KR20190075990A - B 세포 림프구들의 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

마이크로유체 환경 내에서 항체 생산 세포를 스크리닝하기 위한 방법이 본원에 기재되어 있다. 항체 생산 세포는 메모리 B 세포 또는 형질 세포일 수 있는 B 세포 림프구일 수 있다. 관심 항원은 항체 생산 세포와 근접하게 될 수 있으며, 항체 생산 세포에 의해 생산된 항체에 의한 항원의 결합이 모니터링될 수 있다. 항체 생산 세포로부터 서열화 라이브러리를 얻는 방법도 또한 기재되어 있다.

Description

B 세포 림프구들의 스크리닝 방법
본 출원은 2016년 10월 23일자로 출원된 미국 가출원 제 62/411,690 호, 및 2016년 10월 24일자로 출원된 미국 가출원 제 62/412,092 호의 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장하는 정규출원이며, 그 각각은 여기에 그 전체가 참조로 포함된다.
하이브리도마 (hybridoma) 발달 영역 내를 포함하여, 관심 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 생산하는 세포들을 스크리닝하고 식별하는 것이 중요해지고 있다. 또한, 고도로 발현하는 항체 생산 세포를 식별하는 것이 중요하다. 결합/발현의 검정이 용이하게 모니터링될 수 있는 환경을 제공할 뿐만 아니라 항체 생산 세포에 적합한 성장 환경을 허용하는 적합한 환경을 제공하는 것은 어려운 과제가 되고 있다. 또한, 분비된 항체의 바람직한 발현/결합 특성을 입증하는 특정 세포와의 검정 결과의 상관 관계를 제공하는 것이 바람직하다. 항체 발달 분야의 이러한 양태들에 대한 개선이 본 명세서에서 제공된다.
본 발명은 일차 B 세포들을 포함하는 B 세포 림프구들이 마이크로유체 디바이스 내에서 스크리닝되어 B 세포 림프구들이 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체들을 발현하는지 여부를 결정할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이에 따라서, 일 양태에서, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 항체 생산 세포에 의한 발현을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 항체 생산 세포를 마이크로유체 디바이스에 도입하는 단계를 포함한다. 항체 생산 세포는 예를 들어 B 세포 림프구, 예를 들어 메모리 B 세포 또는 형질 세포일 수 있다.
예를 들어, 마이크로유체 디바이스는 마이크로유체 채널 및 적어도 하나의 마이크로유체 격리 펜 (예를 들어, 복수의 격리 펜들) 을 포함할 수 있는 흐름 영역을 포함할 수 있다. 각각의 격리 펜은 단리 영역 및 단리 영역을 흐름 영역 (예를 들어, 마이크로유체 채널) 에 유체 연결하는 연결 영역을 포함할 수 있다.
개시된 방법들 중 일부는 다음의 추가 단계들: 격리 펜의 단리 영역 안으로 항체 생산 세포를 로딩하는 단계; 관심 항원이 항체 생산 세포에 근접하도록 관심 항원을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계; 및 관심 항원과 항체 생산 세포에 의해 발현된 항체와의 결합을 모니터링하는 단계를 포함한다. 로딩된 세포는 복수의 격리 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스 안으로 로딩된 세포들의 집단 (예를 들어, B 세포들) 중 하나일 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 하나 이상의 항체 생산 세포들은 복수의 격리 펜들의 각각의 단리 영역 안으로 로딩될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 단일의 항체 생산 세포는 각각의 격리 펜 안으로 로딩된다. 관심 항원은 항체 생산 세포에 근접하여 제공될 때 세포, 리포솜, 지질 나노라프트 또는 합성 비드 (예를 들어, 마이크로비드 또는 나노비드) 와 같은 마이크로-객체에 용해되거나 부착될 수 있다. 이러한 마이크로-객체는 현미경으로 볼 수 있다. 관심 항원과 항체 생산 세포(들)에 의해 생산된 항체들 사이의 결합을 모니터링하는 단계는: 표지된 관심 항원을 제공하는 단계 및 관심 항원 (예를 들어, 표지된 관심 항원) 의 직접적인 결합을 검출하는 단계; 표지된 항체 결합제를 제공하는 단계 및 표지된 항체 결합제에 대한 (예를 들어, 관심 항원을 제시하는 마이크로-객체에 대한) 관심 항원의 간접적인 결합을 검출하는 단계; 및 항체 결합제를 제공하는 단계, 및 항체 결합제에 대한 (예를 들어, 복수의 항체 결합제에 연결된 마이크로-객체에 대한) 표지된 관심 항원의 간접적인 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 항체 결합제는 이소타입 특이적 (예를 들어, 항-IgG 항체 또는 이들의 IgG 결합 단편) 일 수 있다. 관심 항원 또는 항체-결합제 상의 표지는 형광 표지일 수 있다.
항원-결합 항체를 발현하는 것으로 식별된 항체 생산 세포에 대해, 개시된 방법들은: 식별된 세포 (예를 들어, B 세포) 를 용해시키는 단계; 용해된 세포로부터 유래된 VH mRNA 및/또는 VL mRNA 를 역전사하여 VH cDNA 및/또는 VL cDNA를 각각 형성하는 단계; 및 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 용해 및 역전사 단계들은 마이크로유체 디바이스 내에서 또는 마이크로유체 디바이스 외부에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 식별된 세포는 세포 용해 및 추가 프로세싱을 위해 (예를 들어, 단일 세포로) 배출될 수 있다. 대안으로, 식별된 세포는 그것이 로딩된 격리 펜 내에서 용해되고, 용해시 방출된 VH mRNA 및/또는 VL mRNA 는 캡처 비드들 (즉, 표면에 연결된 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드들, 올리고뉴클레오티들은 VH mRNA 및/또는 VL mRNA 에 특이적으로 결합할 수 있음) 에 의해 격리될 수 있다. 캡처 비드들은 캡처된 VH mRNA 및/또는 캡처된 VL mRNA 이 역전사되기 이전에 또는 이후에 마이크로유체 디바이스로부터 배출될 수 있다.
본 발명의 방법들의 이들 및 다른 특징들 및 이점들은 다음의 설명 및 첨부된 청구항들에서 보다 명확하게 밝혀질 것이다. 특징들 및 이점들은 첨부된 실시예들 및 청구 범위들에서 특히 지적된 수단들 및 조합들에 의해 실현 및 획득될 수 있다. 또한, 기술된 시스템들 및 방법들의 특징들 및 이점들은 실시에 의해 학습되거나 이후에 설명되는 바와 같이 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 연관된 제어 장비를 포함하여 마이크로유체 디바이스와 함께 사용하기 위한 시스템 및 마이크로유체 디바이스의 예를 도시한다.
도 1b 및 도 1c 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 마이크로유체 디바이스의 수직 및 수평 단면도를 각각 도시한다.
도 2a 및 도 2b 는 본 발명의 일부 실시형태들에 따른 단리 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스의 수직 및 수평 단면도를 각각 도시한다.
도 2c 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 격리 펜의 상세화된 수평 단면도를 도시한다.
도 2d 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 단리 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스의 부분 수평 단면도를 도시한다.
도 2e 및 도 2f 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 격리 펜들의 상세화된 수평 단면도를 도시한다.
도 2g 는 본원에 개시된 실시형태에 따른 복수의 흐름 채널들을 포함하는 흐름 영역을 갖는 마이크로유체 디바이스를 도시하고, 각각의 흐름 채널은 복수의 격리 펜들에 유체적으로 연결된다.
도 2h 는 마이크로유체 디바이스의 부분 수직 단면도를 도시하고, 마이크로유체 디바이스에서 베이스의 내향 표면 및 커버의 내향 표면은 본원에 개시된 실시형태에 따른 컨디셔닝된 표면들이다.
도 3a 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 마이크로유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 동작적으로 커플링하도록 구성된 시스템 네스트의 특정 예를 도시한다.
도 3b 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따른 마이크로유체 디바이스를 제어하기 위한 시스템의 광학 트레인을 도시한다.
도 4 는 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따라 관심의 대상인 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하기 위한 예시적인 워크플로우의 단계들을 도시한다.
도 5a-5c 는 복수의 마이크로유체 채널들을 포함하는 마이크로유체 디바이스의 사진도이며 (각각의 마이크로유체 채널은 복수의 격리 펜들과 유체 연결됨), 그리고 본원에 개시된 일부 실시형태들에 따라 B 세포 림프구를 스크리닝하는 방법을 설명한다.
도 6a 는 본원에 개시된 실시형태에 따라 메모리 B 세포들을 활성화 및 스크리닝하는 방법의 개략도이다.
도 6b 는 본원에 개시된 실시형태에 따라 격리 펜들 안으로 이동되는 개별 메모리 B 세포들 이미지의 이미지이다.
도 6c 는 본원에 개시된 일부 실시 형태들에 따른 멀티플렉스 검정의 다이어그램이다.
도 6d 는 본원에 개시된 실시형태에 따라 검정되는 메모리 B 세포들의 형광 이미지이다.
도 6e 는 본원에 개시된 실시형태에 따라, 메모리 B 세포들의 다클론 그룹을 검정한 다음 메모리 B 세포들의 그룹을 후속 검정을 위해 개별적인 격리 펜들로 분리하는 것으로 시작하는 메모리 B 세포들을 스크리닝하는 방법에서의 단계들의 개략도이다.
도 7a 는 본원에 개시된 실시형태에 따라 형질 세포들을 스크리닝하는 방법의 개략도이다.
도 7b 는 본원에 개시된 실시형태에 따라 검정되는 형질 세포들의 브라이트필드 및 대응하는 형광 이미지의 세트이다.
도 8 은 BCR 서열화 라이브러리를 생산하는 방법의 개략도이다.
도 9a 는 단세포 배출 및 mRNA 캡처로부터 생산된 cDNA의 크기 분포를 전기영동도 (electropherogram) 분석의 그래프 표현이다.
도 9b 는 본원에 개시된 방법의 실시형태에 의해 생산된 단일 세포 앰플리콘에서 유래된 전기영동도의 사진 표현이다.
도 10(a)-10(c) 는 본원에 개시된 방법의 일 실시형태에 따라 19개의 개별 세포들로부터 캡처된 mRNA로부터 생산된 앰플리콘의 전기영동도들의 사진 표현이다.
본 상세한 설명은 본 발명의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들에 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 동작하거나 본원에 설명되는 방식에 제한되지 않는다. 더욱이, 도면들은 단순화된 또는 부분 뷰들을 나타낼 수도 있고, 도면들에서 엘리먼트들의 치수들은 과장되거나 또는 다르게는 비례적이지 않을 수도 있다. 또한, 용어들 "~ 상에 (on)", "~ 에 부착된 (attached to)", "~ 에 연결된 (connected to)", "~ 에 결합된 (coupled to)" 또는 유사한 단어들이 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트 바로 위에 있고, 그것에 부착되거나, 그것에 연결되고 또는 그것에 결합되는지, 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 중간 엘리먼트들이 있는지 여부에 관계 없이, 하나의 엘리먼트 (예를 들어, 재료, 층, 기질 등) 는 다른 엘리먼트 "상에" 있을 수 있고, 그것에 "부착될" 수 있고, 그것에 "연결될" 수 있고, 또는 그것에 "결합될" 수 있다. 또한, 콘텍스트가 다르게 기술하지 않으면, 방향들 (예를 들어, 위 (above), 아래 (below), 상단 (top), 하단 (bottom), 측면 (side), 상 (up), 하 (down), 상부에서 (over), 상부 (upper), 하부 (lower), 수평, 수직, "x", "y", "z" 등) 은 제공된다면 상대적이고, 제한이 아니라, 전적으로 예로서 그리고 예시 및 논의의 용이함을 위해 제공된다. 또한, 엘리먼트들 (예를 들어, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 참조가 이루어지는 경우, 이러한 참조는 열거된 엘리먼트들 자체, 전부보다 적은 열거된 엘리먼트들의 임의의 조합, 및/또는 열거된 엘리먼트들의 전부의 조합 중의 임의의 하나를 포함하도록 의도된다. 상세한 설명에서 섹션 분할들은 단지 리뷰의 용이함을 위한 것이고 논의된 엘리먼트들의 임의의 조합을 제한하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로" 는 의도된 목적을 위해 작동하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 따라서, 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체적인 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완전한 상태, 치수, 측정, 결과 등으로부터의 소수의 중요하지 않은 변형들을 허용한다. 수치 값들 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특징들에 대하여 사용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
용어 "것들" 은 하나보다 많은 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배치된" 은 그 의미 내에 "위치된" 을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "마이크로유체 디바이스" 또는 "마이크로유체 장치" 는 유체를 보유하도록 구성된 하나 이상의 별개의 마이크로유체 회로들을 포함하는 디바이스이고, 각각의 마이크로유체 회로는, 영역(들), 흐름 경로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및, 선택적으로는 유체에서 부유된 마이크로-객체들) 가 마이크로유체 디바이스의 안 및/또는 밖으로 흐르는 것을 허용하도록 구성된 적어도 1개의 포트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 유체적으로 서로 연결된 회로 엘리먼트들로 이루어진다. 통상적으로, 마이크로유체 디바이스의 마이크로유체 회로는 흐름 영역을 포함할 것이고, 이 흐름 영역은 마이크로유체 채널 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 것이고, 그리고 약 1 mL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 볼륨을 보유할 것이다. 특정 실시형태들에서, 마이크로유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 보유한다. 마이크로유체 회로는 마이크로유체 디바이스 내의 제 1 포트 (예를 들어, 인렛) 와 유체적으로 연결된 제 1 단부 및 마이크로유체 디바이스 내의 제 2 포트 (예를 들어, 아웃렛) 와 유체적으로 연결된 제 2 단부를 갖도록 구성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 미만의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 마이크로유체 회로를 갖는 마이크로유체 디바이스의 타입이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상) 을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 20 nL 내지 200 nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다.
마이크로유체 디바이스 또는 나노유체 디바이스는 본원에서 "마이크로유체 칩" 또는 "칩"; 또는 "나노유체 칩" 또는 "칩"으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "마이크로유체 채널" 또는 "흐름 채널" 은 수평 및 수직 치수들 양자 모두보다 상당히 더 긴 길이를 갖는 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역을 지칭한다. 예를 들어, 흐름 채널은 수평 또는 수직 치수 중 어느 하나의 길이의 적어도 5 배, 예를 들어 적어도 10 배 길이, 적어도 25 배 길이, 적어도 100 배 길이, 적어도 200 배 길이, 적어도 500 배 길이, 적어도 1,000 배 길이, 적어도 5,000 배 길이, 또는 더 길 수 있다. 일부 실시형태들에서, 흐름 채널의 길이는 그 사이의 임의의 범위를 포함하는, 약 50,000 마이크론 내지 약 500,000 마이크론의 범위에 있다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예를 들어, 약 150 내지 500 마이크론) 의 범위에 있고, 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론, 예를 들어 약 40 내지 약 150 마이크론의 범위에 있다. 흐름 채널은 마이크로유체 디바이스에서 다양한 상이한 공간적 구성들을 가질 수도 있고, 따라서 완벽히 선형 엘리먼트에 제한되지 않는다는 것이 주목된다. 예를 들어, 흐름 채널은 다음의 구성들: 커브, 벤드, 나선형, 경사, 쇠퇴, 포크 (예를 들어, 다수의 상이한 흐름 경로들), 및 이들의 임의의 조합 중 임의의 것을 갖는 하나 이상의 섹션들을 포함할 수도 있다. 또한, 흐름 채널은, 원하는 유체 흐름을 그 안에 제공하기 위해 넓히고 수축시키는, 그 경로를 따른 상이한 단면 영역들을 가질 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장애물"은 일반적으로 마이크로유체 디바이스 내의 2 개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이의 타겟 마이크로-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 방해하기에 충분히 큰 범프 또는 유사한 타입의 구조를 지칭한다. 2 개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은, 예를 들어 마이크로유체 격리 펜 및 마이크로유체 채널, 또는 마이크로유체 격리 펜의 연결 영역 및 단리 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수축 (constriction)" 은 일반적으로 마이크로유체 디바이스에서 회로 엘리먼트 (또는 2 개의 회로 엘리먼트들 사이의 인터페이스) 의 폭을 좁히는 것을 지칭한다. 수축은, 예를 들어 마이크로유체 격리 펜과 마이크로유체 채널 사이의 인터페이스에, 또는 마이크로유체 격리 펜의 단리 영역과 연결 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시 광이 통과될 때 가시 광이 광을 실질적으로 바꾸지 않고 통과하는 것을 허용하는 재료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로-객체"는 일반적으로 본 발명에 따라 단리 및 조정될 수 있는 임의의 마이크로스코픽 객체를 지칭한다. 마이크로-객체들의 비-제한적 예들은: 마이크로입자들; 마이크로비드들 (예를 들어, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들 등); 자기 비드들; 마이크로로드들; 마이크로와이어들; 양자 점들 등과 같은 무생물의 마이크로-객체들; 세포들 등과 같은 생물학적 마이크로-객체들; 생물학적 세포기관들; 소낭들, 또는 착물들; 합성 소낭들; (예를 들어, 막 표본들로부터 유래된 또는 합성의) 리포솜들; 지질 나노래프트들 등; 또는 무생물의 마이크로-객체들 및 생물학적 마이크로-객체들의 조합 (예를 들어, 세포들에 부착된 마이크로비드들, 리포솜-코팅된 마이크로-비드들, 리포솜-코팅된 자기 비드들 등) 을 포함한다. 비드들은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 모이어티들/분자들, 예컨대 형광 표지들, 단백질들, 탄수화물들, 항원들, 소분자 시그널링 모이어티들, 또는 검정에서 사용할 수 있는 화학적/생물학적 종들을 포함할 수도 있다. 리피드 나노라프트는 예를 들어 Ritchie 등 (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs," Methods Enzymol., 464:211-231 에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 용어 "생물학적 세포"와 상호 교환 가능하게 사용된다. 생물학적 세포의 비제한적인 예로는 진핵 세포, 식물 세포, 포유 동물 세포, 파충류 세포, 조류 세포, 물고기 세포 등과 같은 동물 세포, 원핵 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 원충 세포 등, 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직 등과 같은 조직으로부터 해리된 세포, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 대식세포 등의 면역 세포, 배아 (예를 들어 접합체), 난모세포, 난자, 정자 세포, 하이브리도마, 배양된 세포, 세포주의 세포, 암세포, 감염된 세포, 형질 감염된 세포 및/또는 형질 전환된 세포, 리포터 세포 등이 포함한다. 포유류 세포는 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등일 수 있다.
콜로니에서 번식할 수 있는 모든 살아있는 세포들이 단일의 부모 세포에서 유래한 딸 세포라면, 생물학적 세포들의 콜로니는 "클론 (clonal)"이다. 특정 실시형태들에서, 콜론 클로니의 모든 딸 세포들은 단일의 부모 세포들로부터 10 회 이상의 분열에 의해 유래된다. 다른 실시형태들에서, 콜론 클로니의 모든 딸 세포들은 단일의 부모 세포들로부터 14 회 이상의 분열에 의해 유래된다. 다른 실시형태들에서, 콜론 클로니의 모든 딸 세포들은 단일의 부모 세포들로부터 17 회 이상의 분열에 의해 유래된다. 다른 실시형태들에서, 콜론 클로니의 모든 딸 세포들은 단일의 부모 세포들로부터 20 회 이상의 분열에 의해 유래된다. 용어 "클론 세포들"은 동일한 클론 콜로니의 세포들을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 세포들의 "콜로니"는 2 개 이상의 세포들 (예를 들어, 약 2 내지 약 20, 약 4 내지 약 40, 약 6 내지 약 60, 약 8 내지 약 80, 약 10 내지 약 100, 약 20 내지 약 200, 약 40 내지 약 400, 약 60 내지 약 600, 약 80 내지 약 800, 약 100 내지 약 1000, 또는 1000 초과의 세포들) 을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포(들)를 유지하는" 은 세포들의 생존 및/또는 증식을 유지하는데 필요한 컨디션들을 제공하는 유체 및 기체 성분들 양자 모두, 및 선택적으로는 표면을 포함하는 환경을 제공하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포들을 언급할 때 용어 "팽창하는"은 세포 수의 증가를 지칭한다.
유체 배지의 "성분" 은, 용매 분자들, 이온들, 소분자들, 항생물질들, 뉴클레오티드들 및 뉴클레오시드들, 핵산들, 아미노산들, 펩티드들, 단백질들, 설탕들, 탄수화물들, 지질들, 지방산들, 콜레스테롤, 대사물들 등을 포함하는, 배지에 존재하는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자이다.
유체 배지를 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, "확산하다" 및 "확산" 은 농도 구배 아래의 유체 배지 성분의 열역학 운동을 지칭한다.
문구 "배지의 흐름" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘으로 인한 유체 배지의 벌크 이동을 의미한다. 예를 들어, 배지의 흐름은 포인트들 사이의 압력 차이로 인한 유체 배지의 한 포인트에서 다른 포인트로의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 흐름은 액체의 연속적인, 펄싱된, 주기적인, 랜덤한, 간헐적인, 또는 왕복 흐름, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 배지가 다른 유체 배지로 흐르는 경우, 배지의 터뷸런스 및 혼합이 초래될 수 있다.
문구 "실질적으로 흐르지 않음" 은, 시간 경과에 따라 평균화될 때, 유체 배지 안으로 또는 유체 배지 내에서 재료 (예를 들어, 관심 있는 분석물) 의 성분들의 확산 속도보다 작은 유체 배지의 흐름 속도를 지칭한다. 이러한 재료의 성분들의 확산 속도는, 예를 들어 온도, 성분들의 크기, 및 성분들과 유체 배지 간의 상호작용들의 강도에 의존할 수 있다.
마이크로유체 디바이스 내의 상이한 영역들을 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "유체적으로 연결된" 은, 상이한 영역들이 유체 배지와 같은 유체로 실질적으로 채워지는 경우, 유체의 단일 바디를 형성하도록 영역들 각각에서의 유체가 연결되는 것을 의미한다. 이것은, 상이한 영역들에서의 유체들 (또는 유체 배지) 이 반드시 조성이 동일한 것을 의미하지 않는다. 차라리, 마이크로유체 디바이스의 상이한 유체적으로 연결된 영역들에서의 유체들은, 용질들이 그들 각각의 농도 구배들을 하강시키고/시키거나 유체들이 디바이스를 통해 흐를 때 유입되는 상이한 조성들 (예를 들어, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
마이크로유체 (또는 나노유체) 디바이스는 "스윕 (swept)" 영역과 "비스윕 (unswept)" 영역을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "스윕 (swept)" 영역은, 마이크로유체 회로를 통해 유체가 흐를 때 각각이 배지의 흐름을 경험하는, 마이크로유체 회로의 하나 이상의 유체적으로 상호 연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 스윕 영역의 회로 엘리먼트들은 예를 들어 영역들, 채널들, 및 챔버들의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비스윕 (unswept)" 영역은, 마이크로유체 회로를 통해 유체가 흐를 때 각각이 어떠한 흐름의 플럭스도 실질적으로 경험하지 못하는, 마이크로유체 회로의 하나 이상의 유체적으로 상호 연결된 회로 엘리먼트들로 구성된다. 유체 연결들이 확산이 가능하지만 스윕 영역과 비스윕 영역 사이에서 배지가 실질적으로 흐르지 않게 구조화되어 있다면, 비스윕 영역은 스윕 영역에 유체적으로 연결될 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스는 스윕 영역과 비스윕 영역 사이에서 실질적으로 확산 유체 연통만을 가능하게 하면서, 스윕 영역에서의 배지의 흐름으로부터 비스윕 영역을 실질적으로 단리시키도록 구조화할 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 디바이스의 흐름 채널은 스윕 영역의 예인 한편, 마이크로유체 디바이스의 단리 영역 (이하에서 더 상세히 설명됨) 은 비스윕 영역의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "흐름 경로" 는 배지의 흐름의 궤적을 정의하고, 그것에 종속되는 하나 이상의 유체적으로 연결된 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 등) 을 지칭한다. 흐름 경로는 따라서 마이크로유체 디바이스의 스윕 영역의 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 비스윕 영역들) 은 흐름 경로 내의 배지의 흐름에 종속됨 없이 흐름 경로를 포함하는 회로 엘리먼트들과 유체적으로 연결될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "B"는 G (구아노신), C (시티딘) 및 T (티미딘) 뉴클레오티드에서 선택되는 뉴클레오티드이지만 A (아데닌) 는 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "H"는 A, C 및 T로부터 선택된 뉴클레오티드이지만 G는 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "D"는 A, G 및 T로부터 선택된 뉴클레오티드이지만 C는 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "K"는 G 및 T로부터 선택된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "N"은 A, C, G 및 T로부터 선택된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "R"은 A 및 G로부터 선택된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "S"는 G 및 C로부터 선택된 뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "V"는 A, G 및 C로부터 선택된 뉴클레오티드이지만 T는 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "Y"는 C 및 T로부터 선택된 뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단일의 뉴클레오티드를 나타내는데 사용되는 "I"는 이노신이다.
본원에서 사용된 바와 같이, A, C, T, G 에 뒤따르는 "*"는 그 뉴클레오티드의 인산 결합에서의 포스포로티오에이트 치환을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, IsoG는 이소구아노신이고; IsoC는 이소시티딘이고; IsodG는 이소구아노신 디옥시리보뉴클레오티드이고, 그리고 IsodC는 이소시티딘 디옥시리보뉴클레오티드이다. 이소구아노신 및 이소시티딘 리보- 또는 디옥시리보- 뉴클레오티드는 구아닌 핵염기 또는 시토신 핵염기에 대해 각각 이성질체인 핵염기를 포함하는데, 보통 RNA 또는 DNA 내에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, rG는 디옥시리보뉴클레오티드를 함유하는 핵산에 포함된 리보뉴클레오티드를 나타낸다. 모든 리보뉴클레오티드를 함유하는 핵산은 각각의 뉴클레오티드가 리보 뉴클레오티드임을 표시하는 표지를 포함하지 않을 수 있으며, 문맥에 의해 명확해진다.
본원에서 사용된 바와 같이, "프라이밍 서열"은 보다 큰 올리고뉴클레오티드의 일부인 올리고뉴클레오티드 서열이고, 그리고 프라이밍 서열이 유리 3' 말단을 포함하도록 큰 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 때, DNA (또는 RNA) 중합 반응에서 프라이머로서 기능할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, ㎛는 마이크로미터를 의미하고, ㎛3은 입방 마이크로미터를 의미하고, pL은 피코리터를 의미하고, nL은 나노리터를 의미하고, 그리고 μL (또는 uL) 은 마이크로리터를 의미한다.
로딩 방법. 비드에 한정되지 않지만 비드와 같은 생물학적 마이크로-객체 또는 마이크로-객체의 로딩 (loading) 은 본원에 기술된 바와 같이 유체 흐름, 중력, 유전영동 (DEP) 힘, 전기습윤 (electrowetting), 자기력 또는 이들의 임의의 조합의 사용을 수반할 수 있다. DEP 힘은 광전자 트위저들 (optoelectronic tweezers, OET) 구성에 의해서와 같이 광학적으로 작동될 수 있고, 및/또는 시간적/공간적 패턴의 전극들/전극 영역들의 활성화에 의해서와 같이 전기적으로 작동될 수 있다. 마찬가지로, 전기습윤 힘도 광전자 습윤 (OEW) 구성에 의해서와 같이 광학적으로 작동될 수 있고, 및/또는 시간적/공간적 패턴의 전극들/전극 영역들의 활성화에 의해서와 같이 전기적으로 작동될 수 있다.
이러한 디바이스를 조작하고 관찰하기 위한 마이크로유체 디바이스 및 시스템. 도 1a는 관심 항원에 결합하는 (예를 들어, 특이적으로 결합하는) 항체를 분비하는 항체 생산 세포들의 스크리닝 및 검출에 사용될 수 있는 시스템 (150) 및 마이크로유체 디바이스 (100) 의 예를 도시한다. 마이크로유체 디바이스 (100) 의 사시도는 마이크로유체 디바이스 (100) 안의 부분 뷰를 제공하도록 그 커버 (110) 의 부분 컷-어웨이를 갖고 도시된다. 마이크로유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 흐름 경로 (106) 를 포함하는 마이크로유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 흐름 경로를 통해 유체 배지 (180) 가 흘러 선택적으로, 하나 이상의 마이크로-객체들 (미도시) 을 마이크로유체 회로 (120) 안으로 운반하고/하거나 통과시킬 수 있다. 단일의 마이크로유체 회로 (120) 가 도 1a 에 예시되지만, 적합한 마이크로유체 디바이스들은 복수 (예를 들어, 2 또는 3) 의 이러한 마이크로유체 회로들을 포함할 수 있다. 관계없이, 마이크로유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스이도록 구성될 수 있다. 도 1a에 도시된 실시형태에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 각각 유로 (106) 와 유체 연통하는 개구 (예를 들어, 단일 개구) 를 갖는 복수의 마이크로유체 격리 펜들 (124, 126, 128 및 130) 을 포함한다. 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 마이크로유체 격리 펜들은, 배지 (180) 가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르고 있을 때에도, 마이크로유체 디바이스 (100) 와 같은 마이크로유체 디바이스 내에 마이크로-객체들을 보유하기 위해 최적화되어 있는 다양한 피처들 및 구조들을 포함한다. 그러나, 전술한 것을 시작하기 전에, 마이크로유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
일반적으로 도 1a 에 예시된 바와 같이, 마이크로유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에 도시된 예에서 인클로저 (102) 는 지지 구조 (104)(예를 들어, 베이스), 마이크로유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로 도시된다. 지지 구조 (104), 마이크로유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 회로 구조 (108) 는 지지 구조 (104) 의 내측 면 (109) 상에 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 구조 (108) 위에 배치될 수 있다. 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 마이크로유체 회로 구조 (108) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 마이크로유체 회로 (120) 의 하단에 있고 커버 (110) 는 상단에 있을 수 있다. 대안으로, 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 하단에 있을 수 있다. 관계없이, 인클로저 (102) 안 또는 밖으로의 통로를 각각 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 존재할 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole) 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 마이크로유체 회로 구조 (108) 에서 갭에 의해 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에 놓일 수 있다. 단지 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에 예시되지만, 마이크로유체 회로 (120) 는 2 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 회로 (120) 로 진입하는 유체에 대한 인렛으로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 존재할 수 있고, 마이크로유체 회로 (120) 를 나가는 유체에 대한 아웃렛으로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 존재할 수 있다. 포트 (107) 가 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하는지 여부는 유체가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르는 방향에 의존할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 하나 이상의 전극들 (미도시) 및 기질 또는 복수의 상호연결된 기질들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 하나 이상의 반도체 기질들을 포함할 수 있고, 이 기질들 각각은 전극에 전기적으로 연결된다 (예를 들어, 반도체 기질들의 전부 또는 서브세트는 단일 전극에 전기적으로 연결될 수 있다). 지지 구조 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들)은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
마이크로유체 회로 구조 (108) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은, 마이크로유체 회로 (120) 가 유체로 채워질 때 유체적으로 상호연결될 수 있는 공간들 또는 영역들을, 예컨대 (하나 이상의 흐름 채널들을 포함하거나 하나 이상의 흐름 채널들일 수도 있는) 흐름 영역들, 챔버들, 펜들, 트랩들 등을 포함할 수 있다. 도 1a 에 예시된 마이크로유체 회로 (120) 에서, 마이크로유체 회로 구조 (108) 는 프레임 (114) 및 마이크로유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 마이크로유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 인클로징할 수 있다. 프레임 (114) 은, 예를 들어 마이크로유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 둘러싸는 상대적으로 강성 구조일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
마이크로유체 회로 재료 (116) 는 마이크로유체 회로 (120) 의 상호연결들 및 회로 엘리먼트들을 정의하도록 캐비티들 등으로 패터닝될 수 있다. 마이크로유체 회로 재료 (116) 는, 기체 투과성일 수 있는 유연성 재료, 예컨대 유연성 폴리머 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 을 포함할 수 있다. 마이크로유체 회로 재료 (116) 를 구성할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (예를 들어, 포토-패턴 가능 실리콘 또는 "PPS") 과 같은 식각 가능 재료, 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 및 이에 따른 마이크로유체 회로 재료 (116) - 은 강성 및/또는 실질적으로 기체에 대해 불투과성일 수 있다. 관계없이, 마이크로유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 안에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 마이크로유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안으로, 커버 (110) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 과 동일한 또는 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조 (104) 는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 마이크로유체 회로 재료 (116) 로부터 별개의 구조이거나, 또는 프레임 (114) 또는 마이크로유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 마이크로유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에 도시된 바와 같이 별개의 구조들이거나 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 특성들을 갖는 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형 가능한 재료는 폴리머, 예컨대 PDMS 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형 가능한 재료들 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예를 들어, 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 위에 위치된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이스하는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에 코팅될 수도 있는, 전도성 산화물, 예컨대 인듐-틴-옥사이드 (ITO) 를 포함할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 전극들은, 변형 가능한 재료, 예컨대 폴리머 (예를 들어, PDMS) 에 임베딩된, 유연성 전극들, 예컨대 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기적으로 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 이들의 조합들일 수 있다. 마이크로유체 디바이스들에서 사용될 수 있는 유연성 전극들은, 예를 들어 미국 2012/0325665 (Chiou 등) 에서 설명되어 있고, 이 내용들은 참조로서 본원에 통합된다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존성 및/또는 성장을 지원하도록 (예를 들어, 마이크로유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 부분을 컨디셔닝함으로써) 변경될 수 있다. 이 변경은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조체 (104) 는 광에 대해 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 또한 가스 투과성인 적어도 하나의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수 있다.
