JP2019534004A - B細胞リンパ球をスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[0002] ハイブリドーマ開発の分野内を含め、対象の抗原に特異的に結合することが可能な抗体を生成する細胞をスクリーニング及び識別することが関心を集めてきた。更に、高度に発現する抗体生成細胞を識別することが関心を集めている。抗体生成細胞に適した成長環境を可能にする適した環境を提供すること及び結合/発現のアッセイを容易に監視し得る環境を提供することは、難しい問題であった。更に、アッセイ結果と、分泌した抗体の望ましい発現/結合特性を示す特定の細胞との相関を提供することが望ましい。抗体開発の分野のこれらの態様への改善が本明細書において提供される。
[0003] 本発明は、部分的に、マイクロ流体デバイス内で一次B細胞を含むB細胞リンパ球をスクリーニングして、B細胞リンパ球が、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するか否かを判断することができるという発見に基づく。したがって、一態様では、対象の抗原に特異的に結合する抗体の抗体生成細胞による発現を検出する方法が提供される。本方法は、抗体生成細胞をマイクロ流体デバイスに導入するステップを含む。抗体生成細胞は、例えば、記憶B細胞等のB細胞リンパ球又は血漿細胞であり得る。
[0031] 本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び用途、又は例示的な実施形態及び用途が動作する様式若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。更に、図は、簡易化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、強調されることもあれば、又は他に一定の比率でないこともある。加えて、「上」、「付着」、「接続」、「結合」、又は同様の言葉が本明細書において使用される場合、ある要素(例えば、材料、層、基板等)は、ある要素が他の要素の直接上にあるか、直接付着されるか、直接接続されるか、若しくは直接結合されるか否かに関係なく、又はある要素と別の要素との間に1つ若しくは複数の介在要素があるか否かに関係なく、別の要素の「上」にあり、別の要素に「付着」、「接続」、又は「結合」され得る。また、文脈により別のことが示される場合を除き、方向(例えば、上方、下方、上部、下部、横、上、下、の下、の上、上部の、下部の、横、縦、「x」、「y」、「z」等)は、提供される場合、相対的なものであり、単に例として例示及び考察を容易にするために提供され、限定として提供されるものではない。加えて、要素のリスト(例えば、要素a、b、c)が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか1つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ、及び/又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にすることのみを目的とし、考察されるいかなる要素の組合せも限定しない。
[0071] 生物学的微小物体又は限定ではなくビーズ等の微小物体の装填は、本明細書に記載される流体フロー、重力、抗体生成細胞(DEP)力、エレクトロウェッティング、磁力、又はそれらの任意の組合せの使用を含むことができる。DEP力は、光電子ツイーザ(OET)構成による等、光学的に及び/又は時間/空間パターンでの複数の電極/1つの電極の領域の活性化による等、電気的に作動させることができる。同様に、エレクトロウェッティング力も、オプトエレクトロウェッティング(OEW)構成による等、光学的に及び/又は時空間パターンでの複数の電極/1つの電極の領域の活性化による等、電気的に作動させ得る。
[0072] 図1Aは、対象の抗原に結合(例えば、特異的に結合)する抗体を分泌する抗体生成細胞のスクリーニング及び検出に使用することができるマイクロ流体デバイス100及びシステム150の一例を示す。マイクロ流体デバイス100の斜視図は、マイクロ流体デバイス100内への部分図を提供するためにカバー110を部分的に切り欠いて示されている。マイクロ流体デバイス100は、一般に、流路106を含むマイクロ流体回路120を含み、流体媒体180は、流路106を通して流れることができ、任意選択的に、1つ又は複数の微小物体(図示せず)を、マイクロ流体回路120内に及び/又はマイクロ流体回路120を通して搬送することができる。1つのマイクロ流体回路120が図1Aに示されているが、適したマイクロ流体デバイスは、複数(例えば、2つ又は3つ)のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それにかかわらず、マイクロ流体デバイス100は、ナノ流体デバイスであるように構成することができる。図1Aに示されている実施形態では、マイクロ流体回路120は、複数のマイクロ流体隔離ペン124、126、128、及び130を含み、各マイクロ流体隔離ペンは、流路106と流通する開口部(例えば、1つの開口部)を有する。更に後述するように、マイクロ流体隔離ペンは、媒体180が流路106を通して流れている場合でも、マイクロ流体デバイス100等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するのに最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前にマイクロ流体デバイス100及びシステム150の概説を提供する。
[00104] 上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動(DEP)構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の微小物体に対してDEP力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び/又は移動を行うDEP構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス100の支持構造体104及び/又はカバー110は、マイクロ流体回路120内の流体培地180内の液滴に対して電子ウェッティング(EW)力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び/又は移動を行う電子ウェッティング(EW)構成を含むことができる。
図1Cに示される照明DEP電極領域214aの正方形パターン220は単なる例である。マイクロ流体デバイス200に投射される光パターン218により、任意のパターンのDEP電極領域214を照明する(それにより活性化する)ことができ、照明/活性化されるDEP電極領域214のパターンは、光パターン218を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
幾つかの実施形態では、領域/チャンバ202に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン(例えば、TEFLON(登録商標)又はポリ(2,3−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン)(例えば、CYTOP(商標))などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素(例えば、少なくとも10個の炭素又は少なくとも16個、18個、20個、22個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する)であり得る。代替的に、フッ素化(又はパーフルオロ化)炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約10nm〜約50nmの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5から3.0nm)を有する。
[00124] 一般的な隔離ペン224、226、及び228の非限定的な例を、図2A〜図2Cに示されるマイクロ流体デバイス230内に示す。各隔離ペン224、226、及び228は、分離領域240を画定する分離構造232と、分離領域240をチャネル122に流体的に接続する接続領域236とを含むことができる。接続領域236は、チャネル122への基端開口部234と、分離領域240への先端開口部238とを含むことができる。接続領域236は、チャネル122から隔離ペン224、226、228に流れている流体媒体(図示せず)のフローの最大貫入深さが分離領域240内に延びないように構成することができる。したがって、接続領域236に起因して、隔離ペン224、226、228の分離領域240内に配置された微小物体(図示せず)又は他の材料(図示せず)は、したがってチャネル122内の媒体180のフローから分離され、フローから実質的に影響を受けないことができる。
