CN109952313B - 生产患者特异性抗癌治疗剂的方法和其治疗方法 - Google Patents

生产患者特异性抗癌治疗剂的方法和其治疗方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种制备抗体治疗剂的方法，其包含：(a)从得自患者的至少一个实体瘤样品提供解离的细胞样品；(b)将解离的细胞样品加载到微流体装置中，该微流体装置具有流动区域和至少一个与流动区域流体连接的分离区域；(c)将至少一个B细胞从解离的细胞样品移动进入微流体装置中的至少一个分离区域，从而获得至少一个分离的B细胞；以及(d)使用微流体装置来识别产生能够与癌细胞结合的抗体的至少一个B细胞。癌细胞可以是患者自身的癌细胞。还提供了治疗患者的方法、标记或检测癌症的方法、包含抗体或其片段的工程化的T或NK细胞以及工程化的抗体构建体。

Description

生产患者特异性抗癌治疗剂的方法和其治疗方法
本申请是一项非临时申请，其基于35U.S.C.119(e)要求2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,341；2016年10月23日提交的美国临时申请号62/411,690；以及2016年10月24日提交的美国临时申请号62/412,092的权益，这些临时申请的公开内容均通过引用整体并入本文。
领域
提供了用于分离产生癌症特异性抗体的B细胞的方法，以及使用那些抗体和/或其衍生物的治疗方法。
背景
免疫疗法是使用患者自身的免疫系统帮助对抗癌症的迅速发展的领域。已经评估了多种免疫疗法策略，包括刺激患者自身的免疫系统以攻击癌细胞或施用来自外部来源的免疫系统组分。例如，设计用于体内攻击癌细胞的单克隆抗体已经单独施用或在基因工程化的构建体中施用。此外，已经研究了CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法。在该治疗方法中，基因工程化的T细胞在其表面上表达含抗体的融合蛋白，其将T细胞靶向所讨论的癌症并允许T细胞杀死癌细胞。因为CAR-T细胞可以永久地植入到患者体内，所以这种方法似乎特别有希望。然而，这些方法仍需要进一步改进。
单克隆抗体疗法或CAR-T疗法的关键问题之一是识别或设计一种抗体，该抗体将为所讨论的患者提供最大的益处，同时牢记患者在治疗开始之前或要求治疗成功之前可能有非常短的时间窗口，以防止显著的发病率和死亡率。
本发明的实施方案提供了识别抗体的解决方案，所述抗体将为所讨论的患者提供最大的益处，使研究调查所需的时间量的最小化并允许尽快开始治疗。
概述
根据本文的描述，制备抗体治疗剂的方法包括：
a)从得自患者的至少一个实体瘤样品提供解离的细胞样品；
b)将解离的细胞样品加载到具有至少一个分离区域的微流体装置中；
c)将至少一个B细胞从解离的细胞样品移动到微流体装置中的至少一个分离区域中，从而获得至少一个分离的B细胞；
d)识别至少一个分离的B细胞，其产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体。
本文所述的该方法和其他方法提供了识别B细胞的优点，在一些实施方案中，患者自身产生该B细胞，以靶向患者所患的癌症类型。通过使用微流体装置来分离这些抗体，可以以相对快速的测定形式平行测试多个B细胞，并且可以识别、培养和测序感兴趣的特定B细胞(或用于产生杂交瘤)。这使得研究人员能够产生患者特异性抗癌抗体，其可以作为单克隆抗体或其片段或者基因工程化的构建体(如融合蛋白或CAR-T治疗剂)施用，或用于检测方法等。
另外的实施方案包括治疗患有癌症的患者的方法，包括用本文的方法所产生的抗体或其片段来治疗患者。还可以使用与可检测的标志物缀合的抗体或其片段来标记或检测患者中的癌症。作为用于治疗的组合物，可以提供包含在其表面上展示(display)的抗体或其片段的工程化的T细胞，以及包含至少本文所识别的抗体的重链CDR、至少重链和轻链CDR、至少重链可变区或至少重链和轻链可变区的工程化的抗体构建体。
另外的目的和优点将部分地在下面的描述中给出，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践来学习。通过在所附权利要求中特别指出的要素和组合将实现和获得这些目的和优点。
应当理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对权利要求的限制。
包含在本说明书中并构成其一部分的附图示出了一个(几个)实施方案，并与说明书一起用于解释本文所述的原理。
附图的简要说明
图1A示出了根据一些实施方案的微流体装置和与微流体装置一起使用的包括相关控制设备的系统的示例。
图1B和1C分别示出了根据一些实施方案的微流体装置的垂直和水平横截面视图。
图2A和2B分别示出了根据一些实施方案的具有分离坞的微流体装置的垂直和水平横截面视图。
图2C示出了根据一些实施方案的隔离室的详细的水平横截面视图。
图2D示出了根据一些实施方案的具有分离坞的微流体装置的局部水平横截面视图。
图2E和2F示出了根据一些实施方案的隔离室的详细的水平横截面视图。
图2G示出了根据一个实施方案的具有流动区域的微流体装置，该流动区域含有多个流动通道，每个流动通道与多个隔离室为流体连接。
图2H示出了根据一些实施方案的微流体装置的局部垂直横截面视图，其中基部的面向内的表面和盖的面向内的表面是经调节的表面。
图3A示出了根据一些实施方案的系统嵌套以及相关联的控制设备的具体实例，该系统嵌套被配置为与微流体装置可操作地耦合。
图3B示出了根据一些实施方案的用于控制微流体装置的系统的光具组。
图4示出了根据一些实施方案的用于识别表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体的B细胞淋巴细胞的示例性工作流程中的步骤。
图5A-5C描绘了包括多个微流体通道的微流体装置，每个微流体通道与多个隔离室为流体连接。每个隔离室含有多个小鼠脾细胞。图5A是微通道装置的一部分的明视场图像。图5B和5C是使用德克萨斯红滤光器获得的荧光图像。在图5B中，在实施例1中描述的抗原特异性测定开始后5分钟获得图像。在图5C中，在实施例1中描述的抗原特异性测定开始后20分钟获得图像。图5C中的白色箭头指向在测定中产生阳性信号的隔离室。
图6显示了来自Jurkat细胞的各种部分的Western印迹。
图7显示了涂布有用抗CD3、抗CD45或抗Na/K-ATP酶抗体染色的Jurkat细胞膜部分的珠子。
图8显示了用与图7中相同的抗体染色的HEK293细胞涂布的珠子。
实施方案的详细描述
I.定义
本说明书描述了本发明的示例性实施方案和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、基板等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一要素之间有一个或多个中间要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、以下、以上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。
如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。
术语“一”意味着不止一个。
如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞；以及至少两个端口，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括至少一个微流体通道和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。
如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。
如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度在约50,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，约40到约150微米。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以包括具有以下任何配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。
如本文所用，术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以是例如微流体隔离室和微流体通道，或者是微流体隔离室的连接区域和分离区域。
如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如微流体隔离室和微流体通道之间的界面处，或者微流体隔离室的分离区域和连接区域之间的界面处。
如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。
如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本发明分离和收集的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞(如胚胎、卵母细胞、卵子、精子细胞、从组织中解离的细胞、真核细胞、原生生物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、免疫细胞、杂交瘤、培养细胞、来自细胞系的细胞、癌细胞、感染细胞、转染和/或转化的细胞、报告细胞、原核细胞等)；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)(如Ritchie et al.(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中所述)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附着于细胞的微珠、脂质体涂布的微珠、脂质体涂布的磁珠等)。珠子可以进一步具有共价或非共价连接的其他部分/分子，例如荧光标志物、蛋白质、小分子信号传导部分、抗原或能够用于测定的化学/生物物质。
如本文所用，术语“细胞”是指生物细胞，其可以是植物细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)、细菌细胞、真菌细胞等。哺乳动物细胞可以是例如来自人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。
如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。术语“克隆细胞”是指相同克隆集落的细胞。
如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如2-20、4-40、6-60、8-80、10-100、20-200、40-400、60-600、80-800、100-1000或大于1000个细胞)。
如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
流体介质(fluidic media)的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。
短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，感兴趣的分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。
如本文关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、糖、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过装置时，这些组成处于变化中。
如本文所用，“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定并受限于介质流动的轨迹。因此，流动路径是微流体装置的扫描(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫描(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件为流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。
如本文所用：μm表示微米，μm3表示立方微米，pL表示皮升，nL表示纳升，μL(或uL)表示微升。
说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论的要素的任何组合。
II.制备抗体治疗剂的方法
可以使用包括以下步骤的方法制备抗体治疗剂：
a)从得自患者的至少一个实体瘤样品提供解离的细胞样品；
b)将解离的细胞样品加载到微流体装置中，所述微流体装置具有流动区域和至少一个与流动区域流体连接的分离区域；
c)将至少一个B细胞从解离的细胞样品移动到微流体装置中的至少一个分离区域中，从而获得至少一个分离的B细胞；和
d)识别至少一个分离的B细胞，其产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体。
这种识别抗体的方法可以以多种不同的方式实施，记住一个潜在的目标是在产生抗体的B细胞和对于需要治疗剂的患者构成问题的癌细胞之间具有关系。图4中概述了一个特定的方法400。
在某些情况下，该方法进一步包括从所识别的B细胞中确定成对的重链和轻链可变域抗体序列。例如，可以在产生与癌细胞结合的抗体的至少一个B细胞从微流体装置中输出之后进行测序。在其他情况下，该方法包括从至少一个分离的B细胞产生杂交瘤。如果确定了抗体序列，则该方法还可以包括产生抗体治疗剂，所述抗体治疗剂包含来自至少一个被识别的B细胞的一些或所有成对的重链和轻链可变域序列。例如，方法可以包括制备抗体或其功能部分，其包含来自至少一个被识别的B细胞的重链和轻链可变域序列的所有六个CDR。
A.解离的细胞样品的制备
在某些情况下，该方法包括从实体瘤获得样品的步骤。例如，如图4中的方法400的步骤410所示。实体瘤样品可以是肿瘤活组织检查，例如手术切除的活组织检查或细针抽吸物(FNA)。在一些情况下，肿瘤具有三级淋巴样结构，其可包含增殖的B细胞和/或B细胞囊泡。肿瘤可以是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症、神经系统癌症、肠癌、肺癌、黑素瘤或其他类型的癌症。在一些实施方案中，乳腺癌可以是髓样乳腺癌。在一些实施方案中，泌尿生殖系统癌症可以是起源于泌尿道例如肾脏(例如肾细胞癌)、输尿管、膀胱或尿道的癌症。在一些实施方案中，泌尿生殖系统癌症可以是男性生殖道的癌症(例如，睾丸癌、前列腺癌或者精囊、输精管或阴茎的癌症)或者女性生殖道的癌症(例如，卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌)。在一些实施方案中，神经系统的癌症可以是神经母细胞瘤。在一些实施方案中，肠癌可以是结肠直肠癌。在一些实施方案中，肺癌可以是间皮瘤。
在一些情况下，获得单个肿瘤样品。在其他情况下，获得多个肿瘤样品。在一种情况下，所有肿瘤样品来自同一患者。例如，可以使用来自患者的一个肿瘤样品(例如单个活组织检查)，或者可以使用来自同一患者的多个肿瘤样品(例如来自患者中同一肿瘤或不同肿瘤的多个活组织检查)。
在其他情况下，可以使用来自不同患者的肿瘤样品。例如，B细胞可来自第一患者，而癌细胞(例如，用作癌细胞相关的抗原的来源的癌细胞)来自第二患者。在这些模式中的一些中，B细胞来自希望治疗的患者。在这些模式中的一些中，癌细胞来自癌细胞系。如果样品来自不同的患者，则也可以保留产生抗体的B细胞与癌细胞相关的抗原之间的某种关系。例如，如果癌细胞相关的抗原不是来自同一患者的癌细胞，则在一些实施方案中，它们可以来自相同类型的癌症。在某些情况下，在微流体装置中使用的或以其他方式用于提供癌症相关的抗原的癌细胞表现出一种或多种标志物，其是患者所患的肿瘤类型的特征。例如，癌细胞可以具有一种或多种这样的标志物，其也存在于患者的肿瘤样品中。
在某些情况下，该方法包括处理肿瘤样品以产生解离的细胞样品的步骤。例如，如图4中的方法400的步骤420所示。解离的细胞样品可以包含至少一个从肿瘤(例如，肿瘤活组织检查或FNA)中解离的单细胞。在某些情况下，所有细胞都是单细胞形式。在其他情况下，一些细胞不是单细胞形式，而是保留了约2、3、4、5、6、7、8、9、10个细胞或更多个细胞的团块形式，而其他细胞是单细胞形式。解离的细胞样品包括以解离的形式在培养基中生长的癌细胞系。因此，细胞可以被主动解离(通过获得至少一个实体瘤样品并解离至少一个单细胞)或被动解离(通过获得先前已经解离或以解离形式生长的样品)。
解离可以以多种方式进行。例如，可以使用胶原酶加脱氧核糖核酸酶消化来解离肿瘤样品。还可以使用细胞解离器仪器例如来自Miltenyi Biotec的gentleMACSTM仪器来解离肿瘤样品。
在一些情况下，该方法还包括在加载之前对解离的细胞样品进行选择，以分离具有比原始解离的样品更高百分比和/或浓度的B细胞的部分。例如，如图4中的方法400的步骤430所示。如果需要，可以使用至少一种标志物从解离的细胞样品中选择B细胞，例如选自CD19、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA和GL7的那些标志物。替代地或另外地，可以进行负选择以除去非B细胞(例如，使用至少一种未在B细胞上表达的标志物)。例如，可以耗尽解离的细胞样品中的癌细胞(例如，使用癌细胞特异性标志物)和/或T细胞(例如，使用T细胞特异性标志物，例如CD3、CD4、CD8等)。在其他情况下，将解离的细胞样品加载到微流体装置中而不进行处理以富集B细胞。
无论是否处理解离的细胞样品以富集B细胞，将解离的细胞样品加载到微流体装置中。例如，参见图4中的方法400的步骤440。在一些情况下，可以将单个解离的细胞样品加载到微流体装置上。单个解离的细胞样品可以包含B细胞和其他类型的细胞(例如，癌细胞)。在其他情况下，可以在不同的时间加载(i)单个解离的细胞样品的分开的部分或者(ii)不同的解离的细胞样品(例如，各自单独和/或以不同的方式分开)。在一些情况下，可以处理解离的细胞样品以产生具有比原始样品更高百分比和/或浓度的癌细胞的部分。癌细胞部分可以是选择B细胞后剩余的部分，反之亦然。
如果需要，可以使用至少一种癌症特征性标志物从解离的细胞样品中选择癌细胞。在一些情况下，可以使用形态差异来分离细胞。癌细胞通常显示不规则的细胞大小(例如，更大的细胞大小或更小的细胞)、更大的细胞核、含有更多的DNA或含有核结构变化。在许多情况下，可以通过视觉和/或通过图像分析来辨别这些差异，这可以是自动化的。为了促进或增强这种分析，可以对解离的细胞样品进行核酸染色(例如，当用核酸结合染料染色时，癌细胞通常比正常细胞染色更明亮)或者对核膜、核仁和/或核基质相关的标志物染色。此类标志物的实例包括核纤层蛋白(例如，A-或B-型核纤层蛋白)、核膜蛋白(例如核纤层相关的蛋白，例如伊默菌素(emerin))、纤维蛋白、核孔蛋白(NUP，例如Nup153、Nup210等)、组蛋白和核基质蛋白(例如，p84))，其中任何一种都可以突出核结构的差异。
除了形态学差异之外，本领域中已知多种标志物可用于识别某些类型的癌细胞，包括但不限于：
对于乳腺癌，CD44、HLA-DR、Ki-67(或MK167)、醛脱氢酶1(ALDH1)和神经节苷脂GD2倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER2)和CD24倾向于在癌细胞中不存在或减少；ER-/PR-/HER2-/HLA-DR+可以被用于识别髓样乳腺癌；CD44hi/CD24lo/ALDH1hi或CD44hi/CD24lo/GD2hi可以被用于识别乳腺癌干细胞。
对于肾癌，C-反应蛋白、水通道蛋白-1(AQP1)、脂肪分化相关的蛋白(ADFP)、胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3(IGF2BP3或IMP3)、B7-H1(或PD-L1)和Ki-67(MK167)倾向于在癌细胞中存在和/或升高。
对于膀胱癌，核有丝分裂器蛋白(NMP22)、膀胱肿瘤抗原(BTA)和纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)、谷胱甘肽S-转移酶-μ(GST-μ)、前列腺素脱氢酶(PGDF)和角蛋白13倾向于不存在或相对于正常细胞减少；在基因水平上，p16肿瘤抑制基因或9p21基因座可能在癌细胞中缺失。
