KR20190069456A - 미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법 - Google Patents

미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 dna 바코드 조성물 및 방법 Download PDF

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곤살레스 야라 엑스 메히아
맥켄지 에스 토
라비 케이 라메나니
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Abstract

DNA 바코드 디콘볼루션을 위한 장비, 조성물 및 방법이 본 명세서에서 기술된다. DNA 바코드는 하이브리드화 전략을 사용하여 인 시츄에서 검출할 수 있는, 비드 특이적 식별자를 제공하는데 사용될 수 있다. DNA 바코드는 시퀀싱 분석을 통하여 식별성을 제공한다. 이중 검출 방식은 제한없이 유전자 분석을 포함하여 어세이 정보와 위치적 정보를 연결시키기 위한 광범위한 용도에서 사용될 수 있다. 바코드화된 단일 세포 시퀀싱 라이브러리의 생성을 위한 방법이 기술된다. 미세유체 환경 내에서 단일 세포로부터 핵산의 단리는 세포 특이적 시퀀싱 라이브러리 제조를 위한 토대를 제공할 수 있다.

Description

미세유체 장치에서 인 시츄 식별을 위한 DNA 바코드 조성물 및 방법
본 출원은 2016년 10월 1일 출원된 미국 가출원 제62/403,116호; 2016년 10월 1일 출원된 미국 가출원 제62/403,111호; 2017년 2월 10일 출원된 미국 가출원 제62/457,399호; 2017년 2월 10일 출원된 미국 가출원 제62/457,582호; 및 2017년 3월 13일 출원된 미국 가출원 제62/470,669호의 35 U.S.C. 119(E) 하의 이득을 주장하는 정규 출원이고, 이들 각각의 개시 내용은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
단일 세포 게놈 증폭 기술 및 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 개별 생물학적 세포의 게놈 및 전사체를 서열분석하는 우리 능력의 돌파구를 이끌어내었다. 이들 진보에도 불구하고, 서열분석된 세포의 특별한 표현형과 게놈 및 전사체 서열을 연결시키는 것은 극도로 어렵고 - 대체로는 불가능한 채로 남아있다. 본 명세서에서 더욱 기술하는 바와 같이, 미세유체 환경 내에서, 바코드, 예컨대 DNA 바코드를 해독하는 능력은 세포 기원 및 이의 표현형과 게놈 및 전사체 데이타의 연결을 가능하게 할 수 있다.
단일 세포, 또는 세포의 소규모 클론 개체군으로부터 바코드화된 RNA-seq 라이브러리 및/또는 게놈 DNA 라이브러리를 생성시키고, 라이브러리로부터 수득된 서열을 거꾸로 개별 세포/클론 개체군과 연결시키는데 사용될 수 있는, 바코드화된 포획 객체와 관련된 조성물, 키트 및 방법을 본 명세서에서 기술한다. 이 방법은 하나 이상의 격리 펜을 함유하는 인클로저를 구비한 미세유체 장치에서 수행된다. 이 방법의 한 장점은 세포를 미세유체 장치의 상응하는 격리 펜 내에 선택적으로 배치시킬 수 있고 그들의 표현형을 게놈 및/또는 전사체 시퀀싱을 처리하기 이전에 관찰할 수 있다는 것이다. 바코드화된 포획 객체 및 관련 방법의 핵심 특성은 미세유체 장치에서 인 시츄로, 그리고 게놈/전사체 라이브러리로부터 수득된 서열 판독물에서, 바코드를 "판독"할 수 있고, 그리하여 게놈/전사체 데이타와 소스 세포의 관찰된 표현형의 연결을 가능하게 할 수 있다는 것이다.
일 양상에서, 포획 객체가 제공된다. 포획 객체는 고형 지지체 (예를 들어, 비드)에 공유적으로 연결된 적어도 2종의 (예를 들어, 다수의) 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 바코드 서열, 프라이밍 서열, 및 포획 서열을 갖는다. 바코드 서열은 비동일 올리고뉴클레오티드 서열 ("서브-바코드" 서열 또는 "단어"라고도 함)의 세트를 형성하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 디자인된다. 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 고유한 조합은 함께 연결되어 고유한 바코드 서열 (또는 "문장")을 형성한다. 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 표지된 (예를 들어, 형광 표지된) 프로브를 사용하여 개별적으로 해독될 수 있기 때문에, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트에 상보적인 하이브리드화 프로브의 세트는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 모든 가능한 조합, 및 따라서 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 생성될 수 있는 모든 가능한 바코드 서열을 인 시츄에서 식별하는데 충분하다.
다른 양상에서, 미세유체 장치 내에서 포획 객체의 인 시츄 식별을 위한 방법을 비롯하여, 게놈/전사체 데이타와 생물학적 미세-객체의 상호관련을 위한 방법이 제공된다. 방법은 미세유체 장치 내에서, 본 명세서의 다른 부분 또는 상기에 기술된 바와 같을 수 있는 포획 객체를 배치시키는 단계, 및 상보성 하이브리드화 프로브의 세트를 사용하여, 인 시츄에서 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별/해독하는 단계를 포함한다. 인 시츄 식별이 수행되는 미세유체 장치는 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체적으로 접속된 다수의 격리 펜을 포함하는 인클로저를 포함하고, 포획 객체는 격리 펜 중 하나 내에 배치된다. 다수의 격리 펜들 각각은 적어도 하나의 생물학적 미세-객체 및 적어도 하나의 포획 객체를 수용할 수 있다.
바코드의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 하나 이상의 하이브리드화 프로브는 장치의 흐름 영역으로 프로브를 포함하는 용액을 흘려줌으로써 격리 펜으로 유입될 수 있다. 표지, 예컨대 형광 표지를 포함해도 되는, 이들 하이브리드화 프로브는 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열 내의 그들 표적 상보성 서열 (즉, 상응하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열)과 어닐링되어서, 프로브/카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 상보성에 기인하여 관찰되는 표지 (예를 들어, 형광성)를 통해서 바코드화된 비드의 해독을 가능하게 한다. 포획 객체 바코드의 식별은 생물학적 미세-객체로부터 핵산을 포획하는 공정 및 핵산 라이브러리 제조 공정 동안 다양한 시점에 수행될 수 있다. 식별 공정은 하나의 생물학적 미세-객체 유래 핵산이 포획 올리고뉴클레오티드에 포획된 이전 또는 이후 또는 전사/역전사 이후에 수행될 수 있다. 대안적으로, 포획 객체의 식별은 생물학적 미세-객체가 미세유체 장치의 격리 펜에 배치되기 이전에 수행될 수도 있다. 해독 공정은 이미지 획득 유닛을 포함하는 시스템을 사용해 수행될 수 있다.
특정한 실시형태에서, 수많은 생물학적 미세-객체 (예를 들어, 단일 세포 또는 클론 개체군)는 포획 객체가 격리 펜 내에 배치되기 이전 또는 이후에, 격리 펜에서 노출될 수 있다. 격리 펜에 유입되는 포획 객체 및 생물학적 미세-객체의 개수는 결정론적으로 설정될 수 있다. 예를 들어, 단일 포획 객체 및 단일 생물학적 미세-객체는 단일 격리 펜에 배치될 수 있거나, 단일 포획 객체 및 생물학적 세포의 클론 개체군은 단일 격리 펜에 배치될 수 있거나, 또는 복수의 포획 객체 및 하나 이상의 생물학적 미세-객체는 단일 격리 펜에 배치될 수 있다. 격리 펜에 유입되기 이전에, 생물학적 미세-객체의 소스 개체군을 나타낼 수 있다.
격리 펜에서 생물학적 미세-객체의 용해 시에, 포획 객체는 방출된 핵산을 포획할 수 있다. 바코드는 임의로 PCR과 커플링된 역전사 (RT-PCR)와 같은 상이한 기전에 의해서 포획된 핵산의 전사물/게놈 DNA 단편 내에 유입/공유적으로 결합된다. 바코드화된 전사물은 더욱 처리되어 그 후에 시퀀싱될 수 있다. 게놈 데이타 및 연관된 바코드는 해독되어서 특별한 소스 격리 펜 사이 및 그리하여 소스 생물학적 미세-객체 및 이의 표현형 사이 일치를 허용할 수 있다.
포획 올리고뉴클레오티드의 바코드, 및 그리하여 특정 위치에서 포획 객체의 식별 공정은 자동화 공정일 수 있다. 본 명세서에 기술된 이미지 획득 유닛은 미세유체 장치의 다수의 격리 펜 및 흐름 영역의 하나 이상의 이미지를 캡처하도록 구성된 이미징 엘리먼트를 더 포함할 수 있다. 시스템은 이미지 획득 유닛에 통신가능하게 접속된 이미지 프로세싱 유닛을 더 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각각의 캡처된 이미지를 수신하고 이미지로 묘사된 각 격리펜에 대한 관심 영역을 정의하도록 구성된 관심 영역 결정 엔진을 포함할 수 있다. 이미지 프로세싱 유닛은 각 격리 펜에서 특정한 미세-객체 및 그와 연관된 표지화 하이브리드화 프로브로부터 발생된 임의의 연관 신호의 존재를 의미하는 점수를 결정하도록, 각 격리 펜의 관심 영역 내에서 이미지 영역의 적어도 일부분을 분석하도록 구성된 채점 엔진을 더 포함할 수 있다. 미세유체 장치는 적어도 하나의 코팅된 표면을 더 포함해도 된다. 방법의 일부 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 그에 공유적으로 결합된 분자, 예컨대 친수성 중합체 및/또는 음이온성 중합체를 포함할 수 있는, 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함할 수 있다.
다른 양상에서, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 생물학적 세포를 배치시키는 단계; 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 여기서 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 각각은 프라이머에 결합하는 프라이밍 서열; 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 생물학적 세포를 용해시켜서 용해된 생물학적 세포로부터 방출되는 핵산이 포획 객체가 포함하는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계; 및 포획된 핵산을 전사하여, 다수의 바코드화 cDNA가 장식된 포획 객체를 생성시키는 단계로서, 각각의 바코드화된 cDNA는 (i) 포획된 핵산 중 상응하는 하나에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열이 (ii) 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결되어 포함되는 것인 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-특이적 프라이머 서열은 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 mRNA 서열을 표적으로 삼을 수 있다. 다른 실시형태에서, 유전자-특이적 프라이머는 B-세포 수용체 (BCR)를 코딩하는 mRNA 서열을 표적으로 삼을 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 포획 객체가 격리 펜 내에 위치된 상태로, 인 시츄로 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 방법은 상기 포획 객체 또는 상기 다수의 상기 포획 객체를 상기 미세유체 장치로부터 이출시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 생물학적 세포를 배치시키는 단계 및/또는 포획 객체를 배치시키는 단계는 생물학적 세포 및/또는 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동(DEP)력을 인가하여 수행된다.
다음으로, 바코드화된 cDNA가 장식된 포획 객체는 후속 라이브러리 제조 및 시퀀싱을 위해 이출될 수 있다. 바코드 및 cDNA는 시퀀싱될 수 있고 게놈 데이타는 소스 격리 펜 번호 및 개별 세포/콜로니에 일치시킬 수 있다. 이러한 공정은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 자동화 공정을 통해서 미세유체 장치 내에서 수행될 수도 있다.
다른 양상에서, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 게놈 DNA를 포함하는 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계; 생물학적 미세-객체를 생물학적 미세-객체의 핵 엔벨로프를 파괴할 수 있는 용해 시약과 접촉시켜서, 생물학적 미세-객체의 게놈 DNA를 방출시키는 단계; 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화시켜서, 제1 태그먼트화 삽입 서열에 의해 정의되는 제1 말단 및 제2 태그먼트화 삽입 서열에 의해 정의되는 제2 말단을 갖는 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편을 생성시키는 단계; 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 각각은 제1 프라이밍 서열; 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편 중 하나를 (i) 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나의 제1 태그먼트화 삽입 서열, (ii) 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열에 연결된 제2 프라이밍 서열, 무작위 프라이머 서열, 또는 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 가닥 치환 효소 및 중합효소를 포함하는 효소 혼합물과 접촉시키는 단계; 일정 시간 기간 동안 접촉된 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편을 인큐베이션시켜서, 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편 중 하나들을 동시에 증폭시키고 포획 올리고뉴클레오티드 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편 중 하나들의 말단에 첨가하여 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 생성시키는 단계; 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 미세유체 장치로부터 이출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 태그먼트화 단계는 방출된 게놈 DNA를 (i) 제1 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제1 이중-가닥 DNA 단편, 및 (ii) 제2 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제2 이중-가닥 DNA 단편이 로딩된 트랜스포사제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 이중-가닥 DNA 단편은 제3 프라이밍 서열에 연결된 제1 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있고, 제2 이중-가닥 DNA 단편은 제4 프라이밍 서열에 연결된 제2 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 포획 객체가 격리 펜 내에 위치된 상태로, 인 시츄로 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계 및/또는 포획 객체를 배치시키는 단계는 생물학적 세포 및/또는 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP)력을 인가하여 수행된다.
다른 양상에서, 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 생물학적 세포를 배치시키는 단계; 격리 펜 내에 제1 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 제1 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 각각은 제1 프라이밍 서열; 제1 포획 서열; 및 제1 바코드 서열을 포함하고, 제1 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 제1 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 본 명세서에 기술된 바와 같은 cDNA 라이브러리를 수득하는 임의의 방법을 수행하여 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 생물학적 세포의 용해가 수행되어 생물학적 세포의 핵 엔벨로프는 온전하게 남아있으면서, 생물학적 세포의 원형질막이 분해되어, 생물학적 세포로부터 세포질 RNA가 방출되어서, 생물학적 세포의 RNA로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리가 장식된 제1 포획 객체를 제공하는 것인 단계; 격리 펜 내에 제2 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 제2 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각은 제2 프라이밍 서열; 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및 제2 바코드 서열을 포함하고, 제2 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 제2 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 임의의 방법을 수행하여 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 생물학적 세포 유래의 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편이 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 접촉되어서, 생물학적 세포의 게놈 DNA로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 것인 단계; 및 미세유체 장치로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계는 격리 펜에 생물학적 세포를 배치시키는 단계 이전; 생물학적 세포의 RNA로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계 이전; 또는 미세유체 장치로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리-장식된 제1 포획 객체를 이출시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 포획 객체의 다수의 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 B 림프구로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 단계로서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드화된 cDNA를 생성시키는 임의의 방법에 따라서 생성 단계가 수행되고, 바코드화된 cDNA 라이브러리는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체를 장식하고, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 각각은 Not1 제한효소 부위 서열을 포함하는 것인 단계; 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 바코드화된 cDNA 라이브러리로부터 바코드화된 BCR 서열을 선택하여, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 라이브러리를 생성시키는 단계; 바코드화된 BCR 서열이 농축된 라이브러리 유래 서열을 원형화시켜서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 생성시키는 단계; 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 재선형화시켜서 재배열된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 각각은 각자의 가변 (V) 하위-영역 및/또는 각자의 다양성 (D) 하위-영역에 대해서 3'에 BCR 서열의 불변 (C) 영역이 존재하는 것인 단계; 및 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 하위-영역 및/또는 D 하위-영역에 대해서 하위-선택하여, 바코드화된 BCR 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 인-시츄에서 바코드를 식별하는 임의 방법을 사용하여 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 식별 단계는 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 식별 단계는 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키면서 수행될 수 있다.
도 1A는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 장치 및 연관된 제어 장비와의 사용을 위한 시스템의 예를 예시한다.
도 1B 및 도 1C는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 장치를 예시한다.
도 2A 및 도 2B는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 단리 펜들을 예시한다.
도 2C는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 상세한 격리 펜을 예시한다.
도 2D-F는 본 개시의 일부 다른 실시형태들에 따른 격리 펜들을 예시한다.
도 2G는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 장치를 예시한다.
도 2H는 본 개시의 실시형태에 따른 미세유체 장치의 코팅된 표면을 예시한다.
도 3A는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 미세유체 장치 및 연관된 제어 장비와의 사용을 위한 시스템의 특정 예를 예시한다.
도 3B는 본 개시의 일부 실시형태들에 따른 이미징 장치를 예시한다.
도 4A는 포획 객체의 인-시츄 검출가능 바코드 서열과 생물학적 세포 유래 핵산에 대한 시퀀싱 데이타간 관련성을 예시하고, 여기서 핵산은 미세유체 환경 내에 있으면서 포획되고 이출 후에 시퀀싱된다.
도 4B는 본 개시의 실시형태에 따라서 포획 객체의 인-시츄 검출가능 바코드 서열을 사용하여 가능한 다양한 핵산 작업 흐름의 개략도이다.
도 5는 본 개시의 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 일 실시형태의 개략도이다.
도 6은 바코드 서열을 형성하는 카세트형 서열의 상이한 조합으로부터 발생된 10,000의 바코드 다양성을 갖는, 본 개시의 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 일 실시형태의 개략도이다.
도 7A는 본 개시의 일 실시형태에 따른 포획 객체의 바코드의 인-시츄 검출을 위한 방법의 개략도이다.
도 7B 및 7C는 본 개시의 일 실시형태에 따른 포획 객체의 바코드 서열의 인-시츄 검출 방법의 사진도이다.
도 8A-C는 본 개시의 다른 실시형태에 따른 포획 객체의 바코드 서열의 인-시츄 검출 방법의 개략도이다.
도 8D-8F는 본 개시의 다른 실시형태에 따른 포획 객체의 바코드 서열의 2종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 인-시츄 검출 방법의 사진도이다.
도 9는 본 개시의 일 실시형태에 따른 단일 세포 RNA 포획, 라이브러리 제조 및 시퀀싱에 관한 작업흐름의 개략도를 예시한다.
도 10A-10D는 본 개시의 일 실시형태에 따른, 후속 RNA 포획과 외부 세포막의 용해를 위한 공정의 일 실시형태의 사진도이다.
도 11A는 본 개시의 실시형태에 따른, RNA 라이브러리를 제공하는 작업흐름의 일부분의 개략도이다.
도 11B 및 11C는 본 개시의 실시형태에 따른 시퀀싱 라이브러리 품질의 분석에 대한 그래프이다.
도 12A-12F는 본 개시의 실시형태에 따른, 단일 세포 용해, DNA 라이브러리 제조, 및 시퀀싱을 위한 작업흐름의 그림도이다.
도 12G는 단일 세포 DNA 라이브러리 제조의 개략도이다.
도 13A 및 13B은 단일 세포 B 세포 수용체 (BCR) 포획, 라이브러리 제조 및 시퀀싱을 위한 작업흐름의 개략도이다.
도 14A는 본 개시에 따른 포획 객체의 바코드 서열의 인-시츄 검출 방법의 일 실시형태의 사진도이다.
도 14B는 본 개시의 일 실시형태에 따른 cDNA 장식된 포획 객체의 이출에 대한 사진도이다.
도 14C 및 14D는 본 개시의 일 실시형태에 따른 시퀀싱 라이브러리 품질 분석에 대한 그래프이다.
도 15A 및 15B는 본 개시의 일 실시형태를 통해서 제조된 라이브러리로부터의 판독치의 시퀀싱에 관한 그래프이다.
도 16A-16D는 본 개시의 일 실시형태에 따라 제조된 cDNA 시퀀싱 라이브러리로부터 수득된 시퀀싱 결과의 그래프이다.
도 17은 포획 객체 전달의 확률화를 시험하는, 실험 전반에서 검출된 바코드 서열의 세트에서의 변량의 그래프이다.
도 18은 본 개시에 따른 방법의 일 실시형태를 위한 실험에 따른 바코드 서열 판독치의 회수에 관한 그래프이다.
도 19는 본 개시의 일 실시형태에서 미세유체 장치 내 T-세포의 사진도이다.
도 20A 및 20B는 본 개시의 일 실시형태에 따른 배양, 항원의 염색 및 인-시츄 바코드 서열 검출 동안 특이적 세포의 사진도이다.
도 21A 및 21B는 본 개시의 일 실시형태에 따른 배양, 항원의 염색 및 인-시츄 바코드 서열 검출 동안 특이적 세포의 사진도이다.
도 22A 및 22B는 본 개시의 일 실시형태에 따른 배양, 항원의 염색 및 인-시츄 바코드 서열 검출 동안 특이적 세포의 사진도이다.
도 23은 본 개시의 일 실시형태에 따른 활성화, 활성화 항원-양성 및 활성화 항원-음성 세포에 걸친 시퀀싱 결과의 그래프이다.
도 24는 본 개시의 일 실시형태에 따른 실질적으로 하나씩 분포된 세포의 사진도이다.
도 25는 본 개시의 일 실시형태에 따른 핵 DNA의 용해 및 방출을 위한 공정의 사진도이다.
도 26A 및 26B는 본 개시의 실시형태에 따른 용해 이전 및 이후 염색된 세포의 사진도이다.
도 27은 본 개시의 일 실시형태에 따른 시퀀싱 라이브러리에서 게놈 DNA의 분포에 관한 그래프이다.
도 28은 본 개시의 일 실시형태에 따른 샘플 게놈 DNA에서 염색체의 예상 길이 및 각 염색체에 대해서 관찰된 실험 포괄도를 더 포함하는 그래프이다.
도 29A-29D는 본 개시의 일 실시형태에 따른 게놈 DNA 라이브러리 품질의 그래프이다.
도 30A-30F는 본 개시의 일 실시형태에 따른, 단일 세포 유래의 RNA 및 게놈 DNA 시퀀싱 라이브러리를 수득하는 방법의 사진도이다.
도 31A 및 31B는 본 개시의 일 실시형태에 따른 포획 객체 상에서 바코드 서열을 검출하는 방법의 사진도이다.
도 32는 본 개시의 일 실시형태에 따른 인 시츄로 결정된 바코드 서열과 바코드 및 게놈 데이타를 결정하는 시퀀싱 결과 간 상관성의 그래프이다.
본 명세서는 본 개시의 예시적인 실시형태 및 적용형태를 기술한다. 그러나, 본 개시는 이들 예시적인 실시형태 및 적용형태 또는 예시적인 실시형태 및 적용형태가 본 명세서에서 기술되거나 또는 작동되는 방식에 한정되는 것이 아니다. 더욱이, 도면들은 단순도 또는 부분도를 도시할 수 있고, 도면에서 엘리먼트의 치수는 과장될 수 있거나 또는 아니면 비율에 맞지 않을 수도 있다. 또한, 용어들 "상에", "에 부착된", "에 연결된", "에 커플링된", 또는 유사한 용어들이 본 명세서에서 사용될 때, 하나의 엘리먼트 (예를 들어, 재료, 층, 기판 등)는 그 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트의 바로 위에 있거나, 그에 부착되거나, 그에 연결되거나 또는 그에 커플링되거나 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 개재 엘리먼트가 존재하건 무관하게 다른 엘리먼트 "상에" 있을 수 있거나, "그에 부착될"수 있거나, "그에 연결될"수 있거나, 또는 "그에 커플링될" 수 있다. 또한, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 방향 (예컨대, 위에, 아래에, 상부, 저부, 측부, 상향, 하향, 밑에, 가로질러, 위쪽, 아래쪽, 수평, 수직, "x", "y", "z" 등)은 제공된다면 상대적인 것이고, 단지 예로서, 예시 및 설명의 용이함을 위해 제공되고 제한하는 것이 아니다. 또한, 엘리먼트의 목록 (예를 들어, 엘리먼트, a, b, c)을 참조하는 경우에, 이러한 참조는 열거된 엘리먼트 그 자체, 열거된 모든 엘리먼트 미만의 임의 조합, 및/또는 열거된 모든 엘리먼트의 조합 중 어느 하나를 포함하려는 의도이다. 본 명세서에서 섹션 분할들은 단지 검토의 용이성을 위한 것이며 설명되는 엘리먼트의 임의 조합을 한정하지 않는다.
미세유체 피처 (feature)의 치수가 폭 또는 면적을 갖는 것으로 설명되는 경우에, 그 치수는 전형적으로 미세유체 장치의 기판 및/또는 덮개부에 평행한 평면 내에 놓인 x-축 및/또는 y-축 치수에 대해서 설명된다. 미세유체 피처의 높이는 미세유체 장치의 기판 및/또는 덮개부에 평행한 평면에 수직인 z-축 방향에 대해 설명될 수도 있다. 일부 예에서, 채널 또는 통로와 같은, 미세유체 피처의 단면적은 x-축/z-축, y-축/z-축, 또는 x-축/y-축 영역을 기준으로 할 수도 있다.
본 명세서에서 사용시, "실질적으로"는 의도된 목적을 위해 작용하는데 충분하다는 것을 의미한다. 따라서 용어 "실질적으로"는 예컨대 당업자가 예상할 수는 있지만 눈에 띄게 전체 성능에 영향을 미치지는 않을 것인 절대적 또는 완전한 상태, 치수, 측정치, 결과 등에서의 작은, 중요하지 않은 변동들을 허용한다. 수치 값이나 수치 값으로 표시될 수 있는 매개변수 또는 특징들에 대해서 사용될 때, "실질적으로"는 10% 이내를 의미한다.
용어 "하나들"은 하나 보다 많은 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "다수"는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본 명세서에서 사용시, ㎛는 마이크로미터를 의미하고, ㎛3는 세제곱 마이크로미터를 의미하고, pL는 피코리터를 의미하고, nL는 나노리터를 의미하며, μL (또는 uL)는 마이크로리터를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "배치되는"은 "위치된"의 의미 내에 포괄되고, 용어 "배치하는"은 "놓인"이라는 의미 내에 포괄된다.
본 명세서에서 사용시, "미세유체 장치" 또는 "미세유체 장비"는 유체를 수용하도록 구성된 하나 이상의 별개의 미세유체 회로를 포함하는 장치이고, 각각의 미세유체 회로는 제한없이 영역(들), 유로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및 임의로 유체에 현탁된 미세-객체)가 미세유체 장치 안으로 및/또는 밖으로 흐를 수 있도록 구성된 적어도 하나의 포트를 포함하는, 유체적으로 상호연결된 회로 엘리먼트를 포함한다. 전형적으로, 미세유체 장치의 미세유체 회로는 적어도 하나의 챔버, 및 미세유체 채널을 포함할 수도 있는, 흐름 영역을 포함하게 될 것이고, 약 1 mL 미만, 예컨대, 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체 부피를 수용하게 될 것이다. 어떤 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 수용한다. 미세유체 회로는 미세유체 장치에서 제1 포트 (예컨대, 입구)와 유체적으로 접속된 제1 단부 및 미세유체 장치에서 제2 포트 (예컨대, 출구)와 유체적으로 접속된 제2 단부를 구비하도록 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "나노유체 장치" 또는 "나노유체 장비"는 약 1 μL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 또는 그 미만의 유체 부피를 수용하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 함유하는 미세유체 회로를 구비한 미세유체 장치의 한 유형이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000개, 또는 그 이상)을 포함할 수도 있다. 어떤 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트 중 하나 이상 (예를 들어, 전부)는 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체 부피를 수용하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부)은 약 20 nL 내지 200 nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL의 유체 부피를 수용하도록 구성된다.
미세유체 장치 또는 나노유체 장치는 본 명세서에서 "미세유체 칩" 또는 "칩"; 또는 "나노유체 칩" 또는 "칩"이라고 할 수 있다.
본 명세서에서 사용시 "미세유체 채널" 또는 "흐름 채널"은 수평 및 수직 치수 둘 모두보다 유의하게 더 긴 길이를 구비하는 미세유체 장치의 흐름 영역을 의미한다. 예를 들어, 흐름 채널은 수평 또는 수직 치수 길이의 적어도 5 배 길이, 예를 들어 적어도 10 배 길이, 적어도 25 배 길이, 적어도 100 배 길이, 적어도 200 배 길이, 적어도 500 배 길이, 적어도 1,000 배 길이, 적어도 5,000 배 길이일 수 있거나, 또는 더 길 수 있다. 일부 실시형태들에서, 흐름 채널의 길이는 그 사이의 임의 값을 포함하여, 약 100,000 미크론 내지 약 500,000 미크론이다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 미크론 내지 약 1000 미크론 (예를 들어, 약 150 미크론 내지 약 500 미크론)이고, 수직 치수는 약 25 미크론 내지 약 200 미크론 (예를 들어, 약 40 미크론 내지 약 150 미크론)이다. 흐름 채널은 미세유체 장치에서 다양한 상이한 공간 구성들을 구비할 수 있고, 그에 따라, 완벽하게 선형인 엘리먼트로 제한되지 않는다는 것을 주의한다. 예를 들어, 흐름 채널은 다음 구성들: 곡선, 굴곡, 나선, 오름 경사면, 내림 경사면, 포크 (예를 들어, 다수의 상이한 유로), 및 이들의 임의의 조합을 구비하는 하나 이상의 섹션들이어도 되거나, 또는 포함할 수도 있다. 또한, 흐름 채널은 그 안에서 바람직한 유체를 제공하도록 넓어지고 수축되는, 그의 경로를 따라 상이한 단면적들을 가질 수도 있다. 흐름 채널은 밸브들을 포함할 수도 있으며, 그 밸브들은 미세유체공학 분야에 공지된 임의의 유형일 수도 있다. 밸브들을 포함하는 미세유체 채널의 예는 미국 특허들 제 6,408,878호 및 제 9,227,200호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "장애물"은 일반적으로 미세유체 장치의 2개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이에서 표적 미세-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 지연시키기 위해 충분히 큰 범프 또는 유사한 유형의 구조체를 지칭한다. 2개의 상이한 영역/회로 엘리먼트는 예를 들어, 미세유체 격리 펜의 연결 영역 및 고립 영역일 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "수축"은 일반적으로 미세유체 장치에서 회로 엘리먼트 (또는 2개 회로 엘리먼트 사이의 인터페이스)의 폭의 좁혀짐을 의미한다. 수축은 예를 들어, 본 개시의 미세유체 격리 펜의 고립 영역과 연결 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "투명한"은 가시광이 통과되면서 그 광이 실질적으로 변화되지 않고 통과될 수 있게 하는 재료를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "미세-객체"는 일반적으로 본 개시에 따라서 단리 및/또는 조작될 수 있는 임의의 미시적 객체를 의미한다. 미세-객체의 비제한적인 예는 무생물 미세-객체, 예컨대 미립자; 마이크로비드 (예를 들어, 폴리스티렌 비드, Luminex™ 비드 등); 자성 비드; 마이크로로드; 와이크로와이어; 양자 도트 등; 생물학적 미세-객체 예컨대 세포; 생물학적 세포소기관; 소포체 또는 복합체; 합성 소포체; 리포솜(예를 들어, 합성 또는 막 조제물 유래); 지질 나노래프트 등; 또는 무생물 미세-객체 및 생물학적 미세-객체의 조합 (예를 들어, 세포에 부착된 마이크로비드, 리포솜-코팅된 미세-비드, 리포솜-코팅된 자성 비드 등)을 포함한다. 비드는 공유적으로 또는 비공유적으로 부착된 모이어티/분자, 예컨대 검출가능한 표지, 단백질, 탄수화물, 항원, 소형 분자 신호전달 모이어티, 또는 어세이에서 사용할 수 있는 다른 화학적/생물학적 종을 포함할 수 있다. 지질 나노래프트는 예를 들어, 문헌 [Ritchie et al. (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs," Methods Enzymol., 464:211-231]에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "세포"는 용어 "생물학적 세포"와 상호교환적으로 사용된다. 생물학적 세포들의 비제한적인 예는 진핵생물 세포, 식물 세포, 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포, 파충류 세포, 조류 세포, 어류 세포 등, 원핵생물 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 원생동물 세포 등, 조직, 예컨대 근육, 연골, 지방, 피부, 간, 폐, 신경 조직 등으로부터 해리된 세포, 면역학적 세포, 예컨대 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 마크로파지 등, 배아 (예를 들어, 접합체), 난모세포, 난자, 정자 세포, 하이브로도마, 배양된 세포, 세포주 유래 세포, 암 세포, 감염된 세포, 형질감염 및/또는 형질전환 세포, 리포터 세포 등을 포함한다. 포유동물 세포는 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등으로부터 유래될 수 있다.
생물학적 세포의 콜로니는 증식할 수 있는 콜로니의 모든 생존 세포가 단일한 부모 세포로부터 유래되는 딸 세포라면 "클론"이다. 특정한 실시형태들에서, 클론 콜로니의 모든 딸 세포는 10회 이하의 분열에 의해서 단일 부모 세포로부터 유래된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니의 모든 딸 세포는 14회 이하의 분열에 의해서 단일 부모 세포로부터 유래된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니의 모든 딸 세포는 17회 이하의 분열에 의해서 단일 부모 세포로부터 유래된다. 다른 실시형태들에서, 클론 콜로니의 모든 딸 세포는 20회 이하의 분열에 의해서 단일 부모 세포로부터 유래된다. 용어 "클론 세포"는 동일한 클론 콜로니의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 생물학적 세포의 "콜로니"는 2개 이상의 세포들 (예를 들어, 약 2 내지 약 20개, 약 4 내지 약 40개, 약 6 내지 약 60개, 약 8 내지 약 80개, 약 10 내지 약 100개, 약 20 내지 약 200개, 약 40 내지 약 400개, 약 60 내지 약 600개, 약 80 내지 약 800개, 약 100 내지 약 1000개, 또는 1000개 초과의 세포)를 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "세포(들)를 유지하는"은 유체 및 기체 성분 둘 모두를 포함하는 환경, 및 임의로 세포를 생존가능하게 하고/하거나 증식되게 유지하는데 필수적인 조건을 제공하는 표면을 제공하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 세포를 의미할 때 용어 "증식되는"은 세포수의 증가를 의미한다.
유체 배지의 "성분"은 용매 분자, 이온, 소형 분자, 항생제, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 핵산, 아미노산, 펩티드, 단백질, 당류, 탄수화물, 지질, 지방산, 콜레스테롤, 대사산물 등을 포함하여, 배지에 존재하는 임의의 화학적 또는 생화학적 분자이다.
본 명세서에서 사용시, "포획 모이어티"는 미세-객체에 대한 인식 부위를 제공하는 화학적 또는 생물학적 종, 작용기, 또는 모티프이다. 선택된 부류의 미세-객체는 인 시츄-발생된 포획 모이어티를 인식할 수 있고 인 시츄-발생된 포획 모이어티에 대한 친화성을 가지거나 또는 그에 결합할 수도 있다. 비제한적인 예는 항원, 항체 및 세포 표면 결합 모티프를 포함한다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "B"는 G (구아노신), C (시티딘) 및 T (티미딘) 뉴클레오티드로부터 선택되는 뉴클레오티드이고, A (아데닌)는 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "H"는 A, C 및 T로부터 선택되는 뉴클레오티드이고, G는 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "D"는 A, G, 및 T로부터 선택되는 뉴클레오티드이고, C는 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "V"는 A, G, 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드이고, T는 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "N"은 A, C, G, 및 T로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "S"는 G 및 C로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용시, 단일 뉴클레오티드를 표시하기 위해 사용되는 "Y"는 C 및 T로부터 선택되는 뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용시, A, C, T, G에 후속되는 "*"는 그 뉴클레오티드의 포스페이트 연결부의 포스포로티오에이트 치환을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, IsoG는 이소구아노신이고; IsoC는 이소시티딘이고; IsodG는 이소구아노신 데옥시리보뉴클레오티드이고 IsodC는 이소시티딘 데옥시리보뉴클레오티드이다. 이소구아노신 및 이소시티딘 리보- 또는 데옥시리보- 뉴클레오티드 각각은 일반적으로 RNA 또는 DNA에 도입되는, 구아닌 뉴클레오염기 또는 시토신 뉴클레오염기에 대해 개별적으로 이성질체인 뉴클레오염기를 함유한다.
본 명세서에서 사용시, rG는 핵산 내에 포함된 리보뉴클레오티드를 의미하고 그렇지 않으면 데옥시리보뉴클레오티드를 함유한다. 모든 리보뉴클레오티드를 함유하는 핵산은 각각의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드라는 것을 표시하기 위한 표지를 함유하지 않을 수 있지만, 문맥을 통해서 분명해진다.
본 명세서에서 사용시, "프라이밍 서열"은 보다 큰 올리고뉴클레오티드의 일부인 올리고뉴클레오티드 서열이고, 프라이밍 서열이 자유 3'을 포함하도록 보다 큰 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 때, DNA (또는 RNA) 중합 반응에서 프라이머로서 기능할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "항체"는 면역글로불린 (Ig)을 의미하고 다클론 및 단일클론 항체; 영장류화 (예를 들어, 인간화); 쥣과동물; 마우스-인간; 마우스-영장류; 및 키메라를 포함하고; 온전한 분자, 이의 단편 (예컨대 scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2 단편), 또는 온전한 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고; 예를 들어 면역화, 합성 또는 유전자 조작을 통해서 제조될 수 있거나 또는 천연적으로 발생될 수 있다. 본 명세서에서 사용시 "항체 단편"은 항원에 결합하고, 예를 들어 갈락토스 잔기의 도입을 통해서 청소 및 흡수를 촉진하는 구조적 특성을 나타내도록 유도체화될 수 있는 항체로부터 유래되거나 또는 그와 관련된 단편을 의미한다. 이것은 예를 들어, F(ab), F(ab)'2, scFv, 경쇄 가변 영역 (VL), 중쇄 가변 영역 (VH), 및 이들의 조합들을 포함한다.
본 명세서에서 언급시 항원은 다른 분자, 예컨대 Ag-특이적 수용체와 특이적으로 결합할 수 있는 분자 또는 이의 일부분이다. 항원은 유기체, 예컨대 포유동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 토끼 등) 내에서 면역 반응을 유도할 수 있지만, 항원은 그 자체가 이러한 면역 반응을 유도하는데 불충분할 수도 있다. 항원은 분자의 임의의 일부분, 예컨대 입체형태적 에피토프 또는 선형 분자 단편일 수도 있으며, 종종 적응성 면역계의 고도의 가변성 항원 수용체 (B-세포 수용체 또는 T-세포 수용체)에 의해 인식될 수 있다. 항원은 펩티드, 다당류 또는 지질을 포함할 수 있다. 항원은 항체의 가변 Fab 영역에 결합하는 이의 능력을 특징으로 할 수 있다. 상이한 항체는 그 구조가 소형 분자여도 되는 합텐의 존재에 의해서 조절될 수도 있는, 항원 표면 상에 존재하는 상이한 에피토프를 구별하는 잠재력을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항원은 암 세포-연관된 항원이다. 암 세포-연관된 항원은 단순할 수 있거나 또는 복잡할 수 있고; 항원은 단백질 상의 에피토프, 탄수화물 기 또는 사슬, 단백질 또는 탄수화물 이외의 생물학적 또는 화학적 작용제, 또는 이의 임의 조합일 수 있고; 에피토프는 선형 또는 입체형태일 수도 있다.
암 세포-연관 항원은 암 세포 (예를 들어, 하나 이상의 특정 유형의 암 세포)를 고유하게 식별하거나 또는 정상 세포 상에서 그의 발현과 비교하여 암 세포 상에서 상향조절된 항원일 수 있다. 전형적으로, 암 세포-연관 항원은 암 세포의 표면 상에 존재하고, 따라서 항체에 의해 인식될 수 있다는 것을 보장한다. 항원은 당분야에 공지되거나 또는 본 명세서에 기술된 종양에서 발견될 수 있는 임의 유형의 암 세포를 포함하여, 임의 유형의 암 세포와 연관될 수 있다. 특히, 항원은 폐암, 유방암, 흑색종 등과 연관될 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 항원과 관련하여 사용될 때 용어 "암 세포와 연관된"은 그 항원이 암 세포에 의해서 직접적으로 생산되거나 또는 암 세포와 정상 세포 간 상호작용에 의한 결과로 생성된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 유체 매질과 관련하여 사용시, "확산되다" 및 "확산"은 농도 구배가 낮은 쪽으로 유체 매질의 성분의 열역학적 이동을 의미한다.
어구 "매질의 흐름"은 주로 확산 이외의 임의 기전에 기인한 유체 매질의 대량 이동을 의미한다. 예를 들어, 매질의 흐름은 한 지점에서 다른 지점으로 그 지점들 간 압력차에 의한 유체 매질의 이동을 포함할 수 있다. 이러한 흐름은 액체의 연속식, 펄스식, 주기식, 무작위식, 간헐식, 또는 왕복식 흐름, 또는 이의 임의 조합을 포함할 수 있다. 한 유체 매질이 다른 유체 매질로 흘러 들어갈 때, 매질의 혼합 및 난류가 일어날 수 있다.
어구 "실질적으로 무흐름"은 유체 매질로의 또는 그 안에서의 물질 (예를 들어, 관심 피분석물)의 성분의 확산 속도 미만인 시간 경과에 따른 평균적인 유체 매질의 유속을 의미한다. 이러한 재료의 성분의 확산 속도는 예를 들어, 온도, 성분의 크기, 및 성분과 유체 매질간 상호작용의 강도에 의존적일 수 있다.
미세유체 장치 내 상이한 영역과 관련하여 본 명세서에서 사용시, 어구 "유체적으로 접속된"은 상이한 영역들이 유체, 예컨대 유체 매질로 실질적으로 충전되어 있을 때, 각 영역 내 유체가 유체의 단일체를 형성하도록 연결된다는 것을 의미한다. 이것은 상이한 영역 내 유체 (또는 유체 매질)가 반드시 조성이 동일하다는 것을 의미하지 않는다. 오히려, 미세유체 장치의 유체로 접속된 상이한 영역 내 유체는 용질이 그들의 개별적인 농도 구배 아래로 이동하고/하거나 유체가 미세유체 장치를 통해서 흐름에 따라서 유입되는 상이한 조성 (예를 들어, 상이한 농도의 용질, 예컨대 단백질, 탄수화물, 이온 또는 다른 분자)의 상을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "유로"는 유체 매질의 궤적을 한정하고, 그를 예속하는 하나 이상의 유체로 접속된 회로 엘리먼트 (예를 들어, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 등)를 의미한다. 따라서, 유로는 미세유체 디바이스의 스웹 (swept) 영역의 일례이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 비스웹 영역들)은 유로내에서 매질의 흐름을 예속시키지 않는 유로를 포함하는 회로 엘리먼트와 유체적으로 접속될 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "미세-객체를 단리하는"은 미세유체 장치 내 정해진 영역으로 미세-객체를 국한시킨다.
미세유체 (또는 나노유체) 장치는 "스웹" 영역 및 "비스웹" 영역을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용시, "스웹" 영역은 미세유체 회로의 하나 이상의 유체적으로 상호접속된 회로 엘리먼트로 구성되고, 이들 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해서 흐르고 있을 때 매질의 흐름을 경험한다. 스웹 영역의 회로 엘리먼트는 예를 들어, 영역, 채널, 및 챔버의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용시, "비스웹" 영역은 미세유체 회로의 하나 이상의 유체로 상호접속된 회로 엘리먼트로 구성되고, 이들 각각은 유체가 미세유체 회로를 통해서 흐르고 있을 때 유체의 유입을 실질적으로 경험하지 않는다. 비스웹 영역은 스웹 영역에 유체적으로 접속될 수 있는데, 단 유체 접속이 스웹 영역과 비스웹 영역간에 확산은 가능하지만 매질의 흐름은 실질적으로 없도록 구조화되는 것을 조건으로 한다. 따라서, 미세유체 장치는 스웹 영역과 비스웹 영역 간에 실질적으로 오직 확산적 유체 연통만을 가능하게 하면서, 스웹 영역 내 매질의 흐름으로부터 비스웹 영역을 실질적으로 고립시키도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 미세-유체 장치의 흐름 채널은 스웹 영역의 일례인 반면, 미세유체의 고립 영역 (이하에서 더욱 상세히 설명함)은 비스웹 영역의 일례이다.
미세유체 환경 내에서 하나 이상의 세포로부터 gDNA 시퀀싱 라이브러리의 생성. 미세유체 장치 내에서 배양, 관찰 또는 표현형분석된 세포의 물리적 위치와 교차-참조되는 DNA 시퀀싱 결과의 생성은 현재 이용가능한 시퀀싱 전략에 매우 바람직한 개선이다. gDNA를 시퀀싱하는 이유는 세포의 DNA 내 변이 또는 돌연변이의 특징규명, 유전자 편집 사건의 평가, 및 클론형성능에 대한 공정 검증을 포함한다. DNA를 단리한 특별한 세포(들)와 시퀀싱 데이타를 상호관련시키는 능력은 이전에 이용가능하지 않았다.
미세유체 장치 내에서 인-시츄로 그리고 최종 시퀀싱 결과로부터 판독할 수 있는 바코드 서열을 도입시킨 미세유체 장치 내에서 세포로부터 DNA 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 작업흐름이 본 명세서에서 기술된다. 미세유체 환경 내에서 바코드를 해독하는 능력은 세포 표현형과 게놈 데이타의 연결을 가능하게 한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 생물학적 세포 (410)는 미세유체 장치의 인클로저 내의 격리 펜 (405) 내에 배치될 수 있고, 거기서 유지되어 어세이될 수 있다. 어세이 (비제한적으로, 세포 표면 마커 (415)를 검출하는 어세이일 수 있는) 동안, 시약 (420) (예를 들어, 항체일 수 있음)이 세포 표면 마커 (415)에 결합할 수 있고, 그렇게 결합시 검출가능한 신호 (425)의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이러한 표현형은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열 (435)을 포함하는, 포획 객체 (430)로 세포 (410)로부터 방출된 핵산을 포획하기 위한 본 명세서에 기술된 방법을 사용함으로써, 특별한 생물학적 세포 (410) 유래의 게놈 데이타와 연결될 수 있다. 바코드 (435)는 본 명세서에 기술된 검출 방법에서 형광 프로브 (440)를 통해서 인-시츄로 검출될 수 있다. 포획 객체 (430)에 포획된 방출된 핵산은 시퀀싱될 때, 생물학적 세포 (405)의 방출된 핵산으로부터의 게놈 정보 및 연관된 바코드(435)의 서열 둘 모두를 포함하는 시퀀싱 데이타 (445)를 제공하는, 시퀀싱 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서 표현형 및 게놈 데이타 간 상관성이 제공된다. 이러한 능력은 도 4B에 도시된 바와 같은 일반 작업흐름으로의 진입을 제공한다. 예를 들어, 세포 배양 (460) 이전, 이후 또는 그 동안에, 유전자 편집 (450), 기능적/표현형적 어세이 또는 표지 어세이 (455)를 포함할 수 있는, 경로를 통해 온 세포는 바코드화된 포획 비드 (470)를 사용하는 연결 공정 (465)으로 들어가서, RNA (475) 및/또는 DNA (480)를 포획할 수 있고, 소스 세포로 되돌아와 상호관련시키는, RNA-seq 482, T 세포 수용체 (TCR)-seq 484, B 세포 수용체 (BCR)-seq 486; 또는 DNA seq (488) 데이타를 제공할 수 있다. 세포가 클론 개체군의 일부분이라면, 양성 클론 이출 (490)이 일어날 수 있다.
더 나아가서, RNA 포획/라이브러리 제조, 및 DNA 포획/라이브러리 제조에 대해 본 명세서에 기술된 프로토콜을 사용하여, RNA 및 DNA 둘 모두에 대한 시퀀싱 결과를 동일한 단일 세포로부터 수득할 수 있고, 시퀀싱된 RNA 및 DNA의 특별한 단일 세포 소스의 미세유체 장치 내 위치와 상호관련시킬 수 있다.
DNA 바코드 (525)는 도 5에 개략적으로 도시된 바와 같이, 형광을 사용하여 개별적으로 해독되는 카세트형 (예를 들어, 일부 실시형태에서, 완전하게 상호변경가능할 수 있는, 변경가능한 서브-유닛 (435a, 435b, 435c, 435d)) 서브-바코드 또는 "단어"를 사용하여 디자인된 것이 본 명세서에 기술된다. 바코드의 검출은 상보적 형광성 표지 하이브리드화 프로브를 사용하여 4개 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 각각을 검출함으로써, 인-시츄에서 수행될 수 있다. 여기에 도시된 바와 같이, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435a)은 형광단 Fluor 1을 포함하는 하이브리드화 프로브 (440a)와의 하이브리드화를 통해서 인-시츄에서 검출된다. 개별적으로, 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435b)은 하이브리드화 프로브 (440b) (Fluor 2 포함)에 의해 유사하게 검출될 수 있고; 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435c)은 Fluor 3을 갖는 하이브리드화 프로브 (440c)에 의해 검출될 수 있고, 4번째 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435d)은 Fluor 4를 갖는 하이브리드화 프로브 (440c)에 의해 검출될 수 있다. 각각의 형광단 Fluor 1, Fluor 2, Fluor 3, 및 Fluor 4는 스펙트럼이 구별가능하여서, 각각의 개별 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 명확한 식별을 가능하게 한다.
도 5에 예시된 방법에서, 프라이밍 서열 (520)과 함께 각각이 DNA 바코드 (525)를 포함하는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 (다수 중 단일 포획 올리고뉴클레오티드 (550)가 도시됨)를 보유하는 비드 (510)를 포함하는 포획 객체 (430)는 하나의 세포 (410)/하나의 세포 콜로니에 대해서 하나의 포획 객체 (430)/하나의 바코드 (525)로서 각각의 격리 펜 (405)에 유입될 수 있다 (도시하지 않음). 일부 다른 실시형태에서, 하나를 초과하는 포획 객체가 조사 중인 생물학적 세포 유래 핵산의 더 많은 분량을 포획하도록 격리 펜에 놓여질 수 있다.
프라이밍 서열 (520), 바코드 (525), 임의로 고유 분자 식별자 (UMI) (525), 및 포획 서열 (535)을 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드 (550)에 링커 (515)를 통해서 연결된 비드 (510)를 포함하는 포획 객체 (430)에 의한, 용해 시 생물학적 세포 (410)로부터 방출된 핵산 (방출된 핵산은 RNA일 수 있음)(505)의 포획에 관한 개략도가 도 5에 제시되어 있다. 이러한 예에서, 바코드 (525)는 4개 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435a, 435b, 435c, 및 435d)을 포함한다. 이러한 예에서, 포획 올리고뉴클레오티드의 포획 서열 (535)은 방출된 핵산 (505)의 폴리A 절편과 하이브리드화를 통해서 방출된 핵산 (505)을 포획한다.
용해되는 세포는 특별히 라이브러리 제조 및 시퀀싱을 위해 미세유체 장치로 이입될 수 있거나 또는 미세유체 장치 내에 존재하여, 임의의 바람직한 기간 동안 유지될 수도 있다.
포획 객체. 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 상기 다수의 각각은 프라이머 결합 서열인 프라이밍 서열; 포획 서열; 및 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드를 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다. 다양한 실시형태에서, 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 및 3'-대부분의 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 프라이밍 서열은 상기 5'-대부분의 뉴클레오티드에 인접할 수 있거나 또는 그를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 포획 서열은 상기 3'-대부분의 뉴클레오티드에 인접할 수 있거나 또는 그를 포함한다. 전형적으로, 바코드 서열은 프라이밍 서열의 3'에 그리고 포획 서열의 5'에 위치될 수 있다.
포획 객체 조성물. 전형적으로, 포획 객체는 유전영동 (DEP)력, 예컨대 음의 DEP 힘을 사용하여 이동하는 것이 용이한 조성물을 갖는다. 예를 들어, 포획 객체는 상자성 재료, 중합성 재료 및/또는 유리를 포함하는 코어를 갖는 비드 (또는 유사한 물체)일 수 있다. 중합성 재료는 폴리스티렌 또는 포획 올리고뉴클레오티드를 연결시키도록 작용화될 수 있는 임의의 다른 플라스틱 재료일 수 있다. 포획 객체의 코어 재료는 다른 배열도 가능하지만, 작용화된 중합체를 포함할 수 있는 포획 올리고뉴클레오티드에 링커를 부착하는데 적합한 재료를 제공하도록 코팅될 수 있다. 포획 객체에 포획 올리고뉴클레오티드를 연결시키는데 사용되는 링커는 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 링커일 수 있다. 링커는 바람직한 물리화학적 속성을 제공할 수 있는, 작용기 예컨대 아미드, 에테르 또는 케토-기가 개재되거나 또는 비개재되거나, 또는 치환되거나 또는 미치환될 수 있는, 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 링커는 링커에 연결된 포획 올리고뉴클레오티드의 말단 근처에 프라이밍 부위로 처리 효소에 의한 접근을 허용하도록 충분한 길이를 가질 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드는 당분야에 공지된 바와 같이, 공유적으로 또는 비공유적으로 링커에 연결될 수 있다. 링커와의 비공유 연결의 비제한적인 예는 바이오틴/스트렙타비딘 쌍을 통한 것일 수 있다.
포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 임의의 미세유체 장치의 격리 펜의 안으로/밖으로 그리고 흐름 영역의 흐름 채널(들)을 통해서 통과하기에 충분히 작다면, 임의의 적합한 크기일 수 있다. 더 나아가서, 포획 객체는, 시퀀싱에 유용한 핵산 라이브러리를 생성하기 위해 충분한 분량으로 핵산이 포획될 수 있도록, 그에 연결되는 충분히 많은 수의 포획 올리고뉴클레오티드를 갖도록 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획 객체는 구형 또는 부분 구형 비드일 수 있고 약 5 미크론을 초과하고 약 40 미크론 미만인 직경을 갖는다. 일부 실시형태에서, 구형 또는 부분 구형 비드는 약 5, 약 7, 약 8, 약 10, 약 12, 약 14, 약 16, 약 18, 약 20, 약 22, 약 24, 또는 약 26 미크론의 직경을 가질 수 있다.
전형적으로, 포획 객체에 부착된 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 가지며, 많은 실시형태에서, 각각의 포획 객체는 고유한 바코드 서열을 갖는다. 각각의 포획 비드 상에 고유한 바코드를 갖는 포획 비드의 사용은 포획 객체가 놓여진 격리 펜의 고유한 식별을 가능하게 한다. 다수의 세포가 격리 펜 내에 놓여지는 실험에서, 종종 하나씩, 다수의 포획 객체가 또한 전달되어 점유된 격리펜에 격리 펜 당 하나의 포획 비드가 놓여진다. 다수의 포획 비드 각각은 고유한 바코드를 가지며, 바코드는 미세유체 장치 내에 존재하는 임의의 다른 포획 비드의 임의의 다른 바코드와 동일하지 않다. 그 결과로, 격리 펜 내의 세포 (또는, 일부 실시형태에서, 세포들)는 이의 시퀀싱 라이브러리에 유입되는 고유한 바코드 식별자를 가지게 될 것이다.
바코드 서열. 바코드 서열은 2종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5종 또는 그 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 이들 각각은 바코드 서열의 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다. 바코드 서열은 바코드 서열의 세트 중 어느 하나의 바코드 서열의 n (예를 들어, 3종 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 바코드 서열의 세트 중 임의의 다른 바코드 서열의 n’(예를 들어, 3종 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 완전하게 중복되지 않을 때 세트의 다른 바코드 서열과 "동일하지 않고"; 부분 중복 (예를 들어, n-1 이하)은, 세트의 각각의 바코드 서열이 최소 1개의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열만큼 세트의 모든 다른 바코드 서열과 상이하다면, 허용가능하다. 특정한 실시형태에서, 바코드 서열은 2종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어진다 (또는 본질적으로 이루어진다). 본 명세서에서 사용시, "카세트형 올리고뉴클레오티드 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트 (예를 들어, 12종 이상의 올리고뉴클레오티드 서열의 세트) 중 하나인 올리고뉴클레오티드 서열이고, 여기서 정의된 세트 내 각각의 올리고뉴클레오티드 서열의 경우에, 상보성 올리고뉴클레오티드 서열 (본 명세서의 다른 곳어 기술된 바와 같이, 하이브리드화 프로브의 일부일 수 있음)은 올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트 내 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 서열과 실질적으로 하이브리드화되지 않는다. 특정한 실시형태에서, 정의된 세트 내 올리고뉴클레오티드 서열의 전부 (또는 실질적으로 전부)는 동일한 길이 (또는 뉴클레오티드의 개수)를 가지게 될 것이다. 예를 들어, 정의된 세트 내 올리고뉴클레오티드 서열은 모두가 10개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 그러나, 약 6개 뉴클레오티드 내지 약 15개 뉴클레오티드 범위의, 다른 길이가 또한 본 발명에서 사용하기 적합하다. 따라서, 예를 들어, 정의된 세트 내 각각의 올리고뉴클레오티드 서열, 정의된 세트 내 실질적으로 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 6개 뉴클레오티드의 길이, 7개 뉴클레오티드의 길이, 8개 뉴클레오티드의 길이, 9개 뉴클레오티드의 길이, 10개 뉴클레오티드의 길이, 11개 뉴클레오티드의 길이, 12개 뉴클레오티드의 길이, 13개 뉴클레오티드의 길이, 14개 뉴클레오티드의 길이, 또는 15개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 대안적으로, 정의된 세트 내 올리고뉴클레오티드 서열의 각각 또는 실질적으로 전부는 6-8개, 7-9개, 8-10개, 9-11개, 10-12개, 11-12개, 12-14개, 또는 13-16개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트 (및, 따라서 바코드 서열)로부터 선택되는 각각의 올리고뉴클레오티드 서열은 정의된 세트 (및, 따라서, 바코드 서열) 내 다른 올리고뉴클레오티드 서열과 "동일하지 않다"고 할 수 있는데 각각의 올리고뉴클레오티드 서열이 (i) 바코드 서열을 시퀀싱하는 단계, 및 (ii) 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 함유하는 프로브 (예를 들어, 하이브리드화 프로브)와 하이브리드화 반응을 수행하는 단계에 의해서 검출될 수 있는, 이의 고유한 뉴클레오티드 서열을 기반으로 바코드 서열에 존재함에 따라 특이적으로 식별될 수 있기 때문이다.
일부 실시형태에서, 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재된 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결된다. 다른 실시형태에서, 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 카세트형 올리고뉴클레오티드 중 하나 및 이의 이웃하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 사이에 직접 연결이 아닌 하나 이상의 연결을 가질 수 있다. 임의의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 사이의 이러한 연결은 전체 합성이기보다는 결찰에 의한 합성을 촉진하기 위해 존재할 수 있다. 그러나, 다양한 실시형태에서, 카세트형 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 프라이밍 서열, 임의의 인덱스 서열, 임의의 고유 분자 식별자 서열 또는 제한없이 Not1 제한효소 부위 서열을 포함하는 임의의 제한효소 부위를 형성하는 다른 올리고뉴클레오티드 서열 중 임의의 다른 것이 개재되지 않는다.
카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 및 그들의 상보성 올리고뉴클레오티드 서열 (이러한 상보성 올리고뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 하이브리드화 프로브 포함)와 함께 사용시, 용어 "실질적으로 하이브리드화되다"는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 이의 상보성 올리고뉴클레오티드 서열 간 하이브리드화의 수준이 한계 수준 이상인 것을 의미하고, 한계 수준은 올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트 내 임의의 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 상보성 올리고뉴클레오티드 간 교차-하이브리드화 수준보다 크고 실험적으로 구별가능하다. 당업자가 쉽게 이해하게 되는 바와 같이, 상보성 올리고뉴클레오티드 서열이 특정한 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 하이브리드화되거나 또는 실질적으로 하이브리드화되지 않는지 여부를 결정하기 위한 한계치는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 길이, 하이브리드화 반응이 일어나는 용액의 성분, 하이브리드화 반응이 일어나는 온도, 및 하이브리드화를 검출하는데 사용되는 표지 (상보성 올리고뉴클레오티드 서열에 부착될 수 있음)의 화학적 속성을 포함하여, 수많은 인자들에 의존적이다. 출원인은 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트에 사용될 수 있는 예시적인 조건을 제공하였지만, 당업자는 적합한 추가의 조건을 쉽게 확인할 수 있다.
3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 각각은 적어도 12종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 세트는 적어도 12, 15, 16, 18, 20, 21, 24, 25, 27, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 39, 40, 42, 44, 45, 48, 50, 51, 52, 54, 55, 56, 57, 60, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 72, 75, 76, 78, 80, 81, 84, 85, 87, 88, 90, 92, 93, 95, 96, 99, 100개, 또는 그 이상과, 임의의 전술한 것들 사이의 임의 수치를 포함하여, 포함할 수 있다.
표 1에 도시된 바와 같은 40개 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 SEQ ID No. 1-40은 검출 동안 임의로 형광단 프로브 하이브리드화를 허용하는, 10-mer 올리고뉴클레오티드를 사용하는, 인-시츄 검출 방법에서 사용을 위해 디자인되었다. 10-mer의 적어도 6개 염기는 검출 방법에서 잘못된 어닐링을 방지하도록 구별된다. 세트는 Comai lab: (http://comailab.genomecenter.ucdavis.edu/index.php/Barcode_generator)의 바코드 생성기 python script를 사용하여 디자인되었고, 표시된 서열에 대한 추가 선택은 28℃ 이상의 Tm (용융 온도)을 갖는 서열에 대한 선택을 기반으로 하였다. Tm 계산은 IDT OligoAnalyzer 3.1(https://www.idtdna.com/calc/analyzer)을 사용하여 수행하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
다양한 실시형태에서, 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 각각은 SEQ ID NO: 1-40 중 어느 하나의 서열을 갖고, 여기서 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드의 어떠한 것도 동일하지 않다. 카세트형 서열은 임의의 순서로 포획 올리고뉴클레오티드 내에 존재할 수 있고; 그 순서는 인-시츄 검출을 변화시키지 않으며 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각의 서열은 시퀀싱 판독치로부터 디콘볼루션 (deconvolute)될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바코드의 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 1-40의 제1 서브-세트로부터 선택되는 서열을 갖고; 바코드의 제2 카세트형 서열은 SEQ ID No. 1-40의 제2 서브-세트로부터 선택되는 서열을 갖고; 바코드의 제3 카세트형 서열은 SEQ ID No. 1-40의 제3 서브-세트로부터 선택되는 서열을 갖고; 바코드의 제4 카세트형 서열은 SEQ ID No. 1-40의 제4 서브-세트로부터 선택되는 서열을 갖는다;
일부 실시형태에서, 바코드의 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1-10 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11-20 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 21-30 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 31-40 중 어느 하나의 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 바코드의 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 1-10 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 11-20 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 21-30 중 어느 하나의 서열을 갖고; 바코드의 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO: 31-40 중 어느 하나의 서열을 가질 때, 제1, 제2, 제3 및 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 각각은 바코드 서열의 5'에서 3'의 순서로 포획 올리고뉴클레오티드의 길이를 따라서 위치되며, 다시 말해서, 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드는 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 5'에 오게될 것이고, 이어서 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드의 5'에 위치되고, 그 다음으로, 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드는 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드의 5'에 위치될 것이다. 이것은 도 6에 개략적으로 도시되어 있으며, 여기서 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 G1-G10 중 하나는 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 위치에 위치되고; Y1-Y10 서열 중 하나는 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 위치에 놓이며, R1-R10 서열 중 하나는 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 위치에 놓이고, B1-B10 서열 중 하나는 바코드의 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 위치에 놓인다. 그러나, 그 순서는 중요하지 않고 존재 또는 부재를 결정하는 인-시츄 검출 및 시퀀싱 판독은 존재 순서에 의존하지 않는다.
포획 서열. 포획 객체는 핵산을 포획하도록 구성된 포획 서열을 포함한다. 포획 서열은 약 6 내지 약 50개 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 포획 올리고뉴클레오티드 서열은 관심 세포로부터 방출된 핵산과의 하이브리드화에 의해서 핵산을 포획한다. 비제한적인 일례는 그들의 3'말단에 폴리A를 갖는 RNA 단편을 포획하여 하이브리드화될 수 있는 폴리T 서열 (약 30 내지 약 40개 뉴클레오티드)을 포함한다. 폴리T 서열은 이의 3'말단에 2개 뉴클레오티드 VN을 더 함유할 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드의 다른 예는 상보성 핵산에 하이브리드화되어서 포획하도록 혼합물에 사용될 수 있는 무작위 헥사머 ("랜더머")를 포함한다. 대안적으로, 유전자 특이적 서열과의 상보성을 핵산, 예컨대 B 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 서열의 표적화 포획에 사용할 수 있다.
다른 실시형태에서, 포획 올리고뉴클레오티드 서열은 효율적으로 적절하게 태그된 방출 핵산을 "포획"하고, 그리하여 시퀀싱 어댑터, 및 인덱스를 첨가하기 위해서 리콤비나제/중합효소 유도되는 가닥 확장을 통해서 인식가능한 말단 서열을 안내함으로써, 세포로부터 방출된 핵산을 포획하는데 사용될 수 있다. 이러한 유형의 포획 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 당분야에 공지된 바와 같이 모자이크 말단 (ME) 서열 또는 다른 태그먼트화 삽입 서열을 포함한다. 모자이크 말단 삽입 서열은 트랜스포존에 의해 쉽게 인식되는 짧은 올리고뉴클레오티드이고 핵산 단편에 프라이밍/태그화를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 올리고뉴클레오티드 서열은 약 8개 뉴클레오티드 내지 약 50개 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, ME 더해진 추가 삽입 서열은 약 33개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 상업적으로 입수할 수 있는 태그먼트화 키트, 예컨대 Nextera DNA Library Prep Kit, Illumina, Cat. # 15028212 등을 사용하여 삽입될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 포획 서열에 의해 수행된 포획은 하이브리드화 사건이 아니라, 태그먼트화된 DNA 단편 상으로, 포획 올리고뉴클레오티드, 태그화 DNA, 및 프라이밍 서열(들)에 대한 리콤비나제/중합효소 기구, 바코드 서열 및 다른 인덱스, 어댑터, 또는 기능성 부위 예컨데 제한없이 Not1 제한효소 부위 (이하 기술됨) 간 상호작용의 안내 및 유도이다. 안내되고 유도된 상호작용은 방출된 핵산을 포획하기 위해 하이브리드화 상호작용을 사용하여 상기 기술된 cDNA 생성물과 균등한 생성물을 제공한다. 양쪽 경우에서, 증가된 핵산 단편은 방출된 핵산으로부터 제공되고, 이제 이것은 증폭, 후속 시퀀싱 라이브러리 적합화, 및 시퀀싱된 바코드 및 샘플 핵산 판독치를 수득하는 능력을 가능하게 하는, 적어도 시퀀싱 어댑터(들) 및 바코드를 포함한다.
프라이밍 서열. 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이밍 서열을 갖고, 프라이밍 서열은 포획 올리고뉴클레오티드(들)의 5'-대부분의 뉴클레오티드에 인접할 수 있거나 또는 그것을 포함한다. 프라이밍 서열은 포괄적이거나 또는 서열-특이적 프라이미 서열일 수 있다. 프라이밍 서열은 결합 시 역전사효소 또는 전사효소를 프라이밍하는 프라이머에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포괄형 프라이밍 서열은 P7 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3' (SEQ ID. NO 107)) 또는 P5 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3' (SEQ ID NO. 108)) 프라이머에 결합할 수 있다.
다른 실시형태에 따라서, 포괄형 프라이밍 서열은 하기 중 하나의 서열을 갖는 프라이머에 결합할 수 있다:
Figure pct00003
추가의 프라이밍 및/또는 어댑터 서열. 포획 올리고뉴클레오티드(들)는 임의로 프라이머 확장을 위한 랜딩 부위 또는 대량 동시 시퀀싱 어레이 또는 플로우 셀 내 상보성 하이브리드화 앵커 부위에 고정을 위한 부위를 제공하는, 하나 이상의 추가적인 프라이밍/어댑터 서열을 가질 수 있다.
선택적 올리고뉴클레오티드 서열. 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 임의로 고유한 분자 식별자 (UMI) 서열을 더 포함할 수 있다. 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 증폭된 서열의 수와 대조적으로 고유한 포획의 식별을 가능하게 하는, 포획 객체의 다른 포획 올리고뉴클레오티드와 상이한 UMI를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, UMI는 프라이밍 서열의 3'및 포획 서열의 5'에 위치될 수 있다. UMI 서열은 약 5 내지 약 20개 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, UMI 서열의 올리고뉴클레오티드 서열은 약 10개 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 또한 Not1 제한효소 부위 서열 (GCGGCCGC, SEQ ID NO. 160)을 포함할 수 있다. Not1 제한효소 부위 서열은 포획 올리고뉴클레오티드의 포획 서열의 5'에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, Not1 제한효소 서열은 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열의 3'에 위치될 수 있다.
다른 구체예에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 또한 풀 인덱스 서열과 같은 추가의 인덱스를 포함할 수 있다. 인덱스 서열은 4 내지 10개 올리고뉴클레오티드의 서열로서, 한 실험에 속하는 포획 객체의 세트를 고유하게 식별하여, 시퀀싱 운영 비용 및 시간을 절감하도록 몇몇 상이한 실험에 의한 시퀀싱 라이브러리를 조합하는 복합 시퀀싱을 가능하게 하는 한편, 여전히 시퀀싱 데이타의 디컨볼루션, 및 올바른 실험 및 그와 연관된 포획 객체와의 역으로의 상호관련을 가능하게 한다.
일부 예시적이지만, 제한적이지 않은 포획 객체가 표 2에 예시되어 있으며, 여기서는 명확함을 위해서, 오직 하나의 포획 올리고뉴클레오티드가 표시되어 있다. 프라이미 서열, 바코드, UMI 및 RNA 포획용 포획 서열을 포함하는 포획 객체는 SEQ ID No. 97, SEQ ID No. 98, SEQ ID No. 99, 또는 SEQ ID No. 100을 갖는 포획 객체일 수 있다. 프라이밍 서열, 바코드, UMI, Not1 서열, 및 RNA 포획용 포획 서열을 포함하는 포획 객체는 SEQ ID NO. 101 또는 SEQ ID NO. 102를 갖는 포획 객체일 수 있다.
Figure pct00004
다수의 포획 객체. 다수의 포획 객체가 복합 핵산 포획에 사용을 위해 제공된다. 다수 중 각각의 포획 객체는 본 명세서에 기술된 임의의 포획 객체에 따른 포획 객체로서, 여기서 다수 중 각각의 포획 객체의 경우에, 그 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 갖고, 다수 중 각각의 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열은 다수 중 모든 다른 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열과 상이하다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체는 적어도 256개 포획 객체를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 다수의 포획 객체는 적어도 10,000개 포획 객체를 포함할 수 있다. 다수의 포획 객체의 구성을 도시하는 개략도가 도 6에 도시되어 있다. 포획 객체 (630)는 포획 올리고뉴클레오티드 (550)가 링커 (515)를 통해서 부착되는 비드 (510)를 갖는다. 링커 (515)는 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 5'말단에 부착되고, 특히 프라이밍 서열 (520)의 5'에 부착된다. 링커 (515) 및 프라이밍 서열 (520) (여기서 33 bp 길이로 도시됨)은 이 예의 모든 포획 객체의 모든 포획 올리고뉴클레오티드에 대해 공통이지만, 다른 실시형태에서, 링커 및/또는 프라이밍 서열은 포획 객체 상의 상이한 포획 올리고뉴클레오티드에 대해서 상이할 수 있거나 또는 대안적으로 링커 및/또는 프라이밍 서열은 다수 중 상이한 포획 객체에 대해서 상이할 수 있다. 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 포획 서열 (535)은 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 3'말단에 또는 근부에 위치된다. 이러한 비제한적인 예에서, 포획 서열 (535)은 포괄적으로 방출된 RNA를 포획하는 폴리T-VN 서열로서 표시된다. 일부 실시형태에서, 포획 서열 (535)은 다수의 포획 서열의 모든 포획 객체 (630)의 모든 포획 올리고뉴클레오티드 (550)에 공통이다. 그러나, 다른 다수의 포획 객체에서, 포획 객체 (630)의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드 상의 포획 서열 (535)는 반드시 동일할 필요는 없다. 이러한 예에서, 선택적인 고유 분자 식별자 (UMI) (530)가 존재하고, 포획 서열 (535)의 5'이지만 프라이밍 서열 (520)의 3'에 위치된다. 이러한 특정 예에서, UMI (530)은 바코드 서열 (525)에 대해 3'에서의 포획 올리고뉴클레오티드에 따라 위치된다. 그러나, 다른 실시형태에서, UMI (530)은 바코드의 5'에 위치될 수 있다. 그러나, UMI (530)는 증폭된 핵산 생성물 내에 도입시키기 위해서, 프라이밍 서열 (520)에 대해 3'에 위치된다. 이러한 예에서, UMI (530)는 10 bp 길이이다. 여기서 UMI (530)는 NNNNNNNNNN (SEQ. ID NO 84)의 서열을 갖는 것으로 표시된다. 일반적으로, UMI (530)는 임의의 뉴클레오티드의 무작위 조합으로 구성될 수 있지만, 단 바코드 (525)의 임의의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (435a, 435b, 435c, 435d)과 동일하지 않거나 또는 프라이밍 서열 (520)과 동일하지 않는 것을 조건으로 한다. 많은 실시형태에서, UMI는 이러한 경우에 표시된 바와 같이, 포획 서열 (535)와 중복되기도 하는, 10개 T의 서열을 포함하지 않도록 디자인된다. UMI (530)는 각각의 포획 객체 (630)의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드 (550)에 대해 고유하다. 일부 실시형태에서, 포획 객체 (630)의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 고유한 UMI (530)는 상이한 포획 객체 (630)의 바코드 (525)가 시퀀싱 판독치의 디콘볼루션을 허용할 수 있으므로, 다수의 상이한 포획 객체 (630)의 포획 올리고뉴클레오티드 (550) 내에서 사용될 수 있다.
포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 (525)는 프라이밍 서열에 대해 3'에 있고, 각각의 10 bp 길이인 4개 카세트형 서열 (435a, 435b, 435c, 및 435d)을 함유한다. 단일 포획 객체 (630)의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 (550)의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 (525)를 갖고, 다수의 포획 객체에 대한 바코드 (525)는 다수 중 각각의 포획 객체 (630)와 상이하다. 포획 객체 각각에 대한 바코드 (525)의 다양성은 하기에 기술하는 바와 같이 올리고뉴클레오티드의 정의된 세트로부터 카세트형 올리고뉴클레오티드에 대해 선택하여 수득될 수 있다. 이러한 예에서, 10,000개의 상이한 바코드는 각각이 10개의 상이한 가능한 선택안을 함유하는, 올리고뉴클레오티드의 4개의 정의된 세트 각각 중 하나를 선택하여 만들 수 있다.
카세트형 올리고뉴클레오티드 서열. 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드 내에서 사용을 위해 제공되고 SEQ ID No. 1 내지 40 중 어느 하나의 올리고뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
바코드 서열. 바코드 서열은 본 명세서에 기술된 방법 및 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드 내에서 사용을 위해 제공되고, 여기서 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 각각은 SEQ ID NO: 1-40 중 어느 하나의 서열을 갖고, 바코드 서열의 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다. 바코드 서열은 둘 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이들 각각은 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않는다. 특정한 실시형태에서, 바코드 서열은 2종 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열로 이루어진다 (또는 본질적으로 이루어진다). 바코드 서열의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 올리고뉴클레오티드 서열의 정의된 세트 (예를 들어, 12개 이상의 올리고뉴클레오티드 서열의 세트)로부터의 하나일 수 있고, 여기서 정의된 세트 내 각각의 올리고뉴클레오티드 서열의 경우에, 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 정의된 세트 내 임의의 나머지 올리고뉴클레오티드 서열과 실질적으로 하이브리드화되지 않는다. 특정한 실시형태에서, 바코드 서열 내 둘 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 6 내지 15개 뉴클레오티드 (예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드의 길이)를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 둘 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 6 내지 15개 뉴클레오티드 (예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 뉴클레오티드의 길이)로 이루어질 수 있다 (본질적으로 이루어질 수 있다). 여전히 다른 실시형태에서, 바코드 서열 내 둘 이상의 카세트형 서열의 각각은 6-8개, 7-9개, 8-10개, 9-11개, 10-12개, 11-13개, 12-14개 또는 13-15개 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 그로 이루어질 수 있거나, 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다. 특정한 실시형태에서, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1-40로 정의된 세트 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드는 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 바코드의 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재된 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결된다. 다른 실시형태에서, 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 중 하나 이상은 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 사이에 개재되는 1개, 2개 또는 3개 뉴클레오티드를 사용하여 함께 연결될 수 있다. 이것은 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 결찰 화학을 사용하여 연결될 때 유용하다. 일부 실시형태에서, 포획 올리고뉴클레오티드 내에 다른 기능을 갖는 다른 뉴클레오티드 서열은 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 연결을 방해하지 않는다.
바코드 서열의 세트. 적어도 64개의 동일하지 않은 바코드 서열을 포함하는, 바코드 서열의 세트가 제공되고, 세트의 각각의 바코드 서열은 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 바코드에 따른 구조를 갖는다. 본 명세서에서 사용시, 바코드 서열은 바코드 서열의 세트 중 어느 하나의 바코드 서열의 n (예를 들어, 3종 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 바코드 서열의 세트 중 임의의 다른 바코드 서열의 n’(예를 들어, 3종 이상)의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 완전하게 중복되지 않을 때 세트의 다른 바코드 서열과 "동일하지 않고"; 부분 중복 (예를 들어, n-1 이하)은, 세트의 각각의 바코드 서열이 최소 1개의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열만큼 세트의 모든 다른 바코드 서열과 상이하다면, 허용가능하다. 일부 실시형태에서, 바코드 서열의 세트는 64개, 81개, 100개, 125개, 216개, 256개, 343개, 512개, 625개, 729개, 1000개, 1296개, 2401개, 4096개, 6561개, 또는 10,000개 바코드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다.
하이브리드화 프로브. 또한 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 하이브리드화 프로브; 및 검출가능한 표지가 개시된다. 검출가능한 표지는 예를 들어 형광발광성 표지, 예컨대 제한없이 플루오레세인, 시아닌, 로다민, 페닐 인돌, 쿠마린, 또는 아크리딘 염료일 수 있다. 일부 비제한적인 예는 Alexa Fluor 염료 예컨대 Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488; 시아닌 염료 예컨대 Cy® 5 또는 Cy® 7, 또는 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 형광성 표지를 포함한다. 각각의 염료의 형광성 신호가 검출가능하게 구별가능하다면, 바코드의 검출을 위해서 미세유체 환경으로 흘러가는 하이브리드화 프로브 상에 존재하도록 임의 세트의 구별가능한 형광단이 선택될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지는 조율가능할 수 있고 반도체 재료를 포함할 수 있는, 발광제 예컨대 루시퍼라제 리포터, 란탄계 태그 또는 무기 인광체, 퀀텀 도트일 수 있다. 형광단 분자와 함께 소광제 분자를 포함할 수 있는 FRET 표지와 같은 다른 유형의 검출가능한 표지를 도입시킬 수 있다. FRET 표지는 다크 소광제 예컨대 Black Hole Quencher® (Biosearch); Iowa Black™ 또는 답실을 포함할 수 있다. FRET 표지는 임의의 TaqMan® 프로브, 헤어핀 프로브, Scorpion® 프로브, 분자 비콘 프로브 등일 수 있다.
하이브리드화 조건의 추가의 상세 사항은 하기에 기술되며, 당업자는 다양한 바코드 및 그들의 하이브리드화 프로브 쌍에 대한 결합 특이성을 얻는데 적합한 이러한 조건의 다른 변동을 결정할 수 있다.
하이브리드화 프로브. SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열 (표 1 참조); 및 검출가능한 표지를 포함하는 하이브리드화 프로브를 제공한다. 검출가능한 표지는 로다민, 시아닌 또는 플루오레세인 형광성 염료 표지일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 하이브리드화 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 41-80 중 어느 하나의 한 서열로 본질적으로 이루어지고, 하이브리드화 프로브의 일부를 형성하는 다른 뉴클레오티드는 갖지 않는다.
하이브리드화 시약. 다수의 하이브리드화 프로브를 포함하는, 하이브리드화 시약이 제공되고, 여기서 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하이브리드화 프로브이고, 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 (i) 다수의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, (ii) 다수의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 검출가능한 표지와 스펙트럼이 구별가능한 검출가능한 표지를 포함한다. 또한 다수 (예를 들어, 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상)의 하이브리드화 프로브를 포함하는 시약을 개시한다. 하이브리드화 프로브는 본 명세서에 개시된 임의의 하이브리드화 프로브일 수 있다. 시약은 액체, 예컨대 용액일 수 있다. 대안적으로, 시약은 고체, 예컨대 동결건조 분말일 수 있다. 고체로서 제공될 때, 적절한 물 (또는 적합한 용액)의 첨가가 미세유체 장치로 유입에 적합한 액체 시약을 생성시키기 위해 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 하이브리드화 프로브는 2개 내지 4개의 하이브리드화 프로브로 이루어진다. 다수의 하이브리드화 프로브의 일부 실시형태에서, 다수 중 제1 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제1 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 제1 검출가능한 표지를 포함하고; 다수 중 제2 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제2 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 제1 검출가능한 표지와 스펙트럼이 구별되는 제2 검출가능한 표지를 포함하고, SEQ ID NO: 41-80의 제1 및 제2 서브세트는 비중복 서브세트이다.
제1 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)를 포함하는 서열, 또는 이의 서열의 서브세트를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제1 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 서열, 또는 이의 서열의 서브세트를 포함할 수 있다. 제2 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)를 포함하는 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택된 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제2 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택된 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 제3 하이브리드화 프로브 (존재하면)는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)를 포함하는 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1 및 제2 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1 및 제2 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택된 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제3 하이브리드화 프로브 (존재하면)는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1 및 제2 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1 및 제2 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택되는 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 제4 하이브리드화 프로브 (존재하면)는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)를 포함하는 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1, 제2 및 제3 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1, 제2, 및 제3 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택된 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 제4 하이브리드화 프로브 (존재하면)는 SEQ ID NO: 41-80에 기재된 서열 중 하나의 전부 또는 일부 (예를 들어, 8 내지 10개 뉴클레오티드)로 이루어진 (또는 본질적으로 이루어진) 서열, 또는 이의 서열의 서브세트 (예를 들어, 제1, 제2 및 제3 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열을 포함하지 않는 서브세트, 또는 제1, 제2, 및 제3 하이브리드화 프로브에 존재하는 서열이 선택된 서브세트와 중복되지 않는 서브세트)를 포함할 수 있다. 당업자에게 분명한 바와 같이, 시약은 제1, 제2, 제3, 및 제4 하이브리드화 프로브와 유사한 속성을 가질 수 있는, 제5, 제6 등의 하이브리드화 프로브를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수 중 제3 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제3 서브세트로부터 선택된 서열, 및 제1 및 제2 검출가능한 표지 각각과 스펙트럼이 구별가능한 제3 검출가능한 표지를 포함할 수 있고, 여기서 SEQ ID NO: 41-80의 제1, 제2 및 제3 서브세트는 비중복 서브세트이다.
역시 다른 실시형태에서, 시약은 다수 중 제4 하이브리드화 프로브를 더 포함할 수 있고, 제4 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제4 서브세트로부터 선택된 서열, 및 제1, 제2 및 제3 검출가능한 표지 각각과 스펙트럼이 구별가능한 제4 검출가능한 표지를 포함할 수 있고, SEQ ID NO: 41-80의 제1, 제2, 제3, 및 제4는 비중복 서브세트이다.
하이브리드화 시약의 다양한 실시형태에서, SEQ ID NO: 41-80의 각각의 서브세트는 적어도 10개 서열을 포함할 수 있다. 하이브리드화 시약의 다양한 실시형태에서, 제1 서브세트는 SEQ ID NO: 41-50을 함유하고, 제2 서브세트는 SEQ ID NO: 51-60을 함유하고, 제3 서브세트는 SEQ ID NO: 61-70을 함유하고, 제4 서브세트는 SEQ ID NO: 71-80을 함유한다.
키트. 포획 객체의 바코드의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 키트를 제공하고, 여기서 키트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다수의 시약을 포함하고, 각각의 시약의 다수의 하이브리드화 프로브는 다수 내 모든 다른 시약의 하이브리드화 프로브의 세트와 중복되지 않는 세트를 형성한다. 일부 실시형태에서, 키트는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종의 시약을 포함할 수 있다.
포획 객체(들)의 인-시츄 식별을 위한 방법. 또한 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법이 제공되고, 이 방법은
미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 하나 이상의 격리 펜의 각각에 하나 이상의 포획 객체 중 단일 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 가지고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이밍 서열; 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
미세유체 장치의 인클로저 내 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제1 세트를 포함하는 제1 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 여기서 흐름 영역은 하나 이상의 격리 펜의 각각과 유체적으로 접속되고, 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는 임의의 하나 이상의 포획 객체의 임의의 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 바코드 서열이 포함된 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열; 및 스펙트럼이 구별가능한 검출가능한 표지의 세트로부터 선택되는 검출가능한 표지를 갖고, 여기서 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 제1 세트의 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고; 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 검출가능한 표지는 하이브리드화 프로브의 제1 세트의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 검출가능한 표지와 상이한 것인 단계;
제1 세트의 하이브리드화 프로브를 임의의 하나 이상의 포획 객체의 임의의 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 바코드 서열 내 상응하는 카세트형 올리고 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
하이브리드화 프로브의 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 검출가능한 신호를 검출하는 단계; 및
하나 이상의 격리펜 중 하나 내에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, (i) 미세유체 장치의 인클로저 내에서 격리 펜의 위치, 및 (ii) 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상응하는 형광성 신호의 회합 또는 비회합을 포함하는 보고서를 생성시키는 단계로서, 여기서 회합 및 비회합의 보고서는 포획 객체를 격리 펜과 연결시키는 바코드로 구성되는 것인 단계를 포함한다.
이 방법에서 사용시, 하나 이상의 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 임의의 포획 객체의 각각일 수 있다. 일반적으로, 바코드 서열의 전부는 동일한 수의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 가지게 될 것이고, 특정한 포획 객체가 포함되는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 가지게 될 것이다. 상기에 기술된 바와 같이, 각각의 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 동일하지 않은 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 선택된다. 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트는 예를 들어, 12 내지 100개 (또는 그 이상)의 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트는 2종 이상 (예를 들어, 2 내지 5종)의 스펙트럼이 구별가능한 표지를 포함할 수 있는, 스펙트럼이 구별가능한 표지의 세트 내 스펙트럼이 구별가능한 표지의 개수를 초과하는 많은 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
제1 (또는 후속) 세트 내 하이브리드화 프로브의 개수는 각각의 바코드 서열 내 카세트형 올리고뉴클레오티드의 개수와 동일할 수 있다. 그러나, 이들 개수는 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 제1 (또는 임의의 후속) 세트 내 하이브리드화 프로브의 개수는 각각의 바코드 서열 내 카세트형 올리고뉴클레오티드의 개수를 초과할 수 있다.
각각의 하이브리드화 프로브 (또는 표지 클래스)를 검출하는 단계는 하이브리드화 프로브의 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브 (또는 표지)의 구별가능한 스펙트럼 특징을 식별하는 단계를 포함한다. 더 나아가서, 소정 하이브리드화 프로브를 검출하는 단계는 일반적으로 구별되는 스펙트럼 특징(들)을 검출하는데 사용되는 시스템 (예를 들어, 광학 트레인)과 연관된 배경치 또는 한계치 수준을 초과하는 구별되는 스펙트럼 특징(들)의 수준의 검출을 요구한다. 이러한 식별 이후에, 임의의 검출된 표지는 하이브리드화 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 존재와 상호관련시킬 수 있다. 검출가능한 표지는 예를 들어 형광발광성 표지, 예컨대 제한없이 플루오레세인, 시아닌, 로다민, 페닐 인돌, 쿠마린, 또는 아크리딘 염료일 수 있다. 일부 비제한적인 예는 Alexa Fluor 염료 예컨대 Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 405, Alexa Fluor® 488; 시아닌 염료 예컨대 Cy® 5 또는 Cy® 7, 또는 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 형광성 표지를 포함한다. 각각의 염료의 형광성 신호가 검출가능하게 구별가능하다면, 바코드의 검출을 위해서 미세유체 환경으로 흘러가는 하이브리드화 프로브 상에 존재하도록 임의 세트의 구별가능한 형광단이 선택될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지는 조율가능할 수 있고 반도체 재료를 포함할 수 있는, 발광제 예컨대 루시퍼라제 리포터, 란탄계 태그 또는 무기 인광체, 퀀텀 도트일 수 있다. 형광단 분자와 함께 소광제 분자를 포함할 수 있는 FRET 표지와 같은 다른 유형의 검출가능한 표지를 도입시킬 수 있다. FRET 표지는 다크 소광제 예컨대 Black Hole Quencher® (Biosearch); Iowa Black™ 또는 답실을 포함할 수 있다. FRET 표지는 임의의 TaqMan® 프로브, 헤어핀 프로브, Scorpion® 프로브, 분자 비콘 프로브 등일 수 있다.
검출 단계 및/또는 보고서를 생성시키는 단계는 예를 들어 제어기를 통해서, 자동화될 수 있다.
인-시츄 식별 방법은 미세유체 장치의 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제n 세트를 포함하는 제n 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 여기서 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는 임의의 하나 이상의 포획 객체의 임의의 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 바코드 서열이 포함하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열; 및 스펙트럼으로 구별가능한 검출가능한 표지의 세트로부터 선택되는 검출가능한 표지를 포함할 수 있고, 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 미세유체 장치의 흐름 영역으로 흐르는 하이브리드화 프로브의 임의의 다른 세트 및 제n 세트의 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 검출가능한 표지는 하이브리드화 프로브의 제n 세트의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 검출가능한 표지와 상이한 것인 단계;
제n 세트의 하이브리드화 프로브를 임의의 하나 이상의 포획 객체의 임의의 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 바코드 서열 중 상응하는 카세트형 올리고 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
하이브리드화 프로브의 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 검출가능한 신호를 검출하는 단계; 및
하나 이상의 격리 펜 중 하나 내에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상응하는 검출가능한 신호의 회합 또는 비회합을 보고서에 보충하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 n은 {2,..., m}의 값을 갖는 앙의 정수의 세트이고, m은 2 이상의 값을 갖는 양의 정수이며, 전술한 제n 시약을 흘려주는 단계, 하이브리드화 프로브의 제n 세트를 하이브리드화시키는 단계, 상응하는 검출가능한 신호를 검출하는 단계, 및 보고서를 보충하는 단계는 양의 정수의 세트 {2,...,m}에서 각각의 n 값에 대해 반복된다.
다양한 실시형태에서, m은 3 이상이고 20 이하 (예를 들어, 5 이상이고 15 이하)인 값을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, m은 8 이상이고 12 이하 (예를 들어, 10)인 값을 가질 수 있다.
다양한 실시형태에서, 흐름 영역으로 제1 시약 용액 및/또는 제n 시약 용액을 흘려주는 단계는 제1 시약 용액 및/또는 제n 시약 용액이 하나 이상의 격리 펜으로 확산을 통해서 평형화될 수 있게 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
임의의 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계는 미세유체 장치의 흐름 영역을 통해서 하이브리드화 프로브를 갖지 않는 세정 용액을 흘려주는 단계; 및 하나 이상의 격리 펜으로 세정 용액을 확산을 통해서 평형화시켜주어서, 제1 세트 또는 임의의 제n 세트의 비하이브리드화된 하이브리드화 프로브가 하나 이상의 격리 펜 밖으로 확산될 수 있게 하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세정 용액을 흘려주는 단계는 형광성 신호를 검출하기 전에 수행될 수 있다.
인-시츄 검출 방법의 일부 실시형태에서, 각각의 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 바코드 서열은 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이브리드화 프로브의 제1 세트 및 하이브리드화 프로브의 제n 세트 각각은 3종의 하이브리드화 프로브를 포함할 수 있다.
인-시츄 검출 방법의 다양한 실시형태에서, 각각의 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하이브리드화 프로브의 제1 세트 및 하이브리드화 프로브의 제n 세트의 각각은 4종의 하이브리드화 프로브를 포함한다.
하나 이상의 포획 객체의 각각을 배치시키는 단계는 미세유체 장치 내 하나 이상의 격리 펜의 고립 영역 내에 하나 이상의 포획 객체의 각각을 배치시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 미세유체 장치의 하나 이상의 격리 펜 내에 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적 세포 중 각각의 하나는 하나 이상의 격리 펜의 상이한 하나에 배치될 수 있다. 하나 이상의 생물학적 세포는 미세유체 장치의 하나 이상의 격리 펜의 고립 영역 내에 배치될 수 있다. 방법의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적 세포의 적어도 하나는 그 안에 배치된 하나 이상의 포획 객체 중 하나를 갖는 격리 펜 내에 배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적 세포는 클론 개체군 유래의 다수의 생물학적 세포일 수 있다. 방법의 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 하나 이상의 포획 객체를 배치시키는 단계 이전에 수행될 수 있다.
인-시츄 검출 방법의 다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 하나 이상의 격리 펜에 하나 이상의 포획 객체를 배치시키는 단계는 유전영동 (DEP)력을 사용하여 수행될 수 있다. 인-시츄 검출 방법의 다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 하나 이상의 격리 펜 내에 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 유전영동 (DEP)력을 사용하여 수행될 수 있다. 미세유체 장치는 본 명세서에 개시된 임의의 미세유체 장치일 수 있다. 예를 들어, 미세유체 장치는 적어도 하나의 코팅된 표면 (예를 들어, 공유 결합된 표면)을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 코팅된 표면은 친수성 또는 음으로 하전된 코팅된 표면을 포함할 수 있다.
인-시츄 식별 방법의 다양한 실시형태에서, 각각의 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나는 포획 서열에 의해 그에 포획되는 표적 핵산을 더 포함할 수 있다.
미세유체 장치 내에서 포획 객체(들)의 인-시츄 식별 방법을 더욱 잘 이해하기 위해 도 7A로 돌아가면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 검출가능한 표지를 포함하는, 하이브리드화 프로브 (440a)의 흐름에 노출된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드를 포함하는 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는, 포획 객체 (430)의 개략도를 도시한다. 포획 올리고뉴클레오티드의 이의 표적 카세트형 올리고뉴클레오티드와 프로브 (440a)의 회합 시, 하이브리드화된 프로브: 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 포획 올리고뉴클레오티드 길이 (755) 상에서 형성된다. 이것은 포획 객체 (730)의 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부분을 따라서 다수의 하이브리드화된 프로브: 카세트형 올리고뉴클레오티드 쌍을 갖는 포획 객체를 발생시킨다. 도 7B는 포획 객체 (이 사진에는 도시되지 않음)가 격리 펜 내에 배치된 채널과 연결된 격리 펜을 구비한 미세유체 장치 내 미세유체 채널의 사진을 도시한다. 추가적으로, 가시적인 모든 3개의 채널 길이에 개방된 펜 내에 포획 객체가 존재하지만, 최저부 채널 길이에서 격리 펜 내에 존재하는 포획 객체만이 프로브의 표적 카세트형 올리고뉴클레오티드 (440a)를 포함하는 바코드를 가졌다. 최상부 채널 또는 중간 채널에 개방된 격리 펜 내 포획 객체는, 프로브 (440a)에 대한 하이브리드화 표적인 그들의 개별적인 포획 올리고뉴클레오티드 상에 카세트형 올리고뉴클레오티드를 갖지 않았다. 사진은 하이브리드화 프로브 (440a)를 포함하는 시약 흐름이 흐름 채널을 통해서 흐르고 격리 펜으로 확산될 때의 시점을 도시한다. 프로브의 검출가능한 표지의 형광도는 흐름 채널 전반 및 격리 펜 내에서 가시화되었다. 약 20분 동안 시약을 흐르게 한 후에, 하이브리드화 프로브 (440a)를 갖지 않는 세정 흐름이 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행되었다. 도 7B는 세정 흐름이 완료된 후에, 프로브 (440a)의 검출가능한 표지를 여기시키는데 적절한 형광 여기 하의 동일한 뷰를 도시한다. 관찰된 것은 하이브리드화된 하이브리드화 프로브 (440a)로부터의 검출가능한 신호를 제공하는, 최저부 채널과 연결된 격리 펜 내 포획 객체 (730)였다. 또한 관찰된 것은 최상부 및 중간 채널 길이에 연결된 격리 펜 내에서, 포획 객체의 다른 부류가 형광 발광 하에서 볼 수 없었던 것이었다. 이것은 식별을 수행하기 위해서 하이브리드화 프로브를 사용하는 오직 미세유체 장치 내 표적 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 특이적이고 선택적인 식별을 예시한다.
도 8A-8C는 이 예에서, 4종의 상이한 하이브리드화 프로브를 갖는 복합 및 다수 흐름의 시약이 미세유체 장치의 격리 펜 내 각각의 포획 객체의 각각의 바코드를 식별하는데 어떻게 사용되는지를 도시한다. 도 8A는 펜 #84, 펜 #12, 펜 #126, 및 펜 #260으로 예시되고, 각각의 펜은 그 안에 포획 객체가 존재하는 것으로 예시된 4개 격리 펜의 각각에 대한 바코드의 검출에 관한 개략도를 도시한다. 각각의 포획 객체는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 고유한 바코드를 갖는다. 펜 #84의 포획 객체는 다음의 서열을 갖는 바코드를 갖는다: GGGGGCCCCCTTTTTTTTTTCCGGCCGGCCAAAAATTTTT (SEQ ID NO. 89). 펜 #12의 포획 객체는 다음의 서열을 갖는 바코드를 갖는다: AAAAAAAAAATTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCC (SEQ ID NO. 90). 펜 #126의 포획 객체는 다음의 서열을 갖는 바코드를 갖는다: GGGGGCCCCCTTAATTAATTCCGGCCGGCCAAAAATTTTT (SEQ ID 91). 펜 #260의 포획 객체는 다음의 서열을 갖는 바코드를 갖는다: GGGGGCCCCCTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGCCCCCCCCCC (SEQ ID No. 92).
제1 시약 흐름 (820)은 다음과 같은 서열 및 검출가능한 표지를 갖는 4종의 하이브리드화 프로브를 포함한다: 4종의 구별가능한 표지의 세트로부터 선택되는 제1 검출가능한 표지 (패턴 1을 갖는 원형으로 표시됨)를 갖는 TTTTTTTTTT (SEQ ID 85)의 서열 (이 예시를 위해서, 서열의 선택은 오직 설명을 위한 것이고, 폴리T의 포획 서열과 조합하여 사용되는 프로브 서열을 대표하는 것이 아님)을 갖는 제1 프로브 (440a-1); 구별가능한 표지의 세트로부터 선택되는 제2 검출가능한 표지 (패턴 2를 갖는 원형으로 표시됨)를 갖는, AAAAAAAAAA의 서열 (SEQ ID NO. 86)을 갖는 제2 프로브 (440b-1); CCCCCCCCCC의 서열 (SEQ ID No. 87) 및 구별가능한 표지의 세트로부터 선택되는 제3 검출가능한 표지 (패턴 3을 갖는 원형으로 표시됨)를 갖는 제3 프로브 (440c-1); 및 GGGGGGGGGG의 서열 (SEQ ID NO. 88), 및 구별가능한 표지의 세트로부터 선택되는 제4 검출가능한 표지 (패턴 4를 갖는 원형으로 표시됨)를 갖는 제4 프로브 (440d-1).
제1 흐름 (810)이 격리 펜으로 확산될 수 있게 하고, 프로브가 임의의 바코드에 존재하는 임의의 표적 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 하이브리드화된 후에, 프로브-무함유 매질의 플러싱을 수행하여 하이브리드화된 프로브는 제 위치에 유지되면서, 하이브리드화되지 않은 프로브는 제거된다. 이것은 실험 섹션에서 하기에 기술된 바와 같이, DPBS 또는 Duplex 완충제의 사용과 같은, 그들 표적으로부터 하이브리드화된 프로브의 쌍을 해리시키지 않는 매질의 사용에 의해 수행된다. 과량의 비하이브리드화된 프로브 함유 매질이 플러싱된 후에, 적절한 여기 파장에 의한 여기는 그들 표적에 여전히 하이브리드화된 프로브 상의 검출가능한 표지의 검출을 가능하게 한다. 이러한 예에서, 펜 #84의 경우에, 신호는 제2 검출가능한 검출의 파장에 대해서 검출되고, 다른 것은 그렇지 않게 관찰된다. 패턴 2가 흐름 1 (810)에서 관찰되었다는 것을 표시하도록 펜 #84 옆에 패턴화된 원형으로 표시된다. 펜 #12의 경우에, 모든 4종의 구별가능한 검출 파장의 신호가 관찰되고, 상응하는 패턴 1-4로 표시된다. 펜 #126의 경우에, 검출가능한 신호가 관찰되지 않았고, 도면을 따라서 원형이 그렇게 표시된다. 마지막으로, 펜 #260에서, 3종의 프로브 (440b-1, 440c-1 및 440d-1)가 결합하고, 관찰된 검출가능한 신호의 표시는 패턴 2, 3, 및 4가 표시되도록 한다.
모든 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열이 검출된 것은 아니어서, 제2 흐름 (815)이 도 8B에 도시된 바와 같이 수행된다는 것을 확인할 수 있다. 제2 흐름은 4종의 비동일한 프로브로서, 검출가능한 표지의 세트의 검출가능한 표지 1 (패턴 1로 표시됨)과 CCCCCGGGGG의 서열 (SEQ ID NO. 93)을 갖는 프로브 (440a-2); 세트의 검출가능한 표지 2 (패턴 2로 표시됨)를 갖는 AATTAATTAA의 서열 (SSEQ ID No. 94)을 갖는 제2 프로브 (440b-2); 세트의 제3 검출가능한 표지 (패턴 3이라고 표시됨)를 갖는 GGCCGGCCGG의 서열 (SEQ ID No. 95)을 갖는 제3 프로브 (440c-2); 및 세트의 제4 검출가능한 표지 (패턴 4라고 표시됨)를 갖는 TTTTTAAAAA의 서열 (SSEQ ID No. 96)을 갖는 제4 프로브 (440d-2)를 함유한다.
시약 흐름 2 (815)의 흐름 단계, 확산 및 결합을 허용하는 단계, 비하이브리드화된 프로브의 플러싱과 이후 4종의 구별가능한 파장의 각각을 검출하는 단계의 동일한 공정을 수행한다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 펜 #12는 제2 흐름의 프로브의 어떠한 것도 그 안의 임의의 카세트형 서열과 하이브리드화되도록 구성되지 않으므로 검출가능한 신호를 갖지 않는다. 더 나아가서, 펜 #12 내 포획 객체의 바코드의 모든 카세트형 서열은 이미 검출되었다. 추가적으로, 이들 방법에서, 카세트형 서열이 오직 각각의 검출가능한 신호 중 하나만을 갖도록 선택되므로 검출가능한 표지 파장 채널 중 하나에서 신호가 검출될 때 표시되고 반복되지 않을 것이다. 이후의 흐름에서 그 채널 내 검출가능한 신호는 바코드의 그 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 결합된 프로브가 이미 검출되었으므로 무시될 수 있다. 일부 예에서, 신호는 이후의 흐름에서 확인될 수 있지만, 그것은 바코드 서열과 하이브리드화된 채로 여전히 남아있는 초기 흐름의 프로브의 결과이고, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 결합하는 새로운 흐름 시약의 것이 아니다.
제2 흐름 (815)의 검출에 의한 분석으로 돌아가면, 펜 #84의 포획 객체는 제1, 제3 및 제4 검출가능한 신호 파장 채널에 신호를 갖는 것으로 표시되고, 제1, 제3 및 제4 패턴으로 표시된다. 펜 #126의 포획 객체는 전체 4종 프로브의 결합을 갖고, 그리하여 제1, 제2, 제3 및 제4 패턴으로 표시된다. 펜 #260의 포획 객체는 제1 검출가능한 표지 신호 파장 채널의 신호를 갖는 것으로 표시되고, 제1 패턴으로 표시된다. 그 결과는 카세트형 서열의 전체 참조 세트가 상응하는 하이브리드화 프로브로 시험될 때까지, 제1 흐름 (810), 제2 흐름 (815), 제3 흐름 (820) 및 제x 흐름 (895)에 대해서 도 8C에서와 같이 표로 작성될 수 있다.
특정 격리 펜 내 포획 객체 상의 각각의 바코드의 서열은, 하이브리드화 프로브의 서열이 알려져 있으므로, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드의 상보성 서열에 검출된 신호 패턴을 일치시켜서, 도시된 대로 유도시킬 수 있다. 이후에 포획 객체의 서열은 도시된 대로 지정될 수 있는데, 여기서 펜 #12 내 포획 객체의 바코드는 SEQ ID NO. 90의 서열을 갖는다는 것이 인-시츄 검출 방법으로 결정되고; 펜 #84 내 포획 객체의 바코드는 SEQ ID NO. 89의 서열을 갖는다고 결정되고; 펜 #126 내 포획 객체의 바코드는 SEQ ID No. 91의 서열을 갖는다고 결정되고, 펜 # 260 내 포획 객체의 바코드는 SEQ ID NO. 92의 서열을 갖는다고 결정된다.
도 8D-F는 동시에 바코드 서열과 함께 다수의 프로브에 하이브리드화되어 검출되는 능력을 보여주는 다른 실험을 예시한다. 이 실험에서, 사용되는 하이브리드화 프로브 상에서 이용된 염료는 Alexa Fluor® 647 (Cy®5 채널에서 검출 (예를 들어, Cy®5 염료를 검출하게 되지만 Alexa Fluor® 647 염료를 검출할 수도 있는 검출 필터) 및 Alexa Fluor® 594 (Texas Red 채널에서 검출가능(Alexa Fluor® 594를 또한 검출할 수 있는 검출 필터))였다. 이 실험에서, 바코드 서열 내에서 서로에 인접하여 위치된, 동일한 2종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 모두 갖는 다수의 포획 객체를 미세유체 장치 (800) 내 미세유체 채널 (120)로 흘려주었고, 그들을 격리 펜에 배치시키려는 시도는 하지 않았다. 이어서, 포획 객체의 바코드의 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드에 결합하는 서열을 갖는 제1 하이브리드화 프로브 및 Alexa Fluor® 594 염료를 포함하는 흐름을 만들었다. 또한 이 흐름은 포획 객체의 바코드의 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드에 결합하는 서열을 갖는 제2 하이브리드화 프로브 및 Alexa Fluor 647® 염료를 함유하였다. 확산될 수 있게 한 후, 하이브리드화 및 플러싱으로 비하이브리드화된 프로브를 제거한다.
도 8D, 8E 및 8F는 각각 상이한 파장 영역에 대한 검출 채널 (필터)을 도시하였다. 도 8D는 200 ms 노출의 Texas Red 검출 채널, 및 여기되고 검출된 포획 객체 (830)를 도시한다. 이것은 제1 하이브리드화 프로브의 Alexa Fluor® 594 표지가 존재 (예를 들어, 바코드의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 결합됨)하였다는 것을 확인시켜 주었다. 도 8E는 미세유체 장치 채널 (120) 내에서 동일한 뷰를 도시하고, 포획 객체에 결합하는 Alexa Fluor 647 표지를 검출하는 800 ms 노출의, Cy®5 검출 채널이다. 포획 객체 (830)는 또한 이 채널에서 검출할 수 있었고, 제2 하이브리드화 프로브가 제1 하이브리드화 프로브와 동시에 포획 객체 (830)에 결합되었고, 양쪽 신호가 검출가능하다는 것을 확인시켜준다. 도 8F는 FITC 검출 (필터) 채널, 2000 ms 노출의 동일한 뷰이고, 여기서는 채널 내 포획 객체의 신호가 확인되지 않았다. 이 실험은 검출 특이성의 손실없이, 차례로 형광성 프로브와 하이브리드화하는 능력을 입증하였다.
다양한 실시형태에서, 사용된 검출가능한 표지는 미세유체 장치 내에서 여기, 관찰 및 사건 기록에 사용되는 광학 시스템의 Cy®5 형광성 채널에서 검출되는 Alexa Fluor® 647; 광학 시스템의 Dapi 형광성 채널에서 검출가능한 Alexa Fluor® 405; 광학 시스템의 FITC 형광성 채널에서 검출가능한 Alexa Fluor® 488; 및 광학 시스템의 Texas Red 형광성 채널에서 검출가능한 Alexa Fluor® 594를 포함할 수 있다. 형광단은 합성에 적합하므로 하이브리드화 프로브에 부착될 수 있고 프로브의 5' 또는 3'말단에 존재할 수 있다. 하나는 5'말단에 표지되고 하나는 3'말단에 표지된, 2개 프로브의 하이브리드화는 인접한 표지의 존재에 의해 영향받지 않는 것으로 확인되었다 (데이타는 도시하지 않음).
미세유체 장치 내 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법. 미세유체 장치 내 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법이 제공되고, 이 방법은
미세유체 장치의 격리 펜에 포획 객체 (단일 포획 객체일 수 있음)를 배치시키는 단계로서, 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이밍 서열; 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레드 서열은 바코드 서열의 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하는 것인 단계;
다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 식별된 바코드 서열과 격리 펜 간 회합을 기록하는 단계 (즉, 미세유체 장치 내 포획 객체의 위치를 식별하는 단계);
생물학적 세포를 격리 펜에 배치시키는 단계;
생물학적 세포를 용해시키고 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산이 포획 객체에 의해 포함된 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계;
포획된 핵산을 전사 (예를 들어, 역전사)시켜서, 다수 (라이브러리일 수 있음)의 바코드화된 cDNA를 생성시키는 단계로서, 각각의 바코드화된 cDNA는 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결된 상보성의 포획된 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;
전사된 핵산 및 바코드 서열을 시퀀싱하여, 바코드 서열의 판독 서열과 연관된 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 수득하는 단계;
판독 서열을 기반으로 바코드 서열을 식별하는 단계; 및
판독 서열-식별된 바코드 서열 및 인-시츄 식별된 바코드 서열을 사용하여 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 격리 펜과 연결시켜서 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 격리 펜에 놓여진 생물학적 세포와 상호관련시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 단일 생물학적 세포는 격리 펜에 배치될 수 있고 상기 방법이 수행될 수 있다. 대안적으로, 하나를 초과하는 생물학적 세포 (예를 들어, 세포의 동일 클론 개체군으로부터 유래되는 둘 이상의 생물학적 세포 그룹)는 격리 펜 내에 배치될 수 있고 상기 방법이 수행될 수 있다.
포획 객체를 배치시키는 단계, 포획 객체의 바코드를 식별하는 단계, 생물학적 세포를 배치시키는 단계, 용해/전사/시퀀싱 단계, 및 전술한 방법의 판독 서열을 기반으로 바코드 서열을 식별하는 단계는 그들이 기재된 순서로 또는 다른 순서로 수행될 수 있지만, 이들 활성의 순서의 재배열은 논리적 순서 (예를 들어, 용해 전 전사 등)를 위반하지 않는다는 것을 제한으로 한다. 예로서, 바코드 서열의 인 시츄 식별은 격리 펜에 생물학적 세포의 도입 이후, 생물학적 세포를 용해시킨 후, 또는 포획된 핵산을 전사시킨 후에 수행될 수 있다. 유사하게, 포획 객체를 격리 펜에 도입시키는 단계는 격리 펜에 적어도 하나의 생물학적 세포를 도입시킨 후에 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법은 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계; 및 생물학적 세포의 표현형과 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 상호관련시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법은 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계로서, 생물학적 세포는 클론 개체군을 대표하는 것인 단계; 및 생물학적 세포 및 클론 개체군의 표현형을 다수의 전사된 핵산의 판독 서열과 상호관련시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계는 적어도 하나의 생물학적 세포의 적어도 하나의 물리적 특징을 관찰하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계는 생물학적 세포에 대한 어세이를 수행하는 단계 및 어세이 동안 발생된 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어세이는 단백질 발현 어세이일 수 있다.
예를 들어, 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계는 생물학적 세포가 어세이 시약과 상호작용할때 발생된 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 검출가능한 신호는 형광성 신호일 수 있다. 대안적으로, 어세이는 검출가능한 신호의 결여를 기반으로 할 수 있다. 생물학적 세포의 표현형에 관한 관찰을 식별하는 검출가능한 신호를 제공하는, 수행할 수 있는 어세이의 추가 예는 WO2015/061497 (Hobbs et al.); US2015/0165436 (Chapman et al.); 및 국제 특허 출원 PCT/US2017/027795 (Lionberger, et al.)의 개시 내용에서 확인할 수 있고, 이들 개시 내용의 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
다양한 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계 및 식별된 바코드 서열과 격리 펜 사이의 회합을 기록하는 단계는 생물학적 세포를 격리 펜에 배치시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계 및 식별된 바코드 서열과 격리 펜 간 회합을 기록하는 단계는 생물학적 세포를 격리 펜에 도입시키는 단계 이후에 수행될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 포획 객체를 배치시키는 단계, 임의로, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계 및 식별된 바코드 서열과 격리 펜 사이의 회합을 기록하는 단계는 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계 이후에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계 및 식별된 바코드 서열과 격리 펜 사이의 회합을 기록하는 단계는 생물학적 세포를 용해시키는 단계 및 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산을 포획 객체에 의해 포함된 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계 이후에 수행될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법의 임의의 변형을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 미세유체 장치 내 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법의 다양한 실시형태에서, 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 포획 객체일 수 있다.
방법의 다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 포함할 수 있고, 포획 객체를 격리 펜에 배치시키는 단계는 포획 객체를 이동시키기 위해서 유전영동 (DEP)력을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 방법의 일부 다른 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 생물학적 세포를 격리 펜에 배치시키는 단계는 생물학적 세포를 이동시키기 위해 유전영동 (DEP)력을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
미세유체 장치 내 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법의 다양한 실시형태에서, 이 방법은 다수의 포획 객체를 미세유체 장치의 상응하는 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계 (예를 들어, 이것은 격리 펜 당 단일 포획 객체를 배치시키는 단계를 포함할 수 있음); 다수의 생물학적 세포를 상응하는 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계, 및 본 방법의 추가 단계에 따라서 다수의 포획 객체 및 다수의 생물학적 세포의 각각을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트. 핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트가 또한 제공되고, 인클로저를 포함하는 미세유체 장치로서, 인클로저는 흐름 영역과 흐름 영역과 연결된 다수의 격리 펜을 포함하는 것인 장치; 및 다수의 포획 객체를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 포획 서열; 및 적어도 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 여기서 바코드 서열의 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 다수 중 각각이 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함한다.
다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 적어도 2종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 3종, 4종, 5종 또는 그 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열)을 포함할 수 있다. 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같을 수 있다. 예를 들어, 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 비동일 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 선택될 수 있다. 세트는 12종 이상 (예를 들어, 12 내지 100종)의 비동일 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
미세유체 장치는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 미세유체 장치일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있다.
핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트의 다양한 실시형태에서, 다수의 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 다수의 포획 객체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체의 각각은 다수 중 상응하는 격리 펜에 하나씩 배치될 수 있다.
핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트의 다양한 실시형태에서, 키트는 식별 표를 더 포함할 수 있고, 여기서 식별 표는 다수 중 상응하는 격리 펜과 다수의 포획 객체의 각각의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 상호관련시킨다.
핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트의 다양한 실시형태에서, 키트는 다수의 하이브리드화 프로브; 및 표지를 더 포함할 수 있고, 여기서 각각의 하이브리드화 프로브는 다수의 포획 객체의 어느 하나의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 상보성 서열은 상이한 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 상보성이고, 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 표지는 스펙트럼이 구별가능한 표지의 세트로부터 선택된다. 다양한 실시형태에서, 다수 중 하이브리드화 프로브의 각각의 상보성 서열은 SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 표지는 형광성 표지일 수 있다.
포획 객체의 제조 방법. 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 포획 객체를 제조하는 방법이 또한 제공되고, 이 방법은 포획 객체에 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각을 화학적으로 연결시키는 단계를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이머에 결합하는 프라이밍 서열; 포획 서열 (예를 들어, 표적 핵산과 하이브리드화되도록 구성됨); 및 바코드 서열을 포함하고, 여기서 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않으며; 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 포획 객체는 비드일 수 있다. 예를 들어, 포획 객체는 상자성 재료, 중합성 재료 및/또는 유리를 포함하는 코어를 갖는 비드 (또는 유사한 물체)일 수 있다. 중합성 재료는 폴리스티렌 또는 포획 올리고뉴클레오티드를 연결시키도록 작용화될 수 있는 임의의 다른 플라스틱 재료일 수 있다. 포획 객체의 코어 재료는 다른 배열도 가능하지만, 작용화된 중합체를 포함할 수 있는 포획 올리고뉴클레오티드에 링커를 부착시키는데 적합한 재료를 제공하도록 코팅될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 연결 단계는 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각을 공유적으로 연결하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각은 스트렙타비딘/바이오틴 연결을 통할 수 있는, 비드에 비공유적으로 연결될 수 있다. 바코드화된 비드는 당분야에 공지된 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 합성될 수 있다. 프라이밍 서열/고유 분자 식별자 태그/세포 바코드/프라이머 서열은 전체 올리고뉴클레오티드 합성, 분할 및 풀 합성, 임의 길이의 올리고뉴클레오티드 절편의 결찰, 또는 이의 임의의 조합에 의해 합성될 수 있다.
다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 및 3'-대부분의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 프라이밍 서열은 5'-대부분의 뉴클레오티드에 인접할 수 있거나 또는 그를 포함하고, 여기서 포획 서열은 3'-대부분의 뉴클레오티드에 인접할 수 있거나 또는 그를 포함하고, 바코드 서열은 프라이밍 서열의 3' 및 포획 서열의 5'에 위치될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 각각의 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드는 결찰 화학을 통해 연결될 수 있도록 개재된 하나 또는 2개의 뉴클레오티드를 통해서 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각을 분할 및 풀 합성을 통해서 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
포획 객체를 제조하는 방법의 다양한 실시형태에서, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 약 6 내지 15개 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 약 10개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 12 내지 100개의 비동일 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 각각의 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 SEQ ID NO: 1-40로부터 각각의 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-연관된 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 방법은 SEQ ID NO: 1-10의 어느 하나로부터 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계; SEQ ID NO: 11-20 중 어느 하나로부터 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드를 선택하는 단계; SEQ ID NO: 21-30 중 어느 하나로부터 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계; 및 SEQ ID NO: 31-40의 어느 하나로부터 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
포획 객체를 제조하는 방법의 다양한 실시형태에서, 상기 포획 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 때, DNA 중합효소를 프라이밍한다. 일부 실시형태에서, DNA 중합효소는 역전사효소이다. 일부 실시형태에서, 프라이밍 서열은 P7 또는 P5 프라이머의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각이 상이한 고유한 분자 식별자 (UMI)를 포함하도록 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 고유한 분자 식별자 (UMI) 서열을 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다. UMI는 5 내지 20개의 뉴클레오티드 (예를 들어, 8 내지 15개의 뉴클레오티드)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열일 수 있다.
포획 객체를 제조하는 방법의 다양한 실시형태에서, 포획 서열은 폴리-dT 서열, 무작위 헥사머, 또는 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있다.
포획 객체를 제조하는 방법의 다양한 실시형태에서, 이 방법은 포획 올리고뉴클레오티드의 5'말단 근처에서 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 프라이머 서열을 도입시키는 단계; 및, 포획 올리고뉴클레오티드의 3'말단 근처에 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드로 포획 서열을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 프라이밍 서열을 도입시킨 후 및 포획 서열을 도입시키기 전에 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 바코드 서열을 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 프라이밍 서열을 도입시킨 후 및 포획 서열을 도입시키기 전에 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 UMI를 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 Not1 제한효소 부위를 포함하는 서열을 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 바코드 서열을 도입시킨 후 및 포획 서열을 도입시키기 전에 Not1 제한효소 부위를 포함하는 서열을 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
포획 객체를 제조하는 방법의 다양한 실시형태에서, 방법은 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드에 하나 이상의 어댑터 서열을 도입시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 방법. 본 명세서에 기술된 작업흐름을 기반으로, 소스 세포의 위치를 비롯하여 그 세포에서 관찰되는 표현형 정보와 게놈 데이타의 상호관련화를 가능하게 할 다양한 시퀀싱 라이브러리를 제조할 수 있다. 여기서 표시되는 접근법은 합성 화학에 의한 Illumina® 시퀀싱을 사용하는 최종 용도에 적합화되지만, 그렇게 제한되는 것은 아니다. 임의 종류의 시퀀싱 화학이 이들 방법 내에서 사용을 위해 적합할 수 있고 에멀션 PCR, 합성 시퀀싱, 파이로시퀀싱 및 반도체 검출을 포함할 수 있다. 당업자는 다른 대량 동시 시퀀싱 플랫폼 및 화학 예컨대 PacBio long read systems (SMRT, Pacific Biosystems), Ion Torrent (ThermoFisher Scientific), Roche 454, Oxford Nanopore 등에서 이들 방법을 사용하기 위해, 포획 올리고뉴클레오티드 및 연관 어댑터, 프라이머 등의 구축 및 방법을 조정할 수 있다.
RNA 포획 및 라이브러리 제조. 또한, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 생물학적 세포를 배치시키는 단계; 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 여기서 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 프라이밍 서열; 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하며, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 생물학적 세포를 용해시키고 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산이 포획 객체에 의해 포함된 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계; 및
포획된 핵산을 전사시켜서, 포획 객체를 장식하는 다수의 바코드화된 cDNA를 생성시키는 단계를 포함하고, 각각의 바코드화된 cDNA는 (i) 포획된 핵산의 상응하는 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열이 (ii) 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결된 것을 포함한다. 포획 객체는 단일 포획 객체일 수 있다. 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산은 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 포획 서열에 의해 포획될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전사 단계는 역전사 단계를 포함할 수 있다. 포획 객체 및/또는 생물학적 세포는 예를 들어, 격리 펜의 고립 영역 내에 배치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 세포는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, 마크로파지 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 세포는 암세포, 예컨대 흑색종 암세포, 유방암 세포, 신경학적 암세포 등일 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 세포는 줄기 세포 (예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 다능성 (iPS) 줄기 세포 등) 또는 전구 세포일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생물학적 세포는 배아 (예를 들어, 접합자, 2 내지 200개 세포 배아, 포배 등)일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 생물학적 세포는 단일 생물학적 세포일 수 있다. 대안적으로, 생물학적 세포는 다수의 생물학적 세포, 예컨대 클론 개체군일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 세포를 배치하는 단계는 생물학적 세포 (예를 들어, 핵산용 마커, 예컨대 Dapi 또는 Hoechst 착색제를 가짐)를 표시하는 단계를 더 포함할 수 있다.
포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 포획 객체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상 (각각일 수 있음)의 포획 서열은 올리고-dT 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상 (예를 들어, 각각)의 포획 서열은 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-특이적 프라이머 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 를 코딩하는 mRNA 서열(예를 들어, TCR 알파 사슬 또는 TCR 베타 사슬, 특히 가변 영역을 코딩하는 mRNA의 영역 또는 3'이지만 가변 영역의 근부에 위치하는 mRNA의 영역)을 표적으로 할 수 있다 (또는 결합할 수 있다). 다른 실시형태에서, 유전자-특이적 프라이머 서열은 B-세포 수용체 (BCR) 를 코딩하는 mRNA 서열 (예를 들어, BCR 경쇄 또는 BCR 중쇄, 특히 가변 영역을 코딩하는 mRNA의 영역 또는 3'이지만 가변 영역의 근부에 위치되는 mRNA의 영역)을 표적으로 할 수 있다 (또는 결합할 수 있다).
다양한 실시형태에서, 하나 이상 (예를 들어, 전부 또는 실질적으로 전부)의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 포획 서열은 방출된 핵산 중 하나에 결합하여 방출된 핵산을 프라이밍할 수 있어서, 중합효소 (예를 들어, 역전사효소)가 포획된 핵산을 전사시킬 수 있게 한다.
다양한 실시형태에서, 포획 객체는 자성 성분 (예를 들어, 자성 비드)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 포획 객체는 비자성일 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 세포를 격리 펜에 배치시키는 단계는 격리 펜에 포획 객체를 배치시키기 전에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획 객체를 격리 펜에 배치시키는 단계는 격리 펜에 생물학적 세포를 배치시키기 전에 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 포획 객체가 격리 펜 내에 위치된 상태로, 인 시츄로 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바코드를 식별하는 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같이 바코드를 식별하는 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 바코드 서열을 식별하는 단계는 생물학적 세포를 용해시키는 단계 전에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 적어도 하나의 코팅된 표면을 포함할 수 있다. 코팅된 표면은 Tris 및/또는 중합체, 예컨대 PEG-PPG 블록 공중합체로 코팅될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함할 수 있다.
적어도 하나의 컨디셔닝된 표면은 공유적으로 결합된 친수성 모이어티 또는 음으로 하전된 모이어티를 포함할 수 있다. 공유적으로 결합된 친수성 모이어티 또는 음으로 하전된 모이어티는 친수성 또는 음으로 하전된 중합체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있다. 생물학적 세포를 배치시키는 단계 및/또는 포획 객체를 배치시키는 단계는 생물학적 세포 및/또는 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP)력을 인가하여 수행될 수 있다.
미세유체 장치는 다수의 격리 펜을 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 방법은 다수의 생물학적 세포를 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 다수의 생물학적 세포는 클론 개체군일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 다수의 생물학적 세포를 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계는 다수 중 실질적으로 오직 하나의 생물학적 세포를 다수 중 상응하는 격리 펜에 배치시키는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 그에 생물학적 세포가 배치된 다수 중 각각의 격리 펜은 일반적으로 하나의 생물학적 세포를 함유하게 될 것이다. 예를 들어, 점유된 격리 펜의 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만은 하나를 초과하는 생물학적 세포를 함유할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계는 실질적으로 오직 하나의 포획 객체를 다수 중 상응하는 하나의 격리 펜 내에 배치시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계는 생물학적 세포 또는 다수의 생물학적 세포를 용해시키는 단계 전에 수행될 수 있다. 다수의 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 다수의 포획 객체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 포획 객체 또는 다수의 포획 객체를 미세유체 장치로부터 이출시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획 객체 또는 포획 객체들은 cDNA 장식된 포획 객체이다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체를 이출시키는 단계는 다수의 포획 객체 각각을 개별적으로 (즉, 한번에 하나씩) 이출시키는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 방법은 미세유체 장치 외부의 분리된 목적 용기로 다수의 포획 객체의 각각을 전달하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 생물학적 세포 또는 다수의 생물학적 세포를 배치시키는 단계; 포획 객체 또는 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계; 생물학적 세포 또는 다수의 생물학적 세포를 용해시켜서 용해된 생물학적 세포 또는 다수의 생물학적 세포로부터 방출된 핵산이 포획될 수 있게 하는 단계; 전사시키는 단계; 및 포획 객체 또는 다수의 포획 객체의 각각의 바코드 서열을 인-시츄 (수행한다면)에서 식별하는 단계 중 하나 이상은 자동화 방식으로 수행될 수 있다.
또한, 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위한 방법이 제공되고, 이 방법은 본 명세서에 기술된 임의 방법으로 수득된 포획 객체의 cDNA 라이브러리 또는 다수의 포획 객체의 각각의 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 DNA 라이브러리 또는 다수의 cDNA 라이브러리를 태그먼트화하여서, 하나 또는 다수의 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, cDNA 라이브러리 또는 다수의 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계는 풀 인덱스 서열을 도입시키는 단계를 포함할 수 있고, 영기서 풀 인덱스 서열은 4 내지 10개 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 다수의 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 조합하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 다수 중 각각의 바코드화된 시퀀싱 라이브러리는 상이한 바코드 서열 및/또는 상이한 풀 인덱스 서열을 포함한다.
방출된 핵산, 예컨대 RNA로부터 cDNA를 수득하는 방법은 이 공정의 개략도인 도 9로 돌아가서 더욱 충분히 이해될 수 있을 것이다. 세포 단리 및 세포 용해 박스 (902)의 경우, 생물학적 세포 (410)가 미세유체 장치 내 격리 펜 내에 놓일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 포획 객체로서 구성될 수 있는, 포획 객체 (930)는 동일한 격리 펜에 배치될 수 있고, 이것은 격리 펜에 세포 (410)를 배치시키는 단계 이전 또는 이후에 수행될 수 있다. 세포 (410)는 하기 실시예에 기술된 바와 같이, 핵막이 아닌 세포 (410)의 외부 세포막을 용해시키는 용해 시약을 사용하여 용해될 수 있다. 용해된 세포 (410')는 이러한 공정에 의한 결과이고 핵산 (905), 예를 들어 RNA를 방출한다. 포획 객체 (930)의 포획 올리고뉴클레오티드는 5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT 의 서열 (SEQ ID NO. 104)을 갖는 프라이밍 서열 (520), 및 본 명세서에 기술된 임의의 바코드 같이 구성될 수 있는, 바코드 서열 (525)를 포함할 수 있다. 포획 객체 (930)의 포획 올리고뉴클레오티드는 임의로 UMI (530)를 포함할 수 있다. 포획 객체 (930)의 포획 올리고뉴클레오티드는 이 경우에 이의 3'말단에 폴리A 서열을 갖는 방출된 핵산 (905)을 포획할 수 있는 폴리T 서열을 포함하는 포획 서열을 포함한다. 포획 서열 (535)은 방출된 핵산 (905)을 포획한다. 세포 및 분자 바코드화 박스 (904) 및 역전사 박스 (906)에서, 포획 올리고뉴클레오티드는 /5Me-isodC//isodG//iMe-isodC/ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrGrG의 서열 (SEQ ID NO. 103)을 갖는 주형 스위칭 올리고뉴클레오티드 (915)의 존재 하에서 방출된 핵산 (905)으로부터 전사, 및 역전사된다. 바코드 (912)의 식별 단계는 바코드화된 비드에 RNA 포획 이전; 비드에 포획된 RNA 역전사 이전, 또는 비드 상의 RNA의 역전사 이후에 본 명세서에 기술된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 특이적 바코드의 식별은 비드에 포획된 RNA의 역전사 이후에 수행될 수 있다. 포획 객체의 역전사 및 인-시츄 식별이 획득된 이후에, cDNA 장식된 포획 객체는 미세유체 장치 밖으로 이출된다. 다수의 cDNA 포획 객체는 동시에 이출될 수 있고 풀링 및 cDNA 증폭 박스 (912) (DNA 앰플리콘 (92) 생성)는 5'-/5Biosg/ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3'의 서열 (SEQ ID NO. 105)을 갖는 증폭 프라이머를 사용하여 수행된다. 적합화, 크기조정, 및 인덱스화 박스 (916)가 이후 증폭된 DNA (920)에 대해서 수행된다. 이것은 DNA (925) 및 삽입 태그먼트화 어댑터 (942) 크기로 DNA를 단편화시키는 단측 태그먼트화 박스 (914)를 포함한다. 태그먼트화가 본 명세서에 예시되어 있지만, 이러한 공정은 또한 효소 단편화, 예컨대 프래그멘타제 (NEB, Kapa)를 사용한 후 말단 복구에 의해서 수행될 수도 있다.
또한 태그먼트화된 DNA (940)가 프라이머 (935a 및 935b)에 의해서 작용하는 풀 인덱스화 박스 (918)가 박스 (0916)에 포함된다. 태그먼트화 어댑터 (942)에 대해서 유도되는 제1 프라이머 (935a)는 다음의 서열을 갖는, P7 시퀀싱 어댑터 (932)를 도입시키고: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 (SESQ ID NO. 107); 또한 선택적인 풀 인덱스 (934)를 도입시킨다. 5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC C*G*A*T*C*T-3 (SEQ ID No. 106)의 서열을 갖는 제2 프라이머 (935b)는 프라이밍 서열 (520)에 대해 유도된 일부분을 갖고 P5 시퀀싱 어댑터 서열 (936)을 도입시킨다. 크기조정, 인덱스화 및 적합화된 시퀀싱 라이브러리 (950)는 시퀀싱 박스 (922)에서 시퀀싱될 수 있고, 여기서 제1 시퀀싱 판독치 (955) (서열 판독 개시 시점)는 바코드 (525) 및 선택적인 UMI (539)를 판독한다. 제2 시퀀싱 판독치 (960)는 풀 인덱스 (934)를 판독한다. 제3 시퀀싱 판독치 (965)는 DNA 라이브러리 그 자체 내에서 바람직한 수의 bp를 판독하여 게놈 판독치를 생성시킨다.
도 10A-10D는 본 개시의 일 실시형태에 따른 후속 RNA 포획과 외부 세포막의 용해를 위한 공정의 일 실시형태의 사진도이다. 도 10A는 각각이 미세유체 장치 (1000) 내 격리 펜 내에 배치된, 용해 전 세포 (430) 및 포획 객체 (430)를 도시하는 명시야 이미지를 도시한다. 도 10B는 용해 전 동일한 시점에 온전한 세포 (410)의 DAPI 염색된 핵 유래의 형광발광성을 도시한다. 도 10C는 용해가 완료된 후 남아있는 미용해된 핵 (410') 및 포획 객체 (930)의 명시야 이미지를 도시한다. 도 10D는 용해 후 도 10C와 동일한 시점의 형광성 이미지를 도시하는 것으로서, 핵이 온전한 것을 보여주는, 비파손 핵 (410') 유래 DAPI 형광발광성을 도시한다.
도 11A는 도 9에 도시된 바와 같은 RNA의 포획에 의한 결과로서 cDNA의 프로세싱에 대한 개략도로서, 이것은 일부 품질 분석과 함께, cDNA 증폭 박스 (912), 단측 태그먼트화 박스 (914), 풀 인덱스화 박스 (918) 및 시퀀싱 박스 (922)를 포함하여, 미세유체 환경의 외부에서 수행된다. cDNA 증폭 박스 (912) 이후 QC가 도 11B의 증폭된 DNA (920)에 대해 도시되어 있는데, 700의 크기에서 1000 bp 이상의 웰을 갖는 대량의 생성물을 갖는 크기 분포가 도시되어 있다. 태그먼트화 단계의 완료 이후에, 바코드화된 라이브러리 내 최종 단편의 크기 분포는 도 11C에 도시되어 있고, 합성 프로토콜에 의한 시퀀싱에 최적인 300-800 bp 내이다. Qubit에 의해 측정된 정량은 바코드화된 DNA 샘플의 약 1.160 ng/마이크로리터가 단일 세포로부터 수득되었다. 시퀀싱 작업을 위해서, 약 100개의 단일 세포 유래의 개별적으로 바코드화된 재료를 풀링하여서 시퀀싱 작업을 수행하여, 약 100개 단일 세포 각각에 대한 시퀀싱 데이타를 제공하였다.
이러한 작업흐름은 상기에 획득된 바코드화된 cDNA를 프로세싱하여 PacBio 라이브러리 제조 (SMRT system, Pacific Biosystems)에 적합화시킬 수 있고, SMRTbell 어댑터가 전체 길이 바코드화된 전사물에 직접적으로 결찰될 수 있다.
DNA 포획 및 시퀀싱 라이브러리의 생성. 또한, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 게놈 DNA를 포함하는 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계; 생물학적 미세-객체를 생물학적 미세-객체의 핵 엔벨로프를 파괴할 수 있는 용해 시약과 접촉시켜서, 생물학적 미세-객체의 게놈 DNA를 방출시키는 단계; 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화시켜서, 제1 태그먼트화 삽입 서열에 의해 정의되는 제1 말단 및 제2 태그먼트화 삽입 서열에 의해 정의되는 제2 말단을 갖는 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편을 생성시키는 단계; 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 여기서 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 제1 프라이밍 서열; 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및 바코드 서열을 포함하고, 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편 중 하나들을 (i) 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열, (ii) 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열에 연결된 제2 프라이밍 서열, 무작위 프라이머 서열, 또는 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 가닥 치환 효소 및 중합효소를 포함하는 효소 혼합물과 접촉시키는 단계; 일정 기간 동안 접촉된 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 인큐베이션시켜서, 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편 중 하나들을 동시에 증폭시키고 포획 올리고뉴클레오티드 및 증폭 올리고뉴클레오티드를 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 하나의 말단에 첨가하여 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 생성시키는 단계; 및 미세유체 장치로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 게놈 DNA는 미토콘드리아 DNA를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 포획 객체는 태그먼트화 단계 이전 또는 이후에 격리 펜에 놓여질 수 있다. 다양한 실시형태에서, 인큐베이션 단계는 등온 조건 (예를 들어, 약 30℃ 내지 약 45℃, 전형적으로 약 37℃) 하에서 수행될 수 있다.
이출 단계는 증폭된 게놈 DNA가 격리 펜으로부터 격리 펜이 접촉하는 흐름 영역 (예를 들어, 채널)으로, 그 다음으로 흐름 영역을 통해서 유동 매질 (예를 들어, 증폭 완충액, 이출 완충액 등)로, 미세유체 장치에서 나와서, 적절한 용기 (예를 들어, 웰 플레이트의 웰, 튜브, 예컨대 미세원심분리 튜브 등)에 확산될 수 있게 하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 미세-객체를 격리 펜에 배치시키는 단계는 포획 객체를 격리 펜에 배치시키는 단계 이전에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 미세-객체는 생물학 세포일 수 있다. 다른 실시형태에서, 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포 (예를 들어, 진핵생물 세포)의 핵일 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 세포는 면역 세포 (예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, 마크로파지 등)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 세포는 암 세포 (흑색종 암세포, 유방암 세포, 신경학적 암세포 등)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 용해 시약은 적어도 하나의 리보뉴클레아제 억제제를 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 태그먼트화는 방출된 게놈 DNA를 (i) 제1 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제1 이중-가닥 DNA 단편, 및 (ii) 제2 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제2 이중-가닥 DNA 단편이 로딩된 트랜스포사제와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 이중-가닥 DNA 단편은 제3 프라이밍 서열에 연결된 제1 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있고, 제2 이중-가닥 DNA 단편은 제4 프라이밍 서열에 연결된 제2 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열은 제1 태그먼트화 삽입 서열과 적어도 부분적으로 (또는 일부 실시형태에서, 완전할 수 있음) 상보성인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭 올리고뉴클레오티드의 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열은 제2 태그먼트화 삽입 서열과 적어도 부분적으로 (또는 일부 실시형태에서, 완전할 수 있음) 상보성인 서열을 포함한다. 예를 들어, 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열은 제1 태그먼트화 삽입 서열의 제3 프라이밍 서열 및/또는 제1 모자이크 말단 서열과 적어도 부분적으로 (예를 들어, 완전하게) 상보성일 수 있다. 다른 예에서, 증폭 올리고뉴클레오티드의 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열은 제2 태그먼트화 삽입 서열의 제4 프라이밍 서열 및/또는 제2 모자이크 말단 서열과 적어도 부분적으로 (예를 들어, 완전하게) 상보성일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 포획 객체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획 객체는 자성 성분 (예를 들어, 자성 비드)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 포획 객체는 비자성일 수 있다.
바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법의 다양한 실시형태에서, 이 방법은 포획 객체가 격리 펜 내에 위치된 상태로, 인 시츄로 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드 서열을 식별하는 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 바코드 서열을 식별하는 단계는 생물학적 세포를 용해시키는 단계 이전에 수행된다. 대안적으로, 바코드 서열을 식별하는 단계는 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화하는 단계 이전, 또는 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계 이후에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 적어도 하나의 코팅된 표면을 포함할 수 있다. 코팅된 표면은 Tris 및/또는 중합체, 예컨대 PEG-PPG 블록 공중합체로 코팅될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함한다. 제141항의 방법에서, 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면은 공유적으로 결합된 친수성 모이어티 또는 음으로 하전된 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 공유적으로 결합된 친수성 또는 음으로 하전된 모이어티는 친수성 또는 음으로 하전된 중합체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함할 수 있고, 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계 및/또는 포획 객체를 배치시키는 단계는 생물학적 세포 및/또는 포획 객체 상에서 또는 근부에서 유전영동 (DEP)력을 인가하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치는 다수의 격리 펜을 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 방법은 다수의 생물학적 미세-객체를 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 생물학적 미세-객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계는 다수 중 실질적으로 오직 하나의 생물학적 미세-객체를 다수 중 상응하는 격리 펜에 배치시키는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 생물학적 미세-객체가 그에 배치된 다수 중 각각의 격리 펜은 일반적으로 하나의 생물학적 미세-객체를 함유하게 될 것이다. 예를 들어, 점유된 격리펜의 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만은 하나를 초과하는 생물학적 미세-객체를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포의 클론 개체군일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 방법은 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜에 배치시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계는 실질적으로 오직 하나의 포획 객체를 다수 중 상응하는 하나의 격리 펜 내에 배치시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 다수의 포획 객체를 다수의 격리 펜 내에 배치시키는 단계는 생물학적 미세-객체 또는 다수의 생물학적 미세-객체를 용해시키는 단계 이전에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 다수의 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 다수의 포획 객체일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 태그먼트화, 접촉, 및 인큐베이션 단계들은 다수의 생물학적 미세-객체 중 하나를 함유하는 격리 펜의 각각에 대해서 실질적으로 동시에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 생물학적 미세-객체 또는 다수의 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계; 포획 객체 또는 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계; 생물학적 미세-객체 또는 다수의 생물학적 미세-객체를 용해시켜서 용해된 생물학적 세포 또는 다수의 생물학적 세포로부터 핵산이 방출될 수 있게 하는 단계; 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화하는 단계; 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 하나들을 접촉시키는 단계; 접촉된 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편을 인큐베이션시키는 단계; 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리 또는 다수의 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계; 및 포획 객체 또는 다수의 포획 객체 각각의 바코드를 인-시츄에서 식별하는 단계 중 하나 이상은 자동화 방식으로 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 포획 객체 또는 다수의 포획 객체를 미세유체 장치로부터 이출시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 다수의 포획 객체를 이출시키는 단계는 다수의 포획 객체 각각을 개별적으로 이출시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 미세유체 장치 외부의 분리된 목적 용기로 다수의 포획 객체의 각각을 전달하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 하기 실시예 3 및 4 및 도 12A-G로 되돌어가서 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다. 도 12A-12F는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인-시츄 검출가능한 바코드를 갖는 시퀀싱 라이브러리를 수득하기 위한 작업흐름을 예시한다. 생물학적 세포 (410)는 미세유체 장치 내 미세유체 채널 (도시되지 않음)에 연결된 격리 펜 (405) 내에 배치된다 (도 12A). 도 12B에서 처럼, 세포는 세포막 및 또한 핵막 둘 모두를 파괴하도록 용해되어, 게놈 DNA (1220)를 방출시킨다. 도 12C는 다음의 공정으로서, 적절하게 크기조정된 단편을 생성시키고 포획 및 증폭을 허용하는 태그먼트화 DNA (1225)를 제공하는 태그를 삽입시키기 위해 적용되는 태그먼트화를 예시한다. 도 12D에서, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 포획 객체 (1230)는 태그먼트화된 DNA (1225)를 함유하는 펜 (405)에 도입된다. 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각은 인-시츄 검출가능한 바코드, 프라이밍 서열, 및 포획 서열을 포함한다. 도 12E에서, 태그먼트화된 DNA (1225)는 리콤비나제/중합효소 증폭을 사용한 등온 증폭이 수행되고, 여기서 포획 올리고뉴클레오티드의 포획 서열은 (포획 객체 (1230')) 태그먼트화된 DNA를 리콤비나제/중합효소 기구의 존재 하에서 안내하고 유도하여, 시퀀싱 어댑터, 바코드, 및 선택적인 인덱스 예컨대 UMI 또는 풀 인덱스를 포함하는 증폭된 DNA (1235)를 제공한다. 증폭 전반 및 그 이후에 증폭되고 적합화시킨 바코드화된 DNA (1235)는 격리 펜 (405) 밖으로 확산되고 격리 펜과 연결된 미세유체 채널 (122)로 확산되어서, 유체 매질 흐름 (242)을 사용하여 미세유체 장치 밖으로 이출된다 (도 12F). 이출되면, 증폭되고 적합화시킨 바코드화된 DNA (1235)는 시퀀싱 라이브러리로서 사용을 위해 정량되고, 시퀀싱 작업을 위해 다른 라이브러리와 풀링될 수 있다. DNA (1235)의 이출이 완료된 후, 포획 객체 (1230)의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드의 인-시츄 결정은 본 명세서에 기술된 임의의 방법을 사용해 수행된다 (도 12F).
도 12G는 세포의 DNA로부터 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 방법에서 포획 올리고뉴클레오티드 및 DNA 프로세싱에 대한 개략도를 도시한다. 포획 객체 (1230)의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각은 링커 (1215)를 통해서 공유적으로 또는 비공유적으로 연결되고, 포획 올리고뉴클레오티드의 5'말단으로부터: 프라이밍 서열/어댑터 (1240); 바코드 (1245), 선택적인 UMI (1250) 및 태그먼트화 삽입 포획 서열을 포함하고 모자이크 말단 삽입부 서열을 포획 (예를 들어, 안내 및 유도)할 수 있는 포획 서열 (1255)을 포함한다. 바코드 서열 (1245)은 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드를 함유하는 임의의 바코드 서열일 수 있다. 태그먼트화된 DNA (1225)는 모자이크 말단 서열 삽입부, 및 DNA 단편 (1260)일 수 있는 태그먼트화 삽입부 서열 (1255)을 갖는다. 이것은 P5 어댑터/프라이밍 서열 (1270), 선택적 풀 인덱스 (1265) 및 태그먼트화 삽입 포획 서열 (1255)을 갖는 포괄 프라이머 (1275)에 의한 등온 리콤비나제 중합효소 구동 증폭 동안 프라이밍된다. 대안적으로, 유전자 특이적 프라이머 (1275')가 사용될 수 있고, 여기서 프라이머 (1261)의 일부분이 DNA의 서브세트, 예를 들어 유전자 특이적 서열에 대해 선택되도록 유도된다.
시퀀싱 라이브러리를 형성하는, 등온 증폭의 생성물은 증폭 및 적합화된 DNA (1280 또는 1280')이다. 증폭 및 적합화된 DNA (1280)는 포괄 프라이머 (1275)의 생성물이고, DNA 단편의 포괄 라이브러리 (1260)를 포함하는 한편, 증폭된 DNA (1280')는 DNA 단편 영역 (1262) (유전자 특이적 프라이밍 서열에 의해 프라이밍된 유전자 특이적 DNA의 나머지)과 유전자 특이적 증폭 생성물을 포함하는 (1261)(유전자 특이적 프라이밍 서열)을 갖는다.
동일한 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리의 생성. 또한 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜에 생물학적 세포를 배치시키는 단계; 격리 펜 내에 제1 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 제1 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 제1 프라이밍 서열; 제1 포획 서열 (예를 들어, 방출된 핵산을 포획하도록 구성됨); 및 제1 바코드 서열을 포함하고, 제1 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 제1 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 본 명세서에 기술된 바와 같은 cDNA 라이브러리를 수득하는 임의의 방법을 수행하여 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 생물학적 세포의 용해가 수행되어 생물학적 세포의 원형질막이 분해되고 생물학적 세포로부터 세포질 RNA가 방출되는 반면, 생물학적 세포의 핵 엔벨로프는 온전한 채로 남아서, 생물학적 세포의 RNA 유래의 바코드화된 cDNA 라이브러리로 장식된 제1 포획 객체를 제공하는 단계; 격리 펜에 제2 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 제2 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각은 제2 프라이밍 서열; 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및 제2 바코드 서열을 포함하고, 제2 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 제2 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계; 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 임의의 방법을 수행하여 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 여기서 생물학적 세포 유래의 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편은 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나들의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 접촉되어서, 생물학적 세포의 게놈 DNA 유래의 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 단계; 및 미세유체 장치로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계는 격리 펜에 생물학적 세포를 배치시키는 단계 이전; 생물학적 세포의 RNA로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계 이전; 또는 미세유체 장치로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리-장식된 제1 포획 객체를 이출시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 제2 포획 객체의 다수의 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제2 포획의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계는 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계 이전 또는 미세유체 장치로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계 이후에 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제1 또는 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같이 인-시츄에서 바코드를 식별하는 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제1 포획 객체 및 제2 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 각각 임의의 포획 객체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 프라이밍 서열은 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 제2 프라이밍 서열과 상이할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 포획 서열은 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 상이할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열은 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열과 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열은 제2 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열과 상이할 수 있다.
B 세포 수용체 시퀀싱 라이브러리의 생성.
바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 B 림프구로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 단계로서, 생성 단계는 본 명세서에 기술된 바와 같은 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 임의 방법에 따라 수행되고, 바코드화된 cDNA 라이브러리는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체를 장식하고, 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각은 Not1 제한효소 부위 서열을 포함하는 것인 단계; 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 바코드화된 cDNA 라이브러리로부터 바코드화된 BCR 서열을 선택하여, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 라이브러리를 생성시키는 단계; 바코드화된 BCR 서열에 대해 농축된 라이브러리 유래의 서열을 원형화시켜서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 생성시키는 단계; 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 재선형화시켜서 재배열된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 각각은 개별 가변 (V) 하위-영역 및/또는 개별 다양성 (D) 하위-영역에 대해서 3'에 BCR 서열의 불변 (C) 영역이 존재하는 것인 단계; 및 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 하위-영역 및/또는 D 하위-영역에 대해서 하위-선택하여, 바코드화된 BCR 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 BCR 시퀀싱 라이브러리를 증폭하여 바코드화된 BCR 하위-영역 서열의 증폭된 라이브러리를 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계는 유니버설 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, BCR 서열 영역에 대해 선택하는 단계는 BCR 서열에 선택적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여, 바코드화된 BCR 영역 선택적 증폭 DNA의 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바코드화된 BCR 서열에 대해 선택하는 단계는 적어도 하나의 시퀀싱 프라이머 서열 및/또는 적어도 하나의 인덱스 서열을 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 바코드화된 BCR 서열에 대해 농축된 라이브러리 유래 서열을 원형화시키는 단계는 각각의 바코드화된 BCR 서열의 5'말단을 이의 개별 3'말단에 결찰시키는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 재선형화시키는 단계는 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리의 각각을 Not1 제한효소 부위에서 분해시키는 단계를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 및/또는 D 하위-영역에 대해서 하위-선택하는 단계는 PCR을 수행하여, 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 및/또는 D 하위-영역에 대해서 하위-선택하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 다른 실시형태에서, 포획 객체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 포획 객체이다.
다양한 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 인-시츄에서 바코드를 식별하는 임의 방법을 사용하여 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 식별 단계는 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계 이전에 수행될 수 있다. 다른 실시형태에서, 식별 단계는 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키면서 수행될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 바코드화된 BCR 서열에 선택적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 서열을 원형화시키는 단계; Not1 제한효소 부위에서 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 재선형화시키는 단계; 및 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 및/또는 D 하위-영역에 대해 하위-선택하는 단계 중 어느 하나는 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에서 수행될 수 있다.
B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 방법은 도 13A-B를 참조하여 더욱 이해될 수 있다. 도 13A-B는 본 명세서 및 실시예 7에 기술된 바와 같은 BCR 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 방법의 개략도이다. 포획 객체 (1330)는 명확함을 위해서 도시된 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 오직 하나의 포획 올리고뉴클레오티드를 갖는 비드 (1310)를 포함한다. 포획 객체 (1330)의 포획 올리고뉴클레오티드는 공유적이거나 또는 비공유적일 수 있는 링커 (1315)를 통해서 비드 (1310)에 연결된다. 링커 (1315)는 프라이밍 서열 1 (1320)이 포획 올리고뉴클레오티드의 길이를 따라서 위치되는 포획 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 연결된다. 포획 올리고뉴클레오티드는 또한 본 명세서에 기술된 바와 같이 임의의 인-시츄 검출가능한 바코드일 수 있는 바코드 (1325); 선택적 UMI (1335); 시퀀성 어댑터 서열 (1340); Not1 제한효소 부위 서열 및 이 예에서 RNA 용 포괄 포획 서열, 폴리T인 포획 서열 (1350) (3'말단에 2개의 추가적인 뉴클레오티드, Vn을 가질 수 있음)을 포함한다. Not1 서열 (1345)은 포획 서열 (1350)에 대해 5'이고, 바코드 (1325), 프라이밍 서열 (1320), 시퀀싱 어댑터 (1340) 및 임의의 UMI (1335)에 대해 3'이다. 포획 올리고뉴클레오티드는 소스 세포의 세포막의 용해 시 방출되는 관심 RNA 서열 (1301)(폴리A 서열 (1350')이외의 것)을 갖는 RNA (505)를 포획하도록 구성된다. RNA는 이의 폴리A 서열 (1350')이 포획 객체의 폴리T 포획 서열 (1350)에 하이브리드화되어, 변형된 포획 객체 (1330')를 형성함으로써 포획 객체에 포획된다. 주형 스위칭 올리고뉴클레오티드 (1306)의 존재 하에서, 역전사 박스 (1365)는 cDNA 장식된 포획 객체를 제공하고, 여기서 포획 올리고뉴클레오티드는 이제 역전사된 핵산의 영역 (1355)을 함유한다. cDNA에 도입되는 주형 스위칭 올리고뉴클레오티드의 일부분 (1307) 및 프라이밍 서열 1 (1320)에 대한 포괄 프라이머 (1311, 1312) (표 6, SEQ ID NO. 113 참조)를 사용하는, PCR을 통한 cDNA의 증폭은 증폭된 DNA 라이브러리 (1370)를 제공한다. 프라이머 (1302) (DNA (1370))의 프라이밍 서열 1 (1320)에 대한 서열 (1320)을 가짐); 선택적 풀 인덱스 (1305) 및 시퀀싱 프라이밍 서열 2 (1304) 및 BCR 서열에 대해서만 선택하고, 종 의존적인 BCR 선택적 프라이머 (1303)를 사용하는 선택 PCR (1375). BCR 선택적 프라이머 (1303)는 중쇄 또는 경쇄 영역 (1356)을 표적으로 할 수 있는 프라이머의 혼합물일 수 있다 (표 6, SEQ ID No. 114-150 참조). 생성물 선택된 DNA (1380)는 증폭 생성물 (1370)에 대해서 상기에 열거된 바와 같은 프라이밍 서열, UMI, 바코드 서열을 갖지만, DNA 단편은 이제 BCR 영역 (1357)만을 함유하고, 여기서 BCR 영역 (1357)의 5' 대부분의 영역은 연결 (J) 영역 (1352) (실험 중인 종에 존재하는 경우); 다양성 (D) 하위-영역 (1353), 및 마지막으로, 3'말단에 가변 (V) 영역 (1354)과 함께, BCR의 전체 길이 불변 (C) 하위-영역 (1351)이다.
더 많은 관심의 BCR 하위-영역 (V, D, J)을 시퀀싱 분석으로 잘 처리되게 하기 위해서, 재배열이 수행된다. 선택된 DNA (1380)는 결찰을 통해 원형화되어서 도 13B에서의 원형화된 DNA 라이브러리 (1385)가 생성된다. 원형화된 DNA 라이브러리 (1385)는 이후에 Not1 제한효소 부위 (1345) (검은색 화살표)에서 분해되어 재선형화된 DNA 라이브러리 (1390)가 생성된다. 원형화 및 재선형화의 효과는 더 많은 관심의 BCR 하위-영역 (V, D, J)을 시퀀싱 프라이밍 부위에 더 가깝게 오게 하여서 더 높은 품질의 판독치를 획득할 수 있다는 것이다. 재선형화된 DNA 라이브러리 (1390)에서, 5'에서 3'으로 BCR 하위-영역 서열의 순서가 반전되고, 가변 (V) 영역 (1354)이 이제는 모든 BCR 하위-영역의 5'말단을 향해 배치되어, 3' 방향의 순서로 다양성 (D) 하위-영역 (1353); 연결 (J) 영역 (1352) (실험 중인 종에 존재하는 경우); 및 마지막으로, BCR 영역 서열 (1357)의 3' 대부분의 섹션의 전체 길이 불변 (C) 하위-영역 (1351)이 오게 된다.
하위-선택 PCR (1394)가 그 다음으로 수행되고, 선택 영역 (1351") 및 프라이머 서열 (1360)을 포함하는 프라이머 (1308) 이 불변 (C) 하위-영역의 서열 (1351')을 향해 유도된다. 서열 (135')은 많은 C 하위-영역을 잘라내기 위해서 C 하위-영역)의 5'말단에 가깝도록 선택된다. 이것은 역시 프라이밍 서열 (1360)이 첨가된, 하위-선택된 DNA 라이브러리 (1395)를 산출한다. 하위-선택된 BCR 영역은 이제 시퀀싱 프라이밍 부위와 더 나은 병치로 놓여지게 하고, 1) 폴리T 서열 (1350)을 전체로 제거하고 2) BCR C 하위-영역의 실질적인 영역을 제거하여 V, D 및 J 영역으로 높은 품질 판독 및 판독 길이를 가능하게 한다. 시퀀싱 (1396)은 하위-선택된 DNA 라이브러리 (1395)에 대해 수행되고, 바코드 (1325) 및 선택적 UMI (1335)의 제1 판독치를 산출한다. 시퀀싱 (1392)은 선택적 풀 인덱스를 판독한다. 시퀀싱 (1393 및 1397)은 하위-선택된 BCR (1357')을 판독한다.
시퀀싱 라이브러리를 생성시키기 위한 임의 방법이 또한 격리 펜에 둘 이상의 포획 객체를 도입시켜서 수행될 수 있다. 둘 이상의 포획 객체의 각각은 서열을 비롯하여, 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 카세트형 서브-유닛을 포함하는 세포-연관 바코드를 갖는 둘 이상의 포획 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 포획 객체의 각각은 동일한 바코드를 가질 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 둘 이상의 포획 객체가 동일한 펜에 도입된 경우에, 각각의 포획 객체는 상이한 세포-연관 바코드를 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, 둘 이상의 포획 객체의 각각은 동일한 세포-연관 바코드를 가질 수 있다. 하나를 초과하는 포획 객체의 사용은 더 많은 핵산 포획능을 가능하게 할 것이다. 본 명세서에 기술된 인-시츄 식별 방법은 하나의 격리 펜 내에서 둘 이상의 포획 객체를 식별하기 위해 쉽게 연장될 수 있다.
미세유체 장치 및 이러한 장치의 가동 및 관찰을 위한 시스템. 도 1A는 생물학적 미세-객체를 유지, 단리, 어세이 또는 배양하는데 사용될 수 있는 미세유체 장치 (100) 및 시스템 (150)의 예를 예시한다. 미세유체 장치 (100)의 투시도는 미세유체 장치 (100) 내에 부분도를 제공하도록 이의 덮개부 (110)의 부분 컷-어웨이를 갖게 도시되어 있다. 미세유체 장치 (100)는 일반적으로 유체 매질 (180)이 그를 통해서 흐를 수 있고, 임의로 미세유체 회로 (120) 안으로 및/또는 그를 통해서 하나 이상의 미세-객체 (도시하지 않음)를 운반하는, 유로 (106)를 포함하는 미세유체 회로 (120)를 포함한다. 하나의 미세유체 회로 (120)가 도 1A에 예시되어 있지만, 적합한 미세유체 장치는 다수 (예를 들어, 2 또는 3)의 이러한 미세유체 회로를 포함할 수 있다. 관계없이, 미세유체 장치 (100)는 나노유체 장치이도록 구성될 수 있다. 도 1A 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120)는 다수의 미세유체 격리 펜 (124, 126, 128, 및 130)을 포함할 수도 있고, 여기서 각각의 격리 펜은 유로 (106)와 유체 연통되는 하나 이상의 개구들을 구비할 수도 있다. 도 1A의 장치의 일부 실시형태에서, 격리 펜은 유로 (106)와 유체 연통된 오직 하나의 개구만을 구비해도 된다. 하기에서 더욱 기술하는 바와 같이, 미세유체 격리 펜은 매질 (180)이 유로 (106)를 통해서 흐르고 있을 때에도, 미세유체 장치, 예컨대 미세유체 장치 (100)에 미세-객체를 보유하기 위해 최적화된 다양한 특징 및 구조를 포함한다. 하지만, 전술한 내용으로 되돌아가기 전에, 미세유체 장치 (100) 및 시스템 (150)에 관한 간략한 설명을 제공한다.
도 1A에서 일반적으로 예시되어 있는 바와 같이, 미세유체 회로 (120)는 인클로저 (102)에 의해 한정된다. 인클로저 (102)는 상이한 구성으로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1A에 도시된 예에서, 인클로저 (102)는 지지 구조체 (104)(예를 들어, 베이스), 미세유체 회로 구조체 (108) 및 덮개부 (110)를 포함하는 것으로 도시되어 있다. 지지 구조체 (104), 미세유체 회로 구조체 (108), 및 덮개부 (110)는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 구조체 (108)는 지지 구조체 (104)의 내면 (109) 상에 배치될 수 있고, 덮개부 (110)는 미세유체 회로 구조체 (108) 상에 배치될 수 있다. 지지 구조체 (104) 및 덮개부 (110)와 함께, 미세유체 회로 구조체 (108)는 미세유체 회로 (120)의 엘리먼트를 한정할 수 있다.
도 1A에 예시된 바와 같이 지지 구조체 (104)는 하부에 존재할 수 있고 덮개부 (110)는 미세유체 회로 (120)의 상부에 존재할 수 있다. 대안적으로, 지지 구조체 (104) 및 덮개부 (110)는 다른 배향으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조체 (104)는 상부에 존재할 수 있고, 덮개부 (110)는 미세유체 회로 (120)의 하부에 존재할 수 있다. 무관하게, 각각이 인클로저 (102)의 내부 또는 외부로의 통로를 포함하는 하나 이상의 포트 (107)가 존재할 수 있다. 통로의 예는 밸브, 게이트, 관통홀 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107)는 미세유체 회로 구조체 (108)의 갭에 의해 생성되는 관통홀이다. 그러나, 포트 (107)는 인클로저 (102)의 다른 성분, 예컨대 덮개부 (110)에 위치될 수 있다. 오직 하나의 포트 (107)가 도 1A에 예시되어 있지만 미세유체 회로 (120)는 둘 이상의 포트 (107)를 구비할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120)로 진입하는 유체를 위한 입구부로서 기능하는 제1 포트 (107)가 존재할 수 있고, 미세유체 회로 (120)를 빠져 나가는 유체를 위한 출구부로서 기능하는 제2 포트 (107)가 존재할 수 있다. 포트 (107)가 입구부 또는 출구부로서 기능하는지 여부는 유체가 유로 (106)를 통해서 흐르는 방향에 의존적일 수 있다.
지지 구조체 (104)는 하나 이상의 전극 (도시하지 않음) 및 기판 또는 다수의 상호접속 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조체 (104)는 하나 이상의 반도체 기판을 포함할 수 있고, 이들 각각은 전극과 전기적으로 접속된다 (예를 들어, 반도체 기판의 전부 또는 서브세트가 단일 전극과 전기적으로 접속할 수 있음). 지지 구조체 (104)는 인쇄 회로 보드 어셈블리 ("PCBA")를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들)은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조체 (108)는 미세유체 회로 (120)의 회로 엘리먼트를 한정할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트는 미세유체 회로 (120)가 유체로 채워질 때 유체적으로 상호접속될 수 있는 공간 또는 영역, 예컨대 흐름 영역 (하나 이상의 흐름 채널일 수 있거나 또는 그를 포함할 수 있음), 챔버, 펜, 트램 등을 포함할 수 있다. 도 1A에 예시된 미세유체 회로 (120)에서, 미세유체 회로 구조체 (108)는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116)를 포함한다. 프레임 (114)은 미세유체 회로 재료 (116)를 부분적으로 또는 완전하게 봉입시킬 수 있다. 프레임 (114)은 예를 들어 미세유체 회로 재료 (116)를 실질적으로 둘러싸는 비교적 강성인 구조체일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114)은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116)는 미세유체 회로 (120)의 상호접속 및 회로 엘리먼트를 한정하기 위해서 캐비티 등으로 패턴화될 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116)는 가스 투과될 수 있는, 탄성 재료, 예컨대 탄성 중합체 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS") 등)을 포함할 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116)를 구성할 수 있는 재료의 다른 예는 몰딩 유리, 식각가능 재료 예컨대 실리콘 (광-패턴화가능 실리콘 또는 "PPS"), 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 재료- 및 그에 따른 미세유체 회로 재료 (116)-는 강성일 수 있고/있거나 가스에 실질적으로 불투과성일 수 있다. 무관하게, 미세유체 회로 재료 (116)는 지지 구조체 (104) 위 및 프레임 (114) 내부에 배치될 수 있다.
덮개부 (110)는 프레임 (114) 및/또는 미세유체 회로 재료 (116)의 일체부일 수 있다. 대안적으로, 덮개부 (110)는 도 1A에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개인 엘리먼트일 수 있다. 덮개부 (110)는 프레임 (114) 및/또는 미세유체 회로 재료 (116)와 동일하거나 또는 상이한 재료를 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조체 (104)는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116)와는 별개의 구조체일 수 있거나, 또는 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116)의 일체부일 수 있다. 비슷하게, 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116)는 도 1A에 도시된 바와 같이 별개의 구조체일 수 있거나 또는 동일 구조체의 일체부일 수 있다.
일부 실시형태에서, 덮개부 (110)는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리일 수 있거나 또는 유사한 속성의 재료일 수도 있다. 일부 실시형태에서, 덮개부 (110)는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형가능한 재료는 중합체, 예컨대 PDMS일 수 있다. 일부 실시형태에서, 덮개부 (110)는 강성 및 변형가능 재료 둘 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 덮개부 (110)의 하나 이상의 부분 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 130) 상에 위치된 하나 이상의 부분)은 덮개부 (110)의 강성 재료와 접하는 변형가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 덮개부 (110)는 하나 이상의 전극을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극은 유리 또는 유사하게 절연성인 재료 상에 코팅될 수 있는, 전도성 산화물, 예컨대 인듐-주석-산화물 (ITO)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 전극은 변형가능한 재료, 예컨대 중합체 (예를 들어, PDMS)에 매립되는, 탄성 전극, 예컨대 단일-벽 나노튜브, 다중-벽 나노튜브, 나노와이어, 전기 전도성 나노입자의 클러스터, 또는 이의 조합일 수 있다. 미세유체 장치에 사용될 수 있는 탄성 전극은 예를 들어, U.S. 2012/0325665 (Chiou et al.)에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조로 본 명세서에 편입된다. 일부 실시형태에서, 덮개부 (110)는 세포 부착, 생존 및/또는 성장을 지원하기 위해서 (예를 들어, 미세유체 회로 (120)를 향해 안쪽으로 면하는 표면의 전부 또는 일부를 컨디셔닝하여) 변형될 수 있다. 변형은 합성 또는 천연 중합체의 코팅을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 덮개부 (110) 및/또는 지지 구조체 (104)는 빛에 투과성일 수 있다. 덮개부 (110)는 또한 가스 투과성인 하나 이상의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS)를 포함할 수도 있다.
도 1A는 또한 미세유체 장치, 예컨대 미세유체 장치 (100)를 가동 및 제어하기 위한 시스템 (150)을 도시한다. 시스템 (150)은 전력원 (192), 이미징 장치, 및 틸팅 장치 (190) (틸팅 모듈 (166)의 일부)를 포함한다.
전력원 (192)은 필요에 따라서, 바이어스 전압 또는 전류를 제공하는, 미세유체 장치 (100) 및/또는 틸팅 장치 (190)에 전력을 제공할 수 있다. 전력원 (192)은 예를 들어, 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 소스를 포함할 수 있다. 이미징 장치 (하기 기술되는, 이미징 모듈 (164)의 일부)는 미세유체 회로 (120) 내부의 이미지를 캡처하기 위한 장치, 예컨대 디지탈 카메라를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이미징 장치는 빠른 프레임율 및/또는 고감도 (예를 들어, 저조도 어플리케이션용)를 갖는 검출기를 더 포함한다. 이미징 장치는 또한 미세유체 회로 (120)로 자극 방사선 및/또는 광 빔을 유도하고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 함유된 미세-객체)로부터 반사 또는 방출되는 방사선 및/또는 광 빔을 집광하기 위한 기전을 포함할 수 있다. 방출된 광 빔은 가시 스펙트럼 내에 있을 수도 있고, 예를 들어 형광 발광을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔은 LED 또는 광역 스펙트럼 램프, 예컨대 수은 램프 (예를 들어, 고압 수은 램프) 또는 크세논 아크 램프로부터 발원되는 반사 방출을 포함할 수 있다. 도 3B와 관련하여 설명된 바와 같이, 이미징 장치는 접안 렌즈를 포함해도 되거나 또는 포함하지 않아도 되는 현미경 (또는 광학 트레인)을 더 포함해도 된다.
시스템 (150)은 미세유체 장치 (100)를 하나 이상의 회전축에 대해서 회전시키도록 구성된 틸팅 장치 (190) (하기에 기술되는 틸팅 모듈 (166)의 일부)를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 (100) (그에 따라 미세유체 회로 (120))가 수평 배향 (즉, x-축 및 y-축에 대해 0°), 수직 배향 (즉, x-축 및/또는 y-축에 대해 90°), 또는 그 사이의 임의 배향으로 유지될 수 있도록 적어도 하나의 축에 대해서 미세유체 회로 (120)를 포함하는 인클로저 (102)를 지지 및/또는 유지하도록 구성된다. 축에 대한 미세유체 장치 (100) (및 미세유체 회로 (120))의 배향은 본 명세서에서 미세유체 장치 100 (및 미세유체 회로 (120))의 "틸트"라고 한다. 예를 들어, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 (100) 를 x-축에 대해서 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90°로 또는 그 사이의 임의 각도로 틸팅시킬 수 있다. 수평 배향 (및 그에 따라 x-축 및 y-축)은 중력에 의해 정의되는 수직축에 대한 법선으로 정의된다. 틸팅 장치는 또한 x-축 및/또는 y-축에 대해서 90°보다 큰 임의의 각도까지 미세유체 장치 (100) (및 미세유체 회로 (120))를 틸팅시킬 수 있거나, 또는 미세유체 장치 (100) (및 미세유체 회로 (120))를 완전히 뒤집기 위해서 x-축 또는 y-축에 대해서 180°로 미세유체 장치 100 (및 미세유체 회로 (120))를 틸팅시킬 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태에서, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 100 (및 미세유체 회로 (120))를 유로 (106) 또는 미세유체 회로 (120)의 일부 다른 부분에 의해 한정되는 회전 축에 대해서 틸팅시킨다.
일부 예에서, 미세유체 장치 (100)는 유로 (106)가 하나 이상의 격리 펜 위에 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "위에"는 유로 (106)가 중력에 의해 정의되는 수직축 상에서 하나 이상의 격리 펜보다 높게 위치된다는 것을 의미한다 (즉, 유로 (106) 위에 격리 펜 내 객체는 유로 내 객체보다 더 높은 중력 위치 에너지를 가지게 됨). 본 명세서에서 사용되는 용어 "아래에"는 유로 (106)가 중력에 의해 정의되는 수직축 상에서 하나 이상의 격리 펜보다 낮게 위치된다는 것을 의미한다 (즉, 유로 (106) 아래에 격리 펜 내 객체는 유로 내 객체보다 낮은 중력 위치 에너지를 가지게 됨).
일부 예에서, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 (100)를 유로 (106)와 평행한 축에 대해서 틸팅시킨다. 게다가, 미세유체 장치 (100)는 유로 (106)가 격리 펜의 바로 위 또는 아래에 위치되지 않고 하나 이상의 격리 펜의 위 또는 아래에 위치되도록 90°미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 예에서, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 (100)를 유로 (106)에 수직인 축에 대해서 틸팅시킨다. 여전히 다른 예에서, 틸팅 장치 (190)는 미세유체 장치 (100)를 유로 (106)와 평행하지 않거나 또는 수직이지 않은 축에 대해서 틸팅시킨다.
시스템 (150)은 미디어 소스 (178)를 더 포함할 수 있다. 미디어 소스 (178) (예를 들어, 컨테이너, 리저버 등)는 각각이 상이한 유체 매질 (180)을 수용하기 위해서, 다수의 섹션 또는 컨테이너를 포함할 수 있다. 따라서, 미디어 소스 (178)는 도 1A에 예시된 바와 같이, 미세유체 장치 (100)의 외부에 존재하는 별개의 장치일 수 있다. 대안적으로, 미디어 소스 (178)는 미세유체 장치 (100)의 인클로저 (102) 내부에 전체로 또는 부분으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 미디어 소스 (178)는 미세유체 장치 (100)의 일부인 리저버를 포함할 수 있다.
도 1A는 또한 시스템 (150)의 일부를 구성하고 미세유체 장치 (100)와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152)의 예의 단순 블록선도 도면을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152)의 예는 미디어 소스 (178)를 제어하기 위한 미디어 모듈 (160)을 포함하는 주 제어기 (154), 미세유체 회로 (120) 내 미세-객체 (도시하지 않음) 및/또는 매질 (예를 들어, 매질 액적)의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈 (162), 이미지 (예를 들어, 디지탈 이미지)를 캡처하기 위한 이미징 장치 (예를 들어, 카메라, 현미경, 광원 또는 이의 임의 조합)를 제어하기 위한 이미징 모듈 (164), 및 틸팅 장치 (190)를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166)을 포함한다. 제어 장비 (152)는 또한, 미세유체 장치 (100)에 대한 다른 기능의 제어, 모니터링, 또는 수행을 위한 기타 모듈 (168)을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152)는 디스플레이 장치 (170) 및 입력/출력 장치 (172)를 더 포함할 수 있다.
주 제어기 (154)는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158)를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156)은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이타 또는 신호로서 저장된 기계 실행가능 명령어 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드 등)에 따라서 가동되도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제어 모듈 (156)은 하드웨어 내장 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 미디어 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 기타 모듈 (168)은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 미세유체 장치 (100) 또는 임의의 다른 미세유체 장치에 대해 수행되는 것으로 본 명세서에 기술되는 공정의 기능, 공정 작업, 동작, 또는 단계는 상기에서 기술된 바와 같이 구성되는 주 제어기 (154), 미디어 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166) 및/또는 기타 모듈들 (168) 중 어느 하나 이상을 통해서 수행될 수 있다. 유사하게, 주 제어기 (154), 미디어 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 기타 모듈들 (168)은 본 명세서에 기술된 임의의 기능, 공정, 작업, 작동 또는 단계에서 사용되는 데이타를 전송하고 수신하도록 통신적으로 커플링될 수 있다.
미디어 모듈 (160)은 미디어 소스 (178)를 제어한다. 예를 들어, 미디어 모듈 (160)은 인클로저 (102) 안으로 선택된 유체 매질 (180)을 입력하도록 (예를 들어, 입구 포트 (107)를 통함) 미디어 소스 (178)를 제어할 수 있다. 미디어 모듈 (160)은 또한 인클로저 (102)로부터 매질의 제거 (예를 들어, 출구 포트 (도시하지 않음)를 통함)를 제어할 수 있다. 따라서 하나 이상의 매질이 미세유체 회로 (120)로 선택적으로 입력되고 제거될 수 있다. 미디어 모듈 (160)은 또한 미세유체 회로 (120) 내부의 유로 (106) 내에서 유체 매질 (180)의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 미디어 모듈 (160)은 틸팅 모듈 (166)이 틸팅 장치 (190)에 의해 미세유체 장치 (100)를 원하는 경사각까지 틸팅시키기 이전에 유로 (106) 내에서 인클로저 (120)를 통하는 매질 (180)의 흐름을 중지시킨다.
동기 모듈 (162)은 미세유체 회로 (120) 내에서 미세-객체 (도시하지 않음)의 선택, 포집 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1B 및 1C에 대해 하기에 기술된 바와 같이, 인클로저 (102)는 유전영동 (DEP), 광전자 트위저 (OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1A에 도시되지 않음)을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162)은 유로 (106) 및/또는 격리 펜 (124, 126, 128, 130)에서 미세-객체 (도시되지 않음) 및/또는 매질 액적 (도시되지 않음)을 선택하고 이동시키기 위해 트랜지스터 (예를 들어, 포토트랜지스터) 및/또는 전극의 활성화를 제어할 수 있다.
이미징 모듈 (164)은 이미징 장치를 제어할 수 있다. 예를 들어, 이미징 모듈 (164)은 이미징 장치로부터 이미지 데이타를 수신하여 처리할 수 있다. 이미징 장치로부터의 이미지 데이타는 이미징 장치에 의해 캡처된 임의의 정보 유형 (예를 들어, 미세-객체, 매질 액적, 검출가능한 표지, 예컨대 형광성 표지의 축적 등의 존재 또는 부재)을 포함할 수 있다. 이미징 장치에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 이미징 모듈 (164)은 미세유체 장치 (100) 내에서 객체 (예를 들어, 미세-객체, 매질 액적)의 위치 및/또는 이러한 객체의 운동 속도를 더 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166)은 틸팅 장치 (190)의 틸팅 작동을 제어할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 틸팅 모듈 (166)은 중력을 통해서 하나 이상의 격리 펜으로 미세-객체의 전달을 최적화하기 위해 틸팅 속도 및 시기를 제어할 수 있다. 틸팅 모듈 (166)은 미세유체 회로 (120) 내에서 미세-객체 및/또는 매질 액적의 움직임을 설명하는 데이타를 수신하기 위해서 이미징 모듈 (164)과 통신가능하게 커플링된다. 이러한 데이타를 사용하여, 틸팅 모듈 (166)은 미세-객체 및/또는 매질 액적이 미세유체 회로 (120)에서 이동하는 속도를 조정하기 위해 미세유체 회로 (120)의 틸트를 조정할 수 있다. 틸팅 모듈 (166)은 또한 이러한 데이타를 사용하여 미세유체 회로 (120)에서 미세-객체 및/또는 매질 액적의 위치를 반복적으로 조정할 수 있다.
도 1A에 도시된 예에서, 미세유체 회로 (120)는 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (124, 126, 128, 130)을 포함하는 것으로 예시된다. 각각의 펜은 채널 (122)에 대한 개구를 포함하지만, 그렇지 않으면 다른 펜 또는 채널 (122)의 유로 (106) 내 유체 매질 (180) 및/또는 미세-객체로부터 펜 내부의 미세-객체를 펜에 실질적으로 고립시킬 수 있도록 밀봉된다. 격리 펜의 벽은 기부의 내부 표면 (109)으로부터 덮개부 (110)의 내부 표면으로 연장되어서 인클로저를 제공한다. 미세유체 채널 (122)에 대한 펜의 개구는 흐름 (106)이 펜으로 유도되지 않도록 유체 매질 (180)의 흐름 (106)에 대해 일정 각도로 배향된다. 흐름은 펜의 개구 평면에 대해서 직교하거나 또는 탈선될 수 있다. 일부 예에서, 펜 (124, 126, 128, 130)은 미세유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 미세-객체를 물리적으로 가두도록 구성된다. 본 개시에 따른 격리 펜은 하기에 상세하게 기술하고 도시하게 되는 바와 같이 DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 및/또는 중력과 함께 사용하기 위해 최적화된 다양한 형상, 표면 및 피처를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120)는 임의 개수의 미세유체 격리 펜을 포함할 수도 있다. 5개의 격리 펜들이 도시되어 있지만, 미세유체 회로 (120)는 더 적거나 또는 더 많은 격리 펜을 구비할 수도 있다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120)의 미세유체 격리 펜 (124, 126, 128, 및 130)은 각각이 생물학적 미세-객체를 유지, 고립, 분석 또는 배양하기 위해 유용한 하나 이상의 이익들을 제공할 수도 있는 상이한 피처 및 형상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 회로 (120)는 다수의 동일한 미세유체 격리 펜을 포함한다.
도 1A에 예시된 실시형태에서, 단일 채널 (122) 및 유로 (106)가 도시되어 있다. 그러나, 다른 실시형태는 각각이 유로 (106)를 포함하도록 구성되는, 다수의 채널 (122)을 함유할 수 있다. 미세유체 회로 (120)는 유로 (106) 및 유체 매질 (180)과 유체 연통되는 입구부 밸브 또는 포트 (107)를 더 포함하고, 그리하여 유체 매질 (180)은 입구 포트 (107)를 통해서 채널 (122)에 접근할 수 있다. 일부 예에서, 유로 (106)는 단일 경로를 포함한다. 일부 예에서, 단일 경로는 지그재그 패턴으로 배열되어 그에 의해 유로 (106)가 교차 방향으로 2회 이상 미세유체 장치 (100)를 가로질러 이동한다.
일부 예에서, 미세유체 회로 (120)는 다수의 병렬 채널 (122) 및 유로 (106)를 포함하고, 여기서 각각의 유로 (106) 내 유체 매질 (180)은 동일한 방향으로 흐른다. 일부 예에서, 각각의 유로 (106) 내의 유체 매질은 전방향 또는 역방향 중 적어도 하나로 흐른다. 일부 예에서, 다수의 격리 펜은 격리 펜들이 표적 미세-객체를 동시에 로딩할 수 있도록 구성된다 (예를 들어, 채널 (122)에 대함).
일부 실시형태에서, 미세유체 회로 (120)는 하나 이상의 미세-객체 포집부 (132)를 더 포함한다. 포집부 (132)는 일반적으로 채널 (122)의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 미세유체 격리 펜 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구 반대편에 위치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 포집부 (132)는 유로 (106)로부터 단일 미세-객체를 수용하거나 또는 포획하도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 포집부 (132)는 유로 (106)로부터 다수의 미세-객체들을 수용하거나 또는 포획하도록 구성된다. 일부 예에서, 포집부 (132)는 단일 표적 미세-객체의 부피와 대략 균등한 부피를 포함한다.
포집부 (132)는 포집부 (132)로의 표적 미세-객체의 흐름을 보조하도록 구성된 개구를 더 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포집부 (132)는 단일 표적 미세-객체의 치수와 대략 균등한 높이 및 너비를 구비하는 개구를 포함하고, 그리하여 더 큰 미세-객체가 미세-객체 포집부로 진입하는 것을 방지한다. 포집부 (132)는 포집부 (132) 내에서 표적 미세-객체의 체류를 보조하도록 구성된 다른 피처를 더 포함할 수 있다. 일부 예에서, 포집부 (132)는 미세유체 격리 펜의 개구에 대해서 채널 (122)의 반대측 면과 정렬되어 그 위에 위치되어서, 미세유체 채널 (122)에 대해서 평행한 축에 대해서 미세유체 장치 (100)를 틸팅 시에, 포집된 미세-객체는 이 미세-객체가 격리 펜의 개구로 낙하해 들어가게 되는 궤적으로 트랩 (132)을 빠져나가게 된다. 일부 예에서, 포집부 (132)는 포집부 (132)를 통과하는 흐름을 촉진하고 그리하여 포집부 (132) 내에 미세-객체가 포획될 가능성을 증가시키기 위해서 표적 미세-객체보다 더 작은 측면 통로 (134)를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP)력은 하나 이상의 전극 (도시되지 않음)을 통해 (예를 들어, 유로 및/또는 격리 펜 내) 유체 매질 (180)을 가로질러 인가되어서 그 안에 위치된 미세-객체가 조작되고, 수송되고, 분리되고 분류된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 단일 미세-객체를 유로 (106)로부터 원하는 미세유체 격리 펜으로 전달하기 위해서 미세유체 회로 (120)의 하나 이상의 부분에 DEP력이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 력은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 미세-객체가 그로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태에서, DEP 력은 본 개시의 실시형태에 따라서 이전에 수집된 격리 펜으로부터 미세-객체를 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, DEP 력은 광전 트위저 (OET)력을 포함한다.
다른 실시형태에서, 광전기습윤 (OEW) 력은 하나 이상의 전극 (도시되지 않음)을 통해서 미세유체 장치 (100)의 지지 구조체 (104) (및/또는 덮개부 (110)) 내에서 하나 이상의 위치 (예를 들어, 유로 및/또는 격리 펜을 한정하는데 도움이 되는 위치)에 인가되어 미세유체 회로 (120)에 위치된 액적을 조작하고, 이송하고, 분리하고 분류하게 된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, OEW 력은 단일 액적을 유로 (106)로부터 원하는 미세유체 격리 펜으로 전달하기 위해서 지지 구조체 (104) (및/또는 덮개부 (110)) 내 하나 이상의 위치에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 력은 격리 펜 (예를 들어, 격리 펜 (124, 126, 128, 또는 130)) 내 액적이 그로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태에서, OEW 력은 본 개시의 실시형태에 따라서 이전에 수집된 격리 펜으로부터 액적을 선택적으로 제거하는데 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 력은 미세유체 회로 (120) 내의 미세-객체 및/또는 액적을 조작, 이송, 분리 및 분류하기 위해서, 다른 힘, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 조합된다. 예를 들어, 인클로저 (102)는 유로 (106) 및 그 안에 위치된 미세-객체가 미세유체 격리 펜 위에 위치되도록 (예를 들어, 틸팅 장치 (190)에 의해서) 틸팅될 수 있고, 중력이 미세-객체 및/또는 액적을 펜으로 이송시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, DEP 및/또는 OEW 력은 다른 힘들 이전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 력은 다른 힘들 이후에 인가될 수 있다. 여전히 다른 예에서, DEP 및/또는 OEW 력은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교대식으로 인가될 수 있다.
도 1B, 도 1C, 및 도 2A-2H는 본 개시의 실시형태의 실시에서 사용될 수 있는 미세유체 장치의 다양한 실시형태를 예시한다. 도 1B는 미세유체 장치 (200)가 광학적으로 작동되는 동전기적 장치로서 구성된 실시형태를 도시한다. 광전 트위저 (OET) 구성을 갖는 장치 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 장치를 포함하여, 다양한 광학적으로 작동되는 동전기적 장치들이 당분야에 공지되어 있다. 적합한 OET 구성의 예는 다음의 미국 특허 문서들에 예시되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다: 미국 특허 제RE 44,711호 (Wu et al.) (본래는 미국 특허 제7,612,355호로 발행); 및 미국 특허 제7,956,339호 (Ohta et al.). OEW 구성의 예는 미국 특허 제6,958,132호 (Chiou et al.) 및 미국 공개 특허 출원 제2012/0024708호 (Chiou et al.)에 예시되어 있고, 이들 둘 모두는 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다. 광학적으로 작동되는 동전기적 장치의 또 다른 예는 결합형 OET/OEW 구성을 포함하고, 이의 예는 미국 특허 공보 제 20150306598호 (Khandros 등) 및 제 20150306599호 (Khandros 등) 및 그들의 대응 PCT 공개 특허 출원 WO2015/164846 및 WO2015/164847에 도시되어 있고, 이들 전부는 그들 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
생물학적 미세-객체들이 배치, 배양, 및/또는 모니터링될 수 있는 펜들을 구비하는 미세유체 장치의 예는 예를 들어 US 2014/0116881 (2013년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제14/060,117호), US 2015/0151298 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제14/520,568호), 및 US 2015/0165436 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제14/521,447호)에 기술되어 있고, 이들 각각은 그의 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다. 미국 출원 번호 제14/520,568호 및 제14/521,447호는 또한 미세유체 장치에서 배양된 세포들의 분비물을 분석하는 예시적인 방법을 기술한다. 전술한 출원들 각각은 유전영동 (DEP) 력, 예컨대 광전 트위저 (OET)를 생성시키도록 구성되거나 또는 광-전기습윤성 (OEW)을 제공하도록 구성된 미세유체 장치를 더욱 기술하고 있다. 예를 들어, US 2014/0116881의 도 2에 예시된 광전 트위저 장치는 개별적인 생물학적 미세-객체 또는 생물학적 미세-객체의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 개시의 실시형태에서 활용될 수 있는 장치의 예이다.
미세유체 장치 동기 구성. 상기에 기술된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링 장비는 미세유체 장치의 미세유체 회로에서, 객체, 예컨대 미세-객체 또는 액적을 선택하고 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 장치는 이동하게 되는 객체의 유형 및 다른 고려사항들에 의존하여, 다양한 동기 구성을 구비할 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 미세-객체를 선택하고 이동시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 미세유체 장치 (100)의 지지 구조체 (104) 및/또는 덮개부 (110)는 미세유체 회로 (120) 내 유체 매질 (180) 중 미세-객체에 대해 DEP 력을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있고, 그리하여 개별적인 미세-객체 또는 미세-객체의 그룹을 선택하고/하거나, 포획하고/하거나, 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 장치 (100)의 지지 구조체 (104) 및/또는 덮개부 (110)는 미세유체 회로 (120) 내 유체 매질 (180) 중 액적에 대해서 EW 력을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함할 수 있고, 그리하여 개별적인 액적 도는 액적의 그룹을 선택하고/하거나, 포획하고/하거나, 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 장치 (200)의 일례는 도 1B 및 도 1C에 예시되어 있다. 단순함을 위해서, 도 1B 및 도 1C는 영역/챔버 (202)를 구비한 미세유체 장치 (200)의 인클로저 (102)의 일부분의 측단면도 및 평면 단면도를 개별적으로 도시하였지만, 영역/챔버 (202)는 보다 상세한 구조를 구비한 유체 회로 엘리먼트의 일부분, 예컨대 성장 챔버, 격리 펜, 흐름 영역, 또는 흐름 채널일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 뿐만 아니라, 미세유체 장치 (200)는 다른 유체 회로 엘리먼트를 포함해도 된다. 예를 들어, 미세유체 장치 (200)는 다수의 성장 챔버 또는 격리 펜 및/또는 하나 이상의 흐름 영역 또는 흐름 채널, 예컨대 미세유체 장치 (100)에 대해서 본 명세서에 기술된 것들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 미세유체 장치 (200)의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트에 통합될 수 있거나, 또는 이의 일부분을 선택할 수 있다. 임의의 상기 또는 하기에 기술된 미세유체 장치 성분 및 시스템 성분은 미세유체 장치 (200)에 통합될 수 있고/있거나 결합되어 사용될 수 있다는 것을 더욱 인정해야 한다. 예를 들어, 상기에 기술된 제어 및 모니터링 장비 (152)를 포함하는 시스템 (150)은 미디어 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 이미징 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 기타 모듈 (168) 중 하나 이상을 포함하는 미세유체 장치 (200)와 함께 사용될 수도 있다.
도 1B에 도시된 바와 같이, 미세유체 장치 (200)는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 놓인 전극 활성화 기판 (206)을 구비한 지지 구조체 (104), 및 상단 전극 (210)으로서, 하단 전극 (204)으로부터 간격을 둔 상단 전극 (210)을 구비한 덮개부(110)를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206)은 영역/챔버 (202)의 반대 표면을 한정한다. 따라서 영역/챔버 (202)에 포함된 매질 (180)은 상단 전극 (210)과 전극 활성화 기판 (206) 간의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210)과 접속되고 영역/챔버 (202)에서 DEP 력의 발생에 요구되는 전극간 바이어스 전압을 생성하도록 구성된 전력원 (212)가 또한 도시되어 있다. 전력원 (212)은 예를 들어, 교류(AC) 전력원일 수 있다.
특정한 실시형태에서, 도 1B 및 도 1C에 예시된 미세유체 장치 (200)는 광학적으로-작동되는 DEP 구성을 구비할 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162)에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 유래 광 (218)의 패턴을 변화시키는 것은 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)의 영역 (214)에서 DEP 전극의 패턴 변화를 선택적으로 활성화시킬 수 있고 비활성화시킬 수 있다 (본 명세서에서 DEP 구성을 구비한 미세유체 장치의 영역 (214)은 "DEP 전극 영역"이라고 함). 도 1C에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208) 상으로 유도되는 광 패턴 (218)은 패턴, 예컨대 사각형으로 DEP 전극 영역 (214a)(흰색으로 도시됨)을 선택하여 조사될 수 있다. 비-조사된 DEP 전극 영역 (214)(크로스-해칭)은 이하에서 "다크 (dark)" DEP 전극 영역 (214)이라고 한다. DEP 전극 활성화 기판 (206)을 통한 (즉, 하단 전극 (204)으로부터 흐름 영역 (106) 내 매질 (180)과 접하는 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)까지) 상대적 전기 임피던스는 각각의 다크 DEP 전극 영역 (214)에서 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180)을 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)으로부터 덮개부 (110)의 상단 전극 (210)까지) 상대적 전기 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조사된 DEP 전극 영역 (214a)은 각각의 조사된 DEP 전극 영역 (214a)에서의 영역/챔버 (202) 내의 매질 (180)을 통한 상대적 임피던스보다 낮은 전극 활성화 기판 (206)을 통한 감소된 상대적 임피던스를 나타낸다.
전력원 (212)이 활성화되면, 상기 DEP 구성은 조사된 DEP 전극 영역들 (214a) 및 인접한 다크 DEP 전극 영역 (214) 사이의 유체 매질 (180) 에서 전계 구배를 생성시키고, 이것은 이어서 유체 매질 (180) 내 가까운 미세-객체 (도시하지 않음)를 끌어당기거나 또는 밀어내는 국부 DEP 력을 생성시킨다. 따라서 유체 매질 (180) 내 미세-객체를 끌어당기거나 또는 밀어내는 DEP 전극은 광원 (216)으로부터 미세유체 장치 (200)로 투사되는 광 패턴 (218)을 변화시킴으로써 영역/챔버 (202)의 내부 표면 (208)의 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역 (214)에서 선택적으로 활성화될 수 있고 비활성화될 수 있다. DEP 력이 가까운 미세-객체를 끌어당기거나 또는 밀어내는지 여부는 전력원 (212)의 주파수 및 매질 (180) 및/또는 미세-객체의 유전 속성과 같은 매개변수에 의존할 수 있다.
도 1C에 예시된 조사된 DEP 전극 영역 (214a)의 사각형 패턴 (220)은 단지 일례이다. DEP 전극 영역 (214)의 임의 패턴은 미세유체 장치 (200)로 투사되는 광 패턴(218)에 의해 조사(및 그리하여 활성화)될 수 있고, 조사/활성화된 DEP 전극 영역 (214)의 패턴은 광 패턴 (218)을 변화시키거나 또는 이동시켜서 반복적으로 변화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전극 활성화 기판 (206)은 광전도성 재료를 포함하거나 또는 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태에서, 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)은 피처리스 (featureless)일 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206)은 수소화 비정질 규소 (a-Si:H)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 약 8% 내지 40%의 수소 (100 * 수소 원자의 개수/수소 및 규소 원자의 총 개수로서 계산됨)를 포함할 수 있다. a-Si:H의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 마이크로미터의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태에서, DEP 전극 영역 (214)은 광 패턴 (218)에 따라서, 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역 (214)의 개수 및 패턴은 고정될 필요는 없지만, 광 패턴 (218)에 상응할 수 있다. 상기에 기술된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 구비한 미세유체 장치의 예는 예를 들어 미국특허 제 RE 44,711 (Wu 등)(본래 미국특허 제 7,612,355 호로 발행됨)에 기술되어 있고, 이의 전체 내용이 참조로 본 명세서에 편입된다.
다른 실시형태에서, 전극 활성화 기판 (206)은 다수의 도핑층, 전기 절연층 (또는 영역), 및 반도체 분야에 공지된 바와 같은 반도체 집적 회로를 형성하는 전기 전도층을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206)은 예를 들어, 각각의 포토트랜지스터가 DEP 전극 영역 (214)에 해당되는, 수평 쌍극성 포토트랜지스터를 포함하는 다수의 포토트랜지스터를 포함할 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206)은 포토트랜지스터 스위치에 의해 제어되는 전극 (예를 들어, 전도성 금속 전극)을 포함할 수 있고, 이러한 각각의 전극은 DEP 전극 영역 (214)에 해당된다. 전극 활성화 기판 (206)은 이러한 포토트랜지스터 또는 포토트랜지스터-제어 전극의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2B에 도시된 바와 같은 행과 열로 배열된 실질적으로 사각형인 포토트랜지스터 또는 포토트랜지스터-제어 전극의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형인 포토트랜지스터 또는 포토트랜지스터-제어 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴과 무관하게, 전기 회로 엘리먼트는 하단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)의 DEP 전극 영역 (214) 사이에 전기 접속부를 형성할 수 있고, 이들 전기 접속부 (즉, 포토트랜지스터 또는 전극)는 광 패턴 (218)에 의해 선택적으로 활성화될 수 있고 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않을 때, 각각의 전기 접속부는 전극 활성화 기판 (206) 을 통하는 (즉, 하단 전극 (204)으로부터 영역/챔버 (202) 내 매질 (180)과 접하는 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)까지) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214)에서 매질 (180)을 통하는 (즉, 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)으로부터 덮개부 (110)의 상단 전극 (210)까지) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218)의 광에 의해 활성화될 때, 전극 활성화 기판 (206)을 통하는 상대적 임피던스는 각각의 조사된 DEP 전극 영역 (214)에서의 매질 (180)을 통하는 상대적 임피던스보다 더 작고, 그리하여 상기 기술된 바와 같이 상응하는 DEP 전극 영역 (214)의 DEP 전극을 활성화시킨다. 따라서 매질 (180) 내의 미세-객체 (도시하지 않음)를 끌어당기거나 또는 밀어내는 DEP 전극은 광 패턴 (218)에 의해 결정되는 방식으로 영역/챔버 (202) 내 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)에서의 많은 상이한 DEP 전극 영역 (214)에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토트랜지스터를 포함하는 전극 활성화 기판을 구비하는 미세유체 장치의 예는 예를 들어, 미국 특허 제7,956,339호 (Ohta et al.) (예를 들어, 도 21 및 22에 예시된 장치 (300), 및 이의 설명을 참조)에 기술되어 있고, 이의 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 포토트랜지스터 스위치에 의해 제어되는 전극을 포함하는 전극 활성화 기판을 구비하는 미세유체 장치의 예는 예를 들어, 미국 특허 공보 제2014/0124370호 (Short et al.) (예를 들어, 도면 전반에 예시된 장치 (200, 400, 500, 600, 및 900), 및 이의 설명을 참조)에 기술되어 있고, 이의 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
DEP 구성된 미세유체 장치의 일부 실시형태에서, 상단 전극 (210)은 인클로저 (102)의 제1 벽 (또는 덮개부 (110))의 일부이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204)은 인클로저 (102)의 제2 벽 (또는 지지 구조체 (104))의 일부이다. 영역/챔버 (202)는 제1 벽과 제2 벽 사이에 존재할 수 있다. 다른 실시형태에서, 전극 (210)은 제2 벽 (또는 지지 구조체 (104))의 일부이고, 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 중 하나 또는 둘 모두는 제1 벽 (또는 덮개부 (110))의 일부이다. 게다가, 광원 (216)은 대안적으로 아래로부터 인클로저 (102)를 조사하는데 사용될 수 있다.
DEP 구성을 구비하는 도 1B 및 도 1C의 미세유체 장치 (200)에 있어서, 동기 모듈 (162)은 미세-객체를 둘러싸서 포획하는 패턴 (예를 들어, 사각형 패턴 (220))으로 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)의 DEP 전극 영역 (214a)에서 하나 이상의 DEP 전극의 제1 세트를 활성화시키도록 미세유체 장치 (200)로 광 패턴 (218)을 투사하여 영역/챔버 (202) 내 매질 (180) 중의 미세-객체 (도시하지 않음)를 선택할 수 있다. 그 이후에 동기 모듈 (162)은 DEP 전극 영역 (214)에서 하나 이상의 DEP 전극의 제2 세트를 활성화시키도록 미세유체 장치 (200)에 대해서 광 패턴 (218)을 이동시켜 인 시츄-생성된 포획된 미세-객체를 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 장치 (200)는 광 패턴 (218)에 대해서 이동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 미세유체 장치 (200)는 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208)에서 DEP 전극의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 구비할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206)은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예를 들어, 덮개부 (110))의 반대편에 위치되는 선택적으로 어드레싱가능하고 동력공급가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치 (예를 들어, 반도체 기판의 트랜지스터 스위치)는 DEP 전극 영역 (214)에서 DEP 전극을 활성화시키거나 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방되고 폐쇄될 수도 있어서, 활성화된 DEP 전극 근처의 영역/챔버 (202) 내 미세-객체 (도시하지 않음) 상에 순 DEP 력을 생성하게 된다. 영역/챔버 (202) 내 미세-객체 및/또는 매질 (도시하지 않음)의 유전 속성 및 전력원 (212)의 주파수와 같은 이러한 특징에 의존하여, DEP 력은 가까이의 미세-객체를 끌어당길 수 있거나 또는 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 사각형 패턴 (220)을 형성하는 DEP 전극 영역 (214)의 세트에서) DEP 전극의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내 하나 이상의 미세-객체가 영역/챔버 (202) 내에서 포집될 수 있고 이동될 수 있다. 도 1A의 동기 모듈 (162)은 이러한 스위치를 제어할 수 있고 그에 따라서 DEP 전극의 개별적인 하나들을 활성화시키고 비활성화시켜서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 미세-객체 (도시하지 않음)를 선택하고, 포집하고 이동시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능하고 동력공급가능한 전극을 포함하는 DEP 구성을 구비하는 미세유체 장치는 예를 들어 미국특허 제6,294,063호 (Becker 등) 및 제6,942,776호 (Medoro)에 기술되어 있고, 그 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
또 다른 예로서, 미세유체 장치 (200)는 DEP 구성을 대신하여 존재할 수 있거나 또는 DEP 구성을 구비한 부분으로부터 이격되어 미세유체 장치 (200)의 일부에 위치될 수 있는 전기습윤성 (EW) 구성을 구비할 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성일 수 있거나 또는 유전체상 전기습윤 (EWOD) 구성일 수도 있고, 이들 양자는 당분야에 공지되어 있다. 일부 EW 구성에서, 지지 구조체 (104)는 유전체층 (도시하지 않음) 및 하단 전극 (204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206)을 구비한다. 유전체층은 하기에 기술되는 바와 같이, 이하에 기술되는 바와 같이 소수성 재료를 포함할 수 있고/있거나 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 구비하는 미세유체 장치 (200)의 경우에, 지지 구조체 (104) 의 내부 표면 (208)은 유전체층 또는 이의 소수성 코팅부의 내부 표면이다.
유전체층 (도시되지 않음)은 하나 이상의 산화물 층을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 125 nm 내지 약 175 nm)의 두께를 가질 수 있다. 특정한 실시형태에서, 유전체층은 산화물, 예컨대 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물)의 층을 포함할 수도 있다. 특정한 실시형태에서, 유전체층은 금속 산화물 이외의 유전체 재료, 예컨대 규소 산화물 또는 질화물을 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께와 무관하게, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 영역/채널 (202)을 향해서 안쪽에서 대면하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오르화된 탄소 분자를 포함할 수 있다. 플루오르화 탄소 분자의 예는 퍼플루오로-중합체 예컨대 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라히드로퓨란) (예를 들어, CYTOP™)을 포함한다. 소수성 재료를 구성하는 분자는 유전체층의 표면에 공유적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자는 링커, 예컨대 실록산 기, 포스폰산 기, 또는 티올 기를 통해서 유전체층의 표면에 공유적으로 결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 소수성 재료는 알킬-종결 실록산, 알킬-종결 포스폰산, 또는 알킬-종결 티올을 포함할 수 있다. 일킬 기는 장쇄 탄화수소 (예를 들어, 적어도 10개 탄소, 또는 적어도 16개, 18개, 20개, 22개 또는 그 이상의 탄소의 사슬을 가짐)일 수 있다. 대안적으로, 플루오르화 (또는 퍼플루오르화) 탄소 사슬은 알킬 기 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-종결 실록산, 플루오로알킬-종결 포스폰산, 또는 플루오로알킬-종결 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅부는 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅부는 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm)의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 구비하는 미세유체 장치 (200)의 덮개부 (110)는 역시 소수성 재료 (도시되지 않음)로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조체 (104)의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅부는 지지 구조체 (104)의 유전체층상의 소수성 코팅부 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 덮개부 (110)는 지지 구조체 (104)의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206)을 포함할 수 있다. 덮개부 (110)의 유전체층 및 전극 활성화 기판 (206)은 지지 구조체 (104)의 유전체층 및 전극 활성화 기판 (206)과 동일한 조성 및/또는 치수를 가질 수 있다. 따라서, 미세유체 장치 (200)는 2 개의 전기습윤 표면을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206)은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206)은 수소화 비정질 규소 (a-Si:H)의 층을 포함할 수 있거나 또는 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H는, 예를 들어 약 8% 내지 40%의 수소 (100 * 수소 원자의 개수/수소 및 규소 원자의 총 개수로서 계산됨)를 포함할 수 있다. a-Si:H의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 마이크로미터의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206)은 상기 기술된 바와 같이, 포토트랜지스터 스위치에 의해 제어되는 전극 (예를 들어, 전도성 금속 전극)을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 미세유체 장치는 당분야에 공지되어 있고/있거나 당분야에 공지된 전극 활성화 기판으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨 미국 특허 제6,958,132호 (Chiou 등)는 광전도성 재료 예컨대 a-Si:H를 갖는 광-전기습윤 구성을 개시하는 반면, 상기에 참조된 미국 특허 공보 제2014/0124370호 (Short 등)는 포토트랜지스터 스위치에 의해 제어되는 전극을 구비한 전극 활성화 기판을 개시한다.
따라서 미세유체 장치 (200)는 광-전기습윤 구성을 구비할 수 있고, 광 패턴 (218)은 전극 활성화 기판 (206)의 광도전성 EW 영역 또는 광반응성 EW 전극을 활성화시키는데 사용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206)의 그러한 활성화된 EW 영역 또는 EW 전극은 지지 구조체 (104)의 내부 표면 (208) (즉, 중첩된 유전체층 또는 이의 소수성 코팅부의 내부 표면)에서 전기습윤력을 발생시킬 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사되는 광 패턴 (218)을 변화함으로써 (또는 광원 (216)에 대해 미세유체 장치 (200)를 이동시킴으로써), 지지 구조체 (104)의 내부 표면 (208)과 접촉하는 (예를 들어, 수성 매질, 용액, 또는 용매를 함유하는) 액적이 영역/챔버 (202)에 존재하는 비혼화성 유체 (예를 들어, 오일 매질)를 통해서 이동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 미세유체 장치 (200)는 EWOD 구성을 구비할 수 있고, 전극 활성화 기판 (206)은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능하고 동력공급가능한 전극을 포함할 수 있다. 따라서 전극 활성화 기판 (206)은 그러한 전기습윤 (EW) 전극의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2B에 도시된 바와 같은 열 및 행으로 배열된 실질적으로 사각형인 EW 전극의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형인 EW 전극 어레이일 수 있다. 패턴과 무관하게, EW 전극들은 전기 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판의 트랜지스터 스위치)에 의해 선택적으로 활성화 (또는 비활성화)될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206)의 EW 전극을 선택적으로 활성화 및 비활성화함으로써, 중첩된 유전체층 또는 이의 소수성 코팅부의 내부 표면 (208)과 접촉하는 액적 (도시되지 않음)은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1A에서 동기 모듈 (162)은 그러한 스위치를 제어할 수 있고 그에 따라 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 액적을 선택하고 이동시키기 위해 개별 EW 전극을 활성화시킬 수 있고 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능하고 동력공급가능한 전극과 EWOD 구성을 구비하는 미세유체 장치는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,685,344호 (Sundarsan 등)에 기술되었으며, 이의 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
미세유체 장치 (200)의 구성에 무관하게, 전력원 (212)은 미세유체 장치 (200)의 전기 회로에 전력을 공급하는 전위 (예를 들어, AC 전압 전위)를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전력원 (212)은 도 1에서 참조하는 전력원 (192)과 동일하거나, 그의 성분일 수 있다. 전력원 (212)은 상단 전극 (210) 및 하단 전극 (204)에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우에, 전력원 (212)은 상기 기술된 바와 같이, 영역/챔버 (202)에서 개별 미세-객체 (도시하지 않음)를 포집하고 이동시키고/시키거나, 역시 상기에 기술된 바와 같이, 영역/챔버 (202)에서 지지 구조체 (104) (즉, 유전체층 및/또는 유전체층 상의 소수성 코팅부)의 내부 표면 (208)의 습윤 속성을 변화시키는데 충분하게 강력한 순 DEP 력 (또는 전기습윤력)을 발생시키는데 충분한 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예를 들어, 전압 또는 전류)을 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,958,132호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711호 (Wu 등) (본래는 미국특허 제7,612,355호로 발행됨), 및 미국 공개 특허 출원 제US2014/0124370호 (Short 등), US 제2015/0306598호 (Khandros 등) 및 US 제2015/0306599호 (Khandros 등)를 참조한다.
격리 펜. 일반적인 격리 펜 (224, 226, 및 228)의 비제한적인 예는 도 2A-2C에 도시된 미세유체 장치 (230) 내에 도시되어 있다. 각각의 격리 펜 (224, 226 및 228)은 고립 영역 (240) 및 고립 영역 (240)을 미세유체 채널 (122)에 유체적으로 접속시키는 접속 영역 (236)을 한정하는 고립 구조체 (232)를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236)은 미세유체 채널 (122)에 대해 근위 개구 (234) 및 고립 영역 (240)에 대해 원위 개구 (238)를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236)은 채널 (122)로부터 격리 펜 (224, 226, 228)으로 흘러가는 유체 매질 (도시하지 않음)의 흐름의 최대 침투 깊이가 고립 영역 (240)으로 확대되지 않도록 구성될 수 있다. 따라서, 접속 영역 (236)으로 인해서, 격리 펜 (224, 226, 228)의 고립 영역 (240)에 배치된 미세-객체 (도시되지 않음) 또는 다른 재료 (도시되지 않음)는 미세유체 채널 (122)에서 매질 (180)의 흐름으로부터 고립될 수 있어서, 실질적으로 그에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2A-2C의 격리 펜 (224, 226, 및 228)은 각각이 미세유체 채널 (122) 에 대해 직접적으로 개방되는 단일 개구를 구비한다. 격리 펜의 개구는 미세유체 채널 (122)로부터 측방향으로 개방된다. 전극 활성화 기판 (206)은 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (224, 226, 및 228) 둘 모두의 아래에 위치된다. 격리 펜의 바닥부를 형성하는, 격리 펜의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206)의 상부 표면은 미세유체 장치의 흐름 채널 (또는 개별적으로 흐름 영역)의 바닥부를 형성하는, 미세유체 채널 (122)(또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 영역) 내의 전극 활성화 기판 (206)의 상부 표면과 동일한 평면 또는 실질적으로 동일한 평면에 배치된다. 전극 활성화 기판 (206)은 피처리스일 수도 있거나 또는 이의 최고 높이로부터 이의 최저 함몰부까지 약 3 미크론, 2.5 미크론, 2 미크론, 1.5 미크론, 1 미크론, 0.9 미크론, 0.5 미크론, 0.4 미크론, 0.2 미크론, 0.1 미크론 이하만큼 변화하는 불규칙적이거나 또는 패터닝된 표면을 가질 수도 있다. 미세유체 채널 (122) (또는 흐름 영역) 및 격리 펜 둘 모두에 걸쳐서 기판의 상부 표면의 높이 변동은 격리 펜의 벽 또는 미세유체 장치의 벽의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 미만일 수 있다. 미세유체 장치 (200)에 대해 상세하게 설명했지만, 이것은 본 명세서에 기술된 임의의 미세유체 장치 (100, 230, 250, 280, 290, 300, 700, 800, 1000)에도 역시 적용된다.
따라서, 미세유체 채널 (122)은 스웹 영역의 예일 수 있고, 격리 펜 (224, 226, 228)의 고립 영역 (240)은 비스웹 영역의 예일 수 있다. 언급된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (224, 226, 228)은 하나 이상의 유체 매질 (180)을 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2A-2B에 도시된 예에서, 포트 (222)는 미세유체 채널 (122)에 접속되고 유체 매질 (180)이 미세유체 장치 (230) 안으로 유입되거나 또는 그로부터 제거될 수 있게 한다. 유체 매질 (180)의 유입 이전에, 미세유체 장치는 이산화탄소 가스와 같은 가스로 프라이밍될 수도 있다. 미세유체 장치 (230)가 유체 매질 (180)을 함유하게 되면, 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)은 선택적으로 생성될 수 있고 중지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 포트 (222)는 미세유체 채널 (122)의 상이한 위치 (예를 들어, 반대편 말단부)에 배치될 수 있고, 매질의 흐름 (242)은 입구부로서 기능하는 하나의 포트 (222)로부터 출구부로서 기능하는 다른 포트 (222)로 생성될 수 있다.
도 2C는 본 개시에 따른 격리 펜 (224)의 일례의 상세도를 예시한다. 미세-객체 (246)의 예가 또한 도시되어 있다.
공지된 바와 같이, 격리 펜 (224)의 근위 개구 (234)를 지나는 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)은 격리 펜 (224)의 안 및/또는 밖으로의 매질 (180)의 이차 흐름 (244)을 야기할 수 있다. 격리 펜 (224)의 고립 영역 (240) 내 미세-객체 (246)를 이차 흐름 (244)으로부터 고립시키기 위해서, 격리 펜 (224)의 접속 영역 (236)의 길이 (Lcon)(즉, 근위 개구 (234)로부터 원위 개구 (238)까지)는 접속 영역 (236)으로의 이차 흐름 (244)의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야만 한다. 이차 흐름 (244)의 침투 깊이 (Dp)는 미세유체 채널 (122)에서 흐르는 유체 매질 (180)의 속도 및 미세유체 채널 (122)에 대한 접속 영역 (236)의 근위 개구 (234) 및 미세유체 채널 (122)의 구성과 관련된 다양한 매개변수에 의존적이다. 소정의 미세유체 장치의 경우에, 미세유체 채널 (122) 및 개구 (234)의 구성은 고정될 것인 반면, 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242) 속도는 가변적이게 될 것이다. 따라서, 각각의 격리 펜 (224)의 경우에, 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)에 대한 최대 속도 (Vmax)는 이차 흐름 (244)의 침투 깊이 (Dp)가 접속 영역 (236)의 길이 (Lcon)를 초과하지 않게 보장된다는 것을 확인할 수 있다. 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242) 속도가 최대 속도 (Vmax)를 초과하지 않는 한, 초래되는 이차 흐름 (244)은 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236)에 제한될 수 있고 고립 영역 (240) 밖에서 유지될 수 있다. 따라서, 미세유체 채널 (122) 내 매질 (180)의 흐름 (242)은 미세-객체 (246)를 고립 영역 (240) 밖으로 유인하지 않게 될 것이다. 그보다는, 고립 영역 (240)에 위치된 미세-객체 (246)는 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)과 무관하게, 고립 영역 (240)에 머무르게 될 것이다.
게다가, 미세유체 채널 (122) 내 매질 (180)의 흐름 (242) 속도가 Vmax 를 넘지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)은 잡다한 입자들 (예를 들어, 미립자 및/또는 나노입자)을 미세유체 채널 (122)로부터 격리 펜 (224)의 고립 영역 (240)으로 이동시키지 않을 것이다. 따라서 접속 영역 (236)의 길이 (Lcon)가 이차 흐름 (244)의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 큰 것은 미세유체 채널 (122) 또는 다른 격리 펜 (예를 들어, 도 2D의 격리 펜 (226, 228))으로부터 잡다한 입자들에 의해 하나의 격리 펜 (224)의 오염을 방지할 수 있다.
미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (224, 226, 228)의 접속 영역 (236)이 미세유체 채널 (122) 내 매질 (180)의 흐름 (242)에 의해 영향받을 수 있기 때문에, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236)이 미세유체 장치 (230)의 스웹 (또는 흐름) 영역으로 간주될 수 있다. 다른 한편으로 격리 펜 (224, 226, 228)의 고립 영역 (240)은 비스웹 (또는 비흐름) 영역으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 내 제 1 유체 매질 (180) 중의 성분 (도시되지 않음)은 미세유체 채널 (122)로부터 접속 영역 (236)을 통해서 고립 영역 (240) 내 제2 유체 매질 (248)로 제1 매질 (180)의 성분의 실질적으로 오직 확산을 통해서만 고립 영역 (240) 내 제2 유체 매질 (280)과 혼합될 수 있다. 유사하게, 고립 영역 (240) 내 제2 매질 (248) 중의 성분 (도시되지 않음)은 고립 영역 (240)으로부터 접속 영역 (236)을 통해서 미세유체 채널 (122) 내 제1 매질 (180)로, 제2 매질 (248)의 성분의 실질적으로 오직 확산에 의해서만 미세유체 채널 (122) 내 제1 매질 (180)과 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 확산에 의한 격리 펜의 고립 영역과 흐름 영역 사이의 유체 매질 교환의 정도는 유체 교환의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%를 초과하거나 또는 약 99%를 초과한다. 제1 매질 (180)은 제2 매질 (248)과 동일한 매질이거나 또는 상이한 매질일 수 있다. 게다가, 제1 매질 (180) 및 제2 매질 (248)은 동일하게 출발할 수 있고, 그 다음에 상이해질 수 있다 (예를 들어, 고립 영역 (240) 내 하나 이상의 세포에 의한 제2 매질 (248)의 컨디셔닝을 통해서, 또는 미세유체 채널 (122)을 통해 흐르는 매질 (180)을 변화시키는 것에 의함).
미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)에 의해 야기되는 이차 흐름 9244)의 최대 침투 깊이 (Dp)는 상기에 언급된 바와 같이, 수많은 매개변수에 의존적일 수 있다. 이러한 매개변수의 예는 미세유체 채널 (122)의 형상 (예를 들어, 미세유체 채널은 매질을 접속 영역 (236)으로 유도하거나, 접속 영역 (236)으로부터 매질을 멀리 우회시킬 수 있거나, 또는 접속 영역 (236)의 근위 개구 (234)에 실질적으로 수직인 방향으로 매질을 미세유체 채널 (122)로 유도할 수 있음); 근위 개구 (234)에서 미세유체 채널 (122)의 너비 (Wch)(또는 단면적); 및 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)(또는 단면적); 미세유체 채널 (122) 내 유체 매질 (180)의 흐름 (242)의 속도 (V); 제1 매질 (180) 및/또는 제2 매질 (248)의 속도 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (224, 226, 228)의 치수는 미세유체 채널 (122) 중 유체 매질 (180)의 흐름 (242)의 벡터에 대해서 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 너비 (Wch)(또는 미세유체 채널 (122)의 단면적) 매질 (180)의 흐름 (242)에 실질적으로 수직일 수 있고/있거나; 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)(또는 단면적)는 미세유체 채널 (122) 내 매질 (180)의 흐름 (242)에 실질적으로 평행할 수 있고/있거나 미세유체 채널 (122) 내 매질 (180)의 흐름 (242)에 실질적으로 수직일 수 있다. 전술한 것은 단지 예이고, 상기는 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 및 격리 펜 (224, 226, 228)의 상대적 위치는 서로에 대해 다른 배향일 수 있다.
도 2C에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)는 근위 개구 (234)로부터 원위 개구 (238)까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)는 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)에 대해 본 명세서에서 확인되는 임의의 값일 수 있다. 대안적으로, 원위 개구 (238)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)는 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon) 보다 클 수 있다.
도 2C에 예시된 바와 같이, 원위 개구 (238)에서 고립 영역 (240)의 너비는 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)와 실질적으로 동일할 수 있다. 따라서 원위 개구 (238)에서 고립 영역 (240)의 너비는 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)에 대해 본 명세서에서 확인되는 임의의 값일 수 있다. 대안적으로, 원위 개구 (238)에서 고립 영역 (240)의 너비는 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon) 보다 더 클 수 있거나 또는 더 작을 수 있다. 게다가, 원위 개구 (238)는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)는 근위 개구 (234) 및 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236)은 다양한 상이한 기하학적 구조 (예를 들어, 접속 영역의 챔퍼링, 접속 영역의 베벨링)를 사용하여, 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다.　 또한, 접속 영역 (236)의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234)에 인접한 접속 영역의 부분)이 좁아질 수도 있다.
도 2D-2F는 도 1A의 각각의 미세유체 장치 (100), 회로 (132) 및 채널 (134)의 변형들인, 미세유체 회로 (262) 및 흐름 채널 (264)을 함유하는 미세유체 장치 (400)의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 장치 (250)는 또한, 상기에 기술된 격리 펜 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228)의 추가적인 변형들인 다수의 격리 펜 (266) 을 구비한다. 특히, 도 2D-2F에 도시된 장치 (250)의 격리 펜 (266)이 장치 (100, 200, 230, 280, 290, 300, 700, 800, 1000)의 임의의 상기 기술된 임의의 격리 펜 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228)으로 대체될 수 있다. 유사하게, 미세유체 장치 (250)는 미세유체 장치 (100)의 다른 변형이고, 또한 상기 기술된 미세유체 장치 (100, 200, 230, 280, 290, 300, 700, 800, 1000)를 비롯하여 본 명세서에 기술된 임의의 다른 미세유체 시스템 성분과 동일하거나 또는 상이한 DEP 구성을 구비할 수 있다.
도 2D-2F의 미세유체 장치 (250)는 지지 구조체 (도 2D-2F에서는 보이지 않지만, 도 1A에 도시된 장치 (100)의 지지 구조체 (104)와 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조 (256), 및 덮개부 (도 2D-2F에서는 보이지 않지만, 도 1A에 도시된 장치 (100)의 덮개부 (122)와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음)를 포함한다. 미세유체 회로 구조 (256)는, 도 1A 에 도시된 장치 (100)의 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260)와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260)를 포함한다. 도 2D에 나타낸 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260 에 의해 한정되는 미세유체 회로 (262)는 다수의 격리 펜 (266)이 유체적으로 접속되는 다수의 채널 (264)(2개가 도시되어 있지만 더 많이 존재할 수 있음)을 포함할 수 있다.
각각의 격리 펜 (266)은 고립 구조 (272), 고립 구조 (272) 내의 고립 영역 (270), 및 접속 영역 (268)을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264)의 근위 개구 (274)로부터 고립 구조 (272)의 원위 개구 (276) 까지, 접속 영역 (268)은 미세유체 채널 (264)을 고립 영역 (270)에 유체적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2B 및 도 2C의 상기 설명에 따라서, 채널 (264) 내 제 1 유체 매질 (254)의 흐름 (278)은 미세유체 채널 (264)로부터 격리 펜 (266)의 각각의 접속 영역 (268) 안 및/또는 밖으로 제 1 매질 (254) 의 이차 흐름 (282)을 생성할 수 있다.
도 2E에 예시된 바와 같이, 각각의 격리 펜 (266)의 접속 영역 (268)은 일반적으로 채널 (264)에 대한 근위 개구 (274) 및 고립 구조 (272)에 대한 원위 개구 (276) 사이에서 확장되는 영역을 포함한다. 접속 영역 (268)의 길이 (Lcon)는 이차 흐름 (282)의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있는데, 이러한 경우에 이차 흐름 (282)은 고립 영역 (270)쪽으로 재유도되지 않고 접속 영역 (268)으로 확장될 것이다 (도 2D에 도시된 바와 같음). 대안으로, 도 2F에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268)은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon)를 가질 수 있고, 이러한 경우에 이차 흐름 (282)은 접속 영역 (268) 을 통해 확장될 것이고 고립 영역 (270) 을 향해서 재유도될 것이다. 후자의 상황에서, 접속 영역 (268)의 길이 (LC1 및 LC2)의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 커서, 이차 흐름 (282)이 고립 영역 (270) 으로 확장되지 않을 것이다. 접속 영역 (268)의 길이 (Lcon)가 침투 깊이 (Dp) 보다 더 크건, 또는 접속 영역 (268)의 길이 (LC1 및 LC2)의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 크건 간에, 최대 속도 (Vmax)를 초과하지 않는 미세유체 채널 (264)의 제 1 매질 (254)의 흐름 (278)은 침투 깊이 (Dp)를 갖는 이차 흐름을 생성하게 될 것이고, 격리 펜 (266)의 고립 영역 (270) 내 미세-객체 (도시되지 않지만, 도 2C에 도시된 미세-객체 (246)와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음)는 채널 (264) 내 제 1 매질 (254)의 흐름 (278)에 의해 고립 영역 (270) 밖으로 유출되지 않을 것이다. 또한, 미세유체 채널 (264)에서의 흐름 (278)은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 펜 (266)의 고립 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (도시하지 않음)을 유돌하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 미세유체 채널 (264) 내 제1 매질 (254) 중 성분들이 미세유체 채널 (264)로부터 격리 펜 (266)의 고립 영역 (270) 내 제2 매질 (258)로 이동할 수 있게 하는 유일한 기전이다. 마찬가지로, 확산은, 격리 펜 (266)의 고립 영역 (270) 내 제2 매질 (258) 중 성분들이 고립 영역 (270)으로부터 미세유체 채널 (264) 내 제1 매질 (254)로 이동할 수 있게 하는 유일한 기전이다. 제1 매질 (254)은 제2 매질 (258)과 동일한 매질일 수 있거나, 또는 제1 매질 (254)은 제2 매질 (258)과 상이한 매질일 수 있다. 대안적으로, 제1 매질 (254) 및 제2 매질 (258)은 동일하게 출발될 수 있고, 그 후에 예를 들어 고립 영역 (270) 내 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 매질의 컨디셔닝을 통해서, 또는 미세유체 채널 (264)을 통해 흐르는는 매질을 변화시킴으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2E에 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 내 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (278)에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 매질 흐름의 방향을 가로질러 취함) 미세유체 채널 (264)의 너비 (Wch)는 근위 개구 (274)의 너비 (Wcon1)에 실질적으로 수직할 수 있고 따라서 원위 개구 (276)의 너비 (Wcon2) 에 실질적으로 평행할 수 있다. 그러나, 근위 개구 (274)의 너비 (Wcon1) 및 원위 개구 (276)의 너비 (Wcon2)는 서로에 대해 실질적으로 수직일 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274)의 너비 (Wcon1)가 배향되는 축 (도시되지 않음)과 원위 개구 (276)의 너비 (Wcon2)가 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직이 아닐 수 있고 그에 따라 90°이 아닌 것일 수 있다. 다르게 배향된 각도들의 예들은 약 30°내지 약 90°, 약 45°내지 약 90°, 약 60°내지 약 90°등의 각도를 포함한다.
격리 펜 (예를 들어, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266)의 다양한 실시형태에서, 고립 영역 (예를 들어, 240 또는 270)은 다수의 미세-객체를 함유하도록 구성된다. 다른 실시형태에서, 고립 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 유사하게 상대적으로 적은 수의 미세-객체만을 함유하도록 구성될 수 있다. 따라서, 단리 영역의 부피는 예를 들어 적어도 1×106, 2×106, 4×106, 6×106 세제곱 미크론, 또는 그 이상일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 너비 (Wch)는 약 50-1000 미크론, 50-500 미크론, 50-400 미크론, 50-300 미크론, 50-250 미크론, 50-200 미크론, 50-150 미크론, 50-100 미크론, 70-500 미크론, 70-400 미크론, 70-300 미크론, 70-250 미크론, 70-200 미크론, 70-150 미크론, 90-400 미크론, 90-300 미크론, 90-250 미크론, 90-200 미크론, 90-150 미크론, 100-300 미크론, 100-250 미크론, 100-200 미크론, 100-150 미크론, 또는 100-120 미크론일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 너비 (Wch)는 약 200-800 미크론, 200-700 미크론, 또는 200-600 미크론일 수 있다. 전술한 것은 단지 예이며, 미세유체 채널 (122)의 너비 (Wch)는 임의의 상기에 열거된 종결점 내의 임의의 너비일 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122)의 너비 (Wch)는 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역 내 임의의 이들 너비이도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 격리 펜은 약 30 내지 약 200 미크론, 또는 약 50 내지 약 150 미크론의 높이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 격리 펜은 약 1×104 - 3 ×106 제곱 미크론, 2×104 - 2×106 제곱 미크론, 4×104 - 1×106 제곱 미크론, 2×104- 5×105 제곱 미크론, 2×104 - 1×105 제곱 미크론 또는 약 2×105 - 2×106 제곱 미크론의 단면적을 갖는다.
격리펜의 다양한 실시형태에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 높이 (Hch)는 임의의 하기 높이 내의 높이일 수 있다: 20-100 미크론, 20-90 미크론, 20-80 미크론, 20-70 미크론, 20-60 미크론, 20-50 미크론, 30-100 미크론, 30-90 미크론, 30-80 미크론, 30-70 미크론, 30-60 미크론, 30-50 미크론, 40-100 미크론, 40-90 미크론, 40-80 미크론, 40-70 미크론, 40-60 미크론, 또는 40-50 미크론. 전술한 것은 단지 예이고, 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 높이 (Hch)는 임의의 상기 열거된 종결점 내의 높이일 수 있다. 미세유체 채널 (122)의 높이 (Hch)는 격리 펜의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역 내 임의의 이들 높이이도록 선택될 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 단면적은 약 500-50,000 제곱 미크론, 500-40,000 제곱 미크론, 500-30,000 제곱 미크론, 500-25,000 제곱 미크론, 500-20,000 제곱 미크론, 500-15,000 제곱 미크론, 500-10,000 제곱 미크론, 500-7,500 제곱 미크론, 500-5,000 제곱 미크론, 1,000-25,000 제곱 미크론, 1,000-20,000 제곱 미크론, 1,000-15,000 제곱 미크론, 1,000-10,000 제곱 미크론, 1,000-7,500 제곱 미크론, 1,000-5,000 제곱 미크론, 2,000-20,000 제곱 미크론, 2,000-15,000 제곱 미크론, 2,000-10,000 제곱 미크론, 2,000-7,500 제곱 미크론, 2,000-6,000 제곱 미크론, 3,000-20,000 제곱 미크론, 3,000-15,000 제곱 미크론, 3,000-10,000 제곱 미크론, 3,000-7,500 제곱 미크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 미크론일 수 있다. 전술한 것은 단지 예이고, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122)의 단면적은 임의의 상기 열거된 종결점 내의 임의 면적일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태에서, 접속 영역 (예를 들어, 236)의 길이 (Lcon)는 약 1-600 미크론, 5-550 미크론, 10-500 미크론, 15-400 미크론, 20-300 미크론, 20-500 미크론, 40-400 미크론, 60-300 미크론, 80-200 미크론, 또는 약 100-150 미크론일 수 있다. 전술한 것은 단지 예이며, 접속 영역 (예를 들어, 236)의 길이 (Lcon) 는 임의의 상기 열거된 종결점 내의 임의의 길이일 수 있다.
격리 펜들의 다양한 실시형태에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 접속 영역 (예를 들어, 236)의 너비 (Wcon)는 약 20-500 미크론, 20-400 미크론, 20-300 미크론, 20-200 미크론, 20-150 미크론, 20-100 미크론, 20-80 미크론, 20-60 미크론, 30-400 미크론, 30-300 미크론, 30-200 미크론, 30-150 미크론, 30-100 미크론, 30-80 미크론, 30-60 미크론, 40-300 미크론, 40-200 미크론, 40-150 미크론, 40-100 미크론, 40-80 미크론, 40-60 미크론, 50-250 미크론, 50-200 미크론, 50-150 미크론, 50-100 미크론, 50-80 미크론, 60-200 미크론, 60-150 미크론, 60-100 미크론, 60-80 미크론, 70-150 미크론, 70-100 미크론, 또는 80-100 미크론일 수 있다. 전술한 것은 단지 예이고, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 접속 영역 (예를 들어, 236)의 너비 (Wcon)는 전술한 예들 (예를 들어, 임의의 상기 열거된 종결점 내 임의의 값)과 상이할 수 있다.
격리 펜의 다양한 실시형태에서, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 접속 영역 (예를 들어, 236)의 너비 (Wcon)는 격리 펜에 대해서 의도되는 미세-객체 (예를 들어, T 세포, B 세포, 또는 난자 또는 배아일 수 있는 생물학적 세포)의 적어도 최대 치수만큼 클 수 있다. 전술한 것은 단지 예이고, 근위 개구 (예를 들어, 234)에서 접속 영역 (예를 들어, 236)의 너비 (Wcon)는 전술한 예 (예를 들어, 상기 열거된 임의의 종결점 내의 너비)와 상이할 수 있다.
격리 펜의 다양한 실시형태에서, 접속 영역의 근위 개구의 너비 (Wpr)는 격리 펜에 대해서 의도되는 미세-객체 (예를 들어, 생물학적 미세-객체 예컨대 세포)의 적어도 최대 치수만큼 클 수 있다. 예를 들어, 너비 (Wpr)는 약 50 미크론, 약 60 미크론, 약 100 미크론, 약 200 미크론, 약 300 미크론일 수 있거나, 또는 약 50-300 미크론, 약 50-200 미크론, 약 50-100 미크론, 약 75-150 미크론, 약 75-100 미크론, 또는 약 200-300 미크론일 수 있다.
격리 펜의 다양한 실시형태에서, 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (예를 들어, 236)의 너비 (Wcon)에 대한 접속 영역 (예를 들어, 236)의 길이 (Lcon)의 비율은 임의의 하기 비율보다 크거나 또는 동일할 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 이상. 전술한 것은 단지 예이고, 근위 개구 (234)에서 접속 영역 (236)의 너비 (Wcon)에 대한 접속 영역 (236)의 길이 (Lcon)의 비율은 전술한 예와 상이할 수 있다.
미세유체 장치 (100, 200, 23, 250, 280, 290, 300, 700, 800, 1000)의 다양한 실시형태에서, Vmax 는 대략 0.2, 0.5, 0.7, 1.0, 1.3, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.7, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 마이크로리터/초로 설정될 수 있다.
격리 펜을 구비하는 미세유체 장치의 다양한 실시형태에서, 격리 펜의 고립 영역 (예를 들어, 240)의 부피는 예를 들어 적어도 5×105, 8×105, 1×106, 2×106, 4×106, 6×106, 8×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 또는 8×108 세제곱 미크론, 또는 그 이상일 수 있다. 격리 펜을 구비하는 미세유체 장치의 다양한 실시형태에서, 격리 펜의 부피는 약 5×105, 6×105, 8×105, 1×106, 2×106, 4×106, 8×106, 1×107, 3×107, 5×107, 또는 약 8×107 세제곱 미크론, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 격리 펜의 부피는 약 1 나노미터 내지 약 50 나노미터, 2 나노미터 내지 약 25 나노미터, 2 나노미터 내지 약 20 나노미터, 약 2 나노미터 내지 약 15 나노미터, 또는 약 2 나노미터 내지 약 10 나노미터일 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치는, 본 명세서에 기술된 임의의 실시형태에서와 같이 구성된 격리 펜을 구비하고, 여기서 미세유체 장치는 약 5 내지 약 10개의 격리 펜, 약 10 내지 약 50개의 격리 펜, 약 100 내지 약 500개의 격리 펜; 약 200 내지 약 1000개의 격리 펜, 약 500 내지 약 1500개의 격리 펜, 약 1000 내지 약 2000개의 격리 펜, 약 1000 내지 약 3500개의 격리 펜, 약 3000 내지 약 7000개의 격리 펜, 약 5000 내지 약10,000개의 격리 펜, 약 9000 내지 약 15,000개의 격리 펜, 또는 약 12,000 내지 약 20,000개의 격리 펜을 구비한다. 격리 펜은 모두 동일한 크기일 필요는 없고 다양한 구성 (예를 들어, 격리 펜 내의 상이한 너비, 상이한 피처)을 포함해도 된다.
도 2G는 하나의 실시형태에 따라서 미세유체 장치 (280)를 예시한다. 도 2G에 예시된 미세유체 장치 (280)는 미세유체 장치 (100)의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 장치 (280) 및 이의 구성 회로 엘리먼트 (예를 들어, 채널 (122) 및 격리 펜 (128))는 본 명세서에 기술된 치수를 가지게 될 것이다. 도 2G에 예시된 미세유체 회로 (120)는 2개의 포트 (107), 4개의 별개의 채널 (122) 및 4개의 별개의 흐름 영역 (106)을 구비한다. 미세유체 장치 (280)는 각각의 미세유체 채널 (122)과 연결된 다수의 격리 펜을 더 포함한다. 도 2G에 예시된 미세유체 장치에서, 격리 펜은 도 2C에 예시된 펜과 유사한 기하학적 구조를 갖고, 그에 따라서 접속 영역 및 고립 영역 둘 모두를 구비한다. 따라서, 미세유체 회로 (120)는 스웹 영역 (예를 들어, 이차 흐름 (244)의 최대 침투 깊이 (Dp) 내 접속 영역 (236)의 일부 및 채널 (122)) 및 비스웹 영역 (예를 들어, 이차 흐름 (244)의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 접속 영역 (236)의 일부 및 고립 영역 (240)) 둘 모두를 포함한다.
도 3A 내지 3B는 본 개시에 따른 미세유체 장치 (예를 들어, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300, 700, 800, 1000)를 가동하고 관찰하는데 사용할 수 있는 시스템 (150)의 다양한 실시형태를 도시한다. 도 3A에 예시된 바와 같이, 시스템 (150)은 미세유체 장치 (100)(도시되지 않음), 또는 본 명세서에 기술된 임의의 다른 미세유체 장치를 유지하도록 구성된 구조 ("네스트")(300)를 포함할 수 있다. 네스트 (300)는 미세유체 장치 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동되는 동전기 장치 (100))와 인터페이스할 수 있고 전력원 (192)으로부터 미세유체 장치 (320)로 전기적 접속을 제공할 수 있는 소켓 (302)을 포함할 수 있다. 네스트 (300)는 집적 전기 신호 발생 서브시스템 (304)을 더 포함할 수 있다. 전기 신호 발생 서브시스템 (304)은 바이어스 전압을 소켓 (302)에 공급하도록 구성되어서 소켓 (302)에 의해 유지될 때 미세유체 장치 (320) 내 전극 쌍에 걸쳐서 바이어스 전압이 인가된다. 따라서, 전기 신호 발생 서브시스템 (304)은 전력원 (192)의 일부일 수 있다. 미세유체 장치 (320)에 바이어스 전압을 인가하는 능력은 바이어스 전압이 미세유체 장치 (320)가 소켓 (302)에 의해 유지될 때 항상 인가될 것이라는 것을 의미하는 것은 아니다. 그보다는, 대부분의 경우에서, 바이어스 전압이 간헐적으로, 예를 들어 미세유체 장치 (320)에서, 동전기력 예컨대 유전영동 또는 전기습윤의 발생을 촉진시키기 위해서 오직 필요에 따라서만 인가될 것이다.
도 3A에 예시된 바와 같이, 네스트 (300)는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA)(322)를 포함할 수 있다. 전기 신호 발생 서브시스템 (304)은 PCBA (322) 위에 장착되어 그 안으로 전기적으로 통합될 수 있다. 예시적인 지지체는 역시 PCBA (322) 상에 장착된 소켓 (302)을 포함한다.
전형적으로, 전기 신호 발생 서브시스템 (304)은 파형 발생기 (도시되지 않음)를 포함하게 될 것이다. 전기 신호 발생 서브시스템 (304)은 파형 발생기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (도시되지 않음) 및/또는 오실로스코프 (도시되지 않음) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우에, 소켓 (302)에 의해 유지되는 미세유체 장치 (320) 에 공급된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 오실로스코프는 미세유체 장치 (320)에 근접 (및 파형 발생기에 대해 원위) 위치에서 파형을 측정하고, 그에 따라서 장치에 실제로 인가되는 파형을 측정하는데 더 큰 정확성을 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 수득된 데이타는, 예를 들어 파형 발생기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 발생기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합형 파형 발생기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™이다.
특정한 실시형태들에서, 네스트 (300)는 제어기 (308), 예컨대 전기 신호 발생 서브시스템 (304)을 감지 및/또는 제어하는데 사용되는 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (308)는 기능을 수행하고 분석하는데 사용될 수 있거나, 또는 기능을 수행하고 분석하기 위해서 외부 주 제어기 (154)(도 1에 도시됨)와 통신할 수도 있다. 도 3A 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (308)는 인터페이스 (310)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터)를 통해 주 제어기 (154)와 통신된다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300)는 Red Pitaya™ 파형 발생기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 발생된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 미세유체 장치 (100)로 전달하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기 신호 발생 서브시스템 (304)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 미세유체 장치 (320)에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 이후에, 미세유체 장치 (320)에서 측정된 전압이 바람직한 값이도록 필요에 따라서 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는 PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터의 쌍에 의해 발생되는 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있어서, 그 결과로 미세유체 장치 (100)에서 최대 13 Vpp의 신호가 생성된다.
도 3A 에 예시된 바와 같이, 지지 구조체 (300) (예를 들어, 네스트)는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306)은 지지 구조체 (300)에 의해 유지되는 미세유체 장치 (320)의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306)은 펠티어 열전기 장치 (도시되지 않음) 및 냉각 유닛 (도시되지 않음)을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 장치는 미세유체 장치 (320)의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (도시되지 않음), 예컨대 액랭식 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 장치의 제2 표면 (예를 들어, 제1 표면의 반대 표면)은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해서 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유로 (314)에 접속될 수 있다. 도 3A에 예시된 실시형태에서, 지지 구조체 (300)는, 외부 리저버 (도시되지 않음)로부터 냉각 유체를 수용하고, 냉각 유체를 유로 (314) 안으로 도입시키고 냉각 블록을 통해서, 그 다음으로 냉각 유체를 외부 리저버로 반송하기 위한 입구부 (316) 및 출구부 (318)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 장치, 냉각 유닛, 및/또는 유로 (314)는 지지 구조체 (300) 의 케이싱 (312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 열 제어 서브시스템 (306)은 미세유체 장치 (320)를 위한 표적 온도를 획득하기 위해서 펠티어 열전기 장치의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 장치의 온도 조절은, 예를 들어 열전기 전력 공급기, 예컨대 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.)에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306)은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안적으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300)는 레지스터 (예를 들어, 저항이 1 kOhm+/-0.1%이고, 온도 계수는 +/-0.02 ppm/CO 임) 및 NTC 써미스터 (예를 들어, 공칭 저항이 1 kOhm+/-0.01% 임)를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (도시되지 않음)인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306)을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306)은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후에 그 계산된 온도 값을 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력값으로서 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력값은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (도시되지 않음) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여, 열전기 전력 공급기를 작동시키고 그리하여 펠티어 열전기 장치를 제어할 수 있다.
네스트 (300)는 제어기 (308)의 마이크로프로세서가 인터페이스 (310) (도시되지 않음)를 통해 외부 주 제어기 (154)와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324)를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (308)의 마이크로프로세서는 전기 신호 발생 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306)과 통신할 수 있다 (예를 들어, Plink 도구 (도시되지 않음)를 통함). 따라서, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324)의 조합을 통해 전기 신호 발생 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306)은 외부 주 제어기 (154)와 통신할 수 있다. 이러한 방식으로, 주 제어기 (154)는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기 신호 생성 서브시스템 (304)을 보조할 수 있다. 외부 주 제어기 (154)와 커플링된 디스플레이 장치 (170)를 통해 제공되는, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)(도시되지 않음)는 각각 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기 신호 발생 서브시스템 (304)으로부터 수득된 온도 및 파형 데이타를 그래프화하도록 구성될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, GUI는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기 신호 발생 서브시스템 (304)에 대한 업데이트를 허용할 수 있다.
상기에 기술된 바와 같이, 시스템 (150)은 이미징 장치를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이미징 장치는 광 조절 서브시스템 (330)을 포함한다 (도 3B 참조). 광 조절 서브시스템 (330)은 디지탈 미러 장치 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA)을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332)으로부터 광을 수용하고 수용된 광의 서브세트를 현미경 (350)의 광학 트레인으로 전송하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 그 자신의 광을 생성하는 (따라서 광원 (332)이 필요없음) 장치, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 실리콘 액정 표시 (LCOS) 장치, 강유전성 액정 표시 장치 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (330)은 구조화 광 및 비구조화 광 둘 모두를 방출할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 시스템 (150)의 이미징 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162)은 광 조절 서브시스템 (330)을 제어할 수 있다.
특정한 실시형태들에서, 이미징 장치는 현미경 (350)을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330)은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350)은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트 (300)는 현미경 (350)의 스테이지 (344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 조절 서브시스템 (330)은 현미경 (350)의 포트 상에 장착되도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330)은 현미경 (350)의 일체형 성분들일 수 있다.
특정한 실시형태에서, 현미경 (350)은 하나 이상의 검출기 (348)를 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출기 (348)는 이미징 모듈 (164)에 의해 제어된다. 검출기 (348)는 접안 렌즈, 전하-결합 장치 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지탈 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2개의 검출기 (348)가 존재하면, 한개 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350)은 미세유체 장치 (320)로부터 반사 및/또는 발광된 광을 수신하고, 반사 및/또는 발광된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기(348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기에 대해 상이한 튜브 렌즈 (도시되지 않음)를 포함할 수 있다.
특정한 실시형태에서, 이미징 장치는 적어도 2종의 광원을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제1 광원 (332)은 구조화 광 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (330)을 통함)을 생성하도록 사용될 수 있고 제2 광원 (334)은 비구조화 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제1 광원 (332)은 광학적으로-작동되는 동전기 및/또는 형광 여기를 위한 구조화 광을 생성할 수 있고, 제2 광원 (334)은 명시야 조사를 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태에서, 동기 모듈 (164)은 제1 광원 (332)을 제어하도록 사용될 수 있고, 이미징 모듈 (164)은 제2 광원 (334)을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350)의 광학 트레인은 (1) 장치가 네스트 (300)에 의해 유지될 때, 광 조절 서브시스템 (330)으로부터 구조화 광을 수신하고, 이 구조화 광을 미세유체 장치, 예컨대 광학적으로-작동되는 동전기 장치의 적어도 제1 영역에 포커싱하고, (2) 미세유체 장치로부터 반사 및/또는 발광된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 발광된 광의 적어도 일부를 검출기 (348)로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 장치가 네스트 (300)에 의해 유지될 때, 제2 광원으로부터 비구조화 광을 수신하고, 이 비구조화 광을 미세유체 장치의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 미세유체 장치의 제1 및 제2 영역은 중복되는 영역일 수 있다. 예를 들어, 제1 영역은 제2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제2 광원 (334)은 추가적으로 또는 대안적으로 임의의 적합한 광파장을 가질 수 있는, 레이저를 포함해도 된다. 도 3B에 도시된 광학 시스템의 대표도는 단지 개략도이고, 광학 시스템은 추가적인 필터, 노치 필터, 렌즈 등을 포함할 수도 있다. 제2 광원 (334)이 명시야 및/또는 형광 여기를 비롯하여 레이저 조사를 위한 하나 이상의 광원(들)을 포함할 때, 이러한 광원(들)의 물리적 배열은 도 3B에 도시된 것에서 가변적일 수 있고, 레이저 조사는 광학 시스템 내 임의의 적합한 물리적 위치에 도입될 수 있다. 광원 (334) 및 광원 (332)/광 조절 서브시스템 (330)의 개략적인 위치는 또한 상호변화될 수도 있다.
도 3B에서, 제1 광원 (332)은, 시스템 (355)(도시되지 않음)의 현미경 (350)의 광학 트레인에 구조화 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (330)에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제2 광원 (334)은 비구조화 광을 빔 스플리터 (336)를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화 광 및 제2 광원 (334)으로부터의 비구조화 광은 빔 스플리터 (336)로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (330)에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (338))에 도달하고, 여기서 광 대물렌즈 (336)를 통해 샘플 평면 (342)으로 반사된다. 샘플 평면 (342)으로부터 반사 및/또는 발광된 광은 그 후에, 대물렌즈 (340)를 통해서, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338)를 통하고, 이색성 필터 (346)로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346)에 도달하는 광의 일부만이 통과하여 검출기 (348)에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제2 광원 (334)은 블루 광을 발광한다. 적합한 이색성 필터 (346)로, 샘플 평면 (342)으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346)를 통과하고 검출기 (348)에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (330)으로부터 오는 구조화 광은 샘플 평면 (342)으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346)를 통과하지 않는다. 이러한 예에서, 이색성 필터 (346)는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (330)으로부터 나오는 광의 이러한 필터링은 오직 광 조절 서브시스템으로부터 발광된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330)으로부터 나오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장 (예를 들어, 블루 파장)을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346)를 통과하여 검출기 (348)에 도달하게 된다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346)는 제1 광원 (332) 및 제2 광원 (334)으로부터 검출기 (348)에 도달하는 광의 양 사이의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제1 광원 (332)이 제2 광원 (334) 보다 상당히 더 강하다면 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제2 광원 (334)은 레드 광을 발광할 수 있고, 이색성 필터 (346)는 레드 광 이외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광)을 필터링할 수 있다.
코팅 용액 및 코팅제. 이론으로 제한하려는 의도는 아니나, 미세유체 장치 (예를 들어, DEP-구성 및/또는 EW-구성 미세유체 장치) 내에 생물학적 미세-객체 (예를 들어, 생물학적 세포)의 유지는, 미세유체 장치와 그 안에 유지되는 생물학적 미세-객체(들) 사이에 일차 인터페이스를 제공하는 유기 및/또는 친수성 분자의 층이 존재하도록 미세유체 장치의 적어도 하나 이상의 내부 표면이 컨디셔닝되거나 또는 코팅된 경우에 촉진될 수 있다 (즉, 생물학적 미세-객체가 미세유체 장치 내에서 증가된 생존능, 더 큰 확장성 및/또는 더 큰 운반능을 나타냄). 일부 실시형태들에서, 미세유체 장치의 내부 표면 중 하나 이상 (예를 들어, DEP-구성 미세유체 장치의 전극 활성화 기판의 내부 표면, 미세유체 장치의 덮개부, 및/또는 회로 재료의 표면)은 유기 및/또는 친수성 분자의 바람직한 층을 생성하도록 코팅 용액 및/또는 코팅제로 처리되거나 또는 그에 의해 개질될 수도 있다.
코팅부는 생물학적 미세-객체(들)의 도입 이전 또는 이후에 도포될 수 있거나, 또는 생물학적 미세-객체(들)와 동시발생적으로 도입될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 미세-객체(들)는 하나 이상의 코팅제를 포함하는 유체 매질 중에서 미세유체 장치 안으로 이입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 미세유체 장치 (예를 들어, DEP-구성 미세유체 장치)의 내부 표면(들)은 미세유체 장치로 생물학적 미세-객체(들)의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리되거나 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치의 적어도 하나의 표면은 생물학적 미세-객체(들) 의 유지 및/또는 증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 (예를 들어, 하기에 기술된 바와 같은 컨디셔닝된 표면을 제공하는) 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 미세유체 장치의 실질적으로 모든 내부 표면은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들)은 흐름 영역 (예를 들어, 채널), 챔버, 또는 격리 펜, 또는 이들의 조합의 표면을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 다수의 격리 펜의 각각은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태에서, 다수의 흐름 영역 또는 채널의 각각은 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태에서, 다수의 격리 펜의 각각 및 다수의 채널의 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료로 코팅된다.
코팅제/용액. 제한없이, 혈청 또는 혈청 인자, 소 혈청 알부민 (BSA), 중합체, 세제, 효소 및 이의 임의의 조합을 포함하는, 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다.
중합체-기반 코팅 재료. 적어도 하나의 내부 표면은 중합체를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 중합체는 적어도 하나의 표면에 공유적으로 또는 비공유으로 결합될 수도 있다 (또는 비특이적으로 부착될 수도 있음). 중합체는 예컨대 블록 중합체 (및 공중합체), 성상 중합체 (성상 공중합체), 및 그라프트 또는 콤 중합체 (그라프트 공중합체)에 존재하는, 다양한 구조 모티프를 가질 수 있고, 이들 전부는 본 명세서에 개시된 방법에 적합할 수 있다.
중합체는 알킬렌 에테르 모이어티를 포함하는 중합체를 포함할 수도 있다. 광범위하게 다양한 알킬렌 에테르 함유 중합체가 본 명세서에 기술된 미세유체 장치에서 사용하기 적합할 수 있다. 알킬렌 에테르 함유 중합체의 비제한적인 한 클래스는 중합체 사슬 내에서 비율 및 위치가 상이한 폴리에틸렌 산화물 (PEO) 및 폴리프로필렌 산화물 (PPO) 서브유닛의 블록을 포함하는 양친매성 비이온성 블록 공중합체이다. Pluronic® 중합체 (BASF)는 이러한 유형의 블록 공중합체이고, 살아있는 세포와 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 당업계에 알려져 있다. 중합체는 약 2000 Da 내지 약 20 KDa의 평균 분자 질량 (Mw)의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEO-PPO 블록 공중합체는 약 10 보다 큰 (예를 들어, 12-18) 친수성-친유성 밸런스 (HLB)를 가질 수 있다. 코팅된 표면을 만드는데 유용한 특별한 Pluronic® 중합체는 Pluronic® L44, L64, P85, 및 F127 (F127NF 포함)을 포함한다. 다른 클래스의 알킬렌 에테르 함유 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG Mw < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 산화물 (PEO, Mw > 100,000)이다. 일부 실시형태에서, PEG는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000 Da의 Mw를 가질 수 있다.
다른 실시형태에서, 코팅 재료는 카르복실산 모이어티를 함유하는 중합체를 포함해도 된다. 카르복실산 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 함유 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락트산 (PLA)이다. 다른 실시형태에서, 코팅 재료는 중합체 골격의 말단에 또는 중합체 골격으로부터 현수된, 포스페이트 모이어티를 함유하는 중합체를 포함해도 된다. 또 다른 실시형태에서, 코팅 재료는 술폰산 모이어티를 함유하는 중합체를 포함해도 된다. 술폰산 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 함유 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술폰산 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술폰산이다. 추가의 실시형태에서, 코팅 재료는 아민 모이어티를 포함하는 중합체를 포함할 수도 있다. 폴리아미노 중합체는 천연 폴리아민 중합체 또는 합성 폴리아민 중합체를 포함할 수도 있다. 천연 폴리아민의 예는 스퍼민, 스퍼미딘, 및 푸트레신을 포함한다.
다른 실시형태에서, 코팅 재료는 사카라이드 모이어티를 함유하는 중합체를 포함할 수 있다. 비제한적인 예에서, 다당류 예컨대 잔탄 검 또는 덱스트란은 미세유체 장치에서 크산탄 검 또는 덱스트란과 같은 다당류들은 미세유체 장치에서 세포 들러붙음을 감소시키거나 또는 방지할 수 있는 재료를 형성하는데 적합할 수 있다. 예를 들어, 약 3kDa 크기를 갖는 덱스트란 중합체는 미세유체 장치 내 표면에 코팅 재료를 제공하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 코팅 재료는 다가전해질 표면을 제공하는, 리보뉴클레오티드 모이어티 또는 데옥시리보뉴클레오티드 모이어티를 가질 수 있는, 뉴클레오티드 모이어티를 함유하는 중합체, 즉 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 오직 천연 뉴클레오티드 모이어티만을 함유할 수 있거나 또는 제한 없이 핵염기, 리보스 또는 포스페이트 모이어티 유사체 예컨대 7-데아자아데닌, 펜토스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티를 포함하는 비천연 뉴클레오티드 모이어티를 함유할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 코팅 재료는 아미노산 모이어티를 함유하는 중합체를 포함할 수 있다. 아미노산 모이어티를 함유하는 중합체는 천연 아미노산 함유 중합체 또는 비천연 아미노산 함유 중합체를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 쪽이든 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 단백질은 코팅제들로서 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질을 포함하는 혈청 및/또는 소 혈청 알부민 (BSA) (또는 다수의 상이한 혈청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 제한없이 태아 송아지 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하는, 임의의 편리한 공급원 유래일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 코팅 용액 내 BSA는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는, 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 농도로 존재한다. 특정한 실시형태들에서, 코팅 용액 내 혈청은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는, 약 20% (v/v) 내지 약 50% v/v 의 농도로 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, BSA는 5 mg/mL로 코팅 용액 중 코팅제로서 존재할 수도 있지만, 다른 실시형태에서, BSA는 70 mg/mL로 코팅 용액 중 코팅제로서 존재할 수도 있다. 특정한 실시형태에서, 혈청은 30%로 코팅 용액 중 코팅제로서 존재한다. 일부 실시형태에서, 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질이 세포 성장을 촉진하도록 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 물질 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함시켜도 되는 세포 매트릭스 단백질은 제한없이 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예컨대, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 또는 다른 세포 신호전달 종이 미세유체 장치의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 하나 초과의 알킬렌 산화물 모이어티, 카르복실산 모이어티, 술폰산 모이어티, 포스페이트 모이어티, 사카라이드 모이어티, 뉴클레오티드 모이어티, 또는 아미노산 모이어티를 함유하는 중합체를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태에서, 중합체 컨디셔닝된 표면은 코팅 재료에 독립적으로 또는 동시에 유입될 수도 있는, 알킬렌 산화물 모이어티, 카르복실산 모이어티, 술폰산 모이어티, 포스페이트 모이어티, 사카라이드 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티, 및/또는 아미노산 모이어티를 각각 가지는 하나를 초과하는 중합체의 혼합물을 포함해도 된다.
공유적으로 연결된 코팅 재료. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 미세유체 장치 내에 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 공유적으로 연결된 분자를 포함하여서, 그러한 세포에 컨디셔닝된 표면을 제공한다.
공유적으로 연결된 분자는 연결기를 포함하고, 여기서 연결기는 하기에 기술된 바와 같이 미세유체 장치의 하나 이상의 표면에 공유적으로 연결된다. 연결기는 또한 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유적으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬 포함) 모이어티; 단당류 또는 다당류 (제한없이 덱스트란을 포함할 수 있음); 알콜 (제한없이 프로파르길 알콜 포함); 제한없이 폴리비닐 알콜을 포함하는 다가알콜; 제한없이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 알킬렌 에테르; 다가전해질 (제한없이 폴리아크릴산 또는 폴리비닐 포스폰산 포함); 아미노기 (이의 유도체, 예컨대 제한없이 알킬화 아민류, 히드록시알킬화 아미노기, 구아니디늄, 및 비방향족 질소 고리 원자를 함유하는 복소환 기, 예컨대 제한없이 모르폴리닐 또는 피페라지닐 포함); 제한없이 프로피올산 (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수 있음)을 포함하는 카르복실산; 제한없이 에티닐 포스폰산을 포함하는 포스폰산 (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수 있음); 술포네이트 음이온; 카르복시베타인; 술포베타인; 술팜산; 또는 아미노산을 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치 내 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식을 위해 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유적으로 연결된 모이어티는 비중합성 모이어티 예컨대 알킬 모이어티, 치환된 알킬 모이어티, 예컨대 플루오로알킬 모이어티 (제한없이 퍼플루오로알킬 모이어티 포함), 아미노산 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실산 모이어티, 포스폰산 모이어티, 술폰산 모이어티, 술팜산 모이어티 또는 사카라이드 모이어티를 포함할 수 있다. 대안적으로, 공유적으로 연결된 모이어티는 상기에 기술된 임의의 모이어티일 수 있는, 중합체 모이어티를 포함해도 된다.
일부 실시형태에서, 공유적으로 연결된 알킬 모이어티는 선형 사슬 (예를 들어, 적어도 10개 탄소, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22개, 또는 그 이상의 탄소의 선형 사슬)을 형성하는 탄소 원자를 포함할 수도 있고, 비분지형 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태에서, 알킬 기는 치환된 알킬 기를 포함할 수도 있다 (예컨대, 알킬 기의 탄소 중 일부가 플루오르화되거나 또는 퍼플루오르화될 수 있음). 일부 실시형태에서, 알킬 기는 비-치환된 알킬 기를 포함할 수도 있는 제2 분절에 연결된 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제1 분절을 포함할 수도 있고, 여기서 제1 및 제2 분절은 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 결합될 수도 있다. 알킬 기의 제1 분절은 연결 기의 원위에 위치해도 되고, 알킬 기의 제2 분절은 연결기의 근위에 위치해도 된다.
다른 실시형태에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 하나를 초과하는 유형의 아미노산을 포함해도 되는 적어도 하나의 아미노산을 포함해도 된다. 따라서, 공유적으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존능, 이식능, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하도록 쌍성이온 표면을 제공할 수 있는 아미노산을 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 산화물 모이어티를 포함할 수도 있고, 상기에 기술된 바와 같은 임의의 알킬렌 산화물 중합체를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 중합체의 유용한 한 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG Mw < 100,000 Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 산화물 (PEO, Mw > 100,000)이다. 일부 실시형태에서, PEG는 약 1000 Da, 5000 Da, 10,000 Da 또는 20,000 Da의 Mw를 가질 수 있다.
공유적으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 사카라이드를 포함해도 된다. 공유적으로 연결된 사카라이드는 단당류, 이당류 또는 다당류일 수 있다. 공유적으로 연결된 사카라이드는 표면에 부착을 위한 커플링 또는 정교화를 허용하는 반응쌍 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응쌍 모이어티는 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티를 포함할 수도 있다. 다당류는 무작위 방식으로 개질될 수도 있는데, 각각의 사카라이드 단량체가 개질될 수 있거나 또는 다당류 내 사카라이드 단량체의 오직 일부가 개질되어 표면과 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수도 있는 반응쌍 모이어티를 제공한다. 한가지 전형은 비분지형 링커를 통해서 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수 있다.
공유적으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노 기를 포함해도 된다. 아미노 기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소-함유 복소환 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수 있다. 아미노 함유 모이어티는 미세유체 장치 내, 및 임의로 격리 펜 및/또는 흐름 영역 (예를 들어, 채널) 내 환경의 pH 개질을 허용하는 구조를 가질 수 있다.
컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 오직 한 종류의 공유적으로 연결된 모이어티를 포함할 수 있거나 또는 1종 초과의 상이한 종류의 공유적으로 연결된 모이어티를 포함해도 된다. 예를 들어, 플루오로알킬 컨디셔닝 표면 (퍼플루오로알킬 포함)은 모두 동일한, 예를 들어 동일한 표면과의 공유 부착 및 연결기, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 개수의 플루오로메틸렌 유닛을 갖는 다수의 공유적으로 연결된 모이어티를 가질 수 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착되는 1종을 초과하는 종류의 공유적으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정한 개수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛을 갖는 공유적으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티를 갖는 분자를 포함할 수 있고, 코팅된 표면에 더 큰 부피의 모이어티가 존재하도록 수용력을 제공할 수 있는, 더 많은 개수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛을 갖는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유적으로 부착된 대전 모이어티를 갖는 분자의 추가 세트를 더 포함해도 된다. 이러한 예에서, 상이하고, 입체적 요구 말단이 덜하며 골격 원자가 적은 분자의 제1 세트는 전체 기판 표면을 작용화시키는데 도움을 줄 수 있어서 기판 자체를 구성하는 규소/규소 산화물, 하프늄 산화물 또는 알루미나와의 원하지 않는 부착 또는 접촉을 방지할 수 있다. 다른 예에서, 공유적으로 연결된 모이어티는 표면 상에서 무작위 방식으로 교대식 전하를 제공하는 쌍성이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 속성. 컨디셔닝된 표면의 조성 이외에, 다른 인자들 예컨대 소수성 재료의 물리적 두께는 DEP 력에 영향을 미칠 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기판 상에 형성되는 방식 (예를 들어, 증착, 핵상 증착 스핀 코팅, 플러딩, 및 정전 코팅)과 같은, 다양한 인자들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm 또는 이들 사이의 임의의 개별 값의 두께를 갖는다. 다른 실시형태에서, 공유적으로 연결된 모이어티에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가질 수도 있다. 다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만의 두께를 갖는다. 일부 실시형태에서, 컨디셔닝된 표면의 공유적으로 연결된 모이어티는 미세유체 장치의 표면 (예를 들어, DEP 구성 기판 표면)에 공유적으로 연결될 때 단일층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm)의 두께를 가질 수도 있다. 이들 값은 전형적으로 약 30 nm 의 두께를 가질 수도 있는, 예를 들어, 스핀 코팅에 의해 제조된 표면의 것과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 DEP-구성 미세유체 장치 내 가동을 위해 적절하게 기능성인 완벽하게 형성된 단일층을 요구하지 않는다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 장치의 컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 속성을 제공할 수 있다. 이론에 국한하려는 의도는 아니나, 특정한 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 미치는 한 인자는 고유한 전하 포집성이다. 상이한 코팅 재료는 전자를 포집할 수 있어서, 이것이 코팅 재료의 파괴를 초래할 수 있다. 코팅 재료의 결함은 전하 포집성을 증가시켜서 코팅 재료의 추가적인 파괴를 초래할 수도 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료는 전하 포집성에 영향을 미칠 수 있는, 상이한 유전체 강도 (즉, 유전성 파괴를 초래하는 최소 인가 전계)를 갖는다. 특정한 실시형태에서, 코팅 재료는 그 전하 포집량을 감소시키거나 또는 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 조밀 패킹 단일층 구조)를 가질 수 있다.
이의 전기적 속성에 더하여, 컨디셔닝된 표면은 또한 생물학적 분자와의 사용에 유익한 속성을 가질 수도 있다. 예를 들어, 플루오르화 (또는, 퍼플루오르화) 탄소 사슬을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 오손량을 감소시키는데서 알킬-종결 사슬에 비해 이점을 제공할 수도 있다. 본 명세서에서 사용시 표면 오손은 생물질 예컨대 단백질 및 이의 분해 산물, 핵산 및 개별 분해 산물 등의 영구적 또는 반영구적 침착을 포함할 수 있는, 미세유체 장치의 표면 상의 무분별한 재료 침착 양을 의미한다.
일체형 또는 다중-파트형의 컨디셔닝 표면 공유적으로 연결된 코팅 재료는 하기에 기술되는 바와 같이, 미세유체 장치 내 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유적으로 연결된 코팅 재료는 그 자체가 표면에 공유적으로 연결된 표면 개질 리간드에 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 커플링함으로써 2-파트 배열로 형성될 수도 있다.
공유적으로 연결된 코팅 재료의 제조 방법. 일부 실시형태에서, 미세 유체 장치의 표면 (예를 들어, 격리 펜 및/또는 흐름 영역의 적어도 하나의 표면 포함)에 공유적으로 연결되는 코팅 재료는 하기 식 1 또는 식 2의 구조를 갖는다. 코팅 재료가 1 단계로 표면에 도입될 때, 이것은 식 1의 구조를 갖는데 반해, 코팅 재료가 다단계로 도입될 때는, 식 2의 구조를 갖는다.
Figure pct00005
식 1 식 2
코팅 재료는 DEP-구성 또는 EW-구성 기판의 표면의 산화물에 공유적으로 연결될 수 있다. DEP-구성 또는 EW-구성 기판은 규소, 규소 산화물, 알루미나, 또는 하프늄 산화물을 포함할 수도 있다. 산화물은 기판의 천연 화학적 구조의 일부분으로서 존재할 수 있거나 또는 하기 기술된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물과 실록산 또는 포스폰산 기의 반응으로 형성되는 실록시 또는 포스포네이트 에스테르 기일 수 있는, 연결기 ("LG")를 통해서 산화물에 부착될 수도 있다. 미세유체 장치 내 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 본 명세서에 기술된 임의의 모이어티일 수 있다. 연결기 (LG)는 미세유체 장치 내 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수도 있다. 연결기 (LG)가 모이어티에 직접적으로 연결되는 경우에, 선택적 연결자 ("L")는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG)가 모이어티에 간접적으로 연결되는 경우, 연결자 (L)는 존재하고 n 은 1 이다. 연결자 (L)는 선형 부분을 포함할 수도 있으며, 그 선형 부분의 골격은 당분야에 공지된 바와 같이 화학 결합 제한을 겪는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및/또는 인 원자의 임의의 조합으로부터 선택되는 1 내지 200개의 비수소 원자를 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 및/또는 포스포네이트 기, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 복소환 기로부터 선택될 수 있는, 하나 이상의 모이어티의 임의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 연결자 (L)의 골격은 10 내지 20개의 원자들을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태에서, 연결자 (L)의 골격은 약 5개 원자 내지 약 200개 원자; 약 10 개 원자 내지 약 80개 원자; 약 10개 원자 내지 약 50개 원자; 또는 약 10개 원자 내지 약 40개 원자를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 골격 원자는 모두 탄소 원자이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 다단계 공정으로 기판의 표면에 첨가될 수 있고, 상기 도시된 바와 같은 식 2의 구조를 갖는다. 모이어티는 상기에 기술된 임의의 모이어티일 수도 있다.
일부 실시형태에서, 커플링 기 (CG)는 반응성 모이어티 (Rx) 및 반응쌍 모이어티 (Rpx) (즉, 반응성 모이어티 (Rx)와 반응하도록 구성된 모이어티)의 반응에 의한 최종 기를 의미한다. 예를 들어, 한가지 전형적인 커플링 기 (CG)는 카복실산의 유도체, 예컨대 활성화된 에스테르, 산 클로라이드 등과 아미노 기의 반응 결과물인 카르복사미딜 기를 포함할 수 있다. 다른 CG는 트리아졸릴렌 기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 머캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐 기, 또는 그의 개별 반응쌍 모이어티와 반응 모이어티의 반응 시 형성될 수 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 커플링 기(CG)는 상기 기술된 바와 같은 원소의 임의 조합을 포함할 수 있는, 연결자 (L)의 제2 말단 (즉, 미세유체 장치 내 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티 근부 말단)에 위치될 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 커플링 기 (CG)는 연결자 (L)의 골격을 차단할 수 있다. 커플링기 (CG)가 트리아졸릴렌인 경우에, 그것은 클릭 커플링 반응으로 얻어지는 산물일 수도 있고 더욱 치환될 수도 있다 (예를 들어, 디벤조시클로옥테닐 융합된 트리아졸릴렌기).
일부 실시형태에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드)는 화학 증착을 사용하여 미세유체 장치의 내부 표면 상에 증착된다. 증착 공정은 예를 들어, 용매조, 초음파처리 또는 이의 조합에 노출시킴으로써, 덮개부 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판 (DEP-구성 기판의 전극 활성화 기판 (206)의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성 기판의 지지 구조체 (104)의 유전체층)을 예비-세정하여, 임의로 개선시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 이러한 예비-세정은 여러 불순물들을 제거하는 동시에, 산화된 표면 (예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 공유적으로 개질될 수 있는 표면의 산화물)을 도입할 수 있는, 산소 플라즈마 클리너에서 덮개부 (110), 미세유체 회로 물질 (116), 및/또는 기판을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 액상 처리, 예컨대 염산 및 과산화수소의 혼합물 또는 황산 및 과산화수소의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1의 황산 대 과산화수소의 비율을 가질 수 있는 피라나 용액)이 산소 플라즈마 클리너 대신에 사용될 수도 있다.
일부 실시형태에서, 미세유체 장치 (200)가 조립되어 미세유체 회로 (120)를 한정하는 클로저 (102)를 형성한 후에 미세유체 장치 (200)의 내부 표면을 코팅하는데 사용된다. 이론으로 제한하려는 의도가 아니지만, 완전히 조립된 미세유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료의 증착은 미세유체 회로 재료 (116)와 전극 활성화 기판 (206) 유전체층 및/또는 덮개부 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다. 2-단계 공정이 적용되는 실시형태에서, 표면 개질 리간드는 상기 기술된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수 있고, 이후에 생물학적 미세-객체(들)의 유지/증식에 적합한 유기 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티가 후속적으로 도입될 수 있다. 후속 반응은 용액 중 적합한 커플링 시약에 표면 개질된 미세유체 장치를 노출시켜 수행될 수 있다.
도 2H는 컨디셔닝된 표면을 제공하는 예시적인 공유적으로 연결된 코팅 재료를 갖는 미세유체 장치 (290)의 단면도를 도시한다. 예시된 바와 같이, 코팅 재료 (298) (개략적으로 도시됨)는 DEP 기판일 수도 있는 기부 (286)의 내부 표면 (294), 및 미세유체 장치 (290)의 덮개부 (288)의 내부 표면 (292) 양자에 공유결합으로 결합된 조밀-패킹 분자의 단일층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298)는 일부 실시형태들 및 상기 기술된 바와 같이, 미세유체 장치 (290) 내 회로 엘리먼트 및/또는 구조를 한정하는데 사용되는 미세유체 회로 재료 (도시되지 않음)의 표면을 포함하는, 미세유체 장치 (290)의 인클로저 (284) 근부에서 그것을 향해서 내부로 대면하는 실질적으로 모든 내부 표면 (294, 292) 상에 증착될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 코팅 재료 (298)는 미세유체 장치 (290)의 내측 표면 중 오직 하나 또는 일부분 상에 배치될 수 있다.
도 2H에 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298)는 각각의 분자가 실록시 연결자 (296)를 통해서 미세유체 장치 (290)의 내부 표면 (292, 294)에 공유적으로 연결된, 유기실록산 분자의 단일층을 포함할 수 있다. 임의의 상기 기술된 코팅 재료 (298) (예를 들어, 알킬-종결, 플루오로알킬 종결 모이어티, PEG-종결 모이어티, 덱스트란 종결 모이어티, 또는 유기실록산 모이어티에 대해 양전하 또는 음전하를 함유하는 말단 모이어티)가 사용될 수 있고, 여기서 말단 모이어티는 이의 인클로저-대면 말단 (즉, 내부 표면 (292, 294)에 결합되지 않고 인클로저 (284)의 근부에 있는 코팅 재료 (298)의 단일층의 일부분)에 배치된다.
다른 실시형태에서, 미세유체 장치 (290)의 내부 표면(들) (292, 294)을 코팅하기 위해 사용되는 코팅 재료 (298)는 음이온성, 양이온성, 또는 쌍성이온 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론으로 제한하려는 의도는 아니나, 미세유체 회로 (120)의 인클로저 (284)의 내부 표면에 양이온성 모이어티, 음이온성 모이어티, 및/또는 쌍성이온 모이어티가 존재함으로써, 코팅 재료 (298)가 물 분자와 강력한 수소 결합을 형성할 수 있어서 수화의 최종 물이 비생물학적 분자 (예를 들어, 기판의 규소 및/또는 규소 산화물)는 수화 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기판의 규소 및/또는 규소 산화물)과의 상호작용으로부터 생물학적 미세-객체를 분리시키는 층 (또는 "실드")로서 작용된다. 또한, 코팅 재료 (298)가 코팅제들과 함께 사용되는 실시형태에서, 코팅 재료 (298)의 음이온, 양이온, 및/또는 쌍성이온은 인클로저 (284) 내의 매질 (180) (예를 들어, 코팅 용액)에 존재하는 비공유 코팅제 (예를 들어, 용액 중 단백질)의 하전된 일부분과 이온 결합을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 코팅 재료는 이의 인클로저-대면 말단에 친수성 코팅제를 포함하거나 또는 그것이 존재하도록 화학적으로 개질될 수 있다. 일부 실시형태에서, 코팅 재료는 알킬렌 에테르 함유 중합체, 예컨대 PEG를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 다당류, 예컨대 덱스트란을 포함할 수도 있다. 상기에 기술된 대전 모이어티 (예를 들어, 양이온성 모이어티, 음이온성 모이어티, 및/또는 쌍성이온 모이어티)처럼, 친수성 코팅제는 물 분자와 강력한 수소 결합을 형성하여, 그 결과로서 수화의 물이 비생물학적 분자 (예를 들어, 기판의 규소 및/또는 규소 산화물)와의 상호작용으로부터 생물학적 미세-객체를 분리하는 층 (또는 "실드")으로서 작용하게 된다.
적절한 코팅 처리 및 개질의 추가의 상세설명은 2016년 4월 22일에 출원된, 미국 특허 출원 제15/135,707 호에서 확인할 수 있고, 이것은 그 전문이 참조로 편입된다.
미세유체 장치의 격리 펜 내에서 세포의 생존능의 유지를 위한 추가적인 시스템 성분. 세포 개체군의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위해서, 기능성 세포를 유지하는데 도움이 되는 환경 조건이 시스템의 추가 성분에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 그러한 추가 성분은 영양분, 세포 성장 신호전달 종, pH 조절, 가스 교환, 온도 제어, 및 세포 유래 폐기 산물의 제거를 제공할 수 있다.
미세유체 장치의 격리 펜 내 세포의 생존능 유지를 위한 추가적인 시스템 성분. 세포 개체군의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위해서, 기능성 세포를 유지하는데 도움이 되는 환경 조건이 시스템의 추가 성분에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 그러한 추가 성분은 영양분, 세포 성장 신호전달 종, pH 조절, 가스 교환, 온도 제어, 및 세포 유래 폐기 산물의 제거를 제공할 수 있다.
로딩 방법. 생물학적 미세-객체 또는 미세-객체 예컨대 제한없이 비드의 로딩은 유체 흐름, 중력, 유전영동 (DEP) 력, 전기습윤성, 자성력, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 이의 임의 조합의 사용을 포함할 수 있다. DEP 력은 광학적으로, 예컨대 광전 트위저 (OET) 구성 및/또는 전기적으로, 예컨대 시간적/공간적 패턴으로 전극/전극 영역의 활성화에 의해 발생될 수 있다. 유사하게, 전기습윤력은 광학적으로, 예컨대 광-전기습윤 (OEW) 구성 및/또는 전기적으로, 예컨대 시공간적 패턴으로 전극/전극 영역의 활성화에 의해서 제공될 수 있다.
실험
시스템 및 미세유체 장치. 시스템 및 미세유체 장치: Berkeley Lights, Inc.에서 제작. 시스템은 적어도 흐름 제어기, 온도 제어기, 유체 매질 컨디셔닝 및 펌프 성분, 광활성화된 DEP 구성용 광원, 미세유체 장치용 장착 스테이지, 및 카메라를 포함하였다. T 미세유체 장치는 OptoElectroPositioning (OEP™) 기술로 구성된 OptoSelect™ 장치 (Berkeley Lights, Inc.)였다. 미세유체 장치는 미세유체 채널 및 이와 유체적으로 접속된 다수의 NanoPen™ 챔버를 포함하였고, 챔버는 약 7×105 세제곱 미크론의 부피를 갖는다.
프라이밍 계획. 250 마이크로리터의 100% 이산화탄소를 12 마이크로리터/초의 유속으로 흘려주었다. 이것은 다음과 같이 구성된 250 마이크로리터의 프라이밍 매질이 후속된다: 1000 mL의 이스코브 (Iscove)의 변형 둘베코 (Dulbecco) 배지 (ATCC® Catalog No. 30-2005), 200 mL의 태아 소 혈청 (ATCC® Cat. #30-2020), 10 mL의 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies® Cat. # 15140-122), 및 10 mL의 Pluronic F-127 (Life Tech Catalog No. 50-310-494). 프라이밍의 최종 단계는 12 마이크로리터/초로 흘려준, 250 마이크로리터의 프라이밍 매질을 포함하였다. 배양 배지의 유입은 다음과 같다.
관류 계획. 관류 방법은 다음의 2가지 방법 중 하나였다:
1. 2시간 동안 0.01 마이크로리터/초에서 관류; 64초 동안 2 마이크로리터/초에서 관류; 및 반복.
2. 10초에서 0.02 마이크로리터/초에서 관류; 500초 동안 흐름 중단; 64초 동안 2 마이크로리터/초에서 관류; 및 반복.
바코드화된 핵산 포획 비드: 비드는 폴리스티렌 (16 미크론) 또는 자성 (22 미크론)의, Spherotech #SVP-150-4 또는 #SVM-200-4였다. 비드는 본 명세서에 기술된 대로 바코드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 개질되었다. 바코드화된 비드는 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 방식으로 합성할 수 있다.
Figure pct00006
RNA 시퀀싱: 비드는 올리고(dT) 포획 서열/고유 분자 식별자 서열/바코드/프라이밍 서열을 디스플레이하도록 개질되었다. 바코드는 각각의 비드에 대해 고유하게 선택되었다. 올리고(dT) 프라이머/고유 분자 식별자 태그/세포 바코드/프라이머 서열은 전체 올리고뉴클레오티드 합성, 분할 및 풀 합성, 임의 길이의 올리고뉴클레오티드 절편의 결찰, 또는 이의 임의 조합을 통해서 합성될 수 있다. 올리고(dT) 프라이머/고유 분자 식별자 태그/세포 바코드/프라이머 서열은 예를 들어, 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 부착될 수도 있거나 또는 예를 들어 스트렙타비딘/바이오틴 연결자를 통해서 비공유적으로 부착될 수도 있다. 이러한 실험에서, 포획 서열, UMI, 바코드 및 프라이밍 서열을 포함하는 완전하게 합성된 올리고뉴클레오티드는 비공유적 바이오틴/스트렙타비딘 연결을 통해서 비드에 부착되었다.
실시예 1. OKT3 세포에 대해 입증되는 RNA 포획, 시퀀싱 라이브러리 제조 및 시퀀싱 결과.
세포: 쥣과동물 골수종 하이브리도마 세포주인 OKT3 세포는 ATCC (ATCC® Cat. # CRL-8001™)로부터 수득하였다. 세포는 현탁 세포주로서 제공되었다. 배양은 약 1×105 내지 약 2×105 생존 세포/mL을 파종하고, 기체 환경으로서 공기 중 5% 이산화탄소를 사용하여 37℃에서 인큐베이션하여 유지되었다. 세포는 2일 내지 3일 마다 분할하였다. OKT3 세포수 및 생존능을 계측하였고 세포 밀도는 미세유체 장치에 로딩을 위해서 5×105/mL로 조정하였다.
배양 배지: 1000 mL의 이스코브 변형 둘베코 배지 (ATCC® Catalog No. 30-2005), 200 mL의 태아 소 혈청 (ATCC® Cat. #30-2020) 및 10 mL의 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies® Cat. # 15140-122)을 조합하여 배양 배지를 만들었다. 완전 배지는 0.22 ㎛ 필터를 통해서 여과시켰고 사용 전까지 빛을 차단하여 4℃에서 저장하였다.
인큐베이션 기간 동안 관류시, 배양 배지는 OptoSelect 장치로 유입시키기 전에 공기 중 5% 이산화탄소로 계속적으로 컨디셔닝되었다.
실험: OKT3 세포의 샘플을 200 마이크로리터 중 2E6의 밀도로 OptoSelect 장치에 유입시켰다. 250의 세포를 NanoPen 챔버 당 하나의 세포를 로딩하도록 광학적으로 작동되는 유전영동력을 통해서 이동시켰다. 각각의 세포를 개구로부터 미세유체 채널 (예를 들어, 고립 영역)으로 가장 멀리 챔버 섹션 내에 위치시켰다. 단일한 고유하게 바코드화된 비드를 이후에 각각의 점유된 챔버에 로딩하였다. 단일한 생물학적 세포를 갖는 NanoPen 챔버에 로딩된 비드의 총수는 223개였고, 각각의 비드는 또한 침투성 유체 흐름을 겪지 않은 각각의 챔버 부분 내에 위치되었다. 이 실험에서, 256개의 고유하게 바코드화된 비드가 생성되었는데, 각각은 총 4종의 카세트형 서열을 갖는다. 다양성은 바코드 내에, 제1 위치에 4종의 가능한 서열 중 하나; 제2 위치에 4종의 가능한 서열의 제2의 상이한 세트의 4종 중 하나, 제3 서열에 4종의 가능한 서열의 제3 세트의 4종 중 하나, 및 제4 위치에 4종의 가능한 서열의 상이한 제4 세트의 4종 중 하나를 선택함으로서 선택하여 생성되었다.
용해 시약 (Single Cell Lysis Kit, Ambion Catalog No. 4458235)을 미세유체 채널로 흘려주었고 NanoPen 챔버로 확산될 수 있게 하였다. 개별적으로 페닝된 OKT3 세포를 10분 동안 용해 완충액에 노출시켰다. 용해는 용해 중지 완충액 (Single Cell Lysis Kit, Ambion Catalog No. 4458235)을 흘려주고, 미세유체 채널에 흐름이 존재하지 않는 동안 실온에서 2분 동안 인큐베이션시켜서 중지시켰다. (유사한 결과가 제한없이 용해 중지 처리 단계를 필요로 하지 않는 Clontech 용해 완충액 (Cat #635013)을 포함하는 다른 용해 완충액을 사용하여 수득될 수 있다. 사용된 조건 하에서, 핵막은 파괴되지 않았다. 방출된 mRNA는 동일한 NanoPen 챔버 내에 존재하는 바코드화된 비드 상에서 포획되었다.
포획된 RNA는 RT 시약 혼합물 (Thermo Scientific™ Maxima™ H Minus RT (Thermofisher, Catalog No. EP0751: 4 마이크로리터의 RT 완충액; 2 마이크로리터의 각각 10 밀리몰의 dNTP (New England Biolabs Cat #NO447L; 2 마이크로리터의 10 마이크로몰 E5V6 프라이머 (5Me-isodC//iisodG//iMe-isodC/ACACTCTTTCCCTACACGACGCrGrGrG; SEQ ID No. 103); 1 마이크로리터 H Minus RT 효소; 11 마이크로리터의 물)에서 흘려주어 cDNA로 역전사되었다. 대안적으로, 효소, 완충액 및 DTT를 포함하는 Clontech SMARTscribe™ 역전사효소 키트 (Cat. # 639536)를 사용하여 포획된 핵산으로부터 cDNA를 수득할 수 있다. NnoPen 챔버로 시약 혼합물의 확산은 16℃에서 20분 기간 동안, 이후에 42℃에서 90분의 반응 기간 동안 가능하게 하였다.
역전사 이후, 3 마이크로리터/초로 12 마이크로리터의 블랭크 이출이 음성 대조군으로서 수행되었다. 그 다음으로 이러한 대조군은 하기에 기술된 바와 같이 비드의 이출 그룹의 취급과 개별적이지만 유사하게 처리되었다.
다음으로 고유한 세포 바코드는 상기에 기술된 바와 같이 형광성 표지된 하이브리드화 프로브의 복합 흐름에 의해 각 비드에 대해 식별되었다. 형광성 표지 프로브 (시약 흐름 당 4종 프로브의 세트로 제공됨, 각각의 프로브는 흐름 내 임의의 다른 프로브와 상이한 형광단 및 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 함유함)가, 구별가능한 형광성 표지를 갖는 4종 프로브의 각 그룹이 100 mM 스톡으로부터 1 × DPBS에 희석된 1 마이크로몰로 미세유체 장치의 미세유체 채널로 흘러들어갔고, 16℃에서 20분의 기간 동안 NanoPen 챔버로 확산될 수 있게 하였으며, 그 이후에 42℃에서 90분 동안 하이브리드화될 수 있게 하였다. (대안적으로, 상이한 완충액, IDT Duplex 완충액 Cat. # 11-05-01-12이 또한 성공적으로 사용되었다. 뉴클레아제가 없고, 30 mM Hepes, 및 100 mM 포타슘 아세테이트, pH 7.5를 함유하는 이러한 완충액의 사용이 또한 이들 조건 하에서 우수한 듀플렉스 형성을 촉진하였다.) 하이브리드화 기간의 완료 후, 신선한 배지 (DPBS 또는 Duplex 완충액)를 미세유체 장치를 통해서 20분 동안 (300 마이크로리터, 0.25 마이크로리터/초) 흘려주어서 미세유체 장치의 흐름 영역 밖으로 비회합된 하이브리드화 프로브를 플러싱하였다. 이러한 플러싱 기간은 비하이브리드화된 하이브리드화 프로브가 각각의 NanoPen 챔버의 밖으로 확산되기에 충분히 길게 선택되었다. 이후에 각각의 구별가능한 형광성 파장 (Cy5, FITC, DAPI, 및 텍사스 레드 채널)을 여기시켰고, 어떠한 임의의 NanoPen 챔버가 형광성 신호를 입증하는지를 식별하였다. NanoPen 챔버에 국재된 각각의 프로브의 형광성 표지의 색상 및 위치를 표시하였고, 제1 시약 흐름의 하이브리드화 프로브의 형광성 표지 및 기지 서열에 대해 상호관련시켰고, 비드 상의 바코드의 상응하는 카세트형 서열의 정체를 지정하였다. 제1 및 임의의 다른 선행 시약 흐름의 서열과 상이하고 서로 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 각각 갖는, 형광성 표지된 하이브리드화 프로브의 추가 세트의 연속적인 추가 시약 흐름을 상기처럼 흘려주었고 검출을 계속하였다. 시약 흐름 및 검출의 각 라운드 사이에, 100 마이크로리터의 1× DPBS (Dulbecco's PBS)의 제1 플러시와, 이후에 동일 매질의 제2 50 마이크로리터 플러시를 사용하여 플러싱을 수행하였고, 양자는 0.5 마이크로리터/초로 수행되었다. 제2 또는 추가 시약 흐름에서 카세트형 서열의 오인을 최소화시키기 위해서, 각각의 구별가능한 형광단의 오직 제1 식별 형광성 신호만을 사용하여 카세트형 서열 정체를 바코드에 대해 지정하였다. 미세유체 장치 내 모든 비드의 바코드에서 사용된 모든 카세트형 서열이 합계된 시약 흐름을 완료시, NanoPen 챔버 내 모든 비드에 대한 바코드는 각각의 개별 단일 NanoPen 챔버로 지정되었다. 이러한 방법에 의해 지정된 특별한 바코드 서열의 지정 위치를 사용하여 RNA가 비드에 포획된 특별한 세포, 예를 들어, 미세유체 장치의 Nanopen 챔버 내에서 소스 핵산의 위치를 식별하였다. 도 14A는 하나의 NanoPen 챔버, #470에 대한 공정의 연속 지점을 도시한다. 각 컬럼의 상단에 도시된 바와 같은 각각의 구별가능한 형광성 신호는 A-D로 표지되었다. 각각의 흐름은 1-4로 표지되어, 수직으로 도시되어 있다. 흐름 1의 프로브가 하이브리드화되게 하고, 플러싱을 완료한 이후에, NanoPen 챔버 470의 비드는 색상 채널 B에 오직 형광성 신호만을 가졌다. 제2 시약 흐름을 유입시키고, 하이브리드화가 허용되고, 플러싱 후 검출에서, 추가의 표지가 검출되지 않았다. NanoPen 챔버 #470이 "B" 형광 채널에서 제2 흐름 동안 신호를 보이는 동안, 각각의 바코드 및 각각의 프로브는 각각의 바코드가 각각의 구별가능한 형광성 표지를 갖는 오직 하나의 카세트형 서열만을 갖도록 디자인되었다는 것을 주목한다. 이러한 제2 신호는 제1 흐름 프로브가 여전히 비드에 결합된 채로 남아있다는 것을 의미하므로 기록하지 않는다. 어떠한 추가 카세트형 서열도 시약 흐름 2의 프로브, 또는 시약 흐름 3에 의해서 식별되지 않았다. 그러나, 형광성 신호는 각각의 나머지 3개 형광 채널에 대한 제4 흐름에서 식별되었다. 그 결과로서, NonoPen 챔버 470 내 비드에 대한 바코드는, 그 바코드가 A4B1C4D4 카세트형 서열과 상관있는 서열을 갖는 것으로 식별되었다. 검출 후에, 남은 하이브리드화 프로브는 추가 조작 이전에, 10 mM Tris-HCl (200 마이크로리터, 0.5마이크로리터/초)로 2회 미세유체 장치의 흐름 영역을 플러싱하여 제거되었다.
다음으로 광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용하여 도 14B에 도시된 바와 같이, 바코드화된 비드를 NanoPen 챔버로부터 치환 완충액, 10 마이크로몰 Tris 중 흐름 영역 (예를 들어, 흐름 채널)으로 이출시켰다. NanoPen 챔버로부터 이출된 비드를 흐름 및 풀링을 사용하여 미세유체 장치 밖으로 이출시켰다. 양성 대조군 비드가 이출 그룹에 존재하였다. 80℃에서 10분 동안 인큐베이션 및 Exo 1 완충액 (17 마이크로리터의 이출된 비드, 1 마이크로리터의 엑소뉴클레아제 용액 및 2 마이크로리터의 Exo I 완충액) 중 엑소뉴클레아제 I (NEB, catalog number M0293L)의 처리에 의한 역전사효소 불활성화 후에, 비드의 이출 그룹 (20 마이크로리터 부피)을 5 마이크로리터의 10× Advantage 2 PCR 완충액, dNTP, 10 마이크로몰 SNGV6 프라이머 (5'-/5Biosg/ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3'; SEQ ID No. 105), 1 마이크로리터 Advantage 2 중합효소 믹스; 및 22 마이크로리터 물에 첨가하였다. 이러한 서열은 E5V6 프라이머 상에서 양쪽에 존재하였고 비드 상의 올리고 내에 존재하며 짧은 단편에 비해 전체 길이 cDNA를 농축하기 위한 단일 프라이머 PCR을 통해서, cDNA를 증폭하는데 사용되었다.　 cDNA는 18 사이클의 DNA 증폭이 수행되었다 (Advantage® 2 PCR kit, Clontech, Catalog no. 639206).
이출 그룹에 대한 미정제 증폭 혼합물의 초기 정제는 공급사의 지시서에 따라서 0.6× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 수행되었다. 정량은 전기영동으로 및/또는 형광적으로 (Qubit™, ThermoFisher Scientific) (도 14C) 수행되었고 (Bioanalyzer 2100, Agilent, Inc.), 증폭된 DNA의 허용가능한 회수율을 보여주었다. 추가 라이브러리 제조 전에 사용을 위해서 공급사 지시스에 따라서 단측 태그먼트화 (Nextera XT DNA Library Preparation Kit, Illumina®, Inc.)를 수행하였다. 2차 0.6× SPRI 정제 후, 크기 선택을 수행하였다 (Pre-Cast Agarose Gel Electrophoresis System. 래더: 50 bp 래더 (ThermoFisher, catalog no. 10488-099). E-gel®: 2% 아가로스 (Thermofisher, catalog no. G501802). Gel Extraction Kit: QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, #28704)). 정량은 상기와 같이 수행하여서, 시퀀싱을 위해 적절한 300-800 bp 크기를 갖는 라이브러리가 제공되었다 (도 14D).
시퀀싱은 MiSeq Sequencer (Illumina®, Inc.)를 사용하여 수행하였다. 시퀀싱 결과의 초기 분석은 블랭크 대조군 이출로 수득된 데이타가 DNA 보유 비드의 이출 그룹과 상이한 것으로 보이고, 시퀀싱 판독치가 양성 대조군 서열과 관련된 것으로 보인다는 것을 의미하였다. (데이타는 도시하지 않음). 블랭크 대조군 이출 내에서 바코드 식별 분석하였고, 이것은 가장 높게 대표되는 바코드가 양성 대조군 비드로부터 유래되었다는 것을 보여주었다. (데이타는 도시하지 않음). 바코드가 특별한 NanoPen 챔버와 연결가능하였기 때문에, 세포 바코드의 비교는 검출 및 이출 비드 ("이출")로부터의 세포 바코드는 검출되었지만 이의 특별한 NanoPen 챔버 위치로부터 이출되지 않은 세포 바코드 ("비이출")보다 훨씬 더 나타났다는 것을 보여주었다. 도 15A에 도시된 바와 같이, 히트맵 대표도는 "DU"로 표지된, NanoPen 챔버로부터 이출된 것으로 알려진 비드로부터 검출된 바코드의 거대 그룹 ("이출")을 도시하였다. 대부분의 검출된 DU 바코드는 보다 빈번하게 식별된 서열을 표기하는 히트맵의 더 높은 y-축 위치에 있었다. 이출되지 않은 비드와 회합된 것으로 알려진 검출 바코드의 더 작은 세트는 "DN" (예를 들어, 검출되었지만 비이출됨)으로 표지된 컬럼에 도시되어 있다. 다시, 각각의 DN 바코드의 수직 위치는 이의 바코드 서열 식별의 상대적 빈도를 의미하였다. 시퀀싱은 MiSeq Sequencer (Illumina®, Inc.)를 사용하여 수행하였고 55 사이클의 시퀀싱이 40 bp의 바코드 및 10 bp의 UMI의 서열에 대해 판독 1에서 수행되었다. 4회의 추가 사이클이 전체 길이 바코드의 처음 2개 "단어" 사이에서 요구되었고 4 bp로서 이후의 2개는 이러한 특정 실험에서 바코드 결찰에 사용되었다. 마지막 사이클은 베이스-콜링 목적으로 사용되었다. 추가의 8 bp가 서열분석되었는데, 이것은 Nextera Library 제조 동안 첨가된 풀 인덱스를 의미하고 동일한 시퀀싱 작업시 몇몇 칩/실험의 복합화를 가능하게 하였다. 마지막으로, cDNA의 서열 (전사물/유전자)을 제공하는 추가 46 사이클의 시퀀싱이 판독 2 (양측 작업)로 수행되었다. 추가 사이클은 사용된 시퀀싱 키트 및 바람직한 정보에 따라서 수행되는 것이 가능하다. 도 15B는 동일 데이타의 상자그림 도면을 도시하였다. 이론에 국한하지 않으나, 검출되었지만 비이출 위치로부터의 이들 세포 바코드는 프라이머 및/또는 비드 합성의 아티팩트로서 발생될 수 있었다. 시퀀싱 데이타에서 확인된 바코드의 표시의 비교는 비드 이출 샘플이 블랭크 이출로부터 회수된 바코드와 상딩하 상이한 것으로 보인다는 것을 보여준다.
도 16A 및 B는 이들 방법을 사용한, 시퀀싱 데이타 및 라이브러리 제조의 추가적인 품질 평가를 예시한다. 도 16A는 역전사 단계가 수행된 시간 길이를 다르게 (60분, 90분) 하여, 상기와 같이 수행된 2회의 상이한 실험, A 및 B를 열거한다. 실험 A는 108개 비드의 이출에 의해 생성된 DNA 라이브러리로부터의 데이타를 포함하였다 (108개 세포 유래 RNA 포획). 실험 B는 120개 비드의 이출에 의해 생성된 DNA 라이브러리로부터의 데이타를 포함하였다 (120개 세포 유래 RNA 포획). 도 16B에서, 전체 컬럼은 각 실험에 대한 시퀀싱 데이타로부터 수득된 전체 판독수를 보여주었다. 지정된 컬럼은 1) 바코드에 대해 맵핑되고 2) 사전 선택된 품질 한계치 이상의 시퀀싱 품질을 갖는 판독수를 나타내었다. 정렬된 컬럼은 관심 게놈에 대해 맵핑된 판독수를 도시하였다. 위유전자, 오주석된 유전자, 및 참조되지 않은 유전자간 영역에 대해 맵핑된 지정된 판독치는 제거하여 그 전체를 수득하였다. Mito Total 컬럼은 일반적으로 높은 수의 미토콘드리아 유전자를 발현하는, 빈약한 생리학적 조건의 세포와 관련된, 미토콘드리아 참조에 대해 맵핑된 판독수를 포함하였다. Mito UMI 컬럼은 미토콘드리아 참조에 대해 맵핑된 별개의 고유 분자 식별자에 의한 판독수를 나타내었다. Refseq Total 컬럼은 Refseq UMI 컬럼이 mRNA Refseq 참조에 대해 정렬된 별개 UMI의 판독수를 나타내고, 세포 용해 시 포획 비드에 의해 포획된 본래 분자수를 나타내는 mRNA Refseq 참조에 대해 정렬된 판독수를 나타내었다. 모든 이들 번호는 이들 방법에 의해 제공된 DNA 라이브러리가 세포의 레파토리를 의미하는, 양호한 품질 시퀀싱 데이타를 산출한다는 것을 의미한다.
일부 다른 분석을 사용하여 시퀀싱 샘플 라이브러리의 품질을 평가하였다. 오프-칩 실험을 동일한 세포의 풀로부터 추출된 1 ng의 총 RNA를 사용하여 수행하였다. cDNA는 모두 256개 바코드 조합을 함유하는 비드의 믹스를 사용해 제조하였다. 후속 처리 단계는 상기에 기술된 대로 수행하여서, 바코드의 식별을 필요로 하지 않는, 벌크 대조군을 제공하였다. 동량의 입력 DNA가 각각의 이들 입력으로부터 시퀀싱되었다. 이들 샘플로부터 수득된 시퀀싱 데이타의 비교는 도 16C 및 D에 도시되어 있다. 시퀀싱 데이타 내에서 식별가능했던 바코드 판독의 백분율은 총 판독수의 약 78% 내지 약 87% 범위였고 시퀀싱 판독으로 포괄되는 서열은 기준 전사체와 정렬시 약 49% 내지 약 61% 범위였다 (도 16C). 마지막으로, 상위 5개 발현 유전자는 세포 유형 및 기원과 일관되게, RPl28 (리보솜 단백질); Emb (B 세포 특이적); Rpl24 (B 세포 특이적); Dcun1d5 (B 세포 특이적), Rp35a (리보솜 단백질) 및 Ddt (B 세포 특이적)를 포함하였다 (도 16D). 도 17은 90분 역전사 반응 기간을 사용한 실험 (100, 98, 105, 106)에 걸쳐서, 바코드의 세트가 다양한 실험 각각 사이에 검출되었고, NanoPen 챔버로 비드 전달의 양호한 무작위화를 시사한다는 것을 보여주었다. 4회 실험 각각 (실험 100, 98, 105, 106)에 대한 오프-칩 실험 (표지된 256), 블랭크 (XXX-bl) 및 이출 비드 데이타의 비교는 도 18에 도시되어 있다. 도 18은 많은 NanoPen 챔버에 대해 시퀀싱된 판독치의 검색을 보여주었다. 각 실험의 경우에, XXX-E1은 cDNA 장식된 비드의 제1 이출이었고, XXX-E2는 동일 펜으로부터의 후속하는 제2 이출이었다. 도 18의 바이올린 그래프의 y 축은 각 샘플 유래 바코드 판독량이었다. 오프-미세유체 장치 대조군 (256)은 균등하게 표시된 모든 바코드를 가졌다. 이출된 비드 데이타 (XXX-E1 또는 XXX-E2)는 표시된 모든 바코드 미만으로 확인되었고 바코드 판독량도 역시 덜 균등하게 표시되었다. 놀랍지도 않게, 샘플 XXX-E2는 판독치가 더 적게 확인되었지만 보다 더 가변적인 이들 판독수가 확인되었다. 마지막으로, 블랭크 판독은 이전에 기술한 바와 같이, 매우 낮은 바코드 반독수를 보였지만, 타당한 발생 빈도를 갖는 하나 또는 2개의 판독치를 가졌다.
실시예 2. T 세포 표현형, 배양, 어세이 및 RNA 시퀀싱. 게놈 정보와 표현형의 연결.
미세유체 시스템, 재료 및 방법은 다음을 제외하고, 실험 1에서와 동일하였다:
세포: 대조군 세포는 인간 말초 혈액 T 세포였다. 샘플 세포는 인간 종양 샘플로부터 유래된 인간 T 세포였다.
배양 배지: RPMI 1640 배지 (Gibco, #12633-012), 10% 태아 소 혈청 (FBS), (Seradigm, #1500-500); 2% 인간 AB 혈청 (Zen-bio, #HSER-ABP100ml), IL-2 (R&D Systems, 202-IL-010) 2 U/mL; IL-7 (PeproTech, #200-07) 10 ng/mL; IL-15 {PeproTech, #200-15) 10 ng/mL, 1× Pluronic F-127 (Life Tech Catalog No. 50-310-494).
인간 종양 샘플로부터 유래된 인간 T 세포는 항체 오프-칩으로 염색되었고 그 다음으로 5xE6 세포/mL 밀도의 밀도로 OptoSelect 장치의 미세유체 채널에 유입되었다. 항원 양성 T 세포 (P-Ag) 및 항원 음성 세포 (N-Ag) 둘 모두는 광학적으로 작동되는 유전영동력에 의해서 이동되어 단일 T 세포가 개별 NanoPen 챔버에 고립되어, 다수의 이주된 NanoPen 챔버를 형성하였다.
인간 말초 혈액 T 세포는 4일 배양 기간 (도 19) 동안, CD3/28 비드 (Dynabeads® Human T-Activator CD2/CD28, ThermoFisher No. Gibco™ #11131D)의 존재 하에서 활성화되어서, 활성화되었지만 항원 특이적이지 않은 개체군을 형성하였다. 표지된 항원의 처리에 의해서 표지된 대조군-활성화 T 세포가 생성되지 않았다. 이들 대조군 활성화된 T 세포의 개체군은 5xE6 세포/mL의 밀도로 미세유체 채널로 유입되었고 선택된 다수의 대조군 활성화된 T 세포는 종양 샘플로부터 유래된 T 세포 세트를 함유하는 NanoPen 챔버 세트와는 상이한, 다수의 Nanopen 챔버의 각각으로 단일한 대조군 활성화된 T 세포가 위치되도록 광학적으로 작동되는 유전영동력을 통해서 이동되었다.
각각의 점유된 챔버에, 결찰 (이러한 특별한 실험에서)을 통해서 합성된 단일한 바코드화된 비드를 첨가하였다. 각각의 비드는 상기에 기술된 바와 같이 프라이밍 서열, 바코드 서열, UMI 서열, 및 포획 서열을 포함하였다. 상기 기술된 바와 같이, 용해 및 RNA의 포획이 후속되었다. 사용된 조건 하에서, 핵막은 파괴되지 않는다. 방출된 mRNA는 동일한 NanoPen 챔버 내에 존재하는 바코드화된 비드 상에서 포획되었다.
도 20A, 21A, 및 22A에서, 4개의 사진 이미지 세트는 대표적인 점유된 Nanopen 챔버를 예시한다. 좌측에서 우측으로, 각각의 사진 세트는 1) 광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용하여 NanoPen 챔버에 위치 후 T 세포의 명시야 조사; 2) 항원-특이적 염색에 대해 프로빙된 형광성 검출 (텍사스 레드 채널); 3) 하나의 바코드화된 포획 비드가 광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용해 이입된 후 Nanopen 챔버의 명시야 조사; 및 4) 용해 후 명시야 조사를 보여준다. 상기처럼, 용해 조건은 세포는 파열시키지만 핵막은 파괴하지 않았다.
도 20A에서, 1446개의 위치 식별자를 갖는 NanoPen 챔버가 하나의 세포에 의해 점유된 것으로 확인되었다. 이러한 세포는 형광성 신호를 갖는 (NanoPen 챔버 내에 흰색 원형 내에 도시됨), 도 20A의 세트 중 두번째 사진으로 도시된 바와 같이, 항원 양성 염색 세포 (P-Ag)였다. 도 20A의 세트 중 세번째 사진은 단일 비드가 NanoPen 챔버 내에 위치되었다는 것을 도시하였고, 도 20A의 세트 중 4번째 사진은 비드 및 나머지 핵이 여전히 NanoPen 챔버 내에 위치하고 있다는 것을 보여준다. 도 21A에서, NanoPen 챔버 547번으로 세포 (제2 세트의 첫번째 사진) 및 비드 (제2 세트의 세번째 사진)의 유사한 위치가 도시되었다. 그러나, 이러한 세포는 항원으로 염색되지 않았고; t 형광성 신호가 도 21A의 사진 세트의 두번째 사진에서 검출되지 않았다. 그러므로, 이러한 세포는 항원 음성 T 세포 (N-Ag)로서 식별되었다. 도 22A에서, 대조군 활성화 T 세포를 함유하는 NanoPen 챔버, 3431에 대해서 동일한 세트의 사진이 도시되었다. 예상하는 바와 같이, 제2 사진 세트에서 형광성 신호가 존재하지 않았고, 이러한 세포가 항원 양성이 아니라는 것을 확증해 준다.
RNA 방출, 포획, 라이브러리 제조 및 시퀀싱. 미세유체 환경 내에서 역전사 및 바코드 판독에 대해 실시예 1에 기술된 프로토콜을 수행하였고 각 NanoPen 챔버에 대한 바코드의 식별을 기록하였다. 도 20B, 21B 및 22B에서, 개별적인 챔버의 바코드 검출 공정의 이미지가 도시되어 있다. NanoPen 챔버 1446은 바코드 A1B1C1D4를 함유하는 비드를 갖는 것으로 결정되었고; NanoPen 챔버 547은 바코드 A1B3C3D4를 갖는 비드를 가졌고; NanoPen 챔버 3431은 바코드 A2B3C4D4를 함유하는 비드를 가졌다. 비드 이출, 및 오프 칩 증폭, 태그먼트화, 정제, 및 이출된 장식된 비드로부터 cDNA의 크기 선택은 실시예 1에 기술된 대로 수행하엿다.
시퀀싱은 MiSeq Sequencer (Illumina®, Inc.)를 사용하여 수행하였다. 제1 시퀀싱 판독은 40 bp의 바코드 및 10 bp의 UMI의 서열에 대한 판독 1에서 55 사이클로 시퀀싱되었다. 이 특별한 실험에서 바코드 결찰에 추가의 4 bp가 사용되었으므로 4회의 추가 사이클이 전체 길이 바코드의 처음 2종 카세트형 서열과 마지막 2종 카세트형 서열 사이에 필요하였다. 마지막 사이클은 베이스-콜링 목적으로 사용되었다. 제2 시퀀싱 판독은 Nextera 라이브러리 제조 동안 첨가된 풀 인덱스를 의미하는 8 bp를 시퀀싱하여서, 동일한 시퀀싱 작업시 몇몇 실험의 복합화를 가능하게 하였다. 마지막으로, 추가의 46사이클은 cDNA (전사체/유전자)의 시퀀싱을 제공하는 판독 2 (양측 작업)에서 시퀀싱되었다. 보다 긴 판독치가 수득되었지만, 바람직하다면, 이 실험에서 사용하지 않았다.
도 23은 각각의 컬럼이 1) 종양 항원 노출, 항원 양성; 2) 종양 항원 노출, 항원 음성; 또는 3) 음성 대조군, 활성화된 T 세포이지만 항원 비노출인, NanoPen 챔버 내 하나의 세포로부터 단일 바드에 포획된 RNA를 나타내는, 격리 펜의 컬럼을 갖는 이 실험의 시퀀싱 결과의 히트 맵을 도시한다. 컬럼은 유전자 발현 정보와 상관있는, 시퀀싱 판독치의 그들 유사성에 따라서 배열된다. 색상 (진한 밴드 대 연한 밴드)은 발현 수준을 표시하였다. 컬럼 1-14는 컬럼 15-36 보다 서로 더 밀접하게 관련되었다. 판독가능한 바코드가 각 컬럼 (각각의 비드, 하나의 세포 유래)에 대해서 식별가능하였으므로, 비드가 회수된 위치가 결정되었고, RNA를 공급한 세포의 표현형이 결정되었다. 예를 들어, NanoPen 챔버 1446 (labelled 2EB1p_1466 (P-Ag)로 표지, 그룹 A 내의 컬럼 #6에서 확인), 547 (2EB1n_547 (N-Ag), 그룹 A 내 컬럼 #8에서 확인), 및 3431 (EA1NC_3431 (NC)로 표지 그룹 B 내 컬럼 #33에서 확인)로부터의 상기 식별된 3개 비드는 개별적으로 강조하고 표지된 컬럼에 도시된 유전자 발현을 제공하였다. 컬럼 15-36 (히트 맵의 상단에 관련성 괄호로 그룹 B로 클러스터링, 및 컬럼 1-14 (그룹 A)에 대한 유전자 발현간 편차는 종양 항원 노출에 실질적으로 의존적인 것으로 확인되었다. 그룹 A의 실질적으로 모든 컬럼 1-14에 대한 소스 세포는 항원 염색에 대해 양성 또는 음성인지 무관하게 종양 항원에 노출되었다. 대조적으로, 컬럼 15-36의 모든 소스 세포는 음성 대조군 세포였고, 종양 항원에 노출된 적이 없었다. 각각의 컬럼은 한 실험에 대한 시퀀싱 판독을 나타내고 색상은 발현 정도를 나타낸다. 각각의 비드-활성화되고, 항원 비특이적인 대조군 T 세포 (NC)의 시퀀싱 판독은 항원-양성 종양 유래 T 세포 (P-Ag) 또는 항원-음성 종양 유래 (N-Ag) T 세포의 시퀀싱 판독치 중 하나와 명확하게 구별가능하였다. 특이적이고 구별가능한 단일 세포 RNA 시퀀싱이 입증되었다. 추가로, 표현형 정보는 단일 세포에 대한 유전자 발현 프로파일과 연결가능하다는 것이 확인되었다.
실시예 3. OKT3 세포에 대해 입증된 바와 같은 DNA 포획, 시퀀싱 라이브러리 제조 및 시퀀싱 결과. 장비, 프라이밍 및 관류 계획, 세포 소스 및 제조는 특별히 본 실시예에서 언급하지 않으면, 상기 일반 방법처럼 사용/수행하였다. 배지 및 OptoSelect 장치는 달리 명시하지 않으면 37℃에서 유지되었다.
Figure pct00007
이 실험은 Nextera 시퀀싱 라이브러리 (Illumina)가 용액 중 하나의 자유 프라이머 및 비드에 부착된 하나의 바이오틴화된 프라이밍 서열 (바코드 보유)을 사용하는 등온 PCR에 의해 생성될 수 있다는 것을 입증한다. OKT3 세포 (150)는 OptoSelect 장치로 이입되었고, 광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용해 NanoPen 챔버로 로딩되었다. 도 24는 NanoPen 챔버로 전달 이후 세포를 도시하였다. 광학적으로 작동되는 유전영동력은 7개 NanoPen 챔버에 대해서 NanoPen 챔버 당 하나의 세포를 전달하였고, 1개 NanoPen 챔버로 세포의 전달은 놓쳤고, 1개 NanoPen 챔버에 2개 세포를 전달하여서, NanoPen 챔버 당 실질적으로 오직 하나의 세포만을 전달하였다.
용해. 용해 과정은 자동화된 순서를 사용하여 수행하였지만, 각 단계의 수동 제어를 통해서 적합하게 수행해도 된다. 용해 완충액을 OptoSelect 장치 (Buffer TCL (Qiagen, Catalog # 1031576)로 흘려주었고 그 이후에 흐름을 2분 동안 중지시켜서 펜으로 완충액 확산이 가능하게 하였다. 세포막 및 핵막 둘 모두의 용해가 실시되었다. 이어서 OptoSelect 장비는 각각의 50 마이크로리터 플러시 이후에 30초 휴지기를 포함하여, 50 마이크로리터의 배양 배지로 3회 플러싱되었다. 800 마이크로그램/밀리리터 농도의 프로테이나제 K (Ambion Catalog # AM2546, 20 mg/mL)가 OptoSelect 장치로 유입되었고 20분 동안 관류없이 유지되었다. 프로테이나제 K는 NanoPen 챔버로 확산되었고 원치않는 단백질을 가수분해시켰으며 염색질을 파괴하여 gDNA 추출을 가능하게 하였다. 완료 후, OptoSelect 장치는 각 흐름 이후 10분간 유지 기간을 포함하여 50 마이크로리터의 PBS의 3회 사이클로 플러싱되었다.
1×PBS 중 1:1000으로, SYBR® Green I 착색제 (ThermoFisher Scientific, Catalog # S7585)에 의한 염색을 수행하여, 도 25에 도시된 바와 같이, 조밀한 DNA (2510)가 존재한다는 것을 입증하였다. 추가적으로, NanoPen 챔버를 통해서 양쪽 방향 (위와 아래, 교차)으로 수직으로 스캔하는 광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용한 스윕을 수행하였다. 도 25에서, 수직 "교차" 스윕을 생성시키는데 사용된 2개 광패턴 ("OEP 막대")이 도시되어 있다. 이것은 핵의 방출된 DNA (2515)로부터의 흐릿하고 확대된 형광성 신호 영역을 생성시켜서, 조밀한 형태로부터, 핵막의 용해를 의미하는 더 크고, 보다 분산된 영역으로 조밀한 DNA를 유인하는 능력을 입증하였다. 도 26A는 용해 전에 염색된 OKT3 세포를 각각 함유하는 특별한 NanoPen 챔버 세트의 사진을 도시하고, 도 26B는 OEP 스윕 이후 동일한 NanoPen 챔버의 사진을 도시하며, 챔버 내 더 큰 영역으로 착색제 (예를 들어, DNA)의 분산을 입증한다.
태그먼트화. 트랜스포사제를 사용한 DNA의 태그먼트화. 태그먼트화를 위한 프로토콜은 3.3 마이크로리터의 태그먼트 DNA 완충액 (TD); 16 마이크로리터의 태그먼트 DNA 효소 믹스 (TDE1 Buffer); 및 14 마이크로리터의 뉴클레아제 무함유 H2O (Ambion Cat. # AM9937)를 함유하는 15 마이크로리터 부피의 트랜스포솜 시약 (Nextera DNA Library Prep Kit, Illumina, Cat. # 15028212)을 OptoSelect 장치에 도입시켜서 후속하였다. 태그먼트화 시약은 15분 기간 동안 Nanopen 챔버로 확산시켰다. 이어서 OptoSelect 장치는 100 마이크로리터의 PBS에 의한 입구부 및 출구부 라인의 청소, 및 50 마이크로리터의 PBS를 사용한 장치 자체의 플러싱을 포함하여, 광범위하게 플러싱되었다. 도 27은 이 프로토콜을 통해 수득된 태그먼트화된 산물의 크기의 그래픽 분포도를 도시하는데, 최대 분포는 300 bp 바로 아래이고 약 600 bp를 초과하는 크기를 갖는 태그먼트화 산물은 거의 없어서, 대량 동시 시퀀싱 방법을 위한 적합성이 입증되었다.
비드에 DNA 포획. 바이오틴화된 16 미크론 폴리스티른 포획 비드 (Spherotech)는 스트렙타비딘 표지된 올리고뉴클레오티드에 의해 개질되었다. 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3' 순서로, 프라이밍 서열, 바코드 서열, 및 포획 서열 (예를 들어, 모자이크 서열)을 포함하였다. 바코드 서열는 적어도 하나의 하위-바코드 모듈을 함유하여서, OptoSelect 장치의 특별한 NanoPen 챔버 내에서 소스 세포의 식별을 가능하게 하였다. 올리고뉴클레오티드 내에 도입된 프라이밍 서열은 이 실험에서, P7 (P7 어댑터 서열)이었다. (그러나, 다른 프라이밍 서열 예컨대 RPA 공정의 중합효소 및 리콤비나제와의 상용성을 위해 특이적으로 디자인된 프라이밍 서열 또는 P5를 활용해도 된다. 최대 약 300 rpm (VWR 아날로그 와류 믹서)의 속도로 교반하면서 1 M NaCl, 20 mM Tris HCl, 1 mM EDTA 및 0.00002% Triton-X를 함유하는 결합 완충액 중에서 15분 동안 과량의 SA-올리고뉴클레오티드와의 결합 이후에, 비드는 신선한 결합 완충액의 3 분취액으로 세척한 후에, 50 마이크로리터의 PBS로 세척되었다. P7 프라이밍 서열(시퀀싱 어댑터)/바코드/ 포획 서열 올리고뉴클레오티드를 함유하는 신선하게 제조된 비드를 용해 전에 세포를 함유한 NanoPen 챔버에 전달하였다. 이 단계는 NanoPen 챔버로 OEP 전달을 포함하여 자동화된 순서를 사용해 수행되었지만, 역시 원한다면 수동으로 수행해도 된다. 이 실험에서, 사용된 특정한 자동화 공정은 완료까지 1시간이 걸렸다. 보다 신속한 전달이 유리할 수 있다. 추가적으로 37℃ 이하로 저하된 온도가 효율적인 DNA 포획에 유리할 수 있다.
등온 증폭. 층 상에 포획된 DNA의 등온 증폭은 공정 동안 형성된 대치 루프 (D-루프)를 안정화시키는 단일-가닥 DNA (ss-DNA) 결합 단백질을 역시 포함하는, 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 반응, (TwistAMP TABA S03, TwistDX,)을 사용하여 수행되었다. 또한 반응 혼합물에 P5-모자이크 서열, P7 및 P5 프라이머 (IDT)가 존재하였다. 다음의 혼합물: TwistDx 키트의 건조 효소 펠렛; 27.1 마이크로리터의 재현탁 완충액; 2.4 마이크로리터의 10 마이크로몰 P5 프라이머; 2.4 마이크로리터의 10 마이크로몰 P7 프라이머; 및 2.4 마이크로리터의 10 마이크로몰 P5 말단 인덱스 프라이머 (예를 들어, S521)를 2.5 마이크로리터의 280 밀리몰 마그네슘 아세테이트 (MgOAc)에 첨가하였고 미세원심 튜브 내에서 와류시켰다. 15 마이크로리터의 이러한 가용화되고 스피닝된 용액을 1 마이크로리터/초의 속도로 OptoSelect 장치의 미세유체 채널에 이입시켰고, NanoPen 챔버로 확산되어서, 40분 내지 60분 동안 비드 상에 포획된 DNA와 접촉될 수 있게 하였다.
등온 증폭 기간의 완료 후에, 50 마이크로리터의 유체 매질은 PBS를 사용하여 OptoSelect 장치로부터 이출되었다. NanoPen 챔버 밖으로 확산된 증폭된 DNA를 함유하는 이출 용액 ("즉시 이출")은 1× AMPure® 비드 (Agencourt Bioscience)를 사용하여 청소되어서, 프라이머 및 100 bp 크기 미만의 다른 핵산 물질을 제거하였다.
채널로 확산되지 않은 비드 및 증폭된 DNA를 여전히 함유하는 OptoSelect 장치는 4℃에서 밤새 유지시켰고, 50 마이크로리터의 PBS를 사용한 제2 이출을 수행하고, 증폭 산물을 포획하여 미세유체 채널 "제2 이출"에 존재하게 하였다. 2개 샘플은 정량 및 크기 분석을 위해 PCR을 통해서 더욱 개별적으로 증폭되었고, 그 각각은 KAPA HiFi Hotstart (KAPA Biosystems), 1 마이크로리터의 10 마이크로몰 P5 프라이머, 및 1 마이크로리터의 10 마이크로몰 P7 프라이머와의 25 마이크로리터 반응물에서 5 사이클 PCT를 사용하였다. 즉시 이출 및 제2 이출 샘플의 각각은 1× AMPure® 비드를 사용한 처리를 반복하여 프라이머를 제거하도록 청소되었다. 즉시 이출은 샘플은 약 312 bp의 평균 크기를 갖는, 시퀀싱에 적합한 단편 크기를 갖는 총 40 ng을 산출시켰다 (데이타는 도시되지 않음). 제2 이출 샘플은 총 85 ng을 산출하였는데, 평균 크기가 약 760 bp (데이타는 도시되지 않음)여서, NGS 동시 기술에 의핸 추가 시퀀싱에 적합하지 않았다.
즉시 이출 샘플은 공유 Miseq 대량 동시 시퀀싱 실험 (Illumina)에서 시퀀싱되었다. 포괄도는 낮았지만 (평균 = 0.002731), 도 28에 도시된 바와 같이, 마우스 게놈 전반에서 판독치가 맵핑되었다. 도 28에서, 각각의 염색체는 x 축을 따라서 디스플레이된다. 좌측 연한 색상 막대는 각 염색체의 예상 길이를 나타내는 반면 우측 진한 색상 막대는 즉시 이출 샘플 유래 데이타에서 확인된 전체 맵핑 파독치의 백분율을 나타낸다. 일부 염색체 (chr 2, chr 16)가 데이타에서 과대표시된데 반해, 다른 염색체는 과소표시되었다 (chr 8, chr 12, chr 15). 세포가 암컷 마우스로부터 기원된 것이므로, 예상한 바와 같이, Y 염색체에 대한 판독치는 수득되지 않았다는 것을 언급한다. 허용가능하게 낮은 수준의 어댑터 오염 (0.000013%)이 확인되었다. 추가적으로, 특정한 관심 서열이 또한 데이타 (예를 들어, CXCR4 서열, 데이타는 도시되지 않음)에서 확인되었다.
실시예 4. 인간 B-림프구 유래 인간 LCL1 세포 및 OKT3 세포의 혼합물의 DNA 단리, 라이브러리 제조, 및 시퀀싱. LCL1 세포의 공급처: Coriell Institute. 카탈로그 번호: GM128781C. 배양에 사용된 배지는 RPMI-1640 (Life Technologies, Cat #11875-127), 10% FBS, 1% Pen/Strep (1000 U/mL), 2 mM 글루타맥스이다.
실험은 150 OKT3 세포: 150 Hu LCL1 세포 또는 75 OKT3 세포:75 Hu LCL1 세포를 사용하였다. 세포는 각각의 OKT3 및 각각의 Hu LCL1 세포의 위치를 알도록, OEP 력을 사용하여, 챔버에 하나의 세포씩, 개별 NanoPen 챔버로 특이적으로 전달되었다.
용해 및 태그먼트화 과정은 실시예 3처럼 수행되었지만, 모자이크 말단 플러스 삽입 서열이 하기 서열 중 하나를 갖는 트랜스포사제에 의해서 단편화된 DNA에 첨부되었다:
Tn5ME-A (Illumina FC-121-1030), 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID No. 161);
Tn5ME-B (Illumina FC-121-1031), 5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO.162)
특이적 전달은 오직 OKT3 세포-함유 NanoPen으로의 제1 고유 바코드를 갖는 바코드화된 비드의 제1 세트에 의해 수행되었고, 이후에 제2 고유 바코드를 갖는 바코드화된 비드의 제2 세트를 오직 Hu LCL1 세포-함유 NanoPen으로만의 특이적 전달로 수행하였다. 이것은 각각의 비드 세트로부터 증폭된 DNA에 특이적 식별자를 제공하여서, 마우스 DNA 판독치를 다시 마우스 세포에 대해 맵핑할 수 있고, Hu LCL1 세포 DNA 판독치는 인간 세포에 대해 다시 맵핑할 수 있다. 비드는 태그먼트화 단계 이후에 NanoPen 챔버에 전달되었다. 등온 증폭은 실험 3에서 처럼 수행되어서, 5.67 ng (총 300개 세포 유래) 또는 2.62 ng (총 150개 세포 유래)이 산출되었다. 상기에 기술된 바와 같이 작동된, 2 사이클의 PCR이 각각의 라이브러리에 대해서 수행되어 NGS 시퀀싱을 위한 P5, P7의 존재를 보장하였고, 유사하게 청소 단계를 수행하였다. 도 29A (150개 세포 유래) 및 29B (300개 세포 유래)는 후속 2사이클 PCR 증폭 및 청소 단계 이후에 개별적으로 2종 (OKT3/hu LCL1)의 DNA 라이브러리를 보여준다. 이들 결과는 도 29C (OKT3) 및 도29D (hu LCL1)에 도시된 바와 같이, 표준 웰 플레이트 형식으로 개별적으로 처리된 OKT3 세포 및 또한 hu LCL1 세포로부터 생성된 대조군 라이브러리의 크기 분포 추적자와 비교할 수 있다. 비교는 미세유체 프로토콜 내에서 보다 이상적인 단편 분포를 수득하기 위해서 추가적인 최적화가 바람직할 수 있다는 것을 의미한다. 혼합된 OKT3/hu LCL1 DNA 라이브러리로부터의 시퀀싱 결과는 2개 바코드 각각을 갖는 판독치가 수득되었다는 것을 보여주었다 (데이타는 도시되지 않음).
인-시츄 바코드 검출. 증폭된 DNA 산물의 이출 이후에, 상기 기술된 바와 같이 형광 표지된 하이브리드화 프로브의 순차적인 흐름이 바코드 위치를 식별하였다.
실시예 5. DNA 단리, 라이브러리 제조 및 증폭 작업흐름 순서 내에 바코드화된 비드의 도입 및 바코드화된 비드의 인-시츄 검출. 이론에 국한하고 싶지 않지만, 트랜스포존의 활성은 단일 가닥 결합된 올리고가 아닌, 이중 가닥 핵산을 향해 유도된다. 이들 조건에 대한 포획 비드의 강건함은 필연적인 실험으로 확인되었다. 실험 3에서 제조된 바와 같이, 비드, 20 마이크로리터를 동일 실험 조건 하에서 태그먼트화 반응 시약에 노출시켰다. 트랜스포존-노출 비드 및 비노출 대조군 비드 둘 모두를 1.4 ng의 인간 표준 DNA와 접촉시켰다. 2.4 마이크로리터의 각각의 비드 세트를 2.4 마이크로리터의 RPA (S521) 중 쌍형성 프라이머 (S521, Illumina)를 사용하여, 등온 증폭에서 사용하였고, 실질적으로 유사한 양의 증폭된 DNA를 제공하였다. 결과는 DNA 포획에서 사용하기 전에 트랜스포존된 노출된 포획 비드가 타당하게 균등한 양의 증폭 산물을 산출하는 것을 보여주어서, 트랜스포존이 포획 비드 상의 포획 올리고뉴클레오티드를 분해하지 않는다는 것을 시사한다.
Figure pct00008
실시예 6. RNA 시퀀싱이 수행된 동일 세포 유래 핵 DNA의 시퀀싱. 도 30A-F는 각각 OKT3 세포 및 포획 비드를 함유하는 OptoSelect 장치의 4개 NanoPen 챔버의 열을 도시한다. 실험 1에서 처럼 RNA 포획, 태그먼트화 및 이출을 수행한 프로토콜 과정 동안에 일련의 사진을 찍었다. NucBlue® LiveReady Probes® Reagent (Molecular Probes, R37605) 착색제를 이입 전에 세포에 첨가하였다 (2액적을 이입 직전에 200 마이크로리터의 세포 용액에 첨가함). 프로토콜 전반에서 추가의 착색제를 첨가하지 않았다. 각 세포의 핵 dsDNA를 염색하였고 염색을 RNA 포획, 태그먼트화 및 역전사 단계 전반에서 유지시켰다. 도 30A-30C는 명시야 조건에서 찍었고, 도 30D 내지 30F는 UV 여기 조사 (460 nm에서 최대 발광으로, DNA에 결합시 360 nm에서 여기) 하에서 찍었고 400-410 nm에서 DAPI 필터를 통해 가시화시켰다. 도 30A 및 30D는 각각 명시약 및 DAPI 필터 노출 하에서, 용해 전 시점에 세포를 함유하는 동일한 NanoPen 챔버의 쌍 이미지이다. (3002)는 바코드화된 비드이고 (3004)는 동일한 NanoPen 챔버 내의 생물학적 세포이다. 도 2의 4개 NanoPen 챔버 중 다른 것의 다른 비드 및 다른 세포가 역시 가시화되었지만, 표지되지는 않았다. 도 30B 및 30E는 각각 명시야 및 400 nm 조사 하에서, 도 30A 및 30C에 도시된 것과 동일한 NanoPen 챔버의 쌍 이미지이다. 이들 사진은 실험 1에 기술된 바와 같이 외막 용해를 완료한 후에 찍었다. 핵 DNA (3004)는 400 nm 여기 조사 하에서 여전히 가시화되어 있을 뿐만 아니라 (도 30E), 핵 (3004)의 형상이 여전히 비드 (3002)와 함께 명시야 하에서 남아있다. 도 30C 및 30F는 도 30A-30D에서와 같은 4개 NanoPen 챔버 그룹 내의 동일 세포에 대한 각각 쌍 이미지, 명시야, 및 400 nm 여기 조사이다. 도 360C 및 30F의 사진은 역전사가 완료되고, cDNA 장식된 바코드화된 비드 (3002')가 각각의 NanoPen 챔버 밖으로 이출된 이후에 찍었다 (사진 상단의 미세유체 채널 내 3002 참조). 조밀한 핵 (3006)이 명시야 하에서 여전히 가시화되어 있고, 도 30F는 핵 (3006)이 여전히 핵 DNA를 함유한다는 것을 보여준다. 추가 염료를 첨가하지 않았으므로, 비드 상에 생성된 cDNA의 염색은 존재하지 않았다.
도 30A-30F는 RNA 포획/라이브러리 제조, 및 DNA 포획/라이브러리 제조에 대해 본 명세서에 기술된 프로토콜을 사용하여, 조밀한 핵이 영전히 DNA 라이브러리 제조를 위한 핵 dsDNA의 살아있는 공급원이었다는 것을 표시한다. 그러므로, RNA 및 DNA 둘 모두에 대한 시퀀싱 결과는 동일한 단일 세포로부터 수득될 수 있고, 시퀀싱된 RNA 및 DNA의 특이적 단일 세포 소스의 OptoSelect 장치 내 위치와 상호관련시킬 수 있다. RNA/DNA 시퀀싱 결과의 단일 세포 소스의 위치를 상호관련시키는 이러한 능력은 동일한 단일 세포, 예컨대 특이적 항원에 대한 항체를 생산하는 세포의 표현형 관찰과 더욱 상호관련시킬 수 있다.
바코드화된 프라이밍 서열 보유층의 도입 단계는 태그먼트화 단계 이전 또는 태그먼트화 이후에 적합하게 수행되는 것으로 확인되었다 (실험 3에서 처럼).
추가적으로, NanoPen 챔버 내에 위치된 바코드화된 비드 상에서 바코드(들)를 판독하는 단계는 태그먼트화 이전, 등온 증폭 이전, 증폭된 DNA의 이출 이전, 또는 증폭된 DNA의 이출 이후에 수행될 수 있다 (Exp. 4에 도시된 바와 같음). 대안적으로, 비드는 생물학적 세포의 이입 이전에 NanoPen 챔버 내에 놓여질 수 있다. 그러한 실시형태에서, 바코드는 또한 생물학적 세포가 미세유체 환경에 오기 전에 검출될 수도 있다.
실시예 7. OKT3 세포 및 OKT8 세포에 대해 입증된 바와 같은 B-세포 수용체 (BCR) 포획, 시퀀싱 라이브러리 제조 및 시퀀싱 결과.
세포: OKT3 세포, 마우스 골수종 하이브리도마 세포는 ATCC (ATCC® Cat. # CRL-8001™)로부터 수득하였다. 세포는 현탁 세포주로서 제공되었다. 배양은 약 1×105 내지 약 2×105 생존 세포/mL을 파종하고 가스 환경으로서 공기 중 5% 이산화탄소를 사용하여 37℃에서 인큐베이션하여 유지되었다. 세포는 2일 내지 3일 마다 분할하였다. OKT3 세포수 및 생존능을 계측하였고 세포 밀도는 미세유체 장치에 로딩을 위해서 5×105/mL로 조정하였다.
OKT8 세포, 마우스 골수종 하이브리도마 세포주는 ATCC (ATCC® Cat. # CRL-8014™)로부터 수득하였다. 세포는 현탁 세포주로서 제공되었다. 배양은 약 1×105 내지 약 2×105 생존 세포/mL을 파종하고, 가스 환경으로서 공기 중 5% 이산화탄소를 사용하여, 37℃에서 인큐베이션시켜서 유지되었다. 세포는 2일 내지 3일 마다 분할되었다. OKT8 세포주 및 생존능을 계측하였고 세포 밀도는 미세유체 장치에 로딩을 위해서 5×105/mL로 조정하였다.
배양 배지: 이스코브 변형 둘베코 배지 (OKT3의 경우; ATCC® Catalog No. 30-2005, OKT8의 경우; ATCC® Catalog No. 30-2005), 10% 태아 소 혈청 (ATCC® Cat. #30-2020) 및 10 mL 페니실린-스트렙토마이신 (Life Technologies® Cat. # 15140-122)을 배합하여 배양 배지를 제조하였다. 완전 배지를 0.22 ㎛ 필터를 통해서 여과시켰고 사용까지 빛을 피해서 4℃에 저장하였다.
인큐베이션 기간 동안 관료시, 배양 배지는 OptoSelect 장치로 도입 전에 공기 중 5% 이산화탄소로 계속적으로 컨디셔닝시켰다.
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Figure pct00011
실험:
OKT3 세포의 샘플을 200 마이크로리터 중 2E6의 밀도로 OptoSelect 장치에 도입시켰다. 대략 150개의 세포를 광학적으로 작동되는 유전영동력을 통해 이동시켜서 NanoPen 챔버 당 하나의 세포를 로딩하였다. 각각의 세포는 개구로부터 가장 멀리 미세유체 채널 (예를 들어, 고립 영역)로 챔버의 섹션 내에 위치시켰다. 이어서 OptoSelect 장치를 1회 50 마이크로리터의 프라이밍 매질로 플러싱하였다. 명시야 이미지는 이입된 OKT3 세포의 위치 (도시되지 않음)를 식별하기 위한 목적으로 OptoSelect 장치에서 찍었다. OKT8 세포의 샘플은 200 마이크로리터 중 2E6의 밀도로 OptoSelect 장치에 도입되었다. 대략 150개의 세포를 광학적으로 작동되는 유전영동력을 통해서 이동시켜서 OKT3 세포가 이입되지 않은 시계의 NanoPen 챔버 당 하나의 세포를 로딩하였다. 이어서 OptoSelect 장치는 1회 50 마이크로리터의 프라이밍 매질로 플러싱하였다. 명시야 이미지는 이입된 OKT8 세포의 위치 (도시되지 않음)를 식별하기 위한 목적을 위해 OptoSelect 장치에서 찍었다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 포획 올리고를 갖는 바코드화된 비드의 샘플 (2종의 예시적이지만, 제한적이지 않은 서열은 SEQ ID NO. 101 및 102이고, 표 2를 참조함)은 200 마이크로리터 중 2E6의 밀도로 OptoSelect 장치에 도입되었다. 단일한 고유하게 바코드화된 비드를 후속하여 각각의 점유된 챔버에 로딩하였다. 단일한 생물학적 세포를 갖는 NonoPen 챔버에 로딩된 비드의 총수는 126개였고, 57개 비드가 OKT3 세포에 대해 지정되었고 69개 비드는 OKT8 세포에 대해 지정되었으며, 또한 각각의 비드는 침투 유체 흐름을 겪지 않은 각 챔버의 일부분 내에 위치되었다. 이어서 OptoSelect 장치를 50 마이크로리터의 1× DPBS로 1회 플러싱하였다.
용해 시약 (Single Cell Lysis Kit, Ambion Catalog No. 4458235)을 미세유체 채널에 흘려주었고 NanoPen 챔버로 확산될 수 있게 하였다. 개별적으로 이입된 OKT3 및 OKT8 세포는 10분 동안 용해 완충액에 노출시켰다. 이어서 OptoSelect 장치는 30 마이크로리터의 1× DPBS로 1회 플러싱되었다. 용해는 용해 중지 완충액 (Single Cell Lysis Kit, Ambion Catalog No. 4458235)을 흘려주고 미세유체 채널에 흐름이 없는 동안 실온에서 2분 동안 인큐베이션시켜서 중지시켰다. 대안적으로, 용해 완충액 예컨대 10× 용해 완충액, 카탈로그 번호 635013, Clontech/Takara를 사용하여 유사한 결과가 제공될 수 있는데, 이것은 용해 중지 완충액의 사용을 요구하지 않는 장점이 있다. 이어서 OptoSelect 장치는 30 마이크로리터의 1× DPBS로 플러싱되었다. 사용된 조건 하에서, 핵막은 파괴되지 않았다. 방출된 mRNA는 동일한 NanoPen 챔버 내에 존재하는 바코드화된 비드 상에서 포획되었다.
포획된 RNA는 RT 시약 혼합물 (Thermo Scientific™ Maxima™ H Minus RT (Thermofisher, Catalog No. EP0751)) 및 주형 스위칭 올리고뉴클레오티드 (SEQ ID NO. 112)에서 흘려주어서 cDNA로 역전사시켰다. NanoPen 챔버로 효소의 확산은 16℃에서 20분 동안, 이후에 42℃에서 90분의 반응 기간 동안 가능하게 하였다. 역전사 이후에, 이어서 OptoSelect 장치는 30 마이크로리터의 1× DPBS로 1회 플러싱되었다.
다음으로 고유한 바코드는 본 명세서에 기술된 바와 같이 형광 표지된 하이브리드화 프로브의 복합 흐름에 의해 각 포획 비드에 대해 식별되었다. 형광 표지된 프로브의 각 세트의 연속적인 시약 흐름을 1× DPBS (대안적으로, IDT Duplex 완충액이 사용될 수 있음)에 희석된 1 마이크로몰로 미세유체 장치의 미세유체 채널에 흘려주었고, NanoPen 챔버로 확산될 수 있게 하였다. 하이브리드화 이후에 배경 신호는 OptoSelect 장치에 150 마이크로리터의 1× DPBS를 플러싱하여 제거하였다. 이렇게 식별된 각 세포 바코드의 위치 (예를 들어, 그 세포 바코드로 표지된 비드의 NanoPen 위치)를 기록하였고 BCR 서열이 비드에 포획되는 특이적 세포를 식별하는데 사용하였다. 도 31A 및 31B에서, 이미지 및 결과는 2개의 개별 NanoPen 챔버 (3441 및 1451)에 대한 바코드 검출에 대해 도시된다. NanoPen 챔버 (3441)에 대한 바코드는 C3D11F22T31에 대해 결정되었고, 여기서 바코드는 4종의 카세트형 서열 GAATACGGGG (SEQ ID NO. 3) TTCCTCTCGT (SEQ ID NO. 11) AACATCCCTC (SEQ ID NO. 22) CCGCACTTCT (SEQ ID NO. 31)로부터 형성되었다. NanoPen 챔버 (1451)에 대한 바코드는 C1D11F24T31로 결정되었고, 여기서 바코드는 4종의 카세트형 서열 CAGCCTTCTG (SEQ ID NO. 1) TTCCTCTCGT (SEQ ID NO. 11) TTAGCGCGTC (SEQ ID NO. 24) CCGCACTTCT (SEQ ID NO. 31)로부터 형성되었다.
검출 이후에, 칩은 cDNA 장식된 포획 비드의 이출 전에, 10 mM Tris-HCl (200 마이크로리터, 0.5마이크로리터/초)로 2회 세척되었다.
광학적으로 작동되는 유전영동력을 사용하여 치환 완충액, 10 mM Tris-HCl 중에서 NanoPen 챔버로부터 선택된 바코드화된 cDNA 장식된 비드를 이출시켰다. 1회 이출은 OKT3 지정된 웰로부터 47개 비드 및 OKT8 지정된 웰로부터 69개 비드를 함유하였다.
NanoPen 챔버로부터 이출된 비드는 이후에 흐름을 사용하여 미세유체 장치 밖으로 이출되어서 풀링되었다.
엑소뉴클레아제 I (NEB, catalog no. M0293L)의 처리 후에, 비드의 이출 그룹에 대해서 22 사이클의 DNA 증폭 (Advantage® 2 PCR kit, Clontech, Catalog #. 639206)을 프라이머로서 5'-ACACTCTTTCCCT ACACGACGC-3' (SEQ ID NO. 113)을 사용하여 수행하였다. 이출 그룹에 대한 미정제 증폭 혼합물의 초기 정제는 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 수행하였다.
다음으로 미정제 증폭 혼합물을 2개로 분할하였는데, 2개 부분 중 첫번째는중쇄에 대한 BCR 특이적 전방향 프라이머 (SEQ ID NO. 114-132, 표 6)의 혼합물을 사용한 18 사이클의 PCR이 수행되었고 2번째 부분은 경쇄에 대한 BCR 특이적 전방향 프라이머 (SEQ ID NO 133-150, 표 6)의 혼합물을 사용한 18 사이클의 PCR이 수행되었다 (Q5® High-Fidelity DNA Polymerase, NEB, catalog no. M0491S). 역방향 프라이머 (SEQ ID No. 151 및 152)는 중쇄 또는 경쇄 및 비드의 이출 그룹에 대해 지정된 인덱스를 갖는 프라이밍 서열에 첨가되었다. 터치다운 PCR 프로토콜 (어닐링 온도가 연속 사이클에서 하락됨)은 증폭 특이도를 증가시키는데 사용되었다. BCR 서열을 함유하는 앰플리콘의 초기 정제는 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881))를 사용하여 수행하였고, 이후에 2% 아가로스 겔 (E-gel™ EX Agarose Gels 2%, Catalog no. G401002, ThermoFisher Scientific) 상에서 크기를 통해서 선택하였다. 겔 추출은 공급사 지시서 (Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit, catalog no. D4001, Zymo Research)에 따라서 수행하였다.
정제되고 크기-선택된 BCR 서열을 함유하는 앰플리콘은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (T4 polynucleotide kinase, NEB, catalog no. M0201)로 처리하였고 이어서 반응물은 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 정제되었다. 정량은 형광으로 수행되었다 (Qubit™, ThermoFisher Scientific).
10 ng 이하의 BCR 앰플리콘을 사용하여 정제된 T4 폴리뉴클레오티드 키나제-처리된 BCR 서열을 함유하는 앰플리콘을 자가-결찰시켜서 원형화된 DNA 분자를 생성시켰다 (T4 DNA Ligase, Catalog no. EL0011, ThermoFisher Scientific). 대략 약 0.5 ng의, 검출 한계치 이상의 임의량의 DNA가 원형화 반응에 충분할 것이다. 약 10 ng을 넘지 않는 것이 앰플리콘의 다른 분자와의 교차-결찰보다는 자가 원형화를 구동시키는데 유용하다.
결찰 반응은 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 정제되었고 이후에 원형화된 DNA 분자는 2% 아가로스 겔 (E-gel™ EX Agarose Gels 2%, Catalog no. G401002, ThermoFisher Scientific) 상에서 위치를 통해서 선택되었다. 겔 추출은 공급사 지시서에 따라서 수행되었다 (Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit, catalog no. D4001, Zymo Research).
다음으로 정제된 원형화된 DNA 분자는 Not1 제한 효소 분해 (Not1-HF, NEB, Catalog no. R3189S)를 수행하여 재선형화시켰고, 이후에 반응을 불활성화시켰다. 재선형화된 DNA는 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 정제되었다.
재선형화된 DNA는 P7 어댑터 서열 전방향 프라이머 (SEQ ID NO. 153, 표 6) 및 P5 어댑터 서열을 함유하는 BCR 불변 영역 프라이머 (SEQ ID NO. 154, Table 6) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, KK2601, KAPA Biosystems/Roche)를 사용하여 16 사이클의 PCR이 수행되었다. 증폭된 DNA 분자는 공급사의 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, Catalog # A63881)를 사용해 정제되었다. 다음으로 증복된 DNA 산물에 대해서 P7 및 P5 어댑터 서열 프라이머 (SEQ ID NO. 153 및 155, 표 6) (KAPA HiFi HotStart ReadyMix, KK2601, KAPA Biosystems/Roche)를 사용하여, 중쇄에 대해서 7 사이클 및 경쇄에 대해서 6 사이클의 PCR을 수행하였다. 최종 시퀀싱 라이브러리는 공급사 지시서에 따라서 1× SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) 비드 (Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, catalog no. A63881)를 사용하여 정제되었고 이후에 2% 아가로스 겔 (E-gel™ EX Agarose Gels 2%, Catalog no. G401002, ThermoFisher Scientific) 상에서 크기 (550-750 bp)에 의해 선택되었다. 겔 추출은 공급사 지시서 (Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit, catalog no. D4001, Zymo Research)에 따라서 수행되었다.
정제된 시퀀싱 라이브러리의 정량은 형광으로 수행되었다 (Qubit™, ThermoFisher Scientific). 시퀀싱은 MiSeq Sequencer (Illumina®, Inc.)를 사용해 수행되었다.
시퀀싱 결과는 판독 1 및 판독 2 프라이머에 포함된 인덱스를 통해서 각각의 풀 (중쇄 또는 경쇄 포함), 및 고유 바코드 서열로 식별된 각각의 세포에 대한 별개의 서열 데이타의 FASTQ 파일을 생성하기 위해 디-플렉싱되었다. OKT3 및 OKT8 세포주에 대한 가변 영역의, 항원 결합 부위에 대한, 핵심 하위-영역을 함유하는 기지의 CDR3 BCR 서열은 각각의 세포에 대한 판독 데이타로 정렬되었고 OKT3 또는 OKT8 세포로부터 얻은 판독치를 식별하는데 사용되었다. 도 32의 우측 컬럼은 서열 1-8로부터의 판독치가 하기의 CDR3 서열을 갖는, OKT3 서열 정체 (SEQ ID NO. 157, 표 6)와 일치되었다는 것을 보여준다:
TGTGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGG (SEQ ID NO.156).
세포 9-12로부터의 판독치는 하기의 CDR2 서열을 갖는, OKT8 서열 정체 (SEQ ID 159)와 일치되었다:
TGTGGTAGAGGTTATGGTTACTACGTATTTGACCACTGG (SEQ ID No. 158).
각 세포에 대한 바코드가 또한 시퀀싱에 의해 결정되었고 세포 1-12의 각각에 대해 도시되어 있다. 시퀀싱에 의해 결정된 바코드를 상기 기술된 시약 흐름 방법으로 결정된 바코드와 일치시키는 것은 세포와 게놈 간 분명한 상관성을 가능하게 하였다. 예를 들어, 흐름 시약을 통해서 NonoPen 챔버 (1451)에 대해 상기에서 결정된 바코드는 OKT3 세포에 대한 표현형이 일치되는 CDR3 서열을 갖는 세포 1과 일치되었다. NanoPen (3411)에 대한, 상기 기술된 다른 바코드는 OKT8에 대한 표현형이 일치하는 CDR3 서열을 갖는, 세포 9에 대한 바코드와 일치되었다. 이것은 주요 실험의 증거였으므로, 특이적 NanoPen 챔버 내에 어떠한 유형의 세포가 배치되었는지 알았고, 시퀀싱 결과는 바코드 흐름 시약 검출이 시퀀싱및 예상되는 CDR3 서열에 의해 결정된 바코드와 완벽하게 연결되었다는 것을 보여주었다. 이것은 BCR 서열 데이타가 소스 서열의 물리적 위치와 연결가능하였다는 것을 입증하였다.
임의의 이전에 표시한 변형 이외에도, 수많은 다른 변동 및 대안적인 배열이 본 설명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 당업자에 의해 고안될 수 있고, 첨부되는 청구항은 이러한 변형 및 배열을 포괄하고자 한다. 따라서, 현재 가장 실현가능하고 바람직한 양상으로 여겨지는 것과 함께 상세하고 자세한 사항으로 상기에 정보가 기술되었지만, 제한없이, 형태, 기능, 가동 방식, 및 용도를 포함하는 수많은 변형이 본 명세서에 기재된 원리 및 개념을 벗어나지 않고 만들어 질 수 있다는 것이 당업자에게 자명해 질 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용시, 모든 측면에서, 실시예 및 실시형태는 단지 예시를 의미하는 것이고 임의 방식으로 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 더 나아가서, 엘리먼트의 목록 (예를 들어, 엘리먼트, a, b, c)에 대해서 본 명세서에서 언급하는 경우에, 이러한 언급은 열거된 엘리먼트 그 자체로 어느 하나, 모든 열거된 엘리먼트 미만의 임의의 조합, 및/또는 모든 열거된 엘리먼트의 조합을 포함하고자 한다. 또한, 본 명세서에서 사용시, 용어 한, 하나 및 일은 각각이 용어 적어도 하나 및 하나 이상과 상호교환가능하다. 용어 단계가 본 명세서에서 사용되지만, 이 용어는 단순히 기술된 방법의 상이한 부분에 대한 주의를 이끌어내기 위해 사용될 수 있는 것이고 방법의 임의 부분에 대한 출발점 또는 중지점을 기술하거나 또는 임의의 다른 방식으로 제한하려는 의도가 아니라는 것을 역시 주의해야 한다.
예시적인 실시형태
본 개시된 대상 주제에 따라 제공되는 예시적인 실시형태는 제한없이, 청구항 및 하기의 실시형태들을 포함한다:
1. 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
프라이밍 서열;
포획 서열; 및
3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다.
2. 실시형태 1의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함한다.
3. 실시형태 1 또는 2의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분의 뉴클레오티드 및 3'-대부분의 뉴클레오티드를 포함하고,
상기 프라이밍 서열은 상기 5'-대부분의 뉴클레오티드에 인접하거나 또는 그를 포함하고,
상기 포획 서열은 상기 3'-대부분의 뉴클레오티드에 인접하거나 또는 그를 포함하고,
상기 바코드 서열은 상기 프라이밍 서열의 3' 및 상기 포획 서열의 5'에 위치된다.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 6 내지 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
5. 실시형태 1 내지 4 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 10개 뉴클레오티드를 포함한다.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 바코드 서열의 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재되는 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결된다.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 12 내지 100종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 다수로부터 선택된다.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 SEQ ID NO: 1-40 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
10. 실시형태 9의 포획 객체로서, 제1 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1-10 중 어느 하나의 서열을 갖고; 제2 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 11-20 중 어느 하나의 서열을 갖고; 제3 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 21-30 중 어느 하나의 서열을 갖고; 제4 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 31-40 중 어느 하나의 서열을 갖는다.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 프라이밍 서열은, 상기 포획 올리고뉴클레오티드로부터 분리될 때, 중합효소를 프라이밍한다.
12. 실시형태 11의 포획 객체로서, 상기 프라이밍 서열은 P7 또는 P5 프라이머의 서열을 포함한다.
13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 고유 분자 식별자 (UMI) 서열을 더 포함한다.
14. 실시형태 13의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 상이한 UMI 서열을 포함한다.
15. 실시형태 13 또는 14의 포획 객체로서, 상기 UMI는 상기 프라이밍 서열의 3' 및 상기 포획 서열의 5'에 위치된다.
16. 실시형태 13 내지 15 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 UMI 서열은 5 내지 20개 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열이다.
17. 실시형태 13 내지 15 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 UMI의 상기 올리고뉴클레오티드 서열은 10개 뉴클레오티드를 포함한다.
18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 포획 객체로서, 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 Not1 제한효소 부위 서열을 더 포함한다.
19. 실시형태 18의 포획 객체로서, 상기 Not1 제한효소 부위 서열는 상기 포획 서열의 5'에 위치된다.
20. 실시형태 18 또는 19의 포획 객체로서, 상기 Not1 제한효소 부위 서열은 상기 바코드 서열의 3'에 위치된다.
21. 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 포획 객체로서, 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 어댑터 서열을 더 포함한다.
22. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 포획 객체로서, 상기 포획 서열은 폴리-dT 서열, 무작위 헥사머 서열, 또는 모자이크 말단 서열을 포함한다.
23. 다수의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 객체는 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 포획 객체이고, 상기 다수 중 각각의 포획 객체의 경우, 상기 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열은 상기 다수 중 모든 다른 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열과 상이하다.
24. 실시형태 23의 다수의 포획 객체로서, 상기 다수는 적어도 256종의 포획 객체를 포함한다.
25. 실시형태 23의 다수의 포획 객체로서, 상기 다수는 적어도 10,000종의 포획 객체를 포함한다.
26. SEQ ID NO: 1 내지 40 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열.
27. 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열로서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 SEQ ID NO: 1-40 중 어느 하나의 서열을 갖고, 상기 바코드 서열의 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않다.
28. 실시형태 27의 바코드 서열로서, 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
29. 실시형태 27 또는 28의 바코드 서열로서, 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재되는 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결된다.
30. 적어도 64종의 비동일 바코드 서열을 포함하는 바코드 서열의 세트로서, 상기 세트의 각각의 바코드 서열은 실시형태 27 내지 29 중 어느 하나에 따른 구조를 갖는다.
31. 실시형태 30의 바코드 서열의 세트로서, 세트는 64, 81, 100, 125, 216, 256, 343, 512, 625, 729, 1000, 1296, 2401, 4096, 6561, 또는 10,000종의 바코드 서열로 본질적으로 이루어진다.
32. SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열; 및 형광성 표지를 포함하는 하이브리드화 프로브.
33. 다수의 하이브리드화 프로브를 포함하는 시약으로서, 상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 실시예 32에 따른 하이브리드화 프로브이고, 상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 (i) 다수 중 모든 다른 하이브리드화 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열과 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, (ii) 다수 중 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지를 포함한다.
34. 실시형태 33의 시약으로서, 다수의 하이브리드화 프로브는 2 내지 4종의 하이브리드화 프로브로 이루어진다.
35. 실시형태 33 또는 34의 시약으로서, 다수 중 제1 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제1 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 제1 형광성 표지를 포 함하고;
다수 중 제2 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제2 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1 형광성 표지와 스펙트럼이 구별가능한 제2 형광성 표지를 포함하고, SEQ ID NO: 41-80의 제1 및 제2 서브세트는 비중복 서브세트이다.
36. 실시형태 35의 시약으로서, 다수 중 제3 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제3 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1 및 제2 형광성 표지 각각과 스펙트럼이 구별가능한 제3 형광성 표지를 포함하고, SEQ ID NO: 41-80의 제1, 제2 및 제3 서브세트는 비중복 서브세트이다.
37. 실시형태 36의 시약으로서, 다수 중 제4 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제4 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1, 제2 및 제3 형광성 표지와 스펙트럼이 구별가능한 제4 형광성 표지를 포함하고, SEQ ID NO: 41-80의 제1, 제2, 제3 및 제4 서브세트는 비중복 서브세트이다.
38. 실시형태 35 내지 37 중 어느 하나의 시약으로서, SEQ ID NO: 41-80의 각각의 서브세트는 적어도 10개 서열을 포함한다.
39. 실시형태 35 내지 37 중 어느 하나의 시약으로서, 상기 제1 서브세트는SEQ ID NO: 41-50을 함유하고, 상기 제2 서브세트는 SEQ ID NO: 51-60을 함유하고, 상기 제3 서브세트는 SEQ ID NO: 61-70을 함유하고, 상기 제4 서브세트는 SEQ ID NO: 71-80을 함유한다.
40. 실시형태 33 내지 39 중 어느 하나에 따른 다수의 시약을 포함하는 키트로서, 각각의 시약의 다수의 하이브리드화 프로브는 다수 중 모든 다른 시약의 하이브리드화 프로브의 세트와 중복되지 않는 세트를 형성한다.
41. 실시형태 40의 키트로서, 키트는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종의 상기 시약을 포함한다.
42. 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법으로서, 방법은
상기 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 하나 이상의 격리 펜의 각각으로 상기 하나 이상의 포획 객체의 단일 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
프라이밍 서열;
포획 서열; 및
바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
상기 미세유체 장치의 상기 인클로저 내 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제1 세트를 포함하는 제1 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 상기 흐름 영역은 상기 하나 이상의 격리 펜의 각각과 유체적으로 접속되고, 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는
임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열에 의해 포함되는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열로서, 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제1 세트의 상기 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 상보성 올리고뉴클레오티드 서열; 및
스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지의 세트로부터 선택되는 형광성 표지로서, 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 형광성 표지는 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 상이한 것인 형광성 표지를 포함하는 것인 단계;
상기 제1 세트의 상기 하이브리드화 프로브를 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열의 상응하는 카세트형 올리고 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계; 및
상기 하나 이상의 격리 펜 중 하나 내에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, (i) 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저 내에서 격리 펜의 위치, 및 (ii) 상기 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상응하는 형광성 신호의 회합 또는 비회합을 포함하는 기록을 생성시키는 단계로서, 회합 및 비회합의 상기 기록은 상기 포획 객체를 상기 격리 펜과 연결시키는 바코드로 구성되는 것인 단계
를 포함한다.
43. 실시형태 42의 방법으로서,
상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제n 세트를 포함하는 제n 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는
임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열에 의해 포함되는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열로서, 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제n 세트 및 상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역으로 흘려주는 하이브리드화 프로브의 임의의 다른 세트의 상기 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드와 동일하지 않은 것인 상보성 올리고뉴클레오티드; 및
스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지의 세트로부터 선택되는 형광성 표지로서, 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 형광성 표지는 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 상이한 것인 형광성 표지를 포함하는 것인 단계;
임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열의 상응하는 카세트형 올리고 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계; 및
상기 하나 이상의 격리 펜 중 하나 내에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, 상기 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상응하는 형광성 신호의 회합 또는 비회합에 대해 상기 기록을 보충하는 단계,
를 더 포함하고,
여기서 n은 {2,..., m}의 값을 갖는 양의 정수의 세트이고, m은 2 이상의 값을 갖는 양의 정수이고,
전술한 상기 제n 시약을 흘려주는 단계, 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트를 하이브리드화시키는 단계, 상기 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계, 및 상기 기록을 보충하는 단계는 양의 정수의 상기 세트에서 n의 각각의 값에 대해서 반복된다.
44. 실시형태 43의 방법으로서, m은 3 이상이고 20 이하 (예를 들어, 5 이상이고 15 이하)인 값을 갖는다.
45. 실시형태 43의 방법으로서, m은 8 이상이고 12 이하인 값 (예를 들어, 10)을 갖는다.
46. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 흐름 영역으로 상기 제1 시약 용액 및/또는 상기 제n 시약 용액을 흘려주는 단계는 상기 제1 시약 용액 및/또는 상기 제n 시약 용액이 상기 하나 이상의 격리 펜으로 확산에 의해서 평형화될 수 있게 하는 단계를 더 포함한다.
47. 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나의 방법으로서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상기 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계는
상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역을 통해서 하이브리드화 프로브를 갖지 않는 세정 용액을 흘려주는 단계;
상기 하나 이상의 격리 펜으로 상기 세정 용액을 확산에 의해서 평형화시켜서, 상기 제1 세트 또는 임의의 상기 제n 세트의 비하이브리드화된 하이브리드화 프로브가 상기 하나 이상의 격리 펜 밖으로 확산될 수 있게 하는 단계를 더 포함하고, 추가로 상기 세정 용액을 흘려주는 상기 단계는 상기 형광성 신호를 검출하는 단계 전에 수행된다.
48. 실시형태 43 내지 47 중 어느 하나의 방법으로서, 각각의 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 바코드 서열을 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
49. 실시형태 48의 방법으로서, 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트 및 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각은 3종의 하이브리드화 프로브를 포함한다.
50. 실시형태 43 내지 47 중 어느 하나의 방법으로서, 각각의 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
51. 실시형태 50의 방법으로서, 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트 및 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각은 4종의 하이브리드화 프로브를 포함한다.
52. 실시형태 42 내지 51 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 하나 이상의 포획 객체의 각각을 배치시키는 단계는 상기 미세유체 장치 내 상기 하나 이상의 격리 펜의 고립 영역 내에 상기 하나 이상의 포획 객체의 각각을 배치시키는 단계를 포함한다.
53. 실시형태 42 내지 52 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 격리 펜 내에 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 단계를 더 포함한다.
54. 실시형태 53의 방법으로서, 상기 하나 이상의 생물학적 세포의 각각의 하나는 상기 하나 이상의 격리 펜의 상이한 하나에 배치된다.
55. 실시형태 53 또는 54의 방법으로서, 상기 하나 이상의 생물학적 세포는 상기 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 격리 펜의 상기 고립 영역 내에 배치된다.
56. 실시형태 53 내지 55 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 생물학적 세포의 적어도 하나는 상기 하나 이상의 포획 객체 중 하나가 그 안에 배치된 격리 펜 내에 배치된다.
57. 실시형태 53 내지 56 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 생물학적 세포는 클론 개체군 유래의 다수의 생물학적 세포이다.
58. 실시형태 53 내지 57 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 하나 이상의 생물학적 세포를 배치하는 단계는 상기 하나 이상의 포획 객체를 배치시키는 단계 이전에 수행된다.
59. 실시형태 42 내지 58 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 하나 이상의 격리 펜에 상기 하나 이상의 포획 객체를 배채시키는 단계는 유전영동 (DEP) 력을 사용하여 수행된다.
60. 실시형태 53 내지 59 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 격리 펜 내에 상기 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 상기 단계는 유전영동 (DEP) 력을 사용하여 수행된다.
61. 실시형태 42 내지 60 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 하나 이상의 포획 객체는 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 포획 객체이다.
62. 실시형태 42 내지 61 중 어느 하나의 방법으로서, 각각의 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나는 상기 포획 서열에 의해서 그에 포획되는 표적 핵산을 더 포함한다.
63. 미세유체 장치의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법으로서,
미세유체 장치의 격리 펜에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
프라이밍 서열;
포획 서열; 및
바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이 상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고;
상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하는 것인 단계;
상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열 및 상기 격리 펜 사이의 연관성을 기록하는 단계;
상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
상기 생물학적 세포를 용해시키고 상기 용해된 생물학적 세포로부터 방출되는 핵산이 상기 포획 객체에 의해 포함되는 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계;
상기 포획된 핵산을 전사시켜서, 다수의 전사된 핵산을 생성시키는 단계로서, 각각의 전사된 핵산은 상기 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결된 상보성의 포획된 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;
상기 전사된 핵산 및 상기 바코드 서열을 시퀀싱하여서, 상기 바코드 서열의 판독 서열과 연관된 상기 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 수득하는 단계;
상기 판독 서열을 기반으로 상기 바코드 서열을 식별하는 단계; 및
상기 판독 서열-식별된 바코드 서열 및 상기 인-시츄 식별된 바코드 서열을 사용하여 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상기 격리 펜과 연결시켜서 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상기 격리 펜에 위치된 상기 생물학적 세포와 상호관련시키는 단계
를 포함한다.
64. 실시형태 63의 방법으로서, 상기 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계; 및 상기 생물학적 세포의 상기 표현형과 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상호관련시키는 단계를 더 포함한다.
65. 실시형태 63의 방법으로서, 상기 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계로서, 상기 생물학적 세포는 클론 개체군을 대표하는 것인 단계; 및 상기 생물학적 세포 및 상기 클론 개체군의 상기 표현형과 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상호관련시키는 단계를 더 포함한다.
66. 실시형태 64 또는 65의 방법으로서, 상기 생물학적 세포의 상기 표현형을 관찰하는 단계는 상기 적어도 하나의 생물학적 세포의 적어도 하나의 물리적 특징을 관찰하는 단계를 포함한다.
67. 실시형태 64 또는 65의 방법으로서, 상기 생물학적 세포의 상기 표현형을 관찰하는 단계는 상기 생물학적 세포에 대해 어세이를 수행하는 단계 및 상기 어세이 동안 발생된 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함한다.
68. 실시형태 67의 방법으로서, 상기 어세이는 단백질 발현 어세이이다.
69. 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열 및 상기 격리 펜 간 연관성을 기록하는 단계는 상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계 이전에 수행된다.
70. 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열 및 상기 격리 펜 간 연관성을 기록하는 단계는 상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 도입시키는 단계 이후에 수행된다.
71. 실시형태 64 내지 68 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체를 배치시키는 단계, 및 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열 및 상기 격리 펜 간 연관성을 기록하는 단계는 상기 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계 이후에 수행된다.
72. 실시형태 63 내지 68 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열 및 상기 격리 펜 간 연관성을 기록하는 단계는 상기 생물학적 세포를 용해시키고 상기 용해된 생물학적 세포로부터 방출되는 상기 핵산이 상기 포획 객체에 의해 포함되는 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해서 포획될 수 있게 하는 단계 이후에 수행된다.
73. 실시형태 63 내지 72 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계는 실시형태 42 내지 60 중 어느 하나의 방법을 수행하는 단계를 포함한다.
74. 실시형태 63 내지 73 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 실시형태 1-23 중 어느 하나의 포획 객체이다.
75. 실시형태 63 내지 74 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 포함하고, 상기 격리 펜에 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 포획 객체를 이동시키기 위해서 유전영동 (DEP) 력을 사용하는 단계를 포함한다.
76. 실시형태 63 내지 75 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포를 이동시키기 위해서 유전영동 (DEP) 력을 사용하는 단계를 포함한다.
77. 실시형태 63 내지 76 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상응하는 다수의 격리 펜에 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계;
상기 상응하는 다수의 격리 펜에 다수의 생물학적 세포를 배치시키는 단계, 및,
상기 방법의 상기 추가 단계에 따라서 상기 다수의 포획 객체 및 다수의 생물학적 세포의 각각을 처리하는 단계
를 더 포함한다.
78. 핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트로서,
인클로저를 포함하는 미세유체 장치; 및
다수의 포획 객체를 포함하고,
상기 인클로저는 흐름 영역 및 상기 흐름 영역과 연결된 다수의 격리 펜을 포함하고;
상기 다수 중 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
포획 서열; 및
적어도 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열의 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함한다.
79. 실시형태 78의 키트로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함한다.
80. 실시형태 78 또는 79의 키트로서, 상기 다수의 포획 객체는 실시형태 23 내지 25 중 어느 하나에 따른 다수의 포획 객체이다.
81. 실시형태 78 내지 80 중 어느 하나의 키트로서, 상기 다수의 포획 객체의 각각은 다수의 상응하는 격리 펜에 하나씩 배치된다.
82. 실시형태 81의 키트로서, 식별표를 더 포함하고, 상기 식별 표는 상기 다수의 포획 객체의 각각의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 상기 다수의 상기 상응하는 격리 펜과 상호관련시킨다.
83. 실시형태 78 내지 82 중 어느 하나의 키트로서, 다수의 하이브리드화 프로브를 더 포함하고, 각각의 하이브리드화 프로브는
상기 다수의 포획 객체의 어느 하나의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 어느 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열; 및
표지를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 서열은 상이한 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성이고;
상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 표지는 스펙트럼이 구별가능한 표지의 세트로부터 선택된다.
84. 실시형태 83의 키트로서, 상기 다수의 하이브리드화 프로브의 각각의 상보성 서열은 SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다.
85. 실시형태 83 또는 84의 키트로서, 상기 표지는 형광성 표지이다.
86. 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
상기 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
프라이머에 결합하는 프라이밍 서열;
포획 서열; 및
바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열는 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
상기 생물학적 세포를 용해시키고 상기 용해된 생물학적 세포로부터 방출되는 핵산이 상기 포획 객체에 의해 포함되는 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계; 및
상기 포획된 핵산을 전사시켜서, 다수의 바코드화된 cDNA가 장식된 상기 포획 객체를 생성시키는 단계로서, 각각의 바코드화된 cDNA는 (i) 상기 포획된 핵산 중 상응하는 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열이 (ii) 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결되어 포함되는 것인 단계를 포함한다.
87. 실시형태 86의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 면역 세포이다.
88. 실시형태 86의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 암 세포이다.
89. 실시형태 86의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포이다.
90. 실시형태 86의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 배아이다.
91. 실시형태 86 내지 90 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 단일 생물학적 세포이다.
92. 실시형태 86 내지 91 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 생물학적 세포를 배치시키는 상기 단계는 상기 생물학적 세포를 표시하는 단계를 더 포함한다.
93. 실시형태 86 내지 92 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 포획 객체이다.
94. 실시형태 86 내지 93 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 포획 서열은 올리고-dT 프라이머 서열을 포함한다.
95. 실시형태 86 내지 93 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 포획 서열은 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함한다.
96. 실시형태 95의 방법으로서, 상기 유전자-특이적 프라이머 서열은 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 mRNA 서열을 표적으로 한다.
97. 실시형태 95의 방법으로서, 상기 유전자-특이적 프라이머 서열은 B-세포 수용체 (BCR)를 코딩하는 mRNA를 표적으로 한다.
98. 실시형태 86 내지 97 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 포획 서열은 상기 방출된 핵산 중 하나에 결합하고 상기 방출된 핵산을 프라이밍하여서, 중합효소가 상기 포획된 핵산을 전사시킬 수 있게 한다.
99. 실시형태 86 내지 98 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 자성 성분을 포함한다.
100. 실시형태 86 내지 99 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 상기 격리 펜 내에 상기 포획 객체를 배치시키는 단계 이전에 수행된다.
101. 실시형태 86 내지 99 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 격리 펜 내에 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계 이전에 수행된다.
102. 실시형태 86 내지 101 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체가 상기 격리 펜 내에 위치되는 동안, 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인 시츄에서 식별하는 단계를 더 포함한다.
103. 실시형태 102의 방법으로서, 상기 바코드를 식별하는 상기 단계는 실시형태 42 내지 62 중 어느 하나의 방법을 사용하여 수행된다.
104. 실시형태 102 또는 103의 방법으로서, 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 상기 생물학적 세포를 용해시키는 단계 이전에 수행된다.
105. 실시형태 86 내지 104 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 적어도 하나의 코팅된 표면을 포함한다.
106. 실시형태 105의 방법으로서, 상기 적어도 하나의 코팅된 표면은 공유적으로 연결된 표면을 포함한다.
107. 실시형태 105 또는 106의 방법으로서, 상기 적어도 하나의 코팅된 표면은 친수성 또는 음으로 하전된 코팅된 표면을 포함한다.
108. 실시형태 86 내지 107 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계 및/또는 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포 및/또는 상기 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP) 력을 인가하여 수행된다.
109. 실시형태 86 내지 108 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치는 다수의 격리 펜을 더 포함한다.
110. 실시형태 109의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 다수의 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계를 더 포함한다.
111. 실시형태 110의 방법으로서, 상기 다수의 상기 생물학적 세포는 클론 개체군이다.
112. 실시형태 110 또는 111의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 상기 다수 중 상응하는 격리 펜에 상기 다수중 실질적으로 오직 하나의 생물학적 세포를 배치시키는 단계를 포함한다.
113. 실시형태 109 내지 112 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 단계를 더 포함한다.
114. 실시형태 113의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 다수 중 격리 펜의 상응하는 하나들 내에 실질적으로 오직 하나의 포획 객체를 배치시키는 단계를 포함한다.
115. 실시형태 113 또는 114의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포 또는 상기 다수의 상기 생물학적 세포를 용해시키는 상기 단계 이전에 수행된다.
116. 실시형태 113 내지 115 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 상기 포획 객체는 실시형태 23에 따른 다수의 포획 객체이다.
117. 실시형태 86 내지 116 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치로부터 상기 포획 객체 또는 상기 다수의 상기 포획 객체를 이출시키는 단계를 더 포함한다.
118. 실시형태 117의 방법으로서, 상기 다수의 상기 포획 객체를 이출시키는 단계는 상기 다수의 상기 포획 객체의 각각을 개별적으로 이출시키는 단계를 포함한다.
119. 실시형태 118의 방법으로서, 상기 미세유체 장치 외부의 별개의 목적 용기로 상기 다수 중 각각의 상기 포획 객체를 전달하는 단계를 더 포함한다.
120. 실시형태 86 내지 119 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 생물학적 세포 또는 다수의 상기 생물학적 세포를 배치시키는 상기 단계; 상기 포획 객체 또는 상기 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 상기 단계; 상기 생물학적 세포 또는 상기 다수의 상기 생물학적 세포를 용해시키는 상기 단계 및 상기 용해된 생물학적 세포 또는 상기 다수의 상기 생물학적 세포로부터 방출된 핵산을 포획될 수 있게 하는 상기 단계; 상기 전사 단계; 및 상기 포획 객체 또는 상기 다수 중 각각의 상기 포획 객체의 상기 바코드를 인-시츄에서 식별하는 상기 단계 중 하나 이상은 자동화 방식으로 수행된다.
121. 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
실시형태 86 내지 120 중 어느 하나의 방법에 의해 수득되는 포획 객체의 cDNA 라이브러리 또는 다수의 상기 포획 객체의 각각의 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 및
상기 증폭된 DNA 라이브러리 또는 상기 다수의 cDNA 라이브러리를 태그먼트화하여서, 하나 또는 다수의 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다.
122. 실시형태 121의 방법으로서, 상기 cDNA 라이브러리 또는 상기 다수의 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계는 풀 인덱스 서열을 도입시키는 단계를 포함하고, 상기 풀 인덱스 서열은 4 내지 10개 뉴클레오티드를 포함한다.
123. 실시형태 122의 방법으로서, 다수의 상기 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 조합하는 단계를 더 포함하고, 상기 다수 중 각각의 바코드화된 시퀀싱 라이브러리는 상이한 바코드 서열 및/또는 상이한 풀 인덱스 서열을 포함한다.
124. 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 게놈 DNA를 포함하는 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계;
상기 생물학적 미세-객체를 상기 생물학적 미세-객체의 핵 엔벨로프를 파괴할 수 있는 용해 시약과 접촉시켜서, 상기 생물학적 미세-객체의 게놈 DNA를 방출시키는 단계;
상기 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화시켜서, 제1 태그먼트화 삽입 서열에 의해 한정되는 제1 말단 및 제2 태그먼트화 삽입 서열에 의해 한정되는 제2 말단을 갖는 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 생성시키는 단계;
상기 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
제1 프라이밍 서열;
제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및
바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 하나들을 (i) 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 하나들의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열, (ii) 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열과 연결된 제2 프라이밍 서열, 무작위 프라이머 서열, 또는 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 가닥 치환 효소 및 중합효소를 포함하는 효소 혼합물과 접촉시키는 단계;
상기 접촉된 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 일정 기간 동안 인큐베이션시켜서, 상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 상기 하나들을 동시에 증폭시키고 상기 포획 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 올리고뉴클레오티드를 상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편의 상기 하나들의 말단에 첨가하여 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 생성시키는 단계; 및
상기 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계를 포함한다.
125. 실시형태 124의 방법으로서, 상기 격리 펜 내에 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계는 상기 격리 펜 내에 상기 포획 객체를 배치시키는 단계 이전에 수행된다.
126. 실시형태 124 또는 125의 방법으로서, 상기 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포이다.
127. 실시형태 124 또는 125의 방법으로서, 상기 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포 (예를 들어, 진핵생물 세포)의 핵이다.
128. 실시형태 126 또는 127의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 면역 세포이다.
129. 실시형태 126 또는 127의 방법으로서, 상기 생물학적 세포는 암 세포이다.
130. 실시형태 124 내지 129 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 용해 시약은 적어도 하나의 리보뉴클레아제 억제제를 포함한다.
131. 실시형태 124 내지 130 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 태그먼트화는 상기 방출된 게놈 DNA를 (i) 상기 제1 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제1 이중-가닥 DNA 단편, 및 (ii) 상기 제2 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제2 이중-가닥 DNA 단편이 로딩된 트랜스포사제와 접촉시키는 단계를 포함한다.
132. 실시형태 131의 방법으로서, 상기 제1 이중-가닥 DNA 단편은 제3 프라이밍 서열과 연결된 제1 모자이크 말단 서열을 포함하고, 상기 제2 이중-가닥 DNA 단편은 제4 프라이밍 서열에 연결된 제2 모자이크 말단 서열을 포함한다.
133. 실시형태 131 또는 132의 방법으로서, 상기 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열은 상기 제1 태그먼트화 삽입 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 서열을 포함한다.
134. 실시형태 131 내지 133 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 증폭 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열은 상기 제2 태그먼트화 삽입 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 서열을 포함한다.
135. 실시형태 124 내지 134 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나에 따른 포획 객체이다.
136. 실시형태 124 내지 135 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 자성 성분을 포함한다.
137. 실시형태 124 내지 136 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체가 상기 격리 펜 내에 위치되는 동안에, 상기 포획 객체의 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인 시츄에서 식별하는 단계를 더 포함한다.
138. 실시형태 137의 방법으로서, 상기 바코드 서열을 식별하는 상기 단계는 실시형태 42 내지 62 중 어느 하나의 방법을 사용하여 수행된다.
139. 실시형태 137 또는 138의 방법으로서, 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 상기 생물학적 세포를 용해시키는 단계 이전에 수행된다.
140. 실시형태 124 내지 139 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 적어도 하나의 코팅된 표면을 포함한다.
141. 실시형태 124 내지 140 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함한다.
142. 실시형태 141의 방법으로서, 상기 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면은 공유적으로 결합된 친수성 모이어티 또는 음으로 하전된 모이어티를 포함한다.
143. 실시형태 124 내지 142 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계 및/또는 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포 및/또는 상기 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP)력을 인가하여 수행된다.
144. 실시형태 124 내지 143 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치는 다수의 격리 펜을 더 포함한다.
145. 실시형태 144의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 다수의 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계를 더 포함한다.
146. 실시형태 145의 방법으로서, 상기 다수의 상기 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포의 클론 개체군이다.
147. 실시형태 145 또는 146의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계는 상기 다수 중 상응하는 격리 펜에 상기 다수 중 실질적으로 오직 하나의 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계를 포함한다.
148. 실시형태 144 내지 147 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 단계를 더 포함한다.
149. 실시형태 148의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 다수 중 격리 펜의 상응하는 하나들 내에 실질적으로 오직 하나의 포획 객체를 배치시키는 단계를 포함한다.
150. 실시형태 148 또는 149의 방법으로서, 상기 다수의 격리 펜 내에 상기 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 미세-객체 또는 상기 다수의 상기 생물학적 미세-객체를 용해시키는 상기 단계 이전에 수행된다.
151. 실시형태 148 내지 150 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 다수의 상기 포획 객체는 실시형태 23에 따른 다수의 포획 객체이다.
152. 실시형태 124 내지 151 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 미세유체 장치로부터 상기 포획 객체 또는 상기 다수의 상기 포획 객체를 이출시키는 단계를 더 포함한다.
153. 실시형태 152의 방법으로서, 상기 다수의 상기 포획 객체를 이출시키는 단계는 상기 다수의 상기 포획 객체의 각각을 개별적으로 이출시키는 단계를 포함한다.
154. 실시형태 153의 방법으로서, 상기 미세유체 장치 외부의 별개의 목적 용기로 상기 다수 중 각각의 상기 포획 객체를 전달하는 단계를 더 포함한다.
155. 실시형태 145 내지 154 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 태그먼트화, 접촉 및 인큐베이션의 단계는 상기 다수의 생물학적 미세-객체 중 하나를 함유하는 상기 격리 펜의 각각에 대해서 실질적으로 동시에 수행된다.
156. 실시형태 124 내지 155 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 생물학적 미세-객체 또는 상기 다수의 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 상기 단계; 상기 포획 객체 또는 상기 다수의 상기 포획 객체를 배치시키는 상기 단계; 상기 생물학적 미세-객체 또는 상기 다수의 상기 생물학적 미세-객체를 용해시키는 상기 단계 및 상기 용해된 생물학적 세포 또는 상기 다수의 상기 생물학적 세포로부터 방출된 핵산을 포획될 수 있게 하는 상기 단계; 상기 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화시키는 상기 단계; 상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 하나들을 접촉시키는 상기 단계; 상기 접촉된 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 인큐베이션시키는 상기 단계; 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리 또는 상기 다수의 DNA 라이브러리를 이출시키는 상기 단계; 및 상기 상기 포획 객체 또는 상기 다수 중 각각의 상기 포획 객체의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계 중 하나 이상은 자동화 방식으로 수행된다.
157. 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 단계는
미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
상기 격리 펜 내에 제1 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 제1 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
제1 프라이밍 서열;
제1 포획 서열; 및
제1 바코드 서열을 포함하고, 상기 제1 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제1 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
실시형태 86 내지 123 중 어느 하나의 방법을 수행하여 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 생물학적 세포를 용해시키는 단계는 상기 생물학적 세포의 원형질막이 분해되어, 상기 생물학적 세포로부터 세포질 RNA가 방출되지만, 상기 생물학적 세포의 핵 엔벨로프는 온전한 채로 남도록 수행되어서, 상기 생물학적 세포의 상기 RNA 유래의 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리로 장식된 상기 제1 포획 객체를 제공하는 것인 단계;
상기 미세유체 장치로부터 상기 cDNA 라이브러리-장식된 제1 포획 객체를 이출시키는 단계;
상기 격리 펜 내에 제2 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 제2 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각은
제2 프라이밍 서열;
제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및
제2 바코드 서열을 포함하고, 상기 제2 바코드 서열을 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제2 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
실시형태 124 내지 156 중 어느 하나의 방법을 수행하여 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 생물학적 세포 유래의 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편은 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 하나들의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 접촉되어서, 상기 생물학적 세포의 상기 게놈 DNA 유래의 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 것인 단계; 및
상기 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계를 포함한다.
158. 실시형태 157의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함한다.
159. 실시형태 158의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계 이전; 상기 생물학적 세포의 상기 RNA로부터 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계 이전; 또는 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리-장식된 제1 포획 객체를 이출시키는 단계 이전에 수행된다.
160. 실시형태 157 내지 159 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함한다.
161. 실시형태 160의 방법으로서, 상기 제2 포획의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계 이전 또는 상기 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계 이후에 수행된다.
162. 실시형태 157 내지 161 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 또는 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 실시형태 42 내지 60 중 어느 하나의 방법을 사용하여 수행된다.
163. 실시형태 157 내지 162 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체 및 상기 제2 포획 객체는 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 각각의 포획 객체이다.
164. 실시형태 157 내지 163 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 프라이밍 서열은 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 프라이밍 서열과 상이하다.
165. 실시형태 157 내지 164 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 포획 서열은 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 상이하다.
166. 실시형태 157 내지 165 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열과 동일하다.
167. 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
B 림프구로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 단계로서, 상기 생성 단계는 실시형태 86 내지 109 중 어느 하나의 방법에 따라 수행되고, 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체를 장식하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 Not1 제한효소 부위 서열을 포함하는 것인 단계;
상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계;
상기 바코드화된 cDNA 라이브러리로부터 바코드화된 BCR 서열에 대해 선택하여서, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 라이브러리를 생성시키는 단계;
바코드화된 BCR 서열이 농축된 상기 라이브러리 유래의 서열을 원형화시켜서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 생성시키는 단계;
원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리를 재선형화시켜서 재배열된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 각각은 각자의 가변 (V) 하위-영역 및/또는 각자의 다양성 (D) 하위-영역의 3'에 상기 BCR 서열의 불변 (C)영역이 존재하는 것인 단계; 및
시퀀싱 어댑터를 첨가하고 상기 V 하위-영역 및/또는 상기 D 하위-영역에 대해 하위-선택하여서, 바코드화된 BCR 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다.
168. 실시형태 167의 방법으로서, 상기 BCR 시퀀싱 라이브러리를 증폭시켜서 바코드화된 BCR 하위-영역 서열의 증폭된 라이브러리를 제공하는 단계를 더 포함한다.
169. 실시형태 167 또는 168의 방법으로서, 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계는 유니버설 프라이머를 사용하여 수행된다.
170. 실시형태 167 내지 169 중 어느 하나의 방법으로서, BCR 서열 영역에 대한 상기 선택 단계는 BCR 서열에 선택적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여서, 바코드화된 BCR 영역 선택적인 증폭된 DNA의 상기 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함한다.
171. 실시형태 167 내지 170 중 어느 하나의 방법으로서, 바코드화된 BCR 서열에 대한 상기 선택 단계는 적어도 하나의 시퀀싱 프라이머 서열 및/또는 적어도 하나의 인덱스 서열을 첨가하는 단계를 더 포함한다.
172. 실시형태 167 내지 171 중 어느 하나의 방법으로서, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 상기 라이브러리 유래 서열을 원형화시키는 단계는 각각의 바코드화된 BCR 서열의 5' 말단을 이의 개별 3' 말단과 결찰시키는 단계를 포함한다.
173. 실시형태 167 내지 172 중 어느 하나의 방법으로서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리를 재선형화시키는 단계는 상기 Not1 제한효소 부위에서 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리의 각각을 분해시키는 단계를 포함한다.
174. 실시형태 167 내지 173 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 및/또는 D 하위-영역에 대해서 하위-선택하는 단계는 PCR을 수행하여, 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 상기 V 및/또는 D 하위-영역에 대해 하위-선택하는 단계를 포함한다.
175. 실시형태 167 내지 174 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 포획 객체는 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 포획 객체이다.
176. 실시형태 167 내지 175 중 어느 하나의 방법으로서, 실시형태 42 내지 60 중 어느 하나의 방법을 사용하여 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열을 식별하는 단계를 더 포함한다.
177. 실시형태 176의 방법으로서, 상기 식별 단계는 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭하는 단계 이전에 수행된다.
178. 실시형태 177의 방법으로서, 상기 식별 단계는 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키면서 수행된다.
179. 실시형태 167 내지 178 중 어느 하나의 방법으로서, 상기 임의의 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 바코드화된 BCR 서열에 대해 상기 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 서열을 원형화시키는 단계; 상기 Not1 제한효소 부위에서 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리를 재선형화시키는 단계; 및 상기 시퀀싱 어댑터를 첨가하고 V 및/또는 D 하위-영역에 대해 하위-선택하는 단계는 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에서 수행된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
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Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> Berkeley Lights, Inc. Soumillon, Magali Bennett, Hayley M. Mejia Gonzales, Yara X. Toh, Mckenzi S. Ramenani, Ravi K. <120> DNA BARCODE COMPOSITIONS AND METHODS OF IN SITU IDENTIFICATION IN A MICROFLUIDIC DEVICE <130> 098702-000100PC-1061388 <140> PCT/US17/054628 <141> 2017-09-29 <150> US 62/470,669 <151> 2017-03-13 <150> US 62/457,582 <151> 2017-02-10 <150> US 62/457,399 <151> 2017-02-10 <150> US 62/403,111 <151> 2016-10-01 <150> US 62/403,116 <151> 2016-10-01 <160> 162 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 cagccttctg 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 tgtgagttcc 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 gaatacgggg 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 ctttggaccc 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 gccatacacg 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 aagctgaagc 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 tgtggccatt 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 cgcaatctca 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 tgcgttgttg 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 tacagttggc 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 ttcctctcgt 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 gacgttacga 10 <210> 13 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 13 actgacgcgt 10 <210> 14 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 aggagcagca 10 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 15 tgacgcgcaa 10 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 16 tcctcgccat 10 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 17 tagcagccca 10 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 cagacgctgt 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 tggaaagcgg 10 <210> 20 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 gcgacaagac 10 <210> 21 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 tgtccgaaag 10 <210> 22 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 aacatccctc 10 <210> 23 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 23 aaatgtcccg 10 <210> 24 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 ttagcgcgtc 10 <210> 25 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 25 agttcaggcg 10 <210> 26 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 26 acaggggaac 10 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 accggattgg 10 <210> 28 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 tcgtgtgtga 10 <210> 29 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 taggtctgcg 10 <210> 30 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 30 acccataccc 10 <210> 31 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 ccgcacttct 10 <210> 32 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 ttgggtacag 10 <210> 33 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 33 attcgtcgga 10 <210> 34 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 34 gccagcgtat 10 <210> 35 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 35 gttgagcagg 10 <210> 36 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 ggtacctggt 10 <210> 37 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 37 gcatgaacgt 10 <210> 38 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 tggctacgat 10 <210> 39 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 cgaaggtagg 10 <210> 40 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 ttcaaccgag 10 <210> 41 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 41 cagaaggctg 10 <210> 42 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 42 ggaactcaca 10 <210> 43 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 43 ccccgtattc 10 <210> 44 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 44 gggtccaaag 10 <210> 45 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 45 cgtgtatggc 10 <210> 46 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 46 gcttcagctt 10 <210> 47 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 47 aatggccaca 10 <210> 48 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 48 tgagattgcg 10 <210> 49 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 49 caacaacgca 10 <210> 50 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF647N dye <400> 50 gccaactgta 10 <210> 51 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 51 acgagaggaa 10 <210> 52 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 52 tcgtaacgtc 10 <210> 53 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 53 acgcgtcagt 10 <210> 54 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 54 tgctgctcct 10 <210> 55 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 55 ttgcgcgtca 10 <210> 56 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 56 atggcgagga 10 <210> 57 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 57 tgggctgcta 10 <210> 58 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 58 acagcgtctg 10 <210> 59 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 59 ccgctttcca 10 <210> 60 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with AlexF405N dye <400> 60 gtcttgtcgc 10 <210> 61 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 61 ctttcggaca 10 <210> 62 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 62 gagggatgtt 10 <210> 63 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 63 cgggacattt 10 <210> 64 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 64 gacgcgctaa 10 <210> 65 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 65 cgcctgaact 10 <210> 66 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 66 gttcccctgt 10 <210> 67 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 67 ccaatccggt 10 <210> 68 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 68 tcacacacga 10 <210> 69 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 69 cgcagaccta 10 <210> 70 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF488N dye <400> 70 gggtatgggt 10 <210> 71 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 71 agaagtgcgg 10 <210> 72 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 72 ctgtacccaa 10 <210> 73 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 73 tccgacgaat 10 <210> 74 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 74 atacgctggc 10 <210> 75 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 75 cctgctcaac 10 <210> 76 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 76 accaggtacc 10 <210> 77 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 77 acgttcatgc 10 <210> 78 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 78 atcgtagcca 10 <210> 79 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 79 cctaccttcg 10 <210> 80 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with AlexF594N dye <400> 80 ctcggttgaa 10 <210> 81 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 81 agtcgactga 10 <210> 82 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> 3' modification with FITC <400> 82 tcagctgact 10 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(16) <223> n is a, t, c, or g <400> 83 tcagctgact nnnnnn 16 <210> 84 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> n is a, t, c, or g <400> 84 nnnnnnnnnn 10 <210> 85 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 85 tttttttttt 10 <210> 86 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 86 aaaaaaaaaa 10 <210> 87 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 87 cccccccccc 10 <210> 88 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 88 gggggggggg 10 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 89 gggggccccc tttttttttt ccggccggcc aaaaattttt 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 90 aaaaaaaaaa tttttttttt gggggggggg cccccccccc 40 <210> 91 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 91 gggggccccc ttaattaatt ccggccggcc aaaaattttt 40 <210> 92 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 92 gggggccccc tttttttttt gggggggggg cccccccccc 40 <210> 93 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 93 cccccggggg 10 <210> 94 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 94 aattaattaa 10 <210> 95 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 95 ggccggccgg 10 <210> 96 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 96 tttttaaaaa 10 <210> 97 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> n is a, t, c, or g <400> 97 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagcctt ctgttcctct cgttgtccga 60 aagccgcact tctnnnnnnn nnnttttttt tttttttttt tttvn 105 <210> 98 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> n is a, t, c, or g <400> 98 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcgcaatc tcacagacgc tgttcgtgtg 60 tgatggctac gatnnnnnnn nnnttttttt tttttttttt tttvn 105 <210> 99 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> n is a, t, c, or g <400> 99 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagcctt ctgttcctct cgttgtccga 60 aagccgcact tctnnnnnnn nnnttttttt tttttttttt tttvn 105 <210> 100 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (105)..(105) <223> n is a, t, c, or g <400> 100 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagcctt ctgttcctct cgttgtccga 60 aagccgcact tctnnnnnnn nnnttttttt tttttttttt tttvn 105 <210> 101 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> n is a, t, c, or g <400> 101 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctcagcctt ctgttcctct cgttgtccga 60 aagccgcact tctnnnnnnn nnnatctcgt atgccgtctt ctgcttggcg gccgcttttt 120 tttttttttt tttttvn 137 <210> 102 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' linker attached to bead <220> <221> misc_feature <222> (74)..(83) <223> n is a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (137)..(137) <223> n is a, t, c, or g <400> 102 acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcgttg ttgtggaaag cggtaggtct 60 gcgcgaaggt aggnnnnnnn nnnatctcgt atgccgtctt ctgcttggcg gccgcttttt 120 tttttttttt tttttvn 137 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> n is methyl-isocytidine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> n is isoguanosine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> n is methyl-isocytidine deoxyribonucleotide <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n is guanosine <400> 103 nnnacactct ttccctacac gacgcnnn 28 <210> 104 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 104 acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modification with Biotin <400> 105 acactctttc cctacacgac gc 22 <210> 106 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (52)..(53) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <400> 106 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 107 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 108 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 109 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5' Biotin-TEG <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <400> 109 ncaagcagaa gacggcatac gagattcgcc ttagtctcgt gggctcgg 48 <210> 110 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5' Biotin-TEG <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <400> 110 ncaagcagaa gacggcatac gagatctagt acggtctcgt gggctcgg 48 <210> 111 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5' Biotin-TEG <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> phosophorothioate substitution in the phosphate linkage <400> 111 naatgatacg gcgaccaccg agatctacac actgcatatc gtcggcagcg tc 52 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is methyl isocytidine deoxyribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is methyl isoguanosine deoxyribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is methyl isocytidine deoxyribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (26)..(28) <223> n is guanosine <400> 112 nnnacactct ttccctacac gacgcnnn 28 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 113 acactctttc cctacacgac gc 22 <210> 114 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 114 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggakgtrmag cttcaggagt c 51 <210> 115 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 115 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtbcag ctbcagcagt c 51 <210> 116 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 116 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtbcag ctbcagcagt c 51 <210> 117 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 117 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtccar ctgcaacart c 51 <210> 118 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 118 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtycag ctbcagcart c 51 <210> 119 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 119 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtycar ctgcagcagt c 51 <210> 120 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 120 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtccac gtgaagcagt c 51 <210> 121 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 121 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaas stggtggaat c 51 <210> 122 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 122 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggavgtgawg ytggtggagt c 51 <210> 123 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 123 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgcag skggtggagt c 51 <210> 124 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 124 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggakgtgcam ctggtggagt c 51 <210> 125 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 125 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaag ctgatggart c 51 <210> 126 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 126 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgcar cttgttgagt c 51 <210> 127 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 127 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggargtraag cttctcgagt c 51 <210> 128 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 128 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaagtgaar sttgaggagt c 51 <210> 129 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 129 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggttact ctraaagwgt stg 53 <210> 130 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 130 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc gcaggtccaa ctvcagcarc c 51 <210> 131 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 131 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggatgtgaac ttggaagtgt c 51 <210> 132 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 132 gttattgcta gcggctcagc cggcaatggc ggaggtgaag gtcatcgagt c 51 <210> 133 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 133 agccggccat ggcggayatc cagctgactc agcc 34 <210> 134 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 134 agccggccat ggcggayatt gttctcwccc agtc 34 <210> 135 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 135 agccggccat ggcggayatt gtgmtmactc agtc 34 <210> 136 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 136 agccggccat ggcggayatt gtgytracac agtc 34 <210> 137 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 137 agccggccat ggcggayatt gtratgacmc agtc 34 <210> 138 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 138 agccggccat ggcggayatt magatramcc agtc 34 <210> 139 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 139 agccggccat ggcggayatt cagatgaydc agtc 34 <210> 140 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 140 agccggccat ggcggayaty cagatgacac agac 34 <210> 141 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 141 agccggccat ggcggayatt gttctcawcc agtc 34 <210> 142 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 142 agccggccat ggcggayatt gwgctsaccc aatc 34 <210> 143 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 143 agccggccat ggcggayatt stratgaccc artc 34 <210> 144 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 144 agccggccat ggcggayrtt ktgatgaccc arac 34 <210> 145 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 145 agccggccat ggcggayatt gtgatgacbc agkc 34 <210> 146 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 146 agccggccat ggcggayatt gtgataacyc agga 34 <210> 147 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 147 agccggccat ggcggayatt gtgatgaccc agwt 34 <210> 148 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 148 agccggccat ggcggayatt gtgatgacac aacc 34 <210> 149 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 149 agccggccat ggcggayatt ttgctgactc agtc 34 <210> 150 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 150 agccggccat ggcggargct gttgtgactc aggaatc 37 <210> 151 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 151 agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcaccgatgt acactctttc cctacacgac 60 gctcttccga tct 73 <210> 152 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 152 agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tcacgatcag acactctttc cctacacgac 60 gctcttccga tct 73 <210> 153 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 153 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 154 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 154 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg gatagachga tggggstgty gtt 53 <210> 155 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 155 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tggatggtgg gaagatggat acag 54 <210> 156 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 156 tgtgcaagat attatgatga tcattactgc cttgactact gg 42 <210> 157 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157 gcaagatatt atgatgatca ttactgcctt gactac 36 <210> 158 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 158 tgtggtagag gttatggtta ctacgtattt gaccactgg 39 <210> 159 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 159 ggtagaggtt atggttacta cgtatttgac cac 33 <210> 160 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 160 gcggccgc 8 <210> 161 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 161 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33 <210> 162 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 162 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34

Claims (63)

  1. 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    프라이밍 서열;
    포획 서열; 및
    3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고,
    상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하는 것인 포획 객체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 5'-대부분 (5'-most)의 뉴클레오티드 및 3'-대부분 (3'-most)의 뉴클레오티드를 포함하고,
    상기 프라이밍 서열은 상기 5'-대부분의 뉴클레오티드에 인접하거나 또는 그를 포함하고,
    상기 포획 서열은 상기 3'-대부분의 뉴클레오티드에 인접하거나 또는 그를 포함하고,
    상기 바코드 서열은 상기 프라이밍 서열의 3' 및 상기 포획 서열의 5'에 위치하는 것인 포획 객체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 8 내지 12개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인 포획 객체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 임의의 개재된 올리고뉴클레오티드 서열없이 직렬로 연결되는 것인 포획 객체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 12 내지 100개의 비동일 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 세트로부터 선택되는 것인 포획 객체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바코드 서열의 상기 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열의 각각은 SEQ ID NO: 1-40 중 어느 하나의 서열을 갖는 것인 포획 객체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바코드 서열은 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 포획 객체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 고유 분자 식별자 (unique molecule identifier)(UMI) 서열을 더 포함하는 것인 포획 객체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 UMI는 상기 프라이밍 서열의 3' 및 상기 포획 서열의 5'에 위치되는 것인 포획 객체.
  10. 제1항에 있어서, 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 적어도 8개 염기쌍의 인식 서열을 포함하는 제한효소 부위를 더 포함하는 것인 포획 객체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 포획 서열은 폴리-dT 서열, 무작위 헥사머 서열, 유전자 특이적 서열, 또는 모자이크 말단 서열을 포함하는 것인 포획 객체.
  12. 다수의 포획 객체로서, 상기 다수 중 각각의 포획 객체는 제1항의 포획 객체이고, 상기 다수 중 각각의 포획 객체의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 상기 다수 중 모든 다른 포획 객체의 포획 올리고뉴클레오티드의 바코드 서열과 상이한 것인 포획 객체.
  13. SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열; 및 형광성 표지
    를 포함하는 하이브리드화 프로브.
  14. 다수의 하이브리드화 프로브를 포함하는 시약으로서, 상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 제32항에 따른 하이브리드화 프로브이고, 상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브는 (i) 다수 중 모든 다른 하이브리드화 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, (ii) 상기 다수 중 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지를 포함하는 것인 시약.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다수의 하이브리드화 프로브는 2 내지 4종의 하이브리드화 프로브로 이루어지는 것인 시약.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 다수 중 제1 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제1 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 제1 형광성 표지를 포함하고;
    상기 다수 중 제2 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제2 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1 형광성 표지와 스펙트럼이 구별가능한 제2 형광성 표지를 포함하고,
    상기 다수 중 제3 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제3 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1 및 제2 형광성 표지의 각각과 스펙트럼이 구별가능한 제3 형광성 표지를 포함하고,
    SEQ ID NO: 41-80의 상기 제1, 제2, 및 제3 서브세트는 비중복 서브세트인 시약.
  17. 제16항에 있어서, 상기 다수 중 제4 하이브리드화 프로브는 SEQ ID NO: 41-80의 제4 서브세트로부터 선택되는 서열, 및 상기 제1, 제2 및 제3 형광성 표지의 각각과 스펙트럼이 구별가능한 제4 형광성 표지를 포함하고,
    SEQ ID NO: 41-80의 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 서브세트는 비중복 서브세트인 시약.
  18. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 다수의 시약을 포함하는 키트로서, 각각의 시약의 상기 다수의 하이브리드화 프로브는 상기 다수 중 모든 다른 시약의 하이브리드화 프로브의 상기 세트와 중복되지 않는 세트를 형성하고, 상기 키트는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10종의 상기 시약을 포함하는 것인 키트.
  19. 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법으로서, 상기 방법은
    상기 미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 하나 이상의 격리 펜의 각각의 고립 영역 내에 상기 하나 이상의 포획 객체 중 단일 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    프라이밍 서열;
    포획 서열; 및
    바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 단계;
    상기 미세유체 장치의 상기 인클로저 내 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제1 세트를 포함하는 제1 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 상기 흐름 영역은 상기 하나 이상의 격리 펜의 각각과 유체적으로 접속되고, 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는
    임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열에 의해 포함된 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열로서, 상기 제1 세트 내 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제1 세트 내 상기 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 상보성 올리고뉴클레오티드 서열; 및
    스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지의 세트로부터 선택되는 형광성 표지로서, 상기 제1 세트 내 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 형광성 표지는 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트 내 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 상이한 것인 형광성 표지를 포함하는 것인 단계;
    상기 제1 세트의 상기 하이브리드화 프로브를 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열 내 상응하는 카세트형 올리고 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
    하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 격리 펜 중 하나에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, (i) 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저 내에서 상기 격리 펜의 위치, 및 (ii) 상기 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상응하는 형광성 신호의 회합 또는 비회합을 포함하는 기록을 생성시키는 단계로서, 회합 및 비회합에 관한 상기 기록은 상기 포획 객체를 상기 격리 펜과 연결시키는 바코드로 구성되는 것인 단계
    를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역으로 하이브리드화 프로브의 제n 세트를 포함하는 제n 시약 용액을 흘려주는 단계로서, 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브는
    임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열에 의해 포함되는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열로서, 상기 제n 세트 내 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역으로 흘러들어간 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트 및 임의의 다른 세트 내 상기 하이브리드화 프로브의 모든 다른 상보성 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않은 것인 상보성 올리고뉴클레오티드 서열; 및
    스펙트럼이 구별가능한 형광성 표지의 세트로부터 선택되는 형광성 표지로서, 상기 제n 세트 내 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 형광성 표지는 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트 내 모든 다른 하이브리드화 프로브의 형광성 표지와 상이한 것인 형광성 표지를 포함하는 것인 단계;
    상기 제n 세트의 상기 하이브리드화 프로브를 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체의 임의의 상기 포획 올리고뉴클레오티드의 임의의 상기 바코드 서열 내 상응하는 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 하이브리드화시키는 단계;
    하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브에 대해서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계; 및
    상기 하나 이상의 격리 펜 중 하나에 배치된 각각의 포획 객체에 대해서, 상기 포획 객체와 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상응하는 형광성 신호의 회합 또는 비회합으로 상기 기록을 보충하는 단계
    를 더 포함하고,
    여기서 n은 {2,..., m}의 값을 갖는 양의 정수의 세트이고,
    m은 2 이상의 값을 갖는 양의 정수이고,
    전술한 상기 제n 시약을 흘려주는 단계, 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트를 하이브리드화시키는 단계, 상기 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계, 및 상기 기록을 보충하는 단계는 양의 정수 {2,..., m}의 상기 세트에서 n의 각각의 값에 대해 반복되고, 여기서 m은 3 이상이고 20 이하인 값을 갖는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  21. 제19항에 있어서, 임의의 상기 하나 이상의 포획 객체와 회합된 상기 상응하는 형광성 신호를 검출하는 단계는
    상기 미세유체 장치의 상기 흐름 영역을 통해서 하이브리드화 프로브를 갖지 않는 세정 용액을 흘려주는 단계; 및
    상기 하나 이상의 격리 펜으로 상기 세정 용액을 확산에 의해서 평형화시켜서, 상기 제1 세트 또는 임의의 상기 제n 세트의 비하이브리드화된 하이브리드화 프로브가 상기 하나 이상의 격리 펜 밖으로 확산될 수 있게 하는 단계
    를 더 포함하고,
    추가로 상기 세정 용액을 흘려주는 상기 단계는 상기 형광성 신호를 검출하는 단계 이전에 수행되는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  22. 제19항에 있어서, 각각의 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 각각의 바코드 서열은 3종 또는 4종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  23. 제22항에 있어서, 하이브리드화 프로브의 상기 제1 세트 및 하이브리드화 프로브의 상기 제n 세트의 각각은 3종 또는 4종의 하이브리드화 프로브를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 하나 이상의 격리 펜 내에 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 단계를 더 포함하고, 상기 하나 이상의 생물학적 세포의 각각의 하나가 상기 하나 이상의 격리 펜의 상이한 하나에 배치되는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  25. 제19항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 하나 이상의 격리 펜에 상기 하나 이상의 포획 객체를 배치시키는 단계는 유전영동 (DEP) 력을 사용하여 수행되는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  26. 제19항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 격리 펜 내에 상기 하나 이상의 생물학적 세포를 배치시키는 상기 단계는 유전영동 (DEP) 력을 사용하여 수행되는 것인, 미세유체 장치 내에서 하나 이상의 포획 객체의 인-시츄 식별 방법.
  27. 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법으로서,
    미세유체 장치의 격리 펜에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    프라이밍 서열;
    포획 서열; 및
    바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고,
    상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 상기 동일한 바코드 서열을 포함하는 것인 단계;
    상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하고 상기 식별된 바코드 서열과 상기 격리 펜 간 연관성을 기록하는 단계;
    상기 격리 펜에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
    상기 생물학적 세포를 용해시키고 상기 용해된 생물학적 세포로부터 방출된 핵산이 상기 포획 객체에 의해 포함되는 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계;
    상기 포획된 핵산을 전사시켜서, 다수의 바코드화된 cDNA를 생성시키는 단계로서, 각각의 바코드화된 cDNA는 상기 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결된 상보성의 포획된 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;
    상기 전사된 핵산 및 상기 바코드 서열을 시퀀싱하여서, 상기 바코드 서열의 판독 서열과 회합된 상기 다수의 전사된 핵산의 판독 서열을 수득하는 단계;
    상기 판독 서열을 기반으로 상기 바코드 서열을 식별하는 단계; 및
    상기 판독 서열-식별된 바코드 서열 및 상기 인 시츄-식별된 바코드 서열을 사용하여 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상기 격리 펜과 연결시켜서 상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상기 격리 펜에 위치된 상기 생물학적 세포와 상호관련시키는 단계
    를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 생물학적 세포의 표현형을 관찰하는 단계; 및
    상기 다수의 전사된 핵산의 상기 판독 서열을 상기 생물학적 세포의 상기 표현형과 상호관련시키는 단계
    를 더 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 생물학적 세포의 상기 표현형을 관찰하는 단계는 상기 적어도 하나의 생물학적 세포의 적어도 하나의 물리적 특징을 관찰하는 단계를 포함하거나; 또는
    상기 생물학적 세포에 대해 어세이를 수행하는 단계 및 상기 어세이 동안 발생된 검출가능한 신호를 관찰하는 단계를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계는 제19항의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 포함하고, 상기 격리 펜에 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 포획 객체를 이동시키기 위해서 유전영동 (DEP) 력을 사용하는 단계를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포를 이동시키기 위해서 유전영동 (DEP) 력을 사용하는 단계를 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  33. 제27항에 있어서,
    상기 미세유체 장치의 상응하는 다수의 격리 펜에 다수의 포획 객체를 배치시키는 단계;
    상기 상응하는 다수의 격리 펜에 다수의 생물학적 세포를 배치시키는 단계, 및
    상기 방법의 상기 추가 단계에 따라서 상기 다수의 포획 객체 및 다수의 생물학적 세포의 각각을 처리하는 단계
    를 더 포함하는 것인, 미세유체 장치 내의 생물학적 세포와 게놈 데이타를 상호관련시키는 방법.
  34. 핵산 라이브러리를 생성시키기 위한 키트로서,
    미세유체 장치; 및
    다수의 포획 객체를 포함하고,
    미세유체 장치는
    인클로저로서, 상기 인클로저는 흐름 영역 및 상기 흐름 영역과 연결된 다수의 격리 펜을 포함하는 것인 인클로저; 및
    유전영동 (DEP) 구성
    을 포함하고,
    상기 다수 중 각각의 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    포획 서열; 및
    적어도 3종의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열의 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 나머지 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 동일한 바코드 서열을 포함하고; 상기 다수의 포획 객체는 제12항에 따른 다수의 포획 객체인
    키트.
  35. 제34항에 있어서, 다수의 하이브리드화 프로브를 더 포함하고,
    각각의 하이브리드화 프로브는
    상기 다수의 포획 객체의 어느 하나의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열; 및
    표지를 포함하고,
    상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 상보성 서열은 상이한 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열에 상보성이고;
    상기 다수 중 각각의 하이브리드화 프로브의 상기 표지는 스펙트럼이 구별가능한 표지의 세트로부터 선택되는 것인 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 다수 중 하이브리드화 프로브의 각각의 상보성 서열은 SEQ ID NO: 41 내지 80 중 어느 하나의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
  37. 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
    미세유체 장치의 인클로저 내에 위치하는 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
    상기 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    프라이머에 결합하는 프라이밍 서열;
    포획 서열; 및
    바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고; 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 동일한 것인 단계;
    상기 생물학적 세포를 용해시키고 상기 용해된 생물학적 세포로부터 방출되는 핵산이 상기 포획 객체에 의해 포함되는 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드에 의해 포획될 수 있게 하는 단계; 및
    상기 포획된 핵산을 전사시켜서, 상기 포획 객체를 장식하는 다수의 바코드화된 cDNA를 생성시키는 단계로서, 각각의 바코드화된 cDNA는 (i) 상기 포획된 핵산 중 상응하는 하나에 상보성인 올리고뉴클레오티드 서열이 (ii) 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나에 공유적으로 연결된 것을 포함하는 것인 단계
    를 포함하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 생물학적 세포는 면역 세포, 암 세포, 줄기 세포, 전구체 세포, 또는 배아인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 하나 이상의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 포획 서열은 올리고-dT 프라이머 서열을 포함하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  40. 제37항에 있어서, 하나 이상의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 포획 서열은 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 유전자-특이적 프라이머 서열은 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B-세포 수용체 (BCR)를 코딩하는 mRNA 서열을 표적으로 하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  42. 제37항에 있어서, 상기 포획 객체가 상기 격리 펜 내에 위치되는 동안에, 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인 시츄에서 식별하는 단계를 더 포함하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 바코드를 식별하는 상기 단계는 제19항의 방법을 사용하여 수행되는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  44. 제37항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계 및/또는 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포 및/또는 상기 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP) 력을 인가하여 수행되는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  45. 제37항에 있어서, 상기 미세유체 장치로부터 상기 포획 객체를 이출시키는 단계를 더 포함하는 것인, 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  46. 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
    제37항의 방법으로 수득된 포획 객체의 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계; 및
    상기 증폭된 DNA 라이브러리를 태그먼트 (tagment)화하여서, 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계
    를 포함하는 것인, 바코드화된 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
  47. 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
    미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 게놈 DNA를 포함하는 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계;
    상기 생물학적 미세-객체를 상기 생물학적 미세-객체의 핵 엔벨로프 (envelope)를 파괴할 수 있는 용해 시약과 접촉시켜서, 상기 생물학적 미세-객체의 게놈 DNA를 방출시키는 단계;
    상기 방출된 게놈 DNA를 태그먼트화시켜서, 제1 태그먼트화 삽입 서열에 의해 한정되는 제1 말단 및 제2 태그먼트화 삽입 서열에 의해 한정되는 제2 말단을 갖는 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 생성시키는 단계;
    상기 격리 펜 내에 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    제1 프라이밍 서열;
    제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및
    바코드 서열을 포함하고, 상기 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 동일한 것인 단계;
    상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편 중 하나들을 (i) 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 하나들의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열, (ii) 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열에 연결된 제2 프라이밍 서열, 무작위 프라이머 서열, 또는 유전자-특이적 프라이머 서열을 포함하는 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 가닥 치환 효소 및 중합효소를 포함하는 효소 혼합물과 접촉시키는 단계;
    상기 접촉된 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편을 일정 기간 동안 인큐베이션시켜서, 상기 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편의 상기 하나들을 동시에 증폭시키고 상기 포획 올리고뉴클레오티드 및 상기 증폭 올리고뉴클레오티드를 상기 다수의 태그먼트화 게놈 DNA 단편의 상기 하나들의 말단에 첨가하여 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 생성시키는 단계; 및
    상기 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계
    를 포함하는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 생물학적 미세-객체는 생물학적 세포 또는 생물학적 세포의 핵인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 생물학적 세포는 면역 세포 또는 암 세포인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  50. 제47항에 있어서, 상기 태그먼트화 단계는 상기 방출된 게놈 DNA를 (i) 상기 제1 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제1 이중-가닥 DNA 단편, 및 (ii) 상기 제2 태그먼트화 삽입 서열을 포함하는 제2 이중-가닥 DNA 단편이 로딩된 트랜스포사제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 포획 객체의 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열은 상기 제1 태그먼트화 삽입 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 서열을 포함하고;
    상기 증폭 올리고뉴클레오티드의 상기 제2 태그먼트화 삽입 포획 서열은 상기 제2 태그먼트화 삽입 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 서열을 포함하는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  52. 제47항에 있어서, 상기 포획 객체가 상기 격리 펜 내에 위치되는 동안에, 상기 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인 시츄에서 식별하는 단계를 더 포함하는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 바코드 서열을 식별하는 상기 단계는 제19항의 방법을 사용하여 수행되는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  54. 제47항에 있어서, 상기 미세유체 장치의 상기 인클로저는 유전영동 (DEP) 구성을 더 포함하고, 상기 생물학적 미세-객체를 배치시키는 단계 및/또는 상기 포획 객체를 배치시키는 단계는 상기 생물학적 세포 및/또는 상기 포획 객체 상에 또는 근부에 유전영동 (DEP) 력을 인가하여 수행되는 것인, 생물학적 미세-객체로부터 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  55. 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
    미세유체 장치의 인클로저 내에 위치된 격리 펜 내에 상기 생물학적 세포를 배치시키는 단계;
    상기 격리 펜 내에 제1 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 제1 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는
    제1 프라이밍 서열;
    제1 포획 서열; 및
    제1 바코드 서열을 포함하고, 상기 제1 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제1 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 동일한 것인 단계;
    제37항의 방법을 수행하여 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 생물학적 세포의 용해는 상기 생물학적 세포의 원형질막이 분해되어 상기 생물학적 세포로부터 세포질 RNA가 방출되는 한편, 상기 생물학적 세포의 핵 엔벨로프는 온전한 채로 남도록 수행되어서, 상기 생물학적 세포의 상기 RNA 유래의 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리로 장식된 상기 제1 포획 객체를 제공하는 것인 단계;
    상기 미세유체 장치로부터 상기 cDNA 라이브러리-장식된 제1 포획 객체를 이출시키는 단계;
    상기 격리 펜 내에 제2 포획 객체를 배치시키는 단계로서, 상기 제2 포획 객체는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 각각은
    제2 프라이밍 서열;
    제1 태그먼트화 삽입 포획 서열; 및
    제2 바코드 서열을 포함하고, 상기 제2 바코드 서열은 3종 이상의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하고, 각각의 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 제2 바코드 서열의 모든 다른 카세트형 올리고뉴클레오티드 서열과 동일하지 않고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열은 동일한 것인 단계;
    제47항의 방법을 수행하여 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 수득하는 단계로서, 상기 생물학적 세포 유래의 다수의 태그먼트화된 게놈 DNA 단편을 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드 중 하나들의 상기 제1 태그먼트화 삽입 포획 서열과 접촉시켜서, 상기 생물학적 세포의 상기 게놈 DNA 유래의 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 것인 단계; 및
    상기 미세유체 장치로부터 상기 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 이출시키는 단계
    를 포함하는 것인, 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계를 더 포함하는 것인, 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 인-시츄에서 식별하는 단계를 더 포함하는 것인, 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 제1 또는 상기 제2 포획 객체의 상기 다수의 포획 올리고뉴클레오티드의 상기 바코드 서열을 식별하는 단계는 제19항의 방법을 사용하여 수행되는 것인, 단일 생물학적 세포로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리 및 바코드화된 게놈 DNA 라이브러리를 제공하는 방법.
  59. 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법으로서,
    B 림프구로부터 바코드화된 cDNA 라이브러리를 생성시키는 단계로서, 상기 생성 단계는 제37항의 방법에 따라서 수행되고, 상기 바코드화된 cDNA 라이브러리는 다수의 포획 올리고뉴클레오티드를 포함하는 포획 객체를 장식하고, 상기 다수 중 각각의 포획 올리고뉴클레오티드는 Not1 제한효소 부위 서열을 포함하는 것인 단계;
    상기 바코드화된 cDNA 라이브러리를 증폭시키는 단계;
    상기 바코드화된 cDNA 라이브러리로부터 바코드화된 BCR 서열에 대해 선택하여서, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 라이브러리를 생성시키는 단계;
    바코드화된 BCR 서열이 농축된 상기 라이브러리 유래 서열을 원형화시켜서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 생성시키는 단계;
    원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리를 재선형화시켜서 재배열된 바코드화된 BCR 서열의 라이브러리를 제공하는 단계로서, 각각은 각자의 가변 (V) 하위-영역 및/또는 각자의 다양성 (D) 하위-영역의 3'에 상기 BCR 서열의 불변 (C) 영역이 존재하는 것인 단계; 및,
    시퀀싱 어댑터를 첨가하고 상기 V 하위-영역 및/또는 상기 D 하위-영역에 대해 하위-선택하여, 바코드화된 BCR 시퀀싱 라이브러리를 생성시키는 단계
    를 포함하는 것인, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 BCR 시퀀싱 라이브러리를 증폭시켜 바코드화된 BCR 하위-영역 서열의 증폭된 라이브러리를 제공하는 단계를 더 포함하는 것인, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
  61. 제59항에 있어서, BCR 서열 영역에 대해 선택하는 상기 단계는 BCR 서열에 선택적인 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여서, 바코드화된 BCR 영역 선택적인 증폭된 DNA의 상기 라이브러리를 생성시키는 단계를 포함하는 것인, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
  62. 제59항에 있어서, 바코드화된 BCR 서열이 농축된 상기 라이브러리 유래 서열을 원형화시키는 단계는 각각의 바코드화된 BCR 서열의 5' 말단을 이의 각자의 3' 말단에 결찰시키는 단계를 포함하는 것인, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
  63. 제59항에 있어서, 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리를 재선형화시키는 단계는 상기 Not1 제한효소 부위에서 원형화된 바코드화된 BCR 서열의 상기 라이브러리의 각각을 소화시키는 단계를 포함하는 것인, 바코드화된 B 세포 수용체 (BCR) 시퀀싱 라이브러리를 제공하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230019056A (ko) 2021-07-30 2023-02-07 연세대학교 산학협력단 연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
ES2857908T3 (es) 2013-08-28 2021-09-29 Becton Dickinson Co Análisis masivamente paralelo de células individuales
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
EP3835431B1 (en) 2015-03-30 2022-11-02 Becton, Dickinson and Company Methods for combinatorial barcoding
CA2982146A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
ES2961743T3 (es) 2016-09-26 2024-03-13 Becton Dickinson Co Medición de la expresión de proteínas utilizando reactivos con secuencias de oligonucleótidos con código de barras
EP3551745A4 (en) 2016-12-12 2020-07-15 Xcella Biosciences, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR SCREENING USING MICROCAPILLAR ARRAYS
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4310183A3 (en) 2017-01-30 2024-02-21 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110382708A (zh) 2017-02-01 2019-10-25 赛卢拉研究公司 使用阻断性寡核苷酸进行选择性扩增
US11753743B2 (en) 2017-02-13 2023-09-12 Yale University High-throughput single-cell polyomics
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
WO2019017875A1 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 Hewlett-Packard Development Company, L.P. DIELECTROPHORESIS SEPARATORS WITH CELL EJECTION DEVICES
CN111971124B (zh) 2017-09-25 2022-08-23 普莱克斯姆公司 寡核苷酸编码的化学文库
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019104337A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rna printing and sequencing devices, methods, and systems
CN112005115A (zh) 2018-02-12 2020-11-27 10X基因组学有限公司 表征来自单个细胞或细胞群体的多种分析物的方法
CA3097976A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company High throughput multiomics sample analysis
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
US11028401B2 (en) 2018-06-06 2021-06-08 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
US11519033B2 (en) * 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020072380A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 Cellular Research, Inc. Determining 5' transcript sequences
AU2019358198A1 (en) * 2018-10-11 2021-05-27 Berkeley Lights, Inc. Systems and methods for identification of optimized protein production and kits therefor
WO2020086510A1 (en) * 2018-10-22 2020-04-30 The General Hospital Corporation Multiplexed single-cell analysis using optically-encoded rna capture particles
EP3870704A4 (en) 2018-10-25 2023-01-11 Illumina, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING LIGANDS ON NETWORKS USING INDICES AND BARCODES
EP3877520A1 (en) 2018-11-08 2021-09-15 Becton Dickinson and Company Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
AU2019390388A1 (en) * 2018-11-30 2021-05-06 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
EP3914728B1 (en) 2019-01-23 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
CN113614245A (zh) * 2019-02-12 2021-11-05 10X基因组学有限公司 用于加工核酸分子的方法
CN113767178A (zh) * 2019-03-11 2021-12-07 10X基因组学有限公司 用于处理光学标签化珠粒的系统和方法
WO2020223555A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Berkeley Lights, Inc. Methods for encapsulating and assaying cells
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2021016239A1 (en) 2019-07-22 2021-01-28 Becton, Dickinson And Company Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
US20220403374A1 (en) * 2019-09-03 2022-12-22 Flexomics, Llc Optically readable barcodes and systems and methods for characterizing molecular interactions
CN114729392A (zh) * 2019-09-06 2022-07-08 10X基因组学有限公司 用于对细胞和细胞珠粒进行条形码化的系统和方法
KR20220062231A (ko) * 2019-09-20 2022-05-16 일루미나, 인코포레이티드 인덱스 및 바코드를 사용하여 어레이 상의 리간드를 식별하기 위한 방법 및 조성물
CN114787348A (zh) * 2019-09-30 2022-07-22 耶鲁大学 用于空间组学测序的确定性条形码
CA3157359A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
WO2021081486A2 (en) * 2019-10-25 2021-04-29 Scribe Biosciences T-cell receptor neoantigen interaction and other cell analysis via microfluidics
EP4055160B1 (en) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
WO2021091611A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
CN115298534A (zh) 2019-11-17 2022-11-04 伯克利之光生命科技公司 用于生物样本的分析的系统和方法
CN114885610A (zh) 2019-12-23 2022-08-09 10X基因组学有限公司 使用rna模板化连接进行空间分析的方法
WO2021146207A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
WO2021155057A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Barcoded wells for spatial mapping of single cells through sequencing
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
US11702689B2 (en) * 2020-04-24 2023-07-18 Microsoft Technology Licensing, Llc Homopolymer primers for amplification of polynucleotides created by enzymatic synthesis
EP4150118A1 (en) 2020-05-14 2023-03-22 Becton Dickinson and Company Primers for immune repertoire profiling
CN115943216A (zh) * 2020-05-20 2023-04-07 耶鲁大学 实现双亚泊松单细胞rna测序的集成介电泳-俘获和纳米阱转移方法
WO2021236929A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
EP4025692A2 (en) 2020-06-02 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
AU2021283184A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022018055A1 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Circulation method to sequence immune repertoires of individual cells
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
WO2022067494A1 (en) * 2020-09-29 2022-04-07 Singleron (Nanjing) Biotechnologies, Ltd. Method for detection of whole transcriptome in single cells
JP2022058244A (ja) * 2020-09-30 2022-04-11 富佳生技股▲ふん▼有限公司 核酸検出箱及び核酸検出デバイス
CN114317223A (zh) * 2020-09-30 2022-04-12 富佳生技股份有限公司 核酸检测盒及核酸检测设备
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4247967A1 (en) 2020-11-20 2023-09-27 Becton, Dickinson and Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
JP2024508042A (ja) * 2020-12-25 2024-02-21 映泰健康医療科技有限公司 空間トランスクリプトーム解析用のバイオチップ、その製造方法及び使用
CN118103504A (zh) * 2020-12-31 2024-05-28 耶鲁大学 高空间分辨率表观基因组分析
WO2022182903A1 (en) * 2021-02-24 2022-09-01 California Institute Of Technology Multiplexing of experimental conditions and samples in spatial genomics
AU2022238446A1 (en) 2021-03-18 2023-09-07 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023028954A1 (zh) * 2021-09-02 2023-03-09 新格元(南京)生物科技有限公司 高通量单细胞靶向测序的试剂和方法
CN114891779A (zh) * 2022-03-31 2022-08-12 立凌生物制药(苏州)有限公司 一种克隆tcr序列的检测方法及其应用
WO2023236121A1 (zh) * 2022-06-08 2023-12-14 深圳华大生命科学研究院 检测罕见细胞的方法、装置及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150298091A1 (en) * 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294063B1 (en) 1999-02-12 2001-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Method and apparatus for programmable fluidic processing
US6942776B2 (en) 1999-05-18 2005-09-13 Silicon Biosystems S.R.L. Method and apparatus for the manipulation of particles by means of dielectrophoresis
US6958132B2 (en) 2002-05-31 2005-10-25 The Regents Of The University Of California Systems and methods for optical actuation of microfluidics based on opto-electrowetting
US20040086892A1 (en) * 2002-11-06 2004-05-06 Crothers Donald M. Universal tag assay
US6977153B2 (en) * 2002-12-31 2005-12-20 Qiagen Gmbh Rolling circle amplification of RNA
AU2005214329A1 (en) 2004-02-12 2005-09-01 Population Genetics Technologies Ltd Genetic analysis by sequence-specific sorting
US7612355B2 (en) 2004-04-12 2009-11-03 The Regents Of The University Of California Optoelectronic tweezers for microparticle and cell manipulation
CN101374757B (zh) * 2005-11-22 2012-11-14 迈克罗拉布诊断有限公司 流控结构、装置、方法和仪器配置的方法
WO2008091848A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Advanced Liquid Logic, Inc. Surface assisted fluid loading and droplet dispensing
WO2008119066A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 The Regents Of The University Of California Single-sided lateral-field and phototransistor-based optoelectronic tweezers
US9434997B2 (en) * 2007-08-24 2016-09-06 Lawrence Livermore National Security, Llc Methods, compounds and systems for detecting a microorganism in a sample
US9533306B2 (en) 2010-08-02 2017-01-03 The Regents Of The University Of California Single sided continuous optoelectrowetting (SCEOW) device for droplet manipulation with light patterns
US9227200B2 (en) 2011-06-03 2016-01-05 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices with flexible optically transparent electrodes
WO2013112923A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
WO2013191775A2 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
WO2014047561A1 (en) * 2012-09-21 2014-03-27 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for labeling of agents
US9857333B2 (en) 2012-10-31 2018-01-02 Berkeley Lights, Inc. Pens for biological micro-objects
US9403172B2 (en) 2012-11-08 2016-08-02 Berkeley Lights, Inc. Circuit based optoelectronic tweezers
CN105392898B (zh) * 2013-04-30 2019-11-01 加州理工学院 通过顺序杂交编条形码的分子多重标记
EP3013983B1 (en) * 2013-06-25 2023-02-15 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
JP6557658B2 (ja) 2013-10-22 2019-08-07 バークレー ライツ，インコーポレイテッド 隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスおよびそれによる生物学的微小物体の試験方法
US9889445B2 (en) 2013-10-22 2018-02-13 Berkeley Lights, Inc. Micro-fluidic devices for assaying biological activity
US20150306599A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. Providing DEP Manipulation Devices And Controllable Electrowetting Devices In The Same Microfluidic Apparatus
US20150306598A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Berkeley Lights, Inc. DEP Force Control And Electrowetting Control In Different Sections Of The Same Microfluidic Apparatus
AU2015249294B2 (en) 2014-04-25 2020-02-27 Berkeley Lights, Inc. Providing DEP manipulation devices and controllable electrowetting devices in the same microfluidic apparatus
US10017759B2 (en) * 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
WO2016145409A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The Broad Institute, Inc. Genotype and phenotype coupling

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150298091A1 (en) * 2014-04-21 2015-10-22 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for barcoding nucleic acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230019056A (ko) 2021-07-30 2023-02-07 연세대학교 산학협력단 연속적인 매질에서 세포간 구획화를 하지 않는 방식의 단일세포 전사체 분석방법

Also Published As

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AU2017336164A1 (en) 2019-04-18

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