CN110799840A - 筛选b细胞淋巴细胞的方法 - Google Patents

筛选b细胞淋巴细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110799840A
CN110799840A CN201780080081.2A CN201780080081A CN110799840A CN 110799840 A CN110799840 A CN 110799840A CN 201780080081 A CN201780080081 A CN 201780080081A CN 110799840 A CN110799840 A CN 110799840A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
region
cell lymphocytes
microfluidic device
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780080081.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110799840B (zh
Inventor
M·帕克
J·C·布里格斯
J·M·麦克尤恩
R·K·拉梅纳尼
H·基拉蒂纳格尔
K·W·司徒
A·T·比嘉
M·P·怀特
R·D·小罗威
汪晓华
凯文·T·查普曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Phenomex Inc
Original Assignee
Berkeley Lights Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Berkeley Lights Inc filed Critical Berkeley Lights Inc
Priority to CN202210259589.1A priority Critical patent/CN114755412A/zh
Publication of CN110799840A publication Critical patent/CN110799840A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110799840B publication Critical patent/CN110799840B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5052—Cells of the immune system involving B-cells
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD45
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
    • B01L2200/0652—Sorting or classification of particles or molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0424—Dielectrophoretic forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/056—Immunostimulating oligonucleotides, e.g. CpG
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/185—Nucleic acid dedicated to use as a hidden marker/bar code, e.g. inclusion of nucleic acids to mark art objects or animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/518—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the immobilisation of the nucleic acid sample or target
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/537—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the capture oligonucleotide acting as a primer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Fluid Mechanics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)

Abstract

本文描述了用于在微流体环境中筛选抗体产生细胞的方法。抗体产生细胞可以是B细胞淋巴细胞，其可以是记忆B细胞或浆细胞。可以使目标抗原靠近抗体产生细胞，并且可以监测抗体产生细胞产生的抗体与抗原的结合。还描述了从抗体产生细胞获得测序文库的方法。