对于泌尿道上皮癌，补体因子H相关的蛋白(CFHrp)可能在癌细胞中表现出增加的水平和/或分泌；在核水平上，端粒酶逆转录酶(TERT)倾向于在癌细胞中表现出增加的mRNA表达。
对于子宫内膜癌，癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗原125(CA125)、癌抗原19.9(CA19.9)、癌抗原72.4(CA72.4)和癌胚抗原(CEA)倾向于在癌细胞中存在和/或升高。
对于卵巢癌，肿瘤相关的胰蛋白酶抑制剂(TATI)、癌抗原125(CA125)、Claudin5、人附睾蛋白4(epidydmis protein，HE4)、癌胚抗原(CEA)、VCAM-1和miR-181a倾向于在癌细胞中存在和/或升高；TATI、CA125和Claudin5已被联合用于诊断卵巢癌，如HE4和CA125任选地与CEA和VCAM-1已被联合使用那样；STAT1可以用于区分对化疗有反应和对化疗无反应的卵巢癌。
用于宫颈癌，人乳头瘤病毒(HPV)(例如，类型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、6、11、42、43和44)、p16INK4a和胰岛素样生长因子II mRNA结合蛋白3(IGF2BP3或IMP3)倾向于在癌细胞中存在和/或升高。
对于前列腺癌，前列腺特异性抗原(PSA)、肌氨酸(代谢物)、前列腺癌基因3(PCA3)和TMPRSS2:ERG融合产物倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而前列腺酸性磷酸酶、纤维蛋白原α链前体、胶原蛋白α-1(ΠΙ)、胶原蛋白α-1(I)、牛皮癣易感性1候选基因2蛋白、肝细胞癌相关的蛋白TB6、组蛋白H2BB、骨桥蛋白、聚合Ig受体、Na/K转运ATP酶γ、跨膜分泌组分和精液凝固蛋白1倾向于不存在或相对于正常细胞减少。
对于神经母细胞瘤，香草扁桃酸(VMA)、高香草酸(HVA)和铁蛋白的水平和/或分泌增加与癌细胞相关，且神经元特异性烯醇酶(NSE)、乳酸脱氢酶(LDH)和神经节苷脂GD2倾向于在癌细胞中存在和/或升高；在基因组水平上，染色体1p和11q的部分缺失和17q的一部分的复制与癌细胞相关。
对于结肠直肠癌，癌胚抗原(CEA)、癌抗原19-9(CA19-9)、结肠癌特异性抗原3(CCSA-3)、结肠癌特异性抗原4(CCSA-4)和B-Raf突变V600E倾向于在癌细胞中存在和/或升高；在基因水平上，结直肠癌细胞表现出微卫星不稳定性和各种K-Ras突变。
对于小细胞肺癌，神经节苷脂GD2倾向于在癌细胞中存在和/或升高；对于非小细胞肺癌，B-Raf突变V600E倾向于在癌细胞中存在；对于间皮瘤，钙视网膜蛋白、细胞角蛋白5/6和WT1倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(Ep-CAM)(例如，由MOC-31或Ber-EP4抗体所检测的)、Lewis Y血型(例如，由BG-8抗体所检测的)和B72.3抗体所检测的肿瘤相关的糖蛋白倾向于不存在或减少；相反，对于肺腺癌，CEA、Ep-CAM(例如，由MOC-31或Ber-EP4抗体所检测的)、Lewis Y血型(例如，由BG-8抗体所检测的)和由B72.3抗体所检测的肿瘤相关的糖蛋白倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而钙视网膜蛋白、细胞角蛋白5/6和WT1倾向于不存在或减少。
对于黑素瘤，人内源性逆转录病毒(HERV-K)、神经节苷脂GD2、B-Raf突变V600E、Hsp90、G蛋白信号传导调节因子1(RGS1)、骨桥蛋白、人表皮生长因子受体3(HER3)、核受体辅激活因子3(NCOA3)和微染色体维持复合物组分4和6(分别为MCM4和MCM6)倾向于在癌细胞中存在和/或升高，而抑制剂或生长蛋白3和4(分别为ING3和ING4)倾向于缺失或相对于正常细胞减少。
在一些情况下，可以使用至少两种癌症特征性标志物从解离的细胞样品中选择癌细胞。例如，两种或更多种标志物可以包括形态学标志物、至少一种阳性标志物(例如，在癌细胞中存在和/或升高的标志物)和/或至少一种阴性标志物(例如，不存在或相对于正常细胞减少的标志物)，或其任何组合。在某些模式中，B细胞(例如，记忆B细胞、血浆B细胞等及其组合)和/或癌细胞可以通过FACS从解离的细胞样品中选择。替代地或另外地，B细胞(例如，记忆B细胞、血浆B细胞等及其组合)和/或癌细胞也可以通过使用基于磁珠的分选而从解离的样品中选择。选择可以使样品富集表达CD27(或一些其他记忆B细胞标志物)的B细胞或表达CD138(或一些其他浆细胞标志物)的B细胞。选择可以是阳性的(例如，基于B细胞特异性或癌细胞特异性标志物)。或者，选择可以是阴性的。例如，可以使用本领域中公知的技术从解离的细胞样品中去除非B细胞类型，例如用DYNABEADSTM未接触的人B细胞试剂(Thermo Fisher)、B细胞分离试剂盒(Miltenyi)、RosetteSep人B细胞富集鸡尾酒(StemCell Technologies)等来处理样品。作为另一个实例，选择可以耗尽表达IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体、IgG抗体或其任何组合的B细胞样品。替代地或另外地，可以使用微流体装置选择B细胞和/或癌细胞，如下文进一步讨论的。
B.将B细胞装载到微流体装置中并在其中移动
通过使样品的细胞流过装置中的入口并进入流动区域，可以将解离的细胞样品(任选地如上文所述地分开)加载到微流体装置中。例如，图4中所示的方法400的步骤440提供将解离的细胞样品加载到微流体装置中。在一些实施方案中，流动区域包括流动通道(或微流体通道)，并且加载解离的细胞样品包括使细胞流入流动通道。
一旦将解离的细胞样品加载到微流体装置的流动区域(或流动通道)中，样品中的B细胞就可以被移动到微流体装置的分离区域中。例如，如(图4)方法400的步骤450所示，B细胞可以从流动区域(或流动通道)移动到一个或多个分离区域中，所述分离区域可以位于与流动区域(或流动通道)流体连接且通到该流动区域(或流动通道)的分离室内。B细胞可以是例如CD27+B细胞或CD138+B细胞。在一些实施方案中，B细胞是记忆B细胞。在其他实施方案中，B细胞是浆细胞。如本文一般性讨论的，B细胞的移动可以通过多种方式实现，包括使用重力(例如通过倾斜微流体装置)、诱导局部流体流动(例如通过压下或拉动位于邻近或接近分离区域的微流体装置的可变形表面)、施加介电电泳(DEP)力(例如通过光电镊子(OET))或其任何组合。
在一些情况下，在加载解离的细胞样品之前，该方法进一步包括用至少一种可检测的标志物来标记解离的细胞样品中的B细胞。标志物可以是B细胞特异性标志物，例如本文公开的任一种B细胞标志物(例如，CD19、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA、GL7等)。标志物可以有助于基于可检测的标志物的检测来选择B细胞用于移动，例如在通过施加DEP力移动B细胞的实施方案中。或者，可检测的标志物可以与非B细胞标志物结合，例如T细胞标志物或癌细胞相关的标志物。在这种情况下，可以基于它们缺乏可检测的标志物来选择B细胞用于移动。
装载到微流体装置的分离区域中的B细胞可以包括不同B细胞类型的混合物，例如记忆B细胞、浆细胞等。在一些实施方案中，可能需要选择浆细胞用于移动到分离区域中。在一些实施方案中，可能需要选择表达IgG型抗体的B细胞用于移动进入分离区域。
在一些情况下，无论是否所有分离区域都被加载，都只有一个B细胞被移动到每个分离区域中。在其他情况下，B细胞最初可以被合并到一个或多个分离区域中，然后分到单独的分离区域中(即，每个分离区域一个B细胞)。后一实施方案在筛选B细胞以产生与癌细胞结合的抗体时允许更大的通量。在每个分离区域中仅放置一个B细胞允许B细胞的克隆扩增，这可以促进成对的重链和轻链可变域序列的识别。
在某些实施方案中，在将癌细胞相关的抗原加载到微流体装置中之前，将B细胞加载到微流体装置中并移动到分离区域中。在其他实施方案中，在将癌细胞相关的抗原加载到微流体装置中并移入分离区域中之后，将B细胞加载到微流体装置中并移动到分离区域中。在其他实施方案中，将B细胞和癌细胞相关的抗原同时加载到微流体装置中(例如，作为包括B细胞和癌细胞的解离的细胞样品的一部分)。在一些实施方案中，一旦B细胞被加载到分离区域中，它们就保持在那里直到产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个B细胞被识别之后。
C.使产生抗体的B细胞与癌细胞相关的抗原接触
所公开的方法包括检测B细胞是否表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体的步骤。例如，参见图4中的方法400的步骤470。为了检测这种表达，必须允许被表达的抗体与癌细胞相关的抗原相互作用。
癌细胞相关的抗原可以是简单的或复杂的；抗原可以是蛋白质、糖基团或链上的表位、除蛋白质或糖之外的生物或化学试剂或者其任何组合；表位可以是线性的或构象的。与其在正常细胞上的表达相比，癌细胞相关抗原可以是唯一地识别癌细胞(例如，一种或多种特定类型的癌细胞)或在癌细胞上上调的抗原。通常，癌细胞相关的抗原存在于癌细胞的表面上，从而确保其可以被抗体识别。抗原可以与任何类型的癌细胞相关，包括可以在本领域已知的或本文描述的肿瘤中发现的任何类型的癌细胞。特别地，抗原可以与肺癌、乳腺癌、黑素瘤等相关。如本文所用，术语“与癌细胞缔合”当用于提及抗原时，意指抗原直接由癌细胞产生或由癌细胞和正常细胞之间的相互作用产生。
检测B细胞表达的抗体是否与癌细胞相关的抗原特异性结合可以在本文所述的微流体装置中进行。特别地，微流体装置可以包括具有流动区域(例如，微流体通道)和隔离室的壳体。隔离室可以包括分离区域和连接区域，该连接区域在分离区域和流动区域之间提供流体连接。隔离室可以具有约0.5nL至约5.0nl的体积，或其中的任何范围(例如，约0.5nl至约1.0nl，约0.5nl至约1.5nl，约0.5nl至约2.0nl，约1.0nl至约1.5n1，约1.0nl至约2.0nl，约1.0nl至约2.5nl，约1.5nl至约2.0nl，约1.5nl至约2.5nl，约1.5nl至约3.0nl，约2.0nl至约2.5n1，约2.0nl至约3.0nl，约2.0nl至约3.5nl，约2.5nl至约3.0nl，约2.5nl至约3.5nl，约2.5nl至约4.0nl，约3.0nl至约3.5nl，约3.0nl至约4.0nl，约3.0nl至约4.5nl，约3.5nl至约4.0nl，约3.5nl至约4.5nl，约3.5nl至约5.0nl，约4.0nl至约4.5nl，约4.0n1至约5.0nl，约4.5nl至约5.0nl，或由前述端点之一所限定的任何范围)。连接区域可以具有通常如本文所述的宽度Wcon(例如，约20微米至约100微米，或约30微米至约60微米)。分离区域同样可以具有通常如本文所述的宽度Wiso(例如，分离区域可以具有大于连接区域的宽度Wcon的宽度Wiso)。在某些实施方案中，分离区域的宽度Wiso为约50微米至约250微米。
流动区域、隔离室和/或隔离室的分离区域可以包括涂覆有涂层材料的至少一个表面，所述涂层材料促进表达抗体的B细胞(例如，记忆B细胞或浆细胞)的活力。如在本文中所使用的，“促进活力”意味着与未涂覆的等同表面相比，B细胞的活力在经涂覆的表面上更好。在某些实施方案中，流动区域、隔离室和/或分离区域具有多个表面，每个表面涂覆有促进B细胞活力的涂层材料。涂层材料可以是本领域已知的和/或本文所述的任何合适的涂层材料。涂层材料可以是例如包含亲水分子。亲水分子可以选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含糖基团的聚合物、包含氨基酸的聚合物及其组合。
流动区域、隔离室和/或隔离室的分离区域可以包括至少一个经调节的表面，其促进B细胞(例如，记忆B细胞或浆细胞)的活力。如在本文中所使用的，“促进活力”意味着与未经调节的等同表面相比，B细胞的活力在经调节的表面上更好。在某些实施方案中，流动区域、隔离室和/或分离区域具有多个经调节的表面，每个经调节的表面均能够促进B细胞的活力。经调节的表面可以包含共价连接的分子。共价连接的分子可以是本领域已知和/或本文公开的任何合适的分子，包括例如共价连接的亲水分子。亲水分子可以选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含糖基团的聚合物、包含氨基酸的聚合物及其组合。如本文所述，亲水分子可以形成共价连接的亲水分子的层。
检测表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体的B细胞可以包括将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中，使得抗原变得位于B细胞附近。将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中可以包括，例如，将包含癌细胞相关的抗原的流体介质流动到微流体装置的流动区域中，并在癌细胞相关的抗原位于B细胞的附近时停止流体介质的流动。B细胞“附近”的位置可以在B细胞的1毫米(mm)内(例如，在B细胞的750微米内、600微米内、500微米内、400微米内、300微米内、200微米内，在100微米内或50微米内)。
可以作为微物体的一部分来提供癌细胞相关的抗原，微物体可以是本领域已知的和/或本文描述的任何合适的微物体(例如，细胞、脂质体、脂质纳米筏或珠子)。因此，将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中可以包括将这样的微物体定位在B细胞所处的隔离室的连接区域附近或内部。或者，引入癌细胞相关的抗原可以包括将这样的微物体移动到B细胞所处的隔离室的分离区域中。
微物体可包含已从癌细胞中分离的抗原，例如在癌细胞膜制品中发现的膜相关的抗原。这种分离的膜相关的抗原可以与珠子缀合以产生在所公开的方法中使用的微物体。或者，微物体可以包含基本上纯的抗原(例如经纯化的蛋白质)。将抗原分子(例如经纯化的蛋白质、细胞膜制品等)与珠子缀合的方法是本领域已知的和/或在本文的实施例中描述。类似地，从癌细胞中分离抗原的方法是本领域已知的(参见，例如，Bachleitner-Hoffmannet al.(2002),J.Clin.Endocrin.&Metab.87(3):1098-1104；和He et al.(2016),Oncology Letters 12:1101-06)。因此，癌细胞相关的抗原的分离可以通过本领域已知的多种方法进行。在其他实施方案中，微物体可以是细胞，例如癌细胞(例如，从患者的样品中分离的)或癌细胞系的细胞。
如上文所述，可以通过使微物体流过装置中的入口并进入流动区域而将微物体(例如，癌细胞或抗原缀合的珠子)加载到微流体装置中(用于检测抗体结合的目的)。在一些实施方案中，流动区域包括流动通道，并且加载微物体包括使微物体流动到流动通道中。
在一些实施方案中，将微物体加载到微流体装置的流动区域(或流动通道)中并保持在流动区域(或流动通道)中直到从微流体装置输出。在一些实施方案中，微物体不进入分离区域。在一些实施方案中，除了驻留在流动区域(或流动通道)中之外，微物体还下沉(dip)到分离室的连接区域中。在任何这些实施方案中，微物体(例如，癌细胞或抗原缀合的珠子)可以以至少约1×107、2.5×107、5×107、7.5×107或1×108个微物体/ml的浓度加载到流动区域(或流动通道)中。
在一些实施方案中，将微物体移动到微流体装置中的至少一个分离区域中。与B细胞一样，微物体(例如，癌细胞或抗原缀合的珠子)的移动可以通过多种方式实现，包括使用重力(例如通过倾斜微流体装置)、诱导局部流体流动(例如，通过压下或拉动位于邻近或接近分离区域的微流体装置的可变形表面)、施加介电电泳(DEP)力(例如通过光电镊子(OET))或其任何组合。在这样的实施方案中，可以将一个或多个(例如，仅1个，约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多，或约1至20个、1至10个、1至5个、1至3个、1至2个)微物体移动到微流体装置中的各个分离区域中，从而获得具有分离的微物体或一组分离的微物体的至少一个分离区域。分离的微物体和B细胞可以被放置在同一分离区域中。或者，分离的微物体和B细胞可以被放置在不同的分离区域中(例如在相邻的分离区域中)。
不管微物体在微流体装置中的期望位置如何，在将癌细胞加载到微流体装置中之前，可以用一种或多种可检测的标志物来标记作为癌细胞的微物体。如果期望的模式包括将至少一个癌细胞移动到至少一个分离区域中，则可检测的标志物可以用于选择至少一个癌细胞用于移动。替代地或另外地，细胞大小、细胞形状、核大小或核结构的形态学评估可以用于选择至少一个癌细胞用于移动。还可以通过不存在细胞标志物来选择癌细胞，任选地与形态学评估组合。
在某些实施方案中，癌细胞源自从取自患者的一个或多个实体瘤样品获得的解离的细胞样品，因此是患者自身的癌细胞。如上文所述，可以从解离的细胞样品中选择(或分离)癌细胞和/或可以将癌细胞作为包含B细胞的同一解离的细胞样品的一部分加载到微流体装置中。在某些实施方案中，在测定B细胞之前培养和/或克隆癌细胞，以产生能够与癌细胞结合的抗体。这样的培养和/或克隆可以在微流体装置内进行，或者在将癌细胞加载到微流体装置中之前进行(例如，使用用于从肿瘤样品中选择、培养和/或克隆癌细胞的常规技术)。无论如何，可以将癌细胞选择、培养和/或克隆到至少约1×107、2.5×107、5×107、7.5×107或1×108个细胞/ml的浓度。
如本领域中公知的，源自肿瘤的癌细胞群在构成群的个体细胞的形态和基因特征方面可以是相对异质的。例如，群可以含有癌症干细胞(其可以缓慢分裂)和更分化的癌细胞(其可以更快地分裂并且可以含有不同的癌前突变子集)。基于标志物的癌细胞选择和/或克隆可以用于提供更均质的细胞群。因此，在某些实施方案中，在一些实施方案中，可以将多个异质癌细胞加载到微流体装置上。或者，可以在加载到微流体装置上之前选择和克隆单独的癌细胞。因此，在其他实施方案中，可以将基本上均质的癌细胞群加载到微流体装置中并用于识别产生能够与癌细胞结合的抗体的B细胞。基本上均质的群可以是源自提供至少一种肿瘤的患者或源自不同患者的癌细胞系。
在其他实施方案中，提供癌细胞相关的抗原可以包括使包含可溶性抗原的溶液流过微流体装置的流动区域并允许可溶性抗原扩散到B细胞所处的隔离室中。这种可溶性抗原可以与可检测的标记物(例如荧光标记物)共价结合。
D.对B细胞的结合和处理的检测
可以以多种方式检测由B细胞产生的抗体与癌细胞相关的抗原的结合。例如，当将癌细胞引入到微流体装置中时，可以检测细胞聚集，例如可能凝集测定中所发生的。或者，可以添加第二抗体，例如与标记物(例如，荧光标记物)缀合的抗人抗体，以标记具有与其结合的抗体的微物体(例如，癌细胞或抗原缀合的珠子)。因此，在某些实施方案中，该方法进一步包括在癌细胞相关的抗原之前或同时提供被标记的抗体结合剂。在此类实施方案中，监测抗原与由B细胞表达的抗体的结合可以包括检测被标记的抗体结合剂与癌细胞相关的抗原的间接结合。被标记的抗体结合剂可以是被标记的抗IgG抗体，其可以是荧光标记的。在某些实施方案中，被标记的抗体结合剂在与癌细胞相关的抗原的混合物中提供。在其他实施方案中，在提供癌细胞相关的抗原之后提供被标记的抗体结合剂。
在某些实施方案中，所述方法可以进一步包括将至少一个表达抗体的B细胞(例如，浆细胞或记忆B细胞)识别为表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体。如下文中更详细讨论的，微流体装置可以包括成像装置，其允许信号(例如，微物体表面处的癌细胞聚集或标记物积聚)的可视化。例如，成像装置可以周期性地使微流体装置成像，并且可以检测这种信号随时间的任何增加。例如，可以每隔几秒(例如，每5、10、15、20、25、35、40、45、50、55、60秒或更长)或每隔几分钟(例如，每2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟或更长)获得图像。在一些实施方案中，多个图像可以彼此重叠，从而产生“求和”图像，其具有将背景信号平均并在真实信号和背景信号之间产生更好对比度的一般效果。信号的检测可以是手动的，例如当人们查看图像时发生的，或者是自动的(例如，使用适当的图像分析软件)。
一旦在癌细胞相关的抗原和B细胞产生的抗体之间检测到结合，就可以识别产生这种抗体的B细胞，并且可以注意和/或记录它们的位置(例如，它们所处的分离区域或分离室)。例如，参见图4的方法400中的步骤480。任选地，一旦检测到与癌细胞结合的抗体，就可以冲洗流动区域(或流动通道)。这种冲洗可以发生在识别产生与癌细胞相关的抗原(例如，癌细胞或抗原缀合的珠子)结合的抗体的B细胞之前或之后。作为另一个任选的步骤，可以从微流体装置中丢弃不产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的B细胞。