도 1a 는 또한, 마이크로유체 디바이스들, 예컨대 마이크로유체 디바이스 (100) 를 동작 및 제어하는 시스템 (150) 을 나타낸다. 시스템 (150) 은 전기 전원 (192), 촬상 디바이스 (194) (촬상 모듈 (164) 내에 통합된, 여기서 디바이스 (194) 는 도 1a 자체에는 도시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 내에 통합됨, 여기서 디바이스 (190) 는 도 1 에 도시되지 않음) 를 포함한다.
전기 전원 (192) 은, 필요에 따라 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공하는, 마이크로유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 전기 전력을 제공할 수 있다. 전기 전원 (192) 은, 예를 들어 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 공급원들을 포함할 수 있다. 촬상 디바이스 (194) (이하에 논의되는 촬상 모듈 (164) 의 부분) 는 마이크로유체 회로 (120) 내의 이미지들을 캡처하기 위한 디바이스, 예컨대 디지털 카메라를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 (예를 들어, 낮은 광 애플리케이션들에 대해) 빠른 프레임 속도 및/또는 고 감도를 갖는 검출기를 더 포함한다. 촬상 디바이스 (194) 는 또한, 시뮬레이팅 방사 및/또는 광 빔들을 마이크로유체 회로 (120) 로 지향시키고 마이크로유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 마이크로-객체들) 로부터 반사 또는 방출된 방사 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방출된 광선은 가시 광선 스펙트럼 일 수 있으며, 예를 들어, 형광 방출을 포함할 수 있다. 반사된 광선은 수은 램프 (예를 들어, 고압 수은 램프) 또는 크세논 아크 램프와 같은 LED 또는 광역 스펙트럼 램프에서 비롯된 반사 방출을 포함할 수 있다. 도 3b 와 관련하여 논의된 바와 같이, 촬상 장치 (194) 는 접안 렌즈를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 현미경 (또는 광학 트레인) 을 더 포함할 수 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전축을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 회전 시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (후술되는 틸팅 모듈 (166) 의 일부) 를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 마이크로유체 디바이스 (100) (및 이로써 마이크로유체 회로 (120)) 가 레벨 방향 (즉, x 및 y 축에 대해 0°), 수직 방향 (즉, x 축 및/또는 y 축에 대해 90°) 또는 그 사이의 임의의 방향으로 유지될 수 있도록 적어도 하나의 축을 중심으로 마이크로유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 유지하도록 구성된다. 축에 대한 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120)) 의 방향은 본 명세서에서 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120)) 의 "틸트"로 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 마이크로유체 디바이스 (100) 를 x 축에 대해 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90°또는 그 사이의 임의의 각도로 기울일 수 있다. 레벨 방향 (따라서 x 및 y 축) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 수직으로 정의됩니다. 틸팅 디바이스는 또한 x-축 및/또는 y-축에 대해 90°보다 큰 임의의 각도로 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120)) 를 기울이거나, 또는 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120) 를 완전히 반전시키기 위해 x-축 또는 y-축에 대해 180°로 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120) 를 기울인다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유로 (106) 또는 마이크로유체 회로 (120) 의 일부 다른 부분에 의해 정의된 회전축에 대해 마이크로유체 디바이스 (100) (및 마이크로유체 회로 (120)) 를 기울인다.
일부 예에서, 마이크로유체 디바이스 (100) 는 유로 (106) 가 하나 이상의 격리 펜의 위 또는 아래에 위치하도록 수직 배향으로 경사진다. 본 명세서에서 사용되는 "위"라는 용어는 유로 (106) 가 중력에 의해 정의되는 수직축상의 하나 이상의 격리 펜보다 높게 위치됨을 의미한다 (즉, 유로 (106) 위의 격리 펜의 물체는 중력 전위가 유동 경로에 있는 물체보다 높다). 본 명세서에서 사용되는 "아래"라는 용어는 유로 (106) 가 중력에 의해 정의되는 수직축 상에 하나 이상의 격리 펜보다 낮게 위치됨을 의미한다 (즉, 유로 (106) 아래의 격리 펜 내의 물체는 중력 위치 에너지는 흐름 경로 내의 물체보다 낮다).
일부 예에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유로 (106) 에 평행한 축을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 기울인다. 또한, 마이크로유체 디바이스 (100) 는 유로 (106) 가 격리 펜의 바로 위 또는 아래에 위치하지 않고 하나 이상의 격리 펜의 위 또는 아래에 위치하도록 90°미만의 각도로 기울어질 수 있다. 다른 예에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 마이크로유체 디바이스 (100) 를 유동 경로 (106) 에 수직인 축을 중심으로 기울인다. 또 다른 예에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 유로 (106) 에 평행하지도 수직하지도 않은 축을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 기울인다.
시스템 (150) 은 배지 공급원 (178) 을 더 포함할 수 있다. 배지 공급원 (178)(예를 들어, 콘테이너, 저장고 등) 은 상이한 유체 배지 (180) 를 각각 홀딩하기 위해 다수의 섹션들 또는 콘테이너들을 포함할 수 있다. 따라서, 배지 공급원 (178) 은 도 1a 에 예시된 바와 같이, 마이크로유체 디바이스 (100) 밖에 있는 그리고 이로부터 별개인 디바이스일 수 있다. 대안으로, 배지 공급원 (178) 은 마이크로유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 배지 공급원 (178) 은 마이크로유체 디바이스 (100) 의 부분인 저장고들을 포함할 수 있다.
도 1a 는 또한, 시스템 (150) 의 부분을 구성하고 마이크로유체 디바이스 (100) 와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 단순화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들은 다른 제어 및 모니터링 장비, 예컨대 배지 공급원 (178) 을 제어하기 위한 배지 모듈 (160), 마이크로유체 회로 (120) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 및/또는 배지 (예를 들어, 배지의 액적들) 의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈 (162), 이미지들 (예를 들어, 디지털 이미지들) 을 캡처하는 촬상 디바이스 (194) (예를 들어, 카메라, 현미경, 광원 또는 이들의 임의의 조합) 를 제어하기 위한 촬상 모듈 (164), 및 틸팅 디바이스 (190) 를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166) 을 제어할 수 있는 마스터 제어기 (154) 를 포함한다. 제어 장비 (152) 는 또한, 마이크로유체 디바이스 (100) 에 대하여 제어, 모니터링, 또는 다른 기능들을 수행하기 위한 다른 모듈들 (168) 을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152) 는 디스플레이 디바이스 (170) 및 입/출력 디바이스 (172) 를 더 포함할 수 있다.
마스터 제어기 (154) 는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158) 를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드웨어 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 마이크로유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에 설명된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션 또는 단계에서 사용된 데이터를 송신 및 수신하도록 통신 가능하게 커플링될 수도 있다.
배지 모듈 (160) 은 배지 공급원 (178) 을 제어한다. 예를 들어, 배지 모듈 (160) 은 선택된 유체 배지 (180) 를 (예를 들어, 인렛 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 안으로 입력하도록 배지 공급원 (178) 을 제어할 수 있다. 또한, 배지 모듈 (160) 은 (예를 들어, 아웃렛 포트 (미도시) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터 배지의 제거를 제어할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 배지는 선택적으로 마이크로유체 회로 (120) 안으로 입력되고 이로부터 제거될 수 있다. 또한, 배지 모듈 (160) 은 마이크로유체 회로 (120) 내의 흐름 경로 (106) 에서의 유체 배지 (180) 의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서 배지 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 원하는 각도의 기울기로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 전에 인클로저 (120) 를 통해 그리고 흐름 경로 (106) 에서의 배지 (180) 의 흐름을 정지시킨다.
동기 모듈 (162) 은 마이크로유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체들 (미도시) 의 선택, 트랩핑, 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 를 참조하여 이하에 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전자 트위저들 (OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1a 에 미도시) 을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162) 은 흐름 경로 (106) 및/또는 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 에서 배지 (미도시)의 액적 (droplet) 들 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택 및 이동시키도록 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예를 들어, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
촬상 모듈 (164) 은 촬상 디바이스 (194) 를 제어할 수 있다. 예를 들어, 촬상 모듈 (164) 은 촬상 디바이스 (194) 로부터 이미지 데이터를 수신 및 프로세싱할 수 있다. 촬상 디바이스 (194) 로부터의 이미지 데이터는 촬상 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보의 임의의 타입 (예를 들어, 마이크로-객체들의 존재 또는 부재, 배지의 액적들, 형광 표지와 같은 표지의 축적 등) 을 포함할 수 있다. 촬상 디바이스 (194) 에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 촬상 모듈 (164) 은 또한, 객체들 (예를 들어, 마이크로-객체들, 배지의 액적들) 의 포지션 및/또는 마이크로유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 모션 속도를 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 모션들을 제어할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 속도 및 타이밍을 제어하여, 중력들을 통해 하나 이상의 격리 펜들로의 마이크로-객체들의 트랜스퍼를 최적화할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 마이크로유체 회로 (120) 에서 배지의 액적들 및/또는 마이크로-객체들의 모션을 설명하는 데이터를 수신하도록 촬상 모듈 (164) 과 통신 가능하게 커플링된다. 이 데이터를 사용하여, 틸팅 모듈 (166) 은, 마이크로-객체들 및/또는 배지의 액적들이 마이크로유체 회로 (120) 에서 이동하는 속도를 조정하기 위해 마이크로유체 회로 (120) 의 틸트를 조정할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한, 이 데이터를 사용하여 마이크로유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체 및/또는 배지의 액적의 포지션을 반복적으로 조정할 수도 있다.
도 1a 에 도시된 예들에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 마이크로유체 채널 (122) 및 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시된다. 각각의 펜은 채널 (122) 에 대한 단일의 개구를 포함하지만, 다르게는 펜들이 펜 내부의 마이크로-객체들을 채널 (122) 의 흐름 경로 (106) 내 또는 다른 펜들 내의 마이크로-객체들 및/또는 유체 배지 (180) 로부터 실질적으로 격리할 수 있도록 인클로징된다. 격리 펜의 벽들은 베이스의 내부 표면 (109) 로부터 커버 (110) 의 내측 표면까지 연장되어 인클로저를 제공한다. 채널 (122) 에 대한 펜의 개구는 흐름 (106) 이 펜들로 지향되지 않도록 유체 배지 (180) 의 흐름 (106) 에 대해 소정 각도로 배향된다. 그 흐름은 펜의 개구의 평면에 접하거나 직교할 수도 있다. 일부 경우들에서, 펜들 (124, 126, 128, 130) 은 마이크로유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 마이크로-객체들을 물리적으로 몰아넣도록 구성된다. 본 발명에 따른 격리 펜들은, 이하에서 상세히 논의 및 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 및/또는 중력들과의 사용을 위해 최적화되는 다양한 형상들, 표면들 및 피처들을 포함할 수 있다.
마이크로유체 회로 (120) 는 임의의 수의 마이크로유체 격리 펜들을 포함할 수 있다. 5 개의 격리 펜들이 도시되어 있지만, 마이크로유체 회로 (120) 는 더 적거나 더 많은 격리 펜들을 가질 수 있다. 도시된 바와 같이, 마이크로유체 회로 (120) 의 마이크로유체 격리 펜들 (124, 126, 128 및 130) 은 각각 다른 항체 생산 세포로부터 하나의 항체 생산 세포를 분리하는 것과 같이 항체 생산 세포들을 스크리닝하는데 유용한 하나 이상의 이점을 제공할 수 있는 상이한 특징 및 형상을 포함한다. 마이크로유체 격리 펜들 (124, 126, 128 및 130) 은 단일 세포 로딩 및/또는 항체 생산 세포들의 콜로니들 (예를 들어, 클론 콜로니들) 의 성장을 촉진하는 것과 같은 다른 이점을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 마이크로유체 격리 펜들을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 복수의 마이크로유체 격리 펜들을 포함하며, 여기서 2 이상의 격리 펜들은 항체 생산 세포들을 스크리닝하는데 있어서의 상이한 이익들을 제공하는 상이한 구조들 및/또는 특징들을 포함한다. 항체 생산 세포들을 스크리닝하는데 유용한 마이크로유체 디바이스들은 격리 펜들 (124, 126, 128 및 130) 또는 그 변형예 중 임의의 것을 포함할 수 있고, 및/또는 아래에 논의된 바와 같이 도 2b, 2c, 2d, 2e 및 2f 에 도시된 것과 같이 구성된 펜들을 포함할 수 있다.
도 1a에 도시된 실시형태에서, 단일 채널 (122) 및 흐름 경로 (106) 가 도시되어 있다. 그러나, 다른 실시형태들은 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있고, 채널들 각각은 흐름 경로 (106) 를 포함하도록 구성된다. 마이크로유체 회로 (120) 는 흐름 경로 (106) 및 유체 배지 (180) 와 유체 연통하는 인렛 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함하고, 이로써 유체 배지 (180) 는 인렛 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 에 접근할 수 있다. 일부 경우들에서, 흐름 경로 (106) 는 단일의 경로를 포함한다. 일부 경우들에서, 그 단일의 경로는 지그재그 패턴으로 배열되고, 이에 의해 흐름 경로 (106) 는 교번하는 방향들에서 2 회 이상 마이크로유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다.
일부 경우들에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 흐름 경로들 (106) 을 포함하며, 여기서 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 배지 (180) 는 동일한 방향으로 흐른다. 일부 경우들에서, 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 배지는 순방향 또는 역방향 중 적어도 하나로 흐른다. 일부 경우들에서, 복수의 격리 펜들은, 격리 펜들이 타겟 마이크로-객체들과 병렬로 로딩될 수 있도록 (예를 들어, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 마이크로유체 회로 (120) 는 하나 이상의 마이크로-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 마이크로유체 격리 펜들 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구 반대편에 위치될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 단일의 마이크로-객체를 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 복수의 마이크로-객체들을 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 체적과 거의 동일한 체적을 포함한다.
트랩들 (132) 은 타겟이 되는 마이크로-객체들의 트랩들 (132) 안으로의 흐름을 돕도록 구성되는 개구를 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 갖는 개구를 포함하고, 이에 의해 더 큰 마이크로-객체들이 마이크로-객체 트랩 안으로 진입하는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에 타겟이 되는 마이크로-객체들의 보유를 돕도록 구성된 다른 피처들을 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 채널 (122) 에 평행한 축을 중심으로 마이크로유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 때, 트랩된 마이크로-객체가, 마이크로-객체로 하여금 격리 펜의 개구 안으로 들어가게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 나가도록, 마이크로유체 격리 펜의 개구에 대해 채널 (122) 의 반대 측에 놓이고 이와 정렬된다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 트랩 (132) 을 통한 흐름을 용이하게 하고 이에 의해 트랩 (132) 에서 마이크로-객체를 캡처하는 가능성을 증가시키기 위해 타겟 마이크로-객체보다 더 작은 사이드 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들이 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 (예를 들어, 흐름 경로에서 및/또는 격리 펜들에서) 유체 배지 (180) 를 가로질러 인가되어 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 단일의 마이크로-객체를 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 마이크로유체 격리 펜 안으로 트랜스퍼하기 위해 마이크로유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 DEP 힘들이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 마이크로-객체가 챔버로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 본 발명의 교시들에 따라 이전에 수집되었던 마이크로-객체를 격리 펜로부터 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광전기습윤 (OEW) 힘들은 마이크로유체 회로 (120) 내에 위치된 액적들을 조작, 수송, 분리 및 소팅하기 위해 하나 이상의 전극들 (도시하지 않음) 을 통해 마이크로유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들 (예를 들어, 흐름 경로 및/또는 격리 펜들을 정의하는 것을 돕는 위치들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 마이크로유체 격리 펜 내로 단일의 액적을 이송하기 위해 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, OEW 힘들은 본 발명의 교시들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 격리 펜로부터 선택적으로 제거하기 위해 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 마이크로유체 회로 (120) 내의 액적들 및/또는 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하도록, 다른 힘들, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 결합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 흐름 경로 (106)) 및 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 마이크로유체 격리 펜들 위에 위치시키도록 (예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력의 힘은 마이크로-객체들 및/또는 액적들을 펜들 안으로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 후에 인가될 수 있다. 또 다른 경우들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 마이크로유체 디바이스들의 여러 실시형태들을 도시한다. 도 1b 는 마이크로유체 디바이스 (200) 가 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스로서 구성되는 실시형태를 묘사한다. 광전 트위저 (OET) 구성을 갖는 디바이스들 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 디바이스들을 포함하는 여러 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스들이 본 기술에서 알려져 있다. 적합한 OET 구성들의 예들은 각각 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 다음의 미국 특허 문서들에 예시된다: 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등) (US 특허 제 7,612,355 호로서 특허됨); 및 US 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 양자 모두가 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 미국 특허 제 6,958,132 (Chiou 등) 및 US 특허 출원 공개 제 2012/0024708 호 (Chiou 등) 에 예시되어 있다. 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스의 또 다른 예는 결합된 OET/OEW 구성을 포함하며, 이것의 예들은 미국 특허 공보들 제 20150306598 호 (Khandros 등) 및 제 20150306599 호 (Khandros 등) 및 그들의 대응하는 PCT 공보들 WO2015/164846 호 및 WO2015/164847 호에 도시되며, 이들 모두는 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다.
항체 생산 세포들을 배치, 배양, 모니터링 및/또는 스크리닝할 수 있는 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스의 예들은 예를 들어 미국 특허 출원 제 14/060,117 호, 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호에 기재되어 있으며, 그 각각은 본 명세서에서 그 전체가 참조로 인용된다. 상기 출원들 각각은 광전 트위저들 (OET) 과 같은 유전영동 (DEP) 힘들을 생산하도록 구성되거나 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 마이크로유체 디바이스들을 더 기술한다. 예를 들어, US 출원 No. 14/060,117 의 도 2 에 도시된 광전 트위저 디바이스는 개개의 생물학적 마이크로-객체 또는 생물학적 마이크로-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 발명의 실시형태들에서 이용될 수 있는 디바이스의 예이다.
마이크로유체 디바이스 동기 구성들. 전술된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링 장비는 마이크로유체 디바이스의 마이크로유체 회로에서, 마이크로-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택 및 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 마이크로유체 디바이스는, 이동되고 있는 객체의 타입 및 다른 고려사항들에 따라, 다양한 동기 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 마이크로유체 회로에서 마이크로-객체들을 선택하고 이동시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 (120) 내의 유체 배지 (180) 내의 마이크로-객체들상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 마이크로-객체들 또는 마이크로-객체들의 그룹들을 선택, 캡처, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 마이크로유체 회로 (120) 에서의 유체 배지 (180) 내의 액적들 상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택, 캡처, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 마이크로유체 디바이스 (200) 의 하나의 예가 도 1b 및 도 1c 에 도시된다. 간단성의 목적으로, 도 1b 및 도 1c 는 개구 영역/챔버 (202) 를 갖는 마이크로유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의, 각각, 측단면도 및 평면 단면도를 도시하지만, 그 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 격리 펜, 흐름 영역, 또는 흐름 채널과 같은 더 상세한 구조를 갖는 유체 회로 엘리먼트의 부분일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 마이크로유체 디바이스 (200) 는, 마이크로유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에 설명된 바와 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 격리 펜들 및/또는 하나 이상의 흐름 영역들 또는 흐름 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 마이크로유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 안에 통합되거나, 또는 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위 또는 아래에 설명된 마이크로유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나는 마이크로유체 디바이스 (200) 에 통합되고/되거나 이와 결합되어 사용될 수도 있다는 것이 또한 인식되어야 한다. 예를 들어, 전술된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은, 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중 하나 이상을 포함하는 마이크로유체 디바이스 (200) 와 함께 사용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 있는 전극 활성화 기질 (206) 을 갖는 지지 구조 (104), 및 하단 전극 (204) 으로부터 떨어져 이격된 상단 전극 (210) 을 갖는 커버 (110) 를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기질 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 반대 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에 포함된 배지 (180) 는 따라서, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기질 (206) 간의 저항성 연결을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 연결되고 영역/챔버 (202) 에서 DEP 힘들의 생성에 필요한 바와 같은 전극들 간의 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은, 예를 들어 교류 (AC) 전원일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에 예시된 마이크로유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화 및 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다). 도 1c 에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 위로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 DEP 전극 영역들 (214a)(화이트로 도시됨) 을 선택적으로 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214)(십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기질 (206) 을 통한 (즉, 하부 전극 (204) 으로부터 흐름 영역 (106) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은, 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 작은 전극 활성화 기질 (206) 을 통한 감소된 상대적 임피던스를 보인다.
전원 (212) 이 활성화됨에 따라, 상기 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 배지 (180) 에서 전계 구배를 생성하고, 이것은 이어서 유체 배지 (180) 에서 부근의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 로컬 DEP 힘들을 생성한다. 유체 배지 (180) 내의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광원 (216) 으로부터 마이크로유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 부근의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는, 배지 (180) 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 파라미터들에 의존할 수 있다.
도 1c 에 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 단지 일 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴이 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명 (및 이에 의해 활성화) 될 수 있고, 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경 또는 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기질 (206) 은 광전도 재료를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 은 특색이 없을 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기질 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴 및 수는 고정될 필요가 없고, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허 제 RE 44,711 (Wu 등)(미국 특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨) 에서 설명되어 있고, 이 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기질 (206) 은 복수의 도핑된 층들, 전기적으로 절연 층들 (또는 영역들), 및 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은 반도체 집적 회로들을 형성하는 전기적으로 전도성 층들을 포함하는 기질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기질 (206) 은 예를 들어, 측방 바이폴러 포토레지스터들을 포함하는 복수의 포토레지스터들을 포함할 수 있고, 포토레지스터들 각각은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 대안으로, 전극 활성화 기질 (206) 은 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예를 들어, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 전극 활성화 기질 (206) 은 이러한 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같이 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, 전기 회로 엘리먼트들은 하단 전극 (210) 과 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 간의 전기적 연결들을 형성할 수 있고, 이들 전기적 연결들 (즉, 포토레지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않은 경우, 각각의 전기적 연결은, 전극 활성화 기질 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터 영역/챔버 (202) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218) 에서 광에 의해 활성화되는 경우, 전극 활성화 기질 (206) 을 통한 상대적 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 더 작고, 이에 의해 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 DEP 전극을 활성화시킨다. 따라서, 배지 (180) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 의 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토레지스터들을 포함하는 전극 활성화 기질들을 갖는 마이크로유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 7,956,339 (Ohta 등) (예를 들어, 도 21 및 도 22, 그 설명들에 예시된 디바이스 (300) 를 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다. 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기질들을 갖는 마이크로유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허공개 제 2014/0124370 (Short 등) (예를 들어, 도면들 전체에 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
DEP 구성된 마이크로유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이고, 전극 활성화 기질 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이고, 하나 또는 양자 모두의 전극 활성화 기질 (206) 및/또는 전극 (210) 은 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이다. 또한, 광원 (216) 은 대안으로 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하도록 사용될 수 있다.
DEP 구성을 갖는 도 1b 및 도 1c 의 마이크로유체 디바이스 (200) 로, 동기 모듈 (162) 은, 마이크로-객체를 둘러싸고 캡처하는 패턴 (예를 들어, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화시키도록 광 패턴 (218) 을 디바이스 (200) 로 프로젝팅함으로써 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 에서 마이크로-객체 (미도시) 를 선택할 수 있다. 동기 모듈 (162) 은 그 후, DEP 전극 영역들 (214) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화시키도록 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 캡처된 마이크로-객체를 이동시킬 수 있다. 대안으로, 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 전극 활성화 기질 (206) 의 내측 면 (208) 에서 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기질 (206) 은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예를 들어, 커버 (110)) 의 반대편에 위치된 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서 DEP 전극들을 활성화 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방 및 폐쇄될 수도 있고, 이에 의해 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 내의 마이크로-객체 (미도시) 상에 순 (net) DEP 힘을 생성한다. 영역/챔버 (202) 에서 마이크로-객체들 및/또는 배지 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 특징들에 따라, DEP 힘은 부근의 마이크로-객체를 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내의 하나 이상의 마이크로-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트랩 및 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어하고, 따라서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택, 트랩, 및 이동시키도록 DEP 전극들 중 개별의 전극들을 활성화 및 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제 6,294,063 (Becker 등) 및 6,942,776 (Medoro) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
또 다른 예로서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 전기습윤 (EW) 구성을 가질 수 있으며, 이것은 DEP 구성 대신일 수 있거나 DEP 구성을 갖는 부분으로부터 분리된 마이크로유체 디바이스 (200) 의 부분에 위치될 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 또는 유전체상의 전기습윤 (EWOD) 구성일 수도 있으며, 이들 양자는 본 기술에서 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조 (104) 는 유전체층 (미도시) 과 하부 전극 (204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기질 (206) 을 갖는다. 유전체층은 소수성 재료를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들 (200) 의 경우, 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 은 유전체층의 내부 표면 또는 그것의 소수성 코팅이다.
유전체층 (미도시) 은 하나 이상의 산화물 층들을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 125 nm 내지 약 175 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물) 과 같은 산화물의 층을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 실리콘 산화물 또는 질화물과 같은, 금속 산화물 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/채널 (202) 를 향해 내부로 마주하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오리네이티드 카본 분자들을 포함할 수 있다. 플루오리네이티드 카본 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라하이드로퓨란) (예를 들어, CYTOPTM) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수성 재료를 구성하는 분자들은 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스폰산 기, 또는 티올 기와 같은 연결자에 의해 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-말단 실록산, 알킬-말단 포스폰산, 또는 알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일킬기는 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22 개 또는 그 이상의 탄소들의 사슬을 갖는) 긴-사슬 탄화수소들일 수 있다. 대안으로, 플루오리네이티드 (또는, 퍼플루오리네이티드) 카본 사슬들이 알킬 기들을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-말단 실록산, 플루오로알킬-말단 포스폰산, 또는 플루오로알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 마찬가지로 소수성 재료 (미도시) 로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조 (104) 의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조 (104) 의 유전체층상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 커버 (110) 는 지지 구조 (104) 의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기질 (206) 을 포함할 수 있다. 커버 (110) 의 전극 활성화 기질 (206) 및 유전체층은 지지 구조 (104) 의 전극 활성화 기질 (206) 및 유전체층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 따라서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기질 (206) 은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정 실시형태들에서, 전극 활성화 기질 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 대안으로, 전극 활성화 기질 (206) 은 상술된 바와 같이 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들 (예를 들어, 도전성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 및/또는 본 기술에서 알려져 있는 전극 활성화 기질들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 여기에 포힘되는 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 는 a-Si:H 와 같은 광도전성 재료를 갖는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 상술된 미국 특허 공보 제 2014/0124370 호 (Short 등) 는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들을 갖는 전극 활성화 기질들을 개시한다.
따라서, 마이크로유체 디바이스 (200) 는 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기질 (206) 에서의 광도전성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전극 활성화 기질 (206) 의 그러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤력을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기질 (206) 상에 입사하는 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대해 마이크로유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예를 들어, 수성 배지, 용액, 또는 용매를 포함하는) 액적들이 영역/챔버 (202) 에 존재하는 비혼성 유체 (예를 들어, 오일 배지) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기질 (206) 은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기질 (206) 은 따라서 그러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같은 열들 및 행들로 배열된 실질적으로 정사각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, EW 전극들은 전기 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판 내의 트랜지스터 스위치들) 에 의해 선택적으로 활성화 (또는 활성화해제) 될 수 있다. 전극 활성화 기질 (206) 내의 EW 전극들을 선택적으로 활성화 및 활성화해제함으로써, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (미도시) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 그러한 스위치들을 제어할 수 있고 따라서 영역/챔버 (202) 주위의 특정의 액적들을 선택하고 이동시키기 위해 개개의 EW 전극들을 활성화 및 활성화해제할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 갖는 마이크로유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 8,685,344 호 (Sundarsan 등) 에 기술되었으며, 이것의 전체 내용들은 참조에 의해 여기에 포함된다.
마이크로유체 디바이스 (200) 의 구성에 관계없이, 전원 (212) 은 마이크로유체 디바이스 (200) 의 전기 회로들에 전력을 공급하는 전위 (예를 들어, AC 전압 전위) 를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전원 (212) 은 도 1 에서 참조되는 전원 (192) 과 동일하거나, 그 전원의 컴포넌트일 수 있다. 전원 (212) 은 상부 전극 (210) 및 하부 전극 (204) 에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우, 전원 (212) 은 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 내에서 개개의 마이크로-객체들 (미도시) 을 트랩하고 이동시키며, 및/또는 또한 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 에서 지지 구조 (104) (예를 들어, 유전체층 및/또는 유전체층상의 소수성 코팅) 의 내부 표면 (208) 의 습윤 특성들을 변경하기에 충분히 강한 네트 DEP 힘들 (또는 습윤력들) 을 발생시키기에 충부난 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예를 들어, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 본 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 호 (Wu 등) (미국특허 제 7,612,355 호로서 이슈됨), 및 미국 특허 출원 공개 US2014/0124370 호 (Short 등), US2015/0306598 호 (Khandros 등) 및 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 를 참조한다.
격리 펜들. 일반적인 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한 예들은 도 2a 내지 도 2c 에 도시된 마이크로유체 디바이스 (230) 내에 도시된다. 각각의 격리 펜 (224, 226, 및 228) 는 단리 영역 (240) 및 단리 영역 (240) 을 채널 (122) 에 유체적으로 연결시키는 연결 영역 (236) 을 정의하는 단리 구조 (232) 를 포함할 수 있다. 연결 영역 (236) 은 채널 (122) 로의 근위 (proximal) 개구 (234) 및 단리 영역 (240) 로의 원위 (distal) 개구 (238) 를 포함할 수 있다. 연결 영역 (236) 은, 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224, 226, 228) 안으로 흐르는 유체 배지 (미도시) 의 흐름의 최대 침투 깊이가 단리 영역 (240) 안으로 확장하지 않도록 구성될 수 있다. 따라서, 연결 영역 (236) 으로 인해, 격리 펜 (224, 226, 228) 의 단리 영역 (240) 에 배치된 마이크로-객체 (미도시) 또는 다른 재료 (미도시) 는 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름으로부터 단리될 수 있고, 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 은 각각 채널 (122) 에 대해 직접 개방하는 단일 개구를 갖는다. 격리 펜의 개구는 채널 (122) 로부터 측면방향으로 개방된다. 전극 활성화 기질 (206) 은 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 및 228) 양자의 아래에 놓인다. 격리 펜의 바닥을 형성하는, 격리 펜의 인클로저 내의 전극 활성화 기질 (206) 의 상부 표면은 마이크로유체 디바이스의 흐름 채널 (또는 각각, 흐름 영역) 의 바닥을 형성하는, 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 영역) 내의 전극 활성화 기질 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에 배치된다. 전극 활성화 기질 (206) 은 피쳐리스 (featureless) 일 수도 있거나 그것의 최고 고도로부터 그것의 최저 함몰부까지 약 3 마이크론 이하만큼, 2.5 마이크론, 2 마이크론, 1.5 마이크론, 1 마이크론, 0.9 마이크론, 0.8 마이크론, 0.7 마이크론, 0.6 마이크론, 0.5 마이크론, 0.4 마이크론, 0.3 마이크론, 0.2 마이크론, 0.1 마이크론 이하만큼 변화하는 불규칙적이거나 패터닝된 표면을 가질 수도 있다. 채널 (122) (또는 흐름 영역) 및 격리 펜들 양자에 걸친 기질의 상부 표면에서의 고도의 변동은 격리 펜의 벽들 또는 마이크로유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 보다 작을 수도 있다. 마이크로유체 디바이스 (200) 에 대해 상세히 설명되지만, 이것은 또한 여기에 기술된 마이크로유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290) 중 임의의 것에 적용된다.