[00168] 理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス内の生体細胞(例えば、B細胞又はT細胞等の免疫細胞)等の微小物体の培養は、マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスとマイクロ流体デバイス内に維持される微小物体(例えば、生体細胞)との間に一次界面を提供する有機分子及び/又は親水性分子の層が存在するように調整又は被覆された場合に促進され得る(すなわち、微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存性の増大、増殖性の増大、及び/又は可搬性の増大を示す)。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の1つ又は複数(例えば、DEP構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体デバイスのカバー、及び/又は回路材料の表面)は、被覆溶液及び/又は被覆剤で処理して、有機分子及び/又は親水性分子の所望の層を生成する。幾つかの実施形態では、培養され且つ任意選択的にマイクロ流体デバイス内で増殖される微小物体(例えば、生体細胞)は、1つ又は複数の被覆剤を含む被覆溶液に搬入される。
[00171] 実施形態に依存して、上記のコーティング剤/コーティング溶液のいずれも、マイクロ流体デバイス(例えば、DEP構成及び/又はEW構成のマイクロ流体デバイス)の内面の1つ以上にコーティングするために使用される各種コーティング材料と交換され得るか又はそれらと組み合わせて使用され得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも1つの表面は、生物学的微小物体(例えば、免疫細胞(例えばB細胞)又はハイブリドーマ細胞のような細胞)の維持及び/又は拡大に好適な有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するコーティング材料を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の実質的に全ては、コーティング材料を含む。コーティングされた内面は、フロー領域(例えば、チャネル)、チャンバ若しくは隔離ペンの表面又はそれらの組合せを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも1つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、コーティング材料でコーティングされた少なくとも1つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも1つの内面は、コーティング材料でコーティングされる。
[00172] 少なくとも1つの内面は、ポリマーを含むコーティング材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも1つの表面に共有結合又は非共有結合(又は連結)され得る。ポリマーは、ブロックポリマー(及びコポリマー)、スターポリマー(スターコポリマー)及びグラフトポリマー又はコームポリマー(グラフトコポリマー)に見られるような様々な構造モチーフを有し得、それらは、全て本明細書に開示される方法に好適であり得る。
[00183] 幾つかの実施形態では、少なくとも1つの内面は、マイクロ流体デバイス内の微小物体(例えば、免疫細胞(例えば、B細胞)又はハイブリドーマ細胞等の細胞)の維持及び/又は増殖に適し、そのような細胞に調整表面を提供する有機分子及び/又は親水性分子の層を提供する共有結合分子を含む。共有結合分子は、結合基を含み、結合基は、マイクロ流体デバイスの1つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、微小物体(例えば、免疫細胞(例えば、B細胞)又はハイブリドーマ細胞等の細胞)の維持及び/又は増殖に適する有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成された部分にも共有結合する。結合基が結合する表面は、マイクロ流体デバイスの基板の表面を含み得、マイクロ流体デバイスがDEP構成を含む実施形態では、基板の表面は、ケイ素及び/又は二酸化ケイ素を含むことができる。幾つかの実施形態では、共有結合された被覆材料は、マイクロ流体デバイスの内面の略全てを被覆する。
[00192] 幾つかの実施形態では、共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、DEP構成基板表面)に共有結合されたとき、単層を形成し得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分によって形成される調整された表面は、10nm未満(例えば、5nm未満又は約1.5から3.0nm)の厚さを有し得る。他の実施形態では、共有結合された部分によって形成された調整された表面は、約10nmから約50nmの厚さを有し得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、DEP構成のマイクロ流体デバイス内の操作で好適には機能するために完全に形成された単層を必要とするものではない。
[00200] 被覆材料を形成する共有結合部分は、結合基を介して表面に付着する。結合基は、酸化ケイ素(例えば、DEP構成基板の場合)、酸化アルミニウム、又は酸化ハフニウム(例えば、EW構成基板の場合)から形成され得る基板表面の酸化物とのシロキサン含有試薬の反応により形成されるシロキシ結合基であり得る。幾つかの他の実施形態では、結合基は、基板表面の酸化物とのホスホン酸含有試薬の反応により形成されるホスホン酸エステルであり得る。
[00201] 共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体(例えば、免疫細胞(例えば、B細胞)又はハイブリドーマ細胞等の細胞)の維持及び/又は増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子(例えば、ペルフルオロアルキルシロキサン試薬を含み得るアルキルシロキサン試薬又はフルオロ置換アルキルシロキサン試薬)の反応により形成され得る。代替的に、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体(例えば、免疫細胞(例えば、B細胞)又はハイブリドーマ細胞等の細胞)の維持及び/又は増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成された部分を、それ自体が表面に共有結合する表面修飾リガンドに結合することにより形成され得る。
[00202] 幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面(例えば、隔離ペン及び/又はフロー領域の少なくとも1つの表面を含む)に共有結合する被覆材料は、化学式1の構造を有する。
部分−(L)n−LG
化学式2
[00211] 部分含有試薬(化学式5)は、マイクロ流体デバイス内で生物学的微小物体(例えば、免疫細胞(例えば、B細胞)又はハイブリドーマ細胞等の細胞)の維持及び/又は増殖に適した有機分子及び/又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を供給するように構成される。
部分−(L’)m−Rpx
化学式5
[00216] 表面改質試薬は、構造LG−(L’’)j−Rx(式4)を有する化合物である。結合基LGは、基板の表面の酸化物に共有結合する。基板は、DEP構成基板であり得、シリコン又はアルミナ又は酸化ハフニウムを含み得る。また、酸化物は、基板の天然化学構造の一部として存在し得るか又は本明細書で考察されるように導入し得る。結合基LGは、シロキサン基又はホスホン酸基と基板の表面上の酸化物との反応によって形成されるシロキシ基又はホスホネートエステル基等の本明細書に記載の任意の結合基であり得る。反応性部分Rxは、以上に記載される。反応性部分Rxは、結合基LGに直接的に(L’’、j=0)又はリンカーL’’(j=1)を介して間接的に接続し得る。結合基LGは、リンカーL’’の第1の末端に付着し得、反応性部分Rxは、表面改質試薬が式6のように表面に付着されると基板の表面から離れるリンカーL’’の第2の末端に接続し得る。
