも３週間（２１日間）を要する。しかしながら、本開示の条件的不死化ＨＳＣから赤血球の集団を産生する方法は、約１０日間で赤血球を産生する。現在の方法の少なくとも２１日間と比べて、本開示の方法の１０日間は、約５２％の促進を意味する。したがって、いくつかの実施形態では、成熟赤血球の集団の産生は、ＩＬ－３及びＥＰＯの存在下で８日間、その後フィーダー細胞及びＥＰＯの存在下で３日間、最後にフィーダー細胞のみの存在下で１０日間培養された初代幹細胞から赤血球の集団を産生する（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３，６９～７４参照）のと比較して、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上促進される。
別の実施形態では、成熟赤血球の集団は約７～１４日間で産生される。別の実施形態では、成熟赤血球の集団は、約３日間、約４、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、又は約１４日間で産生される。
本開示の方法の他の実施形態では、産生された赤血球の集団は、完全成熟赤血球の集団である。更に別の実施形態では、成熟赤血球の集団中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の細胞が無核化されている。なお更に別の実施形態では、成熟赤血球の集団は、条件的不死化ＨＳＣから連続的に産生される。
本開示の方法の他の実施形態では、成熟赤血球の集団中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の細胞がグリコホリンＡ（ＧＰＡ）を発現する。更なる実施形態では、成熟赤血球の集団中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の細胞が、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の発現レベルの減少を示す。更なる実施形態では、成熟赤血球の集団中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の細胞が、胎児型ヘモグロビンの発現レベルの減少を示す。更なる実施形態では、成熟赤血球の集団中の少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の細胞が、成人型ヘモグロビンを発現する。
別の実施形態では、産生された成熟赤血球の集団はヒト細胞集団である。更なる実施形態では、産生された成熟赤血球の集団は、実験室／実験用動物、げっ歯類、愛玩動物、家畜、畜産動物、労働用動物、運送用動物、希少又は絶滅危惧種、競技用動物、動物園の動物、サル、霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及びニワトリの細胞集団を非限定的に含む、非ヒト動物細胞の集団である。
本開示の方法は、Ａ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、Ｏ＋、Ｏ－、ＡＢ＋、又はＡＢ－の血液型を有するドナーから得られたヒトＨＳＣ由来の、ＨＳＣ、任意の条件的不死化ＨＳＣも利用できる。したがって、ＨＳＣから産生された赤血球の血液型はＡ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、Ｏ＋、Ｏ－、ＡＢ＋、又はＡＢ－となる。
更に、本開示の方法は、Ｏｈ、ＣＤＥ／ＣＤＥ、ＣｄＥ／ＣｄＥ、ＣｗＤ－／ＣｗＤ－、－Ｄ－／－Ｄ－、Ｒｈｎｕｌｌ、Ｒｈ：－５１、ＬＷ（ａ－ｂ＋）、ＬＷ（ａ－ｂ－）、Ｓ－ｓ－Ｕ－、Ｓ－ｓ－Ｕ（＋）、ｐｐ、Ｐｋ、Ｌｕ（ａ＋ｂ－）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）、Ｋｐ（ａ＋ｂ－）、Ｋｐ（ａ－ｂ－）、Ｊｓ（ａ＋ｂ－）、Ｋｏ、Ｋ：－１１、Ｆｙ（ａ－ｂ－）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）、Ｄｉ（ｂ－）、Ｉ－、Ｙｔ（ａ－）、Ｓｃ：－１、Ｃｏ（ａ－）、Ｃｏ（ａ－ｂ－）、Ｄｏ（ａ－）、Ｖｅｌ－、Ｇｅ－、Ｌａｎ－、Ｌａｎ（＋）、Ｇｙ（ａ－）、Ｈｙ－、Ａｔ（ａ－）、Ｊｒ（ａ－）、Ｉｎ（ｂ－）、Ｔｃ（ａ－）、Ｃｒ（ａ－）、Ｅｒ（ａ－）、Ｏｋ（ａ－）、ＪＭＨ－、及びＥｎ（ａ－）を非限定的に含む、まれな血液型を有するドナーから得られたヒトＨＳＣ由来の、ＨＳＣ、任意の条件的不死化ＨＳＣも利用できる。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＣから産生された赤血球の集団は、Ｏｈ、ＣＤＥ／ＣＤＥ、ＣｄＥ／ＣｄＥ、ＣｗＤ－／ＣｗＤ－、－Ｄ－／－Ｄ－、Ｒｈｎｕｌｌ、Ｒｈ：－５１、ＬＷ（ａ－ｂ＋）、ＬＷ（ａ－ｂ－）、Ｓ－ｓ－Ｕ－、Ｓ－ｓ－Ｕ（＋）、ｐｐ、Ｐｋ、Ｌｕ（ａ＋ｂ－）、Ｌｕ（ａ－ｂ－）、Ｋｐ（ａ＋ｂ－）、Ｋｐ（ａ－ｂ－）、Ｊｓ（ａ＋ｂ－）、Ｋｏ、Ｋ：－１１、Ｆｙ（ａ－ｂ－）、Ｊｋ（ａ－ｂ－）、Ｄｉ（ｂ－）、Ｉ－、Ｙｔ（ａ－）、Ｓｃ：－１、Ｃｏ（ａ－）、Ｃｏ（ａ－ｂ－）、Ｄｏ（ａ－）、Ｖｅｌ－、Ｇｅ－、Ｌａｎ－、Ｌａｎ（＋）、Ｇｙ（ａ－）、Ｈｙ－、Ａｔ（ａ－）、Ｊｒ（ａ－）、Ｉｎ（ｂ－）、Ｔｃ（ａ－）、Ｃｒ（ａ－）、Ｅｒ（ａ－）、Ｏｋ（ａ－）、ＪＭＨ－、及びＥｎ（ａ－）を非限定的に含む、まれな血液型となる。
更に、本開示の方法は、自己免疫疾患、免疫不全症、又はＨＳＣ移植及び／若しくは輸血の恩恵を受け得る任意のその他疾病若しくは疾患を有するドナー由来のＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣをも利用して、オーダーメイド療法に使用可能な成熟赤血球の集団を産生できる。例えば、成熟赤血球の集団は、自家又は同種ドナーから得られたＨＳＣから産生できる。有利には、自家赤血球は、輸血及び／又は赤血球による治療を必要とする対象が、同種及び／又は万能ドナーなど、任意の他のドナー由来の、又はこれらドナーから得られた赤血球による治療に対して、陰性反応、有害反応、又は中毒反応を有し得る症例において、特に有用であり得る。自家及び／又は同種ドナー由来のＨＳＣから産生された赤血球による治療から利益を得る患者の例は、当該技術分野において周知であり、自己免疫疾患、血液病又は疾患、免疫病又は疾患、又は他の関連疾患若しくは病気を患っている患者が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、赤血球の集団は、インビトロで無期限に継代でき、凍結保存でき、かつ回復できる条件的不死化ＨＳＣから産生される。したがって、かかる条件的不死化ＨＳＣは、一定の特徴がはっきりした供給源から、完全に分化した赤血球の継続的生産を可能にする。
本開示の方法は、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄、又は動員された血液からの初代造血幹細胞を非限定的に含む、任意の供給源からのＨＳＣを利用できる。胚性幹細胞、胎児血液細胞又は人工多能性幹細胞、並びに条件的不死化造血幹細胞、例えば遺伝子組み換えかつタンパク質導入された条件的不死化細胞由来の造血幹細胞が、特に意図される。
赤血球の集団
本開示の特定の態様は、任意に１つ又は２つ以上の本開示の方法によって産生された赤血球の集団、例えば、成熟赤血球に関する。赤血球の集団は、１つ又は２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質も含んでよい。本明細書に開示されるように、これらの関心対象のタンパク質は、１つ又は２つ以上の疾病若しくは疾患の予防、治療、又は診断に有用であり得る。
いくつかの態様では、赤血球の集団は、集団中の少なくとも約４０％、少なくとも４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、若しくは約１００％の細胞が無核化されている、ＧＰＡを発現している、成人型ヘモグロビン（ＦＡＣＳによる第２対数以上）を発現している、ＣＤ７１の発現レベル（例えば、ＧＰＡ＋／ＣＤ７１－）の減少を示す、及び／又は、胎児型ヘモグロビン（ＦＡＣＳによる第１対数；０～１０）レベルの減少を示す、を非限定的に含む、１つ又は２つ以上の特徴によって特徴付けることができる。赤血球の集団は、１つ又は２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質も含んでよい。本明細書に開示されるように、これらの関心対象のタンパク質は、１つ又は２つ以上の疾病若しくは疾患の予防、治療、又は診断に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、赤血球の集団は、本開示のアポトーシスを阻害する外因性タンパク質、例えばＢｃｌ－２ホモロジードメインを含むタンパク質を更に含んでよい。外因性タンパク質は、ＰＴＤを含む融合タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、外因性タンパク質は、Ｂｃｌ－２、これらのホモログ、これらのアナログ、及び／又はこれらの生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、外因性タンパク質はＢｃｌ－２、任意にＰＴＤ－Ｂｃｌ－２である。いくつかの実施形態では、赤血球の集団は、本開示のアポトーシスを阻害するタンパク質、例えばＢｃｌ－２ホモロジードメインを含むタンパク質を含む、保存培地中で維持される。いくつかの実施形態では、保存培地中の外因性タンパク質は、Ｂｃｌ－２、これらのホモログ、これらのアナログ、及び／又はこれらの生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、保存培地中の外因性タンパク質は、Ｂｃｌ－２、任意にＰＴＤ－Ｂｃｌ－２Ｂｃｌ－２である。
医薬組成物
本開示の特定の態様は、１つ又は２つ以上の本開示の赤血球の集団と、１つ又は２つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。赤血球と共に使用するのに好適な、当該技術分野において既知の任意の薬学的に許容可能な賦形剤を使用してよい。１つの非限定例では、薬学的に許容可能な賦形剤は、ｐＨ調整された生理食塩水溶液である。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ又は２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質を更に含む。
赤血球の集団は、１つ若しくは２つ以上の本開示の方法によって任意に産生され、並びに／又は、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が無核化されている、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が成人型ヘモグロビンを発現している、集団中の約４０％～約１００％の赤血球が成人型ヘモグロビンの発現上昇を示す、集団中の約４０％～約１００％の赤血球がＣＤ７１の発現レベルの低下を示す、及び集団中の約４０％～約１００％の赤血球が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を示す、を非限定的に含む、本開示の１つ又は２つ以上の特徴を呈する。更に、赤血球の集団はまれな血液型を有してよい。いくつかの実施形態では、赤血球はヒト赤血球である。あるいは、赤血球は、本開示の任意の非ヒト動物由来の非ヒト赤血球である。
赤血球の集団は、１つ又は２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質も含んでよい。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質は、赤血球の表面上に結合する。
１つ又は２つ以上の本開示の赤血球の集団と、１つ又は２つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含み、赤血球が１つ又は２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質を任意に含有する本開示の医薬組成物は、輸血などによってインビボに投与されるために配合されてよい。赤血球の集団を含む医薬組成物をインビボに投与するための、当該技術分野において既知の任意の配合物を使用してよい。
治療的利用
本明細書に記載される、及び／又は、ＨＳＣ、任意に条件的不死化ＨＳＣから成熟赤血球の集団を産生するための本開示の任意の方法に従って産生される赤血球は、治療用途においても利用法が見つかる。
様々な理由及び疾患のため、かかる治療を必要とする患者への赤血球輸血の利用は、当該技術分野において周知であり、その方法は標準的な医療行為である。本明細書に記載され、及び／又は、本開示の方法に従って産生される赤血球を使用して、現在輸血に使用されているのと同じ方法と条件を用いて患者を治療することができる。
特定の実施形態では、本開示は、本開示の、つまり本開示の任意の方法に従って調製された赤血球の集団を、赤血球の欠乏を特徴とする疾患を有する対象に投与することによる、赤血球の欠乏を特徴とする疾病又は疾患の治療、予防、又は診断方法に関する。いくつかの実施形態では、集団中の約４０％～約１００％の赤血球は無核化されており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球は成人型ヘモグロビンを発現しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球は成人型ヘモグロビンの発現増加を示しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球はＣＤ７１の発現レベルの低下を示しており、集団中の約４０％～約１００％の赤血球は胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を示している。
本明細書で使用されるとき、「赤血球の欠乏」は、正常量の赤血球を有する対象の赤血球量よりも、約２０％～約９００％低い赤血球量を有する；又は、正常量の赤血球を有する対象の赤血球量よりも、約１０倍～約１，０００倍低い赤血球量を有する対象を指す。
赤血球の欠乏を特徴とする疾患として、貧血（例えば、先天性貧血、再生不良性貧血、悪性貧血、鉄欠乏性貧血、鎌状赤血球性貧血、球状赤血球症、溶血性貧血、無セルロプラスミン血症、アデノシンデアミナーゼ活性上昇－ＡＤＡ－、アデニル酸キナーゼ欠損症、アルドラーゼ欠損症、α－サラセミア－形質型又は保有者、無トランスフェリン血症、常染色体優性鉄芽球性貧血、常染色体劣性鉄芽球性貧血、β－サラセミア－形質型又は保有者、β－重症型サラセミア（及び中間型）、血小板減少症を伴うＣＤＡ（ＧＡＴＡ Ｉ突然変異）、複合ヘテロ接合体性鎌状化疾患、先天性有棘赤血球増加症、先天性赤血球異形成貧血Ｉ型、先天性赤血球異形成貧血ＩＩ型、先天性赤血球異形成貧血ＩＩＩ型、δ β－サラセミア、Ｄｉａｍｏｎｄ－Ｂｌａｃｋｆａｎ貧血、ＤＭＴ１－欠乏性貧血、家族性再生不良性貧血、ファンコーニ貧血、γ－グルタミル－システイン合成酵素欠損症、ＧＬＲＸ５関連鉄芽球性貧血、グルコースリン酸イソメラーゼ欠損症、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、グルタチオンレダクターゼ欠損症、グルタチオン合成酵素欠損症、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、ヘモグロビンＨ症、ヘモグロビンレポア、貧血を伴うヘモグロビンＭ、遺伝性楕円赤血球症、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症、遺伝性球状赤血球症、遺伝性有口赤血球症、ヘキソキナーゼ欠損症、胎児水腫、Ｉｍｅｒｓｌｕｎｄ－Ｇｒａｓｂｅｃｋ症候群、鉄不応性鉄欠乏性貧血、Ｋｅａｒｎｓ－Ｓａｙｒｅ症候群、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ欠損症、ミトコンドリアミオパチー鉄芽球性貧血、サラセミア、先天性赤血球異形成貧血、形成異常を伴う汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症、ピアソン症候群、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ピリミジン５ヌクレオチダーゼ欠損症、ピルビン酸キナーゼ欠損症、鎌状赤血球性貧血、鎌状赤血球形質型、運動失調を伴う鉄芽球性貧血、ＳＬＣ２５Ａ３８関連鉄芽球性貧血、チアミン応答性巨赤芽球性貧血、トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症、不安定ヘモグロビン、ウルフラム症候群、及びＸ連鎖鉄芽球性貧血）、ゴーシェ病、溶血、好中球減少症、血小板減少症、顆粒球減少症、血友病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性慢性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性様リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄系白血病、前駆Ｂ細胞性急性リンパ球性白血病、前駆Ｔ細胞性急性リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病、不応性白血病、又はこれらの組み合わせを挙げてよいが、これらに限定されない。
特定の場合では、赤血球の欠乏を特徴とする疾患は、化学療法、化学物質への曝露、放射線療法、及び／又は放射線への曝露のうち、１つ又は２つ以上によって（部分的に又は完全に）起こる。いくつかの実施形態では、本開示の任意の方法によって産生される赤血球の集団は、化学療法及び／若しくは放射線療法、又は１つ若しくは２つ以上の関心対象のタンパク質と併用投与される。