따라서, 채널 (122) 은 스윕 영역의 일 예일 수 있고, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 단리 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 주목된 바와 같이, 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 배지 (180) 를 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2a 및 도 2b 에 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 채널 (122) 에 연결되고 유체 배지 (180) 가 마이크로유체 디바이스 (230) 안으로 도입되거나 이로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 배지 (180) 의 도입 전에, 마이크로유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍될 수도 있다. 일단, 마이크로유체 디바이스 (230) 가 유체 배지 (180) 를 포함하면, 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 선택적으로 생성 및 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 포트들 (222) 은 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예를 들어, 반대편 단부들) 에 배치될 수 있고, 배지의 흐름 (242) 은 인렛로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 아웃렛으로서 기능하는 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 발명에 따른 격리 펜 (224) 의 일 예의 상세 뷰를 예시한다. 또한, 마이크로-객체들 (246) 의 예들이 도시된다.
알려진 바와 같이, 격리 펜 (224) 의 근위 개구 (234) 를 지나 마이크로유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 격리 펜 (224) 의 안 및/또는 밖으로의 배지 (180) 의 세컨더리 흐름 (244) 을 야기할 수 있다. 격리 펜 (224) 의 단리 영역 (240) 에서 마이크로-객체들 (246) 을 세컨더리 흐름 (244) 으로부터 단리시키기 위해, (즉, 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 로의) 격리 챔버 (224) 의 연결 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (244) 의 연결 영역 (236) 안으로의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야 한다. 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 는 채널 (122) 에서 흐르는 유체 배지 (180) 의 속도 및 채널 (122) 및 채널 (122) 에 대한 연결 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 의 구성에 관련한 다양한 파라미터들에 의존한다. 소정의 마이크로유체 디바이스에 대해, 채널 (122) 및 개구 (234) 의 구성들은 고정될 것이지만 반면에, 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도는 가변적일 것이다. 이에 따라서, 각각의 격리 챔버 (224) 에 대해, 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 대한 최대 속도 (Vmax) 는, 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 가 연결 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 를 초과하지 않는 것을 보장하도록 식별될 수 있다. 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 한, 결과의 세컨더리 흐름 (244) 은 채널 (122) 및 연결 영역 (236) 에 제한되고 단리 영역 (240) 밖에서 유지될 수 있다. 채널 (122) 에서 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 따라서, 마이크로-객체들 (246) 을 단리 영역 (240) 밖으로 인출하지 않을 것이다. 차라리, 단리 영역 (240) 에 위치된 마이크로-객체들 (246) 은 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 관계없이 단리 영역 (240) 에 머무를 것이다.
또한, 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 채널 (122) 에서의 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 채널 (122) 로부터 격리 펜 (224) 의 단리 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예를 들어, 마이크로입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 따라서, 연결 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 가 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 큰 것은 채널 (122) 또는 다른 격리 챔버 (예를 들어, 도 2d 에서 격리 펜들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들로 하나의 격리 펜 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
격리 펜들 (224, 226, 228) 의 연결 영역들 (236) 및 채널 (122) 이 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 채널 (122) 및 연결 영역들 (236) 은 디바이스 (230) 의 스윕 (또는 흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 한편, 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 단리 영역들 (240) 은, 스윕되지 않은 (또는 비-흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 채널 (122) 에서의 제 1 유체 배지 (180) 내의 성분들 (미도시) 은 채널 (122) 로부터 연결 영역 (236) 을 통해 그리고 단리 영역 (240) 내의 제 2 유체 배지 (248) 로의 제 1 배지 (180) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 단리 영역 (240) 에서 제 2 유체 배지 (280) 와 혼합할 수 있다. 유사하게, 단리 영역 (240) 에서의 제 2 배지 (248) 의 성분들 (미도시) 는 단리 영역 (240) 으로부터 연결 영역 (236) 을 통해 그리고 채널 (122) 의 제 1 배지 (180) 안으로 제 2 배지 (248) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 채널 (122) 에서 제 1 배지 (180) 와 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 확산에 의한 격리 펜의 단리 영역과 흐름 영역 사이의 유체 배지 교환의 정도는 총 유체 교환의 양의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이거나, 또는 총 유체 교환의 양보다 더 크다. 제 1 배지 (180) 는 제 2 배지 (248) 와 동일한 배지이거나 상이한 배지일 수 있다. 또한, 제 1 배지 (180) 및 제 2 배지 (248) 는 동일하게 시작하고, 그 후 (예를 들어, 단리 영역 (240) 에서 하나 이상의 세포들에 의해 제 2 배지 (248) 의 컨디셔닝을 통해, 또는 채널 (122) 을 통해 흐르는 배지 (180) 를 변경함으로써) 상이하게 될 수 있다.
채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 야기된 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 는, 위에서 언급된 바와 같이 다수의 파라미터들에 의존할 수 있다. 이러한 파라미터들의 예들은: 채널 (122) 의 형상 (예를 들어, 마이크로유체 채널은 연결 영역 (236) 안으로 배지를 지향시키고, 연결 영역 (236) 으로부터 멀리 배지를 전환시키고, 또는 연결 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 에 실질적으로 수직한 방향에서 배지를 채널 (122) 로 지향시킬 수 있음); 근위 개구 (234) 에서 채널 (122) 의 폭 (Wch)(또는 단면적); 및 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적); 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도 (V); 제 1 배지 (180) 및/또는 제 2 배지 (248) 의 속도 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 치수들은 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 마이크로유체 채널 폭 (Wch)(또는 채널 (122) 의 단면적) 은 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다; 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적) 은 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 평행할 수 있다; 및/또는 연결 영역의 길이 (Lcon) 는 채널 (122) 에서 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다. 상기는 단지 예들이며, 채널 (122) 및 격리 펜들 (224, 226, 228) 의 상대적 포지션은 서로에 대하여 다른 배향들에 있을 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 원위 개구 (238) 에서 단리 영역 (240) 의 폭 (Wiso) 은 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 과 실질적으로 동일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 단리 영역 (240) 의 폭 (Wiso) 은 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 단리 영역 (240) 의 폭 (Wiso) 은 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구 (238) 는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 와 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 연결 영역 (236) 은 다양한 상이한 지오메트리들을 사용하여 (예를 들어, 연결 영역을 챔퍼링, 연결 영역을 베벨링), 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다. 　 또한, 연결 영역 (236) 의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234) 에 인접한 연결 영역의 부분) 이 좁아질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 는 도 1 의 각각의 마이크로유체 디바이스 (100), 회로 (132) 및 채널 (134) 의 변형들인, 마이크로유체 회로 (262) 및 흐름 채널들 (264) 을 포함하는 마이크로유체 디바이스 (400) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 마이크로유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 격리 펜들 (266) 을 갖는다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에 도시된 디바이스 (250) 의 격리 펜들 (266) 은 전술된 디바이스들 (100, 200, 230, 280, 290, 또는 320) 내의 격리 펜들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 중 어느 하나를 대체할 수 있다. 마찬가지로, 마이크로유체 디바이스 (400) 는 마이크로유체 디바이스 (100) 의 다른 변형이고, 또한 전술된 마이크로유체 디바이스 (100, 200, 230, 280, 290, 320), 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 마이크로유체 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나와 동일한 또는 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 마이크로유체 디바이스 (250) 는 지지 구조 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 마이크로유체 회로 구조 (256), 및 커버 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음) 를 포함한다. 마이크로유체 회로 구조 (256) 는, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (252) 및 마이크로유체 회로 재료 (260) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 마이크로유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에 나타낸 바와 같이, 마이크로유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 마이크로유체 회로 (262) 는 다수의 격리 챔버들 (266) 이 유체적으로 연결되는 다수의 채널들 (264)(2 개가 도시되지만 더 많이 존재할 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 격리 펜 (266) 은 단리 구조 (272), 단리 구조 (272) 내의 단리 영역 (270), 및 연결 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 채널 (264) 에서의 근위 개구 (274) 로부터 단리 구조 (272) 에서의 원위 개구 (276) 까지, 연결 영역 (268) 은 채널 (264) 을 단리 영역 (270) 에 유체적으로 연결시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 마이크로유체 채널 (264) 에서 제 1 유체 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 채널 (264) 로부터 격리 펜들 (266) 의 각각의 연결 영역들 (268) 안으로 및/또는 밖으로 제 1 배지 (254) 의 세컨더리 흐름들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 각각의 격리 펜 (266) 의 연결 영역 (268) 은 일반적으로, 마이크로유체 채널 (264) 로의 근위 개구 (274) 와 단리 구조 (272) 로의 원위 개구 (276) 사이에서 확장하는 영역을 포함한다. 연결 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (282) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 (도 2d 에 도시된 바와 같이) 단리 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않고 연결 영역 (268) 으로 확장할 것이다. 대안으로, 도 2f 에 예시된 바와 같이, 연결 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon) 를 가질 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 연결 영역 (268) 을 통해 확장하고 단리 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 연결 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 커서, 세컨더리 흐름 (282) 이 단리 영역 (270) 안으로 확장하지 않을 것이다. 연결 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 가 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 또는 연결 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 마이크로유체 채널 (264) 에서의 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 침투 깊이 (Dp) 를 갖는 세컨더리 흐름을 생성할 것이고, 격리 펜 (266) 의 단리 영역 (270) 에서 마이크로-객체들 (도시되지 않지만, 도 2e 에 도시된 마이크로-객체들 (246) 과 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 마이크로유체 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 에 의해 단리 영역 (270) 밖으로 인출되지 않을 것이다. 또한, 마이크로유체 채널 (264) 에서의 흐름 (278) 은 마이크로유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 단리 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (미도시) 을 인출하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 내의 성분들이 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266) 의 단리 영역 (270) 내의 제 2 배지 (258) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은, 격리 펜 (266) 의 단리 영역 (270) 에서의 제 2 배지 (258) 내의 성분들이 단리 영역 (270) 으로부터 채널 (264) 내의 제 1 배지 (254) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 제 1 배지 (254) 는 제 2 배지 (258) 와 동일한 배지일 수 있고, 또는 제 1 배지 (258) 는 제 2 배지 (258) 와 상이한 배지일 수 있다. 대안으로, 제 1 배지 (254) 및 제 2 배지 (258) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 후 예를 들어 단리 영역 (270) 내의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 배지의 컨디셔닝을 통해, 또는 채널 (264) 을 통해 흐르는 배지를 변경함으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 채널 (264) 내의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (278) 에 의해 표시된 채널을 통한 유체 배지 흐름의 방향을 가로질러 취해진) 채널들 (264) 의 폭 (Wch) 은 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 에 실질적으로 수직하고 따라서 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 에 실질적으로 평행할 수 있다. 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 및 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 은 그러나, 서로 실질적으로 수직할 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 이 배향되는 축 (미도시) 과 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 이 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직 외 및 따라서 90°이외일 수 있다. 다르게 배향된 각도들의 예들은 다음의 범위들 중 어느 하나의 각도들을 포함한다: 약 30°내지 약 90°, 약 45°내지 약 90°, 약 60°내지 약 90°등.
격리 펜들 (예를 들어, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266) 의 다양한 실시형태들에서, 단리 영역 (예를 들어, 240 또는 270) 은 복수의 마이크로-객체들을 포함하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 단리 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 마이크로-객체들 만을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 단리 영역의 체적은, 예를 들어 적어도 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106 입방 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 약 50-1000 마이크론, 50-500 마이크론, 50-400 마이크론, 50-300 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 70-500 마이크론, 70-400 마이크론, 70-300 마이크론, 70-250 마이크론, 70-200 마이크론, 70-150 마이크론, 90-400 마이크론, 90-300 마이크론, 90-250 마이크론, 90-200 마이크론, 90-150 마이크론, 100-300 마이크론, 100-250 마이크론, 100-200 마이크론, 100-150 마이크론, 및 100-120 마이크론. 일부 다른 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 약 200-800 마이크론, 200-700 마이크론, 또는 200-600 마이크론의 범위에 있을 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 다른 범위들 (예를 들어, 위에 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 또한, 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 격리 펜의 근위 개구 외의 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 격리 펜은 약 30 내지 약 200 마이크론, 또는 약 50 내지 약 150 마이크론의 높이를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 격리 펜은 약 1 x104 내지 약 3 x106 제곱 마이크론, 약 2 x104 내지 약 2 x106 제곱 마이크론, 약 4 x104 내지 약 1 x106 제곱 마이크론, 약 2 x104 내지 약 5 x105 제곱 마이크론, 약 2 x104 내지 약 1 x105 제곱 마이크론, 또는 약 2 x105 내지 약 2 x106 제곱 마이크론의 단면적을 갖는다. 　 일부 실시형태들에서, 연결 영역은 약 20 내지 약 100 마이크론, 약 30 내지 약 80 마이크론 또는 약 40 내지 약 60 마이크론의 단면 폭을 갖는다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 채널 (122) 의 높이 (Hch) 는 격리 펜의 근위 개구 이외의 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 500-50,000 제곱 마이크론, 500-40,000 제곱 마이크론, 500-30,000 제곱 마이크론, 500-25,000 제곱 마이크론, 500-20,000 제곱 마이크론, 500-15,000 제곱 마이크론, 500-10,000 제곱 마이크론, 500-7,500 제곱 마이크론, 500-5,000 제곱 마이크론, 1,000-25,000 제곱 마이크론, 1,000-20,000 제곱 마이크론, 1,000-15,000 제곱 마이크론, 1,000-10,000 제곱 마이크론, 1,000-7,500 제곱 마이크론, 1,000-5,000 제곱 마이크론, 2,000-20,000 제곱 마이크론, 2,000-15,000 제곱 마이크론, 2,000-10,000 제곱 마이크론, 2,000-7,500 제곱 마이크론, 2,000-6,000 제곱 마이크론, 3,000-20,000 제곱 마이크론, 3,000-15,000 제곱 마이크론, 3,000-10,000 제곱 마이크론, 3,000-7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태에서, 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 약 20 내지 약 300 마이크론, 약 40 내지 약 250 마이크론, 약 60 내지 약 200 마이크론, 약 80 내지 약 150 마이크론, 약 20 내지 약 500 마이크론, 약 40 내지 약 400 마이크론, 약 60 내지 약 300 마이크론, 약 80 내지 약 200 마이크론, 또는 약 100 내지 약 150 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 상기 예들과 상이한 범위 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 약 20 내지 약 150 마이크론, 약 20 내지 약 100 마이크론, 약 20 내지 약 80 마이크론, 약 20 내지 약 60 마이크론, 약 30 내지 약 150 마이크론, 약 30 내지 약 100 마이크론, 약 30 내지 약 80 마이크론, 약 30 내지 약 60 마이크론, 약 40 내지 약 150 마이크론, 약 40 내지 약 100 마이크론, 약 40 내지 약 80 마이크론, 약 40 내지 약 60 마이크론, 약 50 내지 약 150 마이크론, 약 50 내지 약 100 마이크론, 약 50 내지 약 80 마이크론, 약 60 내지 약 150 마이크론, 약 60 내지 약 100 마이크론, 약 60 내지 약 80 마이크론, 약 70 내지 약 150 마이크론, 약 70 내지 약 100 마이크론, 약 80 내지 약 150 마이크론, 및 약 80 내지 약 100 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 할 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태에서, 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서의 폭 (Wcon) 은 적어도 격리 펜이 그에 대해 의도되는 마이크로-객체 (예를 들어, B 세포 또는 T 세포와 같은 면역 세포, 또는 하이브리도마 세포 등일 수 있는 생물학적 세포) 의 최대 치수만큼 클 수도 있다. 예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 가 위치할 격리 펜의 근위 개구 (234) 에서의 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 다음 중 어느 것일 수 있다: 약 20 마이크론, 약 25 마이크론, 약 30 마이크론, 약 35 마이크론, 약 40 마이크론, 약 45 마이크론, 약 50 마이크론, 약 55 마이크론, 약 60 마이크론, 약 65 마이크론, 약 70 마이크론, 약 75 마이크론, 또는 약 80 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 할 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 대 연결 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 다음의 비율들 중 어느 하나 이상일 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 이상. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (234) 에서 연결 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 대 연결 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 상기 예들과 상이할 수 있다.
마이크로유체 디바이스들 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 320) 의 다양한 실시형태에서, Vmax 는 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 또는 5.0 μL/sec 정도에서 설정될 수 있다.
격리 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 단리 영역 (예를 들어, 240) 의 체적은, 예를 들어 적어도 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 8x106, 1x107 입방 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 격리 펜들을 갖는 마이크로유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 5x105, 6x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107 입방 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 격리 펜의 체적은 약 0.5 나노리터 내지 약 10 나노리터, 약 1.0 나노리터 내지 약 5.0 나노리터, 약 1.5 나노리터 내지 약 4.0 나노리터, 약 2.0 나노리터 내지 약 3.0 나노리터, 약 2.5 나노리터, 또는 위의 엔드포인트들 중 두 가지로 정의된 임의의 범위일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스는 본원에 논의된 실시형태들 중 임의의 실시형태에서와 같이 구성된 격리 펜들을 가지며, 여기서 마이크로유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 격리 펜들, 약 10 내지 약 50 개의 격리 펜들, 약 100 내지 약 500 개의 격리 펜들; 약 200 내지 약 1000 개의 격리 펜들, 약 500 내지 약 1500 개의 격리 펜들, 약 1000 내지 약 2000 개의 격리 펜들, 또는 약 1000 내지 약 3500 개의 격리 펜들을 갖는다. 격리 펜은 모두 동일한 크기일 필요는 없으며 다양한 구성들 (예를 들어, 다양한 폭들, 격리 펜 내의 다른 특징들) 을 포함할 수 있다.
일부 다른 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스는 본원에 논의된 실시형태들 중 임의의 실시형태에서와 같이 구성된 격리 펜들을 가지며, 여기서 마이크로유체 디바이스는 약 1500 내지 약 3000 개의 격리 펜들, 약 2000 내지 약 3500 개의 격리 펜들, 약 2500 내지 약 4000 개의 격리 펜들 약 3000 내지 약 4500 개의 격리 펜들, 약 3500 내지 약 5000 개의 격리 펜들, 약 4000 내지 약 5500 개의 격리 펜들, 약 4500 내지 약 6000 개의 격리 펜들, 약 5000 내지 약 6500 개의 격리 펜들, 약 5500 내지 약 7000 개의 격리 펜들, 약 6000 내지 약 7500 개의 격리 펜들, 약 6500 내지 약 8000 개의 격리 펜들, 약 7000 내지 약 8500 개의 격리 펜들, 약 7500 내지 약 9000 개의 격리 펜들, 약 8000 내지 약 9500 개의 격리 펜들, 약 8500 내지 약 10,000 개의 격리 펜들, 약 9000 내지 약 10,500 개의 격리 펜들, 약 9500 내지 약 11,000 개의 격리 펜들, 약 10,000 내지 약 11,500 개의 격리 펜들, 약 10,500 내지 약 12,000 개의 격리 펜들, 약 11,000 내지 약 12,500 개의 격리 펜들, 약 11,500 내지 약 13,000 개의 격리 펜들, 약 12,000 내지 약 13,500 개의 격리 펜들, 약 12,500 내지 약 14,000 개의 격리 펜들, 약 13,000 내지 약 14,500 개의 격리 펜들, 약 13,500 내지 약 15,000 개의 격리 펜들, 약 14,000 내지 약 15,500 개의 격리 펜들, 약 14,500 내지 약 16,000 개의 격리 펜들, 약 15,000 내지 약 16,500 개의 격리 펜들, 약 15,500 내지 약 17,000 개의 격리 펜들, 약 16,000 내지 약 17,500 개의 격리 펜들, 약 16,500 내지 약 18,000 개의 격리 펜들, 약 17,000 내지 약 18,500 개의 격리 펜들, 약 17,500 내지 약 19,000 개의 격리 펜들, 약 18,000 내지 약 19,500 개의 격리 펜들, 약 18,500 내지 약 20,000 개의 격리 펜들, 약 19,000 내지 약 20,500 개의 격리 펜들, 약 19,500 내지 약 21,000 개의 격리 펜들, 또는 약 20,000 내지 약 21,500 개의 격리 펜들을 갖는다.
도 2g 는 일 실시형태에 따른 마이크로유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에 예시된 마이크로유체 디바이스 (280) 는 마이크로유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 마이크로유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널들 (122) 및 격리 펜들 (128)) 은 본원에 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g 에 예시된 마이크로유체 회로 (120) 는 2 개의 포트들 (107), 4 개의 별개의 채널들 (122) 및 4 개의 별개의 흐름 영역들 (106) 을 갖는다. 마이크로유체 디바이스 (280) 는 각각의 마이크로유체 채널 (122) 에서 개방된 복수의 격리 펜들을 더 포함한다. 도 2g 에 예시된 마이크로유체 디바이스에서, 격리 펜들은 도 2c 에 예시된 펜들과 유사한 지오메트리를 갖고, 따라서 양자의 연결 영역들 및 단리 영역들을 갖는다. 따라서, 마이크로유체 회로 (120) 는 스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내의 연결 영역들 (236) 의 부분들 및 채널들 (122)) 및 비-스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 연결 영역들 (236) 의 부분들 및 단리 영역들 (240)) 양자 모두를 포함한다.
도 3a 및 도 3b 는 본 발명에 따른 마이크로유체 디바이스들 (예를 들어, 100, 200, 230, 280, 250, 290, 320) 을 동작 및 관측하는데 사용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 나타낸다. 도 3a 에 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 마이크로유체 디바이스 (100)(미도시), 또는 본원에 설명된 임의의 다른 마이크로유체 디바이스를 홀딩하도록 구성된 구조 ("네스트 (nest)")(300) 를 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 마이크로유체 디바이스 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이스하고 전원 (192) 으로부터 마이크로유체 디바이스 (320) 로 전기적 연결들을 제공할 수 있는 소켓 (302) 을 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은, 바이어싱 전압이, 마이크로유체 디바이스가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 마이크로유체 디바이스 (320) 내의 전극들의 쌍 양단에 인가되도록 바이어싱 전압을 소켓 (302) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 따라서, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 전원 (192) 의 부분일 수 있다. 마이크로유체 디바이스 (320) 에 바이어싱 전압을 인가하는 능력은, 바이어싱 전압이, 마이크로유체 디바이스 (320) 가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 차라리, 대부분의 경우들에서, 바이어싱 전압은 간헐적으로, 예를 들어 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기적 힘들의 생성을 용이하게 하도록 필요할 때에만, 인가될 것이다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 네스트 (300) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA)(322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 PCBA (322) 상에 장착되고 이 안에 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 PCBA (322) 상에 또한 장착된 소켓 (302) 을 포함한다.
통상적으로, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기 (미도시) 를 포함할 것이다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (미도시) 및/또는 오실로스코프 (미도시) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우, 소켓 (302) 에 의해 홀딩된 마이크로유체 디바이스 (320) 에 인가된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 오실로스코프는 마이크로유체 디바이스 (320) 에 근접한 (및 파형 생성기에 대해 먼) 로케이션에서 파형을 측정하고, 따라서 디바이스에 실제로 인가된 파형을 측정하는데 있어서 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 획득된 데이터는, 예를 들어 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합형 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
특정 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 제어기 (308), 예컨대 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 감지 및/또는 제어하는데 사용된 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (308) 는 기능들 및 분석을 수행하는데 사용될 수도 있고, 또는 기능들 및 분석을 수행하도록 (도 1a 에 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (308) 는 인터페이스 (310)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 마이크로유체 디바이스 (100) 로 패스하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 후, 마이크로유체 디바이스 (320) 에서 측정된 전압이 원하는 값이도록 필요에 따라 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는, 마이크로유체 디바이스 (100) 에서 최대 13 Vpp 의 신호를 초래하는, PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터들의 쌍에 의해 생성된 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 지지 구조 (300) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조 (300) 에 의해 홀딩된 마이크로유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 열전기 디바이스 (미도시) 및 냉각 유닛 (미도시) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 마이크로유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (미도시), 예컨대 수냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예를 들어, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 연결될 수 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 지지 구조 (300) 는 인렛 (316) 및 아웃렛 (318) 를 포함하여, 외부 저장소 (미도시) 로부터 냉각된 유체를 수신하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 안으로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하며, 그 후 냉각된 유체를 외부 저장소로 리턴한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로 (314) 는 지지 구조 (300) 의 케이싱 (312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 마이크로유체 디바이스 (320) 에 대한 목표 온도를 달성하도록 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은, 예를 들어 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급기에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 (예를 들어, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/CO 를 갖는) 저항기 및 (예를 들어, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (미도시) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (미도시) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여 열전기 전력 공급기를 작동시키고, 이에 의해 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (300) 는, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (도시되지 않음) 를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예를 들어, Plink 툴 (미도시) 을 통해) 통신할 수 있다. 따라서, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기적 신호 생성 서브시스템 (308) 을 도울 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 커플링된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)(미도시) 는 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 각각으로부터 획득된 온도 및 파형 데이터를 플롯하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, GUI 는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 촬상 디바이스 (194) 를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 광 조절 서브시스템 (330) (도 3b 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 디지털 미러 디바이스 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수신하고 수신된 광의 서브세트를 현미경 (350) 의 광학 트레인으로 송신하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 그 자신의 광을 생산하고 (따라서 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 디바이스 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (330) 은 구조화된 및 구조화되지 않은 광 양자 모두를 방출할 수 있다. 적합한 광 조절 서브시스템 (330) 의 일 예는 Andor Technologies™ 로부터의 Mosaic™ 시스템이다. 특정 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 촬상 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트 (300) 는 현미경 (350) 의 스테이지 (344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 부분 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에 설명된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 현미경 (350) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 촬상 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지털 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재하면, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 마이크로유체 디바이스 (320) 로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고, 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한, 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기들에 대한 상이한 튜브 렌즈들 (미도시) 을 포함할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스 (194) 는 적어도 2 개의 광원들을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (330) 을 통해) 구조화된 광을 생산하도록 사용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 전기역학 및/또는 형광성 여기를 위해 구조화된 광을 생산할 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 밝은 필드 조명을 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태들에서, 동기 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하도록 사용될 수 있고, 촬상 모듈 (164) 은 제 2 광원 (334) 을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학 트레인은 (1) 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 구조화된 광을 수신하고, 이 구조화된 광을 광학적으로-작동된 전기역학 디바이스와 같은 마이크로유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역에 포커싱하고, (2) 마이크로유체 디바이스로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부를 검출기 (348) 로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수신하고, 이 비구조화된 광을 마이크로유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 오버랩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다.
도 3b 에서, 제 1 광원 (332) 은, 시스템 (355)(미도시) 의 현미경 (350) 의 광학 트레인에 구조화된 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (330) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 빔 스플리터 (336) 를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (334) 으로부터의 비구조화된 광은 빔 스플리터 (336) 로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제 2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (330) 에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (338)) 에 도달하며, 여기서 광은 대물렌즈 (336) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 샘플 평면 (342) 으로부터 반사 및/또는 방출된 광은 그 후, 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338) 를 통해, 이색성 필터 (346) 로 위로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 일부 만이 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 블루 광을 방출한다. 적합한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346) 를 통과하고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 단지, 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장들 (예를 들어, 블루 파장들) 을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346) 를 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (334) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 간의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (334) 보다 상당히 더 강한 경우 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 레드 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 레드 광 외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
코팅 용액들 및 코팅제들. 이론에 의헤 제한되도록 의도하지 않고, 마이크로유체 디바이스 내에서의 생물학적 세포 (예를 들어, B 세포 또는 T 세포와 같은 면역 세포) 와 같은 마이크로-객체의 배양은, 마이크로유체 디바이스와 그 안에 유지되는 마이크로-객체 (예를 들어, 생물학적 세포) 사이의 일차 인터페이스를 제공하는 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 마이크로유체 디바이스의 하나 이상의 내부 표면들이 컨디셔닝 또는 코팅된 경우, 용이하게 될 수도 있다 (즉, 마이크로-객체는 마이크로유체 디바이스 내에서 증가된 생존 능력, 더 큰 증식 및/또는 더 큰 운반가능성을 나타낸다). 일부 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스의 내부 표면들 중 하나 이상 (예를 들어, DEP-구성된 마이크로유체 디바이스의 전극 활성화 기질의 내부표면, 마이크로유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 은 유기 및/또는 친수성 분자들의 원하는 층을 생성하기 우해 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 처리된다. 일부 실시형태에서, 배양되고 선택적으로 마이크로유체 디바이스에서 팽창되는 마이크로-객체(들) (예를 들어, 생물학적 세포(들)) 는 하나 이상의 코팅제를 포함하는 코팅 용액에서 유입된다.
다른 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 마이크로유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 은 마이크로유체 디바이스 내로 마이크로-객체(들) (예를 들어, 생물학적 세포(들)) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다. 혈청 또는 혈청 인자들, 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리머들, 계면활성제들, 효소들, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다. 일부 특정 실시형태에서, 코팅제는 마이크로유체 디바이스의 내부 표면(들)을 처리하기 위해 사용될 것이다. 하나의 예에서, 알킬렌 에테르 모이어티를 포함하는 폴리머는 코팅 용액 중에 코팅제로서 포함될 수 있다. 폭넓게 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머가 적합할 수 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머의 하나의 비한정적인 예시적인 부류는 폴리머 사슬 내의 상이한 비율 및 위치에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리 프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽성 비이온성 블록 코폴리머이다. Pluronic® 폴리머 (BASF) 는 이 유형의 블록 코폴리머이며 살아있는 세포와 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 당업계에 공지되어 있다. 폴리머는 평균 분자량 (Mw) 이 약 2000Da에서 약 20KDa 이다. 일부 실시형태에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 보다 큰 (예를 들어, 12-18) 친수성-친유성 균형 (HLB) 을 가질 수 있다. 코팅된 표면을 만드는데 유용한 Pluronic® 폴리머는 Pluronic® L44, L64, P85 및 F127 (F127NF 포함) 을 포함한다. 폴리머를 함유하는 알킬렌 에테르의 다른 부류는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG Mw <100,000 Da) 또는 다르게는 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, Mw>100,000) 이다. 일부 실시형태에서, PEG는 Mw 가 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 일 수 있다.
일부 실시형태에서, 코팅 용액은 코팅제로서 다양한 단백질 및/또는 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시에서의 용도를 찾는 코팅 용액은 알부민 (예를 들어, BSA) 및/또는 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질을 포함하는 혈청 (또는 다수의 상이한 혈청의 조합) 과 같은 단백질을 포함한다. 혈청은 태아 송아지 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 편리한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 블로킹 용액 중의 BSA는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL 범위로 존재하며, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함한다. 특정 실시형태에서, 코팅 용액 중의 혈청은 약 20% (v/v) 내지 약 50% v/v 범위로 존재하며, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함한다. 일부 실시형태에서, BSA는 5 mg/mL의 코팅 용액 중의 코팅제로서 존재하는 반면, 다른 실시형태에서 BSA는 70 mg/mL의 코팅 용액 중의 코팅제로서 존재한다. 특정 실시형태에서, 혈청은 코팅 용액 중의 코팅제로서 30%로 존재한다.
코팅 재료들. 실시형태에 따라, 전술한 코팅제/코팅 용액 중 임의의 것을 마이크로유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 마이크로유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 중 하나 이상을 코팅하는데 사용되는 다양한 코팅 재료로 대체하거나 또는 다양한 코팅 재료와 조합하여 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들)은 흐름 영역 (예를 들어, 채널), 챔버 또는 격리 펜의 표면, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 격리 펜 각각은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태에서, 복수의 흐름 영역 또는 채널의 각각은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태에서, 복수의 격리 펜 각각 및 다수의 채널 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료로 코팅된다.