Description

筛选B细胞淋巴细胞的方法
本申请是一项非临时申请，根据35U.S.C.119(e)要求2016年10月23日提交的美国临时申请号62/411,690和2016年10月24日提交的美国临时申请号62/412,092的优先权，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。
背景技术
筛选和识别产生能够特异性结合目标抗原的抗体的细胞是有意义的，包括在杂交瘤开发领域内。此外，有意义的是识别高度表达的抗体产生细胞。提供适合于抗体产生细胞的生长环境的合适环境以及提供可以容易地监测结合/表达测定的环境一直是一项艰巨的挑战。此外，期望提供测定结果与特定细胞的相关性，其证明其分泌的抗体的所需表达/结合特性。本文提供了对抗体开发领域的这些方面的改进。
发明内容
本发明部分基于以下发现：可以在微流体装置内筛选B细胞淋巴细胞，包括原代B细胞，以确定B细胞淋巴细胞是否表达特异性结合目标抗原的抗体。因此，在一个方面，提供了检测抗体产生细胞表达特异性结合目标抗原的抗体的方法。该方法包括将抗体产生细胞引入微流体装置的步骤。抗体产生细胞可以是例如B细胞淋巴细胞，例如记忆B细胞或浆细胞。
例如，微流体装置可包括流动区域和至少一个微流体隔离坞(例如，多个隔离坞)，所述流动区域可包括微流体通道。每个隔离坞可包括分离区域和将分离区域流体连接到流动区域(例如，微流体通道)的连接区域。
一些本公开的方法包括以下额外步骤：将抗体产生细胞加载到隔离坞的分离区域中；将目标抗原引入微流体装置中，使得目标抗原靠近抗体产生细胞；并且监测目标抗原与抗体产生细胞表达的抗体的结合。加载的细胞可以是加载到具有多个隔离坞的微流体装置中的细胞(例如，B细胞)群之一。在此类实施方案中，可将一种或多种抗体产生细胞加载到多个隔离坞中的每一个的分离区域中。在一些实施方案中，将单个抗体产生细胞加载到每个隔离坞中。当在抗体产生细胞附近提供时，目标抗原可溶解或连接于微物体，例如细胞、脂质体、脂质纳米筏(lipid nanoraft)或合成珠(例如，微珠或纳米珠)。这些微物体可以在显微镜下可见。监测目标抗原与由抗体产生细胞产生的抗体之间的结合可以包括：提供标记的目标抗原，并检测目标抗原(例如，标记的目标抗原)的直接结合；提供标记的抗体结合剂，并检测标记的抗体结合剂与目标抗原的间接结合(例如，与呈递目标抗原的微物体)；并提供抗体结合剂，并检测标记的目标抗原与抗体结合剂(例如，与多个抗体结合剂连接的微物体)的间接结合。抗体结合剂可以是同种型特异性的(例如，抗-IgG抗体或其IgG-结合片段)。抗原或目标上的标记或抗体结合剂可以是荧光标记。
对于识别为表达抗原-结合抗体的抗体产生细胞，所公开的方法可以进一步包括以下步骤：裂解识别的细胞(例如，B细胞)；逆转录来自裂解细胞的VH mRNA和/或VL mRNA，以分别形成VH cDNA和/或VL cDNA；并对所述VH cDNA和/或VL cDNA的至少一部分进行测序。裂解和逆转录步骤可以在微流体装置内或微流体装置外部进行。例如，可以输出识别的细胞(例如，作为单个细胞)用于细胞裂解和进一步处理。或者，在加载它的隔离坞内裂解识别的细胞，裂解后释放的VH mRNA和/或VL mRNA可以被捕获珠子(即，具有与其表面连接的寡核苷酸的珠子，其中寡核苷酸能够特异性结合VH mRNA和/或VL mRNA)俘获。捕获珠子可以在捕获的VH mRNA和/或捕获的VL mRNA被逆转录之前或之后从微流体装置输出。
本发明的方法的这些和其他特征和优点将在下面的描述和所附权利要求中阐述或变得更加明显。通过所附实施例和权利要求中特别指出的仪器和组合，可以实现和获得这些特征和优点。此外，所描述的系统和方法的特征和优点可以通过实施来了解，或者从说明书中显而易见，如下文所述。
附图简要说明
图1A示出了微流体装置和与微流体装置一起使用的系统的实例，包括根据本文公开的一些实施方案的相关控制设备。
图1B和1C分别示出了根据本文公开的一些实施方案的微流体装置的垂直和水平横截面视图。
图2A和2B分别示出了根据本发明一些实施方案的具有隔离坞的微流体装置的垂直和水平横截面视图。
图2C示出了根据本文公开的一些实施方案的隔离坞的详细水平横截面视图。
图2D示出了根据本文公开的一些实施方案的具有隔离坞的微流体装置的部分水平横截面视图。
图2E和2F示出了根据本文公开的一些实施方案的隔离坞的详细水平横截面视图。
图2G示出了根据本文公开的实施方案的具有流动区域的微流体装置，该流动区域包含多个流动通道，每个流动通道流体连接到多个隔离坞。
图2H示出了根据本文公开的实施方案的微流体装置的局部垂直横截面视图，其中基部的面向内的表面和盖的面向内的表面是条件化的表面。
图3A示出了根据本文公开的一些实施方案的系统巢的具体实例，该系统巢被配置为与微流体装置以及相关联的控制设备可操作地连接。
图3B示出了根据本文公开的一些实施方案的用于控制微流体装置的系统的光具组。
图4示出了根据本文公开的一些实施方案，用于检测表达特异性结合目标抗原的抗体的B细胞淋巴细胞的示例性工作流程中的步骤。
图5A-5C是包含多个微流体通道的微流体装置的照片图示，每个微流体通道与多个隔离坞流体连接，并且示出了根据本文公开的一些实施方案筛选B细胞淋巴细胞的方法。
图6A是根据本文公开的实施方案的用于激活和筛选记忆B细胞的方法的示意图。
图6B是根据本文公开的实施方案的被移动到隔离坞中的各个记忆B细胞的图像。
图6C是根据本文公开的一些实施方案的多路测定的流程图。
图6D是根据本文公开的实施方案测定的记忆B细胞的荧光图像。
图6E是根据本文公开的实施方案，用于筛选记忆B细胞的方法中的步骤的示意图，其开始于测定记忆B细胞的多克隆组，然后将记忆B细胞组分离成单独的隔离坞用于后续测定。
图7A是根据本文公开的实施方案的用于筛选浆细胞的方法的示意图。
图7B是根据本文公开的实施方案测定的浆细胞的一组明场和相应的荧光图像。
图8是产生BCR测序文库的方法的示意图。
图9A是由单细胞输出和mRNA捕获产生的cDNA的尺寸分布的电泳图分析的图示。
图9B是由本文所述方法的一个实施方案产生的单细胞扩增子产生的电泳图的照片图示。
图10A-10C是根据本文所述方法的一个实施方案，从19个单个细胞捕获的mRNA产生的扩增子电泳图的照片图示。
本发明的详细描述
本说明书描述了本发明的示例性实施方案和应用。然而，本发明不限于这些示例性实施方案和应用，也不限于示例性实施方案和应用在本文中操作或描述的方式。此外，附图可以示出简化或局部视图，并且附图中的要素的尺寸可能被夸大或者不成比例。另外，由于本文使用术语“在......上”、“附接到”、“连接到”、“耦合到”或类似的词，一个要素(例如，材料、层、衬底等)可以“在另一要素上”、“附接到另一要素”、“连接到另一要素”或“耦合到另一要素”，而不论该一个要素是直接在该另一要素上、附接到该另一要素、连接到该另一要素或耦合到该另一要素，还是在该一个要素和该另一元素之间有一个或多个间隔要素。此外，除非上下文另有规定，否则如果提供方向(例如，上方、下方、顶部、底部、侧面、上、下、在……下、在……上、上部、下部、水平、垂直、“x”、“y”、“z”等)的话，它们是相对的并且仅作为示例提供，并且为了便于说明和讨论而不是作为限制。另外，在提及要素列表(例如，要素a、b、c)的情况下，这样的提及旨在包括所列要素本身中的任何一个、少于所有列出的要素的任何组合和/或所有列出的要素的组合。说明书中的章节划分仅为了便于审查，并不限制所讨论要素的任何组合。
如本文所用，“基本上”意指足以用于预期目的。因此，术语“基本上”允许由绝对或完美状态、尺寸、测量、结果等的微小的、无关紧要的变化，例如本领域普通技术人员所预期但不明显影响整体性能的变化。当与数值或者可以表示为数值的参数或特性相关地使用时，“基本上”意味着在百分之十之内。
术语“一”意味着不止一个。
如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
如本文所用，术语“置于”在其含义内包括“位于”。
如本文所用，“微流体装置”或“微流体设备”是这样的装置：其包括一个或多个分离的微流体管路，所述微流体管路被配置为容纳流体，每个微流体管路包括流体互连的管路元件，包括但不限于区域、流动路径、通道、腔室和/或坞；以及至少一个端口，所述端口被配置为允许流体(以及任选地悬浮在流体中的微物体)流入和/或流出微流体装置。通常，微流体装置的微流体管路将包括流动区域(该流动路径可以包括微流体通道)和至少一个腔室，并且将容纳小于约1mL(例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2μL)的流体体积。在某些实施方案中，微流体管路容纳约1-2、1-3、1-4、1-5、2-5、2-8、2-10、2-12、2-15、2-20、5-20、5-30、5-40、5-50、10-50、10-75、10-100、20-100、20-150、20-200、50-200、50-250或50-300μL。微流体管路可以被配置为具有与微流体装置中的第一端口(例如，入口)流体连接的第一端和与微流体装置中的第二端口(例如，出口)流体连接的第二端。
如本文所用，“纳米流体装置”或“纳米流体设备”是一种具有微流体管路的微流体装置，所述微流体管路含有至少一个管路元件，所述管路元件被配置为容纳小于约1μL的流体体积，例如，小于约750、500、250、200、150、100、75、50、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1nL或更少。纳米流体装置可以包括多个管路元件(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或更多)。在某些实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约100pL至1nL、100pL至2nL、100pL至5nL、250pL至2nL、250pL至5nL、250pL至10nL、500pL至5nL、500pL至10nL、500pL至15nL、750pL至10nL、750pL至15nL、750pL至20nL、1至10nL、1至15nL、1至20nL、1至25nL或1至50nL的流体体积。在其他实施方案中，所述至少一个管路元件中的一个或多个(例如，所有)被配置为容纳约20nL至200nL、100至200nL、100至300nL、100至400nL、100至500nL、200至300nL、200至400nL、200至500nL、200至600nL、200至700nL、250至400nL、250至500nL、250至600nL、或250至750nL的流体体积。
微流体装置或纳米流体装置在本文中可称为“微流体芯片”或“芯片”；或“纳米流体芯片”或“芯片”。
如本文所用的“微流体通道”或“流动通道”是指微流体装置的流动区域，其长度显著长于水平和垂直尺寸。例如，流动通道可以是水平或垂直尺寸的长度的至少5倍，例如，长度的至少10倍、长度的至少25倍、长度的至少100倍、长度的至少200倍、长度的至少500倍、长度的至少1,000倍、长度的至少5,000倍，或更长。在一些实施方案中，流动通道的长度在约50,000微米至约500,000微米的范围内，包括其间的任何范围。在一些实施方案中，水平尺寸在约100微米至约1000微米(例如，约150至约500微米)的范围内，并且垂直尺寸在约25微米至约200微米的范围内，例如，约40到约150微米。应当注意，流动通道可以在微流体装置中具有各种不同的空间配置，因此不限于完美线性的元件。例如，流动通道可以包括具有任何以下配置的一个或多个部分：曲线、弯曲、螺旋、倾斜、下降，叉状(例如，多个不同的流动路径)，及其任何组合。另外，流动通道沿其路径可以具有不同的横截面积，加宽和收缩以在其中提供所需的流体流动。
如本文所用，术语“障碍物”通常是指凸起或类似类型的结构，其足够大以便部分地(但不完全地)阻碍目标微物体在微流体装置中的两个不同区域或管路元件之间的移动。两个不同的区域/管路元件可以例如是微流体隔离坞和微流体通道，或者是微流体隔离坞的连接区域和分离区域。
如本文所用，术语“收缩”通常是指微流体装置中的管路元件(或两个管路元件之间的界面)的宽度变窄。收缩可以位于例如微流体隔离坞和微流体通道之间的界面处，或者微流体隔离坞的分离区域和连接区域之间的界面处。
如本文所用，术语“透明”是指允许可见光通过而在通过时基本上不改变光的材料。
如本文所用，术语“微物体”通常是指可以根据本发明分离和/或处理的任何微观物体。微物体的非限制性实例包括：无生命的微物体，例如微粒；微珠(例如，聚苯乙烯珠、LuminexTM珠等)；磁珠；微米棒；微丝；量子点等；生物微物体，例如细胞；生物细胞器；囊泡或复合物；合成囊泡；脂质体(例如，合成的或衍生自膜制品)；脂质纳米筏(nanoraft)等；或无生命微物体和生物微物体的组合(例如，附接于细胞的微珠、脂质体涂覆的微珠、脂质体涂覆的磁珠等)。珠子可以包括共价或非共价附接的部分/分子，例如荧光标志物、蛋白质、碳水化合物、抗原、小分子信号传导部分或能够用于测定的其他化学/生物物质。脂质纳米筏已经被描述在例如Ritchie等人(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins inPhospholipid Bilayer Nanodiscs,”Methods Enzymol.,464:211-231中。
如本文所用，术语“细胞”可以与术语“生物细胞”互换使用。“生物细胞的非限制性实例包括真核细胞；植物细胞；动物细胞，例如哺乳动物细胞、爬行动物细胞、禽类细胞、鱼细胞等；原核细胞；细菌细胞；真菌细胞；原生动物细胞等；从组织(例如肌肉、软骨、脂肪、皮肤、肝脏、肺、神经组织等)解离的细胞；免疫细胞，例如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等；胚胎(例如，受精卵)；卵母细胞；卵子；精子细胞；杂交瘤；培养的细胞；来自细胞系的细胞；癌细胞；感染的细胞；转染和/或转化的细胞；报告细胞等。哺乳动物细胞可以是例如人、小鼠、大鼠、马、山羊、绵羊、牛、灵长类动物等。
如果集落中能够繁殖的所有活细胞是衍生自单亲细胞的子细胞，则生物细胞的集落是“克隆的”。在某些实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过10次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过14次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均来自单亲细胞不超过17次分裂。在其他实施方案中，克隆集落中所有的子细胞均衍生自单亲细胞不超过20次分裂。术语“克隆细胞”是指同一克隆集落的细胞。
如本文所用，生物细胞的“集落”是指2个或更多个细胞(例如约2至约20、约4至约40、约6至约60、约8至约80、约10至约100、约20至约200、约40至约400、约60至约600、约80至约800、约100至约1000或大于1000个细胞)。
如本文所用，术语“维持(一个或多个)细胞”是指提供包含流体和气体组分以及任选的表面的环境，其提供保持细胞存活和/或扩增所必需的条件。
如本文所用，术语“扩增”在提及细胞时指的是细胞数目的增加。
流体介质的“组分”是介质中存在的任何化学或生物化学分子，包括溶剂分子、离子、小分子、抗生素、核苷酸和核苷、核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、脂质、脂肪酸、胆固醇、代谢物等。
如本文关于流体介质所用，“扩散(diffuse)”和“扩散(diffusion)”是指流体介质的组分沿着浓度梯度向下的热力学运动。
短语“介质的流动”意味着流体介质主要是由于除扩散之外的任何机制的整体移动。例如，介质的流动可以包括流体介质由于点之间的压力差而从一个点移动到另一个点。这样的流动可以包括液体的连续、脉冲、周期性、随机、间歇或往复流动，或其任何组合。当一种流体介质流入另一种流体介质时，可能导致介质的湍流和混合。
短语“基本上没有流动”是指流体介质的流速，其随时间平均小于材料的组分(例如，目标分析物)扩散到流体介质中或在流体介质内扩散的速率。这样的材料的组分的扩散速率可以取决于例如温度、组分的尺寸以及组分和流体介质之间的相互作用的强度。
如本文关于微流体装置内的不同区域所用，短语“流体连接”是指当不同区域基本上充满流体(例如流体介质)时，每个区域中的流体被连接以形成单一的液体。这并不意味着不同区域中的流体(或流体介质)在组成上必然相同。相反，微流体装置的不同流体连接的区域中的流体可以具有不同的组成(例如，不同浓度的溶质，例如蛋白质、碳水化合物、离子或其他分子)，当溶质沿着其各自的浓度梯度向下移动和/或流体流过装置时，这些组成处于变化中。
微流体(或纳米流体)装置可以包括“扫过”区域和“未扫过”区域。如本文所用，“扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件经受介质的流。扫过区域的管路元件可以包括例如区域、通道以及全部或部分腔室。如本文所用，“未扫过”区域包括微流体管路的一个或多个流体互连的管路元件，当流体流过微流体管路时，每个管路元件基本上不经受流体的流动。未扫过区域可以流体连接到扫过区域，条件是流体连接被构造成在扫过区域和未扫过区域之间能够实现扩散但基本上没有介质流动。因此，微流体装置可以被构造成基本上将未扫过区域与扫过区域中的介质流分离，同时在扫过区域和未扫过区域之间基本上仅能够实现扩散性流体连通。例如，微流体装置的流动通道是扫过区域的示例，而微流体装置的分离区域(下文进一步详细描述)是未扫过区域的示例。
如本文所用，“流动路径”是指一个或多个流体连接的管路元件(例如，通道、区域、腔室等)，其限定并受限于介质流动的轨迹。因此，流动路径是微流体装置的扫过(swept)区域的示例。其他管路元件(例如，未扫过(unswept)区域)可以与包括流动路径的管路元件为流体连接，而不受流动路径中的介质流动的影响。
如本文所用，“B”用于表示单核苷酸，是选自G(鸟苷)、C(胞苷)和T(胸苷)核苷酸的核苷酸，但不包括A(腺嘌呤)。
如本文所用，“H”用于表示单核苷酸，是选自A、C和T的核苷酸，但不包括G。
如本文所用，“D”用于表示单核苷酸，是选自A、G和T的核苷酸，但不包括C。
如本文所用，“K”用于表示单核苷酸，是选自G和T的核苷酸。
如本文所用，“N”用于表示单核苷酸，是选自A、C、G和T的核苷酸。
如本文所用，“R”用于表示单核苷酸，是选自A和G的核苷酸。
如本文所用，“S”用于表示单核苷酸，是选自G和C的核苷酸。
如本文所用，“V”用于表示单核苷酸，是选自A、G和C的核苷酸，并且不包括T。
如本文所用，“Y”用于表示单核苷酸，是选自C和T的核苷酸。
如本文所用，“I”用于表示单核苷酸为肌苷。
如本文所用，A、C、T、G后跟“*”表示该核苷酸的磷酸键中的硫代磷酸酯取代。
如本文所用，IsoG是异鸟苷；IsoC是异胞苷；IsodG是异鸟苷脱氧核糖核苷酸，且IsodC是异胞苷脱氧核糖核苷酸。每个异鸟苷和异胞苷核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸含有分别与鸟嘌呤核碱基或胞嘧啶核碱基异构的核碱基，其通常掺入RNA或DNA中。
如本文所用，rG表示包含在核酸内的核糖核苷酸，其他情况下含有脱氧核糖核苷酸。含有所有核糖核苷酸的核酸可以不包括标记以指示每个核苷酸是核糖核苷酸，但是通过上下文其是清楚的。
如本文所用，“引发序列”是寡核苷酸序列，其是较大寡核苷酸的一部分，并且当与较大寡核苷酸分离使得引发序列包括游离3'末端时，可以作为DNA(或RNA)聚合反应中的引物。
如本文所用：μm是指微米，μm3是指立方微米，pL是指皮升，nL是指纳升，并且μL(或uL)是指微升。
加载方法。加载生物微物体或微物体(例如但不限于珠子)可涉及使用如本文所述的流体流动、重力、介电电泳(DEP)力、电润湿、磁力或其任何组合。DEP力可以光学地(例如通过光电镊子(OET)配置)和/或电学地(例如通过以时间/空间方式激活电极/电极区域)产生。类似地，可以光学地(例如通过光电润湿(OEW)配置)和/或电学地(例如通过以时间空间方式激活电极/电极区域)提供电润湿力。
微流体装置和用于操作和观察这种装置的系统。图1A示出了可以用于筛选和检测分泌与目标抗原结合(例如特异性结合)的抗体的抗体产生细胞的微流体装置100和系统150的实例。示出了微流体装置100的透视图，其盖110被部分切除以提供微流体装置100中的局部视图。微流体装置100通常包括具有流动路径106的微流体管路120，流体介质180可以任选地携带一个或多个微物体(未示出)经过流动路径106流入和/或流过微流体管路120。虽然在图1A中示出了单个微流体管路120，但合适的微流体装置可以包括多个(例如，2或3个)这种微流体管路。无论如何，微流体装置100可以被配置为纳米流体装置。在图1A所示的实施方案中，微流体管路120包括多个微流体隔离坞124、126、128和130，其中每个具有与流动路径106流体连通的开口(例如单个开口)。如下文进一步讨论的，微流体隔离坞包括已被优化用于即使当介质180流过流动路径106时，仍然将微物体保留在微流体装置(例如微流体装置100)中的各种特征和结构。然而，在描述上述之前，提供了对微流体装置100和系统150的简要说明。
如图1A中大体示出的，微流体管路120由外壳102来限定。尽管外壳102可以被物理地构造成不同的配置，但是在图1A所示的实例中，外壳102被描绘为包括支撑结构104(例如，基部)、微流体管路结构108和盖110。支撑结构104、微流体管路结构108和盖110可以彼此附接。例如，微流体管路结构108可以被布置在支撑结构104的内表面109上，并且盖110可以被布置在微流体管路结构108上方。微流体管路结构108与支撑结构104和盖110一起可以限定微流体管路120的元件。
如图1A所示，支撑结构104可以位于微流体管路120的底部，盖110可以位于微流体管路120的顶部。或者，支撑结构104和盖110可以以其他取向来配置。例如，支撑结构104可以位于微流体管路120的顶部，盖110可以位于微流体管路120的底部。无论如何，可以存在一个或多个端口107，每个端口107均包括进入或离开外壳102的通路。通路的实例包括阀、门、通孔等。如图所示，端口107是由微流体管路结构108中的间隙产生的通孔。然而，端口107可以位于外壳102的其他组件(例如盖110)中。图1A中仅示出了一个端口107，但微流体管路120可以具有两个或更多个端口107。例如，可以存在第一端口107，其用作流体进入微流体管路120的入口，并且可以存在第二端口107，其用作流体离开微流体管路120的出口。端口107是用作入口还是出口可以取决于流体流过流动路径106的方向。
支撑结构104可以包括一个或多个电极(未示出)和衬底或多个互连的衬底。例如，支撑结构104可以包括一个或多个半导体衬底，每个半导体衬底电连接到电极(例如，半导体衬底的全部或一部分可以电连接到单个电极)。支撑结构104可以进一步包括印刷电路板组件(“PCBA”)。例如，半导体衬底可以安装在PCBA上。
微流体管路结构108可以限定微流体管路120的管路元件。当微流体管路120填充有流体时，这样的管路元件可以包括可以流体互连的空间或区域，例如流动区域(其可以包括或者是一个或多个流动通道)、腔室、坞、阱(trap)等。在图1A所示的微流体管路120中，微流体管路结构108包括框架114和微流体管路材料116。框架114可以部分地或完全地包围微流体管路材料116。框架114可以是例如基本上包围微流体管路材料116的相对刚性的结构。例如，框架114可以包括金属材料。
微流体管路材料116可以用空腔等进行图案化，以限定微流体管路120的管路元件和互连。微流体管路材料116可以包括柔性材料，例如柔性聚合物(例如橡胶、塑料、弹性体、硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等)，其可以是透气性的。可以构成微流体管路材料116的材料的其他实例包括模制玻璃；可蚀刻材料，例如硅氧烷(例如，可光图案化的硅氧烷或“PPS”)、光致抗蚀剂(例如，SU8)等。在一些实施方案中，此类材料(以及因此微流体管路材料116)可以是刚性的和/或基本上不透气的。无论如何，微流体管路材料116可以被布置在支撑结构104上和框架114内。
盖110可以是框架114和/或微流体管路材料116的集成(integral)部件。或者，盖110可以是结构上不同的元件，如图1A所示。盖110可以包括与框架114和/或微流体管路材料116相同或不同的材料。类似地，支撑结构104可以是与框架114或微流体管路材料116分开的结构(如图所示)，或者是框架114或微流体管路材料116的集成部件。同样地，框架114和微流体管路材料116可以是如图1A所示的分离结构或同一结构的集成部件。
在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料。刚性材料可以是玻璃或具有类似性质的材料。在一些实施方案中，盖110可以包括可变形材料。可变形材料可以是聚合物，例如PDMS。在一些实施方案中，盖110可以包括刚性材料和可变形材料两者。例如，盖110的一个或多个部分(例如，位于隔离坞124、126、128、130上方的一个或多个部分)可以包括与盖110的刚性材料交界的可变形材料。在一些实施方案中，盖110可以进一步包括一个或多个电极。该一个或多个电极可以包括导电氧化物，例如氧化铟锡(ITO)，其可以涂覆在玻璃或类似的绝缘材料上。或者，该一个或多个电极可以是柔性电极，例如嵌入在可变形材料例如聚合物(例如PDMS)中的单壁纳米管、多壁纳米管、纳米线、导电纳米颗粒簇或其组合。已经在例如US 2012/0325665(Chiou等人)中描述了可以用于微流体装置中的柔性电极，其内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，可以修饰盖110(例如，通过调节向内朝向微流体管路120的表面的全部或一部分)以支持细胞粘附、活力和/或生长。该修饰可以包括合成或天然聚合物的涂层。在一些实施方案中，盖110和/或支撑结构104可以是透光的。盖110还可包括至少一种可透气的材料(例如，PDMS或PPS)。
图1A还示出了用于操作和控制微流体装置(例如微流体装置100)的系统150。系统150包括电源192、成像装置194(结合在成像模块164内，其中装置194未在图1A本身中示出)以及倾斜装置190(并入倾斜模块166，其中装置190未在图1中示出)。
电源192可以向微流体装置100和/或倾斜装置190提供电力，根据需要提供偏置电压或电流。电源192可以例如包括一个或多个交流(AC)和/或直流(DC)电压或电流源。成像装置194(成像模块164的一部分，如下文所讨论的)可以包括用于捕捉微流体管路120内的图像的装置，例如数码相机。在一些情况下，成像装置194进一步包括具有快速帧速率和/或高灵敏度(例如，用于低光应用)的检测器。成像装置194还可以包括用于将刺激性辐射和/或光束引导到微流体管路120中并收集从微流体管路120(或其中包含的微物体)反射或发射的辐射和/或光束的机构。所发射的光束可以在可见光谱中，并且可以例如包括荧光发射。所反射的光束可以包括源自LED或诸如汞灯(例如高压汞灯)或氙弧灯的宽光谱灯的反射的发射。如关于图3B所讨论的，成像装置194可以进一步包括显微镜(或光具组)，其可以包括或不包括目镜。
系统150进一步包括倾斜装置190(倾斜模块166的一部分，如下文所讨论的)，其被配置为使微流体装置100围绕一个或多个旋转轴旋转。在一些实施方案中，倾斜装置190被配置为围绕至少一个轴来支撑和/或保持包括微流体管路120的外壳102，使得微流体装置100(以及因此微流体管路120)可以保持在水平取向(即，相对于x轴和y轴为0°)、垂直取向(即，相对于x轴和/或y轴为90°)或其间的任何取向。微流体装置100(和微流体管路120)相对于轴的取向在本文中被称为微流体装置100(和微流体管路120)的“倾斜”。例如，倾斜装置190可以使微流体装置100相对于x轴倾斜0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、90°或其间的任何角度。水平取向(以及因此x轴和y轴)被定义为垂直于由重力限定的垂直轴。倾斜装置还可以使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴和/或y轴倾斜任何大于90°的程度，或者使微流体装置100(和微流体管路120)相对于x轴或y轴倾斜180°，以完全反转微流体装置100(和微流体管路120)。类似地，在一些实施方案中，倾斜装置190使微流体装置100(和微流体管路120)围绕由流动路径106或微流体管路120的一些其他部分限定的旋转轴倾斜。
在一些情况下，将微流体装置100倾斜成垂直取向，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方。如本文所用的术语“上方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上高于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106上方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更高的重力势能)。如本文所用的术语“下方”表示流动路径106被定位为在由重力限定的垂直轴上低于一个或多个隔离坞(即，在流动路径106下方的隔离坞中的物体会具有比流动路径中的物体更低的重力势能)。
在一些情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕平行于流动路径106的轴倾斜。此外，微流体装置100可以被倾斜至小于90°的角度，使得流动路径106位于一个或多个隔离坞的上方或下方，而不是位于隔离坞的正上方或正下方。在其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕垂直于流动路径106的轴倾斜。在另外其他情况下，倾斜装置190使微流体装置100围绕既不平行也不垂直于流动路径106的轴倾斜。
系统150可以进一步包括介质源178。介质源178(例如，容器、贮液器等)可以包括多个部分或容器，每个部分或容器用于容纳不同的流体介质180。因此，介质源178可以是在微流体装置100外部并与之分离的装置，如图1A所示。或者，介质源178可以整体或部分地位于微流体装置100的外壳102内部。例如，介质源178可以包括作为微流体装置100的一部分的贮液器。
图1A还示出了描绘构成系统150的一部分并且可以与微流体装置100结合使用的控制和监测设备152的实例的简化框图。如图所示，这种控制和监视设备152的实例包括主控制器154，其可以控制其他控制器和监控装置，例如用于控制介质源178的介质模块160；运动模块162，用于控制微流体管路120中的微物体(未示出)和/或介质(例如，介质液滴)的移动和/或选择；成像模块164，用于控制成像装置194(例如，相机、显微镜、光源或其任何组合)以捕捉图像(例如，数字图像)；以及倾斜模块166，用于控制倾斜装置190。控制设备152还可以包括其他模块168，用于控制、监测或执行关于微流体装置100的其他功能。如图所示，设备152可以进一步包括显示装置170和输入/输出设备172。
主控制器154可以包括控制模块156和数字存储器158。控制模块156可以包括例如数字处理器，该数字处理器被配置为根据被存储为存储器158中的非暂态数据或信号的机器可执行指令(例如，软件、固件、源代码等)进行操作。替代地或另外地，控制模块156可以包括硬连线数字电路和/或模拟电路。可以类似地配置介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168。因此，可以由如上文所讨论地配置的主控制器154、基质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168中的任意一个或多个来实施本文所讨论的针对微流体装置100或任何其他微流体设备所执行的功能、过程、动作、行动或过程的步骤。类似地，主控制器154、介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和/或其他模块168可以通信地耦接，以发送和接收本文所讨论的任何功能、过程、动作、行动或步骤中使用的数据。
介质模块160控制介质源178。例如，介质模块160可以控制介质源178以将选定的流体介质180输入到外壳102中(例如，通过入口端口107)。介质模块160还可以控制从外壳102中移除介质(例如，通过出口端口(未示出))。因此，可以将一种或多种介质选择性地输入到微流体管路120中以及从其中移除。介质模块160还可以控制微流体管路120内的流动路径106中的流体介质180的流动。例如，在一些实施方案中，在倾斜模块166使倾斜装置190将微流体装置100倾斜到期望的倾斜角度之前，介质模块160停止介质180在流动路径106中和通过外壳102的流动。
运动模块162可以被配置为控制微流体管路120中的微物体(未示出)的选择、捕集和移动。如下文参考图1B和1C所讨论的，外壳102可以包括介电电泳(DEP)、光电镊子(OET)和/或光电润湿(OEW)配置(图1A中未示出)，并且运动模块162可以控制电极和/或晶体管(例如，光电晶体管)的激活，以选择和移动流动路径106和/或隔离坞124、126、128、130中的微物体(未示出)和/或介质液滴(未示出)。
成像模块164可以控制成像装置194。例如，成像模块164可以接收和处理来自成像装置194的图像数据。来自成像装置194的图像数据可以包括由成像装置194捕捉的任何类型的信息(例如，存在或不存在微物体、介质液滴、标记物(例如荧光标记物)的累积等)。使用由成像装置194捕捉的信息，成像模块164可以进一步计算微流体装置100内物体(例如，微物体、介质液滴)的位置和/或这些物体的运动速率。
倾斜模块166可以控制倾斜装置190的倾斜运动。替代地或另外地，倾斜模块166可以控制倾斜速率和时机，以优化微物体经由重力向一个或多个隔离坞的转移。倾斜模块166与成像模块164通信地耦接，以接收描述微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的运动的数据。使用该数据，倾斜模块166可以调节微流体管路120的倾斜，以便调节微物体和/或介质液滴在微流体管路120中移动的速率。倾斜模块166还可以使用该数据来迭代地调节微流体管路120中的微物体和/或介质液滴的位置。
在图1A所示的实例中，微流体管路120被示为包括微流体通道122和隔离坞124、126、128、130。每个坞均包括通向通道122的单个开口，但是其他部分被包围，使得坞可以将坞内的微物体与通道122的流动路径106或其他坞中的流体介质180和/或微物体基本上分离。隔离坞的壁从底座的内表面109延伸到盖110的内表面，以提供外壳。坞到通道122的开口被取向为与流体介质180的流动106成一角度，使得流106不被引导到坞中。流动可以与坞的开口的平面相切或垂直。在一些情况下，坞124、126、128、130被配置为物理地围住微流体管路120内的一个或多个微物体。根据本发明的隔离坞可以包括各种形状、表面和特征，如下文将详细讨论和示出的，其被优化为与DEP、OET、OEW、流体流动和/或重力。
微流体管路120可以包括任何数目的微流体隔离坞。尽管示出了五个隔离坞，但微流体管路120可以具有更少或更多的隔离坞。如图所示，微流体管路120的微流体隔离坞124、126、128和130各自包括不同的特征和形状，这些特征和形状可以提供用于筛选抗体产生细胞(例如将一个抗体产生细胞与另一个抗体产生细胞分离)的一个或多个益处。微流体隔离坞124、126、128和130可提供其他益处，例如促进单个细胞加载和/或抗体产生细胞的集落(例如克隆集落)的生长。在一些实施方案中，微流体管路120包括多个相同的微流体隔离坞。
在一些实施方案中，微流体管路120包括多个微流体隔离坞，其中隔离坞中的两个或更多个包括不同的结构和/或特征，其提供了不同的筛选抗体产生细胞的益处。用于筛选抗体产生细胞的微流体装置可包括隔离坞124、126、128和130的任一个或其变化形式，和/或可以包括类似于图2B、2C、2D、2E和2F所示的坞配置的坞，如下文所讨论。
在图1A所示的实施方案中，示出了单个通道122和流动路径106。然而，其他实施方案可以含有多个通道122，每个通道均被配置为包括流动路径106。微流体管路120进一步包括与流动路径106和流体介质180流体连通的入口阀或端口107，由此流体介质180可以经由入口端口107进入通道122。在一些情况下，流动路径106包括单个路径。在一些情况下，单个路径被布置为Z字形图案，由此流动路径106以交替的方向穿过微流体装置100两次或更多次。
在一些情况下，微流体管路120包括多个平行的通道122和流动路径106，其中每个流动路径106内的流体介质180沿相同的方向流动。在一些情况下，每个流动路径106内的流体介质沿正向或反向中的至少一个方向流动。在一些情况下，配置多个隔离坞(例如，相对于通道122)，使得隔离坞可以平行地加载目标微物体。
在一些实施方案中，微流体管路120进一步包括一个或多个微物体阱132。阱132通常形成在形成通道122的边界的壁中，并且可以与微流体隔离坞124、126、128、130中的一个或多个的开口相对地设置。在一些实施方案中，阱132被配置为成从流动路径106接收或捕获单个微物体。在一些实施方案中，阱132被配置为从流动路径106接收或捕获多个微物体。在一些情况下，阱132包括大约等于单个目标微物体的体积的体积。
阱132还可以包括开口，其被配置为帮助目标微物体流入阱132。在一些情况下，阱132包括开口，该开口的高度和宽度近似地等于单个目标微物体的尺寸，由此防止更大的微物体进入微物体阱。阱132可以进一步包括被配置为帮助将目标微物体保留在阱132内的其他特征。在一些情况下，阱132相对于微流体隔离坞的开口对准并且位于通道122的相对侧上，使得当微流体装置100围绕平行于通道122的轴倾斜时，被捕集的微物体按照使得微物体落入隔离坞的开口中的轨迹离开阱132。在一些情况下，阱132包括小于目标微物体的侧通道134，以便有助于穿过阱132的流，从而增加在阱132中捕获微物体的可能性。
在一些实施方案中，经由一个或多个电极(未示出)将介电电泳(DEP)力施加在流体介质180(例如，在流动路径中和/或在隔离坞中)上，以操纵、运输、分离和分类位于其中的微物体。例如，在一些实施方案中，将DEP力施加到微流体管路120的一个或多个部分，以便将单个微物体从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用DEP力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的微物体从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用DEP力来从隔离坞中选择性地移除先前根据本发明的教导收集的微物体。在一些实施方案中，DEP力包括光电镊子(OET)力。
在其他实施方案中，通过一个或多个电极(未示出)将光电润湿(OEW)力施加到微流体装置100的支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置(例如，有助于限定流动路径和/或多个隔离坞的位置)，以操纵、运输、分离和分类位于微流体管路120中的液滴。例如，在一些实施方案中，将OEW力施加到支撑结构104(和/或盖110)中的一个或多个位置，以将单个液滴从流动路径106转移到期望的微流体隔离坞中。在一些实施方案中，使用OEW力来防止隔离坞(例如，隔离坞124、126、128或130)内的液滴从其中被替换。此外，在一些实施方案中，使用OEW力来从隔离坞中选择性地去除先前根据本发明的教导收集的液滴。
在一些实施方案中，将DEP和/或OEW力与其他力(例如流动和/或重力)组合，以便操纵、运输、分离和分类微流体管路120内的微物体和/或液滴。例如，可以将外壳102倾斜(例如，通过倾斜装置190)，以将流动路径106和位于其中的微物体定位在微流体隔离坞的上方，并且重力可以将微物体和/或液滴运输到坞中。在一些实施方案中，可以在施加其他力之前施加DEP和/或OEW力。在其他实施方案中，可以在施加其他力之后施加DEP和/或OEW力。在其他情况下，可以在施加其他力的同时或者以与其他力交替的方式施加DEP和/或OEW力。
图1B、1C和2A-2H示出了可以用于实施本发明的微流体装置的各种实施方案。图1B描述了其中微流体装置200被配置为光致动的电动力学装置的实施方案。本领域已知多种光致动的电动力学装置，包括具有光电镊子(OET)配置的装置和具有光电润湿(OEW)配置的装置。在以下美国专利文献中示出了合适的OET配置的实例，其均通过引用整体并入本文：美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初以美国专利号7,612,355颁发)；和美国专利号7,956,339(Ohta等人)。美国专利号6,958,132(Chiou等人)和美国专利申请公开号2012/0024708(Chiou等人)中示出了OEW配置的实例，上述两者都通过引用整体并入本文。光致动的电动力学装置的另一个实例包括组合的OET/OEW配置，在美国专利公开号20150306598(Khandros等人)和20150306599(Khandros等人)以及其对应的PCT公开WO2015/164846和WO2015/164847中示出其实例，其均通过引用整体并入本文。