在某些实施方案中，被识别为产生与癌细胞相关的抗原结合的抗体的B细胞可以从微流体装置中输出。例如，为了分离B细胞用于测序(例如，抗体重链和轻链可变区的测序)或制备杂交瘤，可以从微流体装置中输出产生与癌细胞结合的抗体的B细胞。在某些情况下，单独输出每个细胞或克隆细胞的群。
E.B细胞活化的刺激
在任何前述实施方案中，已经被移动进入微流体装置的分离区域中的B细胞可以在有助于产生抗体的条件下孵育。在一些情况下，那些抗体可以通过微流体装置中的介质扩散到癌细胞相关的抗原的位置(无论是由癌细胞或抗原缀合的珠子包含，还是在溶液中；并且无论是在同一分离区域中、主流动通道中，或是在相邻的分离区域中)。在相邻的分离区域的情况下，在一些微流体装置中，在两个相邻的分离区域之间的薄壁中存在小的间隙，允许抗体直接从一个分离区域扩散到另一个分离区域，并且不一定需要进入主流动通道以扩散进入相邻的分离区域。这种小的间隙允许抗体扩散，但不允许癌细胞或B细胞离开分离区域。
在一些情况下，表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体的B细胞的检测可以包括使B细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触的步骤。例如，参见图4的方法400中的步骤460。刺激剂可以是CD40激动剂，例如CD40L、其衍生物或抗CD40抗体。因此，刺激剂可以包含CD40L+饲养细胞、基本上由其组成或由其组成。CD40L+饲养细胞可以是T细胞(例如，JurkatD1.1细胞)或其衍生物。或者，饲养细胞可以是用表达CD40L的构建体转染/转化的细胞系(例如，NIH-3T3细胞)。刺激剂进一步包含toll样受体(TLR)激动剂(例如TLR9激动剂)。TLR激动剂可以是例如CpG寡核苷酸(例如，CpG2006)。CpG寡核苷酸可以以约1微克/mL至约20微克/mL(例如，约1.5至约15微克/mL，约2.0至约10微克/mL或约2.5至约5.0微克/mL)的浓度使用。可以使B细胞与刺激剂接触(例如，基本上连续地或周期性地/间歇地)1至10天(例如，2至8天，3至7天，或4到6天)的期间。
检测表达与癌细胞相关的抗原特异性结合的抗体的B细胞可以进一步包括向B细胞提供培养基的步骤，所述培养基包含一种或多种促进B细胞扩增的生长诱导剂。一种或多种生长诱导剂可以包括至少一种选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21和BAFF的试剂。可以以约10ng/mL至约1微克/mL的浓度提供IL-2和/或IL-4。可以以约10ng/mL至约100ng/mL的浓度提供IL-6、IL-10和/或IL-21。可以以约10ng/mL至约50ng/mL的浓度提供BAFF。在某些实施方案中，将培养基提供给B细胞1至10天(例如，2至8天，3至7天或4至6天)的期间。培养基可以包含刺激剂(例如，CD40激动剂和/或TLR激动剂)。因此，例如，可以在使B细胞与活化剂接触的同时进行向B细胞提供培养基。在某些实施方案中，使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触和向B细胞淋巴细胞提供培养基的步骤在重叠时间(例如，在基本上共同延长的时间段内)进行。另外，作为另一个任选的步骤，可以在微流体装置中将B细胞培养成克隆群。这种培养可以发生例如约2至3天和/或进行到约8至20个细胞的细胞计数。
III.微流体装置
A.微流体装置术语
在一些实施方案中，微流体装置可以包含“扫描”区域和“未扫描”区域。未扫描区域可以流体连接到扫描区域，条件是流体连接被构造成在扫描区域和未扫描区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将未扫描区域与扫描区域中的介质的流分离，同时在扫描区域和未扫描区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。
可以在这种微流体装置中测定生物微物体(例如，生物细胞)产生特定生物材料(例如，蛋白质，例如抗体)的能力。例如，可以将包含待测定用于产生目标分析物(例如抗体)的生物微物体(例如B细胞)的样品材料加载到微流体装置的扫描区域中。可以选择据具有特定特征的那些生物微物体并将其置于未扫描区域中。然后，可以使剩余的样品材料从扫描区域流出，并使测定材料流入到扫描区域中。因为所选择的生物微物体处于未扫描区域中，所以所选择的生物微物体基本上不受剩余样品材料的流出或测定材料的流入的影响。可以允许所选择的生物微物体产生感兴趣的分析物，其可以从未扫描区域扩散到扫描区域中，其中感兴趣的分析物可以与测定材料反应以产生局部的可检测的反应，每个反应可以与特定的未扫描区域相关联。可以分析与检测到的反应相关的任何未扫描区域，以确定未扫描区域中的哪些生物微物体(如果有的话)是足够的感兴趣的分析物的生产者。
B.包括微流体装置的系统
图1A示出了可以用于在体外分离和筛选肿瘤衍生的B细胞的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1A中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这种微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。如图1A所示，微流体管路120可以包括多个微流体隔离室124、126、128和130，其中每个隔离室均具有与流动路径106流体连通的一个或多个开口。在图1A的装置的一些实施方案中，隔离室仅具有与流动路径106流体连通的单个开口。如下文进一步讨论的，微流体隔离室包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
如图1A中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以物理地构造成不同的配置，但是在图1A所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起，可以限定微流体管路120的元件。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，其每个均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的基板。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、腔室、坞(pen)、阱(trap)等。在图1A所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。
盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1A所示的分离结构或同一结构的集成部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离室124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置194(结合在成像模块164内)以及倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，其中装置190未在图1A中示出)。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像装置可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。
系统150进一步包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离室的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离室(即，在流动路径106上方的隔离室中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离室(即，在流动路径106下方的隔离室中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离室的上方或下方，而不是位于隔离室的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。
系统150可以进一步包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1A所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监视设备152的实例包括主控制器154，其包括介质模块160，用于控制介质源178；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出设备172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、基质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离室124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置的图像数据。来自成像装置的图像数据可以包括由成像装置捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离室的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。
在图1A所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离室124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体基本上分离。隔离室的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。坞到微流体通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流106不被引导到坞中。流动可以与坞的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地圈住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本发明的隔离室可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW、流体流动和/或重力一起使用。
微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离室。尽管示出了五个隔离室，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离室。如本文所用，术语“隔离室”和“隔离坞”可以互换使用。如图所示，微流体管路120的微流体隔离室124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于检测细胞特异性抗体分泌(例如将一个B细胞与相邻的B细胞分离)的一个或多个益处。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离室。
在一些实施方案中，微流体管路120包括多个微流体隔离室，其中两个或更多个隔离室包含不同的结构和/或特征，其在维持不同类型的细胞方面提供不同的益处。一个非限制性实例可以包括将B细胞维持在一种类型的坞中，同时将癌细胞保持在不同类型的坞中。
在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120进一步包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，多个隔离室被配置(例如，相对于通道122)，使得隔离室可以平行地装载目标微物体。
在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离室124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施例中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕捉单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕捉多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。
阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离室的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于微流体通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离室的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕捉微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离室中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体分离室中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离室(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离室中选择性地移除先前根据本公开的实施方案收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个隔离室的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离室中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离室(例如，隔离室124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离室中选择性地去除先前根据本公开的实施方案收集的液滴。
在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离室的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到室中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者与其他力交替地施加DEP和/或OEW力。
图1B、1C和2A-2H示出了可以用于实施本公开的实施方案的微流体装置的各种实施方案。图1B描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公布号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公布号20150306598号(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公布WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。
已经在例如US 2014/0116881(申请号14/060,117，2013年10月22日提交)、US2015/0151298(申请号14/520,568，2014年10月22日提交)和US 2015/0165436(申请号14/521,447，2014年10月22日提交)中描述了具有坞的微流体装置的实例，其中可以放置、培养和/或监测肿瘤来源的细胞，例如B细胞、T细胞或癌细胞，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。美国申请号14/520,568和14/521,447也描述了分析在微流体装置中培养的细胞的分泌的示例性方法。前述申请中的每一个进一步描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US 2014/0116881的图2中所示的光电镊子装置是可以在本公开的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。
C.微流体装置运动配置。
如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于选择性地在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上诱导DEP力，从而选择、捕捉和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕捉和/或移动单个液滴或液滴组。
图1B和IC中示出了包含DEP构造的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1B和IC分别示出了具有区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如图1B所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案可以以诸如正方形光图案220的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。
在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。
图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到微流体装置200中的光图案218的照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数目和图案，而是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的DEP配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六方点格的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。
已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)和美国专利公开号2016/0184821(Hobbs等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、502、504、600和700及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，每一个的全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP构造的图1B-1C的微流体装置200，通过将光图案218投射到微流体装置200中，以便以围绕并捕捉微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于微流体装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动原位产生的捕捉到的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动微流体装置200。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕捉和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1A中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕捉和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的DEP结构的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一个示例，微流体装置200可以具有：电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏性水材料和/或可涂覆有疏水材料，如下文所述。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10kOhms至约50kOhms的阻抗。