폴리머 기반의 코팅 재료들. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수 있다. 폴리머는 적어도 하나의 표면에 공유결합 또는 비공유결합될 수도 있다 (또는 결합될 수도 있다). 폴리머는 예를 들어 블록 폴리머들 (및 코폴리머들), 성형 폴리머들 (성형 코폴리머들), 및 그래프트 또는 빗살모양 폴리머들 (그래프트 코폴리머들) 에서 발견되는 다양한 구조성 모티프들을 가질 수도 있으며, 이들 모두는 여기에 개시된 방법들에 적합할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 매우 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들이 여기에 기술된 마이크로유체 디바이스들에서의 사용을 위해 적합할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비제한적인 예시의 부류는 폴리머 사술 내에 상이한 비율들로 및 상이한 위치들에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽 친매성 비이온 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이러한 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아있는 세포들과 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 본 기술에서 알려져 있다. 폴리머는 평균 분자량 (Mw) 이 약 2000Da에서 약 20KDa 이다. 일부 실시형태들에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 (예를 들어, 12-18) 보다 큰 친수성-친유성 밸런스 (HLB) 를 가질 수 있다. 코팅된 표면을 산출하기 위해 유용한 특정의 Pluronic® 폴리머들은 Pluronic® L44, L64, P85, 및 F127 (F127NF 를 포함) 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 다른 부류는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG Mw < 100,000Da) 또는 대안으로 폴리에티렌 옥사이드 (PEO, Mw > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 Mw 를 가질 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실산 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실산 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락트산 (PLA) 이다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술폰산 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술폰산 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술폰산 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술폰산이다. 이들 후자의 예시적인 중합체는 고분자 전해질이며 표면의 특성을 변화시켜 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 코팅 재료는 다음에 한정되지 않지만 폴리우레탄과 같은 우레탄 모이어티를 포함하는 폴리머를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머 백본으로부터의 펜던트 중 어느 하나에서 인산염 모이어티를 함유하는 폴리머를 포함할 수 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티를 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비제한적인 예에서, 크산탄 검 또는 덱스트란과 같은 조류 또는 곰팡이 다당류로부터 유래된 것과 같은 다당류는 마이크로유체 디바이스의 세포 점착을 감소 시키거나 방지할 수 있는 재료를 형성하는데 적합할 수 있다. 예를 들어, 약 3Kda 크기를 갖는 덱스트란 폴리머가 마이크로유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 뉴클레오티드 모이어티들을 포함하는 폴리머, 즉 핵산을 포함할 수도 있으며, 이것은 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 디옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가질 수 있다. 핵산은 천연 뉴클레오티드 모이어티들만을 포함할 수도 있거나 제한 없이 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 포함하는 비천연 뉴클레오티브 모이어티들을 포함할 수도 있다. 핵산 함유 폴리머는 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공할 수 있는 고분자 전해질을 포함할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노산 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노산 모이어티들을 포함하는 폴리머는 천연 아미노산 포함 폴리머 또는 비천연 아미노산 포함 폴리머를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 단백질은 소 혈청 알부민 (BSA) 일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 세포외 기질 (ECM) 단백질은 세포 성장을 조성하기 위해 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함될 수도 있는 세포 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예를 들어, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 사이토킨들, 호르몬들 또는 다른 세포 시그널링 종이 마이크로유체 디바이스의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
추가 실시형태에서, 코팅 재료는 아민 모이어티를 포함하는 폴리머를 포함할 수 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수 있다. 천연 폴리아민의 예에는 스페르민, 스페르미딘 및 퓨트레신을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실산 모이어티들, 술폰산 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노산 모이어티들 중 2 이상을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 컨디셔닝된 표면은 각각 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실산 모이어티들, 술폰산 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노산 모이어티들을 갖는 2 이상의 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있으며, 그것은 코팅 재료 내로 독립적으로 또는 동시에 통합될 수도 있다.
공유 결합된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 공유 결합으로 연결된 분자들을 포함하여, 그러한 세포들에 대한 컨디셔닝된 표면을 제공한다. 공유 결합으로 연결된 분자는 연결기를 포함하며, 연결기는 마이크로유체 디바이스의 하나 이상의 표면에 공유 결합으로 연결된다. 연결기는 또한 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유 결합으로 연결된다. 연결기가 연결된 표면은 마이크로유체 디바이스가 DEP 구성을 포함하는 실시형태에서 실리콘 및/또는 실리콘 디옥사이드를 포함할 수 있는 마이크로유체 디바이스의 기질 표면을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공유 결합으로 연결된 코팅 재료는 마이크로유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면을 코팅한다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유 결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬을 포함함) 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만 이것에 제한되지 않는) 단당류 또는 다당류; (프로파르길 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 알콜류; 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 폴리알콜류; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 알킬렌 에테르류; (폴리아크릴산 또는 폴리비닐 포스폰산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 고분자 전해질류; 아미노기들 (알킬레이티드 아민류, 히드록시알킬레이티드 아미노기, 구아니디늄과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 그것의 유도체들, 및 모르폴리닐 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 비방향화된 질소 고리 원자를 함유하는 헤테로실릭 기들을 포함); (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 카르복실산류; (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 에티닐 포스폰산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 포스폰산류; 술포네이트 음이온들; 카르복시베타인류; 술포베타인류; 술파믹산류; 또는 아미노산류를 포함할 수도 있다.
마이크로유체 디바이스에서의 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유 결합으로 연결된 모이어티는 본원에 기술된 임의의 폴리머일 수 있고, 그리고 알킬렌 옥사이드 모이어티, 카르복실산 모이어티, 당류 모이어티, 술폰산 모이어티, 인산 모이어티, 아미노산 모이어티, 핵산 모이어티 또는 아미노 모이어티를 함유하는 하나 이상의 폴리머를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스에서의 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유 결합으로 연결된 모이어티는 비중합성 모이어티, 알킬 모이어티, 치환된 알킬 모이어티, 예컨대 플루오로알킬 모이어티 (퍼플루오르 알킬 모이어티를 포함하나 이에 한정되지는 않음), 아미노산 모이어티, 알코올 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실산 모이어티, 인산 모이어티, 술폰산 모이어티, 술팜산 모이어티, 또는 당류 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 선형 사슬 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22 개, 또는 그 이상의 탄소들의 선형 사슬) 을 형성하는 알킬기일 수 있다. 따라서, 알킬기는 비분지형 알킬일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬기는 치환된 알킬기 (예를 들어, 알킬기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화 또는 퍼플루오르화될 수 있음) 를 포함할 수도 있다. 알킬기는 비치환된 탄소들의 선형 사슬에 조인된 치환된 (예를 들어, 플루오르화된 또는 퍼플루오르화된) 탄소들의 선형 사슬을 포함할 수 있다. 예를 들어, 알킬기는, 비-치환된 알킬기를 포함할 수도 있는 제 2 분절 (segment) 에 조인된, 퍼플루오로알킬기를 포함할 수도 있는 제 1 분절을 포함할 수도 있다. 제 1 및 제 2 분절들은 직접적으로 또는 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 간접적으로 결합될 수도 있다. 알킬기의 제 1 분절은 연결기에서 멀리 위치될 수도 있고, 알킬기의 제 2 분절은 연결기에 근접하여 위치될 수도 있다. 다른 실시형태에서, 알킬기는 분지형 알킬기를 포함할 수 있고, 알킬기의 알킬 백본을 차단하는 하나 이상의 아릴렌기를 더 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 알킬 또는 플루오르화 알킬기의 분지형 또는 아릴렌-차단된 부분은 연결기의 원위에 있는 지점 및 표면으로의 공유 연결에 위치한다.
다른 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 2 이상의 타입의 아미노산을 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수도 있다. 따라서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존 능력, 운반가능성, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하기 위해 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있는 아미노산을 포함할 수도 있다.
공유 결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류를 포함할 수 있다. 공유 결합으로 연결된 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류일 수 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 표면에 대한 부착을 위해 커플링 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 (pairing) 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 다당류는 랜덤한 양식으로 개질될 수도 있으며, 여기서 당류 모노머들 각각이 개질될 수도 있거나 다당류 내의 당류 모노머들의 일부만이 표면에 직접 또는 간접으로 커플링될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위해 개질된다. 하나의 예는 비분기형 연결자를 통해 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수도 있다.
공유 결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노기들을 포함할 수도 있다. 아미노기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 마이크로유체 디바이스 내의, 및 선택적으로 격리 펜들 및/또는 흐름 영역들 (예를 들어, 채널들) 내의 환경의 pH 변경을 허용하는 구조들을 가질 수도 있다.
코팅 재료는 단지 한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나 2 이상의 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 컨디셔닝된 표면들은 모두 동일한, 예를 들어, 표면에 대한 동일한 연결기 및 공유결합 부착, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 2 이상의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정의 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 갖는 분자들을 포함할 수도 있고, 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 부착된 공유결합으로 대전된 모이어티들을 갖는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 1 종 이상의 공유 결합된 모이어티를 갖는 코팅 재료는, 더 많은 수의 백본 원자를 가지며 따라서 표면에 대한 공유 부착으로부터 더 긴 길이를 갖는 분자의 제 1 세트가 코팅된 표면에서 더 덩치가 큰 (bulkier) 모이어티들을 제공하는 용량을 제공할 수 있는 한편, 상이한 입체 요구가 적고 백본 원자 수가 적은 제 2 세트의 분자가 전체 기질 표면을 관능화하여 기질을 구성하는 실리콘 또는 알루미나와의 바람직하지 않은 접착 또는 접촉을 방지하는데 도움을 줄 수 있도록 설계될 수 있다. 또 다른 예에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티들은 표면상에서 랜덤한 양식으로 교번하는 전하들을 제시하는 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 특성들. 일부 실시형태에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티는 마이크로유체 디바이스의 표면 (예를 들어, DEP로 구성된 기질 표면) 에 공유 결합으로 연결될 때 단층을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 다른 실시형태들에서, 공유 결합으로 연결된 모이어티에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm의 두께를 가질 수 있다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 DEP-구성된 마이크로유체 디바이스 내에서의 동작에 적합하게 관능적이도록 완전하게 형성된 단층을 필요로 하지 않는다.
다양한 실시형태들에서, 마이크로유체 디바이스의 코팅 재료는 바람직한 전기적 특성들을 제공할 수 있다. 이론에 의해 제한하려는 의도는 없지만, 특정 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 미치는 한 가지 요인은 고유 전하 트래핑 (intrinsic charge trapping) 이다. 코팅 재료가 다르면 전자들을 트래핑할 수 있고, 이것은 코팅 재료의 파손을 초래할 수 있다. 코팅 재료의 결함은 전하 트래핑을 증가시키고 코팅 재료의 추가 파괴를 초래할 수 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트래핑에 영향을 줄 수 있는 상이한 유전 강도들 (즉, 절연 파괴를 일으키는 최소 적용 전계) 을 갖는다. 특정 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트래핑의 양을 감소시키거나 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 고밀도로 팩킹된 단층 구조) 를 가질 수 있다.
코팅 재료의 조성을 제외하고, 코팅 재료의 물리적 (및 전기적) 두께와 같은 다른 인자는 마이크로유체 디바이스에서 기질에 의한 DEP 힘 및/또는 전기습윤 힘의 생성에 영향을 미칠 수 있다. 코팅 재료가 기질 상에 증착되는 방식 (예를 들어, 기상증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 또는 정전 코팅) 을 포함한 여러 인자들이 코팅 재료의 물리적 및 전기적 두께를 변경할 수 있다. 코팅 재료의 물리적 두께 및 균일성은 엘립소미터를 사용하여 측정될 수 있다.
이들의 전기 특성 외에도, 코팅 재료는 생물학적 분자와 함께 사용하는데 유익한 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 플루오르화된 (또는 퍼플루오르화된) 알킬기를 함유하는 코팅 재료는 표면 파울링의 양을 감소시키는데 있어서 비치환된 알킬기에 비해 이점을 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 표면 파울링은 마이크로유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다. 이러한 파울링은 생물학적 마이크로-객체의 표면으로의 부착량을 증가시킬 수 있다.
컨디셔닝된 표면의 조성을 제외하고, 소수성 재료의 물리적인 두께와 같은 다른 인자는 DEP 힘에 영향을 미칠 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기질 상에 형성되는 방식 (예를 들어, 기상 증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 범람 및 정전기 코팅) 과 같은 다양한 요인들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 컨디셔닝된 표면의 물리적인 두께 및 균일성은 엘 립소미터를 사용하여 측정될 수 있다.
전기 특성에 추가하여, 컨디셔닝된 표면은 또한 생물학적 분자와 함께 사용하는데 유리한 특성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 플루오르화된 (또는 퍼플루오르화된) 탄소 사슬을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 파울링의 양을 감소시키는데 있어서 알킬 종결된 사슬에 비해 이점을 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 표면 파울링은 마이크로유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다.
DEP 구성에서 사용할 수 있는 컨디셔닝된 표면에 대한 다양한 특성이 아래 표에 포함되어 있다. 알 수 있듯이, 모두가 본원에 기재된 공유 결합으로 연결된 컨디셔닝된 표면들인 항목 1 내지 7에 있어서, 엘립소메트리에 의해 측정된 두께는, 비공유 스핀 코팅에 의해 형성된 CYTOP 표면을 갖는 항목 8의 두께보다 일관되게 더 얇다 (N/A는 표 전체에서 이용할 수 없는 데이터를 나타냄). 플루오르화된 표면은 전형적으로 알킬 (탄화수소) 컨디셔닝된 표면보다 더럽지 않기 때문에 파울링은 형성 모드보다 표면의 화학적 성질에 더 의존적인 것으로 밝혀졌다.
표 1. 비공유 결합으로 형성된 표면인 CYTOP와 비교되는, 표면을 공유 결합으로 개질시켜 준비한 다양한 컨디셔닝된 표면의 특성.
Figure pct00001
표면에 대한 연결기. 코팅 재료를 형성하는 공유 결합으로 연결된 모이어티들은 연결기를 통해 표면에 부착된다. 연결기는 실록산-함유 시약과 기질 표면의 산화물과의 반응에 의해 형성된 실록시 연결기일 수 있으며, 이는 규소 산화물 (예를 들어, DEP-구성된 기질의 경우) 또는 산화 알루미늄 또는 산화 하프늄 (예를 들어, EW-구성된 기질의 경우) 을 포함할 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 연결기는 포스폰산 함유 시약과 기질 표면의 산화물의 반응에 의해 형성된 포스포네이트 에스테르일 수 있다.
멀티-파트 컨디셔닝된 표면. 공유 결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에 기술되는 바와 같이, 마이크로유체 디바이스에서의 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다 (예를 들어, 알킬 실록산 시약 또는 퍼플루오로알킬 실록산 시약을 포함할 수도 있는 플루오로-치환된 알킬 실록산 시약). 대안으로, 공유 결합으로 연결된 코팅 재료는 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 커플링시킴으로써 형성될 수 있다.
공유 결합으로 연결된 코팅 재료의 제조 방법. 일부 실시형태들에서, (예를 들어, 격리 펜들 및/또는 흐름 영역들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 마이크로유체 디바이스의 표면에 공유 결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 의 구조를 갖는다.
Figure pct00002
코팅 재료는 DEP-구성 기질의 표면의 산화물들에 공유 결합으로 연결될 수도 있다. DEP-구성 기질은 실리콘 또는 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있고, 그리고 산화물들은 기질의 본래의 화학적 구조의 부분으로서 제공될 수도 있거나 이하에 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물들과 실록산 또는 포스폰산기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르기일 수도 있는 연결기 ("LG") 를 통해 산화물들에 부착될 수도 있다. 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 여기에 기술된 모이어티들 중 임의의 것일 수 있다. 연결기 (LG) 는 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접 또는 간접으로 연결될 수도 있다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 직접 연결되는 경우, 선택적 연결자 ("L") 는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 간접으로 연결되는 경우, 연결자 (L) 는 존재하고 n 은 1 이다. 연결자 (L) 는 선형 부분을 가질 수도 있으며, 여기서 그 선형 부분의 백본은 본 기술에서 알려진 바와 같은 화학 결합 제한들을 받는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자들의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 200 개의 비수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 일부 비한정적인 실시형태에서, 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도 또는 포스포네이트 기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 또한, 연결자 (L) 는 연결자의 백본을 차단하는 하나 이상의 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로환 기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L) 의 백본은 10 내지 20 개의 원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L) 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 골격 원자는 모두 탄소 원자이다. 다른 실시형태에서, 백본 원자는 모든 탄소가 아니며, 당업계에 공지된 바와 같이 화학 결합 제한이 있는 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 또는 인 원자의 임의의 가능한 조합을 포함할 수 있다.
마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 1 단계 공정으로 기질의 표면에 첨가하는 경우, 식 2의 분자를 사용하여 코팅 재료를 도입할 수 있다 :
모이어티 - (L)n - LG.
식 2
일부 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 다단계 공정으로 기질의 표면에 첨가될 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 단계별 방식으로 표면에 커플링되는 경우, 연결자 (L) 는 식 3 에 도시된 바와 같이 커플링기 (CG) 를 더 포함할 수 있다.
Figure pct00003
일부 실시형태에서, 커플링기 (CG) 는 반응성 모이어티 (Rx) 및 반응성 쌍 부분 (Rpx) (즉, 반응성 모이어티 (Rx) 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과의 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 통상적인 커플링기 (CG) 는 활성화된 에스테르, 산 클로라이드 등과 같은 카르복실산의 유도체와 아미노기의 반응의 결과인 카로복사미딜기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸릴렌기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐기, 또는 반응성 모이어티의 그의 각각의 반응성 페어링 모이어티와의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 커플링기 (CG) 는 연결자 (L) 의 제 2 단부 (마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 근접한 단부) 에 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태에서, 커플링기 (CG) 는 연결자 (L) 의 백본을 차단할 수 있다. 일부 실시형태에서, 커플링기 (CG) 는 알키닐기와 아지드기 사이의 반응의 결과인 트리아졸릴렌이고, 이들 중 하나는 반응성 모이어티 (Rx) 또는 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 일 수 있고, 이는 클릭 커플링 반응에서 사용하기 위해 업계에 공지되어 있다. 트리아졸릴렌기는 또한 추가로 치환될 수 있다. 예를 들어, 디벤조시클로옥테닐 융합 트리아졸릴렌기는 디벤조시클로옥티닐 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 에 결합된 모이어티와 표면 개질 분자의 아지도 반응성 모이어티 (Rx) 의 반응으로부터 초래할 수 있고, 이는 다음의 단락에서 보다 상세하게 기술된다. 다양한 디벤조시클로옥티닐 개질 분자가 당업계에 공지되어 있거나 또는 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 통합하도록 합성될 수 있다.
코팅 재료가 다단계 공정으로 형성되는 경우, 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 모이어티-함유 시약 (식 5) 과 이에 공유 결합으로 연결된 표면 개질 리간드 (식 6) 를 갖는 기질의 반응에 의해 도입될 수 있다.
Figure pct00004
식 4의 개질된 표면에는 -LG-(L")j-Rx 의 식을 갖는 표면 개질 리간드가 부착되어 있고, 이는 기질의 산화물에 연결되고 식 1의 컨디셔닝된 표면에 대해 전술한 바와 유사하게 형성된다. 기질의 표면은 전술한 바와 같이 DEP-구성 기질 표면일 수 있고, 기질에 고유하거나 또는 그 안에 도입된 산화물을 포함할 수 있다. 연결기 (LG) 는 상기한 바와 같다. 연결자 (L") 은 존재할 수 있거나 (j=1) 또는 부재 (j=0) 일 수 있다. 연결자 (L") 는 선형 부분의 백본이 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 100 개의 비수소 원자를 포함할 수 있는 선형 부분을 가질 수 있고, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 화학적 결합이 제한된다. 그것은 몇몇 비한정적인 예에서 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도 또는 포스포네이트 기의 임의의 조합으로 차단될 수 있다. 또한, 연결자 (L") 는 연결자의 백본을 차단하는 하나 이상의 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클릭 기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L") 의 백본은 10 내지 20 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L") 의 백본은 약 5 개의 원자 내지 약 100 개의 원자; 약 10 개의 원자 내지 약 80 개의 원자, 약 10 개의 원자 내지 약 50 개의 원자, 또는 약 10 개의 원자 내지 약 40 개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 백본 원자는 모두 탄소 원자이다. 다른 실시형태에서, 백본 원자는 모든 탄소가 아니며, 당업계에 공지된 바와 같이 화학 결합 제한이 있는 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 또는 인 원자의 임의의 가능한 조합을 포함할 수 있다.
반응성 모이어티 (Rx) 는 표면과 표면 개질 리간드의 공유 연결 원위에 있는 표면 개질 리간드의 말단에 존재한다. 반응성 모이어티 (Rx) 는 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 모이어티를 도입하기 위한 커플링 반응에 유용한 임의의 적합한 반응성 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 반응성 모이어티 (Rx) 는 아지도, 아미노, 브로모, 티올, 활성화된 에스테르, 숙신이미딜 또는 알키닐 모이어티일 수 있다.
모이어티-함유 시약. 모이어티-함유 시약 (식 5) 은 마이크로유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공급하도록 구성된다.
모이어티-(L')m-Rpx
식 5
모이어티-함유 시약에서 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 와 반응성 모이어티 (Rx) 의 반응에 의해 표면 개질 리간드에 연결된다. 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 각각의 반응성 모이어티 (Rx) 와 반응하도록 구성된 임의의 적합한 반응기이다. 하나의 비한정적인 예에서, 하나의 적합한 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 알킨일 수 있고 반응성 모이어티 (Rx) 는 아지드일 수 있다. 대안으로, 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 아지드 모이어티일 수 있고 각각의 반응성 모이어티 (Rx) 는 알킨일 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 활성 에스테르 관능기일 수 있고 반응성 모이어티 (Rx) 는 아미노기일 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 알데히드일 수 있고 반응성 모이어티 (Rx) 는 아미노일 수 있다. 다른 반응성 모이어티-반응성 쌍 모이어티 조합들도 가능하고, 이들 예는 결코 제한적인 것은 아니다.
식 5의 모이어티-함유 시약의 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는, 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬을 포함함) 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만 이것에 제한되지 않는) 단당류 또는 다당류; (프로파르길 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 알콜류; 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 폴리알콜류; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 알킬렌 에테르류; (폴리아크릴산 또는 폴리비닐 포스폰산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 고분자 전해질류; 아미노기들 (알킬레이티드 아민류, 히드록시알킬레이티드 아미노기, 구아니디늄과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 그것의 유도체들, 및 모르폴리닐 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 비방향화된 질소 고리 원자를 함유하는 헤테로실릭 기들을 포함); (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 카르복실산류; (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 에티닐 포스폰산을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 포스폰산류; 술포네이트 음이온들; 카르복시베타인류; 술포베타인류; 술파믹산류; 또는 아미노산류를 포함하여, 본원에 기재된 모이어티들 중 임의의 모이어티를 포함할 수 있다.
식 5의 모이어티-함유 시약의 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 에 직접적으로 연결될 수 있거나 (즉, L', 여기서 m = 0) 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 가 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 유지 및/또는 팽창을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 간접적으로 연결되는 경우, 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 연결자 (L') (m = 1) 에 연결될 수 있다. 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 는 연결자 (L') 의 제 1 말단에 연결될 수 있고, 표면 파울링을 감소시키고 및/또는 세포 부착을 방지 또는 감소시키도록 구성된 모이어티는 연결자 (L') 의 제 2 말단에 연결될 수 있다. 연결자 (L') 는 선형 부분의 백본이 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 100 개의 비수소 원자를 포함하는 선형 부분을 가질 수 있고, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 화학적 결합이 제한된다. 그것은 몇몇 비한정적인 예에서 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도 또는 포스포네이트 기의 임의의 조합으로 차단될 수 있다. 또한, 연결자 (L') 는 연결자의 백본을 차단하는 하나 이상의 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클릭 기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L') 의 백본은 10 내지 20 개의 원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L') 의 백본은 약 5 개의 원자 내지 약 100 개의 원자; 약 10 개의 원자 내지 약 80 개의 원자; 약 10 개의 원자 내지 약 50 개의 원자; 또는 약 10 개의 원자 내지 약 40 개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 백본 원자는 모두 탄소 원자이다. 다른 실시형태에서, 백본 원자는 모든 탄소가 아니며, 당업계에 공지된 바와 같이 화학 결합 제한이 있는 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 또는 인 원자의 임의의 가능한 조합을 포함할 수 있다.
모이어티-함유 시약 (식 5) 이 표면 개질 리간드 (식 3) 를 갖는 표면과 반응할 때, 식 2의 컨디셔닝된 표면을 갖는 기질이 형성된다. 연결자 (L') 및 연결자 (L") 는 공식적으로 연결자 (L) 의 일부이고, 반응성 쌍 모이어티 (Rpx) 와 반응성 모이어티 (Rx) 의 반응은 식 2의 커플링기 (CG) 를 생성한다.
표면 개질 시약. 표면 개질 시약은 LG-(L")j- Rx 구조를 갖는 화합물이다 (식 4). 연결기 (LG) 는 기질 표면의 산화물과 공유 결합으로 연결된다. 기질은 DEP-구성 기질일 수 있고, 규소 또는 알루미나 또는 산화 하프늄을 포함할 수 있고, 그리고 산화물은 기질의 천연 화학 구조의 일부로서 존재할 수 있거나, 본원에서 논의된 바와 같이 도입될 수 있다. 연결기 (LG) 는 실록산 또는 포스폰산기와 기질 표면 상의 산화물과의 반응으로부터 형성된, 실록시 또는 포스포네이트 에스테르 기와 같은 본원에 기재된 임의의 연결기일 수 있다. 반응성 모이이터 (Rx) 는 상기 설명되어 있다. 반응성 모이이터 (Rx) 는 연결기 (LG) 에 직접 연결될 수 있거나 (L", j = 0) 또는 연결자 (L") (j = 1) 를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 연결기 (LG) 는 연결자 (L") 의 제 1 말단에 부착될 수 있고, 반응성 모이어티 (Rx) 는 연결자 (L") 의 제 2 말단에 연결될 수 있으며, 이는 일단 표면 개질 시약이 식 6에서와 같이 표면에 부착되면 기질의 표면에 대해 원위에 있을 것이다.
Figure pct00005
연결자 (L") 는 선형 부분을 가질 수 있고, 여기서 선형 부분의 백본은 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 100 개의 비수소 원자를 포함한다. 그것은 몇몇 비한정적인 예에서 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도 또는 포스포네이트 기의 임의의 조합으로 차단될 수 있다. 또한, 연결자 (L") 는 연결자 (L") 의 백본을 차단하는 하나 이상의 아릴렌, 헤테로아릴렌 또는 헤테로시클릭 기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L') 의 백본은 10 내지 20 개의 원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L") 의 백본은 약 5 개의 원자 내지 약 100 개의 원자; 약 10 개의 원자 내지 약 80 개의 원자, 약 10 개의 원자 내지 약 50 개의 원자, 또는 약 10 개의 원자 내지 약 40 개의 원자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 백본 원자는 모두 탄소 원자이다. 다른 실시형태에서, 백본 원자는 모든 탄소가 아니며, 당업계에 공지된 바와 같이 화학 결합 제한이 있는 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 또는 인 원자의 임의의 가능한 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학 기상 증착을 사용하여 마이크로유체 디바이스의 내부 표면 상에 증착된다. 화학 기상 증착을 통해, 코팅 재료는 코팅 재료를 포함하는 분자가 마이크로유체 디바이스의 내부 표면의 분자에 공유 결합되는 고밀도의 단층을 달성할 수 있다. 바람직한 패킹 밀도를 달성하기 위해, 예를 들어, 알킬 말단 실록산을 포함하는 분자는 적어도 110℃ (예를 들어, 적어도 120℃, 130℃, 140℃, 150℃, 160℃ 등) 의 온도에서 적어도 15 시간 (예를 들어, 적어도 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 그 이상의 시간) 의 기간 동안 기상 증착될 수 있다. 이러한 기상 증착은 전형적으로 진공하에 수화된 황산염 (예를 들어, MgSO4·7H20) 과 같은 물 공급원의 존재하에 수행된다. 전형적으로, 기상 증착의 온도 및 지속 시간을 증가시키는 것은 소수성 코팅 재료의 개선된 특성을 생산한다.
기상 증착 프로세스는 예를 들어, 커버 (110), 마이크로유체 회로 재료 (116), 및/또는 기질 (DEP-구성 기질의 전극 활성화 기질 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성 기질의 지지 구조 (104) 의 유전체층) 을 예비 세정함으로써 선택적으로 향상될 수 있다. 예를 들어, 이러한 예비 세정은 아세톤 배쓰, 에탄올 배쓰 또는 이들의 조합과 같은 용매 배쓰를 포함할 수 있다. 용매 배쓰는 초음파 처리를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 그러한 예비 세정은 동시에 산화된 표면 (여기에 기술된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 산화물들) 을 도입하면서 여러 불순물들을 제거할 수 있는 산소 형질 클리너에서 커버 (110), 마이크로유체 회로 재료 (116), 및/또는 기질을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 산소 형질 클리너는 예를 들어 진공 상태에서 100W에서 60 초 동안 작동될 수 있다. 대안으로, 표면을 산화시키는 과산화수소와 같은 산화제를 포함하는 액상 처리가 산소 형질 클리너 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 염산과 과산화수소의 혼합물 또는 황산과 과산화수소의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1 의 범위의 황산과 과산화수소의 비를 가질 수도 있는 피라냐 용액) 이 산소 형질 클리너 대신에 사용될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 마이크로유체 디바이스 (200) 가 마이크로유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위해 조립된 후 마이크로유체 디바이스 (200) 의 내부 표면을 코팅하기 위해 사용된다. 고밀도로 패킹된 단층을 포함하는 코팅 재료를 완전 조립된 마이크로유체 회로 (120) 상에 증착하는 것은 다양한 기능적 특성을 제공하는데 유익할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 완전히 조립된 마이크로유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료를 증착하는 것은 마이크로유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기질 (206) 유전체층 및/또는 커버 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다.
도 2h 는 예시적인 부류의 코팅 재료를 포함하는 마이크로유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 도시된 바와 같이, (개략적으로 도시된) 코팅 재료들 (298) 은 기질 (286) 의 내부 표면 (294) 및 마이크로유체 디바이스 (290) 의 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 양자에 공유결합으로 결합된 고밀도로 팩킹된 분자들의 단층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서 그리고 상술된 바와 같이 마이크로유체 디바이스 (290) 내의 회로 소자들 및/또는 구조들을 정의하기 위해 사용되는 마이크로유체 회로 재료 (미도시) 의 표면들을 포함하는, 마이크로유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 근접하고, 그것을 향해 내부로 마주하는 모든 내부 표면들 (294, 292) 에 증착될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 는 마이크로유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 단지 하나 또는 일부에만 증착될 수 있다.
도 2h에 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 알킬 말단 실록산 분자의 단층을 포함하고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 마이크로유체 디바이스 (290) 의 내부 표면 (292, 294) 에 공유 결합으로 결합된다. 그러나, 상술한 코팅 재료들 (298) 중 임의의 것이 사용될 수 있다 (예를 들어, 알킬 말단의 포스포네이트 에스테르 분자들). 보다 구체적으로, 알킬기는 적어도 10 개의 탄소 원자 (예를 들어, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 그 이상의 탄소 원자) 의 선형 사슬을 포함할 수 있고, 임의로 치환된 알킬기일 수 있다. 전술한 바와 같이, 고밀도로 팩킹된 분자의 단층을 포함하는 코팅 재료 (298) 는 최소 전하 트래핑, 감소된 물리적/전기적 두께 및 실질적으로 균일한 표면과 같은 DEP 구성 마이크로유체 디바이스 (290) 에 사용하기 위한 유리한 기능적 특성을 가질 수 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 그 인클로저-대면 말단 (즉, 내측 표면 (292, 294) 에 결합하지 않고 인클로저 (284) 에 인접하는 코팅 재료 (298) 의 단층의 부분) 에 플루오로알킬기 (예를 들어, 플루오르화 알킬기 또는 퍼플루오르화 알킬기) 를 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 코팅 재료 (298) 는 플루오로알킬 말단의 실록산 또는 플루오로알킬 말단의 포스포네이트 에스테르의 단층을 포함할 수 있으며, 여기서 플루오로알킬기는 코팅 재료 (298) 의 인클로저-대면 말단에 존재한다. 이러한 코팅 재료 (298) 는 비생물학적 분자 (예를 들어, 기질의 규소 및/또는 산화 규소) 로부터 생물학적 마이크로-객체를 분리 또는 "실드"함으로써 생물학적 마이크로-객체들 (예를 들어, 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 또는 하이브리도마 세포와 같은 세포) 의 향상된 유지 및/또는 팽창을 위해 제공함에 있어서 기능적 이점을 제공한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 마이크로유체 디바이스 (290) 의 내부 표면(들) (292, 294) 을 코팅하기 위해 사용되는 코팅 재료 (298) 는 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온 모이어티들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 마이크로유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들을 제공함으로써, 코팅 재료 (298) 는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기질의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 핵들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 또한, 코팅 재료 (298) 가 블로킹제들과 함께 사용되는 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 양쪽성 이온들은 인클로저 (284) 내의 배지 (180) (예를 들어, 코팅 용액) 에 존재하는 비공유결합 코팅제들 (예를 들어, 용액 내의 단백질들) 의 대전된 부분들과 이온성 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, 코팅 재료는 친수성 코팅제를 그것의 인클로저-대향 말단에 포함하거나 제공하도록 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅제는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅제는 덱스트란과 같은 다당류일 수도 있다. 상술된 대전된 모이어티들 (예를 들어, 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들) 처럼, 친수성 코팅제는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기질의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 핵들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
항체 발현을 검출하는 방법. 본원에 개시된 방법은 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 생물학적 세포를 검출 또는 식별하는 방법을 포함한다. 관심 항원은 단백질, 탄수화물 기 또는 사슬, 단백질 또는 탄수화물 이외의 생물학적 또는 화학적 작용제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 관심 항원은 예를 들어 바이러스, 박테리아 병원체, 진균 병원체, 원충 병원체 등과 같은 병원체와 관련된 항원일 수 있다. 대안으로, 관심 항원은 폐암, 유방암, 흑색종 등과 같은 암과 관련될 수 있다. 또 다른 대안에서, 항원은 다발성 경화증 또는 타입 I 당뇨병과 같은 자가 면역 질환과 관련될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "병원체와 관련된"은 관심 항원과 관련하여 사용될 때, 관심 항원이 병원체에 의해 직접 생성되거나 병원체와 숙주 사이의 상호 작용으로부터 기인한 것을 의미한다.