已经在例如US申请号14/060,117、14/520,568和14/521,447中描述了具有坞的微流体装置的实例，其中可以放置、培养、监测和/或筛选抗体产生细胞，这些申请中的每一个都通过引用整体并入本文。前述申请中的每一个进一步描述了微流体装置，其被配置为产生介电电泳(DEP)力，例如光电镊子(OET)，或被配置为提供光电润湿(OEW)。例如，US申请号14/060,117的图2中所示的光电镊子装置是可以在本发明的实施方案中用于选择和移动单个生物微物体或一组生物微物体的装置的实例。
微流体装置运动配置。如上文所述，系统的控制和监测设备可以包括运动模块，用于选择和移动微流体装置的微流体管路中的物体，例如微物体或液滴。微流体装置可以具有各种运动配置，这取决于被移动物体的类型和其他考虑因素。例如，可以使用介电电泳(DEP)配置来选择和移动微流体管路中的微物体。因此，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括DEP配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的微物体上选择性地诱导DEP力，从而选择、捕获和/或移动单个微物体或微物体组。或者，微流体装置100的支撑结构104和/或盖110可以包括电润湿(EW)配置，其用于在微流体管路120中的流体介质180中的液滴上选择性地诱导EW力，从而选择、捕获和/或移动单个液滴或液滴组。
图1B和IC中示出了包含DEP配置的微流体装置200的一个实例。虽然为了简化的目的，图1B和IC分别示出了具有开口区域/腔室202的微流体装置200的外壳102的一部分的侧截面图和顶截面图，但应当理解，区域/腔室202可以是具有更详细结构的流体管路元件的一部分，例如生长室、隔离坞、流动区域或流动通道。此外，微流体装置200可以包括其他流体管路元件。例如，微流体装置200可以包括多个生长室或隔离坞和/或一个或多个流动区域或流动通道，例如本文关于微流体装置100所描述的那些。DEP配置可以被结合到微流体装置200的任何这种流体管路元件中，或者其选择的部分中。还应当理解，上文或下文描述的微流体装置组件和系统组件中的任一个可以被结合到微流体装置200中和/或与微流体装置200组合使用。例如，上述包括控制和监测设备152的系统150可以与微流体装置200一起使用，该微流体装置200包括介质模块160、运动模块162、成像模块164、倾斜模块166和其他模块168中的一个或多个。
如图1B所示，微流体装置200包括具有底部电极204和覆盖底部电极204的电极活化衬底206的支撑结构104，以及具有顶部电极210的盖110，顶部电极210与底部电极204间隔开。顶部电极210和电极活化衬底206限定区域/腔室202的相对表面。因此，包含在区域/腔室202中的介质180在顶部电极210和电极活化衬底206之间提供电阻连接(resistiveconnection)。还示出了电源212，其被配置为连接到底部电极204和顶部电极210并且在这些电极之间产生偏置电压，如在区域/腔室202中产生DEP力所需要的。电源212可以是例如交流(AC)电源。
在某些实施方案中，图1B和1C中所示的微流体装置200可以具有光致动的DEP配置。因此，改变来自光源216的光218的图案(其可以由运动模块162控制)可以选择性地激活和去激活电极活化衬底206的内表面208的区域214处的DEP电极的变化图案。(下文中，具有DEP配置的微流体装置的区域214被称为“DEP电极区域”。)如图1C所示，指向电极活化衬底206的内表面208的光图案218可以以诸如正方形的图案照亮选择的DEP电极区域214a(以白色示出)。在下文中将未被照亮的DEP电极区域214(交叉阴影线)称为“暗”DEP电极区域214。通过DEP电极活化衬底206(即，从底部电极204直到与流动区域106中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)的相对电阻抗大于在每个暗DEP电极区域214处通过区域/腔室202中的介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对电阻抗。然而，被照亮的DEP电极区域214a表现出通过电极活化衬底206的减小的相对阻抗，其小于在每个被照亮的DEP电极区域214a处通过区域/腔室202中的介质180的相对阻抗。
在电源212被激活的情况下，前述DEP配置在照射的DEP电极区域214a和相邻的暗DEP电极区域214之间的流体介质180中产生电场梯度，这又产生了吸引或排斥流体介质180中附近微物体(未示出)的局部DEP力。因此，通过改变从光源216投射到微流体装置200中的光图案218，可以在区域/腔室202的内表面208处的许多不同的此类DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥流体介质180中微物体的DEP电极。DEP力是吸引还是排斥附近的微物体可以取决于诸如电源212的频率和介质180和/或微物体(未示出)的介电特性之类的参数。
图1C中所示的被照亮的DEP电极区域214a的方形图案220仅是一个实例。可以通过投射到装置200中的光图案218照亮(并由此激活)DEP电极区域214的任何图案，并且可以通过改变或移动光图案218来重复地改变被照亮/激活的DEP电极区域214的图案。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料或由其组成。在这样的实施方案中，电极活化衬底206的内表面208可以是无特征的。例如，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅(a-Si:H)层或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0□m的厚度。在这样的实施方案中，根据光图案218，可以在电极活化衬底206的内表面208上的任何地方以任何图案形成DEP电极区域214。因此，无需固定DEP电极区域214的数目和图案，但是可以将其对应于光图案218。已经在例如美国专利号RE 44,711(Wu等人)(最初颁布为美国专利号7,612,355)中描述了具有包括光电导层(例如上文所述的光电导层)的DEP配置的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中，电极活化衬底206可以包括衬底，该衬底包括多个掺杂层、电绝缘层(或区域)和形成半导体集成电路的导电层，例如在半导体领域中已知的。例如，电极活化衬底206可以包括多个光电晶体管，包括例如横向双极光电晶体管，每个光电晶体管均对应于DEP电极区域214。或者，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)，其中每个这样的电极均对应于DEP电极区域214。电极活化衬底206可以包括此类光电晶体管或光电晶体管控制的电极的图案。例如，该图案可以是排列成行和列的基本上为正方形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格(hexagonal lattice)的基本上六边形的光电晶体管或光电晶体管控制的电极的阵列。无论图案如何，电路元件都可以在电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极区域214与底部电极210之间形成电连接，并且可以由光图案218选择性地激活和去激活那些电连接(即，光电晶体管或电极)。当未被激活时，每个电连接都可以具有高阻抗，使得通过电极活化衬底206的相对阻抗(即，从底部电极204到与区域/腔室202中的介质180相交界的电极活化衬底206的内表面208)大于在相应的DEP电极区214处通过介质180(即，从电极活化衬底206的内表面208到盖110的顶部电极210)的相对阻抗。然而，当被光图案218中的光激活时，通过电极活化衬底206的相对阻抗小于在每个被照亮的DEP电极区域214处通过介质180的相对阻抗，从而在相应DEP电极区域214处激活DEP电极，如上所述。因此，以光图案218所确定的方式，可以在区域/腔室202中的电极活化衬底206的内表面208处的许多不同的DEP电极区域214处选择性地激活和去激活吸引或排斥介质180中的微物体(未示出)的DEP电极。
已经在例如美国专利号7,956,339(Ohta等人)(参见例如图21和22中所示的装置300及其描述)中描述了具有包含光电晶体管的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容均通过引用并入本文。已经在例如美国专利公开号2014/0124370(Short等人)(参见例如整个附图中所示的装置200、400、500、600和900及其描述)中描述了具有包括由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底的微流体装置的实例，其全部内容通过引用并入本文。
在DEP配置的微流体装置的一些实施方案中，顶部电极210是外壳102的第一壁(或盖110)的一部分，并且电极活化衬底206和底部电极204是外壳102的第二壁(或支撑结构104)的一部分。区域/腔室202可以位于第一壁和第二壁之间。在其他实施方案中，电极210是第二壁(或支撑结构104)的一部分，并且电极活化衬底206和/或电极210中的一个或两个是第一壁(或盖110)的一部分。此外，光源216可以替代地用于从下方照亮外壳102。
利用具有DEP构造的图1B-1C的微流体装置200，通过将光图案218投射到装置200中，以便以围绕并捕获微物体的图案(例如，正方形图案220)来激活电极活化衬底206的内表面208的DEP电极区域214a处的第一组一个或多个DEP电极，运动模块162可以选择区域/腔室202中的介质180中的微物体(未示出)。然后，通过相对于装置200移动光图案218以激活DEP电极区域214处的第二组一个或多个DEP电极，运动模块162可以移动捕获的微物体。或者，可以相对于光图案218来移动装置200。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有不依赖于电极活化衬底206的内表面208处的DEP电极的光激活的DEP配置。例如，电极活化衬底206可以包括位于与包括至少一个电极的表面(例如，盖110)相对的位置的选择性可寻址且可激发的电极。可以选择性地打开和闭合开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)以激活或去激活DEP电极区域214处的DEP电极，从而在激活的DEP电极附近的区域/腔室202中的微物体(未示出)上产生净DEP力。取决于诸如电源212的频率和区域/腔室202中的介质(未示出)和/或微物体的介电性质的特征，DEP力可以吸引或排斥附近的微物体。通过选择性地激活和去激活一组DEP电极(例如，在形成正方形图案220的一组DEP电极区域214处)，可以在区域/腔室202中捕获和移动区域/腔室202中的一个或多个微物体。图1A中的运动模块162可以控制这类开关，从而激活和去激活各个DEP电极，以选择、捕集和移动区域/腔室202周围的特定微物体(未示出)。具有包括选择性可寻址且可激发的电极的DEP配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经被描述在例如美国专利号6,294,063(Becker等人)和6,942,776(Medoro)中，其全部内容通过引用并入本文。
作为又一个示例，微流体装置200可以具有电润湿(EW)配置，其可以代替DEP配置，或者可以位于微流体装置200与具有DEP配置的部分分离的部分中。EW配置可以是光电润湿配置或电介质上的电润湿(EWOD)配置，两者都是本领域已知的。在一些EW配置中，支撑结构104具有夹在介电层(未示出)和底部电极204之间的电极活化衬底206。介电层可以包括疏水材料和/或可涂覆有疏水材料。对于具有EW配置的微流体装置200，支撑结构104的内表面208是介电层或其疏水涂层的内表面。
介电层(未示出)可以包括一个或多个氧化物层，并且可以具有约50nm至约250nm(例如，约125nm至约175nm)的厚度。在某些实施方案中，介电层可以包括氧化物层，例如金属氧化物(例如，氧化铝或氧化铪)层。在某些实施方案中，介电层可以包括除金属氧化物之外的介电材料，例如硅氧化物或氮化物。无论确切的组成和厚度如何，介电层可以具有约10k欧至约50k欧的阻抗。
在一些实施方案中，介电层的向内朝向区域/腔室202的表面涂覆有疏水材料。疏水材料可以包括例如氟化碳分子。氟化碳分子的实例包括全氟聚合物，例如聚四氟乙烯(例如，
Figure BDA0002104386230000241
)或聚(2,3-二氟亚甲基-全氟四氢呋喃)(例如，CYTOPTM)。构成疏水材料的分子可以共价键合到介电层的表面。例如，疏水材料的分子可以借助于诸如硅氧烷基团、膦酸基团或硫醇基团的连接基团共价结合到介电层的表面。因此，在一些实施方案中，疏水材料可以包含烷基封端的硅氧烷、烷基封端的膦酸或烷基封端的硫醇。烷基可以是长链烃(例如，具有至少10个碳或至少16、18、20、22或更多个碳的链)。或者，可以使用氟化(或全氟化)碳链代替烷基。因此，例如，疏水材料可以包括氟代烷基封端的硅氧烷、氟代烷基封端的膦酸或氟代烷基封端的硫醇。在一些实施方案中，疏水涂层的厚度为约10nm至约50nm。在其他实施方案中，疏水涂层的厚度小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)。
在一些实施方案中，具有电润湿配置的微流体装置200的盖110也涂覆有疏水材料(未示出)。疏水材料可以是用于涂覆支撑结构104的介电层的相同疏水材料，并且疏水涂层可以具有与支撑结构104的介电层上的疏水涂层的厚度基本相同的厚度。此外，盖110可以包括以支撑结构104的方式夹在介电层和顶部电极210之间的电极活化衬底206。电极活化衬底206和盖110的介电层可以具有与电极活化衬底206和支撑结构104的介电层相同的组成和/或尺寸。因此，微流体装置200可以具有两个电润湿表面。
在一些实施方案中，电极活化衬底206可以包括光电导材料，例如如上文所述的那些。因此，在某些实施方案中，电极活化衬底206可以包括氢化非晶硅层(a-Si:H)或由其组成。a-Si:H可以包含例如约8％至40％的氢(以100×氢原子数/氢和硅原子的总数来计算)。a-Si:H层可以具有约500nm至约2.0μm的厚度。或者，如上文所述，电极活化衬底206可以包括由光电晶体管开关控制的电极(例如，导电金属电极)。具有光电润湿配置的微流体装置在本领域中是已知的和/或可以用本领域已知的电极活化衬底来构建。例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)(其全部内容通过引用并入本文)公开了具有诸如a-Si:H的光电导材料的光电润湿配置，而上文引用的美国专利公开号2014/0124370(Short等人)公开了具有由光电晶体管开关控制的电极的电极活化衬底。
因此，微流体装置200可以具有光电润湿配置，并且光图案218可以用于激活电极活化衬底206中的光电导EW区域或光响应EW电极。电极活化衬底206的这类激活的EW区域或EW电极可以在支撑结构104的内表面208(即，覆盖介电层或其疏水涂层的内表面)处产生电润湿力。通过改变入射在电极活化衬底206上的光图案218(或相对于光源216移动微流体装置200)，可以移动与支撑结构104的内表面208接触的液滴(例如，包含水性介质、溶液或溶剂)穿过区域/腔室202中存在的不混溶流体(例如，油介质)。
在其他实施方案中，微流体装置200可以具有EWOD配置，并且电极活化衬底206可以包括不依赖于光来激活的选择性可寻址且可激发的电极。因此，电极活化衬底206可以包括这类电润湿(EW)电极的图案。例如，图案可以是排列成行和列的基本上正方形的EW电极的阵列，如图2B所示。或者，图案可以是形成六边点格的基本上六边形EW电极的阵列。无论图案如何，都可以通过电开关(例如，半导体衬底中的晶体管开关)选择性地激活(或去激活)EW电极。通过选择性地激活和去激活电极活化衬底206中的EW电极，可以在区域/腔室202内移动与经覆盖的介电层或其疏水涂层的内表面208接触的液滴(未示出)。图1A中的运动模块162可以控制此类开关，从而激活和去激活各个EW电极，以选择和移动区域/腔室202周围的特定液滴。具有有选择性可寻址且可激发的电极的EWOD配置的微流体装置在本领域中是已知的，并且已经描述在例如美国专利号8,685,344(Sundarsan等人)中，其全部内容通过引用并入本文。
无论微流体装置200的配置如何，电源212可以用于提供为微流体装置200的电路供电的电势(例如，AC电压电势)。电源212可以与图1中参引的电源192相同或者是其组件。电源212可以被配置为向顶部电极210和底部电极204提供AC电压和/或电流。对于AC电压，电源212可以提供这样的频率范围和平均或峰值功率(例如，电压或电流)范围：其如上文所述，足以产生足够强的净DEP力(或电润湿力)以在区域/腔室202中捕集和移动各个微物体(未示出)，和/或还如上文所述，足以改变区域/腔室202中支撑结构104的内表面208(即，介电层和/或介电层上的疏水涂层)的润湿性质。这样的频率范围和平均或峰值功率范围在本领域中是已知的。参见，例如，美国专利号6,958,132(Chiou等人)、美国专利号RE44,711(Wu等人)(最初作为美国专利号7,612,355颁布)和美国专利申请公开号US2014/0124370(Short等人)、US2015/0306598(Khandros等人)和US2015/0306599(Khandros等人)。
隔离坞。在图2A-2C中描绘的微流体装置230内示出了一般隔离坞224、226和228的非限制性实例。每个隔离坞224、226和228可以包括分离结构232，其限定了分离区域240和将分离区域240流体连接到通道122的连接区236。连接区域236可以包括通向通道122的近端开口234和通向分离区域240的远端开口238。连接区域236可以被配置为使得从通道122流入隔离坞224、226、228的流体介质(未示出)的流动的最大穿透深度不延伸到分离区域240中。因此，由于连接区域236，布置在隔离坞224、226、228的分离区域240中的微物体(未示出)或其他材料(未示出)可以与通道122中的介质180的流动分离且基本上不受其影响。
图2A-2C的隔离坞224、226和228各自具有单个开口，该开口直接通向通道122。隔离坞的开口从通道122侧向开放。电极活化衬底206在通道122和隔离坞224、226和228二者的下方。隔离坞的外壳内的电极活化衬底206的上表面(形成隔离坞的底板)被设置在与通道122(或者，如果不存在通道，则为流动区域)内的电极活化衬底206的上表面(形成微流体装置的流动通道(或流动区域)的底板)相同水平面上或基本相同的水平面上。电极活化衬底206可以是无特征的，或者可以具有不规则或图案化的表面，其从其最高凸起到其最低凹陷变化小于约3微米、2.5微米、2微米、1.5微米、1微米、0.9微米、0.8微米、0.7微米、0.6微米、0.5微米、0.4微米、0.3微米、0.2微米、0.1微米或更小。跨越通道122(或流动区域)和隔离坞的衬底的上表面中的高度变化可以小于隔离坞的壁或微流体装置的壁的高度的约3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.5％、0.3％或0.1％。虽然详细描述了微流体装置200，但这也适用于本文所述的微流体装置100、230、250、280、290中的任一个。
因此，通道122可以是扫过区域的示例，并且隔离坞224、226、228的分离区域240可以是未扫过区域的实例。应当注意，通道122和隔离物224、226、228可以被配置为包含一种或多种流体介质180。在图2A-2B所示的实例中，端口222被连接到通道122，并允许将流体介质180引入到微流体装置230中或从其中移除。在引入流体介质180之前，微流体装置可以装填有气体，如二氧化碳气体。一旦微流体装置230包含流体介质180，就可以选择性地产生和停止通道122中的流体介质180的流242。例如，如图所示，端口222可以被布置在通道122的不同位置处(例如，相对端)，并且可以从用作入口的一个端口222到用作出口的另一个端口222形成介质的流242。
图2C示出了根据本发明的隔离坞224的实例的详细视图。还示出了微物体246的实例。
已知的是，微流体通道122中的流体介质180的流242经过隔离坞224的近端开口234可以使介质180的二次流244进入和/或离开隔离坞224。为了将隔离坞224的分离区域240中的微物体246与二次流244分离，隔离坞224的连接区域236的长度Lcon(即，从近端开口234到远端开口238)应当大于二次流244进入连接区域236的穿透深度Dp。二次流244的穿透深度Dp取决于在通道122中流动的流体介质180的速度以及与通道122的配置有关的各种参数以及到通道122的连接区域236的近端开口234。对于给定的微流体装置，通道122和开口234的配置将是固定的，而通道122中的流体介质180的流242的速率将是可变的。因此，对于每个隔离坞224，可以识别通道122中的流体介质180的流242的最大速度Vmax，确保二次流244的穿透深度Dp不超过连接区域236的长度Lcon。只要通道122中的流体介质180的流242的速率不超过最大速度Vmax，所得到的二次流244就可以被限制到通道122和连接区域236并且保持在分离区域240之外。因此，通道122中的介质180的流242将不会将微物体246拖曳出分离区域240。相反，无论通道122中的流体介质180的流242如何，位于分离区域240中的微物体246将停留在分离区域240中。
此外，只要通道122中的介质180的流242的速率不超过Vmax，通道122中的流体介质180的流242就不会把混杂的颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)从通道122移动到隔离坞224的分离区域240中。因此，使连接区域236的长度Lcon大于二次流244的最大穿透深度Dp可以防止一个隔离坞224被来自通道122或另一个隔离坞(例如，图2D中的隔离坞226、228)的混杂的颗粒污染。
因为通道122和隔离坞224、226、228的连接区域236可能受到通道122中的介质180的流242的影响，所以通道122和连接区域236可以被认为是微流体装置230的扫过(或流动)区域。另一方面，隔离坞224、226、228的分离区域240可以被认为是未扫过(或非流动)区域。例如，通道122中的第一流体介质180中的组分(未示出)可以基本上仅通过第一介质180的组分从通道122扩散通过连接区域236并进入分离区域240中的第二流体介质248中而与分离区域240中的第二流体介质248混合。类似地，分离区域240中的第二介质248的组分(未示出)可以基本上仅通过第二介质248的组分从分离区域240扩散通过连接区域236并进入通道122中的第一介质180中而与通道122中的第一介质180混合。在一些实施方案中，隔离坞的分离区域与流动区域之间通过扩散进行的流体介质交换的程度为总流体交换量的约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大。第一介质180可以是与第二介质248相同的介质或不同的介质。此外，第一介质180和第二介质248可以开始相同，然后变得不同(例如，通过分离区域240中的一个或多个细胞来调节第二介质248，或者通过改变流过通道122的介质180)。
如上所述，由通道122中的流体介质180的流242引起的二次流244的最大穿透深度Dp可以取决于多个参数。这些参数的实例包括：通道122的形状(例如，通道可以将介质引导到连接区域236中，将介质从连接区域236转移，或者沿着基本上垂直于通向通道122的连接区域236的近端开口234的方向引导介质)；通道122在近端开口234处的宽度Wch(或横截面积)；和连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon(或横截面积)；通道122中的流体介质180的流242的速度V；第一介质180和/或第二介质248的粘度，等等。
在一些实施方案中，通道122和隔离坞224、226、228的尺寸可以相对于通道122中的流体介质180的流242的向量如下定向：通道宽度Wch(或通道122的横截面积)可以基本上垂直于介质180的流242；连接区域236在开口234处的宽度Wcon(或横截面积)可以基本上平行于通道122中的介质180的流242；和/或连接区域的长度Lcon可以基本上垂直于通道122中的介质180的流242。前述仅是示例，并且通道122和隔离坞224、226、228的相对位置可以相对于彼此为其他取向。
如图2C所示，连接区域236的宽度Wcon从近端开口234到远端开口238可以是均匀的。因此，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，连接区域236在远端开口238处的宽度Wcon可以大于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。
如图2C所示，分离区域240在远端开口238处的宽度Wiso可以与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon基本上相同。因此，分离区域240在远端开口238处的宽度Wiso可以在本文中为连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon所标识的任何范围内。或者，分离区域240在远端开口238处的宽度Wiso可以大于或小于连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon。此外，远端开口238可以小于近端开口234，并且连接区域236的宽度Wcon可以在近端开口234和远端开口238之间变窄。例如，使用各种不同的几何形状(例如，斜切连接区域、使连接区域成斜面)，连接区域236可以在近端开口和远端开口之间变窄。此外，连接区域236的任何部分或子部分可以变窄(例如，连接区域与近端开口234相邻的一部分)。
图2D-2F描绘了包含微流体管路262和流动通道264的微流体装置250的另一示例性实施方案，其是图1的相应微流体装置100、管路132和通道134的变体。微流体装置250还具有多个隔离坞266，其是上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228的另外的变体。特别地，应当理解，图2D-2F中所示的装置250的隔离坞266可以代替装置100、200、230、280、290或320中的上述隔离坞124、126、128、130、224、226或228中任一个。类似地，微流体装置250是微流体装置100的另一变体，并且还可以具有与上述微流体装置100、200、230、280、290、320相同或不同的DEP配置，以及本文所述的其他微流体系统组件中的任一个。
图2D-2F的微流体装置250包括支撑结构(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的支撑结构104相同或基本上类似)、微流体管路结构256和盖(在图2D-2F中不可见，但可以与图1A中所描绘的装置100的盖122相同或基本上类似)。微流体管路结构256包括框架252和微流体管路材料260，其可以与图1A中所描绘的装置100的框架114和微流体管路材料116相同或基本上类似。如图2D所示，由微流体管路材料260所定义的微流体管路262可以包括多个通道264(示出了两个，但可以有更多个)，多个隔离坞266与其流体连接。
每个隔离坞266可以包括分离结构272、分离结构272内的分离区域270、以及连接区域268。从通道264处的近端开口274到分离结构272处的远端开口276，连接区域268将通道264流体连接至分离区域270。通常，根据上文对图2B和2C的讨论，通道264中的第一流体介质254的流278可以产生从通道264进入和/或离开隔离坞266的相应连接区域268的第一介质254的二次流282。
如图2E所示，每个隔离坞266的连接区域268通常包括在至通道264的近端开口274与至分离结构272的远端开口276之间延伸的区域。连接区域268的长度Lcon可以大于二次流282的最大穿透深度Dp，在这种情况下，二次流282将延伸到连接区域268中而不被再引导向分离区域270(如图2D所示)。或者，如图2F所示，连接区域268可以具有小于最大穿透深度Dp的长度Lcon，在这种情况下，二次流282将延伸通过连接区域268并且被再引导向分离区域270。在后一种情况下，连接区域268的长度Lc1和Lc2的和大于最大穿透深度Dp，使得二次流282不延伸到分离区域270中。无论连接区域268的长度Lcon是否大于穿透深度Dp，或者连接区域268的长度Lc1和Lc2的和是否大于穿透深度Dp，通道264中的第一介质254的不超过最大速度Vmax的流278会产生具有穿透深度Dp的二次流，并且隔离坞266的分离区域270中的微物体(未示出，但可以与图2C中所示的微物体246相同或基本上类似)不会被通道264中的第一介质254的流278拖曳离开分离区域270。通道264中的流278也不会将混杂的物质(未示出)从通道264拖曳到隔离坞266的分离区域270中。这样，扩散是通道264中的第一介质254中的组分可以从通道264移动到隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的唯一机制。类似地，扩散是隔离坞266的分离区域270中的第二介质258中的组分可以从分离区域270移动到通道264中的第一介质254中的唯一的机制。第一介质254可以是与第二介质258相同的介质，或者第一介质254可以是与第二介质258不同的介质。或者，第一介质254和第二介质258可以在开始时相同，然后变得不同，例如，通过分离区域270中的一个或多个细胞调节第二介质，或者通过改变流过通道264的介质。
如图2E所示，通道264中的通道264的宽度Wch(即，横切流体介质流过通道的方向，如图2D中的箭头278所示)可以基本上垂直于近端开口274的宽度Wcon1，并且因此基本上平行于远端开口276的宽度Wcon2。然而，近端开口274的宽度Wcon1和远端开口276的宽度Wcon2不需要基本上彼此垂直。例如，近端开口274的宽度Wcon1定向于其上的轴(未示出)与远端开口276的宽度Wcon2定向于其上的另一轴之间的角度可以不同于垂直，并因此不是90°。可选择的定向角度的实例包括以下任一范围中的角度：约30°至约90°、约45°至约90°、约60°至约90°等。
在隔离坞室(例如，124、126、128、130、224、226、228或266)的各种实施方案中，分离区域(例如240或270)被配置为包含多个微物体。在其他实施方案中，分离区域可以被配置为包含仅一个、两个、三个、四个、五个或类似的相对较少数目的微物体。因此，分离区域的体积可以是例如至少5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106立方微米或更大。
在隔离坞的各种实施方案中，通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以在以下任一范围内：约50-1000微米、50-500微米、50-400微米、50-300微米、50-250微米、50-200微米、50-150微米、50-100微米、70-500微米、70-400微米、70-300微米、70-250微米、70-200微米、70-150微米、90-400微米、90-300微米、90-250微米、90-200微米、90-150微米、100-300微米、100-250微米、100-200微米、100-150微米和100-120微米。在一些其他实施方案中，通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的宽度Wch可以在约200-800微米、200-700微米或200-600微米的范围内。以上仅是示例，并且通道122的宽度Wch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。此外，在通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，通道122的Wch可以被选择为在任何这些范围内。
在一些实施方案中，隔离坞的高度为约30至约200微米或约50至约150微米。在一些实施方案中，隔离坞的横截面积为约1×104至约3×106平方微米、约2×104至约2×106平方微米、约4×104至约1×106平方微米、约2×104至约5×105平方微米、约2×104至约1×105平方微米和约2×105至约2×106平方微米。在一些实施方案中，连接区域的横截宽度为约20至约100微米、约30至约80微米或约40至约60微米。
在隔离坞的各种实施方案中，通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的高度Hch可以在以下任何范围内：20-100微米、20-90微米、20-80微米、20-70微米、20-60微米、20-50微米、30-100微米、30-90微米、30-80微米、30-70微米、30-60微米、30-50微米、40-100微米、40-90微米、40-80微米、40-70微米、40-60微米或40-50微米。前述仅仅是示例，并且通道(例如，122)的高度Hch可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围)。在通道的除了隔离坞的近端开口之外的区域中，通道122的高度Hch可以被选择为在任何这些范围内。
在隔离坞的各种实施方案中，通道(例如，122)在近端开口(例如234)处的横截面积可以在以下任何范围内：500-50,000平方微米、500-40,000平方微米、500-30,000平方微米、500-25,000平方微米、500-20,000平方微米、500-15,000平方微米、500-10,000平方微米、500-7,500平方微米、500-5,000平方微米、1,000-25,000平方微米、1,000-20,000平方微米、1,000-15,000平方微米、1,000-10,000平方微米、1,000-7,500平方微米、1,000-5,000平方微米、2,000-20,000平方微米、2,000-15,000平方微米、2,000-10,000平方微米、2,000-7,500平方微米、2,000-6,000平方微米、3,000-20,000平方微米、3,000-15,000平方微米、3,000-10,000平方微米、3,000-7,500平方微米或3,000至6,000平方微米。前述仅仅是示例，并且通道(例如，122)在近端开口(例如，234)处的横截面积可以在其他范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon可以是在以下任何范围内：约20至约300微米、约40至约250微米、约60至约200微米、约80至约150微米、约20至约500微米、约40至约400微米、约60至约300微米、约80至约200微米或约100至约150微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)的长度Lcon可以在与前述示例不同的范围内(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以在以下任何范围内：约20至约150微米、约20至约100微米、约20至约80微米、约20至约60微米、约30至约150微米、约30至约100微米、约30至约80微米、约30至约60微米、约40至约150微米、约40至约100微米、约40至约80微米、约40至约60微米、约50至约150微米、约50至约100微米、约50至约80微米、约60至约150微米、约60至约100微米、约60至约80微米、约70至约150微米、约70至约100微米、约80至约150微米和约80至约100微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以至少与隔离坞打算用于的微物体(例如，生物细胞，其可以是免疫细胞，例如B细胞或T细胞，或杂交瘤细胞等)的最大尺寸一样大。例如，连接区域236在将放置免疫细胞(例如B细胞)的隔离坞的近端开口234处的宽度Wcon可以使以下任何宽度：约20微米、约25微米、约30微米、约35微米、约40微米、约45微米、约50微米、约55微米、约60微米、约65微米、约70微米、约75微米或约80微米。前述仅仅是示例，并且连接区域(例如，236)在近端开口(例如，234)处的宽度Wcon可以与前述示例不同(例如，由上文列出的任何端点所限定的范围内)。
在隔离坞的各种实施方案中，连接区域(例如，236)的长度Lcon与连接区域(例如，236)在近端开口234处的宽度Wcon的比可以大于或等于任何以下比值：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0或更大。以上仅仅是示例，并且连接区域236的长度Lcon与连接区域236在近端开口234处的宽度Wcon的比可以与前述示例不同。
在微流体装置100、200、230、250、280、290、320的各种实施方案中，Vmax可以被设定为约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0μL/秒。
在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的分离区域(例如，240)的体积可以是例如至少5×105、8×105、1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、1×107立方微米或更大。在具有隔离坞的微流体装置的各种实施方案中，隔离坞的体积可以是约5×105、6×105、8×105、1×106、2×106、4×106、8×106、1×107立方微米或更大。在一些其他实施方案中，隔离坞的体积可以是约0.5纳升至约10纳升、约1.0纳升至约5.0纳升、约1.5纳升至约4.0纳升、约2.0纳升至约3.0纳升或约2.5纳升，或两个前述端点限定的任何范围。
在各种实施方案中，微流体装置具有如本文所讨论的任何实施方案中所配置的隔离坞，其中微流体装置具有约5至约10个隔离坞、约10至约50个隔离坞、约100至约500个隔离坞；约200至约1000个隔离坞、约500至约1500个隔离坞、约1000至约2000个隔离坞或约1000至约3500个隔离坞。隔离坞不需要全部是相同的尺寸，并且可以包括多种配置(例如，隔离坞内不同的宽度、不同的特征)。
在一些其他的实施方案中，微流体装置的隔离坞被配置为本文讨论的任何实施方案，其中微流体装置具有约1500至约3000个隔离坞、约2000至约3500个隔离坞、约2500至约4000个隔离坞、约3000至约4500个隔离坞、约3500至约5000个隔离坞、约4000至约5500个隔离坞、约4500至约6000个隔离坞、约5000至约6500个隔离坞、约5500至约7000个隔离坞、约6000至约7500个隔离坞、约6500至约8000个隔离坞、约7000至约8500个隔离坞、约7500至约9000个隔离坞、约8000至约9500个隔离坞、约8500至约10,000个隔离坞、约9000至约10,500个隔离坞、约9500至约11,000个隔离坞、约10,000至约11,500个隔离坞、约10,500至约12,000个隔离坞、约11,000至约12,500个隔离坞、约11,500至约13,000个隔离坞、约12,000至约13,500个隔离坞、约12,500至约14,000个隔离坞、约13,000至约14,500个隔离坞、约13,500至约15,000个隔离坞、约14,000至约15,500个隔离坞、约14,500至约16,000个隔离坞、约15,000至约16,500个隔离坞、约15,500至约17,000个隔离坞、约16,000至约17,500个隔离坞、约16,500至约18,000个隔离坞、约17,000至约18,500个隔离坞、约17,500至约19,000个隔离坞、约18,000至约19,500个隔离坞、约18,500至约20,000个隔离坞、约19,000至约20,500个隔离坞、约19,500至约21,000个隔离坞或约20,000至约21,500个隔离坞。
图2G示出了根据一个实施方案的微流体装置280。图2G中示出的微流体装置280是微流体装置100的程式化示意图。在实施中，微流体装置280及其组成管路元件(例如，通道122和隔离坞128)会具有本文所讨论的尺寸。图2G中所示的微流体管路120具有两个端口107、四个不同的通道122和四个不同的流动路径106。微流体装置280进一步包括向每个通道122开口的多个隔离坞。在图2G所示的微流体装置中，隔离坞具有与图2C中所示的坞类似的几何形状，因此具有连接区域和分离区域这两者。因此，微流体管路120包括扫过区域(例如，通道122和连接区域236在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)和非扫过区域(例如，分离区域240和连接区域236不在二次流244的最大穿透深度Dp内的部分)这两者。