いくつかの実施形態では、本開示の、及び／又は、本開示の任意の方法に従って産生される赤血球の集団は、それらを必要とする、例えば、失血状態の対象に投与又は輸血される。失血は、例えば、特に内出血若しくは外出血、出血、外傷、又は手術の結果であり得る。
１つ又は２つ以上の本開示の赤血球の集団による治療は、ウイルス性出血熱と関連するＲＮＡウイルス科（アレナウイルス、ブンヤウイルス、フィロウイルス、及びフラビウイルス）などであるがこれらに限定されない出血を伴う一部の感染症に有用である場合もある。ウイルス性出血熱の例は、ラッサ熱、エボラ、マールブルグ、リフトバレー熱、デング熱、及び黄熱が挙げられるが、これらに限定されない。
迅速な輸血が必要とされる実施形態では、本明細書に記載される、及び／又は本開示の任意の方法に従って調製される大量の赤血球を、固体に投与する。別の実施形態では、産生される赤血球の集団の長時間輸血が固体に行われる。
いくつかの疾病、疾患、及び／又は状態の治療において、１つ又は２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質のデリバリーシステムに適する、赤血球の投与が有用である。赤血球を、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるタンパク質のデリバリーシステムとして適合させる任意の方法を使用してよい。造血性成長因子を必要とする対象、急性炎症性状態、サイトカインストーム状態、サイトカインストームを伴う臨床症状、癌、血管調節異常（例えば、凍傷、癌関連血管収縮、又はリウマチ性関節など）、急性心筋梗塞、分娩中の産科的使用、急性及び／又は持続性片頭痛、追加免疫を必要とする対象、血栓のリスクが高い対象、肺塞栓症のリスクが増加している対象、循環器疾患、免疫病及び／又は疾患、並びに、自己免疫疾患及び／又は疾患を非限定的に含む、開示される関心対象のタンパク質による治療の恩恵を受け得る、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される任意の疾病、疾患、及び／又は状態を、本開示の方法で治療できる。
本開示の任意の方法によって治療される「対象」、「患者」、又は「宿主」は、かかる治療を必要とする、任意のヒト又は非ヒト動物、例えば、任意の本明細書に開示される非ヒト動物であってよい。例えば、対象は、赤血球の欠乏を有していてよく、本開示の赤血球及び／又は１つ若しくは２つ以上の本開示の関心対象のタンパク質によって治療できる、自己免疫性不全症、貧血、癌、又は、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される任意のその他疾病、疾患、若しくは状態を有する。
本明細書に参照される文書及び試験の引用は、上記のうち任意のものが適切な従来技術であると認めることを意図しない。これら文書の内容に関する全ての記載は、出願人が利用できる情報に基づいており、これら文書の内容の正確さをなんら認めることにはならない。
以下の実施例は例示にすぎず、任意の本開示の態様をいかなる方法でも制限することを意味しない。
以下の実施例は、マウス及びヒトの条件的に形質転換された長期造血性幹細胞株（ｃｌｔ－ＨＳＣ）及びタンパク質を形質導入した長期造血幹細胞（ｐｔｌｔ－ＨＳＣ）を、インビトロで赤血球（ＲＢＣ）に分化した結果を記す。
記載の方法により、１つ又は２つ以上の関心対象のタンパク質を任意にペイロードした、成熟除核赤血球の集団の迅速産生を促進する。加えて、出発材料として条件的不死化ＨＳＣを得ると、万能ドナー血液、又は様々な主要血液型、並びにまれな血液型、並びに更にはオーダーメイド血液の産生及び維持を可能にし、まれな血液型の患者が長年直面してきた継続的な血液不足の問題を解決できる。更に、この技術は、病原体を含まないことを保証でき、ＲＢＣの十分な在庫供給の確立を可能にするよう貯蔵寿命を延長できる、一定の供給源由来の輸血用ＲＢＣの一定で予測可能な供給を行うために使用できる。
実施例１：条件的に形質転換された長期的に再構成する造血性幹細胞株の作製
増殖性細胞を除去するために、マウスを５－フルオロウラシル（５ＦＵ）で処理することによって、ＨＳＣが濃縮されている骨髄（ＢＭ）細胞を作製した。処理マウスのエクスビボＢＭ細胞を、以前に説明されている（Ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１，７６３～７７０，１９９９）ように、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＳＣＦを含む培地で培養することによって、ＨＳＣを更に濃縮した。その後、細胞に、腫瘍性タンパク質並びに緑色蛍光タンパク質をコードするｐＭＩＧ－ＭＹＣ－ＥＲ及びｐＭＩＧ－Ｂｃｌ－２ウイルス（図１Ａ）を３回ｓｐｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎした（Ｒｅｆａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６，９９９～１００５，２００２）。ヒトＭＹＣ－ＥＲ又はＢｃｌ－２、並びにＩＲＥＳエレメント及びレポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡをコードさせるため、ｐＭＳＣＶ骨格の変異体を作製した。得られたウイルスは、レポーター遺伝子の発現レベルが第１ｃＤＮＡの発現レベルと相関するように、バイシストロン性転写物を生成した。
初期培養樹立９６時間後に細胞を表す緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の頻度によって測定するとき、この処理によるレトロウイルスの形質導入率は約３３．７％であった（図１Ｂ）。形質導入された１０５個のＨＳＣを、若年の致死的に照射された雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウスコホートに移植し、移植１０日後に、これらのマウスへの１ｍｇ／マウス／週の量の４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）の毎週投与を開始した。４週間の一定の潜伏期間を経て、これらのマウスの９０％以上が白血病を発症した（図１Ｃ）。図１Ｃの曲線は、４－ＯＨＴの投与を開始（グラフ中の０日）後の一定の時点における、生存マウスの割合を示す。約４０日間後、全てのマウスが一様にＡＭＬ様白血病で死亡した（図１Ｃ）。図１に示すデータは、４回の独立した実験のうち、代表的な１回の実験からのものである。白血病の発症には、４－ＯＨＴの連続投与を必要とした。
提供される特定例は、Ｍｙｃ及びＢｃｌ－２を用いるＨＳＣの条件的不死化を目的としているが、同様の方法を用いて、別の関心対象のタンパク質をＨＳＣ内に組み込み、任意に関心対象のタンパク質の発現を制御し得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、条件的不死化ＨＳＣ又はタンパク質を形質導入したＨＳＣを含む。
実施例２：Ｌｔ－ＨＳＣ表面表現型を呈する条件的に形質転換されたＨＳＣ細胞株
実施例１で発生させた細胞株の表現型及び均一性を評価するため、様々な表面マーカーの細胞発現を分析した。細胞を、ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＣＤ３４、及びＦｌｋ－２に対する抗体で染色した。更に、細胞を、特定の系統（Ｂ系統細胞はＣＤ１９及びＢ２２０、Ｔ系統細胞はＴｈｙ１．２、骨髄系細胞はＭａｃ－１、好中球はＧｒ－１、赤血球前駆細胞はＴｅｒ－１１９）について染色した。図１Ｄ～１Ｆに示すように、一貫して見られる表現型は、系統陰性（ＣＤ１９－、Ｂ２２０－）であったが、Ｓｃａ－１＋、ｃ－ｋｉｔ＋、ＣＤ３４－、Ｆｌｋ－２－であった。このマーカー発現パターンは、以前に報告されたマウス初代Ｌｔ－ＨＳＣ（Ｃｈｅｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，３１２０～３１２５，１９９９）と一致している。ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を長期間培養下で維持すると、細胞内ｃ－ｋｉｔ発現が減少することも示された（図１Ｅ）。この変化は、インビボ又はインビトロ機能の検出可能な変化を伴わない。更に、ＳＣＦを含めずに細胞を一晩培養するとｃ－Ｋｉｔレベルが回復したことから、ＳＣＦが、この受容体の調節を推進することが示唆されることも見出された。
特に、図１Ｄは、回復直後の白血病マウスの骨髄から得られたｃｔｌｔ－ＨＳＣを示す。これらのサンプルでは、約４２．２％の細胞がＳｃａ－１＋かつｃ－ｋｉｔ＋であり、約１００％の細胞がＣＤ３４－かつＦｌｋ－２－であり、約９９．８％の細胞がＢ２２０－かつＣＤ１９－であった（図１Ｄ）。
図１Ｅは、長期間培養下で維持されたｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を示す。これらのサンプルでは、約７．７９％の細胞がＳｃａ－１＋かつｃ－ｋｉｔ＋であり、約５１．２％の細胞がＳｃａ－１＋であるがｃ－ｋｉｔ－であり、約１００％の細胞がＣＤ３４－かつＦｌｋ－２－であり、約９９．４％の細胞がＢ２２０－かつＣＤ１９－であった（図１Ｅ）。
図１Ｆは、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスの骨髄から得られた、正常の未操作Ｌｔ－ＨＳＣを示す。これらのサンプルでは、約１．８４％のみの細胞がＳｃａ－１＋かつｃ－ｋｉｔ＋であり、約８．０３％の細胞がＳｃａ－１－かつｃ－ｋｉｔ＋であるが、大部分の細胞（約８８．５％）は、Ｓｃａ－１及びｃ－ｋｉｔの両方に陰性であった（図１Ｆ）。更に、約１００％の細胞がＣＤ３４－である一方で、全ての細胞がＦｌｋ－２－ではなかった（図１Ｆ）。
更に、図１Ｄに示すように、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の樹立プロセスの初期段階では、細胞は、高レベルのｃ－ｋｉｔ及びＳｃａ－１を主に発現し、Ｆｌｋ－２、ＣＤ３４、又はＣＤ１９及びＢ２２０などの系統マーカーを発現しない。樹立したｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のＦＡＣＳ分析は、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株が増殖して凍結保存されると、安定な表面表現型を保持していたことを示す。これらの細胞は、高レベルのＳｃａ－１を発現したが、ｃ－Ｋｉｔの表面レベルは低下しており、Ｆｌｋ－２、ＣＤ３４、Ｂ２２０、ＣＤ１９、及び他の系統マーカーは陰性のままであった（図１Ｅ）。表面からのｃ－ｋｉｔレベルの低下は、ＨＳＣ様表現型の維持にＳＣＦを必要とするため、連続的なシグナル伝達の結果であると思われる。ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の結果を、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスの骨髄からの正常の未操作長期ＨＳＣと比較した。図１Ｆに示すように、正常ＨＳＣ及びｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のマーカータンパク質の発現レベルを比較するため、細胞を、ｃ－ｋｉｔ、ｓｃａ－１、Ｆｌｋ－２、及びＣＤ３４に対する抗体で染色した。
実施例３：ｃｔｌｔ－ＨＳＣの移植によるマウスの致死的照射からの救出
この実験は、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の、分化した赤血球（ＲＢＣ）を生じさせる能力を証明する。この能力、並びに活性ＨＳＣ区画を長期間維持する能力は、ｃｔｌｔ－ＨＳＣのＬｔ－ＨＳＣとしての同一性の確立に重要である。ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の、致死的照射動物の造血性区画を再構成する能力を、２つの方法で調べた。第１には、１０３個のｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞を、３×１０５個のＲａｇ－１－／－マウスの全骨髄細胞と共に、致死的照射された若年Ｃ５７／ＢＬ６マウスに移植した。「キャリア」Ｒａｇ－１－／－細胞を追加することで、移植されたＨＳＣの赤血球産生の再確立に必要な期間、レシピエントによる赤血球の産生を確実にした。全「キャリア」骨髄細胞の補充は、移植レシピエントが、照射後の現存赤血球の減少を生き抜くことができるように、ＨＳＣ再構成と共に通常用いられる（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５，１７５～１８４，１９９２）。したがって、この実験は、成熟リンパ系細胞の唯一の可能な供給源が移植されたｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞となるように設計された。この方法の変法では、１０３個のｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞を、キャリア骨髄を含めずに致死量以下で照射されたＲａｇ－１－／－マウスに移植した。ｃｔｌｔ－ＨＳＣを移植されたマウスを移植６又は１２週間後に安楽死させ、再構成の分析のため、リンパ節、脾臓、胸腺、及び骨髄組織を回収した。得られた細胞懸濁液を系統特異的抗体で染色し、再構成の程度を確認した。ｃｔｌｔ－ＨＳＣから発生した細胞は、レトロウイルスがコードするレポーター遺伝子であるＧＦＰによって、インビボで追跡された。
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株は、骨髄、胸腺、脾臓、及びリンパ節中に、高頻度のＧＦＰ＋細胞（回収された生存細胞の７０～８０％）を有する骨髄、胸腺、脾臓、及びリンパ節組織を生じさせた（図２Ａ）。これらのヒストグラムは、それぞれ５例のコホートのうち、典型的な１例のマウスの臓器由来のものであった。具体的には、約７８％の骨髄細胞がＧＦＰ＋、約７２％の胸腺細胞がＧＦＰ＋、約８０％の脾臓細胞がＧＦＰ＋、約７９％のリンパ節（ＬＮ）細胞がＧＦＰ＋であった（図２Ａ）。
図２Ｂに示すように、骨髄から得られた細胞をＭａｃ－１及びＧｒ－１に対して染色した。骨髄中の全ての骨髄系細胞がＧＦＰを発現しなかったものの、かなりの部分がＧＦＰ＋であり、したがって、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来であった。具体的には、約１４．８％の細胞がＭａｃ－１＋であり、約２４％の細胞がＧＦＰ＋かつＭａｃ－１＋であった。したがって、Ｍａｃ－１＋細胞のうち約６１．８％がｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来であった（図２Ｂ）。更に、約３２％の細胞がＧｒ－１＋であり、約１８．７％の細胞がＧＦＰ＋かつＧｒ－１＋であった。したがって、Ｍａｃ－１＋細胞のうち約５８．４％が、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来であった（図２Ｂ）。
図２Ｃに示すように、キメラＲａｇ－１－／－マウスの脾臓組織から得られた細胞を、成熟Ｔ及びＢ細胞の存在について、フローサイトメトリーによって分析した。Ｒａｇ－１－／－マウス及び野生型マウスを対照として用いた。ＣＤ４又はＣＤ８のいずれかが単一陽性である、ＴＣＲαβ Ｔ細胞の存在について、細胞を染色した。加えて、ＣＤ１９＋Ｂ細胞（ＩｇＭ及びＩｇＤを表面に発現している）の存在について、細胞を染色した。
具体的には、キメラＲａｇ－１－／－マウスの脾臓細胞サンプルは、約２５．８％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、約１６．８％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、約７．８％のＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を有していた（図２Ｃ）。これは、対照Ｒａｇ－１－／－マウス（ＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、ＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、又はＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を含まない）の脾臓細胞サンプル；及び、野生型マウス（約２４％がＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、約１６．１％がＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、約２８．７％がＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を有する）の脾臓細胞サンプルと比較される（図２Ｃ）。
図２Ｃに見られるように、脾臓中の成熟Ｔ細胞の頻度は、野生型の未操作Ｃ５７／ＢＬ６マウスで見られるものと同等であったが、Ｂ細胞の発生は遅れていた。
続いて、ｃｔｌｔ－ＨＳＣが移植後に自己複製が可能かどうかについて、判定した。第１群のｃｔｌｔ－ＨＳＣ移植レシピエントマウスから得られた骨髄細胞を、致死的照射されたＲａｇ－１－／－マウスの第２コホートに連続的に移植した。６又は１２週間後に再構成について分析した。
図２Ｄに示すように、二次移植も成熟系統を生じさせることができた。脾臓を、キメラマウスのコホートから回収し、単一細胞懸濁液を調製してＦＡＣＳ分析に用いた。レシピエント、対照Ｒａｇ－１－／－マウス、及び対照野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスで見られる成熟Ｔ及びＢ細胞の頻度を比較した。この分析は、脾臓中の成熟ＣＤ４及びＣＤ８単一陽性ＴＣＲαβ Ｔ細胞が、野生型マウスの頻度と同様に存在していることを示した。野生型マウスより低頻度であったが、ＣＤ１９＋、ＩｇＭ＋、及びＩｇＤ＋Ｂ細胞も存在していた。