관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 생물학적 세포를 검출하는 방법은 본원에 기재된 마이크로유체 디바이스에서 수행될 수 있다. 특히, 마이크로유체 디바이스는 하나 이상의 마이크로유체 채널들을 포함할 수 있는 흐름 영역 및 격리 펜 (또는 복수의 격리 펜들) 을 갖는 인클로저를 포함할 수 있다. 격리 펜은 단리 영역 및 연결 영역을 포함할 수 있으며, 연결 영역은 단리 영역과 흐름 영역/마이크로유체 채널 사이에 유체 연결을 제공한다. 격리 펜은 약 0.5 nL 내지 약 5.0 nl, 또는 그 안의 임의의 범위 (예를 들어, 약 0.5 nl 내지 약 1.0 nl, 약 0.5 nl 내지 약 1.5 nl, 약 0.5 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.0 nl 내지 약 1.5 nl, 약 1.0 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.0 nl 내지 약 2.5 nl, 약 1.5 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.5 nl 내지 약 2.5 nl, 약 1.5 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.0 nl 내지 약 2.5 nl, 약 2.0 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.0 nl 내지 약 3.5 nl, 약 2.5 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.5 nl 내지 약 3.5 nl, 약 2.5 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.0 nl 내지 약 3.5 nl, 약 3.0 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.0 nl 내지 약 4.5 nl, 약 3.5 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.5 nl 내지 약 4.5 nl, 약 3.5 nl 내지 약 5.0 nl, 약 4.0 nl 내지 약 4.5 nl, 약 4.0 nl 내지 약 5.0 nl, 약 4.5 nl 내지 약 5.0 nl, 또는 상기 종점 중 하나에 의해 정의된 임의의 범위) 의 체적을 가질 수 있다. 연결 영역은 본원에 일반적으로 기재된 바와 같은 폭 (Wcon) (예를 들어, 약 20 마이크론 내지 약 100 마이크론, 또는 약 30 마이크론 내지 약 60 마이크론) 을 가질 수 있다. 단리 영역의 폭 (Wiso) 은 상기 연결 영역의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다. 특정 실시형태에서, 단리 영역은 폭 (Wiso) 이 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론이다.
격리 펜의 흐름 영역, 격리 펜, 및/또는 단리 영역은 생물학적 세포의 생존력을 촉진하고 및/또는 생물학적 세포와의 상호 작용을 감소시키는 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 코팅 재료는 하이브리도마 세포의 생존력을 증진시키고, 및/또는 B 세포 림프구 (예를 들어, 메모리 B 세포 또는 형질 세포) 의 생존력을 증진시키고, 및/또는 마이크로유체 디바이스 내에서의 임의의 세포들의 이동 능력을 증진시킬 수 있다. 이 문맥에 사용된 바와 같이, "생존력 증진"은 생물학적 세포를 발현하는 항체의 생존력이 코팅되지 않은 동등한 표면에 비해 코팅된 표면에서 더 우수함을 의미한다. 특정 실시형태에서, 흐름 영역, 격리 펜 및/또는 단리 영역은 각각 항체 발현 세포의 생존력을 증진하고 및/또는 항체 발현 세포와의 상호작용을 감소시키는 코팅 재료로 코팅된 복수의 표면들을 갖는다. 코팅 재료는 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기재된 임의의 적합한 코팅 재료일 수 있다. 코팅 재료는 예를 들어 친수성 분자들을 포함할 수 있다. 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 폴리머, 탄수화물기를 포함하는 폴리머, 아미노산 (예를 들어, BSA와 같은 단백질) 을 포함하는 폴리머 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
격리 펜의 흐름 영역, 격리 펜 및/또는 단리 영역은 생물학적 세포를 발현하는 항체와의 생존력을 증진시키고 및/또는 상호 작용을 감소시키는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 컨디셔닝된 표면은 하이브리도마 세포의 생존력을 증진시키고, 및/또는 B 세포 림프구 (예를 들어, 메모리 B 세포 또는 형질 세포) 의 생존력을 증진시키고, 및/또는 마이크로유체 디바이스 내에서의 임의의 세포들의 이동 능력을 증진시킬 수 있다. 이 문맥에서 사용되는 바와 같이, "생존력 증진"은 생물학적 세포를 발현하는 항체의 생존력이 컨디셔닝되지 않은 동등한 표면에 비해 컨디셔닝된 표면에서 더 우수함을 의미한다. 특정 실시형태에서, 흐름 영역, 격리 펜 및/또는 단리 영역은 각각 항체 발현 세포의 생존력을 증진하고 및/또는 항체 발현 세포와의 상호 작용을 감소시킬 수 있는 복수의 컨디셔닝된 표면을 갖는다. 컨디셔닝된 표면(들)은 공유 결합으로 연결된 분자를 포함할 수 있다. 공유 결합으로 연결된 분자는 예를 들어 공유 결합으로 연결된 친수성 분자를 포함하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 분자 및/또는 본원에 개시된 임의의 적합한 분자일 수 있다. 친수성 분자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 폴리머, 탄수화물기를 포함하는 폴리머, 아미노산을 포함하는 폴리머 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 친수성 분자는 본원에 기술된 바와 같이 공유 결합으로 연결된 친수성 분자의 층을 형성할 수 있다. 대안으로, 공유 결합으로 연결된 분자는 퍼플루오로알칸 (예를 들어, 공유 결합으로 연결된 퍼플루오로알칸의 층) 을 포함할 수 있다.
관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 생물학적 세포를 검출하는 방법은, 생물학적 세포를 발현하는 항체를 함유하는 샘플을 마이크로유체 디바이스에 도입하는 단계; 항체 발현 생물학적 세포를 마이크로유체 디바이스 내의 격리 펜의 단리 영역에 로딩하는 단계; 관심 항원이 항체 발현 생물학적 세포의 근위에 위치하도록 관심 항원을 마이크로유체 디바이스에 도입하는 단계; 및 생물학적 세포에 의해 발현되는 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계를 포함한다.
항체 발현 생물학적 세포는 예를 들어 하이브리도마 세포일 수 있다. 대안으로, 항체 발현 생물학적 세포는 B 세포 림프구일 수 있다. B 세포 림프구는 예를 들어, CD27+ B 세포 또는 CD138+ B 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, B 세포는 메모리 B 세포이다. 다른 실시형태에서, B 세포는 형질 세포이다.
항체 발현 생물학적 세포를 마이크로유체 디바이스에 도입하는 것은 항체 발현 세포를 함유하는 샘플을 얻는 것을 수반할 수 있다. 항체 발현 생물학적 세포가 B 세포 림프구인 실시형태에 있어서, B 세포 림프구를 함유하는 샘플은 인간과 같은 포유 동물, 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터), 토끼, 흰 족제비, 가축 (예를 들어, 염소, 양, 돼지, 말, 소), 라마, 낙타, 원숭이로부터 얻거나 또는 닭과 칠면조와 같은 조류종으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태들에서, 포유 동물은 관심 항원에 대해 면역화되어 있다. 일부 실시형태들에서, 동물은 관심 항원과 관련된 병원체에 노출되거나 감염되어 있다. 일부 실시형태들에서, 동물은 관심 항원과 관련있는 암을 갖는다. 다른 실시형태들에서, 동물은 관심 항원과 관련된 자가 면역 질환을 갖는다. B 세포 림프구를 함유하는 샘플은 말초 혈액 샘플 (예를 들어 PBMC), 비장 생검, 골수 생검, 림프절 생검, 종양 생검, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
B 세포 림프구를 함유한 샘플은 원하는 B 세포 림프구를 풍부하게 하기 위해 처리 (예를 들어, 음성으로 및/또는 양성으로, 소팅) 될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 원하는 B 세포 림프구들은 메모리 B 세포들이다. 다른 실시형태들에서, 원하는 B 세포 림프구들은 형질 세포들이다. 일부 실시형태들에서, 원하는 B 세포 림프구들은 IgG 타입 항체를 발현한다. 따라서, 예를 들어, 샘플은 B 세포 림프구들 이외의 세포 타입들이 격감될 수 있다. 샘플로부터 비-B 세포 세포 타입들을 격감시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 DYNABEADS™ Untouched Human B Cells 시약 (Thermo Fisher), B Cell Isolation Kit (Miltenyi), EasySep B Cell Enrichment Kit (EasySep), RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktain (Stem Cell Technologies) 등으로 샘플을 처리하는 것을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, B 세포 림프구를 함유하는 샘플은 형광 관련 세포 소팅 (FACS) 에 의해 소팅하여 원하지 않는 세포 타입들을 제거하고 원하는 세포 타입들을 풍부하게 할 수 있다. FACS 소팅은 음성 및/또는 양성일 수 있다. 예를 들어, FACS 소팅은 IgM 항체, IgA 항체, IgD 항체, IgG 항체 또는 이들의 임의 조합을 발현하는 B 세포 림프구 샘플을 격감시킬 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, FACS 소팅은 CD27 (또는 일부 다른 메모리 B 세포 마커) 을 발현하는 B 세포 림프구 또는 CD138 (또는 다른 일부 형질 세포 마커) 을 발현하는 B 세포 림프구에 대한 샘플을 풍부하게 할 수 있다. B 세포 림프구를 함유하는 샘플은 방법의 일부로서 원하는 B 세포 림프구를 풍부하게 하는 처리가 요구되지 않도록 농축된 상태 (즉, 전처리된 상태) 로 제공될 수 있다. 대안으로, B 세포 림프구를 함유하는 샘플을 처리하여 원하는 B 세포 림프구를 풍부하게 하는 것이 본 발명의 방법의 일부로서 수행될 수 있다.
B 세포 림프구를 함유하는 샘플은 샘플 내의 세포들이 마이크로유체 디바이스에 부착되는 것을 감소시키도록 처리될 수 있다. 예를 들어, Benzonase® 뉴클레아제 (Millipore) 와 같은 DNase로 샘플을 처리할 수 있다. 바람직하게는, DNase는 최소한의 프로테아제 활성을 함유한다.
항체 발현 생물학적 세포를 마이크로유체 디바이스에 도입하는 것은 생물학적 세포를 함유하는 샘플을 마이크로유체 디바이스의 인렛으로 및 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역의 일 부분을 통해 흐르게 함으로써 수행될 수 있다. 마이크로유체 디바이스를 통과하는 샘플의 흐름은 중단되어 항체 발현 생물학적 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 를 격리 펜의 단리 영역에 로딩하게 할 수 있다. 항체 발현 세포의 단리 영역으로의 로딩은 중력 및/또는 DEP 힘을 사용하는 것과 같이 당업계에 공지된 또는 본원에 개시된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 단일 항체 발현 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 가 단리 영역에 로딩된다. 특정 실시형태들에서, 단일 항체 발현 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 는 마이크로유체 디바이스 내의 복수의 격리 펜들의 각 격리 펜의 단리 영역으로 로딩된다.
관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 생물학적 세포를 검출하는 방법은 B 세포 림프구를 B 세포 활성화를 자극하는 자극제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 자극제는 CD40 작동제, 예컨대 CD40L, 이의 유도체 또는 항-CD40 항체일 수 있다. 자극제는 CD40L+ 피더 세포들을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 또는 이들로 구성될 수 있다. CD40L+ 피더 세포들은 T 세포들 (예를 들어, Jurkat D1.1 세포들) 또는 이의 유도체일 수 있다. 대안으로, 피더 세포들은 CD40L-발현 구조물로 형질 감염/형질 전환된 세포주 (예를 들어, NIH-3T3 세포들) 일 수 있다. 자극제는 단백질 A, 단백질 G, 또는 임의의 다른 BCR 슈퍼항원과 같은 B 세포 수용체 (BCR) 슈퍼항원을 더 포함할 수 있다. BCR 슈퍼항원은 비드 (bead), 지질 소포 (lipid vesicle), 지질 나노라프트 (lipid nanoraft) 등과 같은 마이크로-객체에 부착될 수 있다. 따라서, 슈퍼항원으로 코팅된 마이크로-객체는 CD40L+ 피더 세포들과 혼합될 수 있다. 혼합물은 약 1:1 피더 세포 대 마이크로-객체의 비율, 또는 약 1:5 피더 세포 대 마이크로-객체의 비율, 또는 그 사이의 임의의 비율을 가질 수 있다. 대안으로, 혼합물은 약 1:2 피더 세포 대 마이크로-객체의 비율, 또는 약 2:10 피더 세포 대 마이크로-객체의 비율, 또는 이들 사이의 임의의 비율을 가질 수 있다. 자극제는 CD40 작동제 및 선택적으로 BCR 슈퍼항원과 조합될 수 있는 톨 유사 수용체 (TLR) 작동제 (예를 들어, TLR9 작동제) 를 더 포함할 수 있다. TLR 작동제는 예를 들어 CpG 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, CpG2006) 일 수 있다. CpG 올리고뉴클레오티드는 약 1 마이크로그램/mL 내지 약 20 마이크로그램/mL (예를 들어, 약 1.5 내지 약 15 마이크로그램/mL, 약 2.0 내지 약 10 마이크로그램/mL, 또는 약 2.5 내지 약 5.0 마이크로그램/mL) 의 농도로 사용될 수 있다. B 세포 림프구는 1 내지 10 일 (예를 들어, 2 내지 8 일, 3 내지 7 일, 또는 4 내지 6 일) 의 기간 동안 자극제와 접촉 (예를 들어, 실질적으로 연속적으로 또는 주기적으로/간헐적으로) 될 수 있다. B 세포 림프구가 로딩되는 격리 펜 내의 자극제와 B 세포 림프구를 접촉시킬 수 있다. 이러한 접촉은 B 세포 림프구가 격리 펜에 로딩된 이후에 발생할 수 있다.
관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 생물학적 세포를 검출하는 방법은, B 세포 활성화 및/또는 팽창을 증진하는 하나 이상의 성장 유도제를 포함하는 배양/활성화 매질을 항체 발현 생물학적 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 에 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 성장 유도제는 CpG 올리고뉴클레오티드, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21, BAFF 및 April 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함할 수 있다. IL-2 는 약 2 ng/mL 내지 약 5 ug/mL, 또는 약 50 ng/mL 내지 약 2 ug/mL, 또는 약 100 ng/mL 내지 약 1.5 ug/mL, 또는 약 500 ng/mL 내지 약 1 ug/mL, 또는 약 1 ug/mL 의 농도로 제공될 수 있다. IL-4 는 약 2 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 내지 약 10 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 의 농도로 제공될 수 있다. IL-6, IL-10 및/또는 IL-21 은 약 2 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 또는 약 5 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL 의 농도로 제공될 수 있다. BAFF 및/또는 April 은 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL 내지 약 20 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL 의 농도로 제공될 수 있다. CpG 올리고뉴클레오티드는 약 1 마이크로그램/mL 내지 약 20 마이크로그램/mL, 약 1.5 내지 약 15 마이크로그램/mL, 약 2.0 내지 약 10 마이크로그램/mL, 또는 약 2.0 마이크로그램/mL 의 농도로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배양 배지는 1 내지 10 일 (예를 들어, 2 내지 8 일, 3 내지 7 일, 또는 4 내지 6 일) 의 기간의 항체 발현 생물학적 세포에 제공된다. 배양 배지는 자극제 (예를 들어, CD40 작동제 및/또는 BCR 슈퍼항원) 를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 항체 생산 세포가 B 세포 림프구인 경우, 배양 배지를 B 세포 림프구에 제공하는 것은 B 세포 림프구를 활성화제와 접촉시키는 것과 동시에 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, B 세포 림프구를 자극제와 접촉시키는 단계 및 B 세포 림프구에 배양 배지를 제공하는 단계는 중첩 시간에 (예를 들어, 실질적으로 동연의 시간에 걸쳐) 수행된다.
특정 실시형태들에서, 관심 항원을 항체 발현 생물학적 세포의 근위에 위치하도록 관심 항원을 마이크로유체 디바이스에 도입하는 단계는 생물학적 세포의 1 밀리미터 (mm) 이내에 (예를 들어, 생물학적 세포의 750 마이크론 이내, 600 마이크론 이내, 500 마이크론 이내, 400 마이크론 이내, 300 마이크론 이내, 200 마이크론 이내, 100 마이크론 이내 또는 50 마이크론 이내에) 관심 항원을 위치시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 격리 펜에 연결된 흐름 영역/마이크로유체 채널에 마이크로-객체 또는 복수의 마이크로-객체들을 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 마이크로-객체들은 항-IGL 항체 또는 다른 IgG-결합제와 같은 항체-특이적 결합제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 6c 를 참조한다. 이러한 실시형태들에서, 생물학적 세포에 의해 발현되는 항체에 대한 관심 항원의 결합의 모니터링은 항체 발현 생물학적 세포에 의해 발현되는 항체를 통해 표지된 항원과 마이크로-객체(들)의 간접적인 결합을 검출하는 것을 포함한다. 표지된 관심 항원은 가용성일 수 있고 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 마이크로-객체는 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기술된 임의의 적합한 마이크로-객체 (예를 들어, 세포, 리포솜, 지질 나노라프트 또는 비드) 일 수 있다. 관심 항원을 제공하는 단계는 항체 발현 생물학적 세포가 위치하는 격리 펜의 연결 영역에 인접하여 또는 그 연결 영역 내에 상기 마이크로-객체를 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안으로, 관심 항원을 제공하는 단계는 항체 발현 생물학적 세포가 위치하는 격리 펜의 단리 영역에 상기 마이크로-객체를 로딩하는 단계를 포함할 수 있다. 관심 항원 및 마이크로-객체는 동시에, 혼합물로서 또는 순차적으로 제공될 수 있다 (마이크로-객체가 격리 펜 내에 처음으로 위치하는 경우).
대안으로, 특정 실시형태에서, 상기 방법은 격리 펜에 연결된 흐름 영역/마이크로유체 채널에 마이크로-객체 또는 복수의 마이크로-객체들을 도입하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 관심 항원은 마이크로-객체에 커플링된다. 이러한 실시형태에서, 항-IgG 항체 또는 다른 IgG-결합제와 같은 가용성 표지된 항체 특이적 결합제가 또한 제공될 수 있고, 생물학적 세포에 의해 발현되는 항체에 대한 관심 항원의 결합의 모니터링은 항체 발현 생물학적 세포에 의해 발현된 항체를 통해 마이크로-객체(들)에 대한 표지된 항체 특이적 결합제의 간접적인 결합을 검출하는 것을 포함한다. 표지된 항체 특이적 결합제는 형광 표지와 같은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 마이크로-객체는 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기술된 임의의 적합한 마이크로-객체 (예를 들어, 세포, 리포솜, 지질 나노라프트 또는 비드) 일 수 있다. 관심 항원을 제공하는 단계는 항체 발현 생물학적 세포가 위치하는 격리 펜의 연결 영역에 인접하여 또는 그 연결 영역 내에 상기 마이크로-객체를 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 관심 항원을 제공하는 단계는 항체 발현 생물학적 세포가 위치하는 격리 펜의 단리 영역에 상기 마이크로-객체를 로딩하는 단계를 더 포함할 수 있다. 마이크로-객체 및 항체-특이적 결합제는 동시에, 혼합물로서 또는 순차적으로 제공될 수 있다 (마이크로-객체가 격리 펜 내에 먼저 배치되는 경우). 관심 분자, 예를 들어 항체의 발현을 스크리닝하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 공보 제 US2015/0151298 호에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
일부 실시형태들에서, 상기 방법은 상기 제 1 항체 특이적 결합제 이전에 또는 동시에 제 2 항체 특이적 결합제를 제공하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 도 6c 를 참조한다. 제 2 항체-결합제는 항-IgG 항체 또는 다른 타입의 항체-결합제일 수 있고 (예를 들어, 형광 표지로) 표지될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 표지된 제 2 항체 특이적 결합제는 관심 항원 및 제 1 항체 특이적 결합제와의 혼합물로 제공된다. 다른 실시형태들에서, 표지된 제 2 항체 특이적 결합제는 관심 항원 및/또는 제 1 항체 특이적 결합제를 제공한 이후에 제공된다.
특정 실시형태들에서, 관심 항원을 제공하는 단계는 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 가용성의 관심 항원을 포함하는 용액을 흐르게 하고, 그리고 항체 발현 생물학적 세포가 위치하는 격리 펜으로 가용성 항원이 확산되게 하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 가용성 항원은 검출 가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지) 에 공유 결합으로 결합될 수 있다. 이러한 방식으로 항체를 포함한 관심 분자의 발현을 스크리닝하는 일반적인 방법은 예를 들어 2017 년 4 월 14 일자로 출원된 국제 출원 PCT/US2017/027795에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 생물학적 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 검출하는 단계, 및 상기 관심 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 것으로서 상기 항체 발현 생물학적 세포 (예를 들어, B 세포 림프구) 를 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
식별된 B 세포 림프구들에서 항체 서열들을 얻음. 서열 라이브러리들을 제공하고 및/또는 항체 발현 세포들로부터 중쇄 및 경쇄 항체 서열을 얻는 방법도 또한 본원에 개시되어 있다. 또한, 관심있는 B 세포 림프구로부터 서열 분석 라이브러리를 얻는 것은 본원에 기재된 방법 이외의 방법으로 수행될 수 있다. 다른 적합한, 그러나 비제한적인 방법은 2017 년 9 월 29 일자로 출원된 PCT/US2017/054628 호에 기재되어 있으며, 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드. 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드는 제 1 프라이밍 서열 및 캡처 서열을 포함할 수 있다. 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분 뉴클레오티드 및 3'-대부분 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
캡처 서열. 캡처 서열은 용균된 세포로부터 핵산을 캡처하도록 구성된 올리고뉴클레오티드 서열이다. 다양한 실시형태들에서, 캡처 서열은 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드의 3'-대부분 뉴클레오티드에 인접하거나 이를 포함할 수 있다. 캡처 서열은 약 6 내지 약 50 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 실시형태들에서, 캡처 서열은 관심 세포로부터 방출된 핵산에 혼성화함으로써 핵산을 캡처한다. 본원에 기술된 일부 방법에서, 관심 B 세포로부터 방출된 핵산은 mRNA 일 수 있다. mRNA의 3' 말단에 PolyA 서열을 갖는 mRNA를 캡처하고 혼성화할 수 있는 캡처 서열은 polyT 서열을 포함할 수 있다. polyT 서열은 약 20 T 뉴클레오티드 내지 100 T 뉴클레오티드 초과를 가질 수 있다. 일부 실시형태들에서, polyT 서열은 약 30 내지 약 40 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. polyT 서열은 3' 말단에 2 개의 뉴클레오티드 VI를 더 포함할 수 있다.
제 1 프라이밍 서열. 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드의 제 1 프라이밍 서열은: 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드의 5'-대부분 뉴클레오티드에 인접한 캡처 서열에 대해 5' 이거나; 또는 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드의 5'-대부분 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제 1 프라이밍 서열은 일반적이거나 서열 특이적 프라이밍 서열일 수 있다. 제 1 프라이밍 서열은 결합시 역전사 효소를 프라이밍하는 프라이머에 결합할 수 있다. 제 1 프라이밍 서열은 약 10 내지 약 50 개의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다.
추가 프라이밍 및/또는 어댑터 서열. 캡처 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 흐름 세포 또는 대량의 병렬 서열화 어레이 내에서 상보적 혼성화 앵커 사이트에 대한 고정화를 위한 사이트 또는 (중합 효소에 의한 연장을 포함할 수 있는) 프라이머 연장을 위한 랜딩 사이트를 제공하는 하나 이상의 추가 프라이밍/어댑터 서열을 가질 수 있다. 여기의 방법에서, 제 2 (또는 부가적인) 프라이밍 서열은 P1 서열 (예를 들어, Illumina 서열화 케미스트리, AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT (SEQ ID NO. 1) 에서 사용된 바와 같음) 일 수 있지만, 그 방법은 이에 제한되지 않는다. 임의의 적합한 프라이밍 서열은 다른 타입의 NGS 라이브러리 제조를 위해 포함될 수 있다. 일부 실시형태들에서, P1 서열이 추가 프라이밍 서열로서 포함되는 경우, 이는 제 1 프라이밍 서열에 대해 5' 일 수 있다. P1 추가 프라이밍 서열은 또한 캡처 서열에 대해 5' 일 수 있다.
템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드. 본원에 사용된 템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드는 Moloney 쥐과 백혈병 바이러스 (Moloney murine leukemia virus, MMLV) 와 같은 적절한 역전사 효소의 말단 전사 효소 활성이 템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드를 고정하기 위해 첨가된 디옥시시티딘 뉴클레오티드를 사용하도록 허용하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드와 부가된 디옥시시티딘 사이의 염기 쌍을 만들 때, 역전사 효소는 캡처된 RNA로부터의 템플릿 가닥을 템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드로 "스위칭"하고 스위칭 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로 계속 복제한다. 따라서, 전사된 RNA의 완전한 5' 말단이 포함되고 추가 증폭을 위한 추가 프라이밍 서열이 도입될 수 있다. 또한, cDNA는 서열 독립적인 방식으로 전사된다.
BCR 유전자 서열. B 세포 수용체 유전자 서열은 방출된 RNA에서 5' 에서 3' 순서로 가변 (V), 다양성 (D), 결합 (J) 및 불변 (C) 분절을 포함하는 여러개의 서브-영역을 포함한다. 불변 영역은 polyA 서열에 대해 단지 5' 이다. BCR을 서열화하는 많은 접근법에서, 폴리 A 서열 (꼬리) 를 포함하지 않는 서열화를 위한 앰플리콘을 얻기 위한 선택 전략을 구축하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 불변 영역을 거의 보유하지 않는 앰플리콘을 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 방출된 핵산 서열의 이들 섹션을 배제하기 위해 증폭을 제한하면, BCR의 V, D (존재하는 경우) 및 J 분절의 보다 강건한 서열화가 가능해진다.
방법의 더 나은 이해를 위해 도 8a-8h를 참조하면, 도 8a-8h의 각각은 단일 세포로부터 BCR 서열화 라이브러리를 얻는 프로세스에서 상이한 지점에 존재하는 단일 종 또는 관련 이중 종의 세트를 나타낸다. 프로세스는 다수의 단일 세포들이 웰 플레이트 내의 특정 시작 사이트로 다시 추적될 수 있는 서열화 라이브러리를 제공하도록 처리될 수 있도록 다중화될 수 있다. 이 위치에 대한 정보는 또한 세포가 배출된 마이크로유체 디바이스 내의 개별 격리 펜으로 다시 추적 가능할 수 있다. 따라서, 생물학적 세포는 원하는 생성물의 생성 또는 다른 세포들을 자극하는 원하는 능력에 대해 검정된 다음, 추적 가능하게 배출될 수 있고, 서열화 라이브러리를 제공하기 위해 추적 가능하게 프로세싱될 수 있고, 그리고 서열화로부터 유도된 결과적인 게놈 데이터는 마이크로유체 디바이스의 소스 세포와 식별 가능하게 상관될 수 있다.
도 8a 에서, 생물학적 세포의 용해시, mRNA (810) 가 방출된다. 방출된 mRNA (810) 는 관심 유전자 서열 (805) 을 포함할 수 있고, 그의 3' 말단에 polyA 분절 (815) 을 갖는다. 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드 (820) 는 P1 프라이밍 서열 (825) 및 PolyT 캡처 서열 (도 8a 에서 T30NI로 나타냄, 이는 30 T 뉴클레오티드의 서열을 나타내고, 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드 (820) 의 3' 말단에 2-뉴클레오티드 서열 (NI) 을 가짐) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, PolyT 캡처 서열의 T30NI 서열 중 N 뉴클레오티드는 G, C 및 A로부터 선택될 수 있다 (예를 들어, T 뉴클레오티드를 배제할 수 있음). 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드는 방출된 mRNA (810) 의 PolyT 서열 (815) 에 결합할 수 있다.
도 8b 에서, mRNA (810) 를 탬플릿으로 사용하여 역전사 효소가 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드를 연장시켜 관심 유전자 (805) 를 전사물 (transcript) 에 통합시키는, 역전사의 초기 프로세스가 나타내진다. mRNA (810) 의 3' 말단에 도달하면, 역전사 효소는 여러개의 C (여기서는 3 개의 C로 나타냄) 뉴클레오티드를 부가한다.
도 8c 에서, 전사물 스위칭 올리고뉴클레오티드 (TSO) (835) 는 역전사 반응 혼합물 내에 존재하며, 여기서 TSO는 P1 서열 (825) 을 포함하고 4 개의 뉴클레오티드 (N4) 제 1 바코드 (802) 를 더 포함할 수 있다. 하기 기재된 예에서, TSO (835) 는 SEQ ID NO. 3 의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 제 1 바코드 (802) 는 서열화 동안 여러개의 실험들을 멀티플렉싱하는데 사용될 수 있으며, 이 방법은 제 1 바코드 (802) 가 존재하도록 요구하는 것으로 제한되지 않는다. 제 1 바코드 (802) 는 4 개의 뉴클레오티드를 갖는 것으로 제한되지 않지만, 서열화 라이브러리 제품을 식별 가능하게 하기 위해 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제 1 (다중화) 바코드는 약 3 개의 뉴클레오티드 내지 약 10 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. TSO 는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 연결된 비오틴을 더 포함하여 효율을 증가시킬 수 있다.
역전사에서, TSO 는 mRNA (810) 의 5' 말단과 정렬되어 역전사 효소가 "템플릿을 스위칭"하게 하고 TSO의 디옥시뉴클레오티드를 템플릿으로 사용하게 하여 cDNA (830) 를 그 3' 말단에서 3개의 C 뉴클레오티드를 지나 연장하게 하여, 도 8d에 도시된 바와 같이, 처음 4 개의 뉴클레오티드 바코드 (802) (N4) 및 TSO의 P1 서열 (825) 을 통합한다. 완전히 확장된 cDNA 생성물 (840) 은 이제 양 말단에 P1 프라이밍 서열, 관심 유전자 (805) 및 임의로 제 1 바코드 (802) (N4) 를 포함한다. cDNA 생성물 (840) 은 또한 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드 (820) 의 캡처 서열로부터 통합된 polyT-NI 서열을 여전히 포함한다.
도 8e 에서, 캡처된 전체 mRNA를 증폭시키기 위해, cDNA (840) 는 순방향 및 역방향 모두에 대해 P1 프라이머 (845) 를 사용하여 증폭될 수 있다. 후술하는 예에서, P1 프라이머는 그의 5' 말단에 비오틴을 가질 수 있으며, SEQ ID NO. 4의 서열을 가질 수 있다. 증폭의 생성물, 증폭된 cDNA 840의 서열은, 5' 및 3' 말단 모두에서의 P1 서열, 관심 유전자 서열 (805) 및 제 1 바코드 (802) 를 포함하는 역전사 단계로부터 발생하는 전사물의 모든 특징을 보유한다. 제 1 바코드는 증폭된 생성물 (840) 의 5' 말단에서 P1 프라이밍 서열의 3' 에 및 관심 유전자 서열 (805) 의 5'에 통합된다.