在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，CYTOPTM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1A中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有包括选择性可寻址和可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕捉和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
D.隔离室
在图2A-2C中描绘的微流体装置230内示出了一般隔离室224、226和228的非限制性实例。每个隔离室224、226和228可以包括隔离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向微流体通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以配置为使得从微流体通道122流入隔离室224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。因此，由于连接区域236，布置在隔离室224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与微流体通道122中的介质180的流动分离且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔离室224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向微流体通道122。隔离室的开口从微流体通道122横向开放。电极活化衬底206在微流体通道122和隔离室224、226和228二者的下方。隔离室的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成隔离室的底板)被设置在与微流体通道122(或者，如果不存在通道，则为流动区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.5微米、0.4微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越微流体通道122(或流动区域)和隔离室的衬底的上表面中的高度变化可以小于隔离室的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290和320中的任一个。
因此，微流体通道122可以是扫描区域的示例，并且隔离室224、226、228的分离区域240可以是未扫描区域的实例。应当注意，微流体通道122和隔离室224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2A-2B所示的实例中，端口222被连接到微流体通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止微流体通道122中的流体介质180的流242。例如，如图所示，端口222可以被布置在微流体通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222形成介质的流242。
图2C示出了根据本公开的隔离室224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。
已知的是，微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔离室224的近端开口234可以使介质180的二次流244进入和/或离开隔离室224。为了将隔离室224的分离区域240中的微物体246与二次流244分离，隔离室224的连接区域236的长度Lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流244进入连接区域236的穿透深度Dp。二次流244的穿透深度Dp取决于在微流体通道122中流动的流体介质180的速度以及与微流体通道122的配置有关的各种参数以及到微流体通道122的连接区域236的近端开口234。对于给定的微流体装置，微流体通道122和开口234的配置将是固定的，而微流体通道122中的流体介质180的流242的速率将是可变的。因此，对于每个隔离室224，可以识别通道122中的流体介质180的流242的最大速度Vmax，确保二次流244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。只要微流体通道122中的流体介质180的流242的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流244可以被限制到微流体通道122和连接区域236并且保持在分离区域240之外。因此，微流体通道122中的介质180的流242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论微流体通道122中的流体介质180的流242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。
此外，只要微流体通道122中的介质180的流242的速率不超过Vmax，微流体通道122中的流体介质180的流242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从微流体通道122移动到隔离室224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度Lcon大于二次流244的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离室224被来自微流体通道122或另一个隔离室(例如，图2D中的隔离室226、228)的混杂的颗粒污染。
因为微流体通道122和隔离室224、226、228的连接区域236可能受到微流体通道122中的介质180的流242的影响，所以微流体通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫描(或流动)区域。另一方面，隔离室224、226、228的分离区域240可以被认为是未扫描(或非流动)区域。例如，微流体通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从微流体通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240通过连接区域236扩散到微流体通道122中的第一介质180中而与微流体通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，隔离室的分离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的流体交换。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过微流体通道122的介质180)。
如上所述，由微流体通道122中的流体介质180的流242引起的二次流244的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：微流体通道122的形状(例如，微流体通道可以将介质引导到连接区域236中，将介质从连接区域236转移，或者沿着基本上垂直于通向微流体通道122的连接区域236的近端开口234的方向引导介质)；微流体通道122在近端开口234处的宽度Wch(或横截面积)；和连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon(或横截面积)；微流体通道122中的流体介质180的流242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度，等等。
在一些实施方案中，微流体通道122和隔离室224、226、228的尺寸可以相对于微流体通道122中的流体介质180的流242的向量如下定向：微流体通道宽度Wch(或微流体通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于微流体通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于微流体通道122中的介质180的流242。前述仅是示例，并且微流体通道122和隔离室224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。
如图2C所示，分离区域240在远端开口238处的宽度可以与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238的宽度可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度Wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。
图2D-2F描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1A的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离室266，其是上述隔离室124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2D-2F中所示的装置250的隔离室266可以代替装置100、200、230、280、290、300中的上述隔离室124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290、300相同或不同的DEP配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。
图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1A中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2D所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个隔离室266与其为流体连接。
每个隔离室266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从微流体通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将微流体通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2B和2C的讨论，通道264中的第一流体介质254的流278可以产生从微流体通道264进入和/或离开隔离室266的相应连接区域268的第一介质254的二次流282。
如图2E所示，每个隔离室266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度Lcon可以大于二次流282的最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度Dp的长度Lcon，在这种情况下，二次流282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度Lc1和Lc2的和大于最大穿透深度Dp，使得二次流282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度Lcon是否大于穿透深度Dp，或者连接区域268的长度Lc1和Lc2的和是否大于穿透深度Dp，通道264中的第一介质254的不超过最大速度Vmax的流278会产生具有穿透深度Dp的二次流，并且隔离室266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流278拖曳离开分离区域270。通道264中的流278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到隔离室266的分离区域270中。这样，扩散是微流体通道264中的第一介质254中的组分可以从微流体通道264移动到隔离室266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是隔离室266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到微流体通道264中的第一介质254中的唯一的机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过微流体通道264的介质。
如图2E所示，微流体通道264中的微流体通道264的宽度Wch(即，横切流体介质流过微流体通道的方向，如图2D中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度Wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度Wcon2。然而，近端开口274的宽度Wcon1和远端开口276的宽度Wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度Wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度Wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下任一范围中的角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。
在隔离室(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，分离区域(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离室的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的宽度Wch可以在以下任一范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。在一些其他实施方案中，微流体通道(例如，122)近端开口(例如234)处的宽度Wch可以在约200-800微米、200-700微米或200-600微米的范围内。以上仅是示例，并且微流体通道122的宽度Wch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。此外，在微流体通道的除了隔离室的近端开口之外的区域中，微流体通道122的Wch可以被选择为在任何这些范围内。
在一些实施方案中，隔离室的高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离室的横截面积为约1×104-3×106平方微米、2×104–2×106平方微米、4×104–1×106平方微米、2×104–5×105平方微米、2×104–1×105平方微米或约2×105–2×106平方微米。
在隔离室的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的高度Hch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)的高度Hch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围)。在微流体通道的除了隔离室的近端开口之外的区域中，微流体通道122的高度Hch可以被选择为在任何这些范围内。
在隔离室的各种实施方案中，微流体通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且微流体通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的横截面积可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离室的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon可以是在以下任何范围内：约1-600微米、5-550微米、10-500微米、15-400微米、20-300微米、20-500微米、40-400微米、60-300微米、80-200微米或约100-150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)的长度Lcon可以在与前述示例不同的范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离室的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以在以下任何范围内：20-500微米、20-400微米、20-300微米、20-200微米、20-150微米、20-100微米、20-80微米、20-60微米、30-400微米、30-300微米、30-200微米、30-150微米、30-100微米、30-80微米、30-60微米、40-300微米、40-200微米、40-150微米、40-100微米、40-80微米、40-60微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、50-80微米、60-200微米、60-150微米、60-100微米、60-80微米、70-150微米、70-100微米和80-100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离室的各种实施方案中，连接区域的近端开口的宽度Wpr可以至少与分离室打算用于的微物体(例如，生物微物体，如细胞)的最大尺寸一样大。例如，宽度Wpr可以是约50微米、约60微米、约100微米、约200微米、约300微米或者可以在约50-300微米、约50-200微米、约50-100微米、约75-150微米、约75-100微米或约200-300微米的范围内。
在隔离室的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon与连接区域(例如，236)在近端开口234处的宽度Wcon的比率可以大于或等于任何以下比率：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域236的长度Lcon与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon的比率可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、230、250、280、290、300的各种实施方案中，Vmax可以被设定为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5微升/秒。
在具有隔离室的微流体装置的各种实施方案中，隔离室的分离区域(例如，240)的体积可以是例如至少5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、1×107、5×107、1×108、5×108或8×108立方微米或更大。在具有隔离室的微流体装置的各种实施方案中，隔离室的体积可以是约5×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107、3×107、5×107或约8×107立方微米或更大。在一些其他实施方案中，隔离室的体积可以是约1纳升至约50纳升、2纳升至约25纳升、2纳升至约20纳升、约2纳升至约15纳升、或约2纳升至约10纳升。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离室，其中微流体装置具有约5至约10个隔离室、约10至约50个隔离室、约100至约500个隔离室；约200至约1000个隔离室、约500至约1500个隔离室、约1000至约2000个隔离室或约1000至约3500个隔离室。隔离室不需要全部是相同的，并且可以包括多种配置(例如，隔离室内不同的宽度、不同的特征)。