具体的には、二次移植レシピエントのＲａｇ－１－／－マウスの脾臓細胞サンプルは、約４１．３％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、約３４．３％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、約１０．２％のＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を有していた（図２Ｄ）。これは、対照Ｒａｇ－１－／－マウス（約０．７％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、約０．４％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、０．５％のＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を有する）の脾臓細胞サンプル；及び、野生型マウス（約３６．９％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ４＋細胞、約３７．７％のＴＣＲαβ＋かつＣＤ８＋細胞、約１６．９％のＩｇＭ＋かつＣＤ１９＋細胞を有する）の脾臓細胞サンプルと比較される（図２Ｄ）。
引き続き、連続的に７回移植を実施して、当初１０３個であったｃｔｌｔ－ＨＳＣからの成熟系統の再構成を観察したが、腫瘍の発生の証拠は見られなかった（表１）。この実験では、百万個の全骨髄細胞を致死的照射されたＲａｇ－１－／－マウスに移植した。Ｒａｇ１－／－マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）への移植は、Ｒａｇ１－／－マウスが、ＢＭ細胞を尾静脈から注入される直前に、４５０ラドの放射線を２回連続して照射（２～３時間離して）された以外は、ＮＳＧマウスについて記載された方法で行った。
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実施例４：ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株及びヒト造血性区画を有するキメラマウスの作製
マウス長期ＨＳＣを条件的に不死化する方法は、以前に開発されている。この方法を、マウスＨＳＣの条件的不死化の原因となるメカニズムが、いかなるＨＳＣに対しても一般的に適用可能かどうか、又は、それらがマウス細胞のみに特異的なのかどうかを特定するために、ヒト長期ＨＳＣの条件的不死化に広げた。この考えを確認するため、ヒト成人骨髄又は臍帯血のＣＤ３４＋画分を入手した（最初はＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から、その後ＵＣＨＳＣ臍帯血バンクから）。細胞を、ヒト組み換えＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＳＣＦを補充した、ヒトＨＳＣに特化して開発された培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で培養した。その後、ヒトＨＳＣに、ＧＦＰレポーターと共にＭＹＣ－ＥＲ又はＢｃｌ－２をコードするレトロウイルスを形質導入した。レトロウイルスは、実施例１で使用したｐＭＳＣＶ変異体と同じである。しかしながら、これらのレトロウイルスを、ヒト細胞への形質導入を可能にするために、両種指向性エンベロープで包まれるように改変した。形質導入されたヒトＨＳＣを、致死量以下で照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウス内に移植するか、又は、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＳＣＦサイトカイン混合物、並びに４－ＯＨＴの存在下においてインビトロで長期培養して維持した。この２つの異なる方法で、ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を得た。完全にインビトロで生じさせた一連のヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を、１４ヶ月間、連続培養して維持している。３種類のレトロウイルスで形質導入された細胞株の初期表面表現型は、ＣＤ３４＋画分が顕著に豊富であることを示した。この細胞は、ＨＳＣの初期頻度よりも１０，０００倍、ＣＤ３４＋画分が豊富であった（図３Ａ～３Ｃ）。
ＦＡＣＳ分析を行って、３種類の樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の表面表現型を特定した。図３に示すように、増殖され、凍結保存されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株は、提示された安定な表面表現型を保持していた。形質導入された（すなわち、ＧＦＰ＋）細胞は、高レベルのＣＤ３４の発現を示した（図３Ａ～３Ｃ）。特に、３種類の異なるｃｔｌｔ－ＨＣＳは、５．２３％、５．０９％、及び４．０３％のＧＦＰ×ＣＤ３４の二重陽性細胞に揃っている。これら３種類のｃｔｌｔ－ＨＳＣ株は、２５．３％、９４．７、及び９２．１のｃＫｉｔ×ＧＦＰの二重陽性でもあった（図３Ｄ～３Ｆ）。これらの同じ３種類のｃｔｌｔ－ＨＳＣ株は、系統マーカーＣＤ４５、Ｆｌｋ－２、及びＣＤ１５０も非常に低いまま保たれていた。示されるのは、１２．３％のＣＤ４５×ＧＦＰ二重陽性細胞（図３Ｇ）、０．７７％のＦｌｋ－２×ＧＦＰ二重陽性細胞（図３Ｈ）、及び０．５５％のＣＤ１５０×ＧＦＰ二重陽性細胞（図３Ｉ）；並びに、Ｂ２２０、ＣＤ１９、及び他の系統マーカー（ｔｈｙ１．２、Ｇｒ－１、Ｍａｃ－１、及びＴｅｒ－１１９）を有する、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ株のうち１つのフローサイトメトリー評価である。３種類の樹立された異なるヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の中で、表面マーカー発現レベルについていくらかの不均一性がある場合があるが、この不均一性は、成人ＨＳＣ区画において以前に報告される固有の不均一性の結果であると考えられる（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７，１２２５～３３，２００６）。
樹立されたヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の多能性を調べるため、既知の異種移植モデルを使用した（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐｐｌ １，１９９～２０３，１９９７）。このモデルは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウスの照射と、ｃｔｌｔ－ＨＳＣの照射したマウスへの移植を含む。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウスのコホートを、致死量以下で照射し（３００ラド）、１０４個のＣＤ３４＋ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞をマウスに移植した。移植前に、細胞は、１０週間培養下で維持された。移植６又は１２週間後のいずれかにおいて、マウスを放血させた。ヒト化キメラＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウスの末梢血中に存在するリンパ球を、ヒト白血球抗原に特異的な抗体で染色した。具体的には、サンプルを、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３に対する抗体で染色した。
図４に示すように、幹細胞移植を受けなかった対照マウスと比較すると、ヒトＢ細胞（ｈＩｇＭ＋細胞）及びヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞が、キメラＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍ－／－マウスの末梢血中に検出された。具体的には、対照マウスの末梢血は、０．０７５％のｈＩｇＭ＋／ｈＣＤ４５＋細胞を有し（図４Ａ）、第１キメラマウスの末梢血は、３１％のｈＩｇＭ＋／ｈＣＤ４５＋細胞を有し（図４Ｂ）、第２キメラマウスの末梢血は、７７．１％のｈＩｇＭ＋／ｈＣＤ４５＋細胞を有し（図４Ｃ）、第３キメラマウスの末梢血は、４９．５％のｈＩｇＭ＋／ｈＣＤ４５＋細胞を有していた（図４Ｂ）。
実施例５：ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣからの成熟ＲＢＣのインビトロ産生
ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣのインビトロでの成熟ＲＢＣ産生能を、既知の赤血球系統の表面マーカーを用いて示した。ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣを、液体培地（Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地）中でインキュベートし、ＥＰＯ及びＩＬ－３で１２日間処理した。図５に示すように、ＥＰＯ及びＩＬ－３を含む培養液の播種１０日後にＨＥ染色で分析すると、培養液中に多数の除核細胞が見られた。フローサイトメトリーで除核細胞集団を調べると、赤血球系細胞表面マーカーであるグリコホリンＡ、ＣＤ７１、及びＣＤ４１を発現している細胞集団が見られた。更に、これらの細胞は、ＣＤ４５の発現又はその他非赤血球系統マーカーの発現を欠いていた。
具体的には、図５Ａは、対照マウス末梢血のＨＥ染色を示す。図５Ｂは、初代ヒト胎児臍帯血のＨＥ染色を示す。図５Ｃ、５Ｄ、及び５Ｅは、ＩＬ－３及びＥＰＯで１２日間処理された３種類の条件的に形質転換された胎児臍帯血細胞株のＨＥ染色を示し、図５Ｆは、赤血球の形態を示す図５Ｅの細胞の拡大図を示す。
実施例６：ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣのインビボ機能解析
インビトロでｃｔｌｔ－ＨＳＣから産生されたＲＢＣの機能を、マウスの致死的貧血からの救出能について検査することによって判定した。ヒトＲＢＣを用いたため、これらの実験用に選択されたマウスは、免疫無防備状態のマウスとした。これらの試験には、２種類の系統の免疫無防備状態のマウスを用いた。これら２種類のマウス系統は、このような試験で一般的に使用されている（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３，２３６～４６，１９９７）。２種類の系統は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス及びＲａｇ－１－／－／γｃ－／－マウスである。インビボ機能試験の操作原理は、機能的ＲＢＣ集団が提供されない場合は、マウスにとって致命的である何らかの貧血状態を誘導することとした。
使用したプロトコールの１つは、Ｈｉｒｏｙａｍａのものを適応した（Ｈｉｒｏｙａｍａ，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２，ｅ１５４４，２００８参照）。このプロトコールは、インビボで溶血による貧血を誘発するため、フェニルヒドラジンを用いる。その後、処理マウスにＲＢＣを翌日に与えるか、又は、更なる治療は行わない。薬剤の２回目の投与は、４日後に続ける。最初の化学的誘発溶血後に機能的ＲＢＣが提供されない場合、２回目の致死的曝露後すぐに動物は死亡する。機能的ＲＢＣが提供される場合、マウスは、致死的貧血への曝露から救出される。
最初の播種の１０日後、本明細書に記載する方法を用いて、１０７個のヒトＲＢＣをヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣの集団からインビトロで誘導した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのコホートを入手し、０日目に８０ｍｇ／ｋｇのフェニルヒドラジンで処理した。１日目に、１０７個のヒトＲＢＣを、尾静脈注入によって処理マウスコホートの半数に移植した。２回目のフェニルヒドラジン曝露は６日目に行った。続いて、２回目のフェニルヒドラジン曝露後９日間、マウスの生存率を観察した。
図６に示すように、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣは、化学的に誘発した致死的貧血からマウスを救出することができた。具体的には、フェニルヒドラジン（フェニル）で処理し、ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣで処理しなかった（ＡＴなし）マウスは約２０％のみが生存したが、フェニルヒドラジン（フェニル）及びヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣ（ＡＴ）の両方で処理したマウスの１００％が生存した（図６）。これは、フェニルヒドラジンで処理しなかった野生型マウス（ＷＴ）と匹敵した。
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣのインビボ機能の検査に使用した別の方法には、ＲＢＣのホメオスタシスの評価に通常用いられるプロトコールを含めた。この場合、マウスを十分に出血させた（５００μＬ、又は全血液量の約１７％）後、観察のため飼育器内に放置した。しかしながら、正常マウスは、更なる介入がなくてもこの傷害から回復することがわかった。そのため、出血性ショックからのＲＢＣ区画の回復を遅らせるため、赤血球系前駆細胞を無能力にする必要があるのは妥当であった。
したがって、ＲＢＣの回復速度に影響を及ぼすため、免疫無防備状態のマウスを尾から４００μＬ出血させる前に、４５０ラドの致死量以下で照射した。この場合、１×１０７個の赤血球系細胞による輸血が尾静脈注入によって提供されない場合、マウスは４８時間以内に死亡した。この形態の致死的貧血を、Ｒａｇ－１－／－／γｃ－／－マウスコホートにおいて誘発させ、コホートの半数に、１×１０７個の、本明細書に記載する方法を用いてヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣの集団からインビトロで誘導された赤血球系細胞を投与した。急性貧血の誘発及び赤血球系細胞の移植後、９日間マウスの生存率を観察した。図７に示すように、インビトロｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣは、複合的傷害誘発性致死的貧血からＲａｇ－１－／－／γｃ－／－マウスを救出することができた。特に、複合的傷害誘発性致死的貧血を生存したＲａｇ－１－／－／γｃ－／－マウス（外傷ＡＴなし）は約１０％のみであったが、ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣで救出されたマウス（外傷ＡＴ）の１００％が生存した（図７）。これは、複合的傷害誘発性致死的貧血を受けなった野生型マウス（ＷＴ）に匹敵した。
実施例７：ＨＳＣへのＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質の直接的タンパク質形質導入
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株作製にＭＹＣ－ＥＲ及び／又はＢｃｌ－２－ＥＲを利用する方法に伴うリスクの１つは、宿主細胞のゲノム内へのウイルス配列の不規則な組み込みである。これは、輸血用のＲＢＣ調製物中に何らかの有核ｃｔｌｔ－ＨＳＣが残り、これらの細胞が投与される患者に望まれないリスクをもたらし得るため、懸念事項である。この実施例に記載する実験は、宿主細胞のゲノム中にウイルス配列を組み込まずに、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を作製するための代替方法を示す。
遺伝子操作（すなわち、ウイルス形質導入）を行わずに細胞内にタンパク質を導入するため、この代替方法は、ＨＩＶ－１のＴＡＴ（ＴＡＴ）タンパク質が生体膜を通過し、タンパク質カーゴを細胞内に送達させる能力に依存する（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ２１，４５～８，２０００）。ＭＹＣ又はＢｃｌ－２のいずれかと融合したＴＡＴフラグメントをコードする、多数のプラスミドを作製した。続いて、プラスミドを細菌細胞内に形質転換し、細胞を対数増殖期中にＩＰＴＧで誘導した。この誘導した細胞を３時間後に回収し、タンパク質をニッケルカラムで精製した。続いて、ブラッドフォード法でタンパク質含量について画分を分析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで泳動させてクマシーブルーで染色した（図８）。図８Ａに示すように、画分Ｅ２～Ｅ１１はＴＡＴ－ＭＹＣを含有し、このとき画分Ｅ３～Ｅ５は最もＴＡＴ－ＭＹＣを含んでいた。図８Ｂに示すように、画分Ｅ１～Ｅ６はＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含有し、このとき画分Ｅ２は最もＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含んでいた。