[00226] 本明細書に開示される方法は、対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現する生体細胞を検出又は識別する方法を含む。対象の抗原は、タンパク質、炭水化物基若しくは鎖、タンパク質若しくは炭水化物以外の生物学的若しくは化学的薬剤、又はそれらの任意の組合せであり得る。対象の抗原は、例えば、ウィルス、病原性微生物、病原真菌、病原性原虫等の病原体に関連付けられた抗原等であり得る。代替的に、対象の抗原は、肺がん、乳がん、メラノーマ等のがんに関連付けることができる。更に別の代替形態では、抗原は、多発性硬化症又はI型糖尿病等の自己免疫疾患に関連付けられ得る。本明細書で使用される場合、「病原体に関連付けられた」という用語は、対象の抗原を参照して使用されるとき、対象の抗原が病原体によって直接生成されるか、又は病原体と宿主との間の相互作用から生じることを意味する。
[00243] 配列決定ライブラリを提供し、及び/又は重鎖及び軽鎖抗体配列を抗体発現細胞から得る方法も本明細書に記載される。更に、対象のB細胞リンパ球から配列決定ライブラリを得ることは、本明細書に記載される方法以外の方法により実行することもできる。限定ではなく、他の適した方法は、2017年9月29日に出願されたPCT/米国特許出願公開第2017/054628号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
[00244] 捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドは、第1のプライミング配列及び捕捉配列を含み得る。捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドは、5’モストヌクレオチド及び3’モストヌクレオチドを含み得る。
[00245] 捕捉配列は、溶解された細胞からの核酸を捕捉するように構成されたオリゴヌクレオチド配列である。様々な実施形態では、捕捉配列は、捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドの3’モストヌクレオチドに隣接し得、又は3’モスとヌクレオチドを含み得る。捕捉配列は、約6個から約50個のヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、捕捉配列は、対象の細胞から解放された核酸にハイブリダイズすることにより核酸を捕捉する。本明細書に記載される方法の幾つかでは、対象のB細胞から解放された核酸は、mRNAであり得る。mRNAの3’末端にポリA配列を有する、mRNAを捕捉し、mRNAにハイブリダイズし得る捕捉配列は、ポリT配列を含み得る。ポリT配列は、約20個のTヌクレオチドから100個を超えるTヌクレオチドを有し得る。幾つかの実施形態では、ポリT配列は、約30個から約40個のヌクレオチドを有し得る。ポリT配列は、3’末端に2つのヌクレオチドVIを更に含み得る。
[00246] 捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドの第1のプライミング配列は、捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドの5’モストヌクレオチドに隣接した捕捉配列への5’であり得、又は捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドの5’モストヌクレオチドを含む。第1のプライミング配列は、一般的又は配列固有のプライミング配列であり得る。第1のプライミング配列は、結合すると、逆転写を準備するプライマーに結合し得る。第1のプライミング配列は、約10個から約50個のヌクレオチドを含み得る。
[00247] 捕捉オリゴヌクレオチドは、任意選択的に、1つ又は複数の追加のプライミング/アダプター配列を有し得、追加のプライミング/アダプター配列は、プライマー拡張(ポリメラーゼによる拡張を含むことができる)の着陸部位又は超並列配列決定アレイ若しくはフローセル内のアンカー部位に相補的にハイブリダイズするための固定化部位のいずれかを提供する。本明細書における方法では、第2の(又は追加の)プライミング配列は、P1配列(例えば、Illumina sequencing chemistries、AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(配列番号1)で使用されるような)であり得るが、方法は、そのように限定されない。他のタイプのNGSライブラリ準備のために任意の適するプライミング配列が含まれ得る。幾つかの実施形態では、P1配列が追加のプライミング配列として含まれる場合、それは、第1のプライミング配列への5’であり得る。追加のP1のプライミング配列も捕捉配列への5’であり得る。
[00248] 本明細書で使用される場合、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドは、鋳型切り替えヌクレオチドに追加されたデオキシシチジンヌクレオチドを使用する、限定ではなくモノニーマウス白血病ウィルス(MMLV)等の適切な逆転写の末端トランスフェラーゼ活性を可能にするオリゴヌクレオチドを指す。鋳型切り替えオリゴヌクレオチドと追加されたデオキシシチジンとが塩基ペアリングされると、逆転写酵素は、鋳型鎖を捕捉されたRNAから鋳型切り替えオリゴヌクレオチドに「切り替え」、鋳型切り替えオリゴヌクレオチドの5’末端への複製を続ける。したがって、転写RNAの完全な5’末端が含まれ、更なる増幅のための追加のプライミング配列を導入し得る。更に、cDNAは、配列から独立して転写される。
[00249] B細胞レセプタ遺伝子配列は、バリアブル(V)、多様性(D)、結合(J)、及び一定(C)セグメントを含む幾つかのサブ領域を解放RNAにその順序で5’から3’に含む。一定領域は、ポリA配列への5’のみである。配列決定BCRへの幾つかの手法では、ポリA配列(テール)を含まない配列決定のための増幅産物を得る選択戦略を構築することが望ましいことがある。更に、一定領域を殆ど保持しない増幅産物を生成することが望ましいことがある。解放された核酸配列のこれらのセクションを除外するように増幅を制限することにより、BCRのV、D(存在する場合)、及びJセグメントのよりロバストな配列決定を可能にすることができる。
実施例1 − ヒトCD45に結合可能なIgG抗体をスクリーニングするマウス脾細胞のスクリーニング
[00260] ヒトCD45に結合したIgG型抗体をスクリーニングするマウス脾細胞を識別するためにスクリーニングを実行した。実験設計は、以下のステップを含んだ。
1.CD45抗原被覆ビーズの生成;
2.マウス脾細胞の収穫;
3.マイクロ流体デバイスへの細胞の装填;及び
4.抗原特定性のアッセイ。
[00266] CD45抗原被覆微小ビーズを以下のように生成した。
[00277] CD45で免疫化したマウスからの脾臓を収穫し、DMEM培地+10%FBSに配置した。ハサミを使用して脾臓を細かく切り刻んだ。
[00281] マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning(OEP(商標))技術が構成されたOptoSelect(商標)デバイス(Berkeley Lights, Inc.)であった。マイクロ流体デバイスは、フロー領域と、それに流体的に接続された複数のNanoPen(商標)チャンバとを含み、チャンバは、約7×105立方μmの容積を有した。マイクロ流体デバイスは、少なくともフローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化DEP構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含むプロトタイプシステム(Berkeley Lights, Inc.)で動作した。
[00283] 1:2500抗マウスヤギF(ab’)2−Alexa568を含む培地を準備した。
[00287] 特定のペンからマイクロ流体デバイスの主チャネルに拡散したIgGアイソタイプ抗体の拡散を反映して、ビーズ/抗体混合物導入後20分の時点において、CD45被覆ビーズに結合可能であったビーズでの陽性信号が観測された。ビーズへの抗CD45抗体の結合により、二次抗マウスヤギIgG−568がビーズに関連付けられ、検出可能な信号を生成することができた。図5Cの白色矢印を参照されたい。
