JP6557658B2 - 隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスおよびそれによる生物学的微小物体の試験方法 - Google Patents
隔離囲いを有するマイクロ流体デバイスおよびそれによる生物学的微小物体の試験方法 Download PDFInfo
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Description
本出願は、変更された米国特許仮出願第14/060321号の非暫定の(したがって、その利益および/または優先権を請求する)ものである。(前記出願番号第14/060321号は、2013年10月22日付けで正規の特許出願として出願されたが、2014年10月9日に認可された、2014年10月7日提出の請願に応じて仮特許出願に変更された。)本出願は、米国特許仮出願番号62/058658号(2014年10月1日出願)の非暫定(したがって、その利益および/または優先権を請求する)ものでもある。
例示的態様の詳細な説明
流体媒体の「成分」とは、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物、その他を含む、媒体内に存在する任意の化学分子または生化学的分子である。
「媒体の流れ」という語句は、主として拡散以外の任意のメカニズムによる、流体媒体のバルク移動を意味する。例えば、媒体の流れは、2点間の圧力差による、1点から別の点への流体媒体の移動を伴う可能性がある。そのような流れは、連続的、パルス状、周期的、無作為、断続的、または反復的な液体の流れ、またはそれらの任意の組合せを含む可能性がある。1つの流体媒体が、別の流体媒体中に流れると、媒体の乱流および混合が生じる可能性がある。
図2A〜Cは、プロセス100をそれによって実行することのできる、マイクロ流体デバイス200の例を示す。図示のように、マイクロ流体デバイス200には、ハウジング202、セレクタ222、検出器224、流れコントローラ226、および制御モジュール230を含めることができる。
支持構造404には、基板、または複数の相互接続された基板を含めることができる。例えば、支持構造404には、1つまたは2つ以上の相互接続された半導体基板、プリント回路板、その他を含めることができる。フレーム414は、マイクロ流体回路材料416を部分的または完全に囲うことができる。フレーム414は、例えば、マイクロ流体回路材料416を実質的に包囲する、比較的剛性のある構造とすることができる。例えば、フレーム414は、金属材料とすることができる。
さらに別の例として、接続領域442および隔離領域444を、実質的に長方形として図5に示してあるが、接続領域442および隔離領域444の一方または両方を他の形状にすることができる。そのような形状の例として、楕円形、三角形、円形、砂時計形(hourglass-shaped)、その他が挙げられる。
図6の滞留囲いには、接続領域642、および隔離領域644を含む隔離構造646を含めることができる。接続領域642には、チャネル434への近位開口652、および隔離領域644への遠位開口654を含めることができる。図6に示す例において、接続領域642は、その幅Wconが、近位開口652から遠位開口654まで増大するように、拡張する。しかしながら、形状以外は、接続領域642、隔離構造646、および隔離領域644は、上記で考察したような、図5の接続領域442、隔離構造446、および隔離領域444と概して同様にすることができる。
いくつかの態様においては、制御モジュール472は、制御/監視機器480にサンプル材料902内の生物学的微小物体904の画像を取り込ませることによって、ステップ104において第1の試験を実行することができる。既知の画像解析アルゴリズムで構成することのできる、制御モジュール472は、画像を解析して、所望の特性を有する生物学的微小物体904のいくつかを識別することができる。代替的に、人間のユーザが、取り込まれた画像を解析することができる。
アッセイ材料1910を装入した後に設けられた培養期間は、生物学的微小物体1202、1204、1206が、対象とする分析物1902を生成するのに、および分析物成分1904が、囲い436、438、440の隔離領域444から対応する接続領域442または近位開口452へと拡散するのに、十分とすることができる。例えば、培養期間は、分析物成分1904に、チャネル434中に拡散するのに十分な時間を与えることができる。
アッセイ材料1910は、対象とする分析物の分析物成分1904と相互作用するとともに、その相互作用から検出可能な反応を生成するように構成することができる。図20に示すように、滞留囲い436、438内の生物学的微小物体1202、1204からの分析物成分1904は、滞留囲い436、438の近位開口452に隣接するアッセイ材料1910と相互作用して、局所化された、検出可能な反応を生成する。しかしながら、滞留囲い440内の生物学的微小物体1206は、対象とする分析物1902を生成しない。結果的に、そのような局所化された反応(例えば、2002のような)は、滞留囲い440の遠位開口452に隣接しては発生しない。
標識2222の例としては、ルミネセンス標識(例えば、蛍光標識)を含む標識剤、および切断(cleavage)時に蛍光を発する信号分子を切断することのできる酵素を含む標識剤が挙げられる。
実施例1−ヒトCD45に結合する能力のあるIgG抗体の分泌のための、マウス脾臓細胞のスクリーニング
ヒトCD45に結合するIgG型抗体を分泌する、マウス脾臓細胞を識別するために、スクリーニングを実行した。実験設計には、以下のステップを含めた。
1. CD45抗原被覆ビーズの生成;
2. マウス脾臓細胞を採取;
3. マイクロ流体デバイス中に細胞を装入;および
4. 抗原特異性についての検定。
CD45抗原被覆マイクロビーズは、以下の方法で生成した。
50μgの無担体CD45を、500μLのPBS(pH7.2)に再懸濁させた。
Slide−A−Lyzer Miniカップを、500μLのPBS(pH7.2)で洗滌し、次いで微量遠心管(microfuge tube)に追加した。
50μLの0.1μg/μL CD45溶液を、洗滌されたSlide−A−Lyzer Miniカップに加えた。
NGS−OEG4−Biotinを、室温で1時間、CD45抗原で培養した。
500μLのSpherotech社のストレプトアビジン被覆ビーズを、微量遠心管中にピペット注入し、PBS(pH7.4)中で3回洗浄し(1000μL/洗浄)、次いで3000RCF(Relative Centrigugal Force)で5分間、遠心分離した。
このビーズを、500μl PBS(pH7.4)に再懸濁させて、結果として、5mg/mlのビーズ濃度を得た。
CD45で免疫化されたマウスからの脾臓を採取し、DMEM媒体+10%FBS中に置いた。はさみを使用して、脾臓を切り刻んだ。
切り刻まれた脾臓を、40μmセルストレーナ(cell strainer)内に入れた。単独細胞を、10mlピペットで、セルストレーナを通して洗浄した。ガラス棒を使用して、脾臓をさらに砕いて、単独細胞を、セルストレーナを通過させて、その後に、単独細胞を、10mlピペットでセルストレーナを通して、再び洗浄した。
赤血球を、市販キットを用いて溶解させた。
細胞を200×Gで遠心沈殿させて、未処理の脾臓を、2e8細胞/mlの濃度で、10mlピペットでDMEM媒体+10%FBS内で再懸濁させた。
脾臓細胞は、マイクロ流体チップ中に移して、囲い当たり20〜30個の細胞を収容する囲い中に装入した。100μLの媒体を、1μL/sでデバイスを通過して流し、不要な細胞を取り除いた。温度は、36℃に設定し、培地は、0.1μL/secで30分間、灌流させた。
1:2500ヤギ抗マウスF(ab’)2−Alexa568を含有する細胞媒体を調製した。
100μLのCD45ビーズを、1:2500希釈のヤギ抗マウスF(ab’)2−Alexa568を含有する、22μLの細胞媒体内で再懸濁させた。
再懸濁されたCD45ビーズを、次に、それらが脾臓細胞を収納する囲いに隣接するが、すぐ外側に位置するまで、1μL/secの流量で、マイクロ流体チップの主チャネルに流入させた。次いで、流体流を停止させた。
次いで、マイクロ流体チップは、明視野で撮像されて、ビーズの場所を特定した。
次に、Texas Red Filterを使用して、細胞とビーズの画像を取り込んだ。画像は、1時間の間、5分ごとに採取し、各露出は1000ms続き、利得は5であった。
IgG−isotype抗体が、ある囲いから出て、それらがCD45被覆ビーズに結合することができる主チャネル中へ拡散する拡散を反映して、陽性の信号がビーズ上で発達するのを観察した。抗CD45抗体のビーズへの結合によって、二次ヤギ抗マウスIgG−568が、ビーズと連携して、検出可能な信号を生成するのを可能にした。図31A〜31Cおよび白の矢印を参照。
本発明の方法を使用すると、陽性信号に関連づけられた脾臓細胞の各群を、分離させ、単独細胞として新規の囲いに移動させて、再検定することも可能である。このようにして、抗CD45IgG抗体を発現させている単独細胞を検出することもできる。
Claims (37)
- 筐体を含むマイクロ流体デバイスであって、
支持構造と、前記支持構造上に配置されたマイクロ流体回路構造と、マイクロ流体回路を画定するカバーとを含み、
前記マイクロ流体回路が、
第1の流体媒体の流れを包含するように構成された流動領域と、
それを通して前記第1の媒体が前記流動領域中へ入力される1以上の入口と、
それを通して前記第1の媒体が除去される1以上の出口と、
マイクロ流体滞留囲いであって、
第2の流体媒体を収納するように構成された隔離領域を含む隔離構造、および
前記隔離領域を前記流動領域に流体的に接続する接続領域を含む、マイクロ流体滞留囲いと
を含む、前記マイクロ流体滞留囲い、
とを含み、
前記接続領域が、前記流動領域の少なくとも一部を含むマイクロ流体チャネルの中への近位開口と、前記隔離領域の中への遠位開口とを含み、前記近位開口から前記遠位開口への前記接続領域の長さLconは、前記接続領域の前記近位開口の幅Wconの少なくとも1.0倍であり、
前記マイクロ流体回路が、拡散によって前記第2の媒体の成分を前記第1の媒体に混合、または、拡散によって前記第1の媒体の成分を前記第2の媒体に混合できるように構成され、
前記隔離領域が一つの開口を有し、当該マイクロ流体デバイスの流れがない領域である、
マイクロ流体デバイス。 - 前記接続領域の前記近位開口における前記マイクロ流体チャネルの幅が、50ミクロンから500ミクロンの間である、請求項1に記載のデバイス。
- 前記近位開口から前記遠位開口への前記接続領域の長さLconが、前記接続領域の前記近位開口の幅Wconの少なくとも1.5倍である、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記近位開口から前記遠位開口までの前記接続領域の長さLcon が、前記接続領域の前記近位開口の幅Wconの少なくとも2.0倍である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記近位開口から前記遠位開口までの前記接続領域の長さLcon、および前記接続領域の前記近位開口の幅Wconが、5.0μL/sec以下の流量で前記マイクロ流体チャネルを通して流れる前記第1の媒体の、前記滞留囲い中への侵入深さが、前記長さLcon未満となるように寸法決めされている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記接続領域の前記近位開口が、20ミクロンから60ミクロンの間の幅Wconを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記近位開口から前記遠位開口までの前記接続領域の長さLconが、60ミクロンから500ミクロンの間である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記近位開口での前記マイクロ流体チャネルの高さHchが、20から100ミクロンである、請求項1〜7のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体デバイスが、第1の電極、電極起動基板および第2の電極をさらに含み、前記第1の電極が、前記筐体の第1の壁の一部であり、前記電極起動基板および前記第2の電極が、前記筐体の第2の壁の一部である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記電極起動基板が光起動である、請求項9に記載のデバイス。
- 前記電極起動基板が:
a.光導電性材料、およびDEP電極を含む前記電極起動基板、または、
b.半導体集積回路を形成する、複数のドープされた層、電気的絶縁層、および電気伝導層を含む半導体材料であって、前記基板の内壁の電極領域でDEP電極を提供する、前記半導体材料、
を含む、請求項9または10に記載のデバイス。 - 前記マイクロ流体デバイスの前記第1の壁がカバーであり、前記マイクロ流体デバイスの前記第2の壁が基部である、請求項9〜11のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記マイクロ流体滞留囲いを画定する障壁が、前記マイクロ流体デバイスの基部の表面から前記表面に対向する前記マイクロ流体デバイスの上壁まで延伸する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記接続領域の前記幅Wconが、前記近位開口から前記遠位開口までの間で均一である、請求項1〜13のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記隔離領域の体積が、少なくとも1x105立方ミクロンである、請求項1〜14のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記カバーが、前記マイクロ流体回路構造のマイクロ流体回路材料の一体部分であるか、または、前記支持構造が、前記マイクロ流体回路材料の一体部分である、請求項1〜15のいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記近位開口が、前記流動領域における前記第1の媒体の前記流れの方向に垂直である、請求項1〜16のいずれか一項に記載のデバイス。
- マイクロ流体デバイス内の生物学的細胞を分析する方法であって、
前記デバイスが、少なくとも1つのマクロ流体滞留囲いがそれに流体的に接続されているマイクロ流体チャネルを含み、
前記少なくとも1つの滞留囲いが、隔離領域と、前記隔離領域を請求項1に記載のマイクロ流体デバイスの前記マイクロ流体チャネルに流体的に接続する接続領域と、を含む、流体隔離構造を含み、
当該方法が、
1つまたは2つ以上の生物学的細胞を、前記少なくとも1つの滞留囲いの前記隔離領域中に装入すること;
前記装入された生物学的細胞を、前記生物学的細胞が、対象とする分析物を生成することを可能にするのに十分な時間、培養すること;
前記少なくとも1つの滞留囲いの前記接続領域から前記マイクロ流体チャネルへの開口に隣接して、前記マイクロ流体チャネル内の場所に捕捉微小物体を配置することであって、前記捕捉微小物体が、前記対象とする分析物に特異的に結合することのできる、少なくとも1つのタイプの親和剤を含むこと;および
前記マイクロ流体チャネルの前記場所で、前記対象とする分析物への前記捕捉微小物体の結合を監視すること
を含む、方法。 - 前記生物学的細胞を装入することが、
生物学的細胞の群を、前記マイクロ流体デバイスの前記マイクロ流体チャネル中に流すこと;および
前記群の1つまたは2つ以上の生物学的細胞を、前記少なくとも1つの滞留囲いのそれぞれの中に移動させること
を含む、請求項18に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの滞留囲いに装入することの後に、前記マイクロ流体チャネル内に残留する生物学的細胞を洗い出すことをさらに含む、請求項18または19に記載の方法。
- 前記生物学的細胞を装入することが、所定の基準に合致する、前記群からの前記生物学的細胞の個々のものを選択することをさらに含み、
選択することが、前記生物学的細胞が前記マイクロ流体チャネル内または前記少なくとも1つの滞留囲いの前記接続領域内または前記隔離領域内にある間に実行される、
請求項19または20に記載の方法。 - 前記捕捉微小物体を配置することが、
前記捕捉微小物体を前記マイクロ流体チャネル内に流すこと、および
前記捕捉微小物体が、前記少なくとも1つの滞留囲いの接続領域からの前記開口に隣接するように、前記流れを実質的に停止すること
を含む、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記捕捉微小物体が標識を含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉微小物体を前記マイクロ流体チャネル内に配置することが、捕捉微小物体と標識剤の混合物を前記マイクロ流体チャネル中に配置することを含む、請求項18〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標識剤が蛍光標識を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記対象とする分析物が抗体である、請求項18〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのタイプの親和剤が、前記抗体によって特異的に認識される抗原である、請求項26に記載の方法。
- 前記抗原が、タンパク質、炭水化物、脂肪、核酸、代謝物、抗体、またはそれらの組合せの1つである、請求項27に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのタイプの親和剤が、Fc分子、抗体、Protain A、またはProtein Gである、請求項26に記載の方法。
- 前記マイクロ流体デバイスが複数の前記滞留囲いを含み、
前記滞留囲いのそれぞれが、隔離領域と、前記隔離領域を前記マイクロ流体チャネルに流体的に接続する接続領域と、を含む、流体隔離構造を含み、
前記捕捉微小物体を配置することが、前記複数の滞留囲いの前記接続領域から前記マイクロ流体チャネルへの開口に隣接する前記マイクロ流体チャネルを、前記捕捉微小物体、または捕捉微小物体と標識剤の混合物で、実質的に充填することを含む、
請求項18〜29のいずれか一項に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの滞留囲いの前記接続領域が、前記チャネル内を最大許容流量Vmaxで流れる媒体の侵入深さDpよりも大きい長さLconを有し、
前記チャネルのどの流れも、前記最大許容流量Vmax未満に保つことをさらに含む、
請求項18〜30のいずれか一項に記載の方法。 - 前記マイクロ流体デバイスが、請求項3または4に記載のマイクロ流体デバイスである、請求項18〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは2つ以上の生物学的細胞を、前記少なくとも1つの滞留囲い中に装入することが、特定の生物学的細胞を捕捉および移動するために、前記マイクロ流体デバイスの誘電泳動(DEP)構成を起動することを含む、請求項18〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記選択および/または前記移動が、前記生物学的細胞を選択および/または移動するための誘電泳動(DEP)構成を起動することを含む、請求項19または21に記載の方法。
- 前記DEP構成を起動することが、光を使用して起動することを含む、請求項33または34に記載の方法。
- 前記隔離領域の幅が、前記接続領域の前記幅W con と同じである、請求項12に記載のデバイス。
- 前記隔離領域の幅が、前記接続領域の前記幅W con と同じである、請求項14に記載のデバイス。
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