ＭＹＣ－ＥＲ及びＢｃｌ－２をレトロウイルスによって遺伝子形質導入されていないｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を作製するために、マウスＬｔ－ＨＳＣへ直接的に形質導入するＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を用いるという考えを検証した。５ＦＵで濃縮したＨＳＣをＣ５７／ＢＬ６マウスの骨髄から回収し、組み換えＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＳＣＦを補充した培地中でインキュベートした。更に、細胞を、低エンドトキシン条件下で調製された、５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ及び１０μｇ／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ－２タンパク質の精製組み換え体と共にインキュベートした。培地及びＴＡＴ－融合タンパク質を４８時間毎に交換し、細胞を２１日間培養下で維持した。続いて、一定分量のｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を用いて、フローサイトメトリーによってマウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の表現型の特徴を明らかにした。細胞を、幹細胞マーカーであるｃ－ｋｉｔ及びｓｃａ－１、並びに系統マーカーであるＣＤ３、Ｂ２２０、及びＴｅｒ１１９に対する抗体で染色した。図９に示すように、これらの培養液中ではｃ－ｋｉｔ＋、ｓｃａ－１＋、ｌｉｎ－の細胞集団が優先的に増殖した。これは、初代マウスＬｔ－ＨＳＣに見られる表現型（Ｃｈｅｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，３１２０～３１２５，１９９９）と類似している。具体的には、７７．５％の細胞がｃ－ｋｉｔ＋かつｓｃａ－１＋（図９Ｂ）であり、９８．１％がＣＤ３－かつＢ２２０－（図９Ｃ）であり、９９．４％の細胞がＴｅｒ１１９－（図９Ｄ）であった。
ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２由来ｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のインビボにおける多能性の特徴を確認するため、致死量以下で照射されたＲａｇ－１－／－マウスに１０４個の細胞を移植した。移植４週間後、静脈穿刺によってレシピエントマウスから末梢血を回収した。続いて、Ｂ細胞マーカーであるＢ２２０及びＩｇＭ、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ４、ＣＤ８、及びＴＣＲβについて、ＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって評価した。染色された細胞を非染色細胞と比較した。図１０に示すように、マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を致死量以下で照射されたＲａｇ－１－／－マウスに移植すると、リンパ系区画の再構成を引き起こした。具体的には、約１０．７％のＰＢＭＣがＢ２２０＋かつＩｇＭ＋であり、対して、対照Ｒａｇ－１－／－マウスでは０％であり（図１０Ｂ）、約１３．５％のＰＢＭＣがＣＤ４＋かつＴＣＲβ＋であり、対して、対照Ｒａｇ－１－／－マウスでは約０．０９％であり（図１０Ｃ）、約６．８％のＰＢＭＣがＣＤ８＋かつＴＣＲβ＋であり、対して、対照Ｒａｇ－１－／－マウスでは約０．０１１％であった（図１０Ｄ）。
実施例８：ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質を形質導入したマウスｐｔｌｔ－ＨＳＣからのＲＢＣの発生
ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣで観察されたもの（図５）と同様に、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質を形質導入することによって作製されたマウスｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株から、成熟した無核のＲＢＣも誘導された。この実験では、ＩＬ－３、ＥＰＯ、及びＴＡＴ－ＭＹＣの存在下及び非存在下で、マウスｐｔｌｔ－ＨＳＣを培養した。培養１０日後、細胞分化をＨＥ染色によって評価した（図１１）。ＩＬ－３、ＥＰＯ、及びＴＡＴ－ＭＹＣで処理したマウスｐｔｌｔ－ＨＳＣから、高頻度で完全に除核されたマウスＲＢＣが得られ（図１１Ｂ及び１１Ｃ）、一方、対照細胞はＲＢＣに分化しない（図１１Ａ）ことがわかった。加えて、マウスＲＢＣの特徴をフローサイトメトリーによって明らかにし、グリコホリンＡレベルが上昇し、ＣＤ７１レベルが減少して発現していることがわかった。
実施例９：ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来赤血球の産生
以下の実施例は、ヒトタンパク質を形質導入した長期ＨＳＣ（ｐｔｌｔ－ＨＳＣ）細胞株由来のヒトの成熟した除核赤血球のインビトロ産生と特徴を説明する。有利には、ヒト赤血球を、遺伝子操作されたＨＳＣ、動物血清、又は動物フィーダー細胞の使用を必要としない培養条件下で、１０日間で確実に産生できる。更に、産生された赤血球は完全に分化され、除核された成熟ヒト赤血球は、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）、並びに減少レベルのＣＤ７１及び胎児型ヘモグロビンを発現している。ＣＤ７１マーカーはトランスフェリン受容体であり、通常は、赤血球（すなわち、赤色血液細胞）の前駆細胞において高レベルで発現しているが、成熟赤血球では下方制御されている。ＧＰＡマーカーは、一般に膜成熟の指標として、成熟赤血球において高レベルで発現している。
ｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のインビトロ産生及び増殖
遺伝子組み換えされタンパク質を形質導入された条件的不死化造血幹細胞は、以前に説明されている（参考文献）。この実験では、以前に説明されているように、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質によるタンパク質形質導入を用いて、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を産生させた。これらの融合タンパク質は、ＨＩＶ－１のＴＡＴ（ＴＡＴ）タンパク質由来のＴＡＴペプチドを含む。
地元の臍帯血バンクから１単位のヒト臍帯血を入手した。続いて、細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で１：１で希釈して、臍帯血から有核細胞集団を単離した。２０ｍＬの希釈臍帯血細胞を、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にゆっくりと重層する。続いて、細胞を９００×ｇで６０分間遠心した。遠心後、ガラス製ピペットでバフィーコートを除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。続いて、細胞を再懸濁し、１５％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－Ｌ、５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ、及び５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を補充した、イスコフ改変ダルベッコ培地で培養した。
最初の細胞集団（０日）は、０．１２％のＣＤ３４＋／ＣＤ３８ｌｏであった。培養３日後、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８ｌｏ細胞の頻度は１．２４％に上昇した（図１２Ａ）。培養１４日後、４５．２％の細胞集団がＣＤ３４＋／ＣＤ３８ｌｏであった（図１２Ｂ）。更に、培養１４日後、細胞の正味の総数が増加した。ＨＳＣは、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の存在下で２１日間培養して増殖させた後、ある細胞株を形成した。この細胞株を、タンパク質を形質導入した長期ＨＳＣ（ｐｔｌｔ－ＨＳＣ）細胞株と表した。続けてこの細胞株を、赤血球（ＲＢＣ）分化と特徴確認のための細胞源として用いた。
インビトロにおけるｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣの産生
続いて、インビトロで産生されたヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣを用いて、ヒトの除核された成熟ＲＢＣを産生させた。このｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの特徴を、その後明らかにした。ＦＡＣＳ分析を用いて、ヒトグリコホリンＡ（ＧＰＡ）、ヒトＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、及びヒト胎児型ヘモグロビンの発現レベルとパターンを測定した。
赤血球分化は、３．２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３及び１００単位／ｍＬのＥＰＯ、並びに１５％のヒト血漿及び１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で、臍帯血由来ｐｔｌｔ－ＨＳＣを培養することによって誘導した。続いて、細胞を少なくとも９日間培養した。
図１３に示すように、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ培養液をＲＢＣ分化条件（ＩＬ－３及びＥＰＯ）に移すと、４日後、細胞はＧＰＡ及びＣＤ７１を高レベルで発現し始めた。ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２を含むが、ＩＬ－３及びＥＰＯを欠く培地中で維持された細胞は、これらの変化を示さなかった（図１２）。培養液のサンプルを、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）及びＣＤ７１（トランスフェリン受容体）の細胞表面発現のＦＡＣＳ分析に用いた。図１３に示すように、ＩＬ－３及びＥＰＯの存在下で培養することによってＲＢＣ分化プログラムに誘導されたｐｔｌｔ－ＨＳＣを、ＧＰＡ及びＣＤ７１の発現について染色し、非染色細胞、並びに、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２を含むが、ＩＬ－３及びＥＰＯを欠く中性培地中で培養されたｐｔｌｔ－ＨＳＣと比較した。この結果は、ＩＬ－３及びＥＰＯと共に培養すると４日目までに、約４２％の細胞がＣＤ７１＋／ＧＰＡ＋（図１３Ｃ）であり、対して、非染色対照中の細胞では約０．３６６％がＣＤ７１＋／ＧＰＡ＋であり（図１３Ａ）、中性培地中で４日間培養された細胞では約０．２２２％がＣＤ７１＋／ＧＰＡ＋であった（図１３Ｂ）ことを示す。
更に、ｐｔｌｔ－ＨＳＣを分化培養に移してから９日後、発生したＲＢＣがトランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現を低下し始める一方で、表面上のＧＰＡは高レベルのまま保たれていた（図１４）。このＣＤ７１の発現変化は、培養液中の除核ヒトＲＢＣの頻度上昇と同時に起こった（図１４及び１５）。細胞を、胎児型ヘモグロビンについても染色した。
図１４は、発生したＲＢＣがＧＰＡ／ＣＤ７１二重陽性からＧＰＡ＋／ＣＤ７１ｌｏに移行すると、高レベルのヒト胎児型ヘモグロビンから低レベルの胎児型ヘモグロビンの発現に切り替わることも示す。理論に束縛されるものではないが、低レベルの胎児型ヘモグロビンを有するＧＰＡ＋／ＣＤ７１ｌｏ細胞は、対応して高レベルの成人型ヘモグロビンを有すると考えられる。
誘導後３つの時点（７日、１２日、及び２２日）において、ＲＢＣ分化培養からの細胞のＦＡＣＳ分析を行った。ＦＡＣＳ分析では、ＧＰＡ及びＣＤ７１の細胞表面発現を測定した。胎児型及び成人型ヘモグロビンの発現についても細胞を観察した。末梢血から得られた初代ヒトＲＢＣを、陽性対照として用いた（図１４；対照上列）。結果は、７日目において、多くのＧＰＡ／ＣＤ７１二重陽性細胞があったことを示す（図１４；最初の図、上部）。結果は更に、１２日目までに、細胞のほとんどがＧＰＡ＋／ＣＤ７１ｌｏに変化したことを示す（図１４；２番目の図、上部）。１２日目の細胞は、高レベルの胎児型ヘモグロビンも発現していた（図１４；２番目の図、下部）。分化培地中で２２日までに、細胞はＧＰＡ＋／ＣＤ７１ｌｏのままであるが、胎児型ヘモグロビンの発現レベルは下方制御され、成人型ヘモグロビンの発現は増加していた（図１４；３番目の図、上下）。成熟マーカー発現のこれら動的変化は、ヒト及びマウスにおける標準的なＲＢＣ分化中に骨髄で見られる変化と一致した。具体的には、誘導培養（ＩＬ－３及びＥＰＯ）におけるｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞の培養７日後、約６０．９％の細胞がＧＰＡ＋／ＣＤ７１＋であり、約１％の細胞がＧＰＡ＋／ＣＤ７１－であり、７１．４％の細胞が胎児型ヘモグロビンを発現していた（図１４Ｂ）。誘導培養（ＩＬ－３及びＥＰＯ）におけるｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞の培養２２日後、ＧＰＡ＋／ＣＤ７１＋はＧＰＡ＋／ＣＤ７１－に移行した。対照血液と同様に、７６％のＧＰＡ陽性細胞が成人型ヘモグロビンを発現し、２０．３％のみの細胞が胎児型ヘモグロビンを発現した（図１４；２番目及び３番目の図、下列）。
更に、培養中の除核（anucleation）組織学的分析を、３日目及び７日目のＲＢＣ分化培養サンプルをＨＥで染色することによって行った（図１５）。サイトスピン装置を用いて細胞をスライド上に広げた。次に、スライドをＨＥで染色し、倒立顕微鏡と光写真を用いて写真を撮った。小さい除核細胞の外観が早くも３日目に観察され（図１５Ａ）、７日目までに数が増えた（図１５Ｂ）。
実施例１０：ｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来赤血球のスケールアップ産生
以下の実施例は、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣのインビトロ産生を、臨床的に意義のある産生レベルにまでスケールアップすることについて説明する。
ガス透過性バッグ中でのｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣの産生
ガス透過性バッグを更に用いて、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣのインビトロで産生をスケールアップした（図１６）。
細胞が接する側にテフロン系コーティングを有するガス透過性バッグを、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣのインビトロ産生のために最適化した（図１６Ａ）。中性条件でインキュベートしたヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣを、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に用いて、ガス透過性バッグ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）中で５日間の培養を開始した。続いて、ＲＢＣ分化を誘導するために、培養をＩＬ－３及びＥＰＯを含む培地に切り換えた。図１６Ａに示す写真は、ＲＢＣ分化培地におけるインキュベート４日後に撮った。図１６Ｂは、ガス透過性培養バッグ中でのＲＢＣの成熟及び除核を示す。図１６Ａに示すバッグから細胞をサンプリングし、サイトスピン装置を用いてスライドガラスに固定した。次に、スライドをＨＥで染色し、倒立顕微鏡と光写真を用いて写真を撮った。
インビトロｐｔｌｔ－ＨＳＣ分化培養の連続継代
この実施例は、ｐｔｌｔ－ＨＳＣがＲＢＣ分化培地中で培養された時間の長さが、ＲＢＣをインビトロ産生し続けられる点について説明する。これは、ヒト輸血にとって臨床的に意義のある量のＲＢＣ（１０１１個／単位）を産生するプロセスの開発には、重要な要素である。
最初の一連の実験は、インビトロにおける赤血球系分化条件下（すなわち、ＩＬ－３及びＥＰＯを含む培養）でのｐｔｌｔ－ＨＳＣの連続継代を含む。６ウェルのプレートに、３×１０６、１０６、３×１０５、及び１０５個の密度でｃｔｌｔ－ＨＳＣをプレーティングする。細胞を、１０％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－Ｌを補充した、イスコフ改変ダルベッコ培地で培養する。最初のｐｔｌｔ－ＨＳＣ集団を、次に、ヒトＨＳＣ及び赤血球系マーカー（ＧＰＡ、ＣＤ７１、及び胎児型ヘモグロビン）について染色する。成熟ＲＢＣの発生について、培養を目視及びＦＡＣＳ分析で観察する。初期培養が樹立して１０日後に一定分量の細胞を取り出し、ＲＢＣから有核生細胞を分離するため、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によって遠心する。ＨＳＣ及び赤血球系統の細胞表面マーカーの発現について、両画分の細胞をＦＡＣＳで分析する。各１０日のサイクルの終了時点で、培養液の分析についても同様の方法を使用する。
Ｆｉｃｏｌｌ勾配の中間相に存在する有核細胞を、新しいＰＢＳ及び培地で洗浄し、同じ条件で再度プレーティングする。一濃度のｃｔｌｔ－ＨＳＣから始めて３回連続継代した後に、少なくとも１つのｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株が成熟ＲＢＣを産生できたことが示された。いくつかの実施形態では、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ株を増殖させ、その後、ＰＴＤ－Ｍｙｃ存在下で赤血球分化培地に曝露する。約９～２８日間で赤血球を分離した後、残存する非赤血球を再度分化培地に入れ、約９～２８日間で赤血球を分離する。このプロセスを少なくとも３回繰り返してよく、無期限に継続することが予想される。