[00289] マイクロ流体デバイスにおいて記憶B細胞をスクリーニングする一般的な方法を図6Aに概説する。上記方法は、ヒト記憶B細胞に焦点を当てるが、この方法は、他の動物からのB細胞のスクリーニングに使用することもできる。
[00290] 凍結したヒト末梢血単核細胞(PBMC)を解凍し、10%FBS(Seradigm)で補足した6倍容量のRPMI1640(Gibco)と混合し、カウントし、500gで5分間遠心分離する。上澄みを吸引し、細胞ペレットをFACSバッファー(PBS、2%BSA、1mM EDTA)中に5×107細胞/mL濃度で再懸濁する。
[00294] マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning(OEP(商標))技術が構成され、共有結合したポリエチレングリコール(PEG)ポリマーの層を含む調整された内面を有するOptoSelect(商標)デバイス(Berkeley Lights, Inc.)である。マイクロ流体デバイスは、複数のマイクロ流体チャネルを有するフロー領域と、各マイクロ流体チャネルに流体的に接続された複数の隔離ペン(又はNanoPen(商標)チャンバ)とを含み、隔離ペンは、約5×105立方μmの容積を有する。マイクロ流体デバイスは、Beaconプラットフォーム(Berkeley Lights, Inc.)又はプロトタイプAlphaプラットフォーム(Berkeley Lights, Inc.)で動作し、プラットフォームは、フローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化DEP構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含む。
[00297] プロテインA(Spherotech)で被覆したビーズを、照射したジャーカットD1.1フィーダ細胞と約1:1の比で混合する。次に、ビーズ/フィーダ細胞混合物をマイクロ流体デバイスに流し入れ、記憶B細胞を含む各隔離ペンにフィーダ細胞及びビーズをバルク装填する。バルク装填は、マイクロ流体デバイスを一端部に傾斜させ、重力により細胞及びビーズを下方の隔離ペンに引っ張ることにより達成される。ビーズ/フィーダ細胞混合物は、各フィーダ細胞及びビーズのそれぞれで約1.5×107個/mLの濃度でマイクロ流体デバイスに流入し、このようにバルク装填された隔離ペンは、ペン毎に予想平均で約10個のフィーダ細胞及び約10個のビーズを受け取る。
[00299] 4日の培養/活性化後、マイクロ流体デバイスを培養ステーションから取り出し、Beacon/Alphaシステムに戻し、そこで多重アッセイを実行して、IgG分泌及び抗原特異性を検出する。図6Cに示す多重化アッセイは、抗ヒトIgG抗体被覆捕捉ビーズ(Spherotech)、抗ヒトIgG−Alexa Fluor488二次抗体(Invitrogen)、及びAlexa Fluor647カルボン酸スクシンイミジルエステルを使用して標識した対象の抗原を含む。捕捉ビーズ、二次抗体、及び標識した対象の抗原をB細胞活性化/培地媒体中で一緒に混合し、マイクロ流体デバイスのフロー領域/マイクロ流体チャネルに流す。フローを停止し、蛍光標識の視覚化に適切なフィルタを使用して、隔離ペンの画像を10分から25分の期間にわたって定期的に撮影する。対象の抗原に結合する抗体を分泌する記憶B細胞は、標識された対象の抗原とIgG抗体被覆捕捉ビーズとの関連性を誘導する。その結果、蛍光標識された捕捉ビーズの「プルーム」が、フロー領域/マイクロ流体チャネルと、記憶B細胞が配置された隔離ペンとの間の開口部に出現する。図6Dは、記憶B細胞の典型的なアッセイ結果を示す。
[00300] 次に、DEP力を使用して(上述したOEPパラメータを使用して)、対象の抗原に結合する抗体を分泌するものとして識別されたB細胞を一度に1つのペンから出し、搬出媒体(Ca2+及びMg2+を有するDPBS(Lonza)、BSA(Sigma)5mg/mL、及び1:100のPluronic(商標)F-127(Thermo Fisher))をマイクロ流体デバイスの流路に流すことにより、マイクロ流体デバイスから96ウェルプレートのウェルに搬出する。搬出に続き、記憶B細胞を溶解させ、重鎖及び軽鎖抗体配列をコードする転写をcDNAに逆転写し、配列決定する。
[00301] 上記プロトコールと略同じプロトコールを使用して、B細胞の活性化率(IgG分泌の検出により測定される)は、ヒト記憶B細胞で約12%に達した。非ヒト哺乳類記憶B細胞の細胞活性化率は、40%と高い値に達した。対象の抗原に結合する抗体を発現する活性化された記憶B細胞の検出率は、対象の抗原に依存するが、通常、1%前後又はそれ未満である。そのようなスクリーニングプロトコールによるヒト記憶B細胞から得られた推定上のAg+抗体の関連性をテストする一実験では、Ag結合抗体を分泌するものとして識別された20個1組の記憶B細胞をマイクロ流体デバイスから搬出し、それらの抗体重鎖及び軽鎖配列を特定した。HEK 393Tにおける再発現及びチップアッセイで使用した対象の抗原を用いてのELISAアッセイに続き、20個の抗体のうちの16個(すなわち80%)がELISAアッセイにおいて対象の抗原を検出した。これは、本明細書に開示される方法による記憶B細胞の活性化とスクリーニングとの関連性を確証する。
[00302] 上記方法は、多くの方法で変更することができ、それでもなお記憶B細胞の直接スクリーニングという目標を達成する。これらの変形形態は、以下を含む。
[00309] マイクロ流体デバイスにおいて血漿細胞をスクリーニングする一般的な方法を図7Aに示す。上記方法は、ヒト血漿細胞に焦点を当てるが、この方法は、他の動物からの血漿細胞のスクリーニングに使用することもできる。
[00310] 凍結したヒト骨髄(BM)細胞を37℃の水浴で急速解凍し、次に1Xデオキシリボヌクレアーゼ(Benzonase(登録商標)、25,000U/mLを含むヌクレアーゼ1000Xストック、Millipore)で補足した、予め加熱した(37℃)血漿細胞培地媒体(RPMI 1640(Gibco)、10%FCS(Hyclone)、1X非必須アミノ酸(NEAA)溶液(Gibco)、1Xピルビン酸ナトリウム(Gibco)、50uM βメルカプトエタノール(Gibco)、及び1X pen-strep(Gibco))5mLに滴下する。生成された混合物を300gで10分間遠心分離し、細胞ペレットをFACSバッファー(PBS、2%BSA、1mM EDTA)で2回洗浄する。
[00313] マイクロ流体デバイスは、OptoElectroPositioning(OEP(商標))技術が構成され、共有結合したポリエチレングリコール(PEG)ポリマーの層を含む調整された内面を有するOptoSelect(商標)デバイス(Berkeley Lights, Inc.)である。マイクロ流体デバイスは、複数のマイクロ流体チャネルを有するフロー領域と、各マイクロ流体チャネルに流体的に接続された複数の隔離ペン(又はNanoPen(商標)チャンバ)とを含み、隔離ペンは、約5×105立方μmの容積を有する。マイクロ流体デバイスは、Beaconプラットフォーム(Berkeley Lights, Inc.)又はプロトタイプAlphaプラットフォーム(Berkeley Lights, Inc.)で動作し、プラットフォームは、フローコントローラ、温度コントローラ、流体媒体調整及びポンプ構成要素、光活性化DEP構成用の光源、マイクロ流体デバイスの搭載ステージ、及びカメラを含む。
[00316] ペンから出した直後、血漿細胞をアッセイして、IgG分泌及び抗原特異性を検出する。図6Cに示す多重化アッセイは、抗ヒトIgG抗体被覆捕捉ビーズ(Spherotech)、抗ヒトIgG−Alexa Fluor488二次抗体(Invitrogen)、及びAlexa Fluor647カルボン酸スクシンイミジルエステル(succinimydyl ester)を使用して標識した対象の抗原を含む。40ug/mLのIL−6(R&D Systems)で補足した血漿細胞培地媒体(上記)中で捕捉ビーズ、二次抗体、及び標識した対象の抗原を一緒に混合し、マイクロ流体デバイスのフロー領域/マイクロ流体チャネルに流す。フローを停止し、蛍光標識の視覚化に適切なフィルタを使用して、隔離ペンの画像を10分から25分の期間にわたって定期的に撮影する。対象の抗原に結合する抗体を分泌する血漿細胞は、標識された対象の抗原とIgG抗体被覆捕捉ビーズとの関連性を誘導する。その結果、蛍光標識された捕捉ビーズの「プルーム」が、フロー領域/マイクロ流体チャネルと、血漿細胞が配置された隔離ペンとの間の開口部に出現する。図7Bは、血漿細胞の典型的なアッセイ結果を示し、明視野画像は、左パネルにあり、抗ヒトIgG二次抗体の蛍光画像は、中央パネルにあり、標識された対象の抗原の蛍光画像は、右パネルにある。