图3A至3B示出了可用于操作和观察根据本发明的微流体装置(例如，100、200、230、280、250、290、320)的系统150的各种实施方案。如图3A所示，系统150可以包括结构(“巢”)300，其被配置为保持微流体装置100(未示出)或本文所述的任何其他微流体装置。巢300可以包括插座(socket)302，其能够与微流体装置320(例如，光致动的电动力学装置100)交界并提供从电源192到微流体装置320的电连接。巢300还可以包括集成的电信号生成子系统304。电信号生成子系统304可以被配置为向插座302提供偏置电压，使得当插座302加持微流体装置320时，在微流体装置320中的一对电极两端施加偏置电压。因此，电信号生成子系统304可以是电源192的一部分。将偏置电压施加到微流体装置320的能力并不意味着当插座302加持微流体装置320时会一直施加偏置电压。相反，在大多数情况下，将间歇地施加偏压电压，例如，仅在需要促进在微流体装置320中生成电动力(例如介电电泳或电润湿)时施加。
如图3A所示，巢300可以包括印刷电路板组件(PCBA)322。电信号生成子系统304可以被安装在PCBA 322上并被电集成到其中。示例性支撑件也包括安装在PCBA 322上的插座302。
通常，电信号生成子系统304将包括波形发生器(未示出)。电信号生成子系统304还可以包括示波器(未示出)和/或被配置为放大从波形发生器接收到的波形的波形放大电路(未示出)。示波器(如果有的话)可以被配置为测量供给至由插座302加持的微流体装置320的波形。在某些实施方案中，示波器在微流体装置320附近(并且远离波形发生器)的位置处测量波形，从而确保更精确地测量实际施加到装置的波形。从示波器测量所获得的数据可以被例如作为对波形发生器的反馈提供，并且波形发生器可以被配置为基于这样的反馈调整其输出。合适的组合式波形发生器和示波器的示例是Red PitayaTM。
在某些实施方案中，巢300进一步包括控制器308，例如用于检测和/或控制电信号生成子系统304的微处理器。合适的微处理器的实例包括ArduinoTM微处理器，例如ArduinoNanoTM。控制器308可以用于执行功能和分析，或者可以与外部主控制器154(图1A中所示)进行通信以执行功能和分析。在图3A所示的实施方案中，控制器308通过界面310(例如，插头或连接器)与主控制器154通信。
在一些实施方案中，巢300可以包括电信号生成子系统304，其包括Red PitayaTM波形发生器/示波器单元(“Red Pitaya单元”)和波形放大电路，该波形放大电路将RedPitaya单元所产生的波形放大并且将放大的电压传送给微流体装置100。在一些实施方案中，Red Pitaya单元被配置为测量微流体装置320处的放大的电压，然后根据需要调节其自身的输出电压，使得微流体装置320处测量到的电压是期望值。在一些实施方案中，波形放大电路可以具有由安装在PCBA 322上的一对DC-DC转换器产生的+6.5V至-6.5V的电源，从而在微流体装置100处产生高达13Vpp的信号。
如图3A所示，支撑结构300可以进一步包括热控制子系统306。热控制子系统306可以被配置为调节由支撑结构300加持的微流体装置320的温度。例如，热控制子系统306可以包括Peltier热电装置(未示出)和冷却单元(未示出)。Peltier热电装置可以具有被配置为与微流体装置320的至少一个表面相交界的第一表面。冷却单元可以是例如冷却块(未示出)，例如液体冷却铝块。Peltier热电装置的第二表面(例如，与第一表面相对的表面)可以被配置为与这种冷却块的表面交界。冷却块可以被连接到流体路径314，流体路径314被配置为使冷却的流体循环通过冷却块。在图3A所示的实施方案中，支撑结构300包括入口316和出口318，以从外部贮液器(未示出)接收冷却的流体，将冷却的流体引入到流体路径314并通过冷却块，然后将冷却的流体返回到外部贮液器。在一些实施方案中，Peltier热电装置、冷却单元和/或流体路径314可以被安装在支撑结构300的壳体312上。在一些实施方案中，热控制子系统306被配置为调节Peltier热电装置的温度，以实现微流体装置320的目标温度。Peltier热电装置的温度调节可以例如通过热电电源实现，例如通过PololuTM热电电源(Pololu Robotics and Electronics Corp.)实现。热控制子系统306可以包括反馈电路，例如由模拟电路提供的温度值。或者，反馈电路可以由数字电路提供。
在一些实施方案中，巢300可以包括具有反馈电路的热控制子系统306，该反馈电路是包括电阻器(例如，具有1k欧+/-0.1％的阻抗，+/-0.02ppm/C0的温度系数)和NTC热敏电阻(例如，具有1k欧+/-0.01％的标称阻抗)的模拟分压器电路(未示出)。在一些情况下，热控制子系统306测量来自反馈电路的电压，然后使用计算出的温度值作为机载PID控制环路算法的输入。来自PID控制环路算法的输出可以驱动例如PololuTM马达驱动器(未示出)上的定向和脉冲宽度调制的信号引脚，以致动热电电源，从而控制Peltier热电装置。
巢300可以包括串行端口324，其允许控制器308的微处理器经由界面310(未示出)与外部主控制器154进行通信。另外，控制器308的微处理器可以与电信号生成子系统304和热控制子系统306进行通信(例如，经由Plink工具(未示出))。因此，经由控制器308、界面310和串行端口324的组合，电信号生成子系统304和热控制子系统306可以与外部主控制器154进行通信。以这种方式，除了其他方面之外，主控制器154还可以通过执行用于输出电压调节的定标计算(scaling calculation)来辅助电信号生成子系统304。经由耦接到外部主控制器154的显示装置170提供的图形用户界面(GUI)(未示出)可以被配置为绘制分别从热控制子系统306和电信号生成子系统304获得的温度和波形数据。替代地或另外地，GUI可以允许更新控制器308、热控制子系统306和电信号生成子系统304。
如上文所讨论的，系统150可以包括成像装置194。在一些实施方案中，成像装置194包括光调制子系统330(参见图3B)。光调制子系统330可以包括数字镜像装置(DMD)或微快门阵列系统(MSA)，其中任一个都可以被配置为接收来自光源332的光并将接收到的光的一部分发送到显微镜350的光具组中。或者，光调制子系统330可以包括产生其自身光的装置(因此无需光源332)，例如有机发光二极管显示器(OLED)、硅基液晶(LCOS)装置、铁电硅基液晶装置(FLCOS)或透射式液晶显示器(LCD)。光调制子系统330可以是例如投影仪。因此，光调制子系统330能够发射结构光和非结构光。合适的光调制子系统330的一个实例是来自Andor TechnologiesTM的MosaicTM系统。在某些实施方案中，系统150的成像模块164和/或运动模块162可以控制光调制子系统330。
在某些实施方案中，成像装置194进一步包括显微镜350。在这样的实施方案中，巢300和光调制子系统330可以单独被配置为安装在显微镜350上。显微镜350可以是例如标准研究级别的光学显微镜或荧光显微镜。因此，巢300可以被配置为安装在显微镜350的载物台344上和/或光调制子系统330可以被配置为安装在显微镜350的端口上。在其他实施方案中，本文所述的巢300和光调制子系统330可以是显微镜350的集成部件。
在某些实施方案中，显微镜350可以进一步包括一个或多个检测器348。在一些实施方案中，检测器348由成像模块164控制。检测器348可以包括目镜、电荷耦合器件(CCD)、相机(例如，数码相机)或其任何组合。如果存在至少两个检测器348，则一个检测器可以是例如快速帧率相机，而另一个检测器可以是高灵敏度相机。此外，显微镜350可以包括光具组，其被配置为接收从微流体装置320反射和/或发射的光，并将反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到一个或多个检测器348上。显微镜的光具组还可以包括用于不同检测器的不同镜筒透镜(未示出)，使得每个检测器上的最终放大率可以是不同的。
在某些实施方案中，成像装置194被配置为使用至少两个光源。例如，可以使用第一光源332来产生结构光(例如，经由光调制子系统330)，并且可以使用第二光源334来提供非结构光。第一光源332可以产生用于光驱动的电运动和/或荧光激发的结构光，且第二光源334可以用于提供亮视场照明。在这些实施方案中，运动模块164可以用于控制第一光源332，并且成像模块164可以用于控制第二光源334。显微镜350的光具组可以被配置为(1)接收来自光调制子系统330的结构光，并且当微流体装置(例如，光致动的电动力学装置)被巢300加持时，将结构光聚焦在该装置中的至少第一区域上，以及(2)接收从微流体装置反射和/或发射的光，并将这种反射和/或发射的光的至少一部分聚焦到检测器348上。光具组可以进一步被配置为接收来自第二光源的非结构光，并且当微流体装置被巢300加持时，将非结构光聚焦在微流体装置的至少第二区域上。在某些实施方案中，微流体装置的第一和第二区域可以是重叠的区域。例如，第一区域可以是第二区域的子集。
在图3B中，第一光源332被显示为将光提供给光调制子系统330，其将结构光提供给系统355的显微镜350的光具组(未示出)。第二光源334被显示为经由分束器336将非结构光提供给光具组。来自光调制子系统330的结构光和来自第二光源334的非结构光一起从分束器336通过光具组行进到达第二分束器(或二向色滤光器338，取决于光调制子系统330提供的光)，光在此通过物镜336向下反射到样品平面342。然后，从样品平面342反射和/或发射的光向上返回通过物镜340、通过分束器和/或二向色滤光器338，并返回到二向色滤光器346。到达二向色滤光器346的光的仅仅一部分穿过并到达检测器348。
在一些实施方案中，第二光源334发射蓝光。利用适当的二向色滤光器346，从样品平面342反射的蓝光能够穿过二向色滤光器346并到达检测器348。相反，来自光调制子系统330的结构光从样品平面342反射，但不穿过二向色滤光器346。在该实例中，二向色滤光器346滤除波长长于495nm的可见光。只有从光调制子系统发射的光不包括短于495nm的任何波长时，这种滤除来自光调制子系统330的光才算完成(如图所示)。在实施中，如果来自光调制子系统330的光包括短于495nm的波长(例如，蓝色波长)，则来自光调制子系统的一些光会穿过滤光器346到达检测器348。在这样的实施方案中，滤光器346作用于改变从第一光源332和第二光源334到达检测器348的光量之间的平衡。如果第一光源332显著强于第二光源334，则这可能是有益的。在其他实施方案中，第二光源334可以发射红光，并且二向色滤光器346可以滤除除了红光之外的可见光(例如，波长短于650nm的可见光)。
涂覆溶液和涂覆剂。不希望受理论的限制，当微流体装置的一个或多个内表面已经被条件化或涂覆以便呈现有机和/或亲水分子层(其提供微流体装置和其中维持的微物体(例如生物细胞)之间的主要界面)时，可以促进微流体装置内的生物细胞(例如免疫细胞，如B细胞或T细胞)的培养(即，微物体表现出增加的活力、更大的扩增和/或在微流体装置中更大的可移植性)。在一些实施方案中，微流体装置的一个或多个内表面(例如，DEP配置的微流体装置的电极活化衬底的内表面、微流体装置的盖和/或管路材料的表面)用涂覆溶液和/或涂覆剂处理，以产生所需的有机和/或亲水分子层。在一些实施方案中，在微流体装置中培养并任选地允许扩增的微物体(例如生物细胞)输入到包含一种或多种涂覆剂的涂覆溶液中。
在其他实施方案中，在将微物体(例如生物细胞)引入到微流体装置中之前，将微流体装置(例如，DEP配置的微流体装置)的内表面用包含涂覆剂的涂覆溶液处理或“装填”。可以使用任何方便的涂覆剂/涂覆溶液，包括但不限于：血清或血清因子、牛血清白蛋白(BSA)、聚合物、去污剂、酶及其任何组合。在一些具体的实施方案中，涂覆剂将用于处理微流体装置的内表面。在一个实例中，在涂覆溶液中包含含亚烷基醚部分的聚合物作为涂覆剂。许多含亚烷基醚的聚合物可以是合适的。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
Figure BDA0002104386230000411
聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw范围可以为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定
Figure BDA0002104386230000412
聚合物包括L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在一些实施方案中，涂覆溶液可包含多种蛋白质和/或肽作为涂覆剂。在一个具体的实施方案中，在本公开中使用的涂覆溶液包括作为涂覆剂的蛋白质，如白蛋白(例如BSA)和/或包含白蛋白和/或一种或多种的其他类似蛋白质的血清(或多种不同血清的组合)。血清可以来自任何方便的来源，包括但不限于胎牛血清、绵羊血清、山羊血清、马血清等。在某些实施方案中，BSA在封闭溶液(blocking solution)中存在的浓度范围为约1mg/mL至约100mg/mL，包括5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL，或更高或介于其间的任何值。在某些实施方案中，血清在涂覆溶液中存在的浓度范围可以为约20％(v/v)至约50％v/v，包括25％、30％、35％、40％、45％，或更高或介于其间的任何值。在一些实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以5mg/mL存在于涂覆溶液中，而在其他实施方案中，BSA可以作为涂覆剂以70mg/mL存在于涂覆溶液中。在某些实施方案中，血清作为涂覆剂以30％存在于涂覆溶液中。
涂层材料。依据实施方案，任何上述涂覆剂/涂覆溶液可被用于涂覆微流体装置(例如，DEP配置的和/或EW配置的微流体装置)的一个或多个内表面的多种涂层材料代替，或与其组合使用。在一些实施方案中，微流体装置的至少一个表面包括涂层材料，其提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层。在一些实施方案中，微流体装置的基本上所有内表面都包括涂层材料。经涂覆的内表面可以包括流动区域(例如，通道)、室或隔离坞的表面，或其组合。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在其他实施方案中，多个流动区域或通道中的每一个都具有至少一个涂覆有涂层材料的内表面。在一些实施方案中，多个隔离坞中的每一个和多个通道中的每一个的至少一个内表面都涂覆有涂层材料。
基于聚合物的涂层材料。至少一个内表面可以包括包含聚合物的涂层材料。聚合物可以与至少一个表面共价或非共价地结合(或连接)。聚合物可以具有多种结构基序，例如嵌段聚合物(和共聚物)、星形聚合物(星形共聚物)和接枝或梳形聚合物(接枝共聚物)中所发现的，所有这些都可以适用于本文公开的方法。
聚合物可以包括含有亚烷基醚部分的聚合物。大量的含亚烷基醚的聚合物可以适用于本文所述的微流体装置。一类非限制性示例性的含亚烷基醚的聚合物是两性非离子嵌段共聚物，其包括在聚合物链内具有不同比例和位置的聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)子单元的嵌段。
Figure BDA0002104386230000421
聚合物(BASF)是这类嵌段共聚物，并且在本领域中已知适合于在与活细胞接触时使用。聚合物的平均分子量Mw为约2000Da至约20KDa。在一些实施方案中，PEO-PPO嵌段共聚物可以具有大于约10(例如，12-18)的亲水-亲油平衡(HLB)。可用于产生经涂覆的表面的特定
Figure BDA0002104386230000422
聚合物包括
Figure BDA0002104386230000423
L44、L64、P85和F127(包括F127NF)。另一类含亚烷基醚的聚合物是聚乙二醇(PEG Mw<100,000Da)或可替代地，聚氧乙烯(PEO，Mw>100,000)。在一些实施方案中，PEG可以具有约1000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da的Mw。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有羧酸部分的聚合物。羧酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚乳酸(PLA)。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磺酸部分的聚合物。磺酸子单元可以是含有烷基、烯基或芳香性部分的子单元。一个非限制性实例是聚苯乙烯磺酸(PSSA)或聚茴香脑磺酸。后者这些示例性聚合物是聚电解质，并且可以改变表面的特征，以提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含氨基甲酸乙酯部分的聚合物，例如但不限于聚氨酯。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有磷酸酯部分的聚合物，该磷酸酯部分在聚合物主链的末端处或者从聚合物的主链悬垂。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有糖部分的聚合物。在一个非限制性实例中，多糖(例如从海藻起源的或真菌多糖，例如黄原胶或葡聚糖)可以适合于形成可以在微流体装置中减少或防止细胞粘附的材料。例如，大小为约3kDa的葡聚糖聚合物可以用于为微流体装置内的表面提供涂层材料。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有核苷酸部分的聚合物，即核酸，其可以具有核糖核苷酸部分或脱氧核糖核苷酸部分。核酸可以仅含有天然核苷酸部分或者可以含有非天然核苷酸部分，其包含核碱基、核糖或磷酸酯部分类似物，例如7-脱氮腺嘌呤、戊糖、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯部分，但不限于此。含核酸的聚合物可以包括聚电解质，其可以提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层。
在其他实施方案中，涂层材料可以包括含有氨基酸部分的聚合物。含有氨基酸部分的聚合物可以包括含有天然氨基酸的聚合物或含有非天然氨基酸的聚合物，其均可以包括肽、多肽或蛋白质。在一个非限制性实例中，蛋白质可以是牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方案中，可以在涂层材料内提供细胞外基质(ECM)蛋白质，用于获得优化的细胞粘附以促进细胞生长。可以包含在涂层材料中的细胞基质蛋白质可以包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白、含RGD的肽(例如纤连蛋白)或层粘连蛋白。在其他实施方案中，可以在微流体装置的涂层材料内提供生长因子、细胞因子、激素或其他细胞信号传导物质。
在进一步的实施方案中，涂层材料可以包括含有胺部分的聚合物。聚氨基聚合物可以包括天然多胺聚合物或合成的多胺聚合物。天然多胺的实例包括精胺、亚精胺和腐胺。
在一些实施方案中，涂层材料可以包括含有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分或氨基酸部分中超过一种的聚合物。在其他实施方案中，经聚合物条件化的表面可以包括超过一种聚合物的混合物，每种聚合物具有亚烷基氧化物部分、羧酸部分、磺酸部分、磷酸酯部分、糖部分、核苷酸部分和/或氨基酸部分，其可以独立地或同时地并入到涂层材料中。
共价连接的涂层材料。在一些实施方案中，至少一个内表面包括共价连接的分子，其提供适于在微流体装置内维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层，以为这样的细胞提供条件化的表面。共价连接的分子包括连接基团，其中连接基团与微流体装置的一个或多个表面共价连接。连接基团还与被配置为提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分共价连接。与连接基团连接的表面可以包括微流体装置的衬底表面，对于其中微流体装置包括DEP配置的实施方案，其可以包括硅和/或二氧化硅。在一些实施方案中，共价连接的涂层材料基本上涂覆微流体装置的所有内表面。
在一些实施方案中，被配置为提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可以包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯膦酸)；氨基基团(包括其衍生物，例如但不限于烷基化的胺、羟烷基化的氨基基团、胍盐和含有非芳香化的氮环原子的杂环基团，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可以提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可以提供膦酸盐阴离子表面)；磺酸盐阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以是本文描述的任何聚合物，并且可以包括含亚烷基氧化物部分、羧酸部分、糖部分、磺酸部分、磷酸酯部分、氨基酸部分、核苷酸部分或氨基部分的聚合物。
在其他实施方案中，被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的共价连接的部分可以包括非聚合部分，例如烷基部分、取代的烷基部分(例如，氟代烷基部分(包括但不限于全氟代烷基部分))、氨基酸部分、醇部分、氨基部分、羧酸部分、膦酸部分、磺酸部分、氨基磺酸部分或糖部分。
在一些实施方案中，共价连接的部分可以是烷基，其包含形成直链(例如，至少10个碳或至少14、16、18、20、22或更多个碳的直链)的碳原子。因此，烷基可以是无支链的烷基。在一些实施方案中，烷基可以包括取代的烷基(例如，烷基中的一些碳可被氟代或全氟代)。烷基可以包括结合到未取代的碳的直链的取代(例如氟代或全氟代)碳的直链。例如，烷基可以包括第一区段(其可以包括全氟代烷基)，其连接至第二区段(其可以包括未取代的烷基)。第一和第二区段可以直接或间接(例如，通过醚链接)连接在一起。烷基的第一区段可以位于连接基团的远端，并且烷基的第二区段可以位于连接基团的近端。在其他实施方案中，烷基可以包括支链烷基，并且还可以具有中断烷基的烷基主链的一个或多个亚芳基。在一些实施方案中，烷基或氟代烷基的支链或亚芳基中断的部分位于远离到表面的连接基团和共价键的位置。
在其他实施方案中，共价连接的部分可以包括至少一个氨基酸，其可以包括超过一种类型的氨基酸。因此，共价连接的部分可以包括肽或蛋白质。在一些实施方案中，共价连接的部分可以包括氨基酸，其可以提供两性离子表面以支持细胞生长、活力、可移植性(portability)或其任何组合。
共价连接的部分可以包括一种或多种糖。共价连接的糖可以是单糖、二糖或多糖。可以修饰共价连接的糖，以引入反应性配对部分，其允许偶联或处理用于表面的附接。示例性的反应性配对部分可以包括醛、炔烃或卤素部分。可以以随机方式修饰多糖，其中可以修饰每种糖单体或仅修饰多糖内的一部分糖单体，以提供可以直接或间接偶联至表面的反应性配对部分。一个实例可以包括葡聚糖多糖，其可以经过非支链的连接部分间接地偶联到表面。
共价连接的部分可以包括一个或多个氨基。氨基可以是取代的胺部分、胍部分、含氮杂环部分或杂芳基部分。含氨基的部分可以具有允许对微流体装置内以及任选地对隔离坞和/或流动区域(例如，通道)内的环境进行pH修饰的结构。
涂层材料可以仅包含一类共价连接的部分，或者可以包括超过一种不同类型的共价连接的部分。例如，经氟代烷基条件化的表面(包括全氟代烷基)可以具有多个共价连接的部分，它们全部相同，例如具有相同的连接基团和与表面的共价连接、相同的总长度和相同数目的氟代亚甲基单元，包括氟代烷基部分。或者，涂层材料可以具有超过一种类型的与表面附接的共价连接部分。例如，涂层材料可以包括具有共价连接的具有指定数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基部分的分子，并且还可以包括另一组分子，其具有共价连接到具有更大数目的亚甲基或氟代亚甲基单元的烷基或氟代烷基链的带电荷部分。在一些实施方案中，具有多于一种共价连接的部分的涂层材料可以被设计成使得具有更大数目的主链原子并因此与共价连接到表面的距离更长的第一组分子可以提供在经涂覆的表面上呈现较大部分的能力，而具有不同的、空间要求更低的末端和更少的主链原子的第二组分子能够有助于使整个衬底表面功能化，从而防止与构成衬底本身的硅或氧化铝的不期望的粘附或接触。在另一个实例中，共价连接的部分可以提供两性离子表面，其在表面上以随机的方式呈现交替的电荷。
条件化的表面性质。在一些实施方案中，当共价连接至微流体装置的表面(例如，DEP配置的衬底表面)时，共价连接的部分可以形成单层。在一些实施方案中，由共价连接的部分形成的条件化的表面可以具有小于10nm(例如，小于5nm，或约1.5至3.0nm)的厚度。在其他的实施方案中，由共价连接的部分形成的条件化的表面可具有约10nm至约50nm的厚度。在一些实施方案中，条件化的表面不需要完美形成的单层以适当地作用于在DEP配置的微流体装置内操作。
在各种实施方案中，微流体装置的涂层材料可以提供所需的电性质。不希望受理论的限制，影响涂覆有特定涂层材料的表面的稳健性的一个因素是固有电荷捕获。不同的涂层材料可能捕获电子，这可能导致涂层材料的破坏。涂层材料中的缺陷可能增加电荷捕获并导致涂层材料的进一步破坏。类似地，不同的涂层材料具有不同的介电强度(即导致介电击穿的最小施加电场)，这可能影响电荷捕获。在某些实施方案中，涂层材料可以具有降低或限制电荷捕获量的整体结构(例如，紧密堆积的单层结构)。
除了涂层材料的组成之外，其他因素(例如涂层材料的物理(和电)厚度)可通过微流体装置的衬底影响DEP力和电润湿力的产生。各种因素可能改变涂层材料的物理厚度和电厚度，包括在衬底上沉积涂层材料的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂和静电涂覆)。涂层材料的物理厚度和均一性可使用椭偏仪测量。
除了其电性质之外，涂层材料可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于未取代的烷基，含有氟代(或全氟代)烷基的涂层材料可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物物质(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和其降解产物)的永久性或半永久性沉积。这样的结垢可以增加生物微物体对表面的粘附量。
除了条件化的表面的组成之外，其他因素(例如疏水材料的物理厚度)可能影响DEP力。各种因素可能改变条件化的表面的物理厚度，例如在衬底上形成条件化的表面的方式(例如，气相沉积、液相沉积、旋涂、溢流和静电涂覆)。条件化的表面的物理厚度和均一性可使用椭偏仪测量。
除了其电性质之外，条件化的表面还可以具有有益于与生物分子一起使用的性质。例如，相对于烷基封端的链，含有氟代(或全氟代)碳链的条件化的表面可以在减少表面结垢量方面提供益处。如本文所用的表面结垢是指沉积在微流体装置的表面上的任意物质的量，其可以包括生物材料(例如，蛋白质及其降解产物、核酸和各自的降解产物，等等)的永久性或半永久性沉积。
下表包括可以在DEP中使用的条件化的表面的许多性质。如所示，对于条目1至7(其全部共价连接到如本文所述的条件化的表面)，如椭圆偏振技术所测量的厚度始终薄于条目8(一种CYTOP表面，其通过非共价旋涂形成)的厚度(在整个表中，N/A表示不可得的数据)。相比于形成方式，发现结垢更依赖于表面的化学性质，因为，氟化表面通常比烷基(烃)调节的表面更不易结垢。
表1.相比于一种非共价形成的表面CYTOP，通过共价修饰表面制备的多种条件化的表面的性质。
Figure BDA0002104386230000481
Figure BDA0002104386230000491
1.旋涂，非共价。
表面的连接基团。形成涂层材料的共价连接部分通过连接基团连接到表面上。连接基团可以是通过含硅氧烷的试剂与衬底表面的氧化物反应形成的甲硅烷氧基连接基团，其可包括氧化硅(例如，用于DEP配置的衬底)或氧化铝或氧化铪(例如，用于EW配置的衬底)。在一些其他实施方案中，连接基团可以是通过含膦酸试剂与衬底表面的氧化物反应形成的磷酸酯。
多部分条件化的表面。如下文所述的，共价连接的涂层材料可以通过已经含有被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分的分子(例如，烷基硅氧烷试剂或氟取代的烷基硅氧烷试剂，其可以包括全氟代烷基硅氧烷试剂)的反应形成。或者，共价连接的涂层材料可以通过将被配置为提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分偶联至表面修饰配体(它本身与表面共价连接)而形成。
制备共价连接的涂层材料的方法。在一些实施方案中，共价连接至微流体装置的表面(例如，包括隔离坞和/或流动区域的至少一个表面)的涂层材料具有式1的结构。
Figure BDA0002104386230000492
涂层材料可以共价连接到DEP配置的衬底的表面的氧化物上。DEP配置的衬底可以包括硅或氧化铝或氧化铪，并且氧化物可以作为衬底的初始化学结构的一部分存在，或者可以被如下所讨论地引入。
涂层材料可以经由连接基团(“LG”)与氧化物连接，该连接基团可以是由硅氧烷或膦酸基团与氧化物反应而形成的甲硅烷氧基或膦酸酯基团。被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分可以是本文所述的任何部分。连接基团LG可以直接或间接连接到被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分。当连接基团LG直接连接至该部分时，不存在任选的连接部分(“L”)，且n为0。当连接基团LG间接连接至该部分时，存在连接部分L，且n为1。连接部分L可以具有线性部分，其中线性部分的主链可以包括1至200个选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合的非氢原子，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被可以选自醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基的一个或多个部分的任何组合所中断。另外，连接部分L可以具有中断连接基团的主链的一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基。在一些实施方案中，连接部分L的主链可以包括10至20个原子。在其他实施方案中，连接部分L的主链可以包括约5个原子至约200个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，主链原子均为碳原子。在其他实施方案中，主链原子不全是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何可能组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
当配置成提供适于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分在一步工艺中加入到衬底表面时，可以使用式2的分子来引入涂层材料：
部分–(L)n–LG.
式2
在一些实施方案中，配置成提供适于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分可以在多步骤工艺中添加到衬底的表面。当配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分以逐步方式偶联至表面时，连接部分L可进一步包括偶联基团CG，如式3所示。
Figure BDA0002104386230000511
在一些实施方案中，偶联基团CG表示由反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx(即，被配置为与反应性部分Rx反应的部分)的反应所得到的基团。例如，一种典型的偶联基团CG可以包括羧酰氨基基团，其是氨基与羧酸衍生物(例如，活化的酯、酰氯等)反应的结果。其他CG可以包括亚三唑基、羧酰氨基、硫代酰氨基、肟、巯基、二硫化物、醚或烯基，或者可以在反应性部分与其相应的反应性配对部分反应时形成的任何其他合适的基团。偶联基团CG可以位于连接基团L的第二末端(即，邻近被配置为提供适合于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分的末端)。在一些其他实施方案中，偶联基团CG可以中断连接基团L的主链。在一些实施方案中，偶联基团CG是亚三唑基，它可以由炔基和叠氮基间的反应获得，它们任何一个可以是反应性部分Rx和反应性配对部分Rpx，如本领域已知用于Click偶联反应的。例如，二苯并环辛烯基稠合的亚三唑基可以是结合二苯并环辛炔基反应性配对部分Rpx与表面改性分子的叠氮基反应性部分Rx的反应得到，其在以下段落中更详细地描述。多种二苯并环辛炔基改性的分子是本领域中已知的，或可以被合成以并入配置成提供适合于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分。
当涂层材料在多步骤工艺中形成时，可以通过含有部分的试剂(式5)与具有与其共价连接的表面修饰配体的衬底(式6)反应引入配置成提供适于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分。
式4的改性表面具有与其连接的表面修饰配体，其具有式-LG-(L”)j-Rx，其与衬底的氧化物连接并且类似于如上对于式1的条件化表面所述地形成。衬底的表面可以是如上所述的DEP配置的衬底表面，并且可以包括衬底本身或引入其中的氧化物。连接基团LG如上所述。连接部分L”可以存在(j＝1)或不存在(j＝0)。连接部分L”可以具有直链部分，其中直链部分的主链可以包括1至100个非氢原子，选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L”可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分的主链。在一些实施方案中，连接部分L”的主链可包含10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L”的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
反应性部分Rx存在于表面修饰配体的末端，远离表面修饰配体与表面的共价连接。反应性部分Rx是可用于偶联反应以引入提供适于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分的任何合适的反应性部分。在一些实施方案中，反应性部分Rx可以是叠氮基、氨基、溴代、巯基、活化酯、琥珀酰亚胺基或炔基部分。
含有部分的试剂。含有部分的试剂(式5)被配置成供给配置成提供适于在微流体装置中维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分。
部分-(L’)m-Rpx
式5
在含有部分的试剂中配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分通过反应性配对部分Rpx与反应性部分Rx的反应与表面修饰配体连接。反应性配对部分Rpx是任何合适的反应性基团，其配置成与相应的反应部分Rx反应。在一个非限制性实例中，一个合适的反应性配对部分Rpx可以是炔烃，反应性部分Rx可以是叠氮化物。反应性配对部分Rpx可以可选择地是叠氮部分，相应的反应性部分Rx可以是炔烃。在其他实施方案中，反应性配对部分Rpx可以是活性酯官能团，反应性部分Rx可以是氨基。在其他实施方案中，反应性配对部分Rpx可以是醛，反应性部分Rx可以是氨基。其他反应性部分-反应性配对部分的组合是可能的，并且这些实例决不是限制性的。
式5的含有部分的试剂的配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分可包括本文所述的任何部分，包括烷基或氟代烷基(包括全氟代烷基)部分；单糖或多糖(其可包括但不限于葡聚糖)；醇(包括但不限于炔丙醇)；多元醇，包括但不限于聚乙烯醇；亚烷基醚，包括但不限于聚乙二醇；聚电解质(包括但不限于聚丙烯酸或聚乙烯基膦酸)；氨基(包括其衍生物，例如但不限于烷基化胺、羟烷基化氨基、胍盐和含有未芳香化的氮环原子的杂环基，例如但不限于吗啉基或哌嗪基)；羧酸，包括但不限于丙炔酸(其可提供羧酸盐阴离子表面)；膦酸，包括但不限于乙炔基膦酸(其可提供膦酸阴离子表面)；磺酸根阴离子；羧基甜菜碱；磺基甜菜碱；氨基磺酸；或氨基酸。
式5的含有部分的试剂的配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分可以直接连接至(即，L’，其中m＝0)或间接连接至反应性配对部分Rpx。当反应性配对部分Rpx间接连接至配置成提供适于维持和/或扩增生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的有机和/或亲水分子层的部分时，反应性配对部分Rpx可连接至连接部分L’(m＝1)。反应性配对部分Rpx可以连接到连接部分L’的第一末端，并且配置成减少表面结垢和/或防止或减少细胞粘附的部分可以连接到连接部分L’的第二末端。连接部分L’可以具有直链部分，其中直链部分的主链包括1至100个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L’可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分L’的主链。在一些实施方案中，连接部分L’的主链可包括10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L’的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子；约10个原子至约50个原子；或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
当含有部分的试剂(式5)与具有表面修饰配体的表面(式3)反应时，形成具有式2的条件化表面的衬底。连接部分L’和连接部分L”然后正式成为连接部分L的一部分，并且反应性配对部分Rpx与反应部分Rx的反应产生式2的偶联基团CG。
表面改性剂。表面改性剂是具有结构LG-(L”)j-Rx(式4)的化合物。连接基团LG共价连接到衬底表面的氧化物上。衬底可以是DEP配置的衬底，并且可以包括硅或氧化铝或氧化铪，并且氧化物可以作为衬底的天然化学结构的一部分存在，或者可以如本文所讨论的那样引入。连接基团LG可以是本文所述的任何连接基团，例如甲硅烷氧基或膦酸酯基团，其由硅氧烷或膦酸基团与衬底表面上的氧化物的反应形成。反应性部分Rx如上所述。反应性部分Rx可以直接连接到(L“，j＝0)或通过连接部分L”间接连接到(j＝1)连接基团LG。连接基团LG可以连接到连接部分L”的第一末端，并且反应性部分Rx可以连接到连接部分L”的第二末端，一旦表面修饰试剂如式6中所示已经被连接到表面，反应性部分Rx将位于衬底表面的远端。
Figure BDA0002104386230000551
连接部分L”可以具有直链部分，其中直链部分的主链包括1至100个非氢原子，其选自硅、碳、氮、氧、硫和磷原子的任何组合。在一些非限制性实例中，它可以被醚、氨基、羰基、酰氨基或膦酸酯基团的任何组合中断。另外，连接部分L”可以具有一个或多个亚芳基、亚杂芳基或杂环基团，它们中断连接部分L”的主链。在一些实施方案中，连接部分L”的主链可包括10至20个碳原子。在其他实施方案中，连接部分L”的主链可包括约5个原子至约100个原子；约10个原子至约80个原子、约10个原子至约50个原子或约10个原子至约40个原子。在一些实施方案中，骨架原子全部是碳原子。在其他实施方案中，骨架原子不全部是碳，并且可以包括硅、碳、氮、氧、硫或磷原子的任何可能的组合，其受本领域中已知的化学键合的限制。
在一些实施方案中，使用化学气相沉积将涂层材料(或表面修饰的配体)沉积在微流体装置的内表面上。通过化学气相沉积，涂层材料可以实现紧密堆积的单层，其中包含涂层材料的分子共价键合到微流体装置的内表面的分子上。为了获得需要的填充密度，可以在至少110℃(例如，至少120℃、130℃、140℃、150℃、160℃等)的温度下气相沉积包含例如烷基封端的硅氧烷的分子，持续至少15小时(例如，至少20、25、30、35、40、45或更多个小时)。这种气相沉积通常在真空下和在水源(例如水合硫酸盐(例如MgSO4·7H2O))存在下进行。通常，增加气相沉积的温度和持续时间产生改善的疏水涂层材料的特性。