この結果は、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来赤血球系前駆細胞が、２～４回の継代中にＲＢＣを産生し続けることができることを示唆する。
培養バイオリアクターシステムにおけるｐｔｌｔ－ＨＳＣ由来ＲＢＣの大規模産生
この実施例は、ｐｔｌｔ－ＨＳＣからの成熟した除核ヒトＲＢＣの大規模インビトロ産生に対する、４種類のシステムの検証について説明する。
最初に２つのシステムを検証した（細胞培養用に設計された可撓性プラスチック容器及びガス透過性バッグ）。これらのシステムでの結果は、大規模ヒトＲＢＣ産生は、組織培養容器の設計変更と、培養条件の修正を行うことにより、最適化できることを示した。
多数のＲＢＣの産生においてより効率的な方法を考えるため、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣからのＲＢＣのインビトロ産生について先に記載した一工程プロトコールを、スピナーフラスコ型バイオリアクター（例えば、ＴＡＰ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡｍｂｒマイクロバイオリアクター、及びＡＴＭＩのＩｎｔｅｇｒｉｔｙ ＰａｄＲｅａｃｔｏｒ）、ガス透過性バッグ（Ｏｒｉｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）、ガス透過性組織培養フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｇ－ｒｅｘ酸素透過性フラスコ）、又は細胞培養用に設計された可撓性プラスチック容器（ＧＥ Ｗａｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）に適応させる。これらの実験は、インビトロにおけるｐｔｌｔ－ＨＳＣからのヒトＲＢＣ大規模産生の実現可能性を判定する。
インビトロでヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣからＲＢＣを産生させるのに用いる基本的なプロトコールは、臍帯血由来ＨＳＣを入手することから始まる。細胞をリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で１：１で希釈して、臍帯血から有核細胞集団を単離した。２０ｍＬの希釈臍帯血細胞を、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にゆっくりと重層する。続いて、細胞を９００×ｇで６０分間遠心する。遠心後、ガラス製ピペットでバフィーコートを除去し、ＰＢＳで２回洗浄する。続いて細胞を、１０％のヒトアルブミン、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－Ｌ、５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ、及び５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ２を補充した、イスコフ改変ダルベッコ培地に再懸濁する。細胞を、これらの培養条件下で、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－集団の所望の濃縮程度、並びに、必要とする総細胞数に応じて１２～３０日間維持する。培地を１５％のヒトアルブミン、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、及び３．２単位／ｍＬのＥＰＯを補充したＤＭＥＭに変更すると、赤血球分化が誘導される。細胞を更に１１日間培養する。次に、ＧＰＡ、ＣＤ７１、及び胎児型ヘモグロビンに対する抗体を用いて、ＦＡＣＳによって細胞のＲＢＣ分化を観察する。ＨＥでの組織染色も行う。
インビトロＲＢＣ産生用プロトコールを、臍帯血単位由来のヒト造血性細胞を大量に増やすのに以前使用されたスピナーフラスコ系バイオリアクターにおける大規模産生用に適応させる。このシステムは、２種類のスピナーフラスコ型バイオリアクターシステムの使用を含む。まず、Ａｍｂｒマイクロバイオリアクターシステム（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる。これは、古典的なバイオリアクターの特徴を小規模で模倣する、スピナーフラスコ条件下で１０～１５ｍＬの培養液を持つ装置である。この器具は、ディスポーサブルのマイクロリアクターチャンバを使用し、自動的に制御される。主な利点の１つは、２４種類の異なる条件で同時培養が可能なことである（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ，Ｎｏｖ １，２０１０，Ｖｏｌ．３０，Ｎ．１９）。この方法は、ＲＢＣ発生のインビボ条件を、バイオリアクター系の構成に素早く最適化かつ適合化させることができる。条件が最適化されると、プロセスが大規模システム（Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ＰａｄＲｅａｃｔｏｒ，ＡＴＭＩ）に移される。ＰａｄＲｅａｃｔｏｒシステムは、ユーザーが異なる容量のバッグ中で細胞を同時に増殖できるドライブユニットと、細胞が増殖しているバッグを支持し、モジュール式の製造スペース内に移動できるモバイルタンクと、並びに、羽根を含み、羽根がバッグ内で回転すると非侵襲的混合が可能な使い捨て細胞用バッグであるバイオリアクター容器と、からなる、使い捨てのバイオリアクターである。このシステムは、剪断力が低い改善された混合をもたらし、懸濁細胞に適用でき、低容量で細胞を増殖できる。
ガス透過性バッグ
上記のように、簡素なガス透過性バッグ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を用いて、ＲＢＣをインビトロで産生させた。これらのバッグは、内面にテフロンコーティングを有し、容器の表面積全体からガス交換することもできる。しかしながら、このシステムは、細胞の密度が限界に達すると、継続的に培地交換するように最適化できる。したがって、新たなシステムを、２室型ガス透過性バッグシステムにおいて、培地を連続的に流すことが可能なように設計できる。細胞損失を最小限にすることに加え、このシステムは、培地と廃棄物が外側チャンバを通って流れる連続フローシステムも提供することができる。このシステムは、ｐｔｌｔ－ＨＳＣの培養液を、ＨＳＣ増殖条件からＲＢＣ分化条件へ切り換えることもできる。
ｐｔｌｔ－ＨＳＣを評価し、細胞がデュアルバッグシステムで増殖できるかどうかについて判定する。バッグに、１０７個のヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣを播種し、１０％のヒトアルブミン、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－ＬをＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に補充したイスコフ改変ダルベッコ培地で維持する。これらは、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞が増殖し、その多能性の維持が可能な中性条件である。続いて１０日後、開始ｐｔｌｔ－ＨＳＣをヒト幹細胞表面マーカーに対する抗体で染色し、これらの条件下でのｐｔｌｔ－ＨＳＣの増殖の程度を判定する。
中性条件下でのｐｔｌｔ－ＨＳＣの増殖の支持という状況でデュアルバッグを検査した後、デュアルバッグシステムに、ＲＢＣ産生のためのｐｔｌｔ－ＨＳＣを播種する。培地の循環中にＲＢＣが流れ出るのを防ぐため、使用する孔径は、５ｋＤａ程度のカットオフとする。デュアルバッグシステムに１０７個のｃｔｌｔ－ＨＳＣを播種し、細胞を、１０％のヒトアルブミン、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３－ＬをＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に補充したイスコフ改変ダルベッコ培地で培養する。培養３日後、培地を、１０％のヒトアルブミン、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３、及び５０ｎｇ／ｍＬのＥＰＯを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地に切り替える。３日毎にバイオリアクターからサンプルを採取する。この期間は、サイトカイン含有培地を含む培地の一部を再度満たす必要性によるものである。次に、採取した細胞を、計数、並びに、上記実施例に記載したＦＡＣＳ及び顕微鏡検査によって分析する。ＲＢＣの総産出量は、デュアルバッグシステムが細胞増殖を支持すると報告されている期間全体（１０～１２日間）で判定される。加えて、１日目にカートリッジの播種に使用されたｐｔｌｔ－ＨＳＣの最終結末についても判定する。理想的には、ＲＢＣを回収でき、更にＲＢＣを産生するために残ったｐｔｌｔ－ＨＳＣを新しい培地に再播種できるように、ｐｔｌｔ－ＨＳＣは、デュアルバッグシステム中で２～４回の培養サイクルにわたって活性を維持する。患者から得た末梢血からＲＢＣを分離するために現在使用されている連続的遠心分離法を、デュアルバッグシステムで産生したＲＢＣの回収に使用する。
可撓性プラスチックバッグ容器
上記のように、細胞培養用に設計された可撓性プラスチックバッグ容器（ＧＥ Ｗａｖｅ）を用いて、ＲＢＣをインビトロで産生させることもできた。しかしながら、最初のｐｔｌｔ－ＨＳＣ集団の未熟で制御されない分化を減らすために、このシステムを最適化できる。
標準的な通気式組織培養フラスコでの静置培養で得られた大量のｐｔｌｔ－ＨＳＣを、可撓性プラスチックバッグ容器内に設置されるときにＲＢＣ分化培地に移す。除核の割合及びＲＢＣ成熟の速度をＦＡＣＳ分析を用いて調べ、ＣＤ７１、ＧＰＡ、及び胎児型ヘモグロビンの発現レベルを測定する。更に組織学的分析を用いて、成熟状態を確認する。続いて、可撓性プラスチック容器の内部を、同じ容器内で増殖させＲＢＣ分化培地に切り替えた、少量のｐｔｌｔ－ＨＳＣでコーティングする。
ガス透過性組織培養フラスコ
２種類のバッグ系バイオリアクターシステム、及びスピナーフラスコ装置での実験に加え、ｐｔｌｔ－ＨＳＣ及びＲＢＣのスケールアップ産生に対してガス透過性組織培養フラスコを検証する。
少量のｐｔｌｔ－ＨＳＣの臨床的に意義のある量の細胞への拡大産生と、ｐｔｌｔ－ＨＳＣのＲＢＣへの制御された分化の両方について、ガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）を調べる。全手順を１つのフラスコ内で実施する。フラスコは、既存の装置よりも、細胞を、はるかに酸素及び栄養素に到達しやすくする。更に、フラスコは非常に使いやすい。フラスコは、標準的なインキュベーターにおいて働き、標準的な実験室用装置を使用する。フラスコの底部は、独自のジメチルシリコーンガス透過性膜で作られており、既存のいかなるガス透過性装置よりも良好な酸素透過性をもたらす（Ｌａｐｔｅｖａ ａｎｄ ａｄ Ｖｅｒ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ，Ｅｐｕｂ ２０１１，Ｓｅｐ１１）。細胞はこのガス透過性膜に引き寄せられ、そこで、既存の装置において可能な深さよりも、非常に深い培地下に沈む。これらの条件下において、細胞は、頻回の栄養供給や培地混合機器による撹乱を受けることなく、酸素及び栄養素を必要に応じて与えられる。
実施例１１：ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株のインビトロ及びインビボでの特徴
以下の実施例は、実施例９で産生されたヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の表面表現型、並びに、インビトロ及びインビボでの多能性の特徴について説明する。この項で記載される実験は、インビトロでは標準的なメチルセルロース分化アッセイを用いて、インビボでは異種移植マウスモデルを用いて、系統の潜在能を特定する。
最低４種のヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を、この実施例で記載の試験に使用する。選択されるヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株は、以下の４つの基準をベースに選択される。第１に、細胞株が、初代ヒトＬｔ－ＨＳＣ（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４８＋、ＣＤ１５０＋、ｌｉｎ－）に似た表面表現型を有していること。第２に、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣが、実施例９に記載の条件下での培養において活発に増殖し、インビトロ増殖において外から追加されるＴＡＴ－ＭＹＣへの依存性を保持していること。第３に、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣが、凍結保存から素早く回復でき、その一方で表面表現型と増殖特性を維持していること。第４に、１つの細胞株が、臨床的に使用される主な形態のＲＢＣを生じるヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣパネルを産生するために、Ａ ｒｈ－、Ｂ ｒｈ－、ＡＢ ｒｈ－、Ｏ ｒｈ－の遺伝子型のそれぞれから選択されること。
以前に説明されているように、１０個、１０２個、又は１０３個のヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株をメチルセルロース分化培地に播種する（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐｐｌ １，１９９～２０３，１９９７）。骨髄系統（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐｐｌ １，１９９～２０３，１９９７）、骨髄－赤血球系統、又は前Ｂ細胞系統（Ｃｈｅｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，３１２０～３１２５，１９９９；及びＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３，２３６～４６，１９９７）に向かってＨＳＣ分化を進ませる目的でサイトカインを補充した培地を、特異的に使用する。次に、前駆体頻度の測定値として、コロニー数、形態、及びコロニー発生速度に関してプレートでのコロニー形成を評価する。様々な試験条件のそれぞれにおいて特定のコロニーを生じさせる能力で判定されるとき、多能性であるｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を続いて同定する。
問題のｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株がインビトロで複数の造血性系統を生じさせる能力があることが証明されると、その多能性をインビボで調べる。続いて、これらのｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞を、初代ヒトＬｔ－ＨＳＣを用いて実施されたように、致死量以下で照射された１０例のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスコホートへの移植に使用する（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １５ Ｓｕｐｐｌ １，１９９～２０３，１９９７；及びＨｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３，２３６～４６，１９９７）。照射マウスに、実施例９に記載の培養条件で維持された１０４個のｐｔｌｔ－ＨＳＣを移植する。続いて、分析用末梢血サンプルを採取するために、マウスを静脈穿刺によって出血させる。赤血球を溶解し、ヒトＣＤ３及びＣＤ１９についてＰＢＭＣを染色する。末梢血中にヒトリンパ系細胞が検出されると、マウスをＣＯ２による仮死化と頸椎脱臼により安楽死させる。続いて、マウスからリンパ節、脾臓、胸腺、及び骨髄を回収する。臓器から単一細胞の懸濁液を作り、細胞を、ヒトＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｍａｃ－１、Ｇｒ－１、及びＴｅｒ－１１９に特異的な抗体で染色する。複数系統のヒト造血性細胞の検出によって、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株の多能性を確認する。２種類の対照を含める。陰性対照には、非操作マウス、つまり、致死量以下で照射され、ヒトｐｔｌｔ－ＨＳＣ細胞の移植を受けなかったマウスを用いる。陽性対照として、致死量以下で照射され、実施例４で作製したヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣ細胞株を移植されたマウスコホートを用いる。
実施例１２：ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣにおいて発現するヘモグロビンの種類の分析
以下の実施例は、ＲＢＣのヘモグロビンの特定の種類（胎児型、成人型など）を決定することによる、実施例９で産生されたヒト赤血球（ＲＢＣ）の分化状態（例えば、赤血球系統への分化の程度及び発生状態）について説明する。