그런 다음 제 1 중합 효소 사슬 반응 (PCR) 이 수행된다. 도 8f 는 BCR 영역의 포커스된 영역을 선택적으로 증폭시키는데 사용되는 프라이머 배열의 개략도를 도시한다. 순방향 프라이머 (850) 는 도 8e의 증폭에서 사용된 P1 서열 (825) 의 3' 인 cDNA 증폭 생성물 (840) 의 5' 영역의 부분들에 결합하도록 설계된다. 순방향 프라이머 (850) 는 또한 웰 플레이트의 소스 웰을 식별하기 위한 시스템의 일부로서 사용될 수 있는 제 2 의 6 뉴클레오티드 바코드 (804) 를 포함할 수 있다. 6 뉴클레오티드 제 2 바코드 (804) 가 도 8e-8h 에 도시되어 있지만, 제 2 바코드는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 약 3 개의 뉴클레오티드 내지 약 10 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 역방향 프라이머 (855) 는 불변 영역의 5' 말단에 가까운 BCR의 큰 불변 영역의 서브-영역에 결합하도록 지시되며, 여기서 BCR의 조인 (J) 영역의 3' 말단을 뒤따른다. 이것은, 모든 가변 (V), 존재하는 경우 다양성 (D), 및 조인 (J) 서브-영역이 앰플리콘의 서열화된 부분에 속하는 것을 보장한다. 이는 캡처/프라이밍 서열 (820) 로부터 도입된 T30NI 서열 및 P1 서열 (825) 을 제거한다. 중쇄 및 카파 경쇄와 람다 경쇄 양자의 커버리지를 보장하기 위해, 역방향 프라이머의 혼합물 (855) 이 채용된다.
제 2 PCR 증폭이 도 8g 에 도시된 바와 같이 선택된 및 절단된 증폭 생성물 (860) 에 대해 수행된다. 증폭 생성물 (860) 은 관심 유전자 서열 (805), 선택적인 제 1 (다중화) 바코드 서열 (802) (N4), 및 제 2 (웰 플레이트) 바코드 (804) (N6) 를 포함한다. 제 2 PCR 용 순방향 프라이머 (865) 는 순방향 프라이머 (850) 에 의해 도입된 제 2 (웰 플레이트) 바코드 (804) 의 5' 서열에 결합한다. 역방향 프라이머 (870) 는 역방향 프라이머(들) (855) (각각의 역방향 프라이머들 (855) 의 5' 부분) 에 의해 도입된 공유 서열에 결합한다. 역방향 프라이머 (870) 는 또한 6 개 뉴클레오티드를 갖는 제 3 (웰 플레이트) 바코드 (806) (N6) 를 포함한다. 6 개의 뉴클레오티드 제 3 (웰 플레이트) 바코드 (806) 가 도 8g-8h에 도시되어 있지만, 제 3 바코드는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 약 3 개의 뉴클레오티드 내지 약 10 개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
최종 앰플리콘 (880) 이 도 8h에 도시되어 있으며, 제 1 의 선택적 다중 바코드 (802), 관심 유전자 서열 (805), 제 2 (웰 플레이트) 바코드 (804), 및 제 3 (웰 플레이트) 바코드 (806) 를 포함한다. 특정 서열화 화학 물질에 사용하기 위해 추가 어댑터가 제공될 수도 있다.
바코드 2와 바코드 3은 배출 웰 플레이트의 웰들을 가로질러 채용되어 각각의 소스 웰을 명확하게 식별하고, 이로 인해 서열화 라이브러리가 생성되어 있는 세포를 명확하게 식별한다. 경제적인 접근법은 웰 플레이트의 웰들을 가로질러 고유한 바코드의 8X12 분포를 사용하는 것일 수 있으며, 각각의 웰을 식별하는데 총 20 개의 고유한 바코드만이 필요하다. 제 1 (다중) 바코드는, 다수의 웰 플레이트 샘플들이 서열화 작업에서 조합되는 경우 사용될 수 있지만, 단지 하나의 웰 플레이트가 서열화 작업에서 서열화되는 경우에는 필요하지 않다.
실시예들
실시예 1-인간 CD45를 결합할 수 있는 IgG 항체들의 분비를 위한 마우스 비장 세포 스크리닝.
인간 CD45에 결합하는 IgG-타입 항체를 분비하는 마우스 비장 세포를 식별하기 위한 스크리닝이 수행되었다. 실험 설계는 다음의 단계들을 포함하였다:
1. CD45 항원 코팅된 비드의 생성;
2. 마우스 지라세포 수확;
3. 세포를 마이크로유체 디바이스 안으로 로딩; 및
4. 항원 특이성에 대한 검정.
표 1-실시예 1의 시약.
Figure pct00006
CD45 항원 코팅된 비드들의 생성. CD45 항원 코팅된 마이크로비드는 다음과 같은 방식으로 생성되었다:
50 마이크로그램 담체가 없는 CD45를 500 마이크로리터 PBS (pH 7.2) 에 재현탁시켰다.
슬라이드-A-라이저 투석 미니 컵을 500 마이크로리터 PBS로 린싱한 다음 마이크로퓨지 튜브에 첨가하였다.
0.1 마이크로그램/마이크로리터 CD45 용액의 50 마이크로리터를 린싱된 투석 미니 컵에 첨가하였다.
170 마이크로리터 PBS를 2 mg의 NHS-PEG4-비오틴에 첨가한 후, 4.1 마이크로리터의 NHS-PEG4-비오틴을 CD45 항원을 함유하는 투석 미니 컵에 첨가하였다.
NGS-PEG4-비오틴을 CD45 항원과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다.
배양 이후, 투석 미니 컵을 마이크로다관으로부터 꺼내어, 제 2 마이크로다관에서 1.3 mls PBS (pH 7.2) 에 넣고, 그리고 처음 1 시간 동안 4℃에서 흔들면서 배양했다. 투석 미니 컵을 후속하여 1.3 mls의 신선한 PBS (pH 7.2) 를 포함하는 제 3 마이크로다관으로 옮기고, 두번째 1 시간 동안 4℃에서 흔들면서 배양했다. 이 마지막 단계를 3 번 더 반복하여 총 5회의 1 시간 배양을 실시했다.
100 마이크로리터의 비오티닐화된 CD45 용액 (~ 50 ng/마이크로리터) 을 표지된 튜브 안으로 피펫팅하였다.
500 마이크로리터 스페로테크 스트렙타비딘 코팅된 비드를 마이크로다관으로 피펫팅한 다음, PBS (pH 7.4) 에서 3회 (1000 마이크로리터/세척) 세척한 다음, 3000 RCF에서 5 분 동안 원심 분리하였다.
비드들을 500 마이크로리터 PBS (pH 7.4) 에 재현탁하여, 5 ㎎/㎖의 비드 농도를 얻었다.
비오티닐화된 CD45 단백질 용액 (50 마이크로리터) 을 재현탁된 스페로테크 스트렙타비딘 코팅된 비드와 혼합하였다. 혼합물을 4 ℃에서 2 시간 동안 배양한 다음, 3000 RCF에서 4 분 동안 4°원심 분리하였다. 상등액을 폐기하고, CD45 코팅된 비드들을 1 mL PBS (pH 7.4) 에서 3 회 세척하였다. 그후, 3000 RCF로 4 ℃에서 또 5 분 동안 원심 분리하였다. 마지막으로, CD45 비드들을 500 마이크로리터 PBS pH 7.4에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.
마우스 비장 세포 수확. CD45으로 면역화된 마우스로부터 비장을 수확하고 DMEM 배지 + 10% FBS에 위치시켰다. 가위는 비장을 가는데 사용되었다.
갈아진 비장을 40 마이크론 세포 여과기에 넣었다. 단일 세포를 10 ml 피펫으로 세포 여과기를 통해 세척하였다. 유리 막대를 사용하여 비장을 더 세분화하고 세포 여과기를 통해 단일 세포를 강제로 만들고, 그 후 단일 세포를 다시 10 ml 피펫으로 세포 여과기를 통해 세척하였다.
적혈구를 상용 키트에 의해 용해시켰다.
세포를 200xG에서 스핀 다운시키고, 원료 비장세포를 2e8 cells/ml의 농도로 10 ml의 피펫으로 DMEM 배지 + 10% FBS에 재현탁시켰다.
세포들을 마이크로유체 디바이스 안으로 로딩. 마이크로유체 디바이스는 OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성된 OptoSelect™ 디바이스 (Berkeley Lights, Inc.) 였다. 마이크로유체 디바이스는 흐름 영역 및 이에 유체적으로 연결된 복수의 NanoPen™ 챔버들을 포함하였고, 챔버들은 약 7x105 입방 마이크론의 체적을 갖는다. 마이크로유체 디바이스는 적어도 흐름 제어기, 온도 제어기, 유체 배지 컨디셔닝 및 펌프 컴포넌트, 광 활성화된 DEP 구성들을 위한 광원, 마이크로유체 디바이스를 위한 장착 단계, 및 카메라를 포함한 프로토타입 시스템 (Berkeley Lights, Inc.) 에서 작동되었다.
비장 세포들을 마이크로유체 디바이스 안으로 유입시키고 NanoPen 챔버당 20-30 개의 세포들을 함유하는 NanoPen 챔버들 안으로 로딩하였다. 100 마이크로리터 배지는 1 마이크로리터/sec에서 디바이스를 통해 흘려보내 원치 않는 세포들을 제거하였다. 온도를 36℃로 설정하고, 배양 배지를 0.1 마이크로리터/sec로 30 분간 관류시켰다. 도 5a에 도시된 바와 같은 브라이트필드 촬상은 NanoPen 챔버들 내의 세포들의 위치를 보여주었다.
항원 특이성 검정. 1:2500 염소 항-마우스 F(ab')2-Alexa 568 을 포함하는 배지를 준비하였다.
100 마이크로리터의 CD45 비드들을 염소 항-마우스 F(ab')2-Alexa 568 2차 항체의 1:2500 희석액을 포함하는 22 마이크로리터의 배지에 재현탁시켰다.
재현탁된 CD45 비드들은 다음, 비장세포를 포함하는 NanoPen 챔버들에 인접하여, 바로 옆에 위치할 때까지 1 마이크로리터/sec의 속도로 마이크로유체 칩의 주요 채널로 유입되었다. 다음, 유체 흐름이 중단되었다.
다음, 마이크로유체 칩은 그 비드들 (도시되지 않음) 의 위치를 결정하기 위해 브라이트 필드 (bright field) 에서 촬상되었다. 다음, 텍사스 레드 필터는 세포들과 비드들의 이미지들을 캡처하는데 사용되었다. 이미지들은 1 시간 동안 매 5 분마다 촬영되었으며, 각 노출은 1000ms 지속되고 5 이득이 있었다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 비드들/표지된 2 차 항체 혼합물의 도입 5 분 이후의 시점의 촬상은 일부 펜들 내의 세포들 부위에서 형광 신호가 분명해진다는 것을 보여주었다. 세포들의 표지는 세포들 표면에 IgG의 존재를 나타냈다. 비드들의 희미한 표지가 이 시점에서 관찰되었다.
결과들. 비드/항체 혼합물 도입 이후 20분 시점에서 비드들 상에서 디벨럽하고, 어떤 펜들 밖으로 및 마이크로유체 디바이스의 주요 채널 안으로 확산하는 IgG-이소타입 항체들의 확산을 반영하는 양성 신호가 관찰되었고, 여기서 이들은 CD45 코팅된 비드들에 결합할 수 있었다. 비드들에 대한 항-CD45 항체의 결합은 2차 염소 항-마우스 IgG-568이 비드들이 결합하여 검출 가능한 신호를 생성하도록 허용하였다. 도 5c, 백색 화살표를 참조한다.
본 발명의 방법들을 사용하여, 양성 신호와 연관된 각각의 그룹의 비장세포들을 분리하고, 단일 세포로서 새로운 펜으로 이동시키고 재검정시켰다. 이러한 방식으로, 항 CD45 IgG 항체를 발현하는 단일 세포를 검출하고 단리시킬 수 있다.
실시예 2: 마이크로유체 디바이스에서 메모리 B 세포들의 활성화 및 스크리닝
마이크로유체 디바이스에서 메모리 B 세포들을 스크리닝하는 일반적인 방법이 도 6a에 개략적으로 도시되어 있다. 상기 방법은 인간 메모리 B 세포들에 초점을 맞추지만, 이 방법은 다른 동물들의 B 세포를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
메모리 B 세포들을 수확. 냉동 염소 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 들을 해동하고 10% FBS (Seradigm) 가 첨가된 RPMI1640 (Gibco) 의 6X 부피와 혼합하고, 카운팅하고, 그리고 500g 에서 5 분 동안 원심 분리한다. 상등액을 흡인 제거하고 FACS 버퍼 (PBS, 2% BSA, 1mM EDTA) 중에 세포 펠렛을 5x107 cells/mL 농도로 재현탁한다.
다음, B 세포 농축을 EasySep 인간 B 세포 농축 키트 (EasySep, #19054) 를 사용하여 수행한다. 50 마이크로리터의 B 세포 농축 칵테일을 각 mL 의 인간 PBMC들에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 10 분 동안 배양한다. 이어서, 각 mL 의 인간 PBMC들에 대해 75 마이크로리터의 자성 입자들을 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하고 10 분 동안 실온에서 배양한다. 대략 1.1 uL 체적의 PBMC 세포 현탁액을 FACS 버퍼에 첨가하여 2.4 mL가 되게 한 후, 피펫팅으로 위 아래로 잘 혼합한다. 다음, PBMC 현탁액을 함유하는 튜브를 EasySep 자석 (뚜껑 없음) 에 넣고 5 분간 배양한다. EasySep 자석에 튜브를 유지하면서, 농축된 B 세포 현탁액을 새롭고 깨끗한 튜브에 붓는다. 농축된 B 세포 현탁액의 세포 카운팅을 수행하고, 그 후 세포들을 300g에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액은 흡인 제거한다.
농축된 B 세포 펠릿을 항-CD27 항체를 포함하는 FACS 버퍼에 5x107 cells/mL 농도로 재현탁한 다음, 4℃에서 20 분간 어둠 속에서 배양한다. 배양 이후, 세포들을 3 mL FACS 버퍼로 2회 세척하고 현탁액을 300g에서 5 분간 원심 분리한다. 최종 농축 B 세포 펠렛을 FACS 버퍼에 5x107 cells/mL 농도로 재현탁한 다음, 단일 세포 스트레이너를 통과시키며, 피펫 팁을 스트레이너의 메시에 대해 (및 수직으로) 가압한다. 변형된 세포 현탁액은 FACS 소팅까지 얼음 위에서 유지된다. FACS Aria 인스트루먼트를 사용하여, CD27+ B 세포들을 B 세포 활성화/배양 배지 (RPMI 1640 (Gibco), 10% FBS (Seradigm), 2 ug/ml CpG (Invivogen), 1 ug/mL IL-2 (Peprotek), 5 ng/mL IL-4 (Peprotek), 10 ng/mL IL-6 (Peprotek), 10 ng/mL IL-21 (Peprotek) 및 10 ng/mL BAFF (Peprotek) 안으로 소팅한다.
단리된 메모리 B 세포들은 2x106 cells/mL 의 농도로 조정된 다음, 마이크로유체 디바이스 안으로 유입될 때까지 37℃ 에서 배양하며, 이는 가능한한 빨리 수행된다.
마이크로유체 디바이스의 제조 및 메모리 B 세포들의 유입. 마이크로유체 디바이스는 OptoElectroPositioning (OEP™) 으로 구성되며, 공유 결합으로 연결된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머들의 층을 포함하는 컨디셔닝된 내부 표면들을 갖는 OptoSelect™ 디바이스이다. 마이크로유체 디바이스는 복수의 마이크로유체 채널들 및 각 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 복수의 격리 펜들 (또는 NanoPen™ 챔버들) 을 갖는 흐름 영역을 포함하고, 격리 펜은 약 5x105 입방 마이크론의 체적을 갖는다. 마이크로유체 디바이스는 Beacon 플랫폼 (Berkeley Lights, Inc.) 또는 프로토타입 Alpha 플랫폼 (Berkeley Lights, Inc.) 에서 작동하며, 플랫폼에는 유량 제어기, 온도 제어기, 유체 배지 컨디셔닝 및 펌프 컴포넌트, 광 활성화 DEP 구성들을 위한 광원, 마이크로유체 디바이스용 장착 스테이지 및 카메라가 포함된다.
250 마이크로리터의 100% 이산화탄소를 12 마이크로리터/초의 속도로 마이크로유체 디바이스 안으로 흘려 보낸다. 이어서, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (ATCC) 1000 ml, 태아 소 혈청 (ATCC) 200 ml, 펜-스트렙 (Life Technologies) 10 ml, 및 Pluronic F-127 (Life Technologies) 10 mL 를 함유하는 프라이밍 배지 250 마이크로리터가 뒤따른다. 10% FBS (Seradigm), 1X 펜-스트렙 (Gibco) 및 1X 카나마이신 설페이트 (Gibco) 가 보충된 RPMI 1640 (Gibco) 를 함유한 B 세포 배양 배지를 도입한다.
다음, 상기와 같이 준비된 단리된 메모리 B 세포 현탁액은 현탁액을 인렛으로 흐르게 하고 메모리 B 세포들이 흐름 영역/마이크로유체 채널들 내에 위치할 때 흐름을 정지시킴으로써 마이크로유체 디바이스로 유입된다. 다음, 메모리 B 세포들을 펜당 하나의 B 세포를 타겟으로 격리 펜들 안으로 로딩한다. 메모리 B 세포들은 광 활성화 DEP 힘 (OEP 기술) 을 사용하여 흐름 영역/마이크로유체 채널들에서 격리 펜들의 단리 영역들로 이동한다. OEP를 작동시키기 위한 파라미터들은 (도 6b에 도시된 바와 같이) 개별 세포들을 트랩하는 광 트랩을 형성하기 위해 구조화된 광을 사용하여 마이크로유체 디바이스 (전압 3.5 V, 주파수 2 MHz) 양단에 AC 전위를 인가하고, 그리고 8 마이크론/초에서 광 트랩들을 이동시키는 것을 포함한다. 페닝 이후 흐름 영역/마이크로유체 채널들에 남아있는 세포들은 마이크로유체 디바이스에서 플러시된다.
메모리 B 세포 활성화. 단백질 A (Spherotech) 로 코팅된 비드들은 조사된 Jurkat D1.1 피더 세포들과 약 1:1의 비율로 혼합된다. 다음, 비드/피더 세포 혼합물을 마이크로유체 디바이스로 흘려 보내고, 피더 세포들 및 비드들을 메모리 B 세포를 함유하는 각각의 격리 펜에 벌크 로딩한다. 벌크 로딩은 마이크로유체 디바이스를 단부에서 기울이고, 중력이 세포들과 비드들을 격리 펜들 안으로 끌어 당기는 것을 허용함으로써 달성된다. 비드/피더 세포 혼합물은 피더 세포들 및 비드들 각각의 mL 당 약 1.5x107 의 농도로 마이크로유체 디바이스 안으로 흘려지고 이 방식으로 대량 로딩된 격리 펜들은 펜당 약 10 개의 피더 세포들 및 약 10 개의 비드들의 예상 평균을 수용한다.
다음 마이크로유체 디바이스를 배양기로 옮기고 B 세포 활성화/배양 배지 (위) 를 마이크로유체 디바이스의 유로를 통해 사 (4) 일간 관류시킨다. 마이크로유체 디바이스는 배양기서 유지되는 동안 말단 위치가 기울어진 채로 유지된다. 관류 방법은 다음과 같다: 0.02 마이크로리터/초, 100 초간 B 세포 활성화/배양 배지 관류; 500 초간 유량을 정지; 2 마이크로리터/초, 64 초간 B 세포 활성화/배양 배지 관류; 그리고 반복.
활성화된 메모리 B 세포들을 검정. 4 일간의 배양/활성화 이후, 마이크로유체 디바이스를 배양기에서 꺼내고 Beacon/Alpha 시스템으로 되돌려주고, 그때 IgG 분비와 항원 특이성을 검출하기 위해 멀티플렉스 검정이 수행된다. 도 6c 에 예시된 멀티플렉스 검정은 항-인간 IgG 항체-코팅된 캡슐 비드들 (Spherotech), 항-인간 IgG-Alexa Fluor 488 2차 항체 (Invitrogen), 및 Alexa Fluor 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 표지된 관심 항원을 포함한다. 캡처 비드들, 2차 항체 및 표지된 관심 항원은 B 세포 활성화/배양 배지에서 함께 혼합되어 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역/마이크로유체 채널 안으로 흘려진다. 흐름을 멈추고, 형광 표지들을 시각화하기 위한 적절한 필터들을 사용하여 격리 펜들의 이미지들을 10 ~ 25 분의 기간동안 주기적으로 취한다. 관심 항원에 결합하는 항체를 분비하는 메모리 B 세포들은 표지된 관심 항원과 IgG 항체가 코팅된 캡처 비드들 사이의 연관성을 유도한다. 결과적으로, 형광 표지된 캡처 비드의 "플륨 (plume)"은 흐름 영역/마이크로유체 채널과 메모리 B 세포가 위치한 격리 펜 사이의 개구부에 나타날 것이다. 도 6d는 메모리 B 세포들에 대한 전형적인 검정 결과들을 도시한다.
배출 및 추가 프로세싱. 관심 항원에 결합하는 항체를 분비하는 것으로 식별된 메모리 B 세포들은, 다음에 DEP 힘을 사용하여 (위에서 논의한 OEP 파라미터들을 사용하여) 한번에 하나의 펜으로 언펜닝되고, 마이크로유체 디바이스의 유로를 통해 배출 배지 (Ca2+ 및 Mg2+ 를 갖는 DPBS (Lonza), 5mg/mL BSA (Sigma) 및 1:100 Pluronic™ F-127 (써모 피셔 (Thermo Fisher)) 를 마이크로유체 디바이스로부터 96-웰 플레이트의 웰 안으로 흘려보냄으로써 배출된다. 배출 이후에, 메모리 B 세포들이 용해되고 중쇄 및 경쇄 항체 서열을 인코딩하는 전사체들이 cDNA로 역전사되고 서열화된다.
결과들: 상기 프로토콜과 실질적으로 동일한 프로토콜을 사용하여, B 세포 활성화 속도 (IgG 분비의 검출에 의해 측정됨) 는 인간 메모리 B 세포들에 대해 약 12%에 도달하였다. 비-인간 포유 동물 메모리 B 세포들의 세포 활성화 비율은 40%에 도달하였다. 관심 항원에 결합하는 항체를 발현하는 활성화된 메모리 B 세포들의 검출 속도는 관심 항원에 의존하지만 일반적으로 약 1% 이하이다. 이러한 스크리닝 프로토콜들에 의해 인간 메모리 B 세포들로부터 얻어진 추정 Ag+ 항체의 관련성을 테스트하는 한 실험에서, 분비하는 Ag-결합 항체들로 식별된 20 개의 메모리 B 세포들의 세트를 마이크로유체 디바이스로부터 배출하고 그 항체 중쇄 및 경쇄 서열들을 결정하였다. HEK 393T 세포들에서의 재발현 및 온칩 검정에서 사용된 관심 항원에 의한 ELISA 분석 이후, 항체 20 개 중 16 개 (또는 80%) 가 ELISA 검정에서 관심 항원을 검출하였다. 이것은 현재 개시된 방법들에 따라 메모리 B 세포들을 활성화시키고 스크리닝하는 관련성을 확인한다.
변형예들. 상기 방법은 많은 방식으로 변화될 수 있으며 여전히 메모리 B 세포들의 직접 스크리닝의 목표를 달성한다. 이러한 변형예들은 다음을 포함한다:
1. 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터), 토끼, 흰담비, 가축 (예를 들어, 염소, 양, 돼지, 말, 소), 라마, 낙타, 및 닭과 칠면조와 같은 조류종과 같은 다른 포유류 종을 포함하여, 인간 이외의 동물에서 단리된 메모리 B 세포들의 스크리닝.
2. 메모리 B 세포들을 펜닝 및 언펜닝하기 위해 사용되는 OEP 동작 파라미터들은 가변될 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 디바이스 양단의 AC 전위는 약 1 내지 약 3 MHz의 주파수로 약 2 내지 약 5 볼트로 설정될 수 있다. 특정 예들은 (i) 약 2.5V의 전압 및 약 3MHz의 주파수, 및 (ii) 약 4.5V의 전압 및 약 1MHz의 주파수를 포함한다. 또한, 구조화된 광 (또는 광 케이지) 이 이동되는 속도는 약 5 내지 약 10 마이크론/초 사이에서 가변될 수 있다.
3. 전술한 바와 같이, 마이크로유체 디바이스는 배양기 상에 유지되고 칩은 말단에서 기울어진다. 대안으로, 마이크로유체 디바이스는 표준 위치 (즉, 마이크로유체 디바이스가 실질적으로 평평하게 놓인 상태) 에서 비콘/알파 시스템 상에 다시 배치될 수 있다. 그후, 메모리 B 세포 배양/활성화 배지는 다음의 프로토콜에 따라 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 관류된다: 0.01 마이크로리터/초에서 2 시간동안 B 세포 배양/활성화 배지를 관류; 2 마이크로리터/초에서 64 초간 B 세포 배양/활성화 배지를 관류; 및 반복.
4. 검정은 또한 제 2 관심 항원 또는 심지어 제 2 및 제 3 관심 항원을 포함하도록 더욱 다중화될 수 있다. 예를 들어, 도 6c 를 참조한다. 이러한 방식으로, 메모리 B 세포들은 동일한 타겟 단백질/분자 상의 상이한 에피토프들에 결합하는 항체들, 타겟 단백질/분자에 대한 종간 반응의 상이한 수준을 나타내는 항체들, 또는 완전히 다른 관심 항원에 단순히 결합하는 항체들에 대해 동시에 스크리닝될 수 있다. 또한, 제 2 및/또는 제 3 관심 항원의 사용은 높은 처리량 스크리닝을 허용한다.
5. 마이크로유체 디바이스 내의 격리 펜들의 크기는 예를 들어, 약 1.1x106 입방 마이크론으로 증가될 수 있다. 일반적으로, 펜들은 약 5x106 입방 마이크론 이하 (예를 들어, 약 4x106 입방 마이크론, 약 3x106 입방 마이크론, 약 2.5x106 입방 미크론, 약 2x106 입방 마이크론, 약 1.5x106 입방 마이크론 이하) 의 체적을 가질 것이다. 보다 큰 크기는 메모리 B 세포들의 처음에 검정하는 다클론 그룹에 유용할 수 있지만, 보다 큰 크기는 또한 멀티플렉스 검정을 지연시키고 잠재적으로 메모리 B 세포 활성화 및 성장에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
6. 이 검정은 다클론 검정으로 시작한 다음, 단일 클론 검정으로 쉬프트할 수 있다. 이러한 접근법에서, 격리 펜들은 초기에 복수의 메모리 B 세포들 (예를 들어, 2 내지 10, 또는 4 내지 10 개) 로 로딩된다. 이 접근법이 취해지면, 초기 검정에서 Ag+ 로 보여주는 격리 펜들은, 격리 펜 내의 어느 메모리 B 세포가 Ag+ 항체를 생산하는지를 결정하기 위해 더욱 분석되어야 한다. 이렇게 하기 위해, Ag- 펜들에서의 세포들은 언펜닝되며 (예를 들어, 배출 배지를 흐름 영역/마이크로유체 채널들을 통해 폐기 관으로 흐르게 함으로써) 배출된다. 다음, Ag+ 펜들에서의 세포들은 언펜닝되며 단일의 메모리 B 세포들은 마이크로유체 디바이스 상의 소스 펜에 인접하거나 인근에 위치한 빈 펜들에 재펜닝된다. Ag+ 펜들에 대한 멀티플렉스 검정이 반복되고, 반복된 검정에서 Ag+로 식별된 임의의 펜들에 위치하는 메모리 B 세포들이 추가 프로세싱을 위해 배출된다. 이러한 보다 높은 처리량의 다클론 대 단일 클론 접근법은 도 6a에 개략적으로 도시된 방법에 대해 도 6e에 개략적으로 나타낸 추가 단계들을 추가한다.
실시예 3: 마이크로유체 디바이스에서의 형질 세포들의 스크리닝
마이크로유체 디바이스에서의 형질 세포들을 스크리닝하는 일반적인 방법이 도 7a에 개략적으로 도시되어 있다. 상기 방법은 인간 형질 세포들에 초점을 맞추었지만, 이 방법은 다른 동물들로부터 형질 세포들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
형질 세포들 수확. 냉동 인간 골수 (BM) 세포들을 37℃ 수조에서 빠르게 녹인 다음, 5 mL 의 미리 가열한 (37℃) 형질 세포 배양 배지 (RPMI 1640 (Gibco), 10% FCS (Hyclone), 1X 비필수 아미노산 (NEAA) 용액 (Gibco), 1X 피부르산 나트륨 (Gibco), 50 uM 베타 메르캅토에탄올 (Gibco), 및 1X DNase (25,000 U/mL, 밀리포어를 함유하는 Benzonase® Nuclease 1000X 스톡, Millipore) 이 보충된 1X 펜-스트렙 (pen-strep) (Gibco)) 에 적하 첨가한다. 생성된 혼합물을 300g에서 10 분간 원심 분리하고, 세포 펠렛을 FACS 버퍼 (PBS, 2% BSA, 1mM EDTA) 로 2X 세척한다.
FACS 버퍼에서 세척한 후 얻은 세포 펠릿을 항-CD138 항체를 함유하는 FACS 버퍼에 1x107 cells/mL의 농도로 재현탁한 다음, 4℃에서 20 분간 암실에서 배양한다. 배양 이후, 세포를 FACS 버퍼에서 2 회 세척하고, 1x107 cells/mL 농도로 FACS 버퍼에 재현탁한다. 세포 현탁액은 FACS 소팅까지 얼음 위에서 유지된다. FACS 아리아 인스트루먼트를 사용하여, CD138+ 형질 세포들을 40 ug/mL IL-6 (R&D 시스템) 가 보충된 형질 세포 배양 배지 (상기) 로 소팅한다.
분리된 형질 세포들은 2x106 cells/mL 의 농도로 조절한 다음, 마이크로유체 디바이스 안으로 유입할 때까지 37℃ 로 배양하며, 이것은 가능한 한 빨리 수행된다.
마이크로유체 디바이스의 제조 및 형질 세포들의 유입. 마이크로유체 디바이스는 OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성되고 공유 결합으로 연결된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머들의 층을 포함하는 컨디셔닝된 내부 표면들이 있는 OptoSelect™ 디바이스 (Berkeley Lights, Inc.) 이다. 마이크로유체 디바이스는 복수의 마이크로유체 채널들 및 각각의 마이크로유체 채널에 유체적으로 연결된 복수의 격리 펜들 (또는 NanoPen™ 챔버들) 을 갖는 흐름 영역을 포함하고, 격리 펜들은 약 5x105 입방 마이크론들의 체적을 갖는다. 마이크로유체 디바이스는 비콘 플랫폼 (Berkeley Lights, Inc.) 또는 프로토타입 알파 플랫폼 (Berkeley Lights, Inc.) 에서 작동하며, 플랫폼은 유량 제어기, 온도 제어기, 유체 배지 컨디셔닝 및 펌프 컴포넌트, 광 활성화된 DEP 구성들을 위한 광원, 마이크로유체 디바이스용 장착 스테이지 및 카메라를 포함한다.
250 마이크로리터의 100% 이산화탄소를 12 마이크로리터/초의 속도로 마이크로유체 디바이스 안으로 흘려보낸다. 이어서 Iscove's Modified Dulbecco's Medium (ATCC) 1000ml, 태아 송아지 혈청 (Hyclone) 200ml, 펜-스트렙 (Life Technologies) 10ml 및 플루로닉 F-127 (Life Technologies) 10mL 를 함유하는 프라이밍 배지 250 마이크로리터를 흘려보낸다. 40 ug/mL IL-6 (R&D Systems) 가 보충된 형질 세포 배양 배지 (상기) 의 도입이 이어진다.
