JP2019534004A5 - - Google Patents

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Claims (39)

  1. 対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するB細胞リンパ球を検出する方法であって、
    B細胞リンパ球を含む試料をマイクロ流体デバイスに導入することであって、
    前記マイクロ流体デバイス
    フロー領域及び隔離ペンを有する囲い
    を備え、
    前記隔離ペン、単一の開口部を有する分離領域及び接続領域を含み、前記接続領域、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、前記隔離ペンの前記分離領域、前記マイクロ流体デバイスの非掃引領域であり、
    B細胞リンパ球を前記試料から前記隔離ペンの前記分離領域に装填することと、
    前記対象の抗原が前記B細胞リンパ球の近くにあるように、前記対象の抗原を前記囲いの前記フロー領域に導入することと、
    前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することと
    を含み、
    前記隔離ペンの前記分離領域、少なくとも1つの調整表面を含む、
    方法。
  2. 前記少なくとも1つの調整表面、共有結合で連結された親水性分子の層を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記親水性分子、ポリエチレングリコール(PEG)含有ポリマーを含む、請求項2に記載の方法。
  4. 前記マイクロ流体デバイスの前記囲い、抗体生成細胞(DEP)構成を更に含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記B細胞リンパ球を含む試料、末梢血の試料、脾臓生検、骨髄生検、リンパ節生検、又は腫瘍生検である、請求項1に記載の方法。
  6. 前記B細胞リンパ球、血漿B細胞である、請求項に記載の方法。
  7. 前記B細胞リンパ球を含む試料、ヒト、マウス、ラット、モルモット、アレチネズミ、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラマ、又はニワトリから得られる、請求項に記載の方法。
  8. 前記B細胞リンパ球を含む試料が哺乳動物から得られており、
    前記哺乳動物、前記対象の抗原に対して免疫化されているか
    前記哺乳動物、前記対象の抗原に関連付けられた病原体に露出されているか又はそれに対して免疫化されているか
    前記哺乳動物がんを有し、前記がん前記対象の抗原に関連付けられるか、又は
    前記哺乳動物自己免疫疾患を有し、前記自己免疫疾患前記対象の抗原に関連付けられる、
    請求項に記載の方法。
  9. 前記B細胞リンパ球を含む試料前記マイクロ流体デバイスに導入される前にデオキシリボヌクレアーゼに接触されており、B細胞リンパ球以外の細胞タイプが枯渇している、請求項1に記載の方法。
  10. 前記B細胞リンパ球を含む試料、CD138を発現するB細胞リンパ球について富化されている、請求項1又はに記載の方法。
  11. 前記B細胞リンパ球を、成長誘導剤に接触させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
  12. 前記B細胞リンパ球に培地を提供することをさらに含み、前記培地、IL−6及び/又はAprilを含む、請求項に記載の方法。
  13. 前記B細胞リンパ球、3日から5日の期間にわたって培地に提供される、請求項12に記載の方法。
  14. 前記B細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域に装填すること、DEP力を使用して、前記B細胞リンパ球を前記フロー領域から前記分離領域に移動させることを含む、請求項4に記載の方法。
  15. 前記対象の抗原を提供すること、対象の可溶性抗原を含む溶液を、前記フロー領域内に又は前記フロー領域を通して流すことを含み、前記対象の抗原が、第1の検出可能な標識に共有結合されている、請求項1に記載の方法。
  16. 第1の抗体結合剤を含む微小物体を提供することを更に含み、前記第1の抗体結合剤、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への対象の抗原の結合を阻害することなく、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体に結合し、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視すること、前記対象の抗原の前記微小物体への間接的な結合を検出することを含む、請求項15に記載の方法。
  17. 前記第1の抗体結合剤、前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体のFcドメインに結合する、請求項16に記載の方法。
  18. 前記微小物体を提供すること、前記微小物体を含む溶液を前記フロー領域に流し、且つ前記微小物体が前記隔離ペンの近くに配置されると前記流れを停止させることを含む、請求項16に記載の方法。
  19. 前記微小物体を含む前記溶液及び前記対象の可溶性抗原を含む前記溶液、同じ溶液である、請求項16に記載の方法。
  20. 第2の抗体結合剤を提供することと、
    前記微小物体への前記第2の抗体結合剤の間接的な結合を監視することと
    を更に含み、
    前記第2の抗体結合剤が、第2の検出可能な標識を含み、
    前記第1の検出可能な標識、前記第2の検出可能な標識と異なる、
    請求項16に記載の方法。
  21. 前記第2の抗体結合剤、IgG抗体に結合する、請求項20に記載の方法。
  22. 前記対象の抗原を提供すること
    前記対象の抗原を含む微小物体を提供することと、
    前記対象の抗原の前又は前記対象の抗原と同時に、標識された抗体結合剤を提供することと、
    を含み、
    前記微小物体、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズであ
    前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を前記監視することが、前記対象の抗原への前記標識された抗体結合剤の間接的な結合を検出することを含む、
    請求項1に記載の方法。
  23. 前記標識された抗体結合剤、抗IgG抗体に結合する、請求項22に記載の方法。