图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G中示出的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和隔离室128)会具有本文所讨论的尺寸。图2G中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280进一步包括向每个通道122开口的多个隔离室。在图2G所示的微流体装置中，隔离室具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫描区域(例如，通道122和连接区域236的在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)和非扫描区域(例如，分离区域240和连接区域236的不在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)这两者。
E.系统巢
图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本公开的微流体装置(例如，100、200、230、250、280、290、300)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302保持微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置320的能力并不意味着当插座302保持微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要时施加，以促进在微流体装置320中生成电动力，例如介电电泳或电润湿。
如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 322上并被电气集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 322上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302保持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为反馈提供给波形发生器，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3A所示，支撑结构300(例如，巢)可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300保持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1kOhm+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1kOhm+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生产子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
F.系统成像装置
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置。在一些实施方案中，成像装置包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)器件、铁电硅基液晶器件(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。合适的光调制子系统330的一个实例是来自AndorTechnologiesTM的MosaicTM系统。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。
在某些实施方案中，成像装置进一步包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成部件。
在某些实施方案中，显微镜350可以进一步包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。
在某些实施方案中，成像装置被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源334可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被巢300保持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被巢300保持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。在其他实施方案中，第二光源334可以另外地或替代地包括激光，其可以具有任何合适的光波长。图3B中所示的光具组的表示仅是示意性表示，并且光具组可以包括另外的滤光器、陷波滤波器、透镜等。当第二光源334包括用于亮视场和/或荧光激发的一个或多个光源以及激光照明时，光源的物理布置可以与图3B中所示的不同，并且可以在光具组内的任何合适的物理位置引入激光照明。光源432和光源402/光调制子系统404的示意性位置也可以互换。
在图3B中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统330，其将结构光提供给成像装置194的显微镜350的光具组。第二光源334被显示为经由分束器336将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此通过物镜340向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上行进通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。
在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，这种滤除来自光调制子系统330的光才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
G.涂覆溶液和涂覆剂。
不希望受理论的限制，当微流体装置的至少一个或多个内表面已经被调节或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和保持在其中的生物微物体之间的主要界面)时，可以促进微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)内的生物微物体(例如，生物细胞)的维持(即，生物微物体在微流体装置内表现出增加的活力、更大的扩增和/或更大的可移植性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)可以用涂覆溶液和/或涂覆剂处理或改性，以产生所需的有机和/或亲水分子层。
涂层可以在引入生物微物体之前或之后施加，或者可以与生物微物体同时引入。在一些实施方案中，生物微物体可以在包含一种或多种涂覆剂的流体介质中输入到微流体装置中。在其他实施方案中，在将生物微物体引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“填装”。
在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适于维持和/或扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层(例如提供如下文所述的经调节的表面)。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、腔室或隔离室的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离室中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离室中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。
涂覆剂/溶液。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、洗涤剂、酶及其任何组合。
基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或可以非特异性地粘附)。聚合物可具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。
聚合物可包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定聚合物包括L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可选地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香族部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香族部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，诸如黄原胶或葡聚糖的多糖可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分，从而提供聚电解质表面。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)和/或包含白蛋白的血清(或多种不同血清的组合)和/或一种或多种作为涂覆剂的其他类似蛋白质。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在涂覆溶液中的存在范围为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中的存在范围可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物调节的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。
共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层，为这些细胞提供调节的表面。
共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接，如下文所述。连接基团还与被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。
在一些实施方案中，被配置为提供适于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
在各种实施方案中，被配置为在微流体装置中提供适于维持/扩增的生物微物体的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。或者，共价连接的部分可以包括聚合部分，其可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，共价连接的烷基部分可以包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子并且可以是无支链的烷基部分。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟化或全氟化)。在一些实施方案中，烷基可以包括第一节段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二节段(其可以包括未取代的烷基)，其中第一和第二节段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一节段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二节段可以位于连接基团的近端。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性或其任何组合。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个亚烷基氧化物部分，并且可以包括如上文所述的任何亚烷基氧化物聚合物。一类有用的含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或者聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或加工用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。
共价连接的部分可包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离室和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。
提供经调节的表面的涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基调节的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分，其可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力。在这种情况下，具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第一组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅/氧化硅、氧化铪或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
经调节的表面性质。除了经调节的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变经调节的表面的物理厚度，例如在衬底上形成经调节的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。在一些实施方案中，经调节的表面的厚度为约1nm至约10nm；约1nm至约7nm；约1nm至约5nm；或其间的任何单个值。在其他实施方案中，由共价连接的部分形成的经调节的表面可以具有约10nm至约50nm的厚度。在各种实施方案中，如本文所述制备的经调节的表面具有小于10nm的厚度。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，经调节的表面的共价连接的部分可以形成单层，并且可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。这些值与(Asahi Glass Co.,Ltd.JP)含氟聚合物旋涂的值(其厚度在约30nm的范围内)形成对比。在一些实施方案中，经调节的表面不需要完美形成的单层来适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。
在各种实施方案中，提供微流体装置的经调节表面的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕获。不同的涂层材料可能捕获电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕获并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕获。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕获量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。
除了其电性质之外，经调节的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的经调节的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用，表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。
单一或多部分调节的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的分子的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以在两步顺序中通过将被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身已经与表面共价连接)而形成。
制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离室和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1或式2的结构。当将涂层材料一步引入到表面中时，它具有式1的结构，而当将涂层材料以多步法引入时，它具有式2的结构。
涂层材料可以共价连接到DEP配置或EW配置的衬底的表面的氧化物上。DEP或EW配置的衬底可以包括硅、氧化硅、氧化铝或氧化铪。氧化物可以作为衬底的原始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。
涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。它可以被选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基、亚芳基、亚杂芳基或杂环基的一个或多个部分的任何组合所中断。在一些实施方案中，连接部分L的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。
在一些实施方案中，可以在多步法中向衬底的表面添加将被配置为提供适合维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分，并且该部分具有上文所示的式2的结构。该部分可以是上文所述的任何部分。
在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx(即，被配置为与反应性部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酸氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于维持/扩增微流体装置中的生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分的末端)，连接基团L可以包括如上文所述的元素的任何组合。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的主链。当偶联基团CG是亚三唑基时，它可以是由Click偶联反应产生的产物并且可以进一步被取代(例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基)。
在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面改性配体)沉积在微流体装置的内表面上。可任选地改进气相沉积工艺，例如，通过暴露于溶剂浴、超声处理或其组合而预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。或者，可以使用液相处理，例如盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率)代替氧等离子体清洁剂。
在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合是引起的分层。在采用两步法的实施方案中，可以通过如上文所述的气相沉积引入表面改性配体，随后引入被配置为提供适合于维持/扩增生物微物体的有机和/或亲水分子层的部分。该随后的反应可以通过在溶液中将表面改性的微流体装置暴露于合适的偶联剂来进行。
图2H描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290具有提供经调节的表面的示例性共价连接的涂层材料。如图所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与底座286(其可以是DEP衬底)的内表面294和微流体装置290的盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子的单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内面向微流体装置290的外壳284的基本上所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。
在图2H所示的实施方案中，涂层材料298可以包括单层有机硅氧烷分子，每个分子经由甲硅烷氧基连接部分296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。可以使用任何上文所讨论的涂层材料298(例如，烷基封端的、氟代烷基封端的部分、PEG封端的部分、葡聚糖封端的部分或含有有机硅氧基部分的正电荷或负电荷的末端部分)，其中末端部分被设置在其面向外壳的末端(即，涂层材料298的单层的未与内表面292、294结合并且邻近外壳284的部分)。
在其他实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与涂覆剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。
在其他实施方案中，涂层材料可以包含或经化学改性以在其面向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂层材料可以包括含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂层材料可以包括多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将生物微物体与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。
适当的涂层处理和修饰的进一步细节可以在2016年4月22日提交的美国申请序列号15/135,707中找到，并且其全部内容通过引用并入本文。
H.用于在微流体装置的隔离室内维持细胞活力的另外的系统组件。
为了促进细胞群的生长和/或扩增，可以通过系统的另外的组件提供有利于维持功能细胞的环境条件。例如，此类另外的组件可以提供营养物、细胞生长信号传导物质、pH调节、气体交换、温度控制和从细胞中除去废产物。
IV.另外的实施方案
A.使用T细胞或NK细胞的实施方案
在某些情况下，T细胞可以存在于解离的细胞样品中。在这种情况下，该方法可以进一步包括对解离的细胞样品进行选择，以分离比原始解离的样品具有更高百分比或更高浓度的T细胞的部分。以这种方式，可以从同一患者的肿瘤样品中获得肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在其他情况下，可以从同一患者的血液中获得T细胞。例如，可以从得自同一患者的血液样品(或外周血单核细胞(PBMC)样品)中选择T细胞。在其他情况下，可以从不是提供至少一种实体瘤的患者的受试者(例如，作为献血者或组织供体的受试者)获得T细胞。通过使用选自CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69和CD3的至少一种T细胞标志物，可以将T细胞与解离的细胞样品或血液/PBMC样品中的其他细胞分离。无论T细胞的来源或所用的选择操作(如果有的话)如何，所得T细胞均可以被克隆和/或用于本文公开的方法中。例如，T细胞(无论是患者特异性的还是供体来源的)可以用于制备CAR-T治疗剂或用于其他类型的免疫疗法，例如涉及TIL和另一种治疗剂(例如，根据本文公开的方法制备的抗体)的组合疗法。
与T细胞类似，天然杀伤(NK)细胞可以用于本文公开的方法中。例如，如Topfer etal.(2015),J.Immunol.194(7):3201-3212中所述，NK细胞可以用于制备CAR治疗剂。NK细胞可以例如从血液样品或组织样品(例如，从肿瘤获得的解离的细胞样品)获得。通过使用至少一种NK标志物(例如CD56)，可以将NK细胞与样品中的其他细胞分离。
B.依赖于外部细胞来源的实施方案
在一些实施方案中，所有细胞来源均来自单个患者。在其他实施方案中，例如在本小节中讨论的那些实施方案中，细胞来源可以来自不同的患者或不同的来源。在一个方面，该方法包括使用微流体装置来识别至少一个B细胞，其产生能够与患者的癌细胞和来自另一来源的癌细胞(例如，在两步法中)这两者的抗体。在一个实施方案中，针对癌细胞系测试B细胞，同时制备和/或培养患者自身的癌细胞(例如，在将患者的癌细胞加载到微流体装置上之前)。T细胞或NK细胞也可以从同一患者或从不同来源获得。
C.使用正常细胞的实施方案
需要时，可以通过比较它们与癌细胞和非癌细胞(即正常细胞)结合的能力来评估B细胞所产生的抗体的特异性。因此，任选地，该方法可以进一步包括使用微流体装置来识别由B细胞产生的抗体是否能够与非癌细胞结合。非癌细胞和癌细胞可以从同一肿瘤样品中解离。或者，非癌细胞和/或癌细胞可以源自提供至少一种实体瘤样品的患者以外的受试者。
同一微流体装置可以用于识别抗体与癌细胞和非癌细胞的结合。可以将癌细胞和非癌细胞加载到微流体装置的不同部分中。例如，可以将癌细胞(或非癌细胞)与B细胞一起置于同一分离室中，且可以使非癌细胞(或癌细胞)流动到流动通道中并流动到分离室向流动通道开口的位置附近的位置。在另一个实例中，可以将癌细胞(或非癌细胞)放置在与包含B细胞的分离室相邻的分离室中，并且可以将非癌细胞(或癌细胞)流动到流动通道中并流动到包含B细胞的分离室向流动通道开口的位置附近的位置。在又一个实例中，可以将癌细胞(或非癌细胞)与B细胞一起置于分离室中，并且可以将非癌细胞(或癌细胞)置于与含有B细胞的分离室相邻的分离室中。无论癌细胞和/或非癌细胞的放置如何，同一微流体装置可以用于同时评估抗体(例如，由B细胞产生的)是否与癌细胞和/或非癌症结合。在其他实施方案中，癌细胞和非癌细胞可以按顺序加载在同一流动路径(或同一分离区域)中，允许顺序检测(1)抗体和癌细胞之间以及(2)抗体和非癌细胞之间的结合。
V.治疗方法和治疗剂组合物
患有癌症的患者可以用通过本文所述的方法产生的抗体或其片段进行治疗。在一种情况下，肿瘤样品取自接受治疗的同一患者。该方法的一个优点是可以为给定的患者设计个性化的治疗，并且在一些情况下，可以在相对短的时间窗口内准备个性化的治疗，从而允许在患者疾病状态所需的时间内的疗效。例如，在一些实施方案中，从获得肿瘤样品到治疗的时间可以是至多约2个月。
一旦确定了由B细胞产生的抗体的可变重链和轻链区，就可以制备多种不同的抗体或抗体片段构建体，其含有全部或一些可变序列。在一些情况下，可以用单链抗体治疗患者。在其他情况下，可以用具有两条重链和两条轻链的抗体或其片段治疗患者。在一些实施方案中，工程化的抗体构建体包含Fab或Fab'(2)片段、scFv、多价scFv(例如，双抗体或三链抗体)、微抗体(例如scFv-CH3二聚体)、双特异性抗体或骆驼可变功能性重链结构域。在其他实施方案中，工程化的抗体构建体包含通过本文的方法识别的抗体的任何变体。在一些实施方案中，抗体或片段可以以分离的形式施用。
例如，工程化的抗体构建体可以包含(a)通过本文方法识别的抗体的至少重链CDR；(b)通过本文方法识别的抗体的至少重链和轻链CDR；(c)通过本文方法识别的抗体的至少重链可变区；或(d)通过本文方法识别的抗体的至少重链和轻链可变区。
在其他情况下，可以使用抗体或片段来制备各种构建体。例如，抗体可以被显示在工程化的T细胞或工程化的NK细胞上。在一些实施方案中，工程化的T细胞是嵌合的抗原受体T细胞。T细胞可以在被工程化以显示抗体之前从同一患者获得，例如从患者的肿瘤样品或得自患者的血液样品获得。可以对这样的T细胞进行基因工程化以表达抗体或其片段。类似地，在其他实施方案中，工程化的NK细胞是嵌合的抗原受体NK细胞。NK细胞可以在被工程化以显示抗体之前从同一患者获得，例如，从患者的肿瘤样品或得自患者的血液样品获得。可以对这样的NK细胞进行基因工程化以表达抗体或其片段。
在一些模式中，抗体或其片段可以与另一种疗法组合施用。在这种情况下，联合疗法可以是手术、放疗、化疗、CAR-T疗法、T细胞疗法(例如通过简单扩增患者自身的T细胞，如TIL，并重新引入它们)、其他免疫疗法(通过靶向用功能阻断抗体(例如抗PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、BTLA或其任何组合的抑制性抗体)抑制T细胞功能的已知抗原)或施用免疫刺激剂，例如ICOS、OX40、41BB、抗肿瘤疫苗、细胞因子或肿瘤特异性病毒。
VI.标记和检测方法
根据本文方法产生的抗体也可以用于检测方法。例如，抗体可以用可检测的标记物标记，并在体内或体外用于检测或标记癌细胞(包括患者自身的肿瘤细胞)。例如，可以使用荧光团缀合的抗体进行荧光引导的手术，以突出肿瘤、改善手术切除并提高存活率。可以使用诸如Alexa Fluor 488的荧光团。可以静脉内注射抗体-荧光团缀合物，或者可以在手术期间将其施用于切除表面。本文产生的抗体也可以用于其他检测或标记方法。
实施例
实施例1.肿瘤活检的处理和解离细胞样品的破碎
A.肿瘤样品的解离
从进行其肿瘤的手术切除的患者获得肿瘤样品。在肿瘤切除的当天，在手术后立即在实验室中接收样品。将样品在无菌容器中的无菌盐水中洗涤。使用解剖刀和无菌钳在层流罩中将活的肿瘤组织从非活组织和健康(非癌症)组织切除。可以获得活肿瘤组织的其他样品用于其他评估。将用于解离的肿瘤样品称重并保持在含有少量无菌HBSS的50ml离心管中。通过补充含有10％人血清(在56℃下加热灭活30分钟)和最终浓度的青霉素G(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)、Hepes(25mM)和2-巯基乙醇(5.5×105M)的RPMI 1640来制备用于培养细胞的培养基。
将组织样品置于无菌切割表面(切割板或开放的培养皿)上。使用无菌手术刀和镊子，将样品切成小的(3-5mm)碎片。将切割的碎片转移到C管中。将酶培养基(EM)添加到管中(对于0.2-2g组织为5ml，对于2-5g为10ml)并通过旋转盖子直至听到轻微的咔哒声而将管牢固地封闭。EM用于帮助在程序运行之间的短暂孵化期间使细胞从手术标本分散。含有酶的培养基RPMI 1640不含血清，但含有青霉素G(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)、(1.25μg/ml)、胶原酶(1mg/ml)和(约30单位/ml)。酶原料是在-20℃下储存的干粉。
C管垂直地且盖侧向下地安装在gentleMAC套管中。正确的安装确保C管对抗旋转和轴向力保持就位。预定义的程序由内部解离器存储器提供。程序的强度不同，因此根据待处理组织的质地选择合适的程序。较软的组织需要更柔和的旋转(较低的速度)，而较硬的组织需要更强劲、更长的旋转。可以进行多次解离运行，并在运行之间进行的解离状态的评估。将解离的组织通过放置在250ml离心管顶部的高压灭菌漏斗中的高压灭菌丝网过滤。用无菌HBSS淋洗丝网，并用另外的无菌HBSS填充管。然后通过以1500rpm离心10分钟而将解离的组织洗涤一次。吸出上清液，并将沉淀重悬于已知体积的HBSS中。
B.用于肿瘤解离的替代操作
作为使用仪器进行肿瘤解离的替代方案，可以使用消化缓冲液。使用钳子将肿瘤组织分开或切成小块(2-5mm)。将组织置于解离缓冲液(含100单位/ml胶原酶和100μg/ml脱氧核糖核酸酶的RPMI和10％人血清(在56℃热灭活30分钟)中)中。消化在37℃的培养箱中进行30分钟。孵育后，用移液管上下吸移样品，得到易于流动的单细胞悬浮液。
将悬浮液通过70微米过滤器过滤并用补充有10％人血清(在56℃下加热灭活30分钟)的MAC分离缓冲液洗涤2次。将细胞悬浮液以400×g离心10分钟。将沉淀用10ml MAC缓冲液淋洗并在相同设置下再次离心。然后将解离的细胞重悬于100μl MAC缓冲液中。
C.来自解离的细胞样品的细胞类型的破碎
在使用上述任一方案制备包含单细胞的解离细胞样品后，可以从解离的细胞样品中破碎出B细胞、T细胞、NK细胞和癌细胞。抗CD20磁珠可以用于选择B细胞。抗CD4和/或抗CD8磁珠可以用于选择T细胞。抗CD56磁珠可以用于选择NK细胞。附着于对癌细胞具有特异性的抗体的磁珠可以用于选择癌细胞，或者可以使用形态学评估来手动除去癌细胞。
将靶向待破碎的第一细胞类型(大约10μl/108个细胞)的抗体标记的微珠添加到解离的细胞样品中。通过轻轻地轻弹管并在4-8℃下避光孵育15分钟，将管充分混合。通过添加10ml MAC缓冲液并以400×g离心10分钟来洗涤细胞。将上清液倾出(或吸出)并将细胞重悬于500μl MAC缓冲液中。将新柱应用到磁分离器上。通过用适量的MAC缓冲液淋洗所选的柱来准备该柱。在准备好柱后，将细胞悬浮液施加到柱的顶部，每1×108个细胞使用一个柱。将任何未标记的细胞(穿过)收集并保留用于分离不同的细胞类型。对于第一次洗涤，将柱用500μl体积洗涤至少3次并最多洗涤5次，总共1.5至2.5ml流体洗涤。流体的流保留在柱中，不允许其流干，这会影响纯度并导致细胞活力的丧失。
对于第二次洗涤，用包含胶原酶和脱氧核糖核酸酶的解离缓冲液混合物洗涤柱，以冲出来自死亡或垂死的肿瘤细胞的粘性碎片(含100单位/ml胶原酶和100μg/ml脱氧核糖核酸酶的RPMI和10％人血清(在56℃下热灭活30分钟)中)。对于第三次洗涤，再次使用MAC缓冲液，直到洗涤看起来完全澄清。
将柱从磁分离器中取出并置于合适的收集管上。将2ml缓冲液置于柱上，并通过牢固地施加柱提供的柱塞来收集磁性标记的细胞。
或者，可以通过进行磁分离。
进行另外的分离步骤以分离B细胞、T细胞、NK细胞和癌细胞中的每一种。在需要时，从细胞中除去磁珠。
实施例2.筛选小鼠脾细胞用于在微流体装置中分泌IgG抗体
进行筛选以识别分泌与人CD45结合的IgG型抗体的小鼠脾细胞。实验设计包括以下步骤：
1.产生CD45抗原涂覆的珠子；
2.收获小鼠脾细胞；
3.将细胞加载到微流体装置中；和
4.抗原特异性测定。
用于实验的试剂包括表1中所示的那些。
表1–试剂
产生CD45抗原涂覆的珠子
以下列方式产生CD45抗原涂覆的微珠：
·将50μg无载体的CD45重悬于500μL PBS(pH 7.2)中。
·用500μL PBS淋洗slide-a-lyzer迷你杯，然后加入到微量离心管中。
·将50μL的0.1μg/μL的CD45溶液添加到经淋洗的slide-a-lyzer迷你杯中。
·将170μL PBS添加到2mg NHS-PEG4-生物素中，之后将4.1μLNHS-PEG4-生物素添加到含有CD45抗原的slide-a-lyzer迷你杯中。
·将NGS-PEG4-生物素与CD45抗原在室温下孵育1小时。
·孵育后，将slide-a-lyser迷你杯从微量离心管中取出，置于第二微量离心管中的1.3ml PBS(pH7.2)中，并在4℃下摇动孵育第一个1小时的时间。随后将slide-a-lyser迷你杯转移至含有1.3ml新鲜PBS(pH7.2)的第三微量离心管中，并在4℃下摇动孵育第二个1小时的时间。重复该最后一步三次，总共进行5次1小时的孵育。
·将100μL生物素化的CD45溶液(～50ng/μL)移液至经标记的管中。
·将500μLSpherotech链霉亲和素涂覆的珠子移液到微量离心管中，在PBS(pH7.4)中洗涤3次(每次洗涤用1000μL)，然后在3000RCF下离心5分钟。
·将珠子重悬于500μl PBS(pH 7.4)中，得到浓度为5mg/ml的珠子。
·将50μL生物素化的蛋白质与重悬的Spherotech链霉亲和素涂覆的珠子混合。将混合物在4℃下摇动孵育2小时，然后在4°和3000RCF下离心5分钟。弃去上清液，并将CD45涂覆的珠子在1mL PBS(pH7.4)中洗涤3次。然后将珠子在4℃下以3000RCF离心另外5分钟。最后，将CD45珠子重悬于500μL PBS pH 7.4中并在4℃下储存。
小鼠脾细胞收获
收获用CD45免疫的来自小鼠的脾脏，并将其置于DMEM培养基+10％FBS中。用剪刀来切碎脾脏。
将切碎的脾脏置于40μm细胞筛网中。用10ml移液管将单细胞洗涤通过细胞筛网。使用玻璃棒使脾脏进一步破碎并迫使单细胞通过细胞筛网，然后用10ml移液管再次将细胞洗涤通过细胞筛网。
用商业试剂盒使血红细胞溶解。
将细胞以200×G离心，并用10ml移液管将原始脾细胞以2e8细胞/ml的浓度重悬于DMEM培养基+10％FBS中。
将细胞加载到微流体装置中
将脾细胞输入到微流体芯片中并加载到每个坞含有20-30个细胞的坞中。使100微升介质以1μL/s流过该装置以除去不需要的细胞。将温度设定为36℃，并以0.1μL/秒的速度灌注培养基30分钟。
抗原特异性测定
制备含有1:2500山羊抗小鼠F(ab’)2-Alexa 568的细胞培养基。
将100μL CD45珠子重悬于22μL含有1:2500稀释度的山羊抗小鼠F(ab’)2-Alexa56的细胞培养基中。
然后将重悬的CD45珠子以1μL/秒的速率流入到微流体芯片的主通道中，直到它们位于含有脾细胞的坞附近，但恰好在其外面。然后停止流体流动。
然后将微流体芯片在明视场中成像以确定珠子的位置。
然后，使用德克萨斯红滤光器来捕捉细胞和珠子的图像。每5分钟拍摄图像，持续1小时，每次曝光持续1000ms，增益为5。
结果
观察到阳性信号在珠子上发展，反映了IgG-同种型抗体扩散出某些坞并进入主通道的扩散，在那里它们能够与CD45涂覆的珠子结合。抗CD45抗体与珠子的结合允许二级山羊抗小鼠IgG-568与珠子结合并产生可检测的信号。参见图5C，白色箭头。
使用本文公开的方法，可以分离与阳性信号相关的每组脾细胞，并将其作为单细胞移动到新的坞中并重新测定。以这种方式，可以检测表达抗CD45IgG抗体的单细胞。
实施例3.膜制备和膜抗原与珠子的缀合
以下方案表明从感兴趣的样品细胞获得含有蛋白质(和其他生物分子)，特别是膜结合或膜缔合的蛋白的样品的可行性。该方案在Jurkat细胞上进行，以便能够测试所得样品中已知存在于这些细胞中的蛋白质。该方案可以很容易地扩展到其他细胞类型，包括从肿瘤活组织检查中分离的癌细胞，从而产生含有肿瘤细胞特异性(或其他细胞类型特异性)抗原的样品，用于筛选免疫细胞(如B细胞)对抗原的反应性。
材料：
·Jurkat细胞(ATCC TIB-152)
·LiDS样品缓冲液：0.02g/mL LiDS，10％甘油，0.51mM EDTA，247mM Tris，pH8.5(ThermoFisher B0008)
·Qiashredder(Qiagen 79654)
·DPBS(含钙和镁，ThermoFisher 14040-182)
·超纯水(ThermoFisher 10977-015)
·EZ-Link磺基-NHS-SS-生物素(ThermoFisher 21328)：储存于-20℃，在使用前取出并在室温下保温约30分钟；短暂离心以收集管底部的所有物质；在使用前立即将164μL超纯水添加到含有1mg磺基-NHS-SS-生物素的1管中，并上下移液数次以溶解(得到10mM溶液)
·Complete Ultra mini(Sigma 5892791001)：制备20×溶液：通过涡旋将1片药片溶解在500μL水中(在4℃或-20℃下稳定4周)
·Minute质膜蛋白分离试剂盒(Invent Biotechnologies SM-005)：使用前，解冻溶液A和B，并添加蛋白酶抑制剂：
·对每个样品，500μL缓冲液A+25μL 20×蛋白酶抑制剂(储存在冰上)
·对每个样品，200μL缓冲液B+10μL 20×蛋白酶抑制剂(储存在冰上)
·为冰上的每个样品准备1个滤芯
·BSA：Chromatopur牛血清白蛋白(MP Biomedicals 02180561)
·链霉亲和素涂覆的磁性微球(Bangs Laboratories CM01N，批号11806)，使用前清洗和封闭：
·涡旋珠，取出300μL/样品并转移到1.5mL管中
·用PBS洗涤
·重悬于0.5％BSA中，在4℃(旋转)下孵育至少1小时
·用PBS洗涤，重悬于500μL DPBS(+蛋白酶抑制剂)/样品中
·抗α1钠钾ATP酶(Na/K-ATP酶)抗体(Abcam ab7671)
·抗人CD3抗体，克隆SK7(BioLegend 344802)
·抗人CD45抗体，克隆HI30(BioLegend 304002)
·F(ab')2-山羊抗小鼠IgG(H+L)，Alexa Fluor 488(ThermoFisher A-11017)
膜蛋白的生物素化：
·对Jurkat细胞计数
·制备用于蛋白质印迹分析的等分试样：
·离心2×106个细胞
·用PBS洗涤
·在LiDS样品缓冲液中溶解并通过Qiashredder柱离心以剪切DNA
·在4℃下储存数天，在-80℃下储存更长时间
·用DPBS通过离心将多批15×106个细胞洗涤三次
·将每个沉淀重悬于500μL DPBS中，转移至1.5mL管中，并添加10μL新制备的10mM磺基-NHS-SS-生物素
·在室温下旋转30分钟
·用冷DPBS洗涤三次并继续进行细胞沉淀以富集膜部分
·处理用于蛋白质印迹分析的1个样品(参见上文)。
图6显示了对存在于质膜中的蛋白质Na/K-ATP酶和细胞溶质蛋白GAPDH染色的示例性蛋白质印迹分析。
使用Minute质膜分离试剂盒富集膜部分
·在冰上进行所有步骤，在4℃下离心。
·将沉淀重悬于缓冲液A：200μl用于<5×106个细胞，500μl用于>5×106个细胞
·在冰上孵育10分钟
·剧烈涡旋10-30秒，立即转移到冰上滤芯
·盖上滤芯，以16,000g离心30秒(如果细胞溶解产物不通过，则增加至2分钟)
·将沉淀重悬于收集管中，转移至同一过滤器并再次离心
·丢弃过滤器，通过剧烈涡旋10秒钟而重悬沉淀
·以700g离心1分钟(以沉淀完整的细胞核)
·在16,000g/4℃下将上清液在新的1.5ml管中离心30分钟(→上清液含有细胞溶质，沉淀＝总膜蛋白质分数)
·通过涡旋或上下移液，将沉淀重悬于200μl缓冲液B中
·在7,800g/4℃下离心20分钟→沉淀含有细胞器膜蛋白
·小心地将上清液(膜部分)转移到新的2.0ml管中
将膜部分与链霉亲和素涂覆的磁性微球结合：
·将80μL每个膜部分添加至500μL珠子
·在4℃下旋转过夜
·保存未结合的部分用于蛋白质印迹分析
·在0.5％BSA/PBS+蛋白酶抑制剂中旋转30分钟
·用PBS洗涤
·重悬于250μL 0.1％BSA/PBS+蛋白酶抑制剂中
·从珠子中释放膜部分(使用DTT切割S-S键)：
·取出50μL珠子的等分试样
·加上磁铁并移除溶液
·将珠子重悬于含有50mM DTT(1×还原剂，ThermoFisher B0009)的50μL LiDS样品缓冲液中
·在室温下孵育2小时(约每30分钟混合一次)
抗体染色：
·对于以下稀释液中的每种抗体，取50μL等份的珠子(来自步骤24)
·CD3(1:200)
·CD45(1:100)
·Na/K-ATP酶(1:100)
·无第一抗体
·在4℃下旋转30分钟
·添加800μL PBS进行洗涤，另外用PBS洗涤1次
·在第二抗体(Alexa488-缀合的山羊抗小鼠)中于4℃孵育30分钟(旋转，体积：200μL，在0.5％BSA/PBS+蛋白酶抑制剂中)1:300
·添加800μL PBS进行洗涤，另外用PBS洗涤1次
·重悬于20μL 0.5％BSA/PBS+蛋白酶抑制剂中
·荧光显微镜上成像
图7显示了涂覆有对CD3、CD45或Na/K-ATP酶染色Jurkat细胞膜部分的珠子。与表现为较暗点的NA/K-ATP酶相比，CD3和CD45都被强烈地表现出来。图8显示了与HEI293细胞的比较。这里Na/K-ATP酶染色相同，但CD3和CD45不存在。
结果表明，从细胞膜制品中分离的蛋白质可以成功地与珠子偶联。可以将这样的珠子与免疫细胞混合以确定哪种细胞对细胞膜制品中存在的抗原(无论是蛋白质还是其他)具有反应性。
实施例4.识别表达与珠缀合的癌细胞衍生的抗原结合的抗体的B细胞
可以进行筛选以识别表达与患者自身的髓样乳腺癌细胞结合的抗体的患者特异性B细胞。实验设计可以包括以下步骤：
·收获和选择B细胞和癌细胞；
·从癌细胞中获取细胞膜制品并使膜抗原与珠子结合；
·将B细胞加载到微流体装置中；
·将与癌细胞衍生的膜抗原结合的珠子加载到细胞微流体装置中；和
·测定B细胞产生的抗体与珠子的结合。
A.细胞收获和选择
如实施例1(上文)中所述，从患者获得髓样乳腺癌肿瘤的活组织检查，并将活组织检查的细胞解离。使用抗CD-20磁珠从所得的解离的细胞样品中选择B细胞，从而产生富含B细胞的细胞样品。然后，使用抗ER(雌激素受体)、抗PR(孕酮受体)和抗HER2磁珠的混合物，将在B细胞耗尽的解离的细胞样品中剩余的细胞中耗尽非髓样乳腺癌细胞，以产生富含三阴性乳腺癌细胞的样品。
B.从乳腺癌细胞制备细胞膜和将膜抗原与珠子缀合
从在A部分中获得的富含三阴性乳腺癌细胞的样品开始，可以从癌细胞制备细胞膜并使其与珠子缀合，如上文3中所述。
C.将细胞加载到微流体装置中
接下来，通过以0.1-1.0微升/秒的速率使1-3微升的样品流入流动通道中，将富含B细胞的细胞样品加载到微流体芯片中。然后停止样品的流，并且当样品中的细胞位于流动通道中时，使用DEP力(例如，OET)选择性地捕获B细胞并将其移动到与流动通道连接的分离室的分离区域中。将单个B细胞置于多个分离室中的每一个中。取决于所使用的微流体芯片的尺寸，可以在单个芯片上单独分离3000个或更多个B细胞。通常，预期样品中存在更少的B细胞。结果是，可以分离样品中的所有B细胞。一旦将B细胞移动进入分离室，就用新鲜培养基冲洗流动通道以清理流动通道中不需要的细胞和碎片。
清理流动通道后，将富含三阴性乳腺癌细胞的样品加载到芯片中。与富含B细胞的样品类似，使1-3微升富含癌细胞的样品以0.1-1微升/秒的速率流动到流动通道中，然后停止流动。使用形态学特征，使用DEP力(例如，OET)选择多个癌细胞(例如，3-6个)并将其移动到含有B细胞的每个分离室中。一旦将癌细胞移动到分离室中，就用新鲜培养基冲洗流动通道以清理流动通道中不需要的细胞和碎片。以这种方式，微流体芯片中的多个分离室装载有单个B细胞和多个髓样乳腺癌细胞。
D.将珠子加载到微流体装置中
在清理流动通道后，将与得自富含三阴性乳腺癌细胞的样品的膜抗原缀合的珠子加载到芯片中。与富含B细胞的样品类似，使1-3微升的癌细胞相关的抗原缀合的珠子以0.1-1微升/秒的速率流动到流动通道中，然后停止流动。将珠子移动进入含有B细胞的每个分离室中。一旦珠子移动到分离室中，随后就用新鲜培养基冲洗流动通道以清理流动通道中不需要的珠子和碎片。以这种方式，微流体芯片中的多个分离室装载有单个B细胞和多个癌细胞相关的抗原-缀合的珠子。或者，可以将珠子留在通道中，如上文实施例2中所述。
E.抗体结合测定
为了确定任何分离的B细胞是否产生与癌细胞相关的抗原结合的抗体，将微流体芯片中的B细胞在有利于抗体表达的条件下孵育。在这种孵育后，使含有与人抗体恒定区结合的第二抗体的混合物的培养基流动到微流体芯片中，然后停止。可以含有荧光标记的抗人IgG抗体、抗人IgM抗体和任选的抗人IgA、IgE和/或IgD的抗体的抗体混合物中的抗体被允许扩散到分离室中并与B细胞所产生的抗体结合。如果B细胞所产生的抗体与在相应分离室中与珠子结合的一种或多种癌细胞相关的抗原结合，则抗人第二抗体(及其标记物)将变得可检测地与珠子的表面结合。如果珠子被留在通道中，则可以在使珠子流入微流体装置之前将荧光标记的第二抗体与珠子混合。
在第二抗体孵育步骤期间，使用用于检测荧光信号的滤光器(例如，德克萨斯红滤光器)周期性地对微流体芯片成像。可以每5分钟拍摄图像，持续1小时，每次曝光持续1000ms。
F.结果
可以在含有表达与癌细胞相关的抗原结合的抗体的B细胞的任何分离室中(或其附近)观察到在珠子表面上发展出阳性信号。使用该方法，可以特异性地识别表达感兴趣的抗体的个体B细胞。可以将不产生任何感兴趣的抗体的B细胞从它们的分离室移出并从微流体芯片中输出到废物中。可以将被识别为表达与患者的髓样乳腺癌细胞衍生的抗原结合的抗体的B细胞移出分离室(例如，使用DEP力，例如OET)并输出用于所表达的抗体的重链和轻链可变区的扩增和测序。如果B细胞在被诱导以表达抗体的同时扩增，则可以输出B细胞的克隆群用于所表达的抗体的重链和轻链可变区的扩增和测序。
实施例5.识别表达与癌细胞结合的抗体的B细胞
或者，可以进行筛选以识别表达与患者自身的髓样乳腺癌细胞结合的抗体的患者特异性B细胞。实验设计可以包括以下步骤：
·收获和选择B细胞和癌细胞；
·将细胞加载到微流体装置中；和
·测定B细胞所产生的抗体与癌细胞的结合。
A.细胞收获和选择
如实施例1(上文)中所述，从患者获得髓样乳腺癌肿瘤的活组织检查，并且将活组织检查的细胞解离。使用抗CD-20磁珠从所得的解离的细胞样品中选择B细胞，从而产生富含B细胞的细胞样品。随后，使用抗ER(雌激素受体)、抗PR(孕酮受体)和抗HER2磁珠的混合物，将在B细胞耗尽的解离的细胞样品中剩余的细胞中耗尽非髓样乳腺癌细胞，以产生富含三阴性乳腺癌细胞的样品。
B.将细胞加载到微流体装置中
接下来，通过以0.1-1.0微升/秒的速率将1-3微升样的品流入流动通道中，将富含B细胞的细胞样品加载到微流体芯片中。然后停止样品的流，并且当样品中的细胞位于流动通道中时，使用DEP力(例如，OET)选择性地捕捉B细胞并将其移动到与流动通道连接的分离室的分离区域中。将单个B细胞置于多个分离室中的每一个中。取决于所使用的微流体芯片的尺寸，可以在单个芯片上单独分离3000个或更多个B细胞。通常，预期样品中存在更少的B细胞。结果是，可以分离样品中的所有B细胞。一旦将B细胞移动进入分离室，就用新鲜培养基冲洗流动通道以清理流动通道中不需要的细胞和碎片。
清理流动通道后，将富含三阴性乳腺癌细胞的样品加载到芯片中。与富含B细胞的样品类似，使1-3微升富含癌细胞的样品以0.1-1微升/秒的速率流动到流动通道中，然后停止流动。使用形态学特征，使用DEP力(例如，OET)选择多个癌细胞(例如，3-6个)并将其移动到包含B细胞的每个分离室中。一旦将癌细胞移动到分离室中，就用新鲜培养基冲洗流动通道以清理流动通道中不需要的细胞和碎片。以这种方式，微流体芯片中的多个分离室装载有单个B细胞和多个髓样乳腺癌细胞。
C.抗体结合测定
为了确定任何分离的B细胞是否产生与癌细胞结合的抗体，将微流体芯片中的B细胞在有利于抗体表达的条件下孵育。在这种孵育后，使含有与人抗体恒定区结合的第二抗体的混合物的培养基流动到微流体芯片中，然后停止。可以含有荧光标记的抗人IgG抗体、抗人IgM抗体和任选的抗人IgA、IgE和/或IgD的抗体的抗体混合物中的抗体被允许扩散到分离室中并与B细胞所产生的抗体结合。如果B细胞所产生的抗体与相应的分离室中的一个或多个癌细胞结合，则抗人第二抗体(及其标记物)将变得可检测地与髓样乳腺癌细胞的表面结合。
在第二抗体孵育步骤期间，使用用于检测荧光信号的滤光器(例如，德克萨斯红滤光器)周期性地对微流体芯片成像。可以每5分钟拍摄图像，持续1小时，每次曝光持续1000ms。
D.结果
可以在含有表达与癌细胞结合的抗体的B细胞的任何分离室中观察到在癌细胞表面上发展出阳性信号。使用该方法，可以特异性地识别表达感兴趣的抗体的个体B细胞。可以将不产生任何感兴趣的抗体的B细胞从它们的分离室移出并从微流体芯片中输出到废物中。可以将被识别为表达与患者的髓样乳腺癌细胞结合的抗体的每个B细胞移出分离室(例如，使用DEP力，例如OET)并输出用于所表达的抗体的重链和轻链可变区的扩增和测序。如果B细胞在被诱导以表达抗体的同时扩增，则可以输出B细胞的克隆群用于所表达的抗体的重链和轻链可变区的扩增和测序。
实施例6.使用CAR-T和溶瘤病毒的联合疗法
嵌合的抗原受体(CAR)-重定向的T细胞具有在癌症治疗中提供增加的益处的潜力。患有癌症例如神经母细胞瘤的患者经历活组织检查或手术切除，且使用前述实施例来识别产生与癌症结合的抗体的B细胞。将CAR-T细胞系工程化，以对应于由被识别的B细胞产生的抗体来表达抗体或其片段(我们使用“对应于”的意思是具有至少相同的重链CDR、至少相同的重链和轻链CDR、至少可变重链或至少可变重链和轻链)。对于该患者，将CAR-T细胞系工程化以表达scFv，其中通过RT-PCR来克隆编码重链和轻链可变区的基因。通过重叠拼接PCR产生组合的scFv基因，然后将其连接到载体噬菌体DNA的限制性位点中。
将scFv序列框内克隆到逆转录病毒骨架中，例如SFG逆转录病毒骨架中。使用239T细胞制备逆转录病毒上清液。48和72小时后收集含有逆转录病毒的上清液。对于转导，将用OKT3(Ortho Biotech，Bridgewater，NJ)和CD28(Becton Dickinson，Mountain View，CA)抗体和重组人IL-12(100单位/ml；Proleukin，Chiron，Emeryville，CA)激活的0.5×106/ml外周血单核细胞(PBMC)在预先涂覆有重组纤连蛋白片段(FN CH-296，Retronectin，TakaraShuzo，Otsu，Japan)的24孔板中铺在完全培养基(RPMI1640 45％、Click培养基45％、10％热灭菌的人血清和2mM L-谷氨酰胺)中。添加病毒上清液后，将细胞旋转并在37℃、5％CO2中孵育。72小时后测量T淋巴细胞上的CAR表达，并且细胞保持在完全培养基中培养，每3天添加rIL-2(50单位/ml)。
将这种CAR-T细胞过继转移到患者体内，同时施用溶瘤病毒，例如溶瘤腺病毒。溶瘤腺病毒可以是Ad5D24，其任选地表达重组IL15、RANTES或其组合。预计患者具有显著的临床改善。
示例性实施方案的列举
1.一种制备抗体治疗剂的方法，该方法包括：从得自患者的至少一个实体瘤样品提供解离的细胞样品；将解离的细胞样品加载到微流体装置中，该微流体装置具有至少一个流动区域和至少一个与流动区域流体连接的分离区域；将至少一个B细胞从解离的细胞样品移动到微流体装置中的至少一个分离区域中，从而获得至少一个分离的B细胞；以及识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞。
2.实施方案1的方法，其中所述分离区域包含至少一个促进B细胞淋巴细胞活力的经调节的表面，所述经调节的表面包含共价连接的分子。
3.实施方案1的方法，其中所述分离区域包含多个促进B细胞淋巴细胞活力的经调节的表面，每个经调节的表面包含共价连接的分子。
4.实施方案2或3的方法，其中所述至少一个经调节的表面或所述多个经调节的表面中的每一个包含共价连接的亲水分子的层。
5.实施方案4的方法，其中所述亲水分子选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含氨基酸的聚合物及其组合。
6.实施方案1的方法，其中所述分离区域包含至少一个涂覆有促进B细胞活力的涂层材料的表面。
7.实施方案1的方法，其中所述分离区域包含多个表面，每个表面均涂覆有促进B细胞活力的涂层材料。
8.实施方案6或7的方法，其中所述涂层材料包含亲水分子。
9.实施方案8的方法，其中所述亲水分子选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含氨基酸的聚合物及其组合。
10.实施方案1至9中任一项所述的方法，其中至少一个分离区域中的每一个在微流体装置中形成死端，并且其中当流动区域基本上填充有流动的第一流体介质且分离区域基本上填充有第二流体介质时：第二介质的组分能够扩散到第一介质中，并且第一介质的组分能够扩散到第二介质中；并且基本上没有第一介质从流动区域进入分离区域的流动。
11.实施方案1至10中任一项的方法，其中微流体装置的流动区域包括微流体通道。
12.实施方案11的方法，其中至少一个分离区域中的每一个是相应的隔离室的一部分，并且其中每个隔离室进一步包括将相应的分离区域流体连接到微流体通道的连接区域。
13.实施方案12的方法，其中连接区域具有约20微米至约60微米的宽度Wcon。
14.实施方案12或13的方法，其中至少一个分离区域中的每一个的宽度Wiso大于相应的连接区域的宽度Wcon。
15.实施方案14的方法，其中至少一个分离区域中的每一个的宽度Wiso为约50微米至约250微米。
16.实施方案12至15中任一项的方法，其中每个隔离室包含约0.5nl至约2.5nl的体积。
17.实施方案1至16中任一项的方法，其中使用重力和/或局部流体流动将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域中。
18.实施方案1至17中任一项的方法，其中微流体装置包括具有DEP配置的衬底。
19.实施方案18的方法，其中将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域中包括使用DEP力来移动至少一个B细胞。
20.实施方案1至19中任一项的方法，其中在加载解离的细胞样品之前，该方法进一步包括用可检测标志物来标记解离的细胞样品中的B细胞。
21.实施方案20的方法，其中将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域中包括基于可检测标志物的检测选择至少一个B细胞用于移动。
22.实施方案1至21中任一项的方法，其中将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域中包括将多个单独的B细胞移动到相应的多个单独的分离区域中。
23.实施方案1至22中任一项的方法，进一步包括：使至少一个B细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触。
24.实施方案23的方法，其中刺激剂包含CD40激动剂。
25.实施方案24的方法，其中CD40激动剂包含CD40L、其衍生物或抗CD40抗体。
26.实施方案23的方法，其中刺激剂包含一种或多种CD40L+饲养细胞。
27.实施方案26的方法，其中一种或多种CD40L+饲养细胞是T细胞或其衍生物。
28.实施方案23至27中任一项的方法，其中刺激剂包含toll样受体(TLR)激动剂。
29.实施方案28的方法，其中TLR激动剂是CpG寡核苷酸。
30.实施方案23至29中任一项的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂接触1至10天的时间。
31.实施方案30的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂在所述1至10天的时间内基本连续地接触。
32.实施方案23至31中任一项的方法，进一步包括：向至少一个B细胞提供培养基，其中该培养基包含一种或多种促进B细胞扩增的生长诱导剂。
33.实施方案32的方法，其中一种或多种生长诱导剂包括至少一种选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21和BAFF的药剂。
34.实施方案32或33的方法，其中所提供的培养基包含刺激剂。
35.实施方案32至34中任一项的方法，其中向至少一个B细胞提供培养基1至10天的时间。
36.实施方案32至35中任一项的方法，其中将至少一个分离的B细胞中的每个B细胞在微流体装置的分离区域中培养至约8至20个细胞的细胞计数。
37.实施方案32至36中任一项的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂接触并向至少一个B细胞提供培养基的步骤在基本上共同延长的时间段内进行。
38.实施方案23至37中任一项的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂接触在将解离的细胞样品加载到微流体装置中之前进行。
39.实施方案23至38中任一项的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂接触在将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域中之后进行。
40.实施方案23至39中任一项的方法，其中使至少一个B细胞与刺激剂接触在识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞的步骤期间进行。
41.实施方案1至40中任一项的方法，其中识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞包括将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中。
42.实施方案41的方法，其中将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中包括将包含癌细胞相关的抗原的流体介质引入到微流体装置中。
43.实施方案42的方法，其中癌细胞相关的抗原溶解在流体介质中。
44.实施方案41的方法，其中将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中包括将微物体引入到微流体装置中，其中微物体包含癌细胞相关的抗原。
45.实施方案44的方法，其中微物体选自细胞、脂质体、脂质纳米筏和珠子。
46.实施方案45的方法，其中微物体是珠子，并且其中癌细胞相关的抗原与珠子缀合。
47.实施方案45或46的方法，其中癌细胞相关的抗原是存在于至少一个肿瘤样品中的癌细胞的细胞表面上存在的膜相关的抗原。
48.实施方案47的方法，其中与珠子缀合的癌细胞相关的抗原来自从分离自至少一个肿瘤样品的癌细胞获得的细胞膜制品。
49.实施方案45的方法，其中微物体是癌细胞。
50.实施方案49的方法，其中癌细胞表现出由来自从患者获得的至少一个肿瘤样品的癌细胞表现出的标志物。
51.实施方案49的方法，其中从至少一个肿瘤样品中分离癌细胞。
52.实施方案49或50的方法，其中从得自不同患者的一个或多个肿瘤样品中分离癌细胞。
53.实施方案52的方法，其中从其获得至少一个实体瘤样品的患者和不同患者已被诊断为患有相同类型的癌症。
54.实施方案49或50的方法，其中癌细胞来自癌细胞系。
55.实施方案41至54中任一项的方法，其中将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中包括：使含有包含癌细胞相关的抗原的微物体的流体介质流过微流体装置的流动区域；以及当介质中的至少一些微物体位于流动区域的靠近至少一个分离区域的部分中时，停止流体介质的流动。
56.实施方案54的方法，其中将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中进一步包括将至少一个微物体移动到微流体装置中的至少一个分离区域中。
57.实施方案56的方法，其中将至少一个微物体移动到微流体装置中的至少一个分离区域中包括将至少一个微物体移动到多个分离区域中的每一个中。
58.实施方案56或57的方法，其中将至少一个微物体移动到包含至少一个B细胞的至少一个分离区域中，从而产生具有至少一个微物体和至少一个B细胞的至少一个分离区域。
59.实施方案56的方法，其中将至少一个微物体和至少一个B细胞移动到不同的分离区域中。
60.实施方案59的方法，其中不同的分离区域在微流体装置内彼此相邻。
61.实施方案41至60中任一项的方法，其中识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞进一步包括：使含有标记的抗体结合剂的流体介质流过微流体装置的流动区域；当流体介质中的至少一些标记的抗体结合剂位于流动区域的靠近至少一个分离区域的部分中时，停止流体介质的流动；以及监测标记的抗体结合剂与癌细胞相关的抗原的结合。
62.实施方案61的方法，其中标记的抗体结合剂是标记的抗IgG抗体。
63.实施方案61或62的方法，其中标记的抗体结合剂与荧光标记物共价结合。
64.实施方案61至63中任一项的方法，其中标记的抗体结合剂在与癌细胞相关的抗原的混合物中提供。
65.实施方案61至63中任一项的方法，其中在提供癌细胞相关的抗原之后提供标记的抗体结合剂。
66.实施方案61至65中任一项的方法，其中监测标记的抗体结合剂与癌细胞相关的抗原的结合包括使微流体装置成像。
67.实施方案66的方法，其中成像包括荧光成像。
68.实施方案66或67的方法，其中所述成像包括拍摄多个图像。
69.实施方案68的方法，其中以固定的时间间隔拍摄多个图像。
70.实施方案1至69中任一项的方法，其中解离的细胞样品得自一个实体瘤样品。
71.实施方案1至69中任一项的方法，其中解离的细胞样品得自多个实体瘤样品。
72.实施方案1至71中任一项的方法，其中提供解离的细胞样品包括获得至少一个实体瘤样品，以及从至少一个实体瘤样品中解离单细胞。
73.实施方案1至72中任一项的方法，其中通过以下方式从至少一个肿瘤样品中解离所述解离的细胞样品的单个细胞：胶原酶加脱氧核糖核酸酶消化；和/或细胞解离器仪器。
74.实施方案1至72中任一项的方法，其中加载解离的细胞样品的步骤包括：筛分解离的细胞样品以分离比原始解离的样品具有更高的B细胞浓度的富含B细胞的部分；以及将富含B细胞的部分加载到微流体装置中。
75.实施方案74的方法，其中所述筛分包括使用选自CD19、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA和GL7的至少一种标志物从解离的细胞样品中选择B细胞。
76.实施方案1至75中任一项的方法，其中在将解离的细胞样品或富含B细胞的部分加载到微流体装置中之前，该方法进一步包括用可检测的标志物标记解离的细胞样品中的癌细胞。
77.实施方案1至76中任一项的方法，其中加载解离的细胞样品的步骤进一步包括：筛分解离的细胞样品以分离比原始解离的样品具有更高浓度的癌细胞的富含癌细胞的部分；以及将富含癌细胞的部分加载到微流体装置中。
78.实施方案76的方法，其中该方法进一步包括选择至少一个癌细胞用于移动到至少一个分离区域中。
79.实施方案77的方法，其中该方法进一步包括选择至少一个癌细胞用于移动到至少一个分离区域中，并且其中基于可检测标志物的检测来选择至少一个癌细胞。
80.实施方案79的方法，其中在将B细胞加载到微流体装置中并移动到分离区域中之前，将至少一个癌细胞加载到微流体装置中并移动到微流体装置的分离区域中。
81.实施方案77的方法，其中在将B细胞加载到微流体装置中并移动到分离区域中之后，将富含癌细胞的部分加载到微流体装置的流动区域中。
82.实施方案77的方法，其中癌细胞不进入分离区域。
83.实施方案76至82中任一项的方法，其中使用至少一种对癌症为特异性的标志物(例如，本文公开的任何癌症相关的标志物)将癌细胞从解离的细胞样品中选择或富集。
84.实施方案76至83中任一项的方法，其中使用形态差异将癌细胞从解离的细胞样品中分离或富集。
85.实施方案76至84中任一项的方法，其中使用至少一种在癌细胞中下调的标志物从解离的细胞样品中选择癌细胞，以将正常细胞与癌细胞分离。
86.实施方案74至85中任一项的方法，其中通过FACS从解离的细胞样品中选择B细胞和/或癌细胞。
87.实施方案74至86中任一项的方法，其中通过基于磁珠的分选而从解离的细胞样品中选择B细胞和/或癌细胞。
88.实施方案1至87中任一项的方法，其中实体瘤样品是肿瘤活组织检查。
89.实施方案1至88中任一项的方法，其中产生至少一个肿瘤样品的肿瘤具有三级淋巴样结构。
90.实施方案1至89中任一项的方法，其中产生至少一个肿瘤样品的肿瘤是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症(例如起源于泌尿道例如肾脏(例如，肾细胞癌)、输尿管、膀胱或尿道中的癌症；男性生殖道的癌症(如睾丸癌、前列腺癌、精囊癌、输精管癌或阴茎癌)；或女性生殖道的癌症(如卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌或输卵管癌))、神经系统的癌症(如神经母细胞瘤)、肠癌(如结肠直肠癌)、肺癌、黑素瘤或其他类型癌症。
91.实施方案90的方法，其中肿瘤是髓样乳腺癌。
92.实施方案90的方法，其中肿瘤是间皮瘤。
93.实施方案1至92中任一项的方法，其中该方法进一步包括：从微流体装置输出至少一个经识别的B细胞或由其衍生的克隆B细胞群。
94.实施方案93的方法，其中单独输出每个经识别的B细胞或由其衍生的克隆B细胞群。
95.实施方案1至94中任一项的方法，进一步包括：对至少一个经识别的B细胞或由其衍生的B细胞的一些或全部克隆群进行抗体测序。
96.实施方案95的方法，其中进行抗体测序包括测定来自至少一个经识别的B细胞或来自由其衍生的B细胞的一些或全部克隆群的配对的重链和轻链可变域抗体序列。
97.实施方案1至96中任一项的方法，其中该方法进一步包括产生抗体治疗剂，所述抗体治疗剂包含来自至少一个经识别的B细胞的一些或所有配对的重链和轻链可变域序列。
98.实施方案1至97中任一项的方法，其中T或NK细胞存在于解离的细胞样品中。
99.实施方案98的方法，其中该方法进一步包括对解离的细胞样品进行选择以分离比原始解离的样品具有更高浓度的T或NK细胞的部分。
100.实施方案98或99的方法，其中T或NK细胞得自同一患者的实体瘤样品。
101.实施方案98至100中任一项的方法，其中通过使用选自CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69和CD3的至少一种标志物将T细胞与解离的细胞样品分离；或者其中通过使用CD56作为标志物将NK细胞与解离的细胞样品分离。
102.实施方案98至101中任一项的方法，其中从患者中选择并克隆单个T或NK细胞。
103.实施方案1至102中任一项的方法，其中该方法包括使用微流体装置来识别至少一个B细胞，所述B细胞产生能够与患者的癌细胞和来自另一来源的癌细胞这两者结合的抗体。
104.实施方案1至103中任一项的方法，其中该方法进一步包括使用微流体装置来识别由B细胞产生的抗体是否能够与非癌细胞结合。
105.实施方案104的方法，其中非癌细胞和癌细胞来自提供至少一个肿瘤样品的患者。
106.实施方案104或105的方法，其中使用同一微流体装置来识别抗体与癌细胞和非癌细胞的结合。
107.实施方案106的方法，其中将癌细胞和非癌细胞按顺序加载在同一流动路径中。
108.一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括用通过实施方案1至107中任一项的方法所产生的抗体或其片段治疗患者。
109.实施方案108的方法，其中肿瘤样品取自接受治疗的同一患者。
110.实施方案108或109的方法，其中从获得肿瘤样品到治疗的时间为至多约2个月。
111.实施方案108至110中任一项的方法，其中抗体或其片段是单链抗体。
112.实施方案108至110中任一项的方法，其中抗体或其片段具有两条重链和两条轻链。
113.实施方案108至111中任一项的方法，其中抗体被显示在工程化的T或NK细胞上。
114.实施方案113的方法，其中工程化的T细胞是嵌合的抗原受体T细胞或者工程化的NK细胞是嵌合的抗原受体NK细胞。
115.实施方案113或114的方法，其中T或NK细胞在被工程化以显示抗体之前从同一患者获得。
116.实施方案115的方法，其中T或NK细胞得自患者的肿瘤样品。
117.实施方案108至116中任一项的方法，其中抗体或其片段与另一种疗法组合施用。
118.如权利要求117所述的方法，其中组合疗法是手术、放疗、化疗、CAR-T细胞疗法、CAR-NK细胞疗法、T细胞疗法、其他免疫疗法或者免疫刺激分子或肿瘤特异性病毒的施用。
119.一种标记或检测患者癌症的方法，包括施用与可检测标记物缀合的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是通过实施方案1至107中任一项的方法产生的。
120.一种工程化的抗体构建体，其包含：通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少重链CDR；通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少轻链CDR；通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少重链和轻链CDR；通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少重链可变区；通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少轻链可变区；或通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的至少重链和轻链可变区。
121.一种工程化的抗体构建体，其中该工程化的抗体构建体是通过实施方案1至107中任一项的方法识别的抗体的变体(例如，所识别的抗体的轻链和/或重链可变区中具有1至20、1至15、1至10或1至5个氨基酸取代、添加或缺失的变体)。
122.实施方案120或121的工程化抗体构建体，其中构建体是Fab、Fab'(2)、scFv、多价scFv、微抗体、双特异性抗体或骆驼可变功能性重链结构域。
123.一种工程化的T或NK细胞，其包含在其外表面上显示的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是通过实施方案1至107中任一项的方法识别的。
124.实施方案123的工程化的T或NK细胞，其中T或NK细胞以及抗体或其片段得自同一患者。
125.一种制备工程化的T细胞的方法，所述工程化的T细胞包含在其外表面上显示的抗体或其片段，所述方法包括：根据实施方案1至107中任一项的方法识别与肿瘤样品结合的抗体；以及基因工程化T细胞以表达抗体或其片段。
126.实施方案125的方法，其中T细胞、表达抗体的B细胞和肿瘤样品得自同一患者。
127.一种制备工程化的NK细胞的方法，所述工程化的NK细胞包括在其外表面显示的抗体或其片段，该方法包括：根据实施方案1至107中任一项的方法识别与肿瘤样品结合的抗体；以及基因工程化NK细胞以表达抗体或其片段。
128.实施方案127的方法，其中NK细胞、表达抗体的B细胞和肿瘤样品得自同一患者。
等同
前述书面说明被认为足以使本领域技术人员能够实施这些实施方案。前面的描述和实施例详述了某些实施方案并描述了预期的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中看起来如何详细，实施方案可以以许多方式实施，并且应当根据所附权利要求及其任何等同来解释。

Claims (32)

1.一种识别分离的B细胞的方法，所述分离的B细胞产生能够结合癌细胞相关抗原的抗体，所述方法包括：
a.从得自患者的至少一个实体瘤样品提供解离的细胞样品；
b.将解离的细胞样品加载到微流体装置中，该微流体装置具有DEP配置、至少一个用于含有第一流体介质流的流动区域和至少一个用于含有第二流体介质并与流动区域流体连接且是未扫描区域的分离区域；
c.使用DEP力将至少一个B细胞从解离的细胞样品移动进入微流体装置的至少一个分离区域的相应分离区域中，从而获得至少一个分离的B细胞；以及
d.识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述分离区域包含至少一个促进B细胞淋巴细胞活力的经调节的表面，所述经调节的表面包含共价连接的分子，其中所述共价连接的分子包括亚烷基醚部分、氨基酸部分、糖部分或其任意组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述至少一个经调节的表面包含共价连接的亲水分子的层。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述分离区域包含至少一个涂覆有促进B细胞活力的涂层材料的表面，其中所述涂层材料包含聚合物，所述聚合物包括亚烷基醚部分、氨基酸部分、糖部分或其任意组合。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括微流体通道，所述微流体通道包括流动区域的至少一部分，和
至少一个隔离室，每个隔离室包括至少一个分离区域和将分离区域流体连接到微流体通道的连接区域，其中所述连接区域包括通向微流体通道的近端开口和通向至少一个分离区域的远端开口，并且其中从近端开口到远端开口的连接区域的长度Lcon是连接区域的近端开口的宽度Wcon的至少1.0倍，并且
其中至少一个隔离室的至少一个分离区域具有通向连接区域的单个开口，其中当流动区域和隔离室基本上填充有流体介质时，第二介质的组分能够扩散到第一介质中，并且第一介质的组分能够扩散到第二介质中；并且
基本上没有第一介质从流动区域进入分离区域的流动。
6.如权利要求5所述的方法，其中连接区域具有20微米至100微米的宽度Wcon。
7.如权利要求5所述的方法，其中至少一个隔离室包含0.5nl至2.5nl的体积。
8.如权利要求1所述的方法，其中使用DEP力将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域的相应分离区域是光致动的。
9.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中在加载解离的细胞样品之前，该方法进一步包括用可检测标志物来标记解离的细胞样品中的B细胞，并且其中将至少一个B细胞移动到至少一个分离区域的相应分离区域中包括基于可检测标志物的检测选择至少一个B细胞用于移动。
10.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，进一步包括：
使至少一个B细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触，其中刺激剂包含CD40激动剂和/或一种或多种CD40L+饲养细胞，并且其中使至少一个B细胞与刺激剂接触1至10天的时间。
11.如权利要求10所述的方法，其中刺激剂进一步包含toll样受体(TLR)激动剂。
12.如权利要求10所述的方法，进一步包括：
向至少一个B细胞提供培养基，其中该培养基包含一种或多种促进B细胞扩增的生长诱导剂，并且其中一种或多种生长诱导剂包括至少一种选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21和BAFF的药剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中将至少一个B细胞中的每个B细胞在微流体装置的分离区域中培养至约8至20个细胞的细胞计数。
14.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞包括将包含癌细胞相关的抗原的流体介质引入到微流体装置中，其中流体介质包含可溶癌细胞相关的抗原或包含癌细胞相关的抗原的微物体。
15.如权利要求14所述的方法，其中微物体是珠子，并且癌细胞相关的抗原与珠子缀合，或其中微物体是细胞，并且癌细胞相关的抗原是存在于癌细胞的细胞表面上的膜相关的抗原。
16.如权利要求15所述的方法，其中微物体是珠子，并且癌细胞相关的抗原来自从分离自至少一个实体瘤样品的癌细胞获得的细胞膜制品，或其中微物体是从至少一个实体瘤样品分离的癌细胞。
17.如权利要求14所述的方法，其中将癌细胞相关的抗原引入到微流体装置中包括：
使含有包含癌细胞相关的抗原的微物体的流体介质流过微流体装置的流动区域；
当介质中的至少一些微物体位于流动区域的靠近至少一个分离区域的部分中时，停止流体介质的流动；以及
将至少一个微物体移动到包含至少一个B细胞的微流体装置中的至少一个分离区域的相应分离区域中，从而产生具有至少一个微物体和至少一个B细胞的至少一个分离区域。
18.如权利要求14所述的方法，其中识别产生能够与癌细胞相关的抗原结合的抗体的至少一个分离的B细胞进一步包括：
使含有标记的抗体结合剂的流体介质流过微流体装置的流动区域；以及
当流体介质中的至少一些标记的抗体结合剂位于流动区域的靠近至少一个分离区域的部分中时，停止流体介质的流动；以及
监测标记的抗体结合剂与癌细胞相关的抗原的结合。
19.如权利要求18所述的方法，其中标记的抗体结合剂在具有癌细胞相关的抗原的混合物中提供。
20.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中提供解离的细胞样品包括获得至少一个实体瘤样品，以及从至少一个实体瘤样品中解离单细胞。
21.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中在加载解离的细胞样品之前，该方法进一步包括：
筛分解离的细胞样品以分离比原始解离的样品具有更高的B细胞浓度的富含B细胞的部分；以及
将富含B细胞的部分加载到微流体装置中。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述筛分包括使用选自CD19、CD20、IgM、IgD、CD38、CD27、CD138、PNA和GL7的至少一种标志物从解离的细胞样品中选择B细胞。
23.如权利要求21所述的方法，其中在加载解离的细胞样品之前，该方法进一步包括：
筛分解离的细胞样品以分离比原始解离的样品具有更高浓度的癌细胞的富含癌细胞的部分；以及
将富含癌细胞的部分加载到微流体装置中。
24.如权利要求23所述的方法，其中使用至少一种对癌症为特异性的标志物和/或使用形态差异来富集癌细胞。
25.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中产生至少一个实体瘤样品的肿瘤包含三级淋巴样结构。
26.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中产生至少一个实体瘤样品的肿瘤是乳腺癌、泌尿生殖系统癌症、神经系统的癌症、肠癌、肺癌或黑素瘤。
27.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，进一步包括：
对至少一个经识别的B细胞或由其衍生的B细胞的一些或全部克隆群进行抗体测序。
28.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括产生抗体治疗剂，所述抗体治疗剂包含来自至少一个经识别的B细胞的抗体的至少重链和轻链CDR序列。
29.如权利要求1-4和8中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括使用微流体装置来识别由B细胞产生的抗体是否能够与非癌细胞结合。
30.如权利要求29所述的方法，其中非癌细胞来自提供至少一个肿瘤样品的患者。
31.如权利要求5所述的方法，其中隔离室的单个开口处的微流体通道的高度Hch是20-100微米。
32.如权利要求26所述的方法，其中产生至少一个实体瘤样品的肿瘤是肾细胞癌、睾丸癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、神经母细胞瘤或结肠直肠癌。
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