다음, 상기한 바와 같이 제조된 단리된 형질 세포 현탁액은, 현탁액을 인렛 안으로 흘려보내고 형질 세포들이 흐름 영역/마이크로유체 채널들 내에 위치할 때 흐름을 정지시킴으로써 마이크로유체 디바이스 안으로 유입된다. 다음, 펜당 하나의 형질 세포를 타겟으로 하여, 형질 세포들을 격리 펜들 안으로 로딩된다. 형질 세포들은 광 활성화된 DEP 힘 (OEP 기술) 을 사용하여 흐름 영역/마이크로유체 채널들에서 격리 펜들의 단리 영역들로 이동된다. OEP를 동작시키기 위한 파라미터들은 (도 6b에 도시된 것과 유사한) 개별적인 세포들을 트랩하는 광 트랩들을 형성하기 위해 구조화된 광을 사용하여 마이크로유체 디바이스 양단에 AC 전위 (전압 2.5V, 주파수 3MHz) 를 인가하고, 그리고 8 마이크론/초로 광 트랩을 이동시키는 것을 포함한다. 펜닝 이후 흐름 영역/마이크로유체 채널들에 남아있는 세포들은 마이크로유체 디바이스에서 플러시된다.
형질 세포들을 검정. 펜닝 직후, 형질 세포를 검정하여 IgG 분비 및 항원 특이성을 검출한다. 도 6c 에 예시된 멀티플렉스 검정은 항-인간 IgG 항체-코팅된 캡슐 비드들 (Spherotech), 항-인간 IgG-Alexa Fluor 488 2차 항체 (Invitrogen), 및 Alexa Fluor 647 카르복실산 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 표지된 관심 항원을 포함한다. 40 ug/mL IL-6 (R&D Systems) 가 보충된 형질 세포 배양 배지 (상기) 에서 캡처 비드들, 2 차 항체 및 표지된 관심 항원을 함께 혼합하고, 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역/마이크로유체 채널들 안으로 흘려 보낸다. 흐름을 멈추고, 형광 표지들을 시각화하기 위한 적절한 필터들을 사용하여 격리 펜들의 이미지들을 10 ~ 25 분의 기간동안 주기적으로 취한다. 관심 항원에 결합하는 항체를 분비하는 형질 세포들은 표지된 관심 항원과 IgG 항체가 코팅된 캡처 비드들 사이의 연관성을 유도할 것이다. 결과적으로, 형광 표지된 캡처 비드들의 "플륨 (plume)"은 흐름 영역/마이크로유체 채널과 형질 세포가 위치한 격리 펜 사이의 개구부에 나타날 것이다. 도 7b는 좌측 패널에서의 브라이트필드 이미지, 중간 패널에서의 항-인간 IgG 2 차 항체의 형광 이미지, 및 우측 패널에서의 표지된 관심 항원의 형광 이미지를 갖는 형질 세포에 대한 전형적인 검정 결과들을 도시한다.
배출 및 추가 프로세싱. 관심 항원에 결합하는 항체를 분비하는 것으로 식별된 형질 세포들은, 다음에 DEP 힘을 사용하여 (위에서 논의한 OEP 파라미터들을 사용하여) 한번에 하나의 펜으로 언펜닝되고, 마이크로유체 디바이스의 유로를 통해 배출 배지 (Ca2+ 및 Mg2+ 를 갖는 DPBS (Lonza), 5mg/mL BSA (Sigma) 및 1:100 Pluronic™ F-127 (써모 피셔 (Thermo Fisher)) 를 흘려보냄으로써 마이크로유체 디바이스로부터 96-웰 플레이트의 웰 안으로 배출된다. 배출 이후에, 형질 세포들이 용해되고 중쇄 및 경쇄 항체 서열들을 인코딩하는 전사체들이 cDNA들로 역전사되고 서열화된다.
결과들: 상기 프로토콜은 하루 안에 수행된다. 상기와 실질적으로 동일한 프로토콜들을 사용하여, (관심 항원에 의존하는) 관심 항원에 결합하는 항체를 발현하는 형질 세포들의 검출 속도는 통상적으로 약 1% 이하이며, 이러한 프로토콜들에 의해 형질 세포들로부터 얻어진 추정 Ag+ 항체들은 한 연구에서 82%만큼 높은 비율로 재발현시 Ag-특이적 결합을 나타냈다.
변형예들. 상기 방법은 많은 방식으로 변화될 수 있으며 형질 세포들의 직접적인 스크리닝의 목표를 여전히 달성한다. 이러한 변형예들은 다음을 포함한다:
1. 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터), 토끼, 흰담비, 가축 (예를 들어, 염소, 양, 돼지, 말, 소), 라마, 낙타, 및 닭과 칠면조와 같은 조류종과 같은 다른 포유류 종을 포함하여, 인간 이외의 동물에서 단리된 형질 세포들의 스크리닝.
2. AB 세포 농축은 예를 들어, EasySep 인간 B 세포 농축 키트 (EasySep, #19054) 를 사용하여 형질 세포들의 FACS 분리 전에 수행될 수 있다.
3. 형질 세포들을 펜닝 및 언펜닝하기 위해 사용되는 OEP 동작 파라미터들은 가변될 수 있다. 예를 들어, 마이크로유체 디바이스 양단의 AC 전위는 약 1 내지 약 3 MHz의 주파수로 약 2 내지 약 5 볼트로 설정될 수 있다. 특정 예들은 (i) 약 3.5V의 전압 및 약 2MHz의 주파수, 및 (ii) 약 4.5V의 전압 및 약 1MHz의 주파수를 포함한다. 또한, 구조화된 광 (또는 광 케이지) 이 이동되는 속도는 약 5 내지 약 10 마이크론/초 사이에서 가변될 수 있다.
4. 형질 세포들이 로딩되는 격리 펜들은 크기가 다를 수 있다. 예를 들어, 펜들은 약 1.1x106 입방 마이크론들의 체적을 가질 수 있다. 통상적으로, 펜들은 약 5x106 입방 마이크론 이하 (예를 들어, 약 4x106 입방 마이크론, 약 3x106 입방 마이크론, 약 2.5x106 입방 미크론, 약 2x106 입방 마이크론, 약 1.5x106 입방 마이크론 이하) 의 체적을 가질 것이다. 격리 펜들의 크기를 줄임으로써, 멀티플렉스 검정을 보다 신속하게 수행할 수 있으며, 이로써 형질 세포들이 세포 사멸을 겪을 수 있는 장기간의 스크리닝 기간을 회피할 수 있다.
5. Ag+ 항체들을 발현하는 형질 세포들을 배출하기 보다는, 형질 세포들은 용해된 세포에 의해 방출된 mRNA를 캡처하도록 설계된 바코딩된 비드의 존재하에 격리 펜 내에서 용해될 수 있다. 그후, 캡처된 mRNA는 바코딩된 비드에 부착되는 cDNA 라이브러리로 역전사될 수 있으며, 바코딩된 비드는 칩 외부에서 cDNA 라이브러리의 연속 시퀀싱을 위해 배출될 수 있다. 칩 세포 용해, mRNA 캡처, 및 cDNA 라이브러리 생성 방법은 예를 들어 전체 내용이 본원에 참고로 인용된 2017 년 9 월 29 일자로 출원된 PCT 국제 출원 제 PCT/US17/54628 호에 기재되어 있다.
실시예 4: B 림프구들을 발현하는 항체의 단세포 배출 및 B 세포 수용체 영역들에 대해 디렉팅된 서열화 라이브러리의 생산
표 2.이 실험에 사용된 프라이머들. 모든 프라이머들은 10 마이크로 몰 농도로 제공되었다.
Figure pct00007
세포들: 쥐과 골수종 하이브리도마 세포주인 OKT3 세포들을 ATCC로부터 수득하였다 (ATCC® Cat. # CRL-8001™). 세포들을 현탁 세포주로서 제공하였다. 약 1x105 내지 약 2x105 생존 가능한 세포들/mL 을 씨딩하고 가스 환경으로서 공기중에 5% 이산화탄소를 37℃에서 배양함으로써 배양들을 유지하였다. 세포들은 2 ~ 3 일 간격으로 나뉘었다. OKT3 세포 수 및 생존율을 계수하고 세포 밀도를 마이크로유체 디바이스에 로딩하기 위해 1x106/ml으로 조정하였다.
배출 플레이트: 세포 배출을 위해 96-웰 풀 스커트 플레이트 (VWR Cat. # 95041-436) 를 사용하였다. 10 마이크로리터 미네랄 오일 (Sigma Cat # M5904) 과 이후 5 마이크로리터의 2X TCL 버퍼 (Qiagen Cat. #1070498) 를 분배함으로써 각각의 플레이트를 제조하였다. (단일 세포 용해 키트, Ambion Catalog No. 4458235 또는 Clontech lysis buffer, Cat #635013과 같은 다른 용해 버퍼들도 적합하게 사용할 수 있다.) 배출 플레이트를 실온에서 1 분간 200g으로 원심 분리하고 사용할 때까지 실온에서 보관하였다.
배출 버퍼: 최종 농도 1 마이크로리터/ml 의 DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) + 칼슘 + 마그네슘 (1000 mL, Lonza Cat. # 17-513F); 소 혈청 알부민 (BSA) (분말, 5g, Fisher Scientific Cat. # BP9706-100); Pluronic F-127 (10ml, Life Technologies Cat. # 50-310-494; 및 재조합 리보뉴클레아제 억제제 (RNaseOUT) (Life Technologies Cat. # 107777019). 배출 버퍼를 0.22 마이크론 필터 유닛 (VWR Cat. #73520-985) 으로 사용하기 이전에 필터링하였다.
세포 배출 및 용해: OKT3 세포들 (모든 종류의 1 차 B 세포를 사용할 수 있음) 을 마이크로유체 디바이스 안으로 흘려보내고 시스템의 OptoElectroPositioning (OEP) 기능을 사용하여 NanoPen 챔버들 안으로 도입하여 NanoPen 챔버당 하나의 세포를 최종 분배하였다. 실시예 1에서 기술된 바와 같은 IgG 검정을 수행하였다 (항원 특이적 검정들도 또한 사용될 수 있다). 흥미있는 IgG 발현 (및 임의로 항원 특이적 항체 발현) 을 갖는 것으로 식별된 세포들을 5 마이크로리터 배출량으로 웰당 하나의 세포에서 96-웰 배출 플레이트 안으로 개별적으로 배출하였다. 상주했었던 선택된 세포를 NanoPen 챔버 밖으로 배출하기 위해 OEP 힘의 혼합물을 사용하여 배출을 수행했고, 그후 흐름 영역/마이크로유체 채널에서의 배지의 흐름을 5 마이크로리터 체적으로 각각의 선택된 세포로 개별적으로 배출하였다. 배출 웰 플레이트를 배출 직후 5 분간 4℃에서 200g으로 회전시켰다. RNA 단리 및 cDNA 합성이 수행될 때까지 플레이트를 -80℃에서 동결시켰다. 웰 플레이트들을 이러한 조건하에서 최대 적어도 1 개월 동안 적절하게 유지하였다. 어떤 상황에서는, 밤새도록 저장 또는 보관을 최대 일주일 동안 수행할 수 있다.
RNA 단리. 단세포 배출 플레이트를 얼음 위에서 15 분 동안 해동시킨 후 실온으로 가져왔다. RNAClean XP SPRI 비드들 (Beckman Coulter #A63987) 를 실온으로 가져와서 10 마이크로리터의 비드 혼합물 (1X 체적) 을 각 웰에 첨가하였다. (1x 체적 SPRI 비드들은 표준 1.8x 내지 2.2x 와 비교하여 보다 높은 RNA 회수율을 보였다).
용해물 및 비드 혼합물을 실온에서 15 분 동안 배양하였다. 제공된 배양의 연장 기간은 방출된 RNA의 결합을 향상시켰다. 이어서, 플레이트를 96-웰 플레이트 자석 (MagWellTM 자기 분리기 96, Cat. #57624) 상으로 전달하여 5 분간 배양하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 에탄올 세척을 80% 에탄올 100 마이크로리터 (Sigma Cat. # E7023, 신선하게 준비) 를 첨가하여 수행하였다. 약 30 초 이후에, 에탄올을 흡인하고 에탄올 세척을 반복하였다. 최종 흡인 이후 플레이트를 96-웰 플레이트 자석으로부터 제거하고 비드들을 5 분 동안 건조시켰다.
cDNA 합성. 플레이트를 4C로 전달하였고 비드들을 0.8 마이크로리터 RNase가 없는 물 (Ambion Cat no AM9937); 1 마이크로리터의 1:5M ERCC 제어 RNA (ThermoFisher Scientific Cat. # 4456740); 1 마이크로리터 dNTPs (각각 10 mM, NEB, #N0447L); 1 마이크로리터의 비오틴-dTVI RNA 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO. 2); 및 0.2 마이크로리터의 RNaseOUT (4U/마이크로리터, Life Technologies Cat. #107777-019) 을 함유하는 4ul의 "RT 믹스 1"에 재현탁하였다. 제공된 비오틴-dTVI RNA 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드의 캡처 서열의 3' 이노신은 이노신이 임의의 천연 뉴클레오티드에 결합할 수 있기 때문에 방출된 RNA에 증가된 결합을 제공하였다. 3' 이노신을 갖는 캡처 서열은, 시간의 25%에만 mRNA에 결합할 수 있는 최종 "N" 뉴클레오티드를 포함하는 캡처 서열보다 방출된 RNA의 우수한 캡처를 제공할 수 있다. 캡처/프라이밍 시퀀스에 의한 캡처의 개략도는 전술한 바와 같이 도 8a에 도시된다. ERCC RNA 대조군은 내부 RT 대조군을 제공하고 역전사 효율을 향상시키는 캐리어 RNA를 제공하였다. 플레이트를 72℃에서 5 분 동안 배양하고 즉시 4℃로 옮겼다. 1 마이크로리터의 베타인 (5M, Sigma Cat. #B030075VL); 1.5 마이크로리터의 5X RT 믹스 (Thermo, #EP0753), 0.5 마이크로리터의 비오티닐화된 바코드-템플릿 스위칭 올리고뉴클레오티드 (biot_barcoded TSO; SEQ ID NO. 3), 0.5 마이크로리터의 120mM MgCl2 (125mM, Life Technologies Cat. #AM9530G), 0.4 마이크로리터의 RNase OUT 및 0.1 마이크로리터의 Maxima RNaseH 마이너스 역전사 효소 (200U/마이크로리터, Thermo Fisher Cat. # EP0753) 을 함유하는 4 마이크로리터의 "RT 믹스 2"를 각 웰에 첨가하였다. "RT 믹스 2"를 추가한 이후, 역전사를 42℃에서 90 분 동안 수행한 다음, 50℃에서 2 분/42℃에서 2 분을 10 사이클 반복하였다. 최종 열 사이클 후에 75℃에서 15 분 동안 열 비활성화시켰다. biot_barcoded TSO의 4 개 뉴클레오타이드 바코드 "NNNN"은 다중 배출 플레이트들의 잠재적 멀티플렉스 서열화 실험을 위한 내부 바코딩을 제공했으며 이 방법의 필수 기능은 아니었다. 초기 가닥 연장의 개략도는 도 8b에 도시되어 있고, TSO 연관은 도 8c에 도시되어 있고, 역전사의 완전한 전사 생성물은 도 8d에 도시되어 있다.
전체 mRNA 증폭. cDNA 합성 이후, 배출 플레이트를 5 분 동안 200g 원심 분리하였고, 12.5 마이크로리터 2X Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix (Roche Cat. #KK2602), 1 마이크로리터의 P1 프라이머 (biot_P1, SEQ ID NO. 4) 및 3.5 마이크로리터의 뉴클레오티드가 없는 물 (Ambion Cat. #AM9937) 을 함유하는 17 마이크로리터의 PCR 믹스를 첨가하였고 PCR을 98℃에서 3 분간 수행한 후 15 초 동안 98℃, 30 초 동안 65℃, 5 분 동안 72℃의 20 회 사이클, 및 72℃에서 5 분의 최종 연장을 수행하였다. 최종 연장 기간은 중합 효소가 긴 cDNA 분자들을 증폭시키기에 충분할만큼 길었다 (2kb 이상). 이 증폭의 개략도가 도 8e에 도시되어 있다.
PCR 클린-업. 25 마이크로리터 (1x 체적) DNAClean SPRI 비드들 (Beckman Coulter, Cat. #A62881) 을 각각의 웰에 첨가하고 잘 혼합하여, 하류 증폭을 오염시킬 수 있는 프라이머-이량체 및 짧은 분해 RNA 생성물을 제거하였다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 배양 이후, 플레이트를 웰 플레이트 자석에 5 분간 두었다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 80% 에탄올 (새로 제조) 100 마이크로리터를 첨가하여 에탄올 세척을 수행하였다. 약 30초 후, 에탄올이 흡인되었다. 에탄올 세척 과정을 한 번 반복하였다. 최종 흡인 후, 배출 웰 플레이트를 웰 플레이트 자석으로부터 제거하고 비드들을 5 분 동안 건조시켰다. DNA는 15 마이크로리터의 뉴클레아제-없는 H2O 에 의해 건조된 비드들로부터 용리되었다. 도 9a 는 전체 길이 cDNA의 예상 평균 길이에 대해 약 1800bp 정도의 예상 분포를 나타낸, 생성물에 대한 BioAnalyzer 전기페로그램 궤적을 보여주었다. cDNA의 통상적인 양은 증폭 및 클린업이 수행된 이후 약 2 ng 내지 약 20 ng으로 추정되었다.
BCR 증폭 및 바코딩. 단일 세포의 B-세포 수용체 (BCR) 증폭 및 바코딩은 2 단계 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 에서 수행되었다.
PCR 1. 제 1 PCR에서, 순방향 프라이머 (FP1, SEQ ID NO. 5) 를 bio_barcoded_TSO로부터 통합된 P1 서열의 3' 말단에 하이브리드화하도록 설계하여, 상기 전체 RNA 증폭 단계에 통합된 P1 서열을 제거하였다. 역방향 프라이머(들) (RP1, SEQ ID Nos. 6, 7, 8) 는 중쇄 및 경쇄의 조인트 (J) 유전자 분절에 가까운 B 세포 수용체 유전자 단편의 불변 영역에 결합한다. PCR 1의 개략도가 도 8f에 도시되어 있다. 순방향 프라이머는 플레이트의 12 열을 가로 질러가는 12 개의 상이한 6 개의 뉴클레오티드 바코드들 (NNNNNN) 을 포함하였다. 이로써 PCR 1은 전체 RNA 증폭 생성물 중 RNA 서열을 함유하는 BCR에 대한 선택을 수행하였고, BCR의 가변, 결합 및 다양성 분절들에 초점을 맞춘 BCR 영역에 대해 추가로 선택하였다. 이러한 선택적인 증폭의 증폭된 생성물 (도 8f의 증폭된 생성물 (860) 로 나타냄) 은 polyA/polyT 캡처 서열도 함유하지 않았고 BCR의 대부분의 불변 영역을 함유하지 않았으며, 이들 중 어느 것도 관심있는 데이터를 제공하지 않았다.
PCR 1은 1 마이크로리터의 증폭된 전사물, 5 마이크로리터의 2X Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix, 0.1 마이크로리터의 순방향 바코딩된 프라이머 (FP1), 0.2 마이크로리터의 역방향 중쇄 불변 프라이머 (쥐과 Hc에 대한 RP1, SEQ ID NO. 6), 쥐과 Kc 에 대해 RP1 및 쥐과 λc에 대해 RP1 (SEQ. ID Nos. 6 및 7) 의 혼합물이 1:1 이었던 0.1 마이크로리터의 경쇄 불변 프라이머, 및 3.6 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 함유하는 10 마이크로리터의 반응에서 수행되었다. 사이클링 조건들: 98℃에서 3 분; 이어서 98℃에서 20 초, 70℃에서 45 초, 및 72℃에서 45 초의 5 사이클; 이어서 98℃에서 20 초, 68℃에서 45 초, 및 72℃에서 45 초의 10 사이클; 이어서 98℃에서 20 초, 65℃에서 45 초, 72℃에서 45초의 10 사이클; 그리고 마지막으로 72℃에서 5 분간 연장을 수행하였다.
PCR 2. 제 2 PCR에서, 단일 순방향 프라이머 (FP2, SEQ ID NO. 9) 는 바코딩된 FP1 에 결합하고 8 바코딩된 (NNNNNN) 역방향 프라이머 (RP2, SEQ ID NO. 10) 를 플레이트의 8 개의 열에 걸쳐 사용하였다. 이 전략은 전체 96 개의 웰 플레이트에서 각각의 웰을 고유하게 바코딩하기 위해 단지 20 개의 바코드만들을 사용할 수 있게 했다. cDNA 합성에 사용된 biot_barcoded_TSO에서 통합된 내부 플레이트 바코드와 다수의 플레이트들을 결합할 수 있다. PCR 2의 개략도가 도 8f에 도시되어 있다. 최종 생성물인 앰플리콘 (amplicon) (880) 의 개략도가 도 8h에 도시되어 있다.
PCR 2는 PCR 1 생성물을 탬플릿으로 사용하여 수행한다 (예를 들어, 도 8g의 생성물 (860)). 1 마이크로리터의 PCR 1 생성물, 5 마이크로리터의 2X Kapa Hi Fi HotStart ReadyMix, 0.1 마이크로리터의 전방향 프라이머 FP2, 0.1 마이크로리터의 역방향 바코딩된 프라이머 RP2, 및 3.8 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 함유하는 10 마이크로리터 반응을 수행하였다. 도 9b 는 이 방법에 의해 제공되는 단일 세포 앰플리콘에 대한 겔 전기영동의 결과를 보여주었다. 화살표는 500bp를 나타내는 참조 사이징 사다리 (레인 M) 의 밴드를 가리킨다. 레인 1에서, 중쇄 (Hc) 로 증폭된 단일 세포, 및 경쇄 (Kc) 로 증폭된 단일 세포 레인 2에서, 각 증폭 생성물에 대해 적절한 길이의 밴드를 보여주었다. 사이클링 조건들: PCR은 98 ℃에서 3 분 동안; 이어서 98℃에서 20 초, 68℃에서 45 초, 72℃에서 45 초의 5 사이클; 이어서 98℃에서 20 초, 65℃에서 45 초, 72℃에서 45 초의 15 사이클을 수행하였고; 그리고 마지막으로 72℃에서 5 분간 연장을 수행하였다.
앰플리콘 풀링, 클린업 및 서열화. 앰플리콘을 풀링했다. 1x 체적 DNAClean SPRI 비드들 (Beckman Coulter, Cat. #A62881) 을 각 웰에 첨가하고 잘 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 배양 이후, 플레이트를 웰 플레이트 자석에 5 분간 두었다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 80% 에탄올 (새로 제조) 100 마이크로리터를 첨가하여 에탄올 세척을 수행하였다. 약 30 초 이후, 에탄올을 흡인하고 에탄올 세척을 한 번 더 반복하였다. 최종 흡인 이후, 플레이트를 자석으로부터 제거하고 비드들을 5 분 동안 건조시켰다. DNA는 15 ul의 뉴클레아제가 없는 물에 의해 건조된 비드들로부터 용리되었다.
이 실험이 Illumina TruSeq에 대해 적용되었지만, 다른 어댑터들을 대신 사용할 수 있으며 임의의 다른 차세대 서열화 (Next Generation Sequencing, NGS) 계측에 적합한 라이브러리들을 제공하거나 대안으로 Sanger 서열화에 적합하도록 증폭될 수 있다.
대안으로, 웰플레이트의 개별 웰들에서의 앰플리콘이 결합되지 않은 경우, PCR 및 클린업의 두 라운드 이후의 QubitTM 에 대한 정량화는 약 25 ng 내지 약 90 ng의 증폭 생성물이 웰당 생산되었음을 보여주었다. 위에서 설명한대로 이것은 서열화를 통해 수행하는데 충분할 수 있다.
도 10(a)-(c)에서, 특이적 증폭 생성물을 검출하는 능력을 뒷받침하는 겔 전기영동 결과를 나타내었다. 이 실험에서, 19 개의 단일 OKT3 세포가 배출되었고, 상기와 같이 생성된 전체 RNA 증폭 생성물은 세 부분으로 분리되었다. 3 개의 부분들 각각은 상기 기재된 프라이머들 및 프로세스를 사용하여 중쇄 (Hc), 경쇄 카파 (Kc) 및 경쇄 람다 (λc) 에 대해 개별적으로 증폭되었다. 도 10(a) 에서, 중쇄는 19 개의 단일 세포들 모두로부터 증폭된 것으로 나타났다 (희미한 밴드들은 큐빗 (Qubit) 분석에 의해 확인되었다). 도 10(b) 및 10(c)에서, 경쇄 카파 (도 7b) 또는 경쇄 람다 (도 7c) 는 각각의 세포가 카파 또는 람다 중 하나를 갖고, 둘 다가 아니라는 것을 나타내었다. 예를 들어, 레인 8, 12, 13, 14는 카파가 아닌 람다 경쇄를 가지고, 레인 9, 10, 11은 카파 경쇄를 가지지만 람다는 갖지 않는다. 겔의 왼쪽 가장자리에 있는 화살표는 500 bp의 사이징 사다리에서 밴드들을 가리키며, 이는 예상되는 생성물의 크기를 확인한다.
선택 실시형태들의 나열
1. 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법으로서, B 세포 림프구들을 포함하는 샘플을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계로서, 마이크로유체 디바이스는, 흐름 영역 및 격리 펜을 갖는 인클로저를 포함하고, 격리 펜은 단일 개구를 갖는 단리 영역 및 연결 영역을 포함하고, 연결 영역은 단리 영역과 흐름 영역 사이에 유체 연결을 제공하며, 보유 펜의 단리 영역은 마이크로유체 디바이스의 비스웹 영역인, 샘플을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계; 샘플로부터의 B 세포 림프구를 격리 펜의 단리 영역 안으로 로딩하는 단계; 관심 항원이 B 세포 림프구에 근접하도록 인클로저의 흐름 영역 안으로 관심 항원을 도입하는 단계; 및 B 세포 림프구에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계를 포함한다.
2. 격리 펜의 단리 영역은 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함하는, 실시형태 1 의 방법. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 조건 표면은 복수의 컨디셔닝된 표면들을 포함할 수 있다.
3. 컨디셔닝된 표면이 B 세포 림프구들과 실질적으로 비반응성인, 실시형태 2 의 방법.
4. 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면 (또는 복수의 컨디셔닝된 표면들 중 각각의 컨디셔닝된 표면) 은 공유 결합으로 연결된 친수성 분자들의 층을 포함하는, 실시형태 2 또는 3 의 방법.
5. 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-함유 폴리머들을 포함하는, 실시형태 4 의 방법.
6. 마이크로유체 디바이스의 인클로저는 유전 영동 (dielectrophoresis, DEP) 구성을 더 포함하는, 실시형태들 1 내지 5 중 어느 하나의 방법.
7. 마이크로유체 디바이스의 인클로저는 베이스, 마이크로유체 회로 구조, 및 마이크로유체 회로를 함께 정의하는 커버를 더 포함하고, 그리고 마이크로유체 회로는 흐름 영역 및 격리 펜을 포함하는, 실시형태들 1 내지 6 중 어느 하나의 방법.
8. 베이스는 제 1 전극을 포함하고; 커버는 제 2 전극을 포함하고; 그리고 베이스 또는 커버는 전극 활성화 기재를 포함하고, 전극 활성화 기재는 복수의 DEP 전극 영역들을 포함하는 표면을 가지며, 전극 활성화 기재의 표면은 흐름 영역의 내부 표면을 제공하는, 실시형태 7 의 방법.
9. 연결 영역은 약 20 마이크론 내지 약 60 마이크론의 폭 (Wcon) 을 갖는, 실시형태들 1 내지 8 중 어느 하나의 방법.
10. 연결 영역은 길이 (Lcon) 를 갖고, 연결 영역의 길이 (Lcon) 대 연결 영역의 폭 (Wcon) 의 비율은 적어도 1.5의 값을 갖는, 실시형태들 1 내지 9 중 어느 하나의 방법.
11. 단리 영역은 연결 영역의 폭 (Wcon) 보다 더 큰 폭 (Wiso) 을 갖는, 실시형태 9 또는 10 의 방법.
12. 연결 영역은 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론의 폭 (Wiso) 을 갖는, 실시형태들 9 내지 11 중 어느 하나의 방법.
13. 격리 펜은 약 0.5 nL 내지 약 2.5 nL의 체적을 포함하는, 실시형태들 1 내지 12 중 어느 하나의 방법.
14. 격리 펜의 단리 영역은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면 (예를 들어, 복수의 표면들) 을 포함하는, 실시형태들 1 내지 13 중 어느 하나의 방법.
15. 코팅 재료는 B 세포 림프구들과 실질적으로 비반응성인 친수성 분자들을 포함하는, 실시형태 14 의 방법.
16. 코팅 재료는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-함유 폴리머들을 포함하는 (예를 들어, 일부 실시형태들에서, PEG 함유 폴리머들은 PEG-PPG 블록 코폴리머들을 포함함), 실시형태 14 또는 15 의 방법.
17. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 말초 혈액, 비장 생검, 골수 생검, 림프절 생검, 또는 종양 생검의 샘플인, 실시형태들 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
18. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플이 말초 혈액의 샘플인, 실시형태들 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
19. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 골수 생검인, 실시형태들 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
20. B 세포 림프구는 메모리 B 세포인, 실시형태 17 또는 18 의 방법.
21. B 세포 림프구는 형질 B 세포인, 실시형태 17 또는 19 의 방법.
22. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 포유 동물 또는 조류 동물로부터 얻어지는, 실시형태들 1 내지 21 중 어느 하나의 방법.
23. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 토끼, 염소, 양, 라마, 닭, 흰담비, 돼지, 말, 소 또는 칠면조로부터 얻어지는, 실시형태 22 의 방법.
24. 포유 동물은 관심 항원에 대해 면역화되어 있는, 실시형태 22 또는 23 의 방법.
25. 포유 동물은 관심 항원과 관련된 병원체에 노출되어 있거나 면역화되어 있는, 실시형태 22 또는 23 의 방법.
26. 포유 동물은 암을 갖고 암은 관심 항원과 관련되어 있는, 실시형태 22 또는 23 의 방법.
27. 포유 동물은 자가 면역 질환을 갖고 자가 면역 질환은 관심 항원과 관련되어 있는, 실시형태 22 또는 23 의 방법.
28. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 B 세포 림프구들 이외의 다른 세포 타입들이 격감되어 있는, 실시형태들 1 내지 27 중 어느 하나의 방법.
29. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 IgM 항체들, IgA 항체들, IgD 항체들 또는 이들의 임의의 조합을 발현하는 B 세포 림프구들이 격감되어 있는, 실시형태들 1 내지 28 중 어느 하나의 방법.
30. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 CD27을 발현하는 B 세포 림프구들에 대해 농축되어 있는, 실시형태들 1 내지 19 및 21 내지 29 중 어느 하나의 방법.
31. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 CD138을 발현하는 B 세포 림프구들에 대해 농축되어 있는, 실시형태들 1 내지 20 및 22 내지 29 중 어느 하나의 방법.
32. B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 마이크로유체 디바이스에 도입되기 이전에 DNase와 접촉되어 있는, 실시형태들 1 내지 31 중 어느 하나의 방법.
33. 단일의 B 세포 림프구는 단리 영역 안으로 로딩되는, 실시형태들 1 내지 32 중 어느 하나의 방법.
34. 복수의 B 세포 림프구들은 단리 영역 안으로 로딩되는, 실시형태들 1 내지 32 중 어느 하나의 방법.
35. B 세포 림프구를 B 세포 활성화를 자극하는 자극제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 실시형태들 1 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 자극제는 CD40 작동제를 포함하는, 실시형태 35의 방법.
37. CD40 작동제는 CD40L, 이의 유도체, 또는 항-CD40 항체를 포함하고 임의로 CD40 작동제는 마이크로-객체 (예를 들어, 비드) 에 연결되는, 실시형태 36의 방법.
38. 자극제는 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들 (예를 들어, 조사된 T 세포들) 또는 이들의 유도체를 포함하는, 실시형태 35의 방법.
39. 자극제는 B 세포 수용체 (BCR)-리게이팅 분자를 더 포함하는, 실시형태들 35 내지 38 중 어느 하나의 방법.
40. BCR-리게이팅 분자는 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는, 실시형태 39의 방법.
41. BCR-리게이팅 분자는 마이크로-객체에 연결되는, 실시형태 39 또는 40의 방법.
42. B 세포 림프구들을 자극제와 접촉시키는 단계는 B 세포 림프구들을 CD40L+ 피더 세포들 및 비드들에 컨쥬게이트된 단백질 A 의 혼합물 (예를 들어, 약 1:1 내지 약 1:10의 비율) 과 접촉시키는 단계를 포함하는, 실시형태 35의 방법.