[00317] 次に、DEP力を使用して(上述したOEPパラメータを使用して)、対象の抗原に結合する抗体を分泌するものとして識別された血漿細胞を一度に1つのペンから出し、搬出媒体(Ca2+及びMg2+を有するDPBS(Lonza)、BSA(Sigma)5mg/mL、及び1:100のPluronic(商標)F-127(Thermo Fisher))をマイクロ流体デバイスの流路に流すことにより、マイクロ流体デバイスから96ウェルプレートのウェルに搬出する。搬出に続き、血漿細胞を溶解させ、重鎖及び軽鎖抗体配列をコードする転写をcDNAに逆転写し、配列決定する。
[00318] 上記プロトコールは、1日未満で実行される。上記と略同じプロトコールを使用して、対象の抗原に結合する抗体を発現する血漿細胞の検出率(対象の抗原に依存する)は、通常、1%前後又はそれ未満であり、そのようなプロトコールにより血漿細胞から得られる推定上のAg+抗体は、一研究では、82%と高い率で再発現時にAg特異結合を示した。
[00319] 上記方法は、多くの方法で変更することができ、それでもなお血漿細胞の直接スクリーニングという目標を達成する。これらの変形形態は、以下を含む。
[00326] マウス骨髄腫ハイブリドーマ細胞株であるOKT3をATCC(ATCC(登録商標)カタログ番号CRL−8001(商標))から得た。細胞は、懸濁液細胞株として提供した。約1×105生存細胞/mLから約2×1015生存細胞/mLで播種し、ガス環境として空気中に5%二酸化炭素を使用して37℃で培養することにより培地を維持した。OKT3細胞の数及び生存性をカウントし、マイクロ流体デバイスへの装填に向けて細胞密度を1×106個/mlに調整する。
[00327] 96ウェルフルスカートプレート(VWRカタログ番号95041−436)を細胞搬出に使用した。10μLの鉱油(Sigmaカタログ番号M5904)を分注し、続けて5μLの2X TCLバッファー(Qiagenカタログ番号1070498)を分注することにより、各プレートを準備した。(Single Cell Lysis Kit、Ambionカタログ番号4458235又はClontech溶解バッファー、カタログ番号635013等の他の溶解バッファーも同様に適宜使用し得る)。搬出プレートを200gで1分間にわたり室温において遠心分離し、使用するまで室温で貯蔵した。
[00328] 1μL/ml最終濃度のダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(DPBS)+カルシウム+マグネシウム(1000mL、Lonzaカタログ番号17−513F);ウシ血清アルブミン(BSA)(粉末、5g、Fisher Scientificカタログ番号BP9706−100);Pluronic F-127(10ml、Life Technologiesカタログ番号50−310−494;及び組み換え型リボヌクレアーゼ阻害剤(RNaseOUT)(Life Technologiesカタログ番号107777019)。使用前に搬出バッファーを0.22μmフィルタユニット(VWRカタログ番号73520−985)で濾過した。
[00329] システムのOptoElectroPositioning(OEP)機能を使用して、OKT3細胞(任意の種類の一次B細胞が使用可能である)をマイクロ流体デバイスに流し入れ、NanoPenチャンバに導入して、NanoPenチャンバ毎に1つの細胞の最終分布を提供した。実施例1に記載したIgGアッセイを実行した(抗原特異アッセイを使用することもできる)。対象のIgG発現(及び任意選択的に抗原特異抗体発現)を有すると識別された細胞を5μL搬出容量でウェル毎に1つの細胞で96ウェルプレートに個々に搬出した。選択された細胞を、その細胞が存在していたNanoPenチャンバから搬出するOEP力と、次に選択された各細胞を5μL容量で個々に搬出するフロー領域/マイクロ流体チャネル内の媒体フローとの混合を使用して搬出を実行した。搬出直後、搬出ウェルプレートを200g、4℃で5分間遠心分離した。RNA分離及びcDNA合成が実行されるまでプレートを−80℃で凍結した。これらの条件下でウェルプレートを少なくとも1ヶ月まで適宜維持した。幾つかの状況では、一晩又は1週間までの貯蔵を実行し得る。
[00330] 1細胞搬出プレートを氷上で15分間解凍し、続けて室温に戻した。RNAClean XP SPRIビーズ(Beckman Coulter番号A63987)を室温に戻し、10μLのビーズ混合物(1X容量)を各ウェルに添加した。(1x容量のSPRIビーズは、標準1.8xから2.2xと比較して高いRNA回収を示した。)
[00332] プレートを4Cにし、リボヌクレアーゼフリー水(Ambionカタログ番号AM9937)0.8μL;1:5M ERCCコントロールRNA(ThermoFisher Scientificカタログ番号4456740)1μL;dNTP(それぞれ10mM、NEB、番号N0447L)1μL;ビオチン−dTVI RNA捕捉/プライミングオリゴヌクレオチド(配列番号2)1μL;及びRNaseOUT(4U/μL、Life Technologiesカタログ番号107777−019)0.2μLを含む「RT混合物1」4ul中に再懸濁させた。イノシンは、任意の天然ヌクレオチドに結合し得るため、ビオチン−dTVI RNA捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドの捕捉配列の3’イノシンは、解放RNAへの結合の増大を提供した。3’イノシンを有する捕捉配列は、時間の25%のみでmRNAに結合し得る最終的な「N」ヌクレオチドを含む捕捉配列よりも高い解放RNA捕捉を提供することができる。上述したような捕捉/プライミング配列による捕捉の概略を図8Aに示す。ERCC RNAコントロールは、内部RTコントロールを提供し、また逆転写効率を改善したキャリアRNAも提供した。プレートを72℃で5分間培養し、直ちに4℃にした。ベタイン(5M、Sigmaカタログ番号B030075VL)1μL:5X RT混合物(Thermo、番号EP0753)1.5μL;ビオチン化バーコード付き鋳型切り替えオリゴヌクレオチド(biot_barcoded TSO;配列番号3)0.5μL;120mM MgCl2(125mM、Life Technologiesカタログ番号AM9530G)0.5μL;RNase OUT 0.4μL;及びMaxima RNaseHマイナス逆転写酵素(200U/μL、Thermo Fisherカタログ番号EP0753)0.1μLを含む「RT混合物2」4μLを各ウェルに添加した。「RT混合物2」の添加に続き、逆転写を42℃で90分間実行し、その後、50℃で2分間/42Cで2分間のサイクルを10回続けた。最後の熱サイクル後、75℃で15分間の熱失活を続けた。ビオチンバーコード付きTSOの4ヌクレオチドバーコード「NNNN」は、複数の搬出プレート潜在的な多重化配列決定実験の内部バーコード付けを提供し、この方法で必須の特徴ではない。初期鎖伸長の概略を図8Bに示し、TSO関連付けを図8cに示し、逆転写の完全な転写産物を図8Dに示す。
[00333] cDNA合成に続き、搬出プレートを200gで5分間遠心分離し、2X Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix(Rocheカタログ番号KK2602)12.5μL;P1プライマー(biot_P1、配列番号4)1μL;及びヌクレオチドフリー水(Ambionカタログ番号AM9937)3.5μLを含むPCR混合物17μLを添加し、PCRを98℃で3分間実行し、その後、98℃で15秒、65℃で30秒、72℃で5分間のサイクルを20回続け、最後に72℃で5分間の最終伸長を実行した。最終伸長時間は、ポリメラーゼが長いcDNA分子(2kbを超える)を増幅するのに十分な長さであった。この増幅の概略を図8Eに示す。