  24. 前記B細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視すること、前記マイクロ流体デバイスの前記隔離ペンの全て又は一部を撮像することを含む、請求項1に記載の方法。
  25. 前記撮像すること、蛍光撮像することを含む、請求項24に記載の方法。
  26. 前記撮像すること、複数の画像を撮影することを含む、請求項24に記載の方法。
  27. 前記マイクロ流体デバイス、複数の前記隔離ペンを含み、各隔離ペン、分離領域及び接続領域を有し、前記接続領域のそれぞれ、前記分離領域と前記フロー領域との間に流体接続を提供し、
    当該方法
    前記複数のB細胞リンパ球の1つ又は複数を前記複数のうちの2つ以上の隔離ペンのそれぞれの前記分離領域に装填することと、
    前記対象の抗原が、1つ又は複数のB細胞リンパ球が装填された前記2つ以上の隔離ペンのそれぞれの近くにあるように、前記対象の抗原を前記マイクロ流体デバイスに導入することと、
    前記装填されたB細胞リンパ球のそれぞれによって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を監視することとと、
    前記装填されたB細胞リンパ球又は前記装填されたB細胞リンパ球のうちのB細胞リンパ球によって発現される前記抗体への前記対象の抗原の結合を検出することと、
    前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するものとして、前記装填されたB細胞リンパ球又は前記装填されたB細胞リンパ球のうちの前記B細胞リンパ球を識別することと、
    を更に含む、請求項1に記載の方法。
  28. 対象の抗原に特異的に結合する抗体を特徴付ける方法であって、
    前記対象の抗原に特異的に結合する抗体を発現するB細胞リンパ球を識別することであって、前記識別すること、請求項27に記載の方法に従って実行される、識別することと、
    前記B細胞リンパ球から、免疫グロブリン重鎖可変領域(V)及び/又は免疫グロブリン軽鎖可変領域(V)をコードする核酸を分離することと、
    前記免疫グロブリン重鎖可変領域(V)をコードする前記核酸の少なくとも一部及び/又は前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(V)をコードする前記核酸の少なくとも一部を配列決定することと
    を含む方法。
  29. 前記免疫グロブリン重鎖可変領域(V)を配列決定すること
    前記識別されたB細胞リンパ球を溶解させることと、
    前記B細胞リンパ球から単離された、前記免疫グロブリン重鎖可変領域(V )をコードするmRNAを逆転写、V cDNAを形成することと、
    前記V cDNAの少なくとも一部を配列決定することと、
    を含む、
    請求項28に記載の方法。
  30. 前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(V)を配列決定すること
    前記識別されたB細胞リンパ球を溶解させることと、
    前記B細胞リンパ球から単離された、前記免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)をコードするmRNAを逆転写、V cDNAを形成することと、
    前記V cDNAの少なくとも一部を配列決定することとと、
    を含む、請求項28に記載の方法。
  31. 前記mRNAを逆転写すること、前記mRNAを捕捉/プライミングオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、請求項29又は30に記載の方法。
  32. 前記逆転写すること、転写スイッチオリゴヌクレオチドの存在下で実行される、請求項29又は30に記載の方法。
  33. 前記識別されたB細胞リンパ球、溶解される前に前記マイクロ流体デバイスから搬出され、
    前記識別されたB細胞リンパ球を搬出することが、
    前記識別されたB細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に移動させることと、
    前記識別されたB細胞リンパ球を、前記フロー領域を通して且つ前記マイクロ流体デバイスから流すことと、
    を含む、
    請求項29又は30に記載の方法。
  34. 前記識別されたB細胞リンパ球を前記隔離ペンの前記分離領域から移動させること、DEP力を使用して、前記識別されたB細胞リンパ球を捕捉し且つ移動させることを含む、請求項33に記載の方法。
  35. 前記V mRNA及び/又は前記V mRNAに結合することが可能なオリゴヌクレオチドをそれぞれ含む、1つ又は複数の捕捉ビーズを、前記識別されたB細胞リンパ球の近傍に提供することと、
    前記識別されたB細胞リンパ球を溶解させることと、
    前記溶解されたB細胞リンパ球からの前記V mRNA及び/又は前記V mRNAを前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合させることと、
    を更に含み、
    前記識別されたB細胞リンパ球、前記マイクロ流体デバイス内で溶解される、
    請求項29又は30に記載の方法。
  36. 前記結合されたV mRNA及び/又は前記結合されたV mRNA、前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、V cDNA及び/又はV cDNAに逆転写される、請求項35に記載の方法。
  37. 前記V cDNA及び/又はV cDNA、前記1つ又は複数の捕捉ビーズに結合されている間、前記マイクロ流体デバイスから搬出される、請求項36に記載の方法。
  38. 前記配列決定前に前記V cDNA及び/又は前記V cDNAを増幅することを更に含
    前記増幅することが、前記B細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたmRNAにおいて、V cDNA及び/又はV cDNA又はその断片の表現を増大させることを含む、
    請求項29又は30に記載の方法。
  39. 前記増幅すること
    前記B細胞リンパ球から単離された前記逆転写されたmRNAにおいて、V cDNA及び/又はV cDNA又はその断片の前記表現を増大させる増幅の第1のラウンドと、
    前記第1のラウンドにおいて増幅されたV cDNA及び/又はV cDNA又はその断片にバーコード配列を導入する増幅の第2のラウンドと
    を含む、請求項38に記載の方法。
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