43. B 세포 림프구들을 자극제와 접촉시키는 단계는 혼합물을 (예를 들어, 중력 또는 DEP 힘을 사용하여) 격리 펜의 단리 영역 안으로 로딩하는 단계를 포함하는, 실시형태 42의 방법.
44. 자극제는 톨 유사 수용체 (toll-like receptor, TLR) 작동제를 더 포함하는, 실시형태들 35 내지 43 중 어느 하나의 방법.
45. TLR 작동제는 CpG 올리고뉴클레오티드인, 실시형태 44의 방법.
46. B 세포 림프구는 1 내지 10 일의 기간 동안 자극제와 접촉되는 (일부 실시형태에서, 접촉 기간은 3 내지 5 일일 수 있음), 실시형태들 35 내지 45 중 어느 하나의 방법.
47. B 세포 림프구는 1 내지 10 일의 기간 동안 자극제와 접촉되는 (일부 실시형태에서, 접촉 기간은 3 내지 5 일일 수 있음), 실시형태 46의 방법.
48. B 세포 림프구에 배양 배지를 제공하는 단계를 더 포함하고, 배양 배지는 B 세포 팽창 및/또는 활성화를 증진하는 하나 이상의 제제들을 포함하는, 실시형태들 35 내지 47 중 어느 하나의 방법.
49. 배양 배지는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21, BAFF 및 April 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함하는, 실시형태 48의 방법.
50. 배양 배지는 TLR 작동제를 포함하는, 실시형태 48 또는 49 의 방법.
51. B 세포 림프구에는 1 내지 10 일의 기간 동안 배양 배치가 제공되는 (일부 실시형태에서, 접촉 기간은 3 내지 5 일일 수 있음), 실시형태들 48 내지 50 중 어느 하나의 방법.
52. 자극제와 접촉시키는 단계 및 배양 배지를 제공하는 단계는 시간의 실질적으로 동연의 기간 동안 수행되는, 실시형태들 48 내지 50 중 어느 하나의 방법.
53. B 세포 림프구를 자극제와 접촉시키는 단계는 B 세포 림프구를 마이크로유체 디바이스에 도입하기 이전에 수행되는, 실시형태들 35 내지 52 중 어느 하나의 방법.
54. B 세포 림프구를 자극제와 접촉시키는 단계는 B 세포 림프구를 마이크로유체 디바이스에 도입한 이후 (예를 들어, B 세포 림프구를 격리 펜의 단리 영역 안으로 로딩한 이후) 수행되는, 실시형태들 35 내지 53 중 어느 하나의 방법.
55. B 세포 림프구를 자극제와 접촉시키는 단계는 모니터링 단계 동안 수행되는, 실시형태 35 내지 54 중 어느 하나의 방법.
56. 격리 펜의 단리 영역 안으로 B 세포 림프구를 로딩하는 단계는 DEP 힘을 사용하여 B 세포 림프구를 단리 영역 안으로 이동시키는 단계를 포함하는, 실시형태 6의 방법.
57. B 세포 림프구는 흐름 영역에서 단리 영역으로 이동되는, 실시형태 56의 방법.
58. 관심 항원을 제공하는 단계는 가용성 관심 항원을 포함하는 용액을 흐름 영역 안으로 또는 흐름 영역을 통해 흘려보내는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 57 중 어느 하나의 방법.
59. 관심 항원은 제 1 검출 가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지) 에 공유 결합으로 결합되는, 실시형태 58의 방법.
60. 제 1 항체 결합제를 포함하는 마이크로-객체를 제공하는 단계를 더 포함하고, 제 1 항체 결합제는 B 세포 림프구에 의해 발현되는 항체에 대한 관심 항원의 결합을 저해함이 없이 B 세포 림프구에 의해 발현되는 항체에 결합하고, 그리고 B 세포 림프구에 의해 발현되는 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계는 마이크로-객체에 대한 관심 항원의 간접적인 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 실시형태 58 또는 59의 방법.
61. 제 1 항체 결합제는 B 세포 림프구에 의해 발현되는 항체의 Fc 도메인에 결합하는, 실시형태 60의 방법.
62. 마이크로-객체는 비드인, 실시형태 60 또는 61의 방법.
63. 마이크로-객체를 제공하는 단계는 마이크로-객체를 포함하는 용액을 흐름 영역 안으로 흐르게 하고 마이크로-객체가 격리 펜의 근위에 위치될 때 흐름을 정지시키는 단계를 포함하는, 실시형태 60 내지 62 중 어느 하나의 방법.
64. 마이크로-객체를 제공하는 단계는 마이크로-객체를 격리 펜 안으로 로딩하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 63의 방법.
65. 마이크로-객체를 포함하는 용액 및 가용성 관심 항원을 포함하는 용액은 동일한 용액인, 실시형태 63 또는 64의 방법.
66. 마이크로-객체를 포함하는 용액 및 가용성 관심 항원을 포함하는 용액은 상이한 용액들이고, 마이크로-객체를 제공하는 단계는 관심 항원을 제공하기 이전에 일어나는, 실시형태 63의 방법.
67. 제 2 검출 가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지) 를 포함하는 제 2 항체 결합제를 제공하는 단계; 및 제 2 항체 결합제의 마이크로-객체에 대한 간접적인 결합을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 실시형태들 60 내지 65 중 어느 하나의 방법.
68. 제 2 항체-결합제가 IgG 항체들 (예를 들어, 항-IgG 2 차 항체) 에 결합하는 (선택적으로 특이적으로 결합할 수 있는), 실시형태 67의 방법.
69. 제 1 검출 가능한 표지가 제 2 검출 가능한 표지와 상이하고 (차별적으로 검출될 수 있는), 실시형태 67 또는 68의 방법.
70. 제 2 항체-결합제를 제공하는 단계는 가용성 제 2 항체-결합제를 포함하는 용액을 흐름 영역 안으로 또는 흐름 영역을 통해 흘려보내는 단계를 포함하는, 실시형태들 67 내지 69 중 어느 하나의 방법.
71. 가용성 제 2 항체-결합제를 포함하는 용액 및 가용성 관심 항원을 포함하는 용액은 동일한 용액인, 실시형태 70의 방법.
72. 가용성 제 2 항체-결합제를 포함하는 용액 및 가용성 관심 항원을 포함하는 용액은 상이한 용액들 (예를 들어, 이들은 순차적으로 제공됨) 인, 실시형태 70의 방법.
73. 관심 항원을 제공하는 단계는 관심 항원을 포함하는 마이크로-객체를 제공하는 단계를 포함하고, 마이크로-객체는 세포, 리포솜, 지질 나노라프트 또는 비드인, 실시형태들 1 내지 57 중 어느 하나의 방법.
74. 관심 항원 이전에 또는 관심 항원과 동시에 표지된 항체 결합제를 제공하는 단계를 더 포함하고, B 세포 림프구에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계는 관심 항원에 대한 표지된 항체 결합제의 간접적인 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 실시형태 73의 방법.
75. (선택적으로 특이적으로 결합할 수 있는) 표지된 항체-결합제는 항-IgG 항체들 (예를 들어, 항-IgG 2 차 항체) 에 결합하는, 실시형태 74의 방법.
76. 표지된 항체-결합제는 형광 표지에 공유 결합으로 결합되는, 실시형태 74 또는 75의 방법.
77. 표지된 항체-결합제는 관심 항원과의 혼합물로 제공되는, 실시형태들 74 내지 76 중 어느 하나의 방법.
78. 표지된 항체-결합제는 관심 항원과의 혼합물로 제공되는, 실시형태들 74 내지 76 중 어느 하나의 방법.
79. B 세포 림프구에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계는 마이크로유체 디바이스의 격리 펜의 전부 또는 일부를 촬상하는 단계를 포함하는, 실시형태들 1 내지 78 중 어느 하나의 방법.
80. 촬상은 형광 촬상을 포함하는, 실시형태 79의 방법.
81. 촬상은 복수의 이미지들을 취하는 것을 포함하는, 실시형태 79 또는 80의 방법.
82. 복수의 이미지들은 고정된 시간 간격들로 취해지는, 실시형태 81의 방법.
83. 마이크로유체 디바이스는 복수의 격리 펜들을 포함하고, 각각의 격리 펜은 단리 영역 및 연결 영역을 갖고, 각각의 연결 영역은 단리 영역과 흐름 영역 사이의 유체 연결을 제공하고, 방법은: 복수의 B 세포 림프구들 중 하나 이상을 복수의 격리 펜들 중 2 이상의 격리 펜들의 각각 격리 펜의 단리 영역 안으로 로딩하는 단계; 관심 항원이 하나 이상의 B 세포 림프구들이 로딩된 2 이상의 격리 펜들 각각에 근접하도록 관심 항원을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계; 및 로딩된 B 세포 림프구들 중 각각의 B 세포 림프구에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 실시형태들 1 내지 82 중 어느 하나의 방법.
84. 단일의 B 세포 림프구는 복수의 격리 펜들 중 2 이상의 격리 펜들의 각각 격리 펜의 단리 영역 안으로 로딩되는, 실시형태 83의 방법.
85. 로딩된 B 세포 림프구 또는 로딩된 B 세포 림프구들 중 어느 것들에 의해 발현된 항체에 대한 관심 항원의 결합을 검출하는 단계; 로딩된 B 세포 림프구 또는 로딩된 B 세포 림프구들 중 어느 것들을, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 표현하는 것으로 식별하는 단계를 더 포함하는, 실시형태들 1 내지 84 중 어느 하나의 방법.
86. 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법으로서, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단을 식별하는 단계로서, 실시형태 85의 방법에 따라 수행되는, 식별하는 단계; B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단으로부터 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계; 및 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 인코딩하는 핵산의 적어도 일 부분 및/또는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하는 핵산의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 방법.
87. 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 서열화하는 단계는:
식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 용해시키는 단계; B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)로부터 단리된 mRNA 를 역전사하는 단계로서, mRNA 는 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 인코딩하여 VH cDNA 를 형성하는, mRNA 를 역전사하는 단계; 및 VH cDNA 의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 실시형태 86의 방법.
88. 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 서열화하는 단계는: 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 용해시키는 단계; B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단으로부터 단리된 mRNA 를 역전사하는 단계로서, mRNA 는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하여 VL cDNA 를 형성하는, mRNA 를 역전사하는 단계; 및 VL cDNA 의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 실시형태 86 또는 87의 방법.
89. mRNA를 역전사하는 단계는 mRNA를 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 실시형태 87 또는 88의 방법.
90. 역전사하는 단계는 전사물 스위칭 올리고뉴클레오티드의 존재하에 수행되는, 실시형태 89의 방법.
91. 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)는 용해되기 이전에 마이크로유체 디바이스로부터 배출되는, 실시형태 87 내지 90 중 어느 하나의 방법.
92. 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단을 배출하는 단계는: 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 격리 펜의 단리 영역으로부터 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역 안으로 이동시키는 단계; 및 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 흐름 영역을 통해 마이크로유체 디바이스 밖으로 흘려보내는 단계를 포함하는, 실시형태 91의 방법.
93. 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 격리 펜의 단리 영역으로부터 이동시키는 단계는 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단을 DEP 힘을 이용하여 캡처 및 이동시키는 단계를 포함하는, 실시형태 92의 방법.
94. 식별된 B 세포 림프구는 단일의 세포로서 배출되는, 실시형태 91 내지 93 중 어느 하나의 방법.
95. 이들의 클론 집단의 식별된 B 세포 림프구(들)는 그룹으로서 배출되는, 실시형태 91 내지 93 중 어느 하나의 방법.
96. 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)는 마이크로유체 디바이스 내에서 용해되는, 실시형태 87 또는 88의 방법.
97. 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)에 근접하여 하나 이상의 캡처 비드들을 제공하는 단계로서, 하나 이상의 캡처 비드들은 각각 VH mRNA 및/또는 VL mRNA 를 결합시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는, 하나 이상의 캡처 비드들을 제공하는 단계; 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단을 용해시키는 단계; 및 용해된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 용해된 B 세포 림프구(들)로부터의 VH mRNA 및/또는 VL mRNA 이 하나 이상의 캡처 비드들에 의해 결합될 수 있게 하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 96의 방법.
98. 하나 이상의 캡처 비드들의 각각의 캡처 비드는 복수의 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드들을 포함하는, 실시형태 94의 방법.
99. 하나 이상의 캡처 비드들은 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 용해시키기 이전에 제공되는, 실시형태 97 또는 98의 방법.
100. 하나 이상의 캡처 비드들의 각각은 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 함유하는 격리 펜 안으로 로딩되는, 실시형태 97 내지 99 중 어느 하나의 방법.
101. 하나 이상의 캡처 비드들을 마이크로유체 디바이스의 실질적으로 RNA가 없는 영역으로 이동시키는 단계를 더 포함하는, 실시형태 97 내지 100 중 어느 하나의 방법.
102. 하나 이상의 캡처 비드들을 마이크로유체 디바이스의 실질적으로 RNA가 없는 영역으로 이동시키기 이전에, 실질적으로 RNA가 없는 영역은 어떠한 B 세포 림프구들도 포함하지 않은, 실시형태 101의 방법.
103. 실질적으로 RNA가 없는 영역은 식별된 B 세포 림프구가 로딩된 격리 펜과는 다른 격리 펜 내에 있는, 실시형태 101 또는 102의 방법.
104. 결합된 VH mRNA 및/또는 결합된 VL mRNA는 하나 이상의 캡처 비드들에 결합되는 동안 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 로 역전사되는, 실시형태 97 내지 103 중 어느 하나의 방법.
105. 결합된 VH mRNA 및/또는 결합된 VL mRNA는 하나 이상의 캡처 비드들이 마이크로유체 디바이스 내에 (예를 들어, 격리 펜 내에) 함유되는 동안 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 로 역전사되는, 실시형태 104의 방법.
106. 결합된 VH 및/또는 결합된 VL mRNA는 역전사 효소, 뉴클레오티드 및 적절한 버퍼를 마이크로유체 디바이스의 흐름 영역 안으로 또는 흐름 영역을 통해 흘려 보냄으로써 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 으로 역전사되는, 실시형태 104 또는 105의 방법.
107. VH cDNA 및/또는 VL cDNA는 하나 이상의 캡슐 비드들에 결합되는 동안 마이크로유체 디바이스로부터 배출되는, 실시형태 104 내지 106 중 어느 하나의 방법.
108. VH mRNA 및/또는 VL mRNA 를 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 로 역전사하기 이전에 마이크로유체 디바이스로부터 하나 이상의 캡처 비드들을 배출하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 97 내지 104 중 어느 하나의 방법.
109. 서열화하기 이전에 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 를 증폭시키는 단계를 더 포함하는, 실시형태 87 또는 88의 방법.
110. 증폭시키는 단계는 PCR 증폭을 포함하는, 실시형태 109의 방법.
111. 증폭시키는 단계는 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들의 표현을 B 세포 림프구로부터 단리된 역전사된 mRNA 에서 증가시키는 단계를 포함하는, 실시형태 109 또는 110의 방법.
112. 증폭시키는 단계는 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들의 표현을 B 세포 림프구로부터 단리된 역전사된 mRNA 에서 증가시키는 증폭의 제 1 라운드; 및 제 1 라운드에서 증폭된, VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들 안으로 바코드 서열들을 도입하는 증폭의 제 2 라운드를 포함하는, 실시형태 111의 방법.
113. VH cDNA 및/또는 VL cDNA가 사전 PCR 증폭없이 서열화되는, 실시형태 87 또는 88의 방법.
이전에 언급된 임의의 변형 이외에, 다수의 다른 변형 및 대안적인 배열이 본 설명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고도 당업자에 의해 고안될 수 있으며, 첨부된 청구 범위는 그러한 변형 및 배열을 포함하도록 의도된다. 따라서, 정보가 현재 가장 실용적이고 바람직한 양태로 간주되는 것과 관련하여 구체적이고 상세한 설명과 함께 위에서 설명되었지만, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게는, 형태, 기능, 동작 방식 및 용도를 포함한 (이에 한정되지 않음) 다수의 변형들이 본원에 기재된 원칙 및 개념을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 실시예 및 실시형태는 모든 면에서 단지 예시적인 것을 의미하며 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 용어 "단계"는 본 명세서에서 사용되었지만, 이 용어는 설명된 방법의 상이한 부분에 간단하게 주의를 기울이는데 사용될 수 있으며, 방법의 임의의 부분에 대한 시작점 또는 정지점을 기술하거나, 또는 다른 어떤 방법으로도 제한할 수 없다는 것을 의미하지 않는다는 점에 유의해야 한다.
비공식 SEQ ID NO. 나열
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Berkeley Lights, Inc. Park, Minha Briggs, Jason C. McEwen, Jason M. Ramenani, Ravi K. Chirra Dinakar, Hariharasudhan Szeto, Kai W. Higa, Adrienne T. White, Mark P. Lowe Jr., Randall D. Wang, Xiaohua Chapman, Kevin T. <120> METHODS FOR SCREENING B CELL LYMPHOCYTES <130> BL002063-PCT <140> PCT/US17/57926 <141> 2017-10-23 <150> US 62/411,690 <151> 2016-10-23 <150> US 62/412,092 <151> 2016-10-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5.1 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 aagcagtggt atcaacgcag agt 23 <210> 2 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with Biotin <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is inosine <400> 2 aagcagtggt atcaacgcag agtacttttt tttttttttt tttttttttt tttttvn 57 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with Biotin <220> <221> misc_feature <222> (39)..(42) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> modified_base <222> (43)..(45) <223> n is guanosine <400> 3 gtggtatcaa cgcagagtac acgacgctct tccgatctnn nnnnn 45 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with Biotin <400> 4 aagcagtggt atcaacgcag agt 23 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n is a, t, c, or g <400> 5 gaccaccgag atctacacnn nnnnacactc tttccctaca cgacgctctt ccgatct 57 <210> 6 <211> 54 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc tctggacagg gatccagagt tcca 54 <210> 7 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc ttcgttcact gccatcaatc ttcca 55 <210> 8 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 actggagttc agacgtgtgc tcttccgatc taggkgtacc atytrccttc ca 52 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (25)..(30) <223> n is a, t, c, or g <400> 10 caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg t 51

Claims (75)

  1. 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법으로서,
    B 세포 림프구들을 포함하는 샘플을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계로서, 상기 마이크로유체 디바이스는,
    흐름 영역 및 격리 펜을 갖는 인클로저를 포함하고,
    상기 격리 펜은 단일 개구를 갖는 단리 영역 및 연결 영역을 포함하고, 상기 연결 영역은 상기 단리 영역과 상기 흐름 영역 사이에 유체 연결을 제공하며, 상기 보유 펜의 상기 단리 영역은 상기 마이크로유체 디바이스의 비스윕 (unswept) 영역인, 상기 샘플을 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계;
    상기 샘플로부터의 B 세포 림프구를 상기 격리 펜의 상기 단리 영역 안으로 로딩하는 단계;
    상기 관심 항원이 상기 B 세포 림프구에 근접하도록 상기 인클로저의 상기 흐름 영역 안으로 상기 관심 항원을 도입하는 단계; 및
    상기 B 세포 림프구에 의해 발현된 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계를 포함하고,
    상기 격리 펜의 상기 단리 영역은 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면은 공유 결합으로 연결된 친수성 분자들의 층을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-함유 폴리머들을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로유체 디바이스의 상기 인클로저는 유전 영동 (dielectrophoresis, DEP) 구성을 더 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 마이크로유체 디바이스의 상기 인클로저는 베이스, 마이크로유체 회로 구조, 및 마이크로유체 회로를 함께 정의하는 커버를 더 포함하고, 그리고 상기 마이크로유체 회로는 상기 흐름 영역 및 상기 격리 펜을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 베이스는 제 1 전극을 포함하고;
    상기 커버는 제 2 전극을 포함하고; 그리고
    상기 베이스 또는 상기 커버는 전극 활성화 기재를 포함하고,
    상기 전극 활성화 기재는 복수의 DEP 전극 영역들을 포함하는 표면을 가지며, 상기 전극 활성화 기재의 상기 표면은 상기 흐름 영역의 내부 표면을 제공하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 연결 영역은 약 20 마이크론 내지 약 60 마이크론의 폭 (Wcon) 을 갖는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 연결 영역은 길이 (Lcon) 를 갖고, 상기 연결 영역의 상기 길이 (Lcon) 대 상기 연결 영역의 폭 (Wcon) 의 비율은 적어도 1.5의 값을 갖는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 단리 영역은 상기 연결 영역의 폭 (Wcon) 보다 더 큰 폭 (Wiso) 을 갖는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 단리 영역은 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론의 폭 (Wiso) 을 갖는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 격리 펜은 약 0.5 nL 내지 약 2.5 nL의 체적을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 격리 펜의 상기 단리 영역은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 코팅 재료는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-함유 폴리머들을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 말초 혈액, 비장 생검, 골수 생검, 림프절 생검, 또는 종양 생검의 샘플인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 말초 혈액의 샘플인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 골수 생검인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구는 메모리 B 세포인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  18. 제 14 항 또는 제 16 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구는 형질 B 세포인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 포유 동물 또는 조류 동물로부터 얻어지는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 게르빌루스쥐, 햄스터, 토끼, 염소, 양, 라마 또는 닭으로부터 얻어지는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    상기 포유 동물은 상기 관심 항원에 대해 면역화되어 있거나, 상기 포유 동물은 상기 관심 항원과 관련된 병원체에 노출되어 있거나 면역되어 있거나, 상기 포유 동물은 암을 갖고 상기 암은 상기 관심 항원과 관련되어 있거나, 또는 상기 포유 동물은 자가 면역 질환을 갖고 상기 자가 면역 질환은 상기 관심 항원과 관련되어 있는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 B 세포 림프구들 이외의 다른 세포 타입들이 격감되어 있는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  23. 제 1 항 또는 제 22 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 CD27을 발현하는 B 세포 림프구들에 대해 농축되어 있는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  24. 제 1 항 또는 제 22 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 CD138을 발현하는 B 세포 림프구들에 대해 농축되어 있는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 포함하는 샘플은 상기 마이크로유체 디바이스 안으로 도입되기 이전에 DNase와 접촉되어 있는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서,
    단일의 B 세포 림프구는 상기 단리 영역 안으로 로딩되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서,
    복수의 B 세포 림프구들은 상기 단리 영역 안으로 로딩되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  28. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구를 B 세포 활성화를 자극하는 자극제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 자극제는 CD40 작동제를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 자극제는 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
    상기 자극제는 B 세포 수용체 (BCR)-리게이팅 분자를 더 포함하고, 상기 BCR-리게이팅 분자는 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 BCR-리게이팅 분자는 마이크로-객체에 연결되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  33. 제 28 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구들을 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 B 세포 림프구들을 비드들에 컨쥬게이트된 단백질 A 및 CD40L+ 피더 세포들의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 B 세포 림프구들을 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 혼합물을 상기 격리 펜의 상기 단리 영역 안으로 로딩하는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  34. 제 29 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구는 3 내지 5 일의 기간 동안 상기 자극제와 실질적으로 연속적으로 접촉되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  35. 제 29 항에 있어서,
    B 세포 림프구에 배양 배지를 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 배양 배지는 B 세포 팽창 및/또는 활성화를 증진하는 하나 이상의 제제들을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-21 및 BAFF 또는 April 을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 TLR 작동제를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 TLR 작동제는 CpG 올리고뉴클레오티드들인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  39. 제 35 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구에는 1 내지 3 내지 5 일의 기간 동안 배양 배지가 제공되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  40. 제 35 항에 있어서,
    상기 자극제와 접촉시키는 단계 및 상기 배양 배지를 제공하는 단계는 시간의 실질적으로 동연의 기간에 걸쳐 수행되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  41. 제 4 항에 있어서,
    상기 격리 펜의 상기 단리 영역 안으로 상기 B 세포 림프구를 로딩하는 단계는 DEP 힘을 사용하여 상기 B 세포 림프구를 상기 단리 영역 안으로 이동시키는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구는 상기 흐름 영역으로부터 상기 단리 영역으로 이동되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  43. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 항원을 제공하는 단계는 가용성 관심 항원을 포함하는 용액을 상기 흐름 영역 안으로 또는 상기 흐름 영역을 통해 흘려보내는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 관심 항원은 제 1 검출 가능한 표지에 공유 결합으로 결합되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    제 1 항체 결합제를 포함하는 마이크로-객체를 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 제 1 항체 결합제는 상기 B 세포 림프구에 의해 발현되는 상기 항체에 대한 관심 항원의 결합을 저해함이 없이 상기 B 세포 림프구에 의해 발현되는 상기 항체에 결합하고, 그리고 상기 B 세포 림프구에 의해 발현되는 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계는 상기 마이크로-객체에 대한 상기 관심 항원의 간접적인 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 제 1 항체 결합제는 상기 B 세포 림프구에 의해 발현되는 상기 항체의 Fc 도메인에 결합하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서,
    상기 마이크로-객체를 제공하는 단계는 상기 마이크로-객체를 포함하는 용액을 상기 흐름 영역 안으로 흘려보내고 상기 마이크로-객체가 상기 격리 펜의 근위에 위치될 때 상기 흐름을 정지시키는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  48. 제 45 항에 있어서,
    상기 마이크로-객체를 포함하는 상기 용액 및 상기 가용성 관심 항원을 포함하는 상기 용액은 동일한 용액인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  49. 제 45 항에 있어서,
    제 2 검출 가능한 표지를 포함하는 제 2 항체 결합제를 제공하는 단계; 및
    상기 제 2 항체 결합제의 상기 마이크로-객체에 대한 간접적인 결합을 모니터링하는 단계를 더 포함하고,
    상기 제 1 검출 가능한 표지는 상기 제 2 검출 가능한 표지와 상이한, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 제 2 항체 결합제는 IgG 항체들에 결합하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  51. 제 1 항에 있어서,
    상기 관심 항원을 제공하는 단계는 상기 관심 항원을 포함하는 마이크로-객체를 제공하는 단계를 포함하고, 상기 마이크로-객체는 세포, 리포솜, 지질 나노라프트 또는 비드인, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    상기 관심 항원 이전에 또는 상기 관심 항원과 동시에 표지된 항체 결합제를 제공하는 단계를 더 포함하고,
    상기 B 세포 림프구에 의해 발현된 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 상기 모니터링하는 단계는 상기 관심 항원에 대한 상기 표지된 항체 결합제의 간접적인 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제는 항-IgG 항체들에 결합하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  54. 제 1 항에 있어서,
    상기 B 세포 림프구에 의해 발현된 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계는 상기 마이크로유체 디바이스의 상기 격리 펜의 전부 또는 일부를 촬상하는 단계를 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    상기 촬상은 형광 촬상을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    상기 촬상은 복수의 이미지들을 취하는 것을 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  57. 제 1 항에 있어서,
    상기 마이크로유체 디바이스는 복수의 상기 격리 펜들을 포함하고, 각각의 격리 펜은 단리 영역 및 연결 영역을 갖고, 각각의 상기 연결 영역은 상기 단리 영역과 상기 흐름 영역 사이의 유체 연결을 제공하고, 상기 방법은:
    상기 복수의 B 세포 림프구들 중 하나 이상을 상기 복수의 격리 펜들 중 2 이상의 격리 펜들의 각각의 격리 펜의 상기 단리 영역 안으로 로딩하는 단계;
    상기 관심 항원이 하나 이상의 B 세포 림프구들이 로딩된 상기 2 이상의 격리 펜들 각각에 근접하도록 상기 관심 항원을 상기 마이크로유체 디바이스 안으로 도입하는 단계; 및
    상기 로딩된 B 세포 림프구들 중 각각의 B 세포 림프구에 의해 발현된 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서,
    단일의 B 세포 림프구는 상기 복수의 격리 펜들 중 상기 2 이상의 격리 펜들의 각각의 격리 펜의 상기 단리 영역 안으로 로딩되는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  59. 제 57 항에 있어서,
    상기 로딩된 B 세포 림프구 또는 상기 로딩된 B 세포 림프구들 중 어느 것들에 의해 발현된 상기 항체에 대한 상기 관심 항원의 결합을 검출하는 단계;
    상기 로딩된 B 세포 림프구, 또는 상기 로딩된 B 세포 림프구들 중 상기 어느 것들을, 상기 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 표현하는 것으로 식별하는 단계를 더 포함하는, 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 검출하는 방법.
  60. 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법으로서,
    상기 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구 또는 이들의 클론 집단을 식별하는 단계로서, 제 59 항의 방법에 따라 수행되는, 상기 식별하는 단계;
    상기 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단으로부터 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 및/또는 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계; 및
    상기 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 인코딩하는 상기 핵산의 적어도 일 부분 및/또는 상기 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하는 상기 핵산의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 서열화하는 단계는:
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 용해시키는 단계;
    상기 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)로부터 단리된 mRNA 를 역전사하는 단계로서, 상기 mRNA 는 상기 면역 글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 을 인코딩하여 VH cDNA 를 형성하는, 상기 mRNA 를 역전사하는 단계; 및
    상기 VH cDNA 의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서,
    상기 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 서열화하는 단계는:
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 B 세포 림프구(들)를 용해시키는 단계;
    상기 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단으로부터 단리된 mRNA 를 역전사하는 단계로서, 상기 mRNA 는 상기 면역 글로불린 경쇄 가변 영역 (VL) 을 인코딩하여 VL cDNA 를 형성하는, 상기 mRNA 를 역전사하는 단계; 및
    상기 VL cDNA 의 적어도 일 부분을 서열화하는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  63. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서,
    상기 mRNA를 역전사하는 단계는 상기 mRNA를 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    상기 역전사하는 단계는 전사물 스위칭 올리고뉴클레오티드의 존재하에 수행되는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  65. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)는 용해되기 이전에 상기 마이크로유체 디바이스로부터 배출되는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  66. 제 65 항에 있어서,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단을 배출하는 단계는,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)를 상기 격리 펜의 상기 단리 영역으로부터 상기 마이크로유체 디바이스의 상기 흐름 영역 안으로 이동시키는 단계; 및
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)를 상기 흐름 영역을 통해 상기 마이크로유체 디바이스 밖으로 흘려보내는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)를 상기 격리 펜의 상기 단리 영역으로부터 이동시키는 단계는 상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단을 DEP 힘을 이용하여 캡처 및 이동시키는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  68. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)는 상기 마이크로유체 디바이스 내에서 용해되는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 B 세포 림프구(들)에 근접하여 하나 이상의 캡처 비드들을 제공하는 단계로서, 상기 하나 이상의 캡처 비드들은 각각 상기 VH mRNA 및/또는 상기 VL mRNA 를 결합시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드들을 포함하는, 상기 하나 이상의 캡처 비드들을 제공하는 단계;
    상기 식별된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단을 용해시키는 단계; 및
    상기 용해된 B 세포 림프구 또는 이들의 상기 클론 집단의 상기 용해된 B 세포 림프구(들)로부터의 상기 VH mRNA 및/또는 상기 VL mRNA 이 상기 하나 이상의 캡처 비드들에 의해 결합될 수 있게 하는 단계를 더 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 캡처 비드들의 각각의 캡처 비드는 복수의 캡처/프라이밍 올리고뉴클레오티드들을 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  71. 제 69 항에 있어서,
    상기 결합된 VH mRNA 및/또는 상기 결합된 VL mRNA는 상기 하나 이상의 캡처 비드들에 결합되는 동안 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 로 역전사되는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    상기 VH cDNA 및/또는 VL cDNA는 상기 하나 이상의 캡처 비드들에 결합되는 동안 상기 마이크로유체 디바이스로부터 배출되는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  73. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서,
    상기 VH cDNA 및/또는 상기 VL cDNA 를 상기 서열화 이전에 증폭시키는 단계를 더 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  74. 제 73 항에 있어서,
    상기 증폭시키는 단계는 VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들의 표현을 상기 B 세포 림프구로부터 단리된 역전사된 mRNA 에서 증가시키는 단계를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 증폭시키는 단계는:
    VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들의 표현을 상기 B 세포 림프구로부터 단리된 역전사된 mRNA 에서 증가시키는 증폭의 제 1 라운드; 및
    상기 제 1 라운드에서 증폭된, VH cDNA 및/또는 VL cDNA 또는 이들의 단편들 안으로 바코드 서열들을 도입하는 증폭의 제 2 라운드를 포함하는, 관심 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 특성화하는 방법.
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