[00334] 25μL(1x容量)のDNAClean SPRIビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A62881)を各ウェルに添加し、よく混合し、プライマーダイマー及び下流の増幅を汚染する恐れがある短く劣化したRNA産物を除去した。混合物を室温で10分間培養した。培養に続き、プレートをウェルプレート磁石に5分間配置した。上澄みを慎重に除去し、100μLの80%エタノール(新鮮なものを準備)を添加することにより、エタノール洗浄を実行した。約30秒後、エタノールを吸引した。エタノール洗浄手順を1回繰り返した。最後の吸引後、搬出ウェルプレートをウェルプレート磁石から取り外し、ビーズを5分間乾燥させた。15μLのヌクレアーゼフリーH2Oを用いて、乾燥させたビーズからDNAを溶出させた。図9Aは、産物のBioAnalyzer電気泳動トレースを示し、トレースは、全長cDNAの予期される平均長で約1800bp前後の予期される分布を示した。cDNAの典型的な量は、増幅及びクリーンアップを実行した後、約2ngから約20ngであると推定された。
[00335] 単細胞のB細胞レセプタ(BCR)増幅及びバーコーディングを2ステップポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で実行した。
[00336] 最初のPCRにおいて、順方向プライマー(FP1、配列番号5)は、bio_barcoded_TSOから組み込まれたP1配列の3’末端にハイブリダイズするように設計され、それにより上記の全RNA増幅ステップにおいて組み込まれたP1配列をなくした。逆方向プライマー(RP1、配列番号6、7、8)は、重鎖及び軽鎖の結合(J)遺伝子に近いB細胞レセプタ遺伝子の一定領域に結合する。PCR1の概略を図8Fに示す。順方向プライマーは、プレートの12列にわたる12個の異なる6ヌクレオチドバーコード(NNNNNN)を含んだ。したがって、PCR1は、全RNA増幅産物からのRNA配列を含むBCRの選択を実行し、BCRのバリアブル、結合、及び多様性セグメントに焦点を当てたBCRの領域を更に選択した。この選択的増幅の増幅産物(図8Fの増幅産物860として示されている)は、ポリA/ポリT捕捉配列もBCRの一定領域の大半もそれ以上含まず、これらは、いずれも対象のデータを提供しない。
[00338] 2番目のPCRにおいて、1つの順方向プライマー(FP2、配列番号9)は、バーコード付きFP1に結合し、8つのバーコード付き(NNNNNN)逆方向プライマー(RP2、配列番号10)をプレートの8行にわたって使用した。この戦略により、20のみのバーコードを使用して、96ウェルプレート全体における各ウェルを一意にバーコード付けすることができる。cDNA合成で使用したbiot_barcoded_TSOから組み込まれた内部プレートバーコードと複数のプレートとを組み合わせることができる。PCR2の概略を図8Gに示す。最終産物である増幅産物880の概略表現を図8Hに示す。
[00340] 増幅産物をプーリングした。1x容量のDNAClean SPRIビーズ(Beckman Coulter、カタログ番号A62881)を各ウェルに添加し、よく混合した。混合物を室温で10分間培養した。培養に続き、プレートをウェルプレート磁石に5分間配置した。上澄みを慎重に除去し、100μLの80%エタノール(新鮮なものを準備)を添加することにより、エタノール洗浄を実行した。約30秒後、エタノールを吸引し、エタノール洗浄をもう一度繰り返した。最後の吸引後、プレートを磁石から取り外し、ビーズを5分間乾燥させた。15μLのヌクレアーゼフリー水を用いて、乾燥させたビーズからDNAを溶出させた。
[00344] 1.対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するB細胞リンパ球を検出する方法であって、B細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及び隔離ペンを有する囲いを含み、隔離ペンは、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、接続領域は、分離領域とフロー領域との間に流体接続を提供し、保持ペンの分離領域は、マイクロ流体デバイスの非掃引領域である、導入することと、B細胞リンパ球を試料から隔離ペンの分離領域に装填することと、対象の抗原がB細胞リンパ球の近くにあるように、対象の抗原を囲いのフロー領域に導入することと、B細胞リンパ球によって発現される抗体への対象の抗原の結合を監視することとを含む方法。
Claims (75)
- 対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するB細胞リンパ球を検出する方法であって、
B細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、
前記マイクロ流体デバイスは、
フロー領域及び隔離ペンを有する囲い
を備え、
前記隔離ペンは、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域は、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記保持ペンの前記分離領域は、前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、
B細胞リンパ球を前記試料から前記隔離ペンの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が前記B細胞リンパ球の近くにあるように、前記対象の抗原を前記囲いの前記フロー領域に導入することと、
前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと
を含み、
前記隔離ペンの前記分離領域は、少なくとも1つの調整表面を含む、
方法。 - 前記少なくとも1つの調整表面は、共有結合で連結された親水性分子の層を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記親水性分子は、ポリエチレングリコール(PEG)含有ポリマーを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスの前記囲いは、抗体生成細胞(DEP)構成を更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスの前記囲いは、ベース、マイクロ流体回路構造、及びカバーを更に含み、前記ベース、前記マイクロ流体回路構造、及び前記カバーは、一緒にマイクロ流体回路を画定し、前記マイクロ流体回路は、前記フロー領域及び前記隔離ペンを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記ベースは、第1の電極を含み、
前記カバーは、第2の電極を含み、及び
前記ベース又は前記カバーは、電極活性化基板を含み、
前記電極活性化基板は、複数のDEP電極領域を含む表面を有し、前記電極活性化基板の前記表面は、前記フロー領域の内面を提供する、請求項5に記載の方法。 - 前記接続領域は、約20μmから約60μmの幅Wconを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記接続領域は、長さLconを有し、前記接続領域の前記長さLconと前記接続領域の幅Wconとの比率は、少なくとも1.5の値を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記分離領域は、前記接続領域の前記幅Wconよりも大きい幅Wisoを有する、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記分離領域は、約50μmから約250μmの幅Wisoを有する、請求項9に記載の方法。
- 前記隔離ペンは、約0.5nLから約2.5nLの容積を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記隔離ペンの前記分離領域は、被覆材料で被覆された少なくとも1つの表面を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記被覆材料は、ポリエチレングリコール(PEG)含有ポリマーを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、又は腫瘍生検である、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、末梢血の試料である、請求項14に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、骨髄生検である、請求項14に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球は、記憶B細胞である、請求項14又は15に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球は、血漿B細胞である、請求項14又は16に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、哺乳動物又は鳥類動物から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、又はニワトリから得られる、請求項19に記載の方法。