本明細書に記載する方法を用いて実施例１１で産生させたヒトＲＢＣ中で発現するヘモグロビンの性質を、２つの同様の方法で判定する。まず、ヒトＲＢＣの産生に用いる培養液中に存在するＲＢＣ前駆体から、ｍＲＮＡを得る。加えて、健康な匿名ボランティアから得られた初代ヒトＲＢＣについても、陽性対照として使用する。実施例７に記載するように、ＩＬ－３及びＥＰＯを補充したＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で、ヒトｃｔｌｔ－ＨＳＣをインキュベートする。細胞画分を、４８時間毎に１０日間採取する。細胞表面表現型及び赤血球系分化マーカーのフローサイトメトリーによる分析に、１つの細胞画分を用いる。細胞をヒトＣＤ７１及びＧＰＡについて染色する。サンプル中の残りの細胞を用いて、ｃＤＮＡを作るためのｍＲＮＡを得る。得られたｃＤＮＡを、３つのグロビン遺伝子（ヘモグロビンα、β、及びγ）、及び２つのハウスキーピング遺伝子（β－アクチン及びＧＡＰＤＨ）の半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）に対するテンプレートとして用いる。プライマーセットを用いて、胎児型ＲＢＣ中で通常発現しているヘモグロビン転写物を増幅する。陽性対照からのｍＲＮＡも単離する。インビトロでｃｔｌｔ－ＨＳＣから産生されたヒトＲＢＣ及びその前駆細胞は、成人型グロビン遺伝子を発現していることが期待される。ｍＲＮＡの結果は、モノクローナル抗体及びＦＡＣＳ分析を用いることによって確認する。
以前に説明されているように、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣ中のヘモグロビンタンパク質の存在を、パーフュージョンクロマトグラフィ及びＨＰＬＣで確認する（Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５，１２６～３２，１９９０）。上記のインビトロ培養により得られたＲＢＣを回収し、０．９％ ＮａＣｌで３回洗浄し、その後、９倍量の水に懸濁してサポニンで溶解し、６００×ｇの遠心分離によって清浄化する。以前に説明されているように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｍｎｉｆｌｅｘ）を用いてグロビンの質量スペクトルを得る（Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ ３４，１９９～２０３，１９９０）。ＺｉｐＴｉｐｓをＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入し、Ｃ１８及びＣ４樹脂を充填して、それぞれペプチド及びタンパク質のＭＳ分析のために溶液を調製する。シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）及びシナピン酸（ＳＡ）を、それぞれペプチド及びタンパク質のマトリックスとして用いる。一定分量（１．３ｍＬ）のマトリックス溶液（０．１％ ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液１ｍＬ中、３～１０ｍｇのＣＨＣＡ又はＳＡ）を用いて、ＺｉｐＴｉｐｓからペプチド／タンパク質を溶出し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦターゲットにスポットする。３３７ｎｍの窒素レーザーパルスを備える、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔシリーズ１２００ ＨＰＬＣモジュール、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ Ｃｈｉｐインターフェース、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５１０ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ飛行時間型質量分析計）を用いて、サンプルを分析する。ｍ／ｚ１２３６２のハトシトクロムｃ（cyctochrome c）、ｍ／ｚ１６９５２のアポミオグロビン、及びｍ／ｚ３９２１２のアルドラーゼ（adolase）（ウサギ筋肉）の混合ピークを使用して、外部校正を実施する。
胎児型ＲＢＣで通常発現しているグロビン遺伝子のｍＲＮＡレベルについても調べ、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣで発現しているグロビン遺伝子と比較する。
実施例１３：ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの酸素結合特性の解析
以下の実施例は、ＲＢＣの酸素平衡曲線を測定することによる、実施例９で産生されたヒト赤血球（ＲＢＣ）で発現しているヘモグロビンタンパク質の機能特性について記載する。
酸素平衡曲線は、以前に記載されているようなものである（Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ ３４，１９９～２０３，１９９０；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，３８８～９０，１９７０；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １９，２６２９～３５，２００５）。使用される方法は、二重波長分光光度計（Ｈｅｍｏｘ ａｎａｌｙｚｅｄ、ＴＣＳ）を用いる連続法である。ＲＢＣを、１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭビス－トリス緩衝液（３７℃でｐＨ ７．４）中に懸濁する。１ｍｍの光学セル中の溶液の閃光光分解によって、ヘモグロビンの結合特性を調べる。簡潔にいえば、以前に記載されているように、５３２ｎｍにおいて１０ｎｓのパルスで光分解後、４３６ｎｍにおいてＣＯの細胞内ヘモグロビンテトラマーへの再結合速度を解析する（Ｈｏｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ ３４，１９９～２０３，１９９０；Ｍａｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７，３８８～９０，１９７０；及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １９，２６２９～３５，２００５）。
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの酸素結合特性も解析する。
実施例１４：ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの細胞形状と柔軟性の解析
以下の実施例は、ＲＢＣの柔軟性を測定することによって、実施例９で産生されたヒト赤血球（ＲＢＣ）が伸長でき、インビボの微小血管系において機能できるかどうかの判定について記載する。
以前に記載されているように、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣ及び末梢血から得られた初代ＲＢＣの変形性を調べる（Ｋａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５，２００８）。簡潔にいえば、実施例９に記載のインビトロｃｔｌｔ－ＨＳＣ培養液、及び健康成人の末梢血から得られたＲＢＣ調製物を、白血球除去フィルター（Ｌｅｕｃｏｌａｂ ＬＣＧ２、Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）に通す。次に、除核細胞をｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ekacytometry）で調べる。ＲＢＣを４％ポリビニルピロリドン溶液に懸濁し、続いて、ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ektocytometer）（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ，Ｂａｙｅｒ）中で増加する浸透勾配（６０～４５０ｍｏｓＭ）に曝す。この設定でのＲＢＣのレーザー回折の変化を記録する。光度測定により、変形性指数（ＤＩ）と称されるシグナルが生じる。ＤＩ曲線を解析すると、一定で加えられた１７Ｐａ（１７０ダイン／ｃｍ２）の剪断応力における、モル浸透圧濃度に応じた細胞膜の動的変形性の測定値が得られる。ＤＩの最大値は細胞の平均表面積に関係する。
実施例１５：ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの寿命の解析
以下の実施例は、実施例９で産生されたヒト赤血球（ＲＢＣ）が初代ヒトＲＢＣに相当するかを確認するため、それらの平均未損傷寿命について記載する。初代ヒトＲＢＣの平均寿命は１２０日間と推定されている。末梢血から採取されたＲＢＣの世代にばらつきがあるため、臨床用途におけるＲＢＣ濃縮物の貯蔵寿命は通常２８日間である。インビトロでのＲＢＣの同調産生能は、臨床用途においてＲＢＣ濃縮物の貯蔵寿命を著しく延長できると考えられる。
いくつかの実施形態では、赤血球は、本明細書に記載する方法を用いて７～３０日間にわたって産生される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法を用いて産生される赤血球は、同日又は同日付近に、例えば、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、若しくは２８日目、又はその付近に回収される。その後、本明細書に記載するものを含む既知の方法を用いて、赤血球の長期間の生存率について評価する。
いくつかの実施形態では、赤血球は赤血球保存培地で維持される。いくつかの実施形態では、赤血球保存培地は、Ｂｃｌ－２、任意にＰＴＤ－Ｂｃｌ－２を更に含む。Ｂｃｌ－２（任意にＰＴＤ－Ｂｃｌ－２）は、最初にボーラスで供給されてもよく、持続的に供給されてもよく、又は、間欠的に（例えば、２４時間毎、４８時間毎、７２時間毎、９６時間毎など）供給されてもよい。供給されるＢｃｌ－２の濃度は、０．５μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ、又はそれ以上を含んでよい。いくつかの実施形態では、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、又は５０μｇ／ｍＬのＢｃｌ－２（任意にＴＡＴ－Ｂｃｌ－２）を保存培地に供給してよい。その後、本明細書に記載するものを含む既知の方法を用いて、赤血球の長期間の生存率について評価する。
ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの平均未損傷寿命を判定するため、フローサイトメトリーで定量化でき、測定できる、３つの基準を用いる。第１には、既知の初期数からの減少率を測定するため、ある時間において培養液中に存在する生存ＲＢＣ数を計数する。第２には、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの表面上のＣＤ４７レベルを測定する。第３には、ｃｔｌｔ－ＨＳＣ由来ヒトＲＢＣの表面上に露出しているホスファチジルセリン（ＰＳ）レベルを測定する。フローサイトメトリーによる方法を用いて３つの基準全てを測定する。ある特定の時点における培養液中に存在する生存除核ＲＢＣ数を確認するため、前方及び側方錯乱特性を生体染料（ＬＤＳ－７５１）と組み合わせて使用する。ＲＢＣ表面上に存在するＣＤ４７レベルは、蛍光色素ＡＰＣと結合させたモノクローナル抗体を用いて測定する。ＲＢＣの表面上に露出しているＰＳレベルは、以前に記載されるようにアネキシンＶ－ＦＩＴＣを用いて測定する（Ｈｏｌｏｖａｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４８，１６５８～６８，２００８）。
実施例９に記載されるように、ＩＬ－３及びＥＰＯの存在下でｃｔｌｔ－ＨＳＣの培養液を作る。ＲＢＣは、培養８～１０日目にまず出現する。ｃｔｌｔ－ＨＳＣ培養液からＲＢＣを回収し、白血球除去フィルター（Ｌｅｕｃｏｌａｂ ＬＣＧ２、Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ）を通す。健康な匿名ドナーから初代ヒトＲＢＣを得る。両細胞をＳｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中で培養液とし、培養液を３７℃で維持する。一定分量の細胞を更に、ＲＢＣ濃縮物の保存に通常使用されるクエン酸緩衝液中で４℃にて保存する（Ｌａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ４７，２２４２～９，２００７）。各条件を、１０１０個の細胞を用いて証明する。
いずれの供給源からのＲＢＣの未損傷生存率を決定するため、４日毎に一定分量を取り出し、細胞を生体染料（ＬＤＳ－７５１）、抗ヒトＣＤ４７－ＡＰＣ、及びアネキシンＶ ＦＩＴＣで染色する。次に、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて細胞を分析する。特定の条件において生存細胞が残らなくなるか、１２０日間のうち、最初に来る日まで、継続的に一定分量について分析する。Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ培地中３７℃にて維持されるＲＢＣ培養液は、７日毎に培地を再補充する。
実施例１６：５－ＦＵ処理した骨髄からのＲＢＣ分化法の比較
以下の実施例は、マウス骨髄からの赤血球産生について記載する。
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓ ＃ ００３５４８）マウスに、２００μＬのダルベッコＰＢＳ中５ｍｇの５－フルオロウラシル（Ｇｅｎｅｒａ Ｍｅｄｉｘ Ｃａｔ ＃ ＮＤＣ１０１３９－０６３－１１）を静脈内投与する。５日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を回収する。
回収した骨髄細胞を沈殿させ、５ｍＬの無菌ＴＡＣ緩衝液（１３５ｍＭ ＮＨ４ＣＬ、１７ｍＭトリスｐＨ ７．６５）に再懸濁して、赤血球を溶解する。ＴＡＣ緩衝液中で１～２分間細胞を静置し、続いて、１２００ＲＰＭで５分間細胞を遠心沈殿する。細胞を２５ｍＬのＤ１０培地で洗浄する。細胞ペレットを、１０ｍＬのＢＭ培地（９０ｍＬの熱失活済みＦＢＳ、６ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １５１４０）、６ｍＬのＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １１１４０）、６ｍＬのＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ ２５０３０）、６ｍＬのＨｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １５６３０）、及び６０ｍＬのサイトカイン混合物（ＩＬ３、ＩＬ６、及びＳＣＦ）を含む５００ｍＬのＤＭＥＭボトル）に再懸濁する。
これら再懸濁した細胞を計数し、１ウェル当たり細胞１×１０６個／培地１ｍＬの密度で２４ウェル多穴ディッシュのウェルに播種する。５ＦＵ処理がうまくいった場合、未処理マウスでは１０×１０＾６個であるのに対して、各マウスのＢＭ細胞の収率は１～１．２×１０＾６個であることに留意されたい。
培地１ｍＬを含む各ウェルを、２０μＬのヒト血清アルブミン（Ｇｒｉｆｏｌｓ ＮＤＣ ６８５１６－５２１６－２）で希釈した５単位のＴＡＴ－ＭＹＣ及び５単位のＴＡＴ－Ｂｃｌ２で処理をする。培地を２日毎に交換し、サイトカイン及びＴＡＴ－融合タンパク質を新しくする。１４～１７日辺りから、Ｓｃａ－１×ｃＫｉｔ集団が培養液中で優勢になり始める。
６穴プレートの１ウェル当たり、２×１０５個のＳｃａ－１×ｃＫｉｔ細胞を播種する。ＢＭ培地をＲＢＣ分化培地＃１（１５％の熱失活済みＦＢＳ、１０％のＩＬ３含有培地、及び１００単位／ｍＬのＥＰＯ、１００ｍＭのデキサメタゾン、及び２５μｇ／ｍＬのホロトランスフェリン（Holo-Tranferrin）を補充したＩＭＤＭ）に交換する。検査ウェルを区別するため、次の検査用融合タンパク質、すなわち、５単位／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ、５単位／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ－２、又は、５単位／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ及び５単位／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の両方を添加する。
最初の６日間は、ＲＢＣ分化培地＃１及び融合タンパク質を２日毎に新しくする。次に、ＲＢＣ培地＃１をＲＢＣ培地＃２（１５％の熱失活済みＦＢＳ、１０％のＩＬ３含有培地、及び１００単位／ｍＬのＥＰＯ、及び２５μｇ／ｍＬのホロトランスフェリンを補充したＩＭＤＭ）に交換する。ＲＢＣが出現するまで約９～１２日間、２日毎にＲＢＣ培地＃２及び融合タンパク質を交換し続ける。
図１７に示すように、赤血球分化中のＴＡＴ－Ｍｙｃの添加は（図１７Ｃ）、未処理対照（図１７Ａ）、ＩＬ３及びＥＰＯだけでの分化（図１７Ｂ）、又はＩＬ３及びＥＰＯとＴＡＴ－Ｂｃｌ－２添加（図１７Ｄ）、又はＴＡＴ－Ｂｃｌ－２とＴＡＴ－Ｍｙｃの組み合わせ（図１７Ｅ）と比較して、赤血球の産生数と割合の増加につながる。
実施例１７：マウス赤血球のペイロード
５ＦＵ濃縮化骨髄由来ＨＳＣを上記のように回収する。マウスを５ＦＵで処理した５日後に細胞を回収し、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＳＣＦ、並びにＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含む培養液に入れる。培養の最初の２日間、ｐＭＳＣＶ－ｈＣＤ１２２－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ又はｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰのうち１つ又は２つ以上を用いて、レトロウイルスによって細胞に形質導入を行う。形質導入後、細胞を、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を含む培地中で更に１４日間増殖させる。