可以任选地改进气相沉积工艺，例如，通过预清洁盖110、微流体管路材料116和/或衬底(例如，DEP配置的衬底的电极活化衬底206的内表面208，或EW配置的衬底的支撑结构104的介电层)。例如，该预清洁可包括溶剂浴，例如丙酮浴、乙醇浴或其组合。溶剂浴可包括声处理。替代地或另外地，这种预清洁可以包括在氧等离子体清洁剂中处理盖110、微流体管路材料116和/或衬底，其可以去除各种杂质，同时引入经氧化的表面(例如，表面上的氧化物，其可以如本文所述进行共价修饰)。氧等离子体清洁剂可以例如在真空条件下以100W操作60秒。或者，可以使用液相处理(其包括氧化剂(例如过氧化氢)来氧化表面)代替氧等离子体清洁剂。例如，盐酸和过氧化氢的混合物或硫酸和过氧化氢的混合物(例如，食人鱼溶液，其可以具有约3:1至约7:1的硫酸与过氧化氢的比率范围)代替氧等离子体清洁剂。
在一些实施方案中，在微流体装置200已经被组装以形成限定微流体管路120的外壳102之后，使用气相沉积来涂覆微流体装置200的内表面。在完全组装的微流体管路120上沉积包含紧密堆积的单层的涂层材料可以有益于提供多种功能特性。不希望受理论的限制，将这样的涂层材料沉积在完全组装的微流体管路120上可能有益于防止由微流体管路材料116和电极活化衬底206介电层和/或盖110之间变弱的结合所引起的分层。
图2H描绘了微流体装置290的横截面视图，该微流体装置290包括示例类别的涂层材料。如所示，涂层材料298(示意性地示出)可以包括与微流体装置290的衬底286的内表面294和盖288的内表面292两者共价结合的紧密堆积的分子单层。涂层材料298可以被设置在邻近且向内朝向微流体装置290的外壳284的所有内表面294、292上，在一些实施方案中并且如上文所讨论的，包括用于定义微流体装置290内的管路元件和/或结构的微流体管路材料的表面(未示出)。在可选的实施方案中，涂层材料298可以仅被设置在微流体装置290的一个或一些内表面上。
在图2H所示的实施方案中，涂层材料298包含烷基封端的硅氧烷分子单层，每个分子经由甲硅烷氧基连接体296共价键合到微流体装置290的内表面292、294。然而，可以使用任何上述涂层材料298(例如烷基封端的膦酸酯分子)。更具体地，烷基可包含至少10个碳原子(例如10、12、14、16、18、20、22或更多个碳原子)的直链，并且任选地，可以是取代的烷基。如上所述，包含紧密堆积的分子单层的涂层材料298可具有用于DEP配置的微流体装置290的有益功能特性，例如最小电荷捕获、减小的物理/电厚度和基本均匀的表面。
在另一个具体的实施方案中，涂层材料298可在其面向外壳的末端(即未结合到内表面292、294并且靠近外壳284的涂层材料298的单层的部分)包含氟代烷基(例如氟代烷基或全氟代烷基)。如上所述，涂层材料298可包括氟代烷基封端的硅氧烷或氟代烷基封端膦酸酯的单层，其中氟代烷基存在于涂层材料298的面向外壳的末端。这种涂层材料298通过将生物微物体与非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)分离或“屏蔽”，提供改善的生物微物体(例如细胞，如免疫细胞(例如B细胞)或杂交瘤细胞)的维持和/或扩增的功能益处。
在其他具体的实施方案中，用于涂覆微流体装置290的内表面292、294的涂层材料298可以包括阴离子、阳离子或两性离子部分，或其任何组合。不希望受理论的限制，通过在微流体管路120的外壳284的内表面上提供阳离子部分、阴离子部分和/或两性离子部分，涂层材料298可以与水分子形成强的氢键，使得所产生的水合水充当将核(nuclei)与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。另外，在涂层材料298与阻断剂结合使用的实施方案中，涂层材料298的阴离子、阳离子和/或两性离子可以与存在于外壳284中的介质180(例如，涂覆溶液)中的非共价涂覆剂(例如，溶液中的蛋白质)的带电荷部分形成离子键。
在另一个具体的实施方案中，涂层材料可以包含或经化学修饰以在其朝向外壳的末端提供亲水涂覆剂。在一些实施方案中，涂覆剂可以是含亚烷基醚的聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，涂覆剂可以是多糖，例如葡聚糖。与上文所讨论的带电荷部分(例如，阴离子、阳离子和两性离子部分)一样，亲水涂覆剂可以与水分子形成强的氢键，使得所得的水合水充当将核与对非生物分子(例如，衬底的硅和/或氧化硅)的相互作用分开的层(或“屏蔽”)。
检测抗体表达的方法。本文公开的方法包括检测或识别表达特异性结合目标抗原的抗体的生物细胞的方法。目标抗原可以是蛋白质、碳水化合物基团或链、蛋白质或碳水化合物以外的生物或化学试剂，或其任何组合。目标抗原可以例如是与病原体(例如病毒、细菌病原体、真菌病原体、原生动物病原体等)相关的抗原。或者，目标抗原可与癌症(例如肺癌、乳腺癌、黑素瘤等)相关。在另一个替代方案中，抗原可以与自身免疫疾病(例如多发性硬化或I型糖尿病)相关。如本文所用，术语“与病原体相关”当与目标抗原一起使用时，是指目标抗原直接由病原体产生或由病原体和宿主之间的相互作用产生。
检测表达特异性结合目标抗原的抗体的生物细胞的方法可以在本文所述的微流体装置中进行。特别地，微流体装置可包括具有流动区域的外壳，该流动区域可包括一个或多个微流体通道和隔离坞(或多个隔离坞)。隔离坞可以包括分离区域和连接区域，该连接区域在分离区域和流动区域/微流体通道之间提供流体连接。隔离坞的体积可以是约0.5nL至约5.0nl或其中的任何范围(例如，约0.5nl至约1.0nl、约0.5nl至约1.5nl、约0.5nl至约2.0nl、约1.0nl至约1.5nl、约1.0nl至约2.0nl、约1.0nl至约2.5nl、约1.5nl至约2.0nl、约1.5nl至约2.5nl、约1.5nl至约3.0nl、约2.0nl至约2.5nl、约2.0nl至约3.0nl、约2.0nl至约3.5nl、约2.5nl至约3.0nl、约2.5nl至约3.5nl、约2.5nl至约4.0nl、约3.0nl至约3.5nl、约3.0nl至约4.0nl、约3.0nl至约4.5nl、约3.5nl至约4.0nl、约3.5nl至约4.5nl、约3.5nl至约5.0nl、约4.0nl至约4.5nl、约4.0nl至约5.0nl、约4.5nl至约5.0nl或由前述端点之一限定的任何范围)。连接区域可具有本文中一般描述的宽度Wcon(例如，约20微米至约100微米，或约30微米至约60微米)。分离区域的宽度Wiso可以大于所述连接区域的宽度Wcon。在某些实施方案中，分离区域的宽度Wiso约为50微米至约250微米。
流动区域、隔离坞和/或隔离坞的分离区域可包括涂覆有涂层材料的至少一个表面，所述涂层材料促进生物细胞的活力和/或减少与生物细胞的相互作用。因此，例如，涂层材料可以促进杂交瘤细胞的活力，和/或促进B细胞淋巴细胞(例如，记忆B细胞或浆细胞)的活力，和/或将任何此类细胞移动至微流体装置内的能力。如在本文中使用的，“促进活力”意指与未涂覆的等效表面相比，抗体表达生物细胞的活力在涂覆表面上更好。在某些实施方案中，流动区域、隔离坞和/或分离区域具有多个表面，每个表面均涂覆有涂层材料，该涂层材料促进抗体表达细胞的活力和/或减少与抗体表达细胞的相互作用。涂层材料可以是本领域已知和/或本文所述的任何合适的涂层材料。涂层材料可以例如包含亲水性分子。亲水性分子可选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含碳水化合物基团的聚合物、包含氨基酸的聚合物(例如，蛋白质，例如BSA)，及其组合。
流动区域、隔离坞和/或隔离坞的分离区域可包括至少一个条件化的表面，其促进抗体表达生物细胞的活力和/或减少与抗体表达生物细胞的相互作用。因此，例如，条件化的表面可以促进杂交瘤细胞的活力，和/或促进B细胞淋巴细胞(例如，记忆B细胞或浆细胞)的活力，和/或促进将任何细胞移动到微流体装置内的能力。如在本文中使用的，“促进活力”意指与未经调节的等效表面相比，抗体表达生物细胞的活力在条件化的表面上更好。在某些实施方案中，流动区域、隔离坞和/或分离区域具有多个条件化的表面，每个条件化的表面均能够促进抗体表达细胞的活力和/或减少与抗体表达细胞的相互作用。条件化的表面可包含共价连接的分子。共价连接的分子可以是本领域已知和/或本文公开的任何合适的分子，包括例如共价连接的亲水性分子。亲水性分子可选自包含聚乙二醇(PEG)的聚合物、包含碳水化合物基团的聚合物、包含氨基酸的聚合物，及其组合。如本文所述，亲水性分子可以形成共价连接的亲水分子层。或者，共价连接的分子可包含全氟烷烃(例如，共价连接的全氟烷烃层)。
检测表达特异性结合目标抗原的抗体的生物细胞的方法可包括以下步骤：将含有抗体表达生物细胞的样品引入微流体装置；将抗体表达生物细胞加载到微流体装置中的隔离坞的分离区域中；将目标抗原引入微流体装置中，使得目标抗原位于抗体表达生物细胞的附近；并监测目标抗原与生物细胞表达的抗体的结合。
抗体表达生物细胞可以例如是杂交瘤细胞。或者，抗体表达生物细胞可以是B细胞淋巴细胞。B细胞淋巴细胞可以是例如CD27+B细胞或CD138+B细胞。在一些实施方案中，B细胞是记忆B细胞。在其他实施方案中，B细胞是浆细胞。
将抗体表达生物细胞引入微流体装置可涉及获得含有抗体表达细胞的样品。对于其中抗体表达生物细胞是B细胞淋巴细胞的实施方案，含有B细胞淋巴细胞的样品可以从哺乳动物获得，所述哺乳动物例如是人、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠)、兔、雪貂、家畜(如山羊、绵羊、猪、马、牛)、美洲驼、骆驼、猴，或从鸟类中获得，如鸡和火鸡。在一些实施方案中，哺乳动物已针对目标抗原进行免疫。在一些实施方案中，动物已暴露于或感染与目标抗原相关的病原体。在一些实施方案中，动物患有与目标抗原相关的癌症。在其他实施方案中，动物具有与目标抗原相关的自身免疫疾病。含有B细胞淋巴细胞的样品可以是外周血样品(例如PBMC)、脾活检、骨髓活检、淋巴结活检、肿瘤活检或其任何组合。
可以处理(例如，分选，阴性和/或阳性地)含有B细胞淋巴细胞的样品以富集期望的B细胞淋巴细胞。在一些实施方案中，期望的B细胞淋巴细胞是记忆B细胞。在其他实施方案中，期望的B细胞淋巴细胞是浆细胞。在一些实施方案中，期望的B细胞淋巴细胞表达IgG型抗体。因此，例如，样品可以耗尽B细胞淋巴细胞以外的细胞类型。从样品中耗尽非B细胞细胞类型的方法是本领域熟知的，并且包括，例如，用DYNABEADSTM未修改B细胞试剂(DYNABEADSTM Untouched Human B Cells试剂，Thermo Fisher)、B Cell Isolation Kit(Miltenyi)、EasySep B Cell Enrichment Kit(EasySep)、RosetteSep人B细胞富集Cocktain(RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktain，Stem Cell Technologies)等处理样品。或者，或另外，可以通过荧光相关细胞分选(FACS)分选含有B细胞淋巴细胞的样品以除去不需要的细胞类型并富集期望的细胞类型。FACS分选可以是阴性和/或阳性的。例如，FACS分选可以耗尽表达IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体、IgG抗体或其任何组合的B细胞淋巴细胞样品。或者，或另外，FACS分选可以富集样品的表达CD27(或一些其他记忆B细胞标志物)的B细胞淋巴细胞或表达CD138(或一些其他浆细胞标志物)的B细胞淋巴细胞。含有B细胞淋巴细胞的样品可以富集状态提供(即预处理的)，使得不需要进行富集期望的B细胞淋巴细胞的处理作为该方法的一部分。或者，可以将处理含有B细胞淋巴细胞的样品以富集期望的B细胞淋巴细胞作为本发明方法的一部分来进行。
可以处理含有B细胞淋巴细胞的样品以减少样品中细胞粘附到微流体装置。例如，可以用DNA酶(例如Nuclease(Millipore))处理样品。优选地，DNA酶含有最小的蛋白酶活性。
将抗体表达生物细胞引入微流体装置可以通过使含有生物细胞的样品流入微流体装置的入口并通过微流体装置的流动区域的一部分来进行。然后可以停止样品通过微流体装置的流动，以允许将抗体表达生物细胞(例如B细胞淋巴细胞)加载到隔离坞的分离区域中。将抗体表达细胞加载到分离区域中可以通过本领域已知的或本文公开的任何技术进行，例如使用重力和/或DEP力。在某些实施方案中，将单一抗体表达细胞(例如，B细胞淋巴细胞)加载到分离区域中。在某些实施方案中，将单一抗体表达细胞(例如，B细胞淋巴细胞)加载到微流体装置中的多个隔离坞中的每一个的分离区域中。
检测表达特异性结合目标抗原的抗体的生物细胞的方法可包括使B细胞淋巴细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触的步骤。刺激剂可以是CD40激动剂，例如CD40L，其衍生物或抗CD40抗体。刺激剂可包含CD40L+饲养细胞，基本上由其组成或由其组成。CD40L+饲养细胞可以是T细胞(例如，Jurkat D1.1细胞)或其衍生物。或者，饲养细胞可以是用CD40L表达构建体转染/转化的细胞系(例如，NIH-3T3细胞)。刺激剂可进一步包含B细胞受体(BCR)超抗原，例如蛋白A、蛋白G或任何其他BCR超抗原。BCR超抗原可以连接于微物体，例如珠子、脂质囊泡、脂质纳米筏等。因此，涂有超抗原的微物体可以与CD40L+饲养细胞混合。混合物可具有约1:1的饲养细胞与微物体的比，或约1:5的饲养细胞与微物体的比，或其间的任何比。或者，混合物可具有约1:2的饲养细胞与微物体的比，或约2:10的饲养细胞与微物体的比，或其间的任何比。刺激剂可以进一步包含toll样受体(TLR)激动剂(例如，TLR9激动剂)，其可以与CD40激动剂和任选的BCR超抗原组合。TLR激动剂可以是例如CpG寡核苷酸(例如，CpG2006)。CpG寡核苷酸可以以约1微克/mL至约20微克/mL(例如，约1.5至约15微克/mL、约2.0至约10微克/mL或约2.5至约5.0微克/mL)的浓度使用。B细胞淋巴细胞可以与刺激剂接触(例如，基本上连续地、或周期性地/间歇地)接触1至10天(例如，2至8天，3至7天或4至6天)。可以使B细胞淋巴细胞与刺激剂在隔离坞内接触，B细胞淋巴细胞被加载到隔离坞中。这种接触可以在B细胞淋巴细胞加载到隔离坞中之后发生。
检测表达特异性结合目标抗原的抗体的生物细胞的方法还可以包括向抗体表达生物细胞(例如，B细胞淋巴细胞)提供培养基/活化培养基的步骤，所述培养基/活化培养基包含一种或多种生长诱导剂，其促进B细胞活化和/或扩增。一种或多种生长诱导剂可包括至少一种选自CpG寡核苷酸、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21、BAFF和April的试剂。IL-2可以约2ng/mL至约5ug/mL，或约50ng/mL至约2ug/mL，或约100ng/mL至约1.5ug/mL，或约500ng/mL至约1ug/mL，或约1ug/mL的浓度提供。IL-4可以约2ng/mL至约20ng/mL，或约5ng/mL至约10ng/mL，或约5ng/mL的浓度提供。IL-6、IL-10和/或IL-21可以约2ng/mL至约50ng/mL，或约5ng/mL至约20ng/mL，或约10ng/mL的浓度提供。BAFF和/或April可以约10ng/mL至约100ng/mL，或约10ng/mL至约50ng/mL，或约10ng/mL至约20ng/mL，或约10ng/mL的浓度提供。CpG寡核苷酸可以以约1微克/mL至约20微克/mL，约1.5至约15微克/mL，约2.0至约10微克/mL，或约2.0微克/mL的浓度使用。在某些实施方案中，向抗体表达生物细胞提供培养基1至10天(例如，2至8天、3至7天或4至6天)。培养基可包含刺激剂(例如，CD40激动剂和/或BCR超抗原)。因此，例如，当抗体产生细胞是B细胞淋巴细胞时，向B细胞淋巴细胞提供培养基可以在使B细胞淋巴细胞与活化剂接触的同时进行。在某些实施方案中，使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触和向B细胞淋巴细胞提供培养基的步骤在重叠的时间内(例如，在基本上共同延长的时间段内)进行。
在某些实施方案中，将目标抗原引入微流体装置中使得目标抗原位于抗体表达生物细胞的附近包括将目标抗原定位在生物细胞的1毫米(mm)内(例如，生物细胞的750微米内、600微米内、500微米内、400微米内、300微米内、200微米内、100微米内或50微米内)。在某些实施方案中，所述方法可包括将微物体或多个微物体引入连接至隔离坞的流动区域/微流体通道中。微物体可包含抗体特异性结合剂，例如抗IgG抗体或其他IgG结合剂。参见，例如，图6C。在此类实施方案中，监测目标抗原与生物细胞表达的抗体的结合包括检测标记的目标抗原通过抗体表达生物细胞表达的抗体与微物体的间接结合。标记的目标抗原可以是可溶的，并且可以包括可检测的标记，例如荧光标记。微物体可以是本领域已知和/或本文描述的任何合适的微物体(例如，细胞、脂质体、脂质纳米筏或珠子)。提供目标抗原的步骤可包括将这样的微物体置于隔离坞的连接区域附近或内部，其中抗体表达生物细胞位于其中。或者，提供目标抗原的步骤可包括将这种微物体加载到隔离坞的分离区域中，抗体表达生物细胞位于其中。微物体和目标抗原可以作为混合物同时提供，或者顺序提供(如果微物体首先置于隔离坞内)。
或者，在某些实施方案中，所述方法可以包括将微物体或多个微物体引入连接至隔离坞的流动区域/微流体通道中，其中目标抗原与微物体结合。在此类实施方案中，还可提供可溶性标记的抗体特异性结合剂，例如抗IgG抗体或其他IgG结合剂，并且监测目标抗原与由生物细胞表达的抗体的结合包括检测标记的抗体特异性结合剂通过抗体表达生物细胞表达的抗体与微物体的间接结合。标记的抗体特异性结合剂可包括可检测的标记，例如荧光标记。微物体可以是本领域已知和/或本文描述的任何合适的微物体(例如，细胞、脂质体、脂质纳米筏或珠子)。提供目标抗原的步骤可包括将这样的微物体置于隔离坞的连接区域附近或内部，抗体表达生物细胞位于其中。提供目标抗原的步骤还可以包括将这样的微物体加载到隔离坞的分离区域中，抗体表达生物细胞位于其中。微物体和抗体特异性结合剂可以作为混合物同时提供，或者顺序提供(如果微物体首先置于隔离坞内)。筛选目标分子(例如抗体)的表达的方法已描述于例如美国专利公开号US2015/0151298中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述第一抗体特异性结合剂之前或同时提供第二抗体特异性结合剂。参见例如图6C。第二抗体结合剂可以是抗IgG抗体或其他类型的抗体结合剂，并且可以(例如，用荧光标记)标记。在某些实施方案中，标记的第二抗体特异性结合剂以与目标抗原和第一抗体特异性结合剂的混合物提供。在其他实施方案中，在提供目标抗原和/或第一抗体特异性结合剂之后提供标记的第二抗体特异性结合剂。
在某些实施方案中，提供目标抗原可以包括使包含可溶性目标抗原的溶液流过微流体装置的流动区域并使可溶性抗原扩散到抗体表达生物细胞所在的隔离坞中。这种可溶性抗原可以与可检测标记(例如荧光标记)共价结合。以这种方式筛选目标分子(包括抗体)的表达的一般方法已经描述于例如2017年4月14日提交的国际申请PCT/US2017/027795中，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述方法还可以包括检测目标抗原与由生物细胞(例如，B细胞淋巴细胞)表达的抗体的结合，并识别表达特异性结合所述目标抗原的抗体的抗体表达生物细胞(例如，B细胞淋巴细胞)。
从识别的B细胞淋巴细胞获得抗体序列。本文还公开了提供测序文库和/或从抗体表达细胞获得重链和轻链抗体序列的方法。另外，从目标B细胞淋巴细胞获得测序文库可以通过本文所述方法之外的方法进行。其他合适但非限制性的方法描述于2017年9月29日提交的PCT/US2017/054628，并且其整体出于所有目的通过引用并入本文。
捕获/引发寡核苷酸。捕获/引发寡核苷酸可包括第一引发序列和捕获序列。捕获/引发寡核苷酸可包括5'最末端核苷酸和3'最末端核苷酸。
捕获序列。捕获序列是配置成从裂解的细胞捕获核酸的寡核苷酸序列。在各种实施方案中，捕获序列可以靠近或包括捕获/引发寡核苷酸的3'最末端核苷酸。捕获序列可具有约6至约50个核苷酸。在一些实施方案中，捕获序列通过与从目标细胞释放的核酸杂交来捕获核酸。在本文所述的一些方法中，从目标B细胞释放的核酸可以是mRNA。可以捕获mRNA并与mRNA杂交的捕获序列可以包括polyT序列，所述mRNA在mRNA的3'末端具有PolyA序列。polyT序列可具有约20个T核苷酸至超过100个T核苷酸。在一些实施方案中，polyT序列可具有约30至约40个核苷酸。polyT序列可在其3'末端进一步含有两个核苷酸VI。
第一引发序列。捕获/引发寡核苷酸的第一引发序列可以是：捕获序列的5'，靠近捕获/引发寡核苷酸的5'最末端核苷酸；或包含捕获/引发寡核苷酸的5'最末端核苷酸。第一引发序列可以是通用序列或序列特异性引发序列。第一引发序列可以与引物结合，所述引物在结合后引发逆转录酶。第一引发序列可包括约10至约50个核苷酸。
额外的引发和/或衔接子序列。捕获寡核苷酸可任选地具有一个或多个额外的引发/衔接子序列，其提供引物延伸的着陆位点(其可包括通过聚合酶的延伸)或用于固定到大规模平行测序阵列或流动细胞内的互补杂交锚定位点的位点。在这里的方法中，第二(或额外)引发序列可以是P1序列(例如，如Illumina测序化学中所用的，AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.1))，但方法不限于此。可以包括用于其他类型的NGS文库制备的任何合适的引发序列。在一些实施方案中，当包括P1序列作为额外的引发序列时，它可以在第一引发序列的5'。P1额外引发序列也可以在捕获序列的5'。
模板转换寡核苷酸。如本文所用的模板转换寡核苷酸是指允许合适的逆转录酶(例如但不限于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV))的末端转移酶活性的寡核苷酸，以使用添加的脱氧胞苷核苷酸锚定模板转换寡核苷酸。在模板转换寡核苷酸和附加的脱氧胞苷之间碱基配对后，逆转录酶将模板链从捕获的RNA“转换”到模板转换寡核苷酸，并继续复制到模板转换寡核苷酸的5'末端。因此，包括转录的NA的完整5'末端，并且可以引入用于进一步扩增的额外引发序列。此外，cDNA以不依赖序列的方式转录。
BCR基因序列。B细胞受体基因序列包括几个亚区，以在释放的RNA中按5'至3'的顺序包括可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定(C)区段。恒定区恰好在polyA序列的5'。在许多测序BCR的方法中，可能期望构建获得不含poly A序列(尾部)的用于测序的扩增子的选择策略。此外，可能需要产生保留很少恒定区的扩增子。限制扩增以排除释放的核酸序列的这些区段可以允许对BCR的V、D(如果存在)和J区段进行更稳健的测序。
为了更好地理解该方法，转到图8A-8H，图8A-8H中的每一个均代表在从单个细胞获得BCR测序文库的方法中存在于不同点的单一物质或一组相关双链物质。该方法可以是多路的，使得可以处理许多单个细胞以提供可以追溯到孔板内的特定起始位点的测序文库。该位置的知识可以进一步追溯到微流体装置内的单个隔离坞，细胞已经从该微流体装置输出。因此，可以测定生物细胞产生所需产物或刺激其他细胞的所需能力，然后可追踪地输出，可追踪地加工以提供测序文库，并且从测序得到的所得基因组数据可以可识别地关联回微流体装置中的源细胞。
在图8A中，通过裂解生物细胞，释放mRNA 810。释放的mRNA 810可以包括目标基因序列805并且在其3'末端具有poly A区段815。捕获/引发寡核苷酸820可包括P1引发序列825和PolyT捕获序列(图8A中显示为T30NI，其代表30个T核苷酸的序列并且在捕获/引发寡核苷酸820的3'末端具有双核苷酸序列NI)。在一些实施方案中，PolyT捕获序列的T30NI序列中的N核苷酸可选自G、C和A(例如，可排除T核苷酸)。捕获/引发寡核苷酸可以与释放的mRNA 810的polyA序列815结合。
在图8B中，表示逆转录的初始过程，其中逆转录酶使用mRNA 810作为模板延伸捕获/引发寡核苷酸，从而将目标基因805引入转录物中。到达mRNA 810的3'末端后，逆转录酶添加几个C(此处显示为三个C)核苷酸。
在图8C中，转录物转换寡核苷酸(TSO)835存在于逆转录反应混合物中，其中TSO包括P1序列825并且还可以包括四核苷酸(N4)第一条形码802。在下面描述的实施方案中，TSO835可以是具有SEQ ID NO.3的序列的寡核苷酸。第一条形码802在测序期间可用于多路的若干实验，并且该方法不限于要求存在第一条形码802。第一条形码802不限于具有四个核苷酸，而是可以具有任何合适数量的核苷酸以使测序文库产物可识别。在一些实施方案中，第一(多路)条形码可具有约3个核苷酸至约10个核苷酸。TSO还可以包括与寡核苷酸的5'末端连接的生物素，以提高效率。
在逆转录中，TSO与mRNA 810的5'末端对齐并允许逆转录酶“转换模板”，并使用TSO的脱氧核苷酸作为模板使cDNA 830延伸超过其3'末端的三个C核苷酸，以并入TSO的前四个核苷酸条形码802(N4)和P1序列825，如图8D所示。完全延伸的cDNA产物840现在包括两端的P1引发序列，目标基因805和任选的第一条形码802(N4)。cDNA产物840还包括从捕获/引发寡核苷酸820的捕获序列并入的polyT-NI序列。
在图8E中，可以使用正向和反向P1引物845扩增cDNA 840，以扩增捕获的完整mRNA。在下面描述的实施例中，P1引物可以在其5'末端具有生物素，并且可以具有SEQ IDNO.4的序列。扩增产物(扩增的cDNA 840)的序列保留了由逆转录步骤产生的转录物的所有特征，包括5'和3'末端的P1序列，目标基因序列805和第一条形码802。将第一条形码并入目标基因序列805的5'和扩增产物840的5'末端的P1引发序列的3'。
然后进行第一聚合酶链式反应(PCR)。图8F显示了用于选择性扩增BCR区域的聚焦区域的引物排列的示意图。设计正向引物850以结合cDNA扩增产物840的5'区域的部分，其位于已用于图8E的扩增的P1序列825的3'。正向引物850还可以包括第二6核苷酸条形码804，其可以用作识别孔板的源孔的系统的一部分。虽然图8E-8H中示出了6个核苷酸的第二条形码804，但是第二条形码可以具有任何合适数量的核苷酸，并且可以具有约3个核苷酸至约10个核苷酸。反向引物855被引导结合BCR的大恒定区的亚区，靠近恒定区的5'末端，其中其跟随BCR的连接(J)区的3'末端。这确保了所有可变(V)、多样性(D)(如果存在)和连接(J)子区落入扩增子的测序部分内。这去除了T30NI序列和从捕获/引发序列820引入的P1序列825。为了确保重链和κ和λ轻链的覆盖，使用反向引物855的混合物。
对选择和截短的扩增产物860进行第二PCR扩增，如图8G所示。扩增产物860含有目标基因序列805，任选的第一(多路)条形码序列802(N4)和第二(孔板)条形码804(N6)。用于第二PCR的正向引物865结合正向引物850引入的第二(孔板)条形码804的5'的序列。反向引物870结合由反向引物855(每个反向引物855的5'部分)引入的共有序列。反向引物870还包括具有6个核苷酸(N6)的第三(孔板)条形码806。虽然图8G-8H示出了6个核苷酸的第三(孔板)条形码806，第三条形码可具有任何合适数量的核苷酸，并且可具有约3个核苷酸至约10个核苷酸。
最终扩增子880显示在图8H中，并含有第一任选的多路条形码802、目标基因序列805、第二(孔板)条形码804和第三(孔板)条形码806。可以存在额外的衔接子用于特定的测序化学。
条形码2和3用于跨输出孔板的孔使用，以明确地识别每个源孔，从而确定生成测序文库的细胞。一种经济的方法可以是使用跨孔板的孔的8X12分布的独特条形码，因此仅需要20个独特的条形码来识别每个孔。如果在测序运行中组合多个孔板样品，则可以使用第一(多路)条形码，但如果在测序运行中仅对一个孔板进行测序则不是必需的。
实施例
实施例1-筛选分泌能够结合人CD45的IgG抗体的小鼠脾细胞。
进行筛选以识别分泌与人CD45结合的IgG型抗体的小鼠脾细胞。实验设计包括以下步骤：
1.产生CD45抗原涂覆的珠子；
2.收获小鼠脾细胞；
3.将细胞加载到微流体装置中；和
4.测定抗原特异性。
表1–实施例1的试剂
Figure BDA0002104386230000671
Figure BDA0002104386230000681
产生CD45抗原涂覆的珠子。以下列方式产生CD45抗原涂覆的珠子：
将50微克无载体的CD45重悬浮于500微升PBS(pH7.2)中。
用500微升PBS冲洗Slide-A-Lyzer透析迷你杯，然后加入微量离心管中。
将50微升0.1微克/微升CD45溶液加入漂洗过的透析迷你杯中。
将170微升PBS加入到2mg HS-PEG4-生物素中，然后将4.1微升HS-PEG4-生物素加入到含有CD45抗原的透析迷你杯中。
将NGS-PEG4-生物素与CD45抗原在室温下温育1小时。
温育后，将透析迷你杯从微量离心管中取出，置于第二微量离心管中的1.3ml PBS(pH7.2)中，并在4℃下摇动培养1小时。随后将透析迷你杯转移至含有1.3ml新鲜PBS(pH7.2)的第三微量离心管中，并在4℃下摇动培养1小时。最后一步重复三次，总共进行5次1小时的温育。
将100微升生物素化的CD45溶液(～50ng/微升)移液到标记的管中。
将500微升Spherotech链霉亲和素涂覆的珠子移液到微量离心管中，在PBS(pH7.4)中洗涤3次(1000微升/洗涤)，然后以3000RCF离心5分钟。
将珠子重悬于500微升PBS(pH7.4)中，得到珠子浓度为5mg/ml。
将生物素化的CD45蛋白质溶液(50微升)与重悬的Spherotech链霉亲和素涂覆的珠子混合。将混合物在4℃温育，摇动2小时，然后在4℃下以3000RCF离心5分钟。弃去上清液，将CD45涂覆的珠子在1mL PBS(pH7.4)中洗涤3次。然后将珠子在4℃下以3000RCF离心另外5分钟。最后，将CD45珠子重悬于500微升PBS pH 7.4中并在4℃下储存。
小鼠脾细胞收获。收获用CD45免疫的小鼠的脾脏并置于DMEM培养基+10％FBS中。剪刀用于切碎脾脏。
将切碎的脾脏置于40微米的细胞过滤器中。用10ml移液管将单个细胞通过细胞过滤器洗涤。使用玻璃棒进一步分解脾脏并迫使单个细胞通过细胞过滤器，然后用10ml移液管再次通过细胞过滤器洗涤单个细胞。
用商业试剂盒裂解红细胞。
将细胞以200×G离心下(spun down)，并将原料脾细胞用10ml移液管重悬浮于DMEM培养基+10％FBS中，浓度为2e8个细胞/ml。
将细胞加载到微流体装置。微流体装置是OptoSelectTM装置(Berkeley Lights,Inc.)，配置OptoElectro Positioning(OEPTM)技术。微流体装置包括流动区域和与其流体连接的多个NanoPenTM室，室体积为约7×105立方微米。微流体装置在原型系统(BerkeleyLights，Inc.)上操作，该系统至少包括流量控制器、温度控制器、流体介质调节和泵组件、用于光激活DEP配置的光源、用于微流体装置的安装台以及相机。
将脾细胞输入微流体装置并加载到NanoPen室中，每个NanoPen室含有20-30个细胞。使100微升培养基以1微升/秒流过该装置以除去不需要的细胞。将温度设定为36℃，并以0.1微升/秒的速度灌注培养基30分钟。如图5A所示的明场成像显示了NanoPen室内细胞的位置。
抗原特异性测定。制备含有1:2500山羊抗小鼠F(ab’)2-Alexa 568的培养基。
将100微升的CD45珠子重悬浮于22微升含有1：2500稀释的山羊抗小鼠F(ab’)2-Alexa 568二抗的培养基中。
然后将重悬浮的CD45珠子以1微升/秒的速率流入微流体芯片的主通道，直到它们位于含有脾细胞的NanoPen室附近，但恰好位于其外部。然后停止流体流动。
然后将微流体芯片在明视场中成像以确定珠子的位置(未示出)。接下来，使用德克萨斯红滤光器捕获细胞和珠子的图像。每5分钟拍摄图像，共1小时，每次曝光持续1000ms，增益为5。如图5B所示，在引入珠子/标记的二抗混合物后5分钟时间点成像显示荧光信号在一些坞内的细胞部位变得明显。细胞标记表明细胞表面存在IgG。在该时间点观察到珠子的微弱标记。
结果。在珠子/抗体混合物引入后20分钟的时间点观察到阳性信号在珠子上显示，反映了IgG-同种型抗体扩散离开某些坞并扩散到微流体装置的主通道中的扩散，在主通道中它们能够结合CD45涂覆的珠子。抗CD45抗体与珠子的结合允许第二山羊抗小鼠IgG-568与珠子结合并产生可检测的信号。参见图5C，白色箭头。
使用本发明的方法，可以将与阳性信号相关的每组脾细胞分离并作为单个细胞移入新的坞中并重新测定。以这种方式，可以检测和分离表达抗CD45IgG抗体的单个细胞。
实施例2：微流体装置中记忆B细胞的活化和筛选
用于筛选微流体装置中的记忆B细胞的一般方法在图6A中概述。上述方法聚焦于人记忆B细胞，但该方法可用于筛选来自其他动物的B细胞。
收获记忆B细胞。将冷冻的人外周血单核细胞(PBMC)解冻并与补充有10％FBS(Seradigm)的6X体积的RPMI 1640(Gibco)混合，计数，并以500g离心5分钟。吸去上清液，在FACS缓冲液(PBS，2％BSA，1mM EDTA)中将细胞沉淀重悬浮至5×107个细胞/mL的浓度。
接下来，使用EasySep Human B cell Enrichment Kit(EasySep，#19054)进行B细胞富集。每mL人PBMC加入50微升B细胞富集混合物，并将所得混合物在室温下温育10分钟。然后每mL人PBMC加入75微升磁性颗粒，将混合物充分混合并在室温下温育10分钟。通过加入FACS缓冲液使约1.1uL体积的PBMC细胞悬浮液达到2.4mL，然后通过上下移液充分混合。然后将含有PBMC悬浮液的管置于EasySep磁体(无盖)中并温育5分钟。在将管保持在EasySep磁体中的同时，将富集的B细胞悬浮液倒入新的干净管中。进行富集的B细胞悬浮液的细胞计数，之后将细胞以300g离心5分钟。吸出上清液。
将富集的B细胞沉淀在含有抗CD27抗体的FACS缓冲液中重悬浮至5×107个细胞/mL的浓度，然后在黑暗中于4℃温育20分钟。温育后，将细胞用3mL FACS缓冲液洗涤2次，并以300g离心悬浮液5分钟。将最终富集的B细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，至浓度为5×107个细胞/mL，然后通过单细胞过滤器，移液管尖端压靠(并垂直于)过滤器的网孔。将过滤的细胞悬浮液保持在冰上，直至FACS分选。使用FACS Aria仪器，将CD27+B细胞分选到B细胞活化/培养基(RPMI 1640(Gibco)、10％FBS(Seradigm)、2ug/mL CpG(Invivogen)、1ug/mL IL-2(Peprotek)、5ng/mL IL-4(Peprotek)、10ng/mL IL-6(Peprotek)、10ng/mL IL-21(Peprotek)和10ng/mL BAFF(Peprotek))。
将分离的记忆B细胞调节至2×106个细胞/mL的浓度，然后在37℃温育直至输入微流体装置，这尽可能快地进行。
微流体装置的准备和记忆B细胞的输入。该微流体装置是OptoSelectTM装置(Berkeley Lights，Inc.)，配置有OptoElectro Positioning(OEPTM)技术，具有条件化的内表面，其包括一层共价连接的聚乙二醇(PEG)聚合物。微流体装置包括具有多个微流体通道的流动区域和与每个微流体通道流体连接的多个隔离坞(或NanoPenTM室)，隔离坞的体积为约5×105立方微米。微流体装置在Beacon平台(Berkeley Lights，Inc.)或原型Alpha平台(Berkeley Lights，Inc.)上操作，所述平台包括流量控制器、温度控制器、流体介质调节和泵组件、用于光激活DEP配置的光源、微流体装置的安装台和相机。
使250微升100％二氧化碳以12微升/秒的速率流入微流体装置。接着是250微升含有1000ml Iscove改性Dulbecco培养基(ATCC)、200ml胎牛血清(ATCC)、10ml pen-strep(Life Technologies)和10mL Pluronic F-127(Life Technologies)的引发培养基。然后引入含有RPMI 1640(Gibco)的B细胞培养基，该RPMI 1640(Gibco)补充有10％FBS(Seradigm)、1X Pen-Strep(Gibco)和1X卡那霉素硫酸盐(Gibco)。
接着将如上制备的分离的记忆B细胞悬浮液通过使悬浮液流入入口并在记忆B细胞位于流动区域/微流体通道内时停止流动而导入微流体装置中。然后，将记忆B细胞加载到隔离坞中，目标是每个坞一个B细胞。使用光激活DEP力(OEP技术)将记忆B细胞从流动区域/微流体通道移动到隔离坞的分离区域中。操作OEP的参数包括在微流体装置上施加AC电位(电压3.5V，频率2MHz)，使用结构光形成捕获单个细胞的光阱(如图6B所示)，并以8微米/秒移动光阱。在进入坞后仍然在流动区域/微流体通道中的细胞从微流体装置中冲洗掉。
记忆B细胞活化。将涂覆有蛋白A(Spherotech)的珠子与辐照的Jurkat D1.1饲养细胞以约1:1的比例混合。然后使珠子/饲养细胞混合物流入微流体装置，并将饲养细胞和珠子批量加载到含有记忆B细胞的每个隔离坞中。通过在端部倾斜微流体装置并允许重力将细胞和珠子向下拉入隔离坞来实现批量加载。珠子/饲养细胞混合物以约1.5×107个饲养细胞和珠子/mL的浓度流入微流体装置，并且以这种方式大量装载的隔离坞接收预期平均每坞约10个饲养细胞和约10颗珠子。
然后将微流体装置移动至培养站(culture station)，并将B细胞活化/培养基(上述)通过微流体装置的流动路径灌注四(4)天。微流体装置在端部位置保持倾斜，同时保持在培养站上。灌注方法如下：以0.02微升/秒灌注B细胞活化/培养基100秒；停止流动500秒；以2微升/秒灌注B细胞活化/培养基64秒；并重复。
测定活化的记忆B细胞。培养/活化4天后，将微流体装置从培养站中取出并返回Beacon/Alpha系统，随后进行多路测定以检测IgG分泌和抗原特异性。图6C中所示的多路测定包括抗人IgG抗体涂覆的捕获珠子(Spherotech)、抗人IgG-Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen)和使用Alexa Fluor 647羧酸酸琥珀酰亚胺酯标记的目标抗原。将捕获珠子、二抗和标记的目标抗原在B细胞活化/培养基中混合在一起，并流入微流体装置的流动区域/微流体通道。停止流动，并使用适当的滤光器定期拍摄隔离坞的图像10至25分钟，以使荧光标记可视化。分泌与目标抗原结合的抗体的记忆B细胞将诱导标记的目标抗原与IgG抗体涂覆的捕获珠子之间的结合。结果，荧光标记的捕获珠子的“羽流(plume)”将出现在流动区域/微流体通道和记忆B细胞所在的隔离坞之间的开口处。图6D显示记忆B细胞的典型测定结果。
输出和进一步加工。被识别为分泌与目标抗原结合的抗体的记忆B细胞接下来使用DEP力(使用上述OEP参数)一次打开一个坞，并通过使输出介质(具有Ca2+和Mg2+的DPBS(Lonza)、5mg/mL BSA(Sigma)和1:100PluronicTM F-127(Thermo Fisher))流过微流体装置的流动路径从微流体装置输出到96孔板的孔中。输出后，裂解记忆B细胞，将编码重链和轻链抗体序列的转录物逆转录成cDNA并测序。
结果：使用与前述方案基本相同的方案，对于人记忆B细胞，B细胞活化率(如通过检测IgG分泌测量的)已达到约12％。非人哺乳动物记忆B细胞的细胞活化率已达到高达40％。表达结合目标抗原的抗体的活化记忆B细胞的检出率取决于目标抗原，但通常为约1％或更低。在通过这类筛选方案测试从人记忆B细胞获得的公认Ag+抗体的相关性的一个实验中，从微流体装置输出一组被识别为分泌Ag结合抗体的20个记忆B细胞，并确定它们的抗体重链和轻链序列。在HEK 393T细胞中重新表达并用芯片上测定中使用的目标抗原进行ELISA分析后，20个抗体中的16个(或80％)在ELISA测定中检测到目标抗原。这证实了根据本文公开的方法活化和筛选记忆B细胞的相关性。
变化。前述方法可以以多种方式变化，并且仍然实现直接筛选记忆B细胞的目标。这些变化包括：
1.筛选从人以外的动物分离的记忆B细胞，包括其他哺乳动物物种，如啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠)、兔、雪貂、家畜(如山羊、绵羊、猪、马、奶牛)、美洲驼、骆驼，和鸟类，如鸡和火鸡。
2.用于使记忆B细胞进出坞的OEP操作参数可以变化。例如，微流体装置上的AC电位可以设定为约2至约5伏，频率为约1至约3MHz。具体实例包括(i)约2.5V的电压和约3MHz的频率，和(ii)约4.5V的电压和约1MHz的频率。另外，结构光(或光笼)移动的速度可在约5至约10微米/秒之间变化。
3.如上所述，微流体装置保持在培养台上，芯片在端部倾斜。或者，微流体装置可以在标准位置放回到Beacon/Alpha系统上(即，微流体装置基本上平放)。然后根据以下方案将记忆B细胞培养/活化培养基灌注通过微流体装置的流动区域：以0.01微升/秒灌注B细胞培养/活化培养基，持续2小时；以2微升/秒灌注B细胞培养/活化培养基，持续64秒；并重复。