- 前記哺乳動物は、前記対象の抗原に対して免疫化されており、前記哺乳動物は、前記対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに対して免疫化されており、前記哺乳動物は、がんを有し、及び前記がんは、前記対象の抗原に関連付けられるか、又は前記哺乳動物は、自己免疫疾患を有し、及び前記自己免疫疾患は、前記対象の抗原に関連付けられる、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、B細胞リンパ球以外の細胞タイプが枯渇している、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、CD27を発現するB細胞リンパ球について富化されている、請求項1又は22に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、CD138を発現するB細胞リンパ球について富化されている、請求項1又は22に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を含む試料は、前記マイクロ流体デバイスに導入される前にデオキシリボヌクレアーゼに接触されている、請求項1に記載の方法。
- 単一のB細胞リンパ球は、前記分離領域に装填される、請求項1に記載の方法。
- 複数のB細胞リンパ球は、前記分離領域に装填される、請求項1に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を、B細胞活性化を刺激する刺激剤に接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記刺激剤は、CD40アゴニストを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記刺激剤は、1つ又は複数のCD40L+フィーダ細胞を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記刺激剤は、B細胞レセプタ(BCR)ライゲート分子を更に含み、前記BCRライゲート分子は、プロテインA又はプロテインGを含む、請求項29又は30に記載の方法。
- 前記BCRライゲート分子は、微小物体に連結される、請求項31に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、前記B細胞リンパ球を、CD40L+フィーダ細胞と、ビーズに共役されたプロテインAとの混合物に接触させることを含み、前記B細胞リンパ球を刺激剤に接触させることは、前記混合物を前記隔離ペンの前記分離領域に装填することを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球は、3日から5日の期間にわたって前記刺激剤に略連続して接触される、請求項29に記載の方法。
- 培地を前記B細胞リンパ球に提供することであって、前記培地は、B細胞の増殖及び/又は活性化を促進する1つ又は複数の薬剤を含む、提供することを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 前記培地は、IL−2、IL−4、IL−6、IL−21、及びBAFF又はAprilを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記培地は、TLRアゴニストを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記TLRアゴニストは、CpGオリゴヌクレオチドである、請求項37に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球は、3日から5日の期間にわたって培地に提供される、請求項35に記載の方法。
- 前記刺激剤に接触させること及び前記培地を提供することは、略同一の時間期間にわたって実行される、請求項35に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域に装填することは、DEP力を使用して、前記B細胞リンパ球を前記分離領域に移動させることを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球は、前記フロー領域から前記分離領域に移動される、請求項41に記載の方法。
- 前記対象の抗原を提供することは、対象の可溶性抗原を含む溶液を、前記フロー領域内に又は前記フロー領域を通して流すことを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の抗原は、第1の検出可能な標識に共有結合される、請求項43に記載の方法。
- 第1の抗体結合剤を含む微小物体を提供することを更に含み、前記第1の抗体結合剤は、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への対象の抗原の結合を阻害することなく、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体に結合し、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することは、前記対象の抗原の前記微小物体への間接的な結合を検出することを含む、請求項43又は44に記載の方法。
- 前記第1の抗体結合剤は、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体のFcドメインに結合する、請求項45に記載の方法。
- 前記微小物体を提供することは、前記微小物体を含む溶液を前記フロー領域に流し、且つ前記微小物体が前記隔離ペンの近くに配置されると前記流れを停止させることを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記微小物体を含む前記溶液及び前記対象の可溶性抗原を含む前記溶液は、同じ溶液である、請求項45に記載の方法。
- 第2の抗体結合剤を提供することであって、前記第2の抗体結合剤は、第2の検出可能な標識を含む、提供することと、
前記微小物体への前記第2の抗体結合剤の間接的な結合を監視することと
を更に含み、前記第1の検出可能な標識は、前記第2の検出可能な標識と異なる、請求項45に記載の方法。 - 前記第2の抗体結合剤は、IgG抗体に結合する、請求項49に記載の方法。
- 前記対象の抗原を提供することは、前記対象の抗原を含む微小物体を提供することを含み、前記微小物体は、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズである、請求項1に記載の方法。
- 前記対象の抗原の前又は前記対象の抗原と同時に、標識された抗体結合剤を提供すること
を更に含み、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を前記監視することは、前記対象の抗原への前記標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することを含む、請求項51に記載の方法。 - 前記標識された抗体結合剤は、抗IgG抗体に結合する、請求項52に記載の方法。
- 前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することは、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンの全て又は一部を撮像することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記撮像することは、蛍光撮像することを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記撮像することは、複数の画像を撮影することを含む、請求項54に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスは、複数の前記隔離ペンを含み、各隔離ペンは、分離領域及び接続領域を有し、前記接続領域のそれぞれは、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記方法は、