表面のｃ－ｋｉｔ、ｓｃａ－１、系統マーカー（Ｂ２２０、ＣＤ３、ｔｅｒ－１１９、Ｍａｃ－１、Ｇｒ－１）レベル、並びにＧＦＰ発現及び表面ｈＣＤ１２２について、ＦＡＣＳによって細胞の特徴を明らかにする。以前に記載されるように、ＧＦＰ及びｈＣＤ１２２も発現している増殖したマウスＬＳＫ集団を、次に、ＩＬ－３、ＥＰＯ、及び低濃度のＴＡＴ－ＭＹＣを含む培地を用いるＲＢＣ分化条件に切り替える。１４～２８日後、培養液を連続して観察し、以前に記載されるように、ＣＤ７１、ＧＰＡ、成人型及び胎児型ヘモグロビン、並びにＧＦＰ及びｈＣＤ１２２の発現の特徴を明らかにする。
実施例１８：生物学的に活性なＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２融合タンパク質の作製
非構造化ループドメインを欠いている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１５，１６２～７０）、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）と、ヒトＭＹＣのＯＲＦ又は切断型ヒトＢｃｌ－２のいずれかを有する融合タンパク質を作製した。組み換えタンパク質は、Ｖ５ペプチドタグ及び６－Ｈｉｓタグもコードしており、検出及び精製を促進した（図１８Ａ）。ＴＡＴ－ＭＹＣ融合タンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、図２４に示す。ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２Δ融合タンパク質のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を、図２５に示す。
ｐＴＡＴ－Ｍｙｃ－Ｖ５－６×Ｈｉｓ（ＡｍｐＲ）及びｐＴＡＴ－Ｂｃｌ２Δ－Ｖ５－６×Ｈｉｓ（ＡｍｐＲ）：ＨＩＶのインフレームＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）をコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトｃＭｙｃ又はヒトＢｃｌ２をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、プラスミドを作製した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ１０１／Ｄ－Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃ ２００５２１－５）を用いて、ＢＣＬ－２コード配列から非構造化ループ（Ａ．Ａ．＃２７～８０）を取り出した。
タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ内で合成し、均一になるまで精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びクマシー染色により、我々の実験で用いた最終産物の純度が明らかとなった（図１８Ｂ）。ｐＴＡＴ－Ｍｙｃ－Ｖ５－６×ＨｉｓでＢＬ２１－ＳＴＡＲ（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３７℃において３時間、タンパク質を誘導した。細胞を、溶解用緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスｐＨ ７．０まで、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．２）中で溶解した。溶解物を６Ｍ尿素で希釈し、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０にした。溶解物を、室温にて１時間、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（５００単位）で処理し、１２，０００ＲＰＭで６０分間、遠心分離によって清浄化し、２２μＭのフィルターを通した。Ｍｙｃ－Ｖ５－６×Ｈｉｓを、ＧＥ ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣを用いてニッケルアフィニティカラム（ＧＥ）で精製した。Ｍｙｃ－Ｖ５－６×Ｈｉｓを、透析用緩衝液（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に透析することによってリフォールディングした。精製タンパク質をＡｃｔｉｃｌｅａｎ Ｅｔｏｘカラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ）に通すことによって、エンドトキシンを減少させた。
Ｂｃｌ２Δ－Ｖ５－６×Ｈｉｓタンパク質を上記のように誘導した。細胞を、１Ｌの誘導タンパク質当たり、５００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬのロイペプチン、０．０１５単位／ｍＬのアプロチニン、５μＭの鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）を補充した、５０ｍＬの溶解用緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ ＫＣＬ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、直ちに氷上に１時間置いた。細胞を、２分間ずつ２回、氷上で超音波処理した（デューティー比＝５０％、出力＝５）。溶解物を、１２，０００ＲＰＭで６０分間、遠心分離によって澄明にし、０．２２μＭのフィルターを通した。Ｂｃｌ２Δ－Ｖ５－６×Ｈｉｓをニッケルアフィニティカラム（ＧＥ）で精製し、上述のようにエンドトキシンを除去した。
実施例１９：ＴＡＴ－融合タンパク質の適切な局在性の確認
融合タンパク質は、適切な細胞内区画（図１８Ｃ）に局在した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、６ウェルプレート中でカバーガラス上に播種し、３０～４０％のコンフルエンスまで増殖した。各ウェルを、１０μｇ／ｍＬのＴＡＴ－Ｍｙｃ若しくはＴＡＴ－Ｂｃｌ－２で形質導入し、又は陰性対照として処理しなかった。タンパク質形質導入の２時間後、細胞を、４％パラホルムアルデヒド－ＰＢＳ中で１０分間室温（ＲＴ）にて固定した。細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補充したＰＢＳ中で、ＲＴにて３分間透過処理した。Ｖ５マウスモノクローナル抗血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＢＳ－１％ ＢＳＡで希釈したもの（１：１，０００）で、細胞を４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１２１）と共に３０分間インキュベートした。カバーガラスを、５０％グリセロールの１０μＬの液滴と、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔと共に、スライドガラス上に乗せた。Ｚｅｉｓｓ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１蛍光顕微鏡で画像を得た。
ＴＡＴ－Ｍｙｃは、迅速に初代ヒトＨＳＣの核に局在した（図１８Ｄ）。ＴＡＴ－融合タンパク質は、ＨＳＣ中で７２時間後に完全に分解される（図１８Ｅ）。胎児臍帯血細胞に、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２Δを１時間形質導入し、その後３回ＰＢＳで洗浄した。形質導入２時間後、５×１０６個の細胞を回収し、核及び細胞質画分を単離した。続く５日間、２４時間毎に細胞（５×１０６個）を回収した。核及び細胞質タンパク質を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ２、３ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．５％ ＮＰ４０に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と共に沈殿させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続き、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ヒトβ－アクチン（ａｂｃａｍ）、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ又はヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロットによって検査した。
実施例２０：ヒト臍帯血由来ＨＳＣのＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２との増殖
地元の臍帯血バンクが廃棄したサンプルから、新鮮な臍帯血細胞を入手した。ヒト細胞を全て匿名化し、ＩＲＢの監視を免除した。臍帯血は、Ｏ＋、Ｏ－、Ａ＋、Ａ－、Ｂ＋、Ｂ－、及びＡＢ＋を含んでおり、これらの全てはほぼ同じ増殖特性を示した。
総臍帯量を２０ｍＬの一定分量に分け、ＰＢＳで１：１に希釈した。希釈した臍帯血（２０ｍＬ）を、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃ １７－１４４０－０３）に静かに重層した。細胞を９００×ｇで６０分間遠心した。ガラス製ピペットでバフィーコートを除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＦＣＢ培地（１０％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、３０ｍＬのＳＣＦ、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地、並びに、３０ｍＬのＴＰＯ、ＦＬＴ３－Ｌ、及び上記ＧＭ－ＣＳＦを含有する培地を補充したイスコフ培地（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。胎児臍帯血（ＦＣＢ）細胞に添加する直前、ＦＣＢ培地に、５μｇ／ｍＬの組み換えＴＡＴ－Ｍｙｃ、及び１０μｇ／ｍＬの組み換えＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を更に補充した。増殖期間中、３日毎に培地を交換した。
サイトカイン混合物は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＳＣＦ、及びＧＭ－ＣＳＦを含んでおり、これら６つのサイトカインを組み合わせる以前に報告された培地（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４，２４５６－６５）と、並びに、組み換えＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を添加することによって異なっている。インビトロで増殖させたヒトＨＳＣの表面表現型を評価すると、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の存在下で長期間培養した後に、ヒトＨＳＣがその表面特性を維持していることがわかった（図１９Ａ）。この条件群は、培養１４日間でＣＤ３４＋細胞の数が８６．４倍に上昇し、培養２１日間で未分画臍帯血由来のヒトＣＤ３４＋細胞の数が１０３．８倍に上昇する結果をもたらした（図１９Ｂ）。
実施例２１：ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２で増殖させたヒトＣＢ ＨＳＣは、インビトロ及びインビボで生物学的に活性である
インビトロで増殖させたヒトＨＳＣを、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にプレーティングし、特定のコロニータイプを生じさせる能力について調べた。インビトロで増殖させたヒトＨＳＣは、ＣＦＵ－Ｇ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－ＧＭ及びＢＦＵ－Ｅコロニーを生じさせることができる（図１９Ｃ及び１９Ｄ）。加えて、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の存在下で増殖したＨＳＣの表面表現型は、培養中保存されていたが、これらの条件下では、コロニー形成単位の量が顕著に濃縮された（図１９Ｄ）。Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の存在下で増殖したＣＤ３４＋細胞は、新たなＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍ、ＣＦＵ－Ｇ及びＣＦＵ－ＧＭコロニーを生じさせることもできたが、一方、培地のみで培養されたＣＤ３４＋細胞は新たなコロニーを生じさせなかった（図１９Ｅ）。
インビトロで増殖したヒトＣＤ３４＋細胞の、インビボで成熟ヒト造血性系統を生じさせる能力を検査する実験のため、レシピエントとしてＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ－／－マウス（ＮＳＧ）マウスを使用した。これは、この目的で有用な、確認されたマウスモデルである（Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８，６１４５～５５．）。
胎児臍帯血細胞（ＦＣＢ）を、投与直前に１８０ラドの照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ－／－マウス（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に投与した。増殖したＦＣＢをＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳにおいて尾静脈から投与した。移植８週間後、マウスの尾静脈から出血させ、抗ヒトＣＤ３（ｈＣＤ３）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３００３１２）、抗ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３０２２０８）、及び抗ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３０４０２８）を用いて、フローサイトメトリーによって再構成について評価した。
１×１０７個の未分画臍帯血細胞を用いて、ＮＳＧキメラマウス中で産生されたヒトＣＤ４５＋を発現するＴ及びＢ細胞が、短時間で成長することが観察された。しかしながら、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に１４日間培養することによってインビトロで産生された、１×１０６個のタンパク質を形質導入した長期（ｐｔｌｔ）－ＨＳＣを誘導すると、異種キメラＮＳＧマウスにおいてヒトＣＤ４５＋細胞がより高頻度であるという結果となった。加えて、ヒトＣＤ４５＋細胞は、移植後２０週間までマウスの末梢血中に観察できた（図２０Ａ）。ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ ＨＳＣは骨髄中に見られ（図２０Ｂ）、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋及びヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋リンパ系細胞は脾臓中に見られ、ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋リンパ系細胞は異種キメラマウスの胸腺中に見られた。
異種キメラＮＳＧマウスの脾臓由来のヒトＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞を、ＣＦＳＥで標識し、ヒトＣＤ４０及びＩｇＭに対するモノクローナル抗体で活性化した。７２時間目に、フローサイトメトリーでＣＦＳＥの希釈について細胞を分析した。図２０Ｃは、異種キメラＮＳＧマウスにおいてインビボで発生したヒトＢ細胞の増殖特性を示す。
異種キメラＮＳＧマウスの骨髄由来のヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ ＨＳＣを用いて、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍに播種した。これらの細胞は、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔプレートにおいてコロニーを生じ（図２０Ｄ）、一部のコロニーは、連続して再プレーティングした後でも観察できた（図２０Ｅ）。両方の場合においてコロニー数は、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に１４日間培養されたヒト臍帯血細胞で再構成されたＮＳＧマウスの方が、新鮮な未操作のヒト臍帯血細胞で再構成されたＮＳＧマウスで観察された細胞よりも顕著に高かった。
加えて、Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物中において、インビトロで予め増殖させた１０６個の臍帯血細胞（黒四角）を移植された異種キメラマウスコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞（図２０Ｆ）及び脾臓細胞（図２０Ｇ）のＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。
実施例２２：ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２によるヒトＧ－ＣＳＦ動員済み末梢血ＨＳＣの増殖