4.可以进一步多路进行该测定以包括第二目标抗原或甚至第二和第三目标抗原。参见例如图6C。以这种方式，可以同时筛选记忆B细胞的与同一靶蛋白/分子上的不同表位结合的抗体、对靶蛋白/分子表现出不同水平的跨物种反应性的抗体，或简单地与完全不同的目标抗原结合的抗体。此外，使用第二和/或第三目标抗原允许高通量筛选。
5.微流体装置中的隔离坞的尺寸可以增加到例如约1.1×106立方微米。通常，坞的体积将为约5×106立方微米或更小(例如，约4×106立方微米、约3×106立方微米、约2.5×106立方微米、约2×106立方微米、约1.5×106立方微米或更小)。较大的尺寸可用于最初测定记忆B细胞的多克隆组，但较大的尺寸也延迟多路测定并且可能潜在地负面影响记忆B细胞的活化和生长。
6.该测定可以多克隆测定开始，然后转变为单克隆测定。在该方法中，隔离坞最初加载有多个记忆B细胞(例如，2到10个或4到10个)。当采用这种方法时，必须进一步分析在初始测定中显示为Ag+的隔离坞，以确定隔离坞中哪个记忆B细胞产生该Ag+抗体。为此，将Ag-坞中的细胞打开并输出(例如，通过使输出介质流过流动区域/微流体通道到达废弃管)。接下来，将Ag+坞中的细胞打开，并将单个记忆B细胞重新装入位于靠近或接近微流体装置上的源坞的空坞。然后重复Ag+坞的多路测定，并将位于任何在重复测定中识别为Ag+坞中的记忆B细胞输出用于进一步加工。这种更高通量的多克隆至单克隆方法将图6E所示的额外步骤添加到图6A所示的方法。
实施例3：在微流体装置中筛选浆细胞
在图7A中概述了用于在微流体装置中筛选浆细胞的一般方法。前述方法聚焦于人浆细胞，但该方法可用于筛选来自其他动物的浆细胞。
收获浆细胞。将冷冻人骨髓(BM)细胞在37℃水浴中快速解冻，然后滴加到5mL预热(37℃)的浆细胞培养基(Plasma Cell Culture Medium)(RPMI1640(Gibco)、10％FCS(Hyclone)、1X非必需氨基酸(NEAA)溶液(Gibco)、1X丙酮酸钠(Gibco)、50uMβ-巯基乙醇(Gibco)和1X pen-strep(Gibco))，其补充有1X DNA酶(
Figure BDA0002104386230000751
Nuclease1000X储备液，含有25,000U/mL，Millipore)。将得到的混合物以300g离心10分钟，细胞沉淀用FACS缓冲液(PBS，2％BSA，1mM EDTA)洗涤2次。
将在FACS缓冲液中洗涤后获得的细胞沉淀在含有抗CD138抗体的FACS缓冲液中重悬浮至1×107个细胞/mL的浓度，然后在黑暗中于4℃温育20分钟。温育后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤2次，并重悬于FACS缓冲液中，至浓度为1×107个细胞/mL。将细胞悬浮液保持在冰上直至FACS分选。使用FACS Aria仪器，将CD138+浆细胞分选到补充有40ug/mL IL-6(R&DSystems)的浆细胞培养基(上述)中。
将分离的浆细胞调节至2×106个细胞/mL的浓度，然后在37℃温育直至输入微流体装置，这尽可能快地进行。
微流体装置的准备和浆细胞的输入。该微流体装置是OptoSelectTM装置(BerkeleyLights，Inc.)，配置有OptoElectro Positioning(OEPTM)技术，具有条件化的内表面，包括一层共价连接的聚乙二醇(PEG)聚合物。微流体装置包括具有多个微流体通道的流动区域和与每个微流体通道流体连接的多个隔离坞(或NanoPenTM室)，隔离坞的体积为约5×105立方微米。微流体装置在Beacon平台(Berkeley Lights，Inc.)或原型Alpha平台(BerkeleyLights，Inc.)上操作，所述平台包括流量控制器、温度控制器、流体介质调节和泵组件、用于光激活DEP配置的光源、微流体装置的安装台和相机。
使250微升100％二氧化碳以12微升/秒的速率流入微流体装置。接着是250微升含有1000ml Iscove改性Dulbecco培养基(ATCC)、200ml胎牛血清(ATCC)、10ml pen-strep(Life Technologies)和10mL Pluronic F-127(Life Technologies)的引发培养基。然后引入浆细胞培养基(上述)，其补充有40ug/mL IL-6(R&D Systems)。
接着将如上制备的分离浆细胞悬浮液通过使悬浮液流入入口并在浆细胞位于流动区域/微流体通道内时停止流动而导入微流体装置中。然后，将浆细胞加载到隔离坞中，目标是每个坞一个浆细胞。使用光激活DEP力(OEP技术)将浆细胞从流动区域/微流体通道移动到隔离坞的分离区域中。操作OEP的参数包括在微流体装置上施加AC电位(电压3.5V，频率2MHz)，使用结构光形成捕获单个细胞的光阱(与图6B所示类似)，并以8微米/秒移动光阱。在进入坞后仍然在流动区域/微流体通道中的细胞从微流体装置中冲洗掉。
测定浆细胞。在进入坞之后，立即测定浆细胞以检测IgG分泌和抗原特异性。图6C中所示的多路测定包括抗人IgG抗体涂覆的捕获珠子(Spherotech)、抗人IgG-Alexa Fluor488二抗(Invitrogen)和使用Alexa Fluor 647羧酸酸琥珀酰亚胺酯标记的目标抗原。将捕获珠子、第二抗体和标记的目标抗原在补充有40ug/mL IL-6(R&D Systems)的浆细胞培养基(上述)中混合在一起，并流入微流体装置的流动区域/微流体通道。停止流动，并使用适当的滤光器定期拍摄隔离坞的图像10至25分钟，以使荧光标记可视化。分泌与目标抗原结合的抗体的浆细胞将诱导标记的目标抗原与IgG抗体涂覆的捕获珠子之间的结合。结果，荧光标记的捕获珠子的“羽流(plume)”将出现在流动区域/微流体通道和浆细胞所在的隔离坞之间的开口处。图7B显示了浆细胞的典型测定结果，左图为明场图像，中图为抗人IgG二抗的荧光图像，右图为标记的目标抗原的荧光图像。
输出和进一步加工。被识别为分泌与目标抗原结合的抗体的浆细胞接下来使用DEP力(使用上述OEP参数)一次打开一个坞，并通过使输出介质(具有Ca2+和Mg2+的DPBS(Lonza)、5mg/mL BSA(Sigma)和1:100PluronicTM F-127(Thermo Fisher))流过微流体装置的流动路径从微流体装置输出到96孔板的孔中。输出后，裂解浆细胞，将编码重链和轻链抗体序列的转录物逆转录成cDNA并测序。
结果：上述方案在不到一天的时间内完成。使用与前述基本相同的方案，表达与目标抗原结合的抗体的浆细胞的检出率(其依赖于目标抗原)通常为约1％或更低，并且在一项研究中，通过这样的方案从浆细胞获得的公认Ag+抗体当以高达82％的比率重新表达时，表现出Ag特异性结合。
变化。前述方法可以以多种方式变化，并且仍然实现直接筛选浆细胞的目标。这些变化包括：
1.筛选从人以外的动物分离的浆细胞，包括其他哺乳动物物种，如啮齿动物(如小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠)、兔、雪貂、家畜(如山羊、绵羊、猪、马、奶牛)、美洲驼、骆驼，和鸟类，如鸡和火鸡。
2.可以在FACS分离浆细胞之前进行B细胞富集，例如，使用EasySep Human B cellEnrichment Kit(EasySep，#19054)。
3.用于使浆细胞进出坞的OEP操作参数可以变化。例如，微流体装置上的AC电位可以设定为约2至约5伏，频率为约1至约3MHz。具体实例包括(i)约3.5V的电压和约2MHz的频率，和(ii)约4.5V的电压和约1MHz的频率。另外，结构光(或光笼)移动的速度可在约5至约10微米/秒之间变化。
4.加载浆细胞的隔离坞的尺寸可以不同。例如，坞的体积可以为约1.1×106立方微米。通常，坞的体积将为约5×106立方微米或更小(例如，约4×106立方微米、约3×106立方微米、约2.5×106立方微米、约2×106立方微米、约1.5×106立方微米或更小)。通过减小隔离坞的尺寸，可以更快速地进行多路测定，从而避免延长的筛选期，在此期间浆细胞可以经历细胞死亡。
5.除了输出表达Ag+抗体的浆细胞，可以在条形码化珠子的存在下在隔离坞内裂解浆细胞，所述条形码化珠子设计用于捕获由裂解的细胞释放的mRNA。然后可以将捕获的mRNA逆转录成与条形码化珠子连接的cDNA文库，并且可以输出条形码化珠子用于随后的芯片外cDNA文库测序。芯片上细胞裂解、mRNA捕获和cDNA文库产生的方法已描述于例如2017年9月29日提交的PCT国际申请号PCT/US17/54628中，其全部内容通过引用并入本文。
实施例4：表达抗体的B淋巴细胞的单细胞输出和针对B细胞受体区域的测序文库 的产生
表2.本实验中使用的引物。所有引物均以10微摩尔浓度提供。
Figure BDA0002104386230000781
细胞：OKT3细胞(一种鼠骨髓瘤杂交瘤细胞系)从ATCC获得(
Figure BDA0002104386230000782
Cat.#CRL-8001TM)。以悬浮细胞系提供细胞。通过将约1×105至约2×105个活细胞/mL接种并在37℃下温育来维持培养物，使用含5％二氧化碳的空气作为气体环境。每2-3天分瓶细胞。对OKT3细胞数和活力计数，并将细胞密度调节至1×106/ml，以加载到微流体装置中。
输出板：96孔全裙板(full skirted plate，VWR Cat.#95041-436)用于细胞输出。通过分配10微升矿物油(Sigma Cat.#M5904)，然后分配5微升2X TCL缓冲液(Qiagen Cat.#1070498)来制备每个板。(也可以适当使用其他裂解缓冲液，例如单细胞裂解试剂盒(Single Cell Lysis Kit)，Ambion Cat.#4458235或Clontech裂解缓冲液，Cat.#635013)。将输出板在室温下以200g离心1分钟并在室温下储存直至使用。
输出缓冲液：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)+钙+镁(1000mL，Lonza Cat.#17-513F)；牛血清白蛋白(BSA)(粉末，5g，Fisher Scientific Cat.#BP9706-100)；PluronicF-127(10ml，Life Technologies Cat.#50-310-494)；和重组核糖核酸酶抑制剂(RNaseOUT)(Life Technologies Cat.#107777019)，终浓度为1微升/ml。输出缓冲液在使用前用0.22微米过滤装置(VWR Cat.#73520-985)过滤。
细胞输出和裂解：使OKT3细胞(可以使用任何种类的原代B细胞)流入微流体装置并使用系统的OptoElectro Positioning(OEP)功能将其引入NanoPen室，以提供每个NanoPen室一个细胞的最终分布。进行如实施例1中所述的IgG测定(也可使用抗原特异性测定)。将识别出具有目标IgG表达(和任选的抗原特异性抗体表达)的细胞分别以5微升输出体积每孔一个细胞输出到96孔输出板中。使用OEP力的混合物进行输出以将选定的细胞输出其已经存在其中的NanoPen室，然后在流动区域/微流体通道中的培养基流动以5微升体积单独输出每个选择的细胞。输出孔板在输出后立即在4℃以200g离心下，持续5分钟。将板在-80℃冷冻直至进行RNA分离和cDNA合成。在这些条件下，孔板适当地保持至少一个月。在某些情况下，可以执行过夜存储或存储长达一周的时间。
RNA分离。将单细胞输出板在冰上解冻15分钟，然后升至室温。使RNAClean XPSPRI珠子(Beckman Coulter#A63987)达到室温，并向每个孔中加入10微升珠子混合物(1X体积)(与标准1.8x至2.2x相比，1x体积SPRI珠子显示更高的RNA回收率)。
将裂解物和珠子混合物在室温下温育15分钟。这种延长的温育期提供了释放的RNA的改善的结合。随后将板转移到96孔板磁体(MagWellTM磁性分离器(MagneticSeparator)96，Cat.#57624)上并温育5分钟。小心地除去上清液，并通过加入100微升80％乙醇(Sigma Cat.#E7023，新鲜制备)进行乙醇洗涤。约30秒后，吸出乙醇并重复乙醇洗涤。最后一次抽吸后，将板从96孔板磁体中取出，将珠子干燥5分钟。
cDNA合成。将板转移至4℃，将珠子重悬浮于4ul“RT混合物1”中：含有0.8微升无RNA酶水(Ambion Cat no AM9937)；1微升1:5M ERCC对照RNA(ThermoFisher ScientificCat.#4456740)；1微升dNTP(各10mM，NEB，#N0447L)；1微升生物素-dTVI RNA捕获/引发寡核苷酸(SEQ ID NO.2)；和0.2微升RNaseOUT(4U/微升，Life Technologies Cat.#107777-019)。生物素-dTVI RNA捕获/引发寡核苷酸的捕获序列的3'肌苷提供与释放的RNA的增加的结合，因为肌苷可以结合任何天然核苷酸。具有3'肌苷的捕获序列可以比包括最终“N”核苷酸的捕获序列更好地捕获释放的RNA，所述捕获序列可以仅在25％的时间结合mRNA。捕获/引发序列捕获的示意图如图8A所示，如上所述。ERCC RNA对照提供了内部RT对照，并且还提供了提高逆转录效率的载体RNA。将板在72℃温育5分钟并立即转移至4℃。向每个孔加入4微升“RT混合物2”，其含有1微升甜菜碱(5M，Sigma Cat.#B030075VL)；1.5微升5X RT混合物(Thermo，#EP0753)、0.5微升生物素化条形码化-模板转换寡核苷酸(biot_条形码化TSO；SEQ ID NO.3)、0.5微升120mM MgCl2(125mM，Life Technologies Cat.#AM9530G)、0.4微升RNase OUT和0.1微升Maxima RNaseH-逆转录酶(200U/微升，Thermo Fisher Cat.#EP0753)。在添加“RT混合物2”之后，在42℃下进行逆转录90分钟，然后进行10个循环：50℃，2分钟/42℃，2分钟。最后一个热循环之后是在75℃下热灭活15分钟。biot_条形码化TSO的四核苷酸条形码“NNNN”为多路输出板的潜在多路测序实验提供了内部条形码化，并且不是该方法的必需特征。初始链延伸的示意图显示在图8B中，并且TSO关联显示在图8c中，并且逆转录的完整转录产物显示在图8D中。
完整mRNA扩增。cDNA合成后，输出板以200g离心5分钟，并加入含有12.5微升2XKapa Hi Fi HotStart ReadyMix(Roche Cat.#KK2602)、1微升P1引物(biot_P1,SEQ IDNO.4)和3.5微升无核苷酸水(Ambion Cat.#AM9937)的17微升PCR混合物，并在98℃下进行PCR 3分钟，然后进行20个以下循环：98℃15秒，65℃30秒，72℃5分钟；并在72℃进行5分钟的最终延伸。最终延长期足够长，以使聚合酶扩增长cDNA分子(大于2kb)。该扩增的示意图显示在图8E中。
PCR纯化。将25微升(1x体积)DNAClean SPRI珠子(Beckman Coulter，Cat.#A62881)加入到每个孔中并充分混合，去除引物二聚体和短的降解的RNA产物，其可污染下游扩增。将混合物在室温下温育10分钟。温育后，将板置于孔板磁体上5分钟。小心地除去上清液，通过加入100微升80％乙醇(新鲜制备)进行乙醇洗涤。约30秒后，吸出乙醇。重复乙醇洗涤程序一次。在最终抽吸后，将输出孔板从孔板磁体中取出并将珠子干燥5分钟。用15微升无核酸酶的H2O从干燥的珠子上洗脱DNA。图9A显示了产物的BioAnalyzer电泳图迹线，其显示了全长cDNA的预期平均长度约为1800bp的预期分布。在进行扩增和纯化后，估计cDNA的典型量约为2ng至约20ng。
BCR扩增和条形码化。单个细胞的B细胞受体(BCR)扩增和条形码化在2步聚合酶链式反应(PCR)中进行。
PCR 1。在第一次PCR中，正向引物(FP1，SEQ ID NO.5)被设计为与从生物条形码化TSO引入的P1序列的3'末端杂交，从而消除了在上述完整RNA扩增步骤中引入的P1序列。反向引物(RP1，SEQ ID NO.6、7、8)结合B细胞受体基因区段的恒定区，其靠近重链和轻链的连接(J)基因区段。PCR 1的示意图显示在图8F中。正向引物含有12个不同的6核苷酸条形码(NNNNNN)，横跨平板的12列。因此，PCR 1从完整RNA扩增产物中选择含有BCR的RNA序列，并进一步选择BCR的聚焦于BCR的可变区段、连接区段和多样性区段的区域。该选择性扩增的扩增产物(显示为图8F的扩增产物860)进一步不含polyA/polyT捕获序列，也不含BCR的大部分恒定区，两者都不提供目标数据。
PCR 1在10微升反应中进行，该反应含有1微升扩增的转录组、5微升2X Kapa HiFi HotStart ReadyMix、0.1微升正向条形码化引物(FP1)、0.2微升反向重链恒定引物(鼠Hc的RP 1，SEQ ID NO.6)、0.1微升轻链恒定引物(其为鼠kc的RP1和鼠λc的RP1的1:1混合物(SEQ.ID NO.6和7))和3.6微升无核酸酶水。循环条件：98℃3分钟；然后进行5个以下循环：98℃20秒，70℃45秒，72℃45秒；然后进行10个以下循环：98℃20秒，68℃45秒，72℃45秒；接着进行10个以下循环：98℃20秒，65℃45秒，72℃45秒；最后，在72℃下延伸5分钟。
PCR 2。在第二PCR中，单个正向引物(FP2，SEQ ID NO.9)与条形码化FP1结合，并且跨板的8个行使用8个条形码化(NNNNNN)反向引物(RP2，SEQ ID NO.10)。该策略允许使用仅20个条形码就对整个96孔板中的每个孔具有唯一条形码。多个板可以与从cDNA合成中使用的biot_条形码化TSO并入的内部板条形码组合。PCR 2的示意图显示在图8G中。最终产物扩增子880的示意图显示在图8H中。
使用PCR 1产物作为模板(例如，图8G的产物860)进行PCR 2。进行10微升反应，其含有1微升PCR 1产物、5微升2X Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix、0.1微升正向引物FP2、0.1微升反向条形码化引物RP2和3.8微升无核酸酶水。图9B显示了通过该方法提供的单个细胞扩增子的凝胶电泳结果。箭头指向参照尺寸梯度(泳道M)上的带，其代表500bp。在泳道1中，对重链(He)扩增的单个细胞，以及在泳道2中，对轻链Kc扩增的单个细胞各自显示每个扩增产物的适当长度的条带。循环条件：PCR在98℃下进行3分钟；然后进行5个以下循环：98℃20秒，68℃45秒，72℃45秒；然后进行15个以下循环，98℃20秒，65℃45秒，72℃45秒；最后，在72℃下延伸5分钟。
扩增子合并、纯化和测序。合并扩增子，将1x体积DNAClean SPRI珠子(BeckmanCoulter，Cat.#A62881)加入每个孔中并充分混合。将混合物在室温下温育10分钟。温育后，将板置于孔板磁体上5分钟。小心地除去上清液，通过加入100微升80％乙醇(新鲜制备)进行乙醇洗涤。约30秒后，吸出乙醇并再次重复乙醇洗涤。最后一次抽吸后，将板从磁体上取下，将珠子干燥5分钟。用15μl无核酸酶水从干燥的珠子上洗脱DNA。
虽然该实验适用于Illumina TruSeq，但是可以替代地使用其他衔接子并且可以提供适合于任何其他下一代测序(NGS)仪器的文库，或者可以替代地扩增以适合于Sanger测序。
或者，当来自孔板的各个孔的扩增子未合并时，在两轮PCR和纯化后在QubitTM上进行定量显示每孔产生约25ng至约90ng的扩增产物。如上所述，这足以进行测序。
在图10A-C中，显示了凝胶电泳的结果，证实了检测特定扩增产物的能力。在该实验中，输出19个单个OKT3细胞，并将如上制备的完整RNA扩增产物分成三部分。使用上述引物和方法，分别对重链Hc、轻链κKc和轻链λλc扩增三个部分中的每一个。在图10A中，显示重链从所有19个单个细胞中扩增(通过用Qubit分析确认微弱带)。在图10B和10C中，轻链κ(图7B)或轻链λ(图7C)显示每个细胞具有κ或λ，而不是两者。例如，泳道8、12、13、14具有λ轻链而不是κ，而泳道9、10、11具有κ轻链而不具有λ。凝胶左边缘的箭头指向500bp的尺寸梯度中的带，这确认了预期产物的大小。
选择实施方案的列举
1.一种检测表达特异性结合目标抗原的抗体的B细胞淋巴细胞的方法，该方法包括：将包含B细胞淋巴细胞的样品引入微流体装置，该微流体装置包括：具有流动区域和隔离坞的外壳，其中所述隔离坞包括具有单个开口的分离区域和连接区域，所述连接区域在所述分离区域和所述流动区域之间提供流体连接，并且其中支持坞的分离区域是所述微流体装置的未扫过区域；将B细胞淋巴细胞从样品加载到隔离坞的分离区域；将目标抗原引入外壳的流动区域，使得目标抗原靠近B细胞淋巴细胞；并且，监测目标抗原与B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合。
2.实施方案1所述的方法，其中隔离坞的分离区域包括至少一个条件化的表面。在一些实施方案中，至少一个条件化的表面可包括多个条件化的表面。
3.实施方案2所述的方法，其中条件化的表面基本上不与B细胞淋巴细胞反应。
4.实施方案2或3所述的方法，其中所述至少一个条件化的表面(或所述多个条件化的表面中的每一个)包含共价连接的亲水性分子层。
5.实施方案4所述的方法，其中亲水性分子包含含聚乙二醇(PEG)的聚合物。
6.实施方案1至5中任一项所述的方法，其中微流体装置的外壳还包括介电电泳(DEP)配置。
7.实施方案1至6中任一项所述的方法，其中微流体装置的外壳还包括基部、微流体管路结构和盖，它们一起界定微流体管路，并且其中所述微流体管路包括流动区域和隔离坞。
8.实施方案7所述的方法，其中：所述基部包括第一电极；所述盖包括第二电极；所述基部或所述盖包括电极活化衬底，其中所述电极活化衬底具有包括多个DEP电极区域的表面，并且其中所述电极活化衬底的表面提供流动区域的内表面。
9.实施方案1至8中任一项所述的方法，其中连接区域的宽度Wcon为约20微米至约60微米。
10.实施方案1至9中任一项所述的方法，其中连接区域具有长度Lcon，并且其中连接区域的长度Lcon与连接区域的宽度Wcon的比具有至少1.5的值。
11.实施方案9或10所述的方法，其中所述分离区域的宽度Wiso大于连接区域的宽度Wcon。
12.实施方案9至11中任一项所述的方法，其中所述分离区域的宽度Wiso为约50微米至约250微米。
13.实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述隔离坞包含约0.5nL至约2.5nL的体积。
14.实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述隔离坞的分离区域包括涂覆有涂层材料的至少一个表面(例如，多个表面)。
15.实施方案14所述的方法，其中所述涂层材料包含基本上与B细胞淋巴细胞不反应的亲水性分子。
16.实施方案14或15所述的方法，其中所述涂层材料包含含聚乙二醇(PEG)的聚合物(例如，在一些实施方案中，含PEG的聚合物包含PEG-PPG嵌段共聚物)。
17.实施方案1至16中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品是外周血、脾活检、骨髓活检、淋巴结活检或肿瘤活检的样品。
18.实施方案1至16中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品是外周血样品。
19.实施方案1至16中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品是骨髓活检。
20.实施方案17或18所述的方法，其中B细胞淋巴细胞是记忆B细胞。
21.实施方案17或19所述的方法，其中B细胞淋巴细胞是浆B细胞。
22.实施方案1至21中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品获自哺乳动物或禽类动物。
23.实施方案22所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品获自人、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、美洲驼、鸡、雪貂、猪、马、牛或火鸡。
24.实施方案22或23所述的方法，其中所述哺乳动物已针对目标抗原进行免疫。
25.实施方案22或23所述的方法，其中所述哺乳动物已暴露于或感染与目标抗原相关的病原体。
26.实施方案22或23所述的方法，其中所述哺乳动物患有癌症并且所述癌症与目标抗原相关。
27.实施方案22或23所述的方法，其中所述哺乳动物患有自身免疫疾病，并且所述自身免疫疾病与目标抗原相关。
28.实施方案1至27中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品已经耗尽除B细胞淋巴细胞之外的细胞类型。
29.实施方案1至28中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品已经耗尽表达IgM抗体、IgA抗体、IgD抗体或其任何组合的B细胞淋巴细胞。
30.实施方案1至19和21至29中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品富含表达CD27的B细胞淋巴细胞。
31.实施方案1至20和22至29中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品富含表达CD138的B细胞淋巴细胞。
32.实施方案1至31中任一项所述的方法，其中包含B细胞淋巴细胞的样品在引入微流体装置之前已与DNA酶接触。
33.实施方案1至32中任一项所述的方法，其中将单个B细胞淋巴细胞加载到分离区域中。
34.实施方案1至32中任一项所述的方法，其中将多个B细胞淋巴细胞加载到分离区域中。
35.实施方案1至34中任一项所述的方法，还包括：使B细胞淋巴细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触。
36.实施方案35所述的方法，其中所述刺激剂包含CD40激动剂。
37.实施方案36所述的方法，其中所述CD40激动剂包含CD40L、其衍生物或抗CD40抗体，并且任选地，其中CD40激动剂与微物体(例如珠子)连接。
38.实施方案35所述的方法，其中所述刺激剂包含一种或多种CD40L+饲养细胞(例如，经照射的T细胞)或其衍生物。
39.实施方案35至38中任一项所述的方法，其中刺激剂还包含B细胞受体(BCR)-连接分子。
40.实施方案39所述的方法，其中BCR-连接分子包含蛋白A或蛋白G。
41.实施方案39或40所述的方法，其中BCR-连接分子与微物体(例如珠子)连接。
42.实施方案35所述的方法，其中使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触包括使B细胞淋巴细胞与CD40L+饲养细胞和缀合至珠子的蛋白A的混合物接触(例如，以约1:1至约1:10的比)。
43.实施方案42所述的方法，其中使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触包括将混合物加载到隔离坞的分离区域中(例如，使用重力或DEP力)。
44.实施方案35至43中任一项所述的方法，其中所述刺激剂还包含toll样受体(TLR)激动剂。
45.实施方案44所述的方法，其中所述TLR激动剂是CpG寡核苷酸。
46.实施方案35至45中任一项所述的方法，其中使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触1至10天的时间(在一些实施方案中，接触时间可以是3至5天)。
47.实施方案46所述的方法，其中B细胞淋巴细胞与刺激剂基本连续地接触1至10天的时间(在一些实施方案中，接触时间可以是3至5天)。
48.实施方案35至47中任一项所述的方法，还包括：
向B细胞淋巴细胞提供培养基，其中所述培养基包含一种或多种促进B细胞扩增和/或活化的试剂。
49.实施方案48所述的方法，其中所述培养基包含选自IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21、BAFF和April的至少一种试剂。
50.实施方案48或49所述的方法，其中所述培养基包含TLR激动剂。
51.实施方案48至50中任一项所述的方法，其中向所述B细胞淋巴细胞提供培养基1至10天的时间(在一些实施方案中，接触时间可以是3至5天)。
52.实施方案48至50中任一项所述的方法，其中与刺激剂接触和提供培养基在基本上共同延长的时间段内进行。
53.实施方案35至52中任一项所述的方法，其中在将所述B细胞淋巴细胞引入微流体装置之前，使所述B细胞淋巴细胞与所述刺激剂接触。
54.实施方案3f至53中任一项的方法，其中将所述B细胞淋巴细胞与所述刺激剂接触在将所述B细胞淋巴细胞引入所述微流体装置后进行(例如，在将所述B细胞淋巴细胞加载到所述隔离坞的所述分离区域之后)。
55.实施方案35至54中任一项所述的方法，其中在监测步骤期间使B细胞淋巴细胞与刺激剂接触。
56.实施方案6所述的方法，其中将所述B细胞淋巴细胞加载到所述隔离坞的所述分离区域中包括使用DEP力将所述B细胞淋巴细胞移动到所述分离区域中。
57.实施方案56所述的方法，其中所述B细胞淋巴细胞从所述流动区域移动到所述分离区域。
58.实施方案1至57中任一项所述的方法，其中提供目标抗原包括使包含可溶性目标抗原的溶液流入或流过所述流动区域。
59.实施方案58所述的方法，其中目标抗原与第一可检测标记(例如荧光标记)共价结合。
60.实施方案58或59所述的方法，其还包括提供包含第一抗体结合剂的微物体，其中所述第一抗体结合剂结合所述B细胞淋巴细胞表达的抗体，而不抑制目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合，并且其中监测目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合包括检测目标抗原与所述微物体的间接结合。
61.实施方案60所述的方法，其中所述第一抗体结合剂结合所述B细胞淋巴细胞表达的抗体的Fc结构域。
62.实施方案60或61所述的方法，其中微物体是珠子。
63.实施方案60至62中任一项所述的方法，其中提供微物体包括使包含微物体的溶液流入流动区域并在所述微物体位于所述隔离坞的附近时停止流动。
64.实施方案63所述的方法，其中提供所述微物体还包括将所述微物体装载到所述隔离坞中。
65.实施方案63或64所述的方法，其中包含微物体的溶液和包含可溶性目标抗原的溶液是同一溶液。
66.实施方案63所述的方法，其中包含微物体的溶液和包含可溶性目标抗原的溶液是不同的溶液，并且其中在提供目标抗原之前提供所述微物体。
67.实施方案60至65中任一项所述的方法，还包括：提供第二抗体结合剂，其中所述第二抗体结合剂包含第二可检测标记(例如，荧光标记)；并监测所述第二抗体结合剂与所述微物体的间接结合。
68.实施方案67所述的方法，其中所述第二抗体结合剂结合(其可任选特异性结合)IgG抗体(例如，抗IgG二抗)。
69.实施方案67或68所述的方法，其中所述第一可检测标记不同于所述第二可检测标记(并且可以差异检测)。
70.实施方案67至69中任一项所述的方法，其中提供所述第二抗体结合剂包括使包含可溶性第二抗体结合剂的溶液流入或流过流动区域。
71.实施方案70所述的方法，其中包含可溶性第二抗体结合剂的溶液和包含可溶性目标抗原的溶液是同一溶液。
72.实施方案70所述的方法，其中包含可溶性第二抗体结合剂和包含可溶性目标抗原的溶液是不同的溶液(例如，其顺序提供)。
73.实施方案1至57中任一项所述的方法，其中提供目标抗原包括提供包含目标抗原的微物体，其中微物体是细胞、脂质体、脂质纳米筏或珠子。
74.实施方案73所述的方法，还包括：在目标抗原之前或与目标抗原同时提供标记的抗体结合剂，其中监测目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合包括检测标记的抗体结合剂与目标抗原的间接结合。
75.实施方案74所述的方法，其中标记的抗体结合剂结合(其可任选特异性结合)抗-IgG抗体(例如，是抗-IgG二抗)。
76.实施方案74或75所述的方法，其中标记的抗体结合剂与荧光标记共价结合。
77.实施方案74至76中任一项所述的方法，其中标记的抗体结合剂以与目标抗原的混合物提供。
78.实施方案74至76中任一项所述的方法，其中在提供目标抗原后提供标记的抗体结合剂。
79.实施方案1至78中任一项所述的方法，其中监测目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合包括使微流体装置的全部或部分隔离坞成像。
80.实施方案79所述的方法，其中所述成像包括荧光成像。
81.实施方案79或80所述的方法，其中所述成像包括拍摄多个图像。
82.实施方案81所述的方法，其中以固定的时间间隔拍摄多个图像。
83.实施方案1至82中任一项的方法，其中所述微流体装置包括多个隔离坞，每个隔离坞均具有分离区域和连接区域，每个连接区域在分离区域和流动区域之间提供流体连接，所述方法还包括：将所述多个B细胞淋巴细胞中的一个或多个加载到所述多个隔离坞中的两个或更多个隔离坞的每一个的分离区域中；将目标抗原引入所述微流体装置中，使得目标抗原靠近加载有一个或多个B细胞淋巴细胞的两个或更多个隔离坞的每一个；并且监测目标抗原与每个加载的B细胞淋巴细胞表达的抗体的结合。
84.实施方案83所述的方法，其中将单个B细胞淋巴细胞加载到所述多个隔离坞中的两个或更多个隔离坞的每一个的分离区域中。
85.实施方案1至84中任一项所述的方法，还包括：检测目标抗原与加载的B细胞淋巴细胞或多个加载的B细胞淋巴细胞中的几个表达的抗体的结合；识别表达特异性结合目标抗原的抗体的加载的B细胞淋巴细胞或多个加载的B细胞淋巴细胞中的几个。
86.一种表征特异性结合目标抗原的抗体的方法，该方法包括：识别表达特异性结合目标抗原的抗体的B细胞淋巴细胞或其克隆群，其中根据实施方案85的方法进行识别；从所述B细胞淋巴细胞或其克隆群中分离编码免疫球蛋白重链可变区(VH)和/或免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸；并对编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸的至少一部分和/或编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸的至少一部分进行测序。
87.实施方案86所述的方法，其中对免疫球蛋白重链可变区(VH)进行测序包括：裂解识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞；逆转录从所述B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞分离的mRNA，其中mRNA编码免疫球蛋白重链可变区(VH)，由此形成VH cDNA；并对VH cDNA的至少一部分进行测序。
88.实施方案86或87所述的方法，其中对免疫球蛋白轻链可变区(VL)进行测序包括：裂解识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞；逆转录从所述B细胞淋巴细胞或其克隆群体分离的mRNA，其中mRNA编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)，由此形成VL cDNA；并对VL cDNA的至少一部分进行测序。
89.实施方案87或88所述的方法，其中逆转录所述mRNA包括使所述mRNA与捕获/引发寡核苷酸接触。
90.实施方案89所述的方法，其中所述逆转录在转录物转换寡核苷酸的存在下进行。
91.实施方案87至90中任一项所述的方法，其中识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞在裂解之前从微流体装置输出。
92.实施方案91所述的方法，其中输出识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群包括：将识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞从所述隔离坞的分离区域移动进入所述微流体装置的流动区域；并使识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞流过流动区域并流出微流体装置。
93.实施方案92所述的方法，其中从隔离坞的分离区域移动识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞包括使用DEP力捕获和移动识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群。
94.实施方案91至93中任一项所述的方法，其中识别的B细胞淋巴细胞作为单个细胞输出。
95.实施方案91至93中任一项所述的方法，其中克隆群的识别的B细胞淋巴细胞作为一组输出。
96.实施方案87或88所述的方法，其中识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞在微流体装置内裂解。
97.实施方案96所述的方法，还包括：提供一个或多个捕获珠子，所述捕获珠子紧邻识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞，其中所述一个或多个捕获珠子各自包含能够结合VH mRNA和/或VL mRNA的寡核苷酸；裂解识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群；并且允许来自裂解的B细胞淋巴细胞或来自其克隆群的裂解的B细胞淋巴细胞的VH mRNA和/或VL mRNA被一个或多个捕获珠子结合。
98.实施方案94所述的方法，其中一个或多个捕获珠子的每个捕获珠子均包含多个捕获/引发寡核苷酸。
99.实施方案97或98所述的方法，其中在裂解识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞之前提供一个或多个捕获珠子。
100.实施方案97至99中任一项所述的方法，其中将一个或多个捕获珠中的每一种均加载到包含识别的B细胞淋巴细胞或其克隆群的B细胞淋巴细胞的隔离坞中。
101.实施方案97至100中任一项所述的方法，还包括：将一个或多个捕获珠子移动到微流体装置的基本上无RNA的区域。
102.实施方案101所述的方法，其中在将一个或多个捕获珠子移动到微流体装置的基本上无RNA的区域之前，基本上无RNA的区域不包括任何B细胞淋巴细胞。
103.实施方案101或102所述的方法，其中基本上无RNA的区域位于不同于其中加载识别的B细胞淋巴细胞的隔离坞的隔离坞内。
104.实施方案97至103中任一项所述的方法，其中结合的VH mRNA和/或结合的VLmRNA在与一个或多个捕获珠结合时逆转录成VH cDNA和/或VL cDNA。
105.实施方案104所述的方法，其中结合的VH mRNA和/或结合的VL mRNA在一个或多个捕获珠子被包含在微流体装置内(例如，在隔离坞内)时被逆转录成VH cDNA和/或VLcDNA。
106.实施方案104或105所述的方法，其中通过使逆转录酶、核苷酸和适当的缓冲液流入或流过微流体装置的流动区域，将结合的VH和/或结合的VL mRNA逆转录为VH cDNA和/或VL cDNA。
107.实施方案104至106中任一项所述的方法，其中VH cDNA和/或VL cDNA从微流体装置输出，同时与一个或多个捕获珠子结合。
108.实施方案97至104中任一项所述的方法，还包括：在将VH mRNA和/或VL mRNA逆转录成VH cDNA和/或VL cDNA之前，从微流体装置输出一个或多个捕获珠子。
109.实施方案87或88所述的方法，还包括在测序之前扩增VH cDNA和/或VL cDNA。
110.实施方案109所述的方法，其中扩增包括PCR扩增。
111.实施方案109或110所述的方法，其中扩增包括增加从B细胞淋巴细胞分离的逆转录mRNA中VH cDNA和/或VL cDNA或其片段的表现。
112.实施方案111所述的方法，其中所述扩增包括：第一轮扩增，其增加从B细胞淋巴细胞分离的逆转录mRNA中VH cDNA和/或VL cDNA或其片段的表现；和第二轮扩增，其将条形码序列引入在第一轮中扩增的VH cDNA和/或VL cDNA或其片段。
113.实施方案87或88的方法，其中VH cDNA和/或VL cDNA在没有预先PCR扩增的情况下进行测序。
除了任何先前指出的修改之外，本领域技术人员可以在不脱离本说明书的精神和范围的情况下提出许多其他变型和替换安排，并且所附权利要求旨在涵盖这样的修改和安排。因此，尽管上面已经结合目前被认为是最实际和优选的方面的特定内容和细节描述了信息，但是对于本领域技术人员来说，显而易见的是，不脱离本文阐述的原理和概念的情况下可以进行许多修改，包括但不限于形式、功能、操作方式和使用。此外，如本文所用，实施例和实施方案在所有方面都仅是说明性的，不应被解释为以任何方式进行限制。还应注意，虽然本文使用术语步骤，但该术语可用于简单地引起对所述方法的不同部分的注意，并不意味着描绘方法的任何部分的起点或停止点，或以任何其他方式限制。
非正式SEQ ID NO.列表
Figure BDA0002104386230000921
Figure BDA0002104386230000931