前記複数のB細胞リンパ球の1つ又は複数を前記複数のうちの2つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填することと、
前記対象の抗原が、1つ又は複数のB細胞リンパ球が装填された前記2つ以上の隔離ペンのそれぞれの近くにあるように、前記対象の抗原を前記マイクロ流体デバイスに導入することと、
前記装填されたB細胞リンパ球のそれぞれによって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと
を更に含む、請求項1に記載の方法。 - 単一のB細胞リンパ球は、前記複数のうちの前記2つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填される、請求項57に記載の方法。
- 前記装填されたB細胞リンパ球又は前記装填されたB細胞リンパ球のうちのB細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を検出することと、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして、前記装填されたB細胞リンパ球又は前記装填されたB細胞リンパ球のうちの前記B細胞リンパ球を識別することと
を更に含む、請求項57に記載の方法。 - 対象の抗原に特異的に結合する抗体を特徴付ける方法であって、
前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するB細胞リンパ球又はそのクローン集団を識別することであって、前記識別することは、請求項59に記載の方法に従って実行される、識別することと、
前記B細胞リンパ球又は前記そのクローン集団から、免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)及び/又は免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)をコードする核酸を分離することと、
前記免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)をコードする前記核酸の少なくとも一部及び/又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)をコードする前記核酸の少なくとも一部を配列決定することと
を含む方法。 - 前記免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)を配列決定することは、
前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団のB細胞リンパ球を溶解させることと、
前記B細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球から単離されたmRNAを逆転写することであって、前記mRNAは、前記免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)をコードし、それによりVH cDNAを形成する、逆転写することと、
前記VH cDNAの少なくとも一部を配列決定することと
を含む、請求項60に記載の方法。 - 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)を配列決定することは、
前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団のB細胞リンパ球を溶解させることと、
前記B細胞リンパ球又は前記そのクローン集団から単離されたmRNAを逆転写することであって、前記mRNAは、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)をコードし、それによりVL cDNAを形成する、逆転写することと、
前記VL cDNAの少なくとも一部を配列決定することと
を含む、請求項60に記載の方法。 - 前記mRNAを逆転写することは、前記mRNAを捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記逆転写することは、転写スイッチオリゴヌクレオチドの存在下で実行される、請求項63に記載の方法。
- 前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球は、溶解される前に前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を搬出することは、
前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に移動させることと、
前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球を、前記フロー領域を通して且つ前記マイクロ流体デバイスから流すことと
を含む、請求項65に記載の方法。 - 前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から移動させることは、DEP力を使用して、前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を捕捉し且つ移動させることを含む、請求項66に記載の方法。
- 前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球は、前記マイクロ流体デバイス内で溶解される、請求項61又は62に記載の方法。
- 1つ又は複数の捕捉ビーズを、前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記B細胞リンパ球の近傍に提供することであって、前記1つ又は複数の捕捉ビーズは、前記VH mRNA及び/又は前記VL mRNAに結合することが可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、提供することと、
前記識別されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団を溶解させることと、
前記溶解されたB細胞リンパ球又は前記そのクローン集団の前記溶解されたB細胞リンパ球からの前記VH mRNA及び/又は前記VL mRNAを前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合させることと
を更に含む、請求項68に記載の方法。 - 前記1つ又は複数の捕捉ビーズの各捕捉ビーズは、複数の捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドを含む、請求項69に記載の方法。
- 前記結合されたVH mRNA及び/又は前記結合されたVL mRNAは、前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、VH cDNA及び/又はVL cDNAに逆転写される、請求項69に記載の方法。
- 前記VH cDNA及び/又はVL cDNAは、前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項71に記載の方法。
- 前記配列決定前に前記VH cDNA及び/又は前記VL cDNAを増幅することを更に含む、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記増幅することは、前記B細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたmRNAにおいて、VH cDNA及び/又はVL cDNA又はその断片の表現を増大させることを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記増幅することは、
前記B細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたmRNAにおいて、VH cDNA及び/又はVL cDNA又はその断片の前記表現を増大させる増幅の第1のラウンドと、
前記第1のラウンドにおいて増幅されたVH cDNA及び/又はVL cDNA又はその断片にバーコード配列を導入する増幅の第2のラウンドと
を含む、請求項74に記載の方法。
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