自家ＨＳＣ移植のためにＧ－ＣＳＦ動員を受けた５人の患者の浄化血液１ｍＬから、Ｇ－ＣＳＦ動員細胞を入手した。全てのＧ－ＣＳＦサンプルを再識別し、これらの試験に用いた細胞に関する更なる識別情報を関連付けなかった。１０ｍＬのＦＣＢ培地に細胞を滴下した。この細胞をＦＣＢ培地で２回洗浄し、１０ｍＬ量中、５μｇ／ｍＬの組み換えＴＡＴ－Ｍｙｃ及び１０μｇ／ｍＬの組み換えＴＡＴ－Ｂｃｌ－２で処理した。細胞（５×１０６個）を、Ｇ－Ｒｅｘ １００細胞増殖用容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）に、製造業者の推奨に従って播種した。
この細胞を、サイトカインにＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２を加えた培地中で１４日間増殖させた。増殖したＨＳＣのＦＡＣＳ特性は、ｈＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８ｈｉ、ＣＤ１３３＋の、異なった細胞集団を示す（図２１Ａ）。細胞の増殖速度を図２１Ｂに示す。
成人型ＧＣＳ－Ｆで動員したＨＳＣの増殖したものを、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍにプレーティングし、インビトロでの分化能の特徴を確認した。骨髄赤血球分化を支持する培地において通常見られる４種類のコロニータイプが観察され（図２１Ｃ）、これらのコロニータイプのうち一部は、連続して再プレーティングしても見られた。
増殖した成人ＨＳＣは、致死量以下で照射されたＮＳＧマウスを再構成することができた。図２１Ｄは、骨髄１２週間前に、１０６個の増殖したＧ－ＣＳＦ及びＴＡＴ－Ｍｙｃ／ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２動員ＨＳＣ（１つ目の図）、又は５×１０６個の新鮮な未操作臍帯血細胞（２つ目の図）のいずれかを移植されたＮＳＧマウスの骨髄における、ＣＤ４５＋染色のＦＡＣＳ分析を示す。
ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２と共に培養されたＧ－ＣＳＦ動員細胞によって作製されたＮＳＧ異種キメラマウスを安楽死させ、更なる分析のために骨髄、脾臓及び胸腺を採取した。増殖させた成人ＨＳＣで再構成した異種キメラＮＳＧマウス由来のリンパ系器官を分析すると、これらマウスの骨髄（図２１Ｅ；１つ目の図）中にヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏ細胞があり、脾臓（図２１Ｅ；２つ目の図）及び胸腺（図２１Ｅ；３つ目の図）中にヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋リンパ系細胞があることを示した。これらのデータを合わせると、ヒトＧ－ＣＳＦで動員した成人の血液から得られたＨＳＣ集団の増殖に成功できることが示される。
Ｔａｔ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２を加えたサイトカイン混合物中においてインビトロで増殖させた、増殖済みの１０６個のＧ－ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植した異種キメラマウスのコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞（図２１Ｆ）及び脾臓細胞（図２１Ｇ）のＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。
この方法は、現状の方法（Ｓｉｄｅｒｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９６，１２１３～２０．）による平均的な大きさの成人の移植に必要な、十分な数のＨＳＣを産生できる。
実施例２３：生物学的に活性なＭｙｃ融合タンパク質の作製
実施例１８に記載されるＴＡＴ－Ｍｙｃ融合タンパク質に加え、５種類のＭｙｃ融合タンパク質を作製し、同実施例に記載のものと同じ方法を使用して精製した。インフレームＮ末端ＰＴＤ－アミノ酸配列を含むフォワードプライマー及び終止コドンを除去したリバースプライマーを用いて、コード領域をＰＣＲ増幅することによって、プラスミドを作製した。その後、Ｃ末端Ｖ５エピトープ及び６×－ヒスチジン精製タグを含む、ｐＥＴ１０１／Ｄ－Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに、ＰＣＲ産物をクローニングした。図２２Ａは、実施例１８のＴＡＴ－Ｍｙｃと比較した、Ｍｙｃ融合タンパク質の図式表示を示す。それぞれにおいて、タンパク質形質導入（ＰＴＤ）を、Ｍｙｃポリペプチドの前又は後にインフレームで融合する。
タンパク質形質導入ドメインは、ＴＡＴ、ＥＰＴＤ、及びＶＰＲを含んだ。ＥＰＴＤは、Ｈｏ，Ａ．ら（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）６１：４７４～４７７）が選び取った最適化タンパク質形質導入ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ）である。ＶＰＲ形質導入ドメインは、Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら（Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ａｎ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＶＰＲ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ－１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）３２０（１）：１８～２６）によって同定された。
Ｍｙｃは、実施例１に記載されるポリペプチドのＯＲＦ、又は、以前Ｈｕａｎｇ，Ｚ．ら（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｙｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ Ｐａｋ－２．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００４）２４（４）：１５８２～９４）によって説明された３ＡＭｙｃ配列のいずれかとした。組み換えタンパク質は、Ｖ５ペプチドタグ及び６－Ｈｉｓタグもコードしており、検出及び精製を促進した（図２２Ａ）。
実施例２４：活性化Ｔ細胞の生存アッセイ
実施例２３に記載されるＭｙｃ融合タンパク質（ＴＡＴ－Ｍｙｃ、ＴＡＴ－３ＡＭｙｃ、ＥＰＴＤ－Ｍｙｃ、ＶＰＲ－Ｍｙｃ、及びＭｙｃ－ＶＰＲ）を、活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおいてＭｙｃの生物学的活性について調べた（図２２Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ．６ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスから脾臓を回収し、ワイヤーメッシュを通して機械的に分離した。赤血球を除去し、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（２ｃ１１）でＴ細胞を活性化した。細胞を、２４ウェル多穴ディッシュに、１ｍＬの培地中１ウェル当たり３×１０＾６個の細胞をプレーティングした。４８時間後、生細胞をＦｉｃｏｌクッション上に捕捉して洗浄し、２４ウェル多穴ディッシュに、１ウェル当たり１～１．５×１０＾６個の細胞をプレーティングした。ＰＴＤ－Ｍｙｃタンパク質を、Ｔ細胞に対して、０．５、１、５、１０、２５、又は５０μｇ／ｍＬでタイトレーションした。ＰＴＤ－Ｍｙｃタンパク質処理４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって生存率について評価した（前方×側方錯乱）。図２２Ｂにおいて示されるデータは、２５μｇ／ｍＬタンパク質処理のものである。
図２２Ｂに示されるように、ＴＡＴ－３ＡＭｙｃ以外の調べた構築物は全て、未処理対照よりも４８時間後のＴ細胞の生存率が高かった。しかしながら、実施例１に記載したＴＡＴ－ＭｙｃよりもＴ細胞の生存率が高い構築物は得られなかった。
同様の実験における、様々な濃度におけるＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の活性を、以下の表５に示す。Ｃ５７ＢＬ．６ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスの脾臓由来のＴ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（２ｃ１１）で活性化する。活性化後（４８時間後）、細胞を洗浄して約１～１．５×１０６個の細胞／ウェルでプレーティングし、融合タンパク質（ＴＡＴ－Ｍｙｃ又はＴＡＴ－Ｂｃｌ－２）を様々な濃度（０．５、１、５、１０、２５、又は５０μｇ／ｍＬ）で加えた。４８時間後、以下の表５に示すように、生細胞の割合をフローサイトメトリー（前方×側方散乱）で決定した。
Figure 0007291825000002
ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の両方で、並びに調べた全ての濃度において、いずれの融合タンパク質も含まずにインキュベートした細胞と比較して、細胞生存率及び／又は増殖が上昇する。
同じ方法を用いた別の実験において、図２３は、５０μｇ／ｍＬの融合タンパク質で処理した活性化Ｔ細胞に関するライブゲートのＦＡＣＳデータを示し、ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２及びＴＡＴ－Ｍｙｃを対照（ＴＡＴ－Ｃｒｅ又は未処理）と比較する。示されるように、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴＡＴ－Ｂｃｌ－２の処理両方によって、Ｔ細胞の生存及び／又は増殖を顕著に改善する結果が得られる。
実施例２５：Ｂｃｌ－２の評価
３Ｔ３細胞に、ＴＡＴ－Ｂｃｌ２を１時間形質導入し、その後３回ＰＢＳで洗浄した。形質導入２時間後、細胞をトリプシン処理し、数えてから、５×１０６個を回収した。核及び細胞質画分を単離した。続く５日間、２４時間毎に５×１０６個の細胞を回収した。核及び細胞質タンパク質を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ２、３ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０．５％ ＮＰ４０に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と共に沈殿させた。抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウエスタンブロットを調べた。
２４及び４８時間において、細胞質画分中にＴＡＴ－Ｂｃｌ２が観察された。そのシグナルは、形質導入７２時間後までに減少し始め、９６時間時点では見られなかった。
ＴＡＴ－Ｂｃｌ２、ＴＡＴ－Ｂｃｌ２Δ、ＥＰＴＤ－Ｂｃｌ２、ＶＰＲ－Ｂｃｌ２、ＶＰＲ－Ｂｃｌ２Δ、及びＶＰＲ－ＢｃｌＸＬを発現するプラスミドを作製した。ｐＰＴＤ－Ｂｃｌ２－Ｖ５－６×Ｈｉｓ（ＡｍｐＲ）：インフレームＰＴＤ（ＴＡＴ、ＥＰＴＤ又はＶＰＲ）タンパク質形質導入ドメインをコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトＢｃｌ２をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅することによって、プラスミドを作製した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ１０１／Ｄ－Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。Ｂｃｌ２を産生するため、ΔＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２００５２１－５）を用いて、ＢＣＬ－２コード配列から非構造化ループ（Ａ．Ａ．＃２７－８０）を取り出した。上記ＰＴＤ－Ｂｃｌ２と同様の方法であるが、Ｂｃｌ２ではなくヒトＢｃｌＸＬのｃＤＮＡを用いて、ＶＰＲ－ＢｃｌＸＬを作製した。
ＴＡＴ－Ｂｃｌ－２Δのアミノ酸配列及び核酸配列を図２５に示す。
実施例２６：ＨＳＣからの成熟ＲＢＣの産生
Ｄｙｎａｌ ＣＤ３４陽性選択ビーズを製造業者のプロトコールに従って用いて、ＣＤ３４＋細胞を動員済み末梢血から精製した。ＣＤ３４＋細胞を、１５％のヒト血漿、及び１００単位／ｍＬのペニシリンストレプトマイシンを補充したイスコフ培地中で、５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－ＭＹＣ及び５μｇ／ｍＬのＴＡＴ－Ｂｃｌ２と共に３７℃で１時間処理した。ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２で処理した後、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレットから培地を除去する。処理した初代ＣＤ３４＋細胞を、ＲＢＣ培地中にＩＬ３及びＥＰＯサイトカインが存在することによって、ＨＳＣから赤血球系細胞に向けて細胞プログラムを転換する、赤血球系分化培地（１５％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリンストレプトマイシン、１００単位／ｍＬのＥＰＯ、及び３．２ｎｇ／ｍＬのＩＬ３を補充したイスコフ培地）に播種する。
精製ＣＤ３４＋細胞をこのような単回ボーラスＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２で処理することによって、これらの分化培養を２つの方法で改善する。第１には、ＴＡＴ－融合タンパク質で処理された初代ＣＤ３４＋細胞は、分化中の生存率の改善を示し、より多くの成熟赤血球の産生をもたらす。第２には、ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２で処理され、ＲＢＣ分化培地に播種された初代ＣＤ３４＋細胞は、別の骨髄系細胞に分化するよりも、赤血球系統に分化することへの傾倒をより示す。
ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２処理後、ＣＤ３４＋細胞を、２４ウェル多穴ディッシュのウェルにおいて、上記ＲＢＣ分化培地中にウェル当たり５×１０＾４個の細胞を播種した。細胞を１１日間分化させた。６日目及び１１日目において、ＧＰＡ×ＣＤ７１赤血球系表面マーカーについて細胞を評価した（図２６Ａ）。ＴＡＴ－Ｍｙｃ及びＴａｔ－Ｂｃｌ２処理細胞は、７４％及び８７．６％のＧＰＡ×ＣＤ７１二重陽性細胞（図２６Ａ；それぞれ６日及び１１日）によって示されるように、赤血球系細胞に分化する。更に、これらの赤血球系細胞は、７８．８％の成人型ヘモグロビンのみを発現する細胞に対して、１９．８％の胎児型ヘモグロビンを発現する細胞（図２６Ａ；１１日、ｈＢ×ｆｈＢの図）によって示されるように、胎児型ヘモグロビンよりも成人型ヘモグロビンを発現し続ける。
１０日目において、ＨＥ染色のため、分化培養からのサンプルをカバーガラス上にサイトスピンしたものを示す。画像は、１０Ｘ及び２０Ｘの倍率である（図２６Ｂ）。中央部に暗く染色される核を欠く、赤く染色された細胞で示される、無核になったヘモグロビンを発現する細胞が見られた（図２６Ｂ）。

Claims (7)

  1. 造血幹細胞から成熟赤血球の集団を産生するために造血幹細胞を培養するための組成物であって、ＥＰＯと、細胞の生存及び／又は増殖を促進するＭＹＣポリペプチド又はその生物学的に活性な断片と、を含む組成物。
  2. 前記ＭＹＣポリペプチド又はその生物学的に活性な断片が、タンパク質形質導入ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＭＹＣポリペプチドが、ＴＡＴ－ＭＹＣである、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記造血幹細胞が、成長因子、ホルモン、又は、１つ若しくは２つ以上の疾患若しくは病気の診断若しくは治療に有用なその他ポリペプチドからなる群から選択される、１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記造血幹細胞が、成長因子、ホルモン、又は、１つ若しくは２つ以上の疾患若しくは病気の診断若しくは治療に有用なその他ポリペプチドからなる群から選択される１つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質をコードする、１つ若しくは２つ以上の導入遺伝子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. １つ若しくは２つ以上の関心対象の組み換えタンパク質の発現又は機能が、制御可能又は誘導可能である、請求項４又は５に記載の組成物。
  7. 前記成熟赤血球の集団が、４０％～１００％の細胞が無核化されている成熟赤血球の集団；４０％～１００％の細胞がＧＰＡを発現している成熟赤血球の集団；４０％～１００％の細胞が成人型ヘモグロビンを発現している成熟赤血球の集団；４０％～１００％の細胞がＣＤ７１の発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団；４０％～１００％の細胞が胎児型ヘモグロビンの発現レベルの低下を呈している成熟赤血球の集団からなる群から選択される１つ又は２つ以上の特徴を呈する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
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