Claims (75)

1.一种检测表达特异性结合目标抗原的抗体的B细胞淋巴细胞的方法，该方法包括：
将包含B细胞淋巴细胞的样品引入微流体装置，所述微流体装置包括：
具有流动区域和隔离坞的外壳，
其中所述隔离坞包括具有单个开口的分离区域和连接区域，所述连接区域在所述分离区域和所述流动区域之间提供流体连接，并且其中所述支持坞的分离区域是所述微流体装置的未扫过区域；
将B细胞淋巴细胞从所述样品加载到所述隔离坞的所述分离区域；
将所述目标抗原引入所述外壳的所述流动区域，使得所述目标抗原靠近所述B细胞淋巴细胞；并且，
监测所述目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合，
其中所述隔离坞的所述分离区域包括至少一个条件化的表面。
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一个条件化的表面包含共价连接的亲水分子层。
3.权利要求2所述的方法，其中所述亲水性分子包含含聚乙二醇(PEG)的聚合物。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包括介电电泳(DEP)配置。
5.权利要求4所述的方法，其中所述微流体装置的所述外壳还包括基部、微流体管路结构和盖，它们一起界定微流体管路，并且其中所述微流体管路包括所述流动区域和所述隔离坞。
6.权利要求5所述的方法，其中：
所述基部包括第一电极；
所述盖包括第二电极；并且
所述基部或所述盖包括电极活化衬底，
其中所述电极活化衬底具有包括多个DEP电极区域的表面，并且其中所述电极活化衬底的所述表面提供所述流动区域的所述内表面。
7.权利要求1所述的方法，其中所述连接区域的宽度Wcon为约20微米至约60微米。
8.权利要求1所述的方法，其中所述连接区域具有长度Lcon，并且其中所述连接区域的所述长度Lcon与所述连接区域的所述宽度Wcon的比具有至少1.5的值。
9.权利要求7或8所述的方法，其中所述分离区域的宽度Wiso大于所述连接区域的宽度Wcon。
10.权利要求9所述的方法，其中所述分离区域的宽度Wiso为约50微米至约250微米。
11.权利要求1所述的方法，其中所述隔离坞包含约0.5nL至约2.5nL的体积。
12.权利要求1所述的方法，其中所述隔离坞的所述分离区域包括涂覆有涂层材料的至少一个表面。
13.权利要求12所述的方法，其中所述涂层材料包含含聚乙二醇(PEG)的聚合物。
14.权利要求1所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品是外周血、脾活检、骨髓活检、淋巴结活检或肿瘤活检的样品。
15.权利要求14所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品是外周血样品。
16.权利要求14所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品是骨髓活检。
17.权利要求14或15所述的方法，其中所述B细胞淋巴细胞是记忆B细胞。
18.权利要求14或16所述的方法，其中所述B细胞淋巴细胞是浆B细胞。
19.权利要求1所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品获自哺乳动物或禽类动物。
20.权利要求19所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品获自人、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、兔、山羊、绵羊、美洲驼或鸡。
21.权利要求19或20所述的方法，其中所述哺乳动物已针对所述目标抗原进行免疫，其中所述哺乳动物已暴露于或感染与所述目标抗原相关的病原体，其中所述哺乳动物患有癌症并且所述癌症与所述目标抗原相关，或其中所述哺乳动物患有自身免疫疾病并且所述自身免疫疾病与所述目标抗原相关。
22.权利要求1所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品已经耗尽除B细胞淋巴细胞之外的细胞类型。
23.权利要求1或22所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品富含表达CD27的B细胞淋巴细胞。
24.权利要求1或22所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品富含表达CD138的B细胞淋巴细胞。
25.权利要求1所述的方法，其中所述包含B细胞淋巴细胞的样品在引入所述微流体装置之前已与DNA酶接触。
26.权利要求1所述的方法，其中将单个B细胞淋巴细胞加载到所述分离区域中。
27.权利要求1所述的方法，其中将多个B细胞淋巴细胞加载到所述分离区域中。
28.权利要求1所述的方法，还包括：
使所述B细胞淋巴细胞与刺激B细胞活化的刺激剂接触。
29.权利要求28所述的方法，其中所述刺激剂包含CD40激动剂。
30.权利要求29所述的方法，其中所述刺激剂包含一种或多种CD40L+饲养细胞。
31.权利要求29或30所述的方法，其中所述刺激剂还包含B细胞受体(BCR)-连接分子，其中所述BCR-连接分子包含蛋白A或蛋白G。
32.权利要求31所述的方法，其中所述BCR-连接分子与微物体连接。
33.权利要求28所述的方法，其中使所述B细胞淋巴细胞与刺激剂接触包括使所述B细胞淋巴细胞与CD40L+饲养细胞和缀合至珠子的蛋白A的混合物接触，其中使所述B细胞淋巴细胞与刺激剂接触包括将所述混合物加载到所述隔离坞的所述分离区域中。
34.权利要求29所述的方法，其中所述B细胞淋巴细胞与所述刺激剂基本连续地接触3至5天的时间。
35.权利要求29所述的方法，还包括：
向所述B细胞淋巴细胞提供培养基，其中所述培养基包含一种或多种促进B细胞扩增和/或活化的试剂。
36.权利要求35所述的方法，其中所述培养基包含IL-2、IL-4、IL-6、IL-21和BAFF或April。
37.权利要求35所述的方法，其中所述培养基包含TLR激动剂。
38.权利要求37所述的方法，其中所述TLR激动剂是CpG寡核苷酸。
39.权利要求35所述的方法，其中向所述B细胞淋巴细胞提供培养基3至5天的时间。
40.权利要求35所述的方法，其中所述与刺激剂接触和所述提供培养基在基本上共同延长的时间段内进行。
41.权利要求4所述的方法，其中将所述B细胞淋巴细胞加载到所述隔离坞的所述分离区域中包括使用DEP力将所述B细胞淋巴细胞移动到所述分离区域中。
42.权利要求41所述的方法，其中所述B细胞淋巴细胞从所述流动区域移动到所述分离区域。
43.权利要求1所述的方法，其中提供所述目标抗原包括使包含可溶性目标抗原的溶液流入或流过所述流动区域。
44.权利要求43所述的方法，其中所述目标抗原与第一可检测标记共价结合。
45.权利要求43或44所述的方法，其还包括提供包含第一抗体结合剂的微物体，其中所述第一抗体结合剂结合所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体，而不抑制目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合，并且其中监测所述目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合包括检测所述目标抗原与所述微物体的间接结合。
46.权利要求45所述的方法，其中所述第一抗体结合剂结合所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的Fc结构域。
47.权利要求45所述的方法，其中提供所述微物体包括使包含所述微物体的溶液流入所述流动区域并在所述微物体位于所述隔离坞的附近时停止流动。
48.权利要求45所述的方法，其中所述包含所述微物体的溶液和所述包含所述可溶性目标抗原的溶液是同一溶液。
49.权利要求45所述的方法，还包括：
提供第二抗体结合剂，其中所述第二抗体结合剂包含第二可检测标记；并
监测所述第二抗体结合剂与所述微物体的间接结合，
其中所述第一可检测标记不同于所述第二可检测标记。
50.权利要求49所述的方法，其中所述第二抗体结合剂与IgG抗体结合。
51.权利要求1所述的方法，其中提供所述目标抗原包括提供包含所述目标抗原的微物体，其中所述微物体是细胞、脂质体、脂质纳米筏或珠子。
52.权利要求51所述的方法，还包括：
在所述目标抗原之前或与所述目标抗原同时提供标记的抗体结合剂，
其中所述监测所述目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合包括检测所述标记的抗体结合剂与所述目标抗原的间接结合。
53.权利要求52所述的方法，其中所述标记的抗体结合剂与抗-IgG抗体结合。
54.权利要求1所述的方法，其中监测所述目标抗原与所述B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合包括使所述微流体装置的全部或部分所述隔离坞成像。
55.权利要求54所述的方法，其中所述成像包括荧光成像。
56.权利要求54所述的方法，其中所述成像包括拍摄多个图像。
57.权利要求1的方法，其中所述微流体装置包括多个所述隔离坞，每个隔离坞均具有分离区域和连接区域，每个所述连接区域均在所述分离区域和所述流动区域之间提供流体连接，所述方法还包括：
将所述多个B细胞淋巴细胞中的一个或多个加载到所述多个隔离坞中的两个或更多个隔离坞的每一个的所述分离区域中；
将所述目标抗原引入所述微流体装置中，使得所述目标抗原靠近加载有一个或多个B细胞淋巴细胞的所述两个或更多个隔离坞的每一个；并且
监测所述目标抗原与每个所述加载的B细胞淋巴细胞表达的所述抗体的结合。
58.权利要求57所述的方法，其中将单个B细胞淋巴细胞加载到所述多个隔离坞中的所述两个或更多个隔离坞的每一个的所述分离区域中。
59.权利要求57所述的方法，还包括：
检测所述目标抗原与所述加载的B细胞淋巴细胞或所述多个加载的B细胞淋巴细胞中的几个表达的所述抗体的结合；
识别表达特异性结合所述目标抗原的抗体的所述加载的B细胞淋巴细胞或所述多个加载的B细胞淋巴细胞中的所述几个。
60.一种表征特异性结合目标抗原的抗体的方法，所述方法包括：
识别表达特异性结合所述目标抗原的抗体的B细胞淋巴细胞或其克隆群，其中根据权利要求59的方法进行所述识别；
从所述B细胞淋巴细胞或其克隆群中分离编码免疫球蛋白重链可变区(VH)和/或免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸；并
对编码所述免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸的至少一部分和/或编码所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸的至少一部分进行测序。
61.权利要求60所述的方法，其中对所述免疫球蛋白重链可变区(VH)进行测序包括：
裂解所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的B细胞淋巴细胞；
逆转录从所述B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞分离的mRNA，其中所述mRNA编码所述免疫球蛋白重链可变区(VH)，由此形成VH cDNA；并
对所述VH cDNA的至少一部分进行测序。
62.权利要求60所述的方法，其中对所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)进行测序包括：
裂解所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的B细胞淋巴细胞；
逆转录从所述B细胞淋巴细胞或所述其克隆群体分离的mRNA，其中所述mRNA编码所述免疫球蛋白轻链可变区(VL)，由此形成VL cDNA；并
对所述VL cDNA的至少一部分进行测序。
63.权利要求61或62所述的方法，其中逆转录所述mRNA包括使所述mRNA与捕获/引发寡核苷酸接触。
64.权利要求63所述的方法，其中所述逆转录在转录物转换寡核苷酸的存在下进行。
65.权利要求61或62所述的方法，其中所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞在裂解之前从所述微流体装置输出。
66.权利要求65所述的方法，其中输出所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群包括：
将所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞从所述隔离坞的所述分离区域移动进入所述微流体装置的所述流动区域；并
使所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞流过所述流动区域并流出所述微流体装置。
67.权利要求66所述的方法，其中从所述隔离坞的所述分离区域移动所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞包括使用DEP力捕获和移动所述识别的B细胞淋巴细胞或所述克隆群。
68.权利要求61或62所述的方法，其中所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞在所述微流体装置内裂解。
69.权利要求68所述的方法，还包括：
提供一个或多个捕获珠子，所述捕获珠子紧邻所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群的所述B细胞淋巴细胞，其中所述一个或多个捕获珠子各自包含能够结合所述VH mRNA和/或所述VL mRNA的寡核苷酸；
裂解所述识别的B细胞淋巴细胞或所述其克隆群；并且
允许来自所述裂解的B细胞淋巴细胞或来自所述其克隆群的所述裂解的B细胞淋巴细胞的所述VH mRNA和/或所述VL mRNA被所述一个或多个捕获珠子结合。
70.权利要求69所述的方法，其中所述一个或多个捕获珠子的每个捕获珠子均包含多个捕获/引发寡核苷酸。
71.权利要求69所述的方法，其中所述结合的VH mRNA和/或所述结合的VL mRNA在与所述一个或多个捕获珠结合时逆转录成VH cDNA和/或VLcDNA。
72.权利要求71所述的方法，其中所述VH cDNA和/或VL cDNA从所述微流体装置输出，同时与所述一个或多个捕获珠子结合。
73.权利要求61或62所述的方法，还包括在所述测序之前扩增所述VHcDNA和/或所述VLcDNA。
74.权利要求73所述的方法，其中所述扩增包括增加从所述B细胞淋巴细胞分离的逆转录mRNA中VH cDNA和/或VL cDNA或其片段的表现。
75.权利要求74所述的方法，其中所述扩增包括：
第一轮扩增，其增加从所述B细胞淋巴细胞分离的逆转录mRNA中VHcDNA和/或VL cDNA或其片段的表现；和
第二轮扩增，其将条形码序列引入在第一轮中扩增的VH cDNA和/或VLcDNA或其片段。
CN201780080081.2A 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法 Active CN110799840B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210259589.1A CN114755412A (zh) 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662411690P 2016-10-23 2016-10-23
US62/411,690 2016-10-23
US201662412092P 2016-10-24 2016-10-24
US62/412,092 2016-10-24
PCT/US2017/057926 WO2018076024A2 (en) 2016-10-23 2017-10-23 Methods for screening b cell lymphocytes

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210259589.1A Division CN114755412A (zh) 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110799840A true CN110799840A (zh) 2020-02-14
CN110799840B CN110799840B (zh) 2022-03-01

Family

ID=62019336

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780080081.2A Active CN110799840B (zh) 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法
CN202210259589.1A Pending CN114755412A (zh) 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210259589.1A Pending CN114755412A (zh) 2016-10-23 2017-10-23 筛选b细胞淋巴细胞的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20200064337A1 (zh)
EP (2) EP3981785A1 (zh)
JP (2) JP7053601B2 (zh)
KR (2) KR102560201B1 (zh)
CN (2) CN110799840B (zh)
CA (1) CA3041527C (zh)
DK (1) DK3529611T3 (zh)
IL (1) IL266208B2 (zh)
SG (1) SG11201903557SA (zh)
WO (1) WO2018076024A2 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017375631B2 (en) 2016-12-12 2023-06-15 xCella Biosciences, Inc. Methods and systems for screening using microcapillary arrays
CA3061984A1 (en) 2017-06-06 2018-12-13 Zymergen Inc. A htp genomic engineering platform for improving fungal strains
CA3097071A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
CA3115808A1 (en) * 2018-10-11 2020-04-16 Berkeley Lights, Inc. Systems and methods for identification of optimized protein production and kits therefor
EP4039789A4 (en) * 2019-09-30 2023-10-04 Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd. METHOD FOR SCREENING CELLS PRODUCING SECRETIONS AND KIT FOR SCREENING CELLS PRODUCING SECRETIONS
CA3157616A1 (en) 2019-11-17 2021-05-20 Darshan THAKER Systems and methods for analyses of biological samples
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi
JP2024502234A (ja) * 2020-12-22 2024-01-18 アムジエン・インコーポレーテツド 抗ｃｄ３含有分子の拡散勾配アッセイ
EP4239333A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-06 Lonza Biologics plc Method for selecting clonal cells expressing correctly assembled multi-specific binding molecules

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132112A1 (en) * 2002-08-28 2004-07-08 Kimon Angelides Screening antibodies using an optical fiber array device capable of simultaneously performing multiple functional assays
CN1626669A (zh) * 2003-07-16 2005-06-15 Ccl控股有限公司 完全人源化抗体的制备
US20060073095A1 (en) * 2001-08-22 2006-04-06 Steven Kessler Methods for screening antibody-producing cells on heterogeneous antigen substrates
CN1781936A (zh) * 2004-12-03 2006-06-07 中国人民解放军第三军医大学 B淋巴细胞刺激因子抑制肽及其筛选、制备方法
CN101918527A (zh) * 2005-04-05 2010-12-15 阿耳特弥斯保健公司 富集和改变细胞和其他微粒的装置和方法
US20100317539A1 (en) * 2009-06-12 2010-12-16 Guo-Liang Yu Library of Engineered-Antibody Producing Cells
US20150151298A1 (en) * 2013-10-22 2015-06-04 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic Devices Having Isolation Pens and Methods of Testing Biological Micro-Objects with Same
CN105214742A (zh) * 2015-10-10 2016-01-06 中国科学院深圳先进技术研究院 基于人工结构声场的微流体系统及操控微粒的方法
CN105849561A (zh) * 2013-10-22 2016-08-10 伯克利照明有限公司 用于测定生物活性的微流体装置
WO2016125106A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Technion Research & Development Foundation Limited System and method for single cell genetic analysis

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989012231A1 (en) * 1988-06-08 1989-12-14 Cambridge Bioscience Corporation Anti-fc assay for detection of antibodies
JP2618497B2 (ja) * 1989-10-03 1997-06-11 鐘淵化学工業株式会社 腫瘍障害細胞誘導剤および腫瘍障害細胞誘導デバイス
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6942776B2 (en) 1999-05-18 2005-09-13 Silicon Biosystems S.R.L. Method and apparatus for the manipulation of particles by means of dielectrophoresis
ATE500051T1 (de) * 2001-04-06 2011-03-15 Fluidigm Corp Polymeroberflächenmodifikation
US6958132B2 (en) 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
EP1561107A1 (en) * 2002-11-13 2005-08-10 Micromet AG Method for identifying antigen specific b cells
EP1735428A4 (en) 2004-04-12 2010-11-10 Univ California OPTOELECTRONIC TWEEZERS FOR MANIPULATING MICROPARTICLES AND CELLS
US7488596B2 (en) * 2004-12-17 2009-02-10 Samsung Electronics Co., Ltd. Microfluidic device comprising electrolysis device for cell lysis and method for electrochemically lysing cells using the same
WO2007016366A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Yale University Defined culture conditions of human embryonic stem cells
US8080517B2 (en) * 2005-09-12 2011-12-20 Xigen Sa Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway
WO2007092713A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Trustees Of The University Of Pennsylvania Microfluidic system and method for analysis of gene expression in cell-containing samples and detection of disease
WO2008091848A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Advanced Liquid Logic, Inc. Surface assisted fluid loading and droplet dispensing
WO2008119066A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 The Regents Of The University Of California Single-sided lateral-field and phototransistor-based optoelectronic tweezers
AU2008284015B2 (en) * 2007-08-03 2014-05-15 Musc Foundation For Research Development Human monoclonal antibodies and methods for producing the same
JP2010536371A (ja) * 2007-08-21 2010-12-02 ノダリティ，インコーポレイテッド 診断方法、予後および治療方法
US20100086919A1 (en) * 2008-04-11 2010-04-08 China Molecular, Ltd. Devices and methods for immunoglobulin production
JP2010035472A (ja) * 2008-08-04 2010-02-18 Shizuoka Prefecture Ｓｓｔ−ｒｅｘ法を用いた新規のがん抗原特異的抗体遺伝子スクリーニング方法
GB0818609D0 (en) * 2008-10-10 2008-11-19 Univ Hull apparatus and method
JP2010263825A (ja) * 2009-05-14 2010-11-25 Kyoto Univ 記憶ｂ細胞の培養方法
US9533306B2 (en) 2010-08-02 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Single sided continuous optoelectrowetting (SCEOW) device for droplet manipulation with light patterns
US9227200B2 (en) 2011-06-03 2016-01-05 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices with flexible optically transparent electrodes
US9823248B2 (en) * 2011-11-15 2017-11-21 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods and kits for detecting IgE-expressing B cells
US9403172B2 (en) 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
ES2786253T3 (es) * 2013-03-14 2020-10-09 Immusoft Corp Métodos para la diferenciación y transducción in vitro de células b de memoria con vectores virales pseudotipados vsv-g
GB2525568B (en) * 2013-03-15 2020-10-14 Abvitro Llc Single cell barcoding for antibody discovery
US9889445B2 (en) * 2013-10-22 2018-02-13 Berkeley Lights, Inc. Micro-fluidic devices for assaying biological activity
US20150306598A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. DEP Force Control And Electrowetting Control In Different Sections Of The Same Microfluidic Apparatus
US20150306599A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. Providing DEP Manipulation Devices And Controllable Electrowetting Devices In The Same Microfluidic Apparatus
KR102232094B1 (ko) 2014-04-25 2021-03-25 버클리 라잇츠, 인크. 동일한 미세유체 장치에의 dep 처리 디바이스들 및 제어가능 전기습윤 디바이스들의 제공
CN107206377B (zh) * 2014-12-09 2020-02-11 伯克利之光生命科技公司 微流体装置中测定阳性的区域的自动检测
US9744533B2 (en) * 2014-12-10 2017-08-29 Berkeley Lights, Inc. Movement and selection of micro-objects in a microfluidic apparatus
AU2016250689B2 (en) * 2015-04-22 2021-07-08 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic cell culture

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060073095A1 (en) * 2001-08-22 2006-04-06 Steven Kessler Methods for screening antibody-producing cells on heterogeneous antigen substrates
US20040132112A1 (en) * 2002-08-28 2004-07-08 Kimon Angelides Screening antibodies using an optical fiber array device capable of simultaneously performing multiple functional assays
CN1626669A (zh) * 2003-07-16 2005-06-15 Ccl控股有限公司 完全人源化抗体的制备
CN1781936A (zh) * 2004-12-03 2006-06-07 中国人民解放军第三军医大学 B淋巴细胞刺激因子抑制肽及其筛选、制备方法
CN101918527A (zh) * 2005-04-05 2010-12-15 阿耳特弥斯保健公司 富集和改变细胞和其他微粒的装置和方法
US20100317539A1 (en) * 2009-06-12 2010-12-16 Guo-Liang Yu Library of Engineered-Antibody Producing Cells
US20150151298A1 (en) * 2013-10-22 2015-06-04 Berkeley Lights, Inc. Microfluidic Devices Having Isolation Pens and Methods of Testing Biological Micro-Objects with Same
CN105849561A (zh) * 2013-10-22 2016-08-10 伯克利照明有限公司 用于测定生物活性的微流体装置
WO2016125106A1 (en) * 2015-02-05 2016-08-11 Technion Research & Development Foundation Limited System and method for single cell genetic analysis
CN105214742A (zh) * 2015-10-10 2016-01-06 中国科学院深圳先进技术研究院 基于人工结构声场的微流体系统及操控微粒的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONGYAN BI 等: "Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption", 《LAB ON A CHIP》 *
TATSUHIKO OZAWA 等: "Amplification and analysis of cDNA generated from a single cell by 5 "-RACE: application to isolation of antibody heavy and light chain variable gene sequences from single B cells", 《BIOTECHNIQUES》 *
中国科学技术协会: "《免疫学学科发展报告2014-2015》", 30 April 2016, 中国科学技术出版社 *
孙晓非 等: "《儿童淋巴瘤诊断与治疗》", 31 August 2016, 广东科技出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
IL266208A (en) 2019-06-30
KR102560201B1 (ko) 2023-07-27
IL266208B2 (en) 2024-05-01
KR20190075990A (ko) 2019-07-01
JP2019534004A (ja) 2019-11-28
KR20230115350A (ko) 2023-08-02
CA3041527A1 (en) 2018-04-26
WO2018076024A8 (en) 2018-07-26
CN110799840B (zh) 2022-03-01
EP3981785A1 (en) 2022-04-13
EP3529611A2 (en) 2019-08-28
US20200064337A1 (en) 2020-02-27
AU2017345813A1 (en) 2019-05-23
SG11201903557SA (en) 2019-05-30
CA3041527C (en) 2023-09-05
WO2018076024A2 (en) 2018-04-26
WO2018076024A3 (en) 2019-06-06
EP3529611B1 (en) 2022-11-23
CN114755412A (zh) 2022-07-15
EP3529611A4 (en) 2020-08-12
JP2022091160A (ja) 2022-06-20
DK3529611T3 (da) 2023-02-06
JP7053601B2 (ja) 2022-04-12
IL266208B1 (en) 2024-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110799840B (zh) 筛选b细胞淋巴细胞的方法
US11971409B2 (en) Methods of producing patient-specific anti-cancer therapeutics and methods of treatment therefor
US11666912B2 (en) Sorting of T lymphocytes in a microfluidic device
KR102423945B1 (ko) 미세유체 디바이스에서의 t 림프구들의 선택 및 클로닝
US20210115436A1 (en) Methods for preparation of nucleic acid sequencing libraries
US20200115680A1 (en) Selection and Cloning of T Lymphocytes in a Microfluidic Device
CN109311930B (zh) 核酸稳定试剂、试剂盒及其使用方法
AU2017345813B2 (en) Methods for screening B cell lymphocytes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40023966

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant