KR20180101548A - 환자 특이적인 항암 치료제의 제조 방법 및 그 치료 방법 - Google Patents

환자 특이적인 항암 치료제의 제조 방법 및 그 치료 방법 Download PDF

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KR20180101548A
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라드스트롬 샤오 구안
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조지 엘 폭스
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Abstract

(a) 환자로부터 수득된 적어도 하나의 고체 종양 샘플로부터 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계; (b) 해리된 세포 샘플을 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체적으로 접속된 적어도 하나의 고립 영역을 갖는 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계; (c) 적어도 하나의 B 세포를 해리된 세포 샘플로부터 미세유체 디바이스에서 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계; 및 (d) 암 세포들에 결합시킬 수 있는 항체들을 생산하는 적어도 하나의 B 세포를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 포함하는 항체 치료제의 제조 방법이 제공된다. 암 세포들은 환자 자신의 암 세포들일 수 있다. 또한 환자를 치료하는 방법, 암을 표지 또는 검출하는 방법, 항체들 또는 그 단편들을 포함하는 엔지니어링된 T 또는 NK 세포들, 및 엔지어링된 항체 구조물들이 제공된다.

Description

환자 특이적인 항암 치료제의 제조 방법 및 그 치료 방법
본 출원은 2016년 1월 15일자로 출원된 미국 가출원 제 62/279,341 호, 2016년 10월 23일자로 출원된 미국 가출원 제 62/411,690 호, 2016년 10월 24일자로 출원된 미국 가출원 제 62/412,092 호의 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장하는 정규출원이며, 이들 개시들 각각은 여기에 그 전체가 참조에 의해 포함된다.
분야
암 특이적인 항체들을 생산하는 B 세포들을 고립시키는 방법, 그리고 이들 항체들 및/또는 그 유도체들을 이용한 치료 방법이 제공된다.
면역 요법은 암 퇴치를 돕기 위해 환자 자신의 면역계를 사용하는 급성장하는 분야이다. 암 세포들을 공격하기 위해 환자 자신의 면역계를 자극하거나 외부 공급원에서 면역계 성분들을 투여하는 것을 포함하여, 다양한 면역요법 전략이 평가되고 있다. 예를 들어, 생체 내에서 암 세포를 공격하도록 설계된 단일클론 항체들은 단독으로 또는 유전적으로 엔지니어링된 구조물에서 투여되고 있다. 또한, CAR-T (키메릭 항원 수용체 T 세포) 요법이 연구되고 있다. 이 치료 접근법에서, 유전적으로 엔지니어링된 T 세포들은 표면에 항체-포함의 융합 단백질을 발현하고, 이 단백질은 문제의 암에 T 세포들을 타겟팅하고 T 세포들이 암 세포들을 죽이는 것을 허용한다. CAR-T 세포들이 환자의 신체에서 영구적으로 이식될 수 있기 때문에, 이 접근법은 특히 유망한 것으로 보인다. 그러나, 이러한 접근법은 여전히 더 세분화가 필요하다.
단일클론 항체 요법 또는 CAR-T 요법의 주요 문제점들 중 하나는, 상당한 이환율과 사망률을 방지하기 위해 치료 성공이 요구되기 이전에 또는 치료가 시작되기 전에 환자가 매우 짧은 시간 윈도우를 가질 수 있다는 점을 염두에 두고, 해당 환자에게 최대한의 이익을 제공할 항체를 식별하거나 설계하는 것이다.
본 실시형태는 해당 환자에게 최대의 이익을 제공하는 항체를 식별하기 위한 해결책을 제공하여, 연구 조사에 요구되는 시간의 양을 최소화하며 가능한한 빨리 치료를 시작할 수 있게 한다.
기재에 따라서, 항체 치료제를 제조하는 방법은:
a) 환자로부터 수득된 적어도 하나의 고형 종양 샘플로부터 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계;
b) 해리된 세포 샘플을 적어도 하나의 흐름 영역을 갖는 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계;
c) 적어도 하나의 B 세포를 해리된 세포 샘플로부터 미세유체 디바이스에서의 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시켜, 적어도 하나의 고립된 B 세포를 수득하는 단계; 및
d) 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계를 포함한다.
이 방법 및 본원에 기재된 다른 방법은, 일부 실시형태들에서, 환자가 앓고 있는 암의 타입을 타겟팅하기 위해 환자 자신의 신체가 생산하고 있는 B 세포를 식별하는 이점을 제공한다. 이들 항체들을 고립시키기 위해 미세유체 디바이스를 사용함으로써, 복수의 B 세포들은 비교적 빠른 검정 포맷으로 병렬 테스트될 수 있고, 관심있는 특이적 B 세포가 식별, 배양 및 시퀀스화 (또는 하이브리도마를 생산하는데 사용) 될 수 있다. 이는 모노클론 항체 또는 이의 단편으로 투여될 수 있거나, 또는 융합 단백질 또는 CAR-T 치료제와 같이 유전적으로 엔지니어링된 구조물로 투여될 수 있거나, 또는 검출 방법에서 사용될 수 있는, 환자 특이적 항암 항체들을 연구자가 생산할 수 있게 한다.
추가적인 실시형태들은, 본원의 방법에 의해 생산된 항체 또는 그 단편으로 환자를 치료하는 단계를 포함하는 암이 있는 환자의 치료 방법을 포함한다. 환자의 암은 또한 검출 가능한 표지에 콘쥬게이트된 항체 또는 그 단편을 사용하여 표지 또는 검출될 수 있다. 치료용 조성물로서, 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 T 세포들, 그리고 적어도 본원에서 식별된 항체의 중쇄 CDR들, 적어도 중쇄 및 경쇄 CDR들, 적어도 중쇄 가변의 영역, 또는 적어도 중쇄 및 경쇄 가변의 영역을 포함하는 엔지니어링된 항체 구조물들이 제공될 수 있다.
추가적인 목적들 및 이점들은 부분적으로 다음의 설명에서 설명될 것이고, 부분적으로 설명으로부터 명백해지거나 또는 실제에 의해 습득될 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 청구범위에서 특별히 지적된 엘리먼트들 및 조합들에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 모두 단지 예시적이고 설명적인 것이며 청구범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
첨부된 도면은 본 명세서에 통합되어 본 명세서의 일부를 구성하며, 하나의 (복수의) 실시형태(들)를 나타내고, 그리고 설명과 함께 본원에 기재된 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 는 일부 실시형태들에 따른 연관된 제어 장비를 포함하여 미세유체 디바이스와 함께 사용하기 위한 시스템 및 미세유체 디바이스의 예를 도시한다.
도 1b 및 도 1c 는 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스의 수직 및 수평 단면도를 각각 도시한다.
도 2a 및 도 2b 는 일부 실시형태들에 따른 고립 펜들을 갖는 미세유체 디바이스의 수직 및 수평 단면도를 각각 도시한다.
도 2c 는 일부 실시형태들에 따른 격리 챔버의 상세화된 수평 단면도를 도시한다.
도 2d 는 일부 실시형태들에 따른 고립 펜들을 갖는 미세유체 디바이스의 부분 수평 단면도를 도시한다.
도 2e 및 도 2f 는 일부 실시형태들에 따른 격리 챔버들의 상세화된 수평 단면도를 도시한다.
도 2g 는 실시형태에 따른 복수의 흐름 채널들을 포함하는 흐름 영역을 갖는 미세유체 디바이스를 도시하고, 각각의 흐름 채널은 복수의 격리 채널들에 유체적으로 접속된다.
도 2h 는 미세유체 디바이스의 부분 수직 단면도를 도시하고, 미세유체 디바이스에서 베이스의 내향 표면 및 커버의 내향 표면은 일부 실시형태들에 따른 컨디셔닝된 표면들이다.
도 3a 는 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스 및 연관된 제어 장비와 함께 동작적으로 커플링하도록 구성된 시스템 네스트의 특정 예를 도시한다.
도 3b 는 일부 실시형태들에 따른 미세유체 디바이스를 제어하기 위한 시스템의 광학 트레인을 도시한다.
도 4 는 일부 실시형태들에 따라 암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포 림프구를 식별하기 위한 예시적인 워크플로우의 단계들을 도시한다.
도 5a-5c 는 복수의 미세유체 채널들을 포함하는 미세유체 디바이스를 도시하며, 각각의 미세유체 채널은 복수의 격리 챔버들과 유체 접속된다. 각각의 격리 챔버는 복수의 마우스 지라세포 (spenocytes) 를 포함한다. 도 5a 는 미세채널 디바이스의 일부의 명시야 이미지이다. 도 5b 및 도 5c 는 텍사스 레드 필터를 사용하여 얻어진 형광 이미지이다. 도 5b 에서, 이미지는 예 1에 기재된 항원 특이성 검정의 개시 5 분 후에 수득되었다. 도 5c 에서, 이미지는 예 1에 기재된 항원 특이성 검정의 개시 20 분 후에 수득되었다. 도 5c 의 백색 화살표는 검정에서 양성 신호를 생성한 격리 챔버들을 가리킨다.
도 6 은 Jurkat 세포로부터 여러 분획물의 웨스턴 블랏을 도시한다.
도 7 은 항-CD3, 항-CD45 또는 항-NA/K-ATPase 항체들로 염색된 Jurkat 세포 막 분획으로 코팅된 비드를 도시한다.
도 8 은 도 7 에서와 동일한 항체들로 염색된 HEK293 세포들로 코팅된 비드를 도시한다.
I. 정의들
본 상세한 설명은 본 발명의 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들을 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들에 또는 예시적인 실시형태들 및 애플리케이션들이 동작하거나 본원에 설명되는 방식에 제한되지 않는다. 더욱이, 도면들은 단순화된 또는 부분 뷰들을 나타낼 수도 있고, 도면들에서 엘리먼트들의 치수들은 과장되거나 또는 다르게는 비례적이지 않을 수도 있다. 또한, 용어들 "~ 상에 (on)", "~ 에 부착된 (attached to)", "~ 에 접속된 (connected to)", "~ 에 결합된 (coupled to)" 또는 유사한 단어들이 본원에서 사용되는 바와 같이, 하나의 엘리먼트가 다른 엘리먼트 바로 위에 있고, 그것에 부착되거나, 그것에 접속되고 또는 그것에 결합되는지, 또는 하나의 엘리먼트와 다른 엘리먼트 사이에 하나 이상의 중간 엘리먼트들이 있는지 여부에 관계 없이, 하나의 엘리먼트 (예를 들어, 재료, 층, 기판 등) 는 다른 엘리먼트 "상에" 있을 수 있고, 그것에 "부착될" 수 있고, 그것에 "접속될" 수 있고, 또는 그것에 "결합될" 수 있다. 또한, 콘텍스트가 다르게 기술하지 않으면, 방향들 (예를 들어, 위 (above), 아래 (below), 상단 (top), 하단 (bottom), 측면 (side), 상 (up), 하 (down), 상부에서 (over), 상부 (upper), 하부 (lower), 수평, 수직, "x", "y", "z" 등) 은 제공된다면 상대적이고, 제한이 아니라, 전적으로 예로서 그리고 예시 및 논의의 용이함을 위해 제공된다. 또한, 엘리먼트들 (예를 들어, 엘리먼트들 a, b, c) 의 리스트에 대해 참조가 이루어지는 경우, 이러한 참조는 열거된 엘리먼트들 자체, 전부보다 적은 열거된 엘리먼트들의 임의의 조합, 및/또는 열거된 엘리먼트들의 전부의 조합 중의 임의의 하나를 포함하도록 의도된다. 상세한 설명에서 섹션 분할들은 단지 리뷰의 용이함을 위한 것이고 논의된 엘리먼트들의 임의의 조합을 제한하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로" 는 의도된 목적을 위해 작동하기에 충분하다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로" 는 따라서, 당업자에 의해 예상될 것이지만, 전체적인 성능에 인식가능하게 영향을 주지 않는 바와 같은, 절대적인 또는 완전한 상태, 치수, 측정, 결과 등으로부터의 소수의 중요하지 않은 변형들을 허용한다. 수치 값들 또는 수치 값들로서 표현될 수 있는 파라미터들 또는 특징들에 대하여 사용될 때, "실질적으로" 는 10 퍼센트 이내를 의미한다.
용어 "것들" 은 하나보다 많은 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복수" 는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배치된" 은 그 의미 내에 "위치된" 을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "미세유체 디바이스" 또는 "미세유체 장치" 는 유체를 보유하도록 구성된 하나 이상의 별개의 미세유체 회로들을 포함하는 디바이스이고, 각각의 미세유체 회로는, 영역(들), 흐름 경로(들), 채널(들), 챔버(들), 및/또는 펜(들), 및 유체 (및, 선택적으로는 유체에서 부유된 마이크로-객체들) 가 미세유체 디바이스의 안 및/또는 밖으로 흐르는 것을 허용하도록 구성된 적어도 2개의 포트들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 유체적으로 서로접속된 회로 엘리먼트들로 이루어진다. 통상적으로, 미세유체 디바이스의 미세유체 회로는 적어도 하나의 미세유체 채널 및 적어도 하나의 챔버를 포함할 것이고, 약 1 mL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 μL 미만의 유체의 볼륨을 보유할 것이다. 특정 실시형태들에서, 미세유체 회로는 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-8, 2-10, 2-12, 2-15, 2-20, 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 10-50, 10-75, 10-100, 20-100, 20-150, 20-200, 50-200, 50-250, 또는 50-300 μL 를 보유한다.
본원에 사용된 바와 같이, "나노유체 디바이스" 또는 "나노유체 장치" 는 약 1 μL 미만, 예를 들어 약 750, 500, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 nL 미만의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된 적어도 하나의 회로 엘리먼트를 포함하는 미세유체 회로를 갖는 미세유체 디바이스의 타입이다. 나노유체 디바이스는 복수의 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 그 이상) 을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 100 pL 내지 1 nL, 100 pL 내지 2 nL, 100 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 2 nL, 250 pL 내지 5 nL, 250 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 5 nL, 500 pL 내지 10 nL, 500 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 10 nL, 750 pL 내지 15 nL, 750 pL 내지 20 nL, 1 내지 10 nL, 1 내지 15 nL, 1 내지 20 nL, 1 내지 25 nL, 또는 1 내지 50 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 적어도 하나의 회로 엘리먼트들 중 하나 이상 (예를 들어, 전부) 은 약 20 nL 내지 200 nL, 100 내지 200 nL, 100 내지 300 nL, 100 내지 400 nL, 100 내지 500 nL, 200 내지 300 nL, 200 내지 400 nL, 200 내지 500 nL, 200 내지 600 nL, 200 내지 700 nL, 250 내지 400 nL, 250 내지 500 nL, 250 내지 600 nL, 또는 250 내지 750 nL 의 유체의 볼륨을 보유하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 "미세유체 채널" 또는 "흐름 채널" 은 수평 및 수직 치수들 양자 모두보다 상당히 더 긴 길이를 갖는 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 지칭한다. 예를 들어, 흐름 채널은 수평 또는 수직 치수 중 어느 하나의 길이의 적어도 5 배, 예를 들어 적어도 10 배 길이, 적어도 25 배 길이, 적어도 100 배 길이, 적어도 200 배 길이, 적어도 500 배 길이, 적어도 1,000 배 길이, 적어도 5,000 배 길이, 또는 더 길 수 있다. 일부 실시형태들에서, 흐름 채널의 길이는 그 사이의 임의의 범위를 포함하는, 약 50,000 마이크론 내지 약 500,000 마이크론의 범위에 있다. 일부 실시형태들에서, 수평 치수는 약 100 마이크론 내지 약 1000 마이크론 (예를 들어, 약 150 내지 500 마이크론) 의 범위에 있고, 수직 치수는 약 25 마이크론 내지 약 200 마이크론, 예를 들어 약 40 내지 약 150 마이크론의 범위에 있다. 흐름 채널은 미세유체 디바이스에서 다양한 상이한 공간적 구성들을 가질 수도 있고, 따라서 완벽히 선형 엘리먼트에 제한되지 않는다는 것이 주목된다. 예를 들어, 흐름 채널은 다음의 구성들: 커브, 벤드, 나선형, 경사, 쇠퇴, 포크 (예를 들어, 다수의 상이한 흐름 경로들), 및 이들의 임의의 조합 중 임의의 것을 갖는 하나 이상의 섹션들을 포함할 수도 있다. 또한, 흐름 채널은, 원하는 유체 흐름을 그 안에 제공하기 위해 넓히고 수축시키는, 그 경로를 따른 상이한 단면 영역들을 가질 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "장애물"은 일반적으로 미세유체 디바이스 내의 2 개의 상이한 영역들 또는 회로 엘리먼트들 사이의 타겟 마이크로-객체들의 이동을 부분적으로 (그러나 완전히는 아님) 방해하기에 충분히 큰 범프 또는 유사한 타입의 구조를 지칭한다. 2 개의 상이한 영역들/회로 엘리먼트들은, 예를 들어 미세유체 격리 펜 및 미세유체 채널, 또는 미세유체 격리 챔버의 접속 영역 및 고립 영역일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수축 (constriction)" 은 일반적으로 미세유체 디바이스에서 회로 엘리먼트 (또는 2 개의 회로 엘리먼트들 사이의 인터페이스) 의 폭을 좁히는 것을 지칭한다. 수축은, 예를 들어 미세유체 격리 챔버와 미세유체 채널 사이의 인터페이스에, 또는 미세유체 격리 챔버의 고립 영역과 접속 영역 사이의 인터페이스에 위치될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투명한" 은 가시 광이 통과될 때 가시 광이 광을 실질적으로 바꾸지 않고 통과하는 것을 허용하는 재료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로-객체"는 일반적으로 본 발명에 따라 고립 및 수집될 수 있는 임의의 마이크로스코픽 객체를 지칭한다. 마이크로-객체들의 비-제한적 예들은: 미세입자들; 미세비드들 (예를 들어, 폴리스티렌 비드들, Luminex™ 비드들 등); 자기 비드들; 미세로드들; 미세와이어들; 양자 점들 등과 같은 무생물의 마이크로-객체들; 세포들 (배아들, 난모세포들, 난자들, 정자 세포들, 조직으로부터 분리된 세포들, 진핵 세포들, 원생생물 세포들, 동물 세포들, 포유류 세포들, 인간 세포들, 면역 세포들, 하이브리도마, 배양 세포들, 세포주로부터의 세포들, 암 세포들, 감염된 세포들, 형질 주입된 및/또는 형질 전환된 세포들, 리포터 세포들, 원핵 세포들 등); 생물학적 세포기관들; 소낭들, 또는 착물들; 합성 소낭들; (예를 들어, 막 표본들로부터 유래된 또는 합성의) 리포솜들; 지질 나노래프트들 (Ritchie 등의, (2009) "Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs," Methods Enzymol., 464:211-231 에 기술되어 있음) 등과 같은 생물학적 마이크로-객체들; 또는 무생물의 마이크로-객체들 및 생물학적 마이크로-객체들의 조합 (예를 들어, 세포들에 부착된 미세비드들, 리포좀-코팅된 미세-비드들, 리포솜-코팅된 자기 비드들, 등) 을 포함한다. 비드들은 또한, 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 부착된 다른 모이어티들/분자들, 예컨대 형광성 라벨들, 단백질들, 소분자 시그널링 모이어티들, 항원들, 또는 검정에서 사용할 수 있는 화학적/생물학적 종들을 가질 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포"는 식물 세포, 동물 세포 (예를 들어, 포유류 세포), 박테리아 세포, 균류 세포 등일 수 있는 생물학적 세포를 지칭한다. 포유류 세포는 예를 들어 인간, 생쥐, 쥐, 말, 염소, 양, 소, 영장류 등으로부터일 수 있다.
생물학적 세포들의 콜로니 (colony) 는 재생할 수 있는 콜로니에서의 모든 살아 있는 세포들이 단일의 친세포로부터 도출된 딸 세포들인 경우 "클론"이다. 용어 "클론 세포"는 동일한 클론 콜로니의 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 세포의 "콜로니"는 2 개 이상의 세포들 (예를 들어, 2-20, 4-40, 6-60, 8-80, 10-100, 20-200, 40-400, 60-600, 80-800, 100-1000 또는 1000 개 이상의 세포들) 을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포(들)을 유지하는" 은 세포들의 생존 및/또는 증식을 유지하는데 필요한 컨디션들을 제공하는 유체 및 기체 성분들 양자 모두, 및 선택적으로는 표면을 포함하는 환경을 제공하는 것을 지칭한다.
유체 배지의 "성분" 은, 용매 분자들, 이온들, 소분자들, 항생물질들, 뉴클레오티드들 및 뉴클레오시드들, 핵산들, 아미노산들, 펩티드들, 단백질들, 설탕들, 탄수화물들, 지질들, 지방산들, 콜레스테롤, 대사물들 등을 포함하는, 배지에 존재하는 임의의 화학적 또는 생물학적 분자이다.
유체 배지를 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, "확산하다" 및 "확산" 은 농도 구배 아래의 유체 배지 성분의 열역학 운동을 지칭한다.
문구 "배지의 흐름" 은 주로 확산 이외의 임의의 메커니즘으로 인한 유체 배지의 벌크 이동을 의미한다. 예를 들어, 배지의 흐름은 포인트들 사이의 압력 차이로 인한 유체 배지의 한 포인트에서 다른 포인트로의 이동을 수반할 수 있다. 이러한 흐름은 액체의 연속적인, 펄싱된, 주기적인, 랜덤한, 간헐적인, 또는 왕복 흐름, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 유체 배지가 다른 유체 배지로 흐르는 경우, 배지의 터뷸런스 및 혼합이 초래될 수 있다.
문구 "실질적으로 흐르지 않음" 은, 시간 경과에 따라 평균화될 때, 유체 배지 안으로 또는 유체 배지 내에서 재료 (예를 들어, 관심 있는 분석물) 의 성분들의 확산 속도보다 작은 유체 배지의 흐름 속도를 지칭한다. 이러한 재료의 성분들의 확산 속도는, 예를 들어 온도, 성분들의 크기, 및 성분들과 유체 배지 간의 상호작용들의 강도에 의존할 수 있다.
미세유체 디바이스 내의 상이한 영역들을 참조하여 본원에 사용된 바와 같이, 문구 "유체적으로 접속된" 은, 상이한 영역들이 유체 배지와 같은 유체로 실질적으로 채워지는 경우, 유체의 단일 바디를 형성하도록 영역들 각각에서의 유체가 접속되는 것을 의미한다. 이것은, 상이한 영역들에서의 유체들 (또는 유체 배지) 이 반드시 조성이 동일한 것을 의미하지 않는다. 차라리, 미세유체 디바이스의 상이한 유체적으로 접속된 영역들에서의 유체들은, 용질들이 그들 각각의 농도 구배들을 하강시키고/시키거나 유체들이 디바이스를 통해 흐를 때 유입되는 상이한 조성들 (예를 들어, 단백질들, 탄수화물들, 이온들, 또는 다른 분자들과 같은 용질들의 상이한 농도들) 을 가질 수 있다.
여기서 사용된 바와 같이, "흐름 경로" 는 배지의 흐름의 궤적을 정의하고, 그것에 종속되는 하나 이상의 유체적으로 접속된 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널(들), 영역(들), 챔버(들) 등) 을 지칭한다. 흐름 경로는 따라서 미세유체 디바이스의 스윕 영역의 예이다. 다른 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 비스윕 영역들) 은 흐름 경로 내의 배지의 흐름에 종속됨 없이 흐름 경로를 포함하는 회로 엘리먼트들과 유체적으로 접속될 수도 있다.
여기서 사용된 바와 같이, ㎛는 마이크로미터를 의미하고, ㎛3은 입방 마이크로미터를 의미하고, pL은 피코리터를 의미하고, nL은 나노리터를 의미하고, 그리고 μL (또는 uL) 은 마이크로리터를 의미한다.
본 명세서에서의 섹션 구분은 검토의 편의를 위한 것이며 논의된 엘리먼트의 임의의 조합을 제한하지 않는다.
II. 항체 치료제의 제조 방법
항체 치료제는 하기 단계를 포함하는 방법을 사용하여 제조될 수 있다:
a) 환자로부터 수득된 적어도 하나의 고형 종양 샘플로부터의 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계;
b) 해리된 세포 샘플을 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체적으로 접속된 적어도 하나의 고립 영역을 갖는 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계;
c) 해리된 세포 샘플로부터의 적어도 하나의 B 세포를 미세유체 디바이스 내의 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시켜, 적어도 하나의 고립된 B 세포를 수득하는 단계; 및
d) 암 세포 연관 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계.
항체를 식별하는 이 방법은 다양한 상이한 모드에서 실행될 수 있어, 항체를 생산하는 B 세포와 치료제가 필요한 환자에게 문제를 일으키는 암 세포 사이의 관계를 갖는 하나의 잠재적인 목표를 염두한다. 하나의 특정 방법 (400) 은 도 4에 개략적으로 도시되어 있다.
특정 예들에서, 방법은 식별된 B 세포(들)로부터 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 항체 시퀀스를 결정하는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 시퀀싱은 암 세포에 결합하는 항체를 생산하는 적어도 하나의 B 세포가 미세유체 디바이스로부터 배출된 후에 수행될 수 있다. 다른 경우, 상기 방법은 적어도 하나의 고립된 B 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계를 포함한다. 항체 시퀀스가 결정되면, 방법은 또한 적어도 하나의 식별된 B 세포로부터의 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 시퀀스들의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 치료제를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 적어도 하나의 식별된 B 세포로부터 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 시퀀스로부터의 여섯 개의 CDR들을 모두 포함하는 항체 또는 그의 기능적 부분을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
A. 해리된 세포 샘플의 제조
특정 예들에서, 방법은 고형 종양으로부터 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (410) 에 도시된 바와 같다. 고형 종양 샘플은 외과적 절제 생검 또는 미세 바늘 흡인 (FNA) 과 같은 종양 생검일 수 있다. 일부 예들에서, 종양은 증식하는 B 세포들 및/또는 B 세포 여포를 포함할 수 있는 3차 림프성 구조를 갖는다. 종양은 유방암, 비뇨생식기 암, 신경계의 암, 장암, 폐암, 흑색종 또는 다른 타입의 암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유방암은 수질상 유방암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비뇨생식기 암은 신장 (예컨대, 신장 세포 암종), 요관, 방광 또는 요도와 같은 요로에서 기인한 암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 비뇨생식기 암은 남성 생식기관의 암 (예를 들어, 고환암, 전립선 암, 또는 정낭, 정액 또는 페니스의 암) 또는 여성 생식기관의 암 (예를 들어, 난소 암, 자궁 암, 자궁 경부암, 질암, 또는 난관의 암) 일 수 있다. 일부 실시형태에서, 신경계의 암은 신경 모세포종일 수 있다. 일부 실시형태에서, 장암은 결장 직장암일 수 있다. 일부 실시형태에서, 폐암은 중피종일 수 있다.
어떤 경우에는, 단일 종양 샘플이 수득된다. 다른 경우, 다중 종양 샘플들이 수득된다. 한 예로, 모든 종양 샘플들은 동일한 환자의 샘플이다. 예를 들어, 하나의 종양 샘플이 (단일 생검과 같은) 환자로부터 사용되거나 (동일한 종양 또는 환자의 다른 종양으로부터의 다중 생검과 같은) 동일한 환자로부터 사용될 수 있다.
다른 경우에는, 다른 환자로부터 종양 샘플이 사용될 수 있다. 예를 들어, B 세포들은 첫 번째 환자의 것일 수 있고 암 세포들 (예를 들어, 암 세포 관련 항원의 원천으로 사용되는 암 세포) 는 두 번째 환자의 것이다. 이 중 일부 모드에서, B 세포들은 치료를 원하는 환자의 것이다. 이 모드 중 일부에서, 암 세포는 암 세포주로부터의 것이다. 샘플들이 다른 환자의 것인 경우, 항체를 생산하는 B 세포와 암 세포 관련 항원 간의 어떤 관계가 또한 유지될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 관련 항원이 동일한 환자의 암 세포들로부터 유래되지 않는 경우, 이들은 일부 실시형태에서 동일한 타입의 암일 수 있다. 특정 예들에서, 미세유체 디바이스에 사용되거나 또는 그렇지 않은 경우 암 관련 항원을 제공하는데 사용되는 암 세포는 환자가 겪고 있는 종양 타입의 특징인 하나 이상의 마커들을 나타낸다. 예를 들어, 암 세포들은 환자의 종양 샘플에도 존재하는 하나 이상의 그러한 마커들을 가질 수 있다.
특정 예들에서, 상기 방법은 종양 샘플을 처리하여 해리된 세포 샘플을 생산하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (420) 에 도시된 바와 같다. 해리된 세포 샘플은 종양 (예를 들어, 종양 생검 또는 FNA) 으로부터 해리되는 적어도 하나의 단일 세포를 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 모든 세포들이 단일 세포 형태이다. 다른 경우들에서, 일부 세포들은 단일 세포 형태가 아니고 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 세포 이상의 덩어리에 남아 있지만, 다른 세포는 단일 세포 형태에 있다. 해리된 세포 샘플은 해리된 형태로 배양된 암 세포주를 포함한다. 따라서, 세포들은 (적어도 하나의 고형 종양 샘플을 수득하고 적어도 하나의 단일 세포를 해리함으로써) 활발히 해리되거나 또는 (해리된 형태로 이전에 해리되거나 성장된 샘플을 수득함으로써) 수동적으로 해리될 수 있다.
해리는 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 종양 샘플은 콜라게나아제 플러스 DNase 분해를 사용하여 해리될 수 있다. 종양 샘플은 또한 Miltenyi Biotec의 gentleMACS™ 기기와 같은 세포 해리기를 사용하여 해리될 수 있다.
경우에 따라, 상기 방법은 로딩 전에 해리된 세포 샘플에 대한 선택을 수행하는 단계를 더 포함하여 원래의 해리된 샘플보다 큰 백분율 및/또는 농도의 B 세포들을 갖는 분획을 고립시킨다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (430) 에 도시된 바와 같다. 필요하다면, B 세포들은 CD19, CD20, IgM, IgD, CD38, CD27, CD138, PNA, 및 GL7로부터 선택된 것들과 같은 적어도 하나의 마커를 사용하여 해리된 세포 샘플로부터 선택될 수 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, (예를 들어, B 세포들에서 발현되지 않는 적어도 하나의 마커를 사용하여) 비-B 세포를 제거하기 위해 음성 선택이 수행될 수 있다. 예를 들어, 해리된 세포 샘플은 (예를 들어, 암 세포 특이적 마커를 사용하여) 암 세포들을 및/또는 (예를 들어, CD3, CD4, CD8 등과 같은 T 세포 특이적 마커를 사용하여) T 세포들을 고갈시킬 수 있다. 또 다른 예들에서, 해리된 세포 샘플은 B 세포들이 풍부하도록 처리하지 않고 미세유체 디바이스로 로딩된다.
해리된 세포 샘플이 처리되어 B 세포를 풍부하게 하는지 여부에 관계없이, 해리된 세포 샘플은 미세유체 디바이스 안으로 로딩된다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (440) 를 참조한다. 일부 경우에, 단일 해리된 세포 샘플이 미세유체 디바이스 상으로 로딩될 수 있다. 단일의 해리된 세포 샘플은 B 세포들 및 다른 타입의 세포들 (예를 들어, 암 세포) 모두를 포함할 수 있다. 다른 경우, (i) 단일 해리된 세포 샘플의 분리된 분획들 또는 (ii) 상이한 해리된 세포 샘플들 (예를 들어, 각각 분별 및/또는 상이한 방식으로 분획됨) 은 상이한 시간들에서 로딩될 수 있다. 일부 경우, 해리된 세포 샘플은 원래 샘플보다 암 세포들의 백분율 및/또는 농도가 더 높은 분획을 생산하도록 처리될 수 있다. 암 세포 분획은 B 세포들의 선별 후에 잔류하는 분획일 수 있고, 또는 그 반대일 수도 있다.
원하는 경우, 암 세포들은 암의 적어도 하나의 마커 특성을 이용하여 해리된 세포 샘플로부터 선택될 수 있다. 일부 경우, 세포들은 형태학적 차이를 사용하여 분리될 수 있다. 암 세포들은 종종 불규칙한 세포 크기 (예를 들어, 더 큰 세포 크기 또는 더 작은 세포 크기), 더 큰 핵을 디스플레이하거나, 더 많은 DNA를 포함하거나, 또는 핵 구조 변화를 포함한다. 대부분의 경우, 이러한 차이들은 시각적으로 및/또는 자동화될 수 있는 이미지 분석에 의해 식별될 수 있다. 그러한 분석을 촉진 또는 강화하기 위해, 해리된 세포 샘플은 핵산들에 대해 염색될 수 있거나 (예를 들어, 핵산 결합성 염료로 염색될 때, 암 세포들은 종종 정상 세포들보다 더 밝게 염색된다) 또는 핵 엔벨로프, 인 및/또는 핵 매트릭스와 연관된 마커에 대해 염색될 수 있다. 이러한 마커들의 예들은 라민들 (예를 들어, A 형 또는 B 형 라민), 핵막 단백질들 (예를 들어, 에머린과 같은 핵 라미나 관련 단백질), 섬유소, 핵 공극 단백질들 (Nup153, Nup210 등과 같은 NUP), 히스톤 단백질들, 및 핵 매트릭스 단백질들 (예를 들어, p84)), 핵 구조의 차이점을 강조할 수 있는 임의의 것을 포함한다.
또한, 형태학적 차이 외에, 다양한 마커들이 암 세포들의 특정 타입들을 식별하는데 유용한 것으로 업계에 알려져 있으며, 다음을 포함하지만 이에 한정하지 않는다.
유방 암의 경우, CD44, HLA-DR, Ki-67 (또는 MK167), 알데하이드 탈수소효소 1 (ALDH1), 및 강글리오사이드 GD2 는 암 세포들에 존재하거나 증가하는 경향이 있는 한편, 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2), 및 CD24 는 암 세포들에서 부재하거나 감소하는 경향이 있다; ER-/PR-/HER2-/HLA-DR+ 는 수질상 유방 암을 식별하는데 사용할 수 있고; 그리고 CD44hi/CD24lo/ALDH1hi 또는 CD44hi/CD24lo/GD2hi 는 유방 암 줄기 세포를 식별하는데 사용될 수 있다.
신장 암, C-반응성 단백질, 아쿠아포린-1 (AQP1), 아디포필린 (ADFP), 인슐린-유사 성장 인자 II mRNA 결합 단백질 3 (IGF2BP3 또는 IMP3), B7-H1 (또는 PD-L1), 및 Ki-67 (MK167) 은 암 세포들에 존재하거나 상승하는 경향이 있다.
방광 암, 핵 분열 장치 단백질 (NMP22), 방광 종양 항원 (BTA), 및 피브린/피브리노겐 분해 생성물들이 암 세포들에 존재하고 및/또는 증가하는 경향이 있는 한편, 아디포시트 지방산 결합 단백질 (A-FABP), 글루타티온 S-전이효소 mu (GST-μ), 프로스타글란딘 탈수소효소 (PGDH), 및 케라틴 13은 정상 세포들에 비해 결핍되거나 감소하는 경향이 있고, 유전자 수준에서 p16 종양 억제 유전자 또는 9p21 로커스 (locus) 는 암 세포들에서 삭제될 수도 있다.
방광 암의 경우, 보체 인자 H 관련 단백질 (CFHrp) 은 암 세포들에서의 증가된 레벨 및/또는 분비를 나타낼 수 있고; 핵 수준에서, 텔로머라아제 역 전사효소 (TERT) 는 암 세포에서 증가된 mRNA 발현을 나타내는 경향이 있다.
자궁내막 암의 경우, 암 항원 15-3 (CA15-3), 암 항원 125 (CA125), 암 항원 19.9 (CA19.9), 암 항원 72.4 (CA72.4), 및 암배아 항원 (CEA) 은 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있다.
난소 암의 경우, 종양-관련 트립신 억제제 (TATI), 암 항원 125 (CA125), Claudin5, 인간 에피디드미스 단백질 4 (HE4), 암배아 항원 (CEA), VCAM-1 및 miR-181a는 암 세포들 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있고; TATI, CA125 및 Claudin 5는 HE4 및 CA125와 같이 선택적으로 CEA 및 VCAM-1과 함께 난소 암을 진단하기 위해 조합하여 사용되었다; STAT1 은 화학 요법에 반응하는 난소 암들과 그렇지 않은 난소 암들을 구별하는데 사용될 수 있다.
자궁 암의 경우, 인간 유두종 바이러스 (HPV) (예를 들어, 타입 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 6, 11, 42, 43, 및 44), p16INK4a 및 인슐린 유사 성장 인자 II mRNA 결합 단백질 3 (IGF2BP3 또는 IMP3) 은 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있다.
전립선 암의 경우, 전립선 특이 항원 (PSA), 사르코신 (대사), 전립선 암 유전자 3 (PCA3) 및 TMPRSS2:ERG 융합 생성물은 암 세포들에 존재하고 및/또는 증가하는 경향이 있는 한편, 전립선 산 포스파타제, 피브리노겐 α 사슬 전구체, 콜라겐 α-1 (III), 콜라겐 α-1 (I), 건선 감수성 1 후보 유전자 2 단백질, 간세포 암 관련 단백질 TB6, 히스톤 H2BB, 오스테오폰틴, 폴리머 Ig 수용체, Na/K-수송 ATPase γ, 막전위 위선암 (transmembrane secretory component) 및 세메노겔린 (semenogelin) 1은 정상 세포에 비해 결핍되거나 감소하는 경향이 있다.
신경아세포종의 경우, VMA (vanillylmandelic acid), 호모바닐릭 산 (HVA), 및 페리틴의 증가된 레벨들 및/또는 분비는 암 세포들 및 신경 특이 에놀라제 (NSE), 락트산 탈수소효소 (LDH) 와 연관되고, 그리고 강글리오사이드 GD2는 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있고; 그리고 게놈 수준에서 염색체 1p 및 11q 부분의 삭제 및 17q의 일부의 중복은 암 세포들과 관련된다.
대장 암의 경우, 암배아 항원 (CEA), 암 항원 19-9 (CA19-9), 대장암 특이 항원 3 (CCSA-3), 대장암 특이 항원 4 (CCSA-4), 및 B-Raf 돌연변이 V600E는 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있는 한편; 유전적 수준에서 대장 암 세포들은 마이크로위성 불안정성과 다양한 K-Ras 돌연변이를 나타낸다.
소세포 폐암종의 경우, 갱글리오사이드 GD2 는 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있고; 비소세포 폐암종의 경우, B-Raf 돌연변이 V600E 는 암 세포들에 존재하는 경향이 있고; 메소델리오마의 경우, 칼레티닌, 시토케라틴 5/6, 및 WT1은 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있는 한편, 암배 항원 (CEA), 상피 세포 부착 분자 (Ep-CAM) (예를 들어, MOC-31 또는 Ber-EP4 항체에 의해 검출됨), 루이스 Y 혈액 그룹 (예를 들어, BG-8 항체에 의해 검출됨), 및 B72.3 항체에 의해 검출된 종양 관련 당 단백질은 부재하거나 감소하는 경향이 있고; 그리고 반대로 폐 선암의 경우, CEA, Ep-CAM (예를 들어, MOC-31 또는 Ber-EP4 항체로 검출됨), 루이스 Y 혈액 그룹 (예를 들어, BG-8 항체에 의해 검출됨), 및 B72.3 항체에 의해 검출되는 종양 관련 당 단백질은 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있는 한편, 칼레티닌, 시토케라틴 5/6 및 WT1은 결핍되거나 감소되는 경향이 있다.
흑색종의 경우, 인간 내인성 레트로바이러스 (HERV-K), 갱글리오사이드 GD2, B-Raf 돌연변이 V600E, Hsp90, RGS1 (regulator of G-protein signaling 1), 오스테오폰틴, 인간 표피 성장 인자 수용체 3 (HER3), 핵 수용체 보조활성화 3 (NCOA3), 및 미니크로모섬 유지 복소 성분들 4 및 6 (각각 MCM4 및 MCM6) 은 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 경향이 있는 한편, 억제제 또는 성장 단백질 3 및 4 (각각 ING3 및 ING4) 는 정상 세포들에 비해 결핍 또는 감소하는 경향이 있다.
일부 경우, 암 세포들은 암을 특징으로 하는 적어도 2개의 마커들을 이용하여 해리된 세포 샘플로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 2 이상의 마커들은 형태학적 마커, 적어도 하나의 양성 마커 (예를 들어, 암 세포들에 존재하고 및/또는 상승하는 마커) 및/또는 적어도 하나의 음성 마커 (예를 들어, 정상 세포들에 비해 결핍되거나 감소되는 마커), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 모드에서, B 세포들 (예를 들어, 메모리 B 세포들, 혈장 B 세포들 등, 및 이들의 조합) 및/또는 암 세포들은 FACS에 의해 해리된 세포 샘플로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, B 세포들 (예를 들어, 메모리 B 세포들, 혈장 B 세포들 등, 및 이들의 조합) 및/또는 암 세포들은 또한 자기 비드-기반의 분류를 사용하여 해리된 샘플로부터 선택될 수 있다. 선택은 CD27 (또는 일부 다른 메모리 B 세포 마커) 을 표현하는 B 세포들 또는 CD138 (또는 일부 다른 다른 혈장 세포 마커) 를 표현하는 B 세포들에 대한 샘플을 풍부하게 할 수 있다. 선택은 양성일 수 있다 (예를 들어, B 세포 특이적 또는 암 세포 특이적인 마커에 기초함). 대안으로, 선택은 음성일 수 있다. 예를 들어, 비-B 세포의 세포 타입들은 DYNABEADSTM 언터치의 인간 B 세포 시약 (Thermo Fisher), B 세포 분리 키트 (Miltenyi), RosetteSep 인간 B 세포 풍부 코카인 (Stem Cell Technologies) 등으로 샘플을 처리하는 것과 같은, 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 해리된 세포 샘플로부터 고갈될 수 있다. 다른 예로서, 선택은 IgM 항체, IgA 항체, IgD 항체, IgG 항체 또는 이들의 임의의 조합을 발현하는 B 세포들의 샘플을 고갈시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, B 세포들 및/또는 암 세포들은 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 미세유체 디바이스를 사용하여 선택될 수 있다.
B. B 세포들의 미세유체 디바이스 안으로의 로딩 및 미세유체 디바이스 내에서의 이동
해리된 세포 샘플 (선택적으로 전술한 바와 같이 분획됨) 은, 미세유체 디바이스의 입구를 통해 흐름 영역으로 샘플의 세포를 흐르게 함으로써 미세유체 디바이스 안으로 로딩될 수 있다. 예를 들어, 도 4에 도시된 방법 (400) 의 단계 440은 해리된 세포 샘플을 미세유체 디바이스에 로딩하는 단계를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 흐름 영역은 흐름 채널 (또는 미세유체 채널) 을 포함하고, 해리된 세포 샘플을 로딩하는 것은 세포들을 흐름 채널로 흐르게 하는 것을 포함한다.
일단 해리된 세포 샘플이 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 안으로 로딩되면, 샘플의 B 세포들은 미세유체 디바이스의 고립 영역들 안으로 이동될 수 있다. 예를 들어, 방법 (400) 의 단계 (450) (도 4) 에 도시된 바와 같이, B 세포들은 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 으로부터 하나 이상의 고립 영역들로 이동될 수 있고, 고립 영역들은 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 과 유체적으로 접속되고 개방되는 고립 챔버들 내에 위치할 수 있다. B 세포는 예를 들어 CD27+ B 세포 또는 CD138+ B 세포일 수 있다. 일부 실시형태들에서, B 세포는 메모리 B 세포이다. 다른 실시형태들에서, B 세포는 혈장 세포이다. B 세포들의 이동은 본원에 일반적으로 논의된 바와 같이 (예컨대 미세유체 디바이스를 팁핑하는 것에 의한) 중력 이용, (고립 영역에 인접하거나 또는 근접하여 위치한 미세유체 디바이스의 변형 가능한 표면을 압박 또는 당기는 것에 의한) 국소화된 유체 흐름 유도, (예컨대 광전자 핀셋 (OE) 에 의한) 유전체 영동 (DEP) 힘의 인가, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 경우, 해리된 세포 샘플을 로딩하기 이전에, 방법은 해리된 세포 샘플에서의 B 세포들을 적어도 하나의 검출가능한 마커로 표지하는 단계를 더 포함한다. 마커는 본원에 개시된 B 세포 마커들 (예를 들어, CD19, CD20, IgM, IgD, CD38, CD27, CD138, PNA, GL7 등) 중 임의의 하나와 같은 B 세포 특이적 마커일 수 있다. 마커는, B 세포들이 DEP 힘을 적용하여 이동되는 실시형태에서와 같이, 검출가능한 마커의 검출에 기초한 이동을 위해 B 세포를 선택하는데 도움을 줄 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 마커는 T 세포 마커 또는 암 세포 관련 마커와 같은 비-B 세포 마커에 결합할 수 있다. 그러한 경우에, B 세포들은 검출가능한 마커의 부재에 기초하여 이동을 위해 선택될 수 있다.
미세유체 디바이스의 고립 영역(들) 안으로 로딩된 B 세포들은 메모리 B 세포들, 혈장 세포들 등과 같은, 상이한 B 세포 타입들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 고립 영역들 내로의 이동을 위해 혈장 세포들을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 고립 영역들 안으로의 이동을 위해 IgG-타입 항체를 발현하는 B 세포를 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 경우에, 단지 하나의 B 세포는 모든 고립 영역들이 로딩되는지 여부와 무관하게 각각의 고립 영역 안으로 이동된다. 다른 경우에, B 세포들은 초기에 하나 이상의 고립 영역들 안으로 모아질 수 있으며, 이후 개별 고립 영역 (즉, 고립 영역당 하나의 B 세포) 안으로 분리될 수 있다. 후자의 실시형태들은 암 세포들에 결합하는 항체 생산을 위해 B 세포들을 스크리닝할 때 보다 많은 처리량을 허용한다. 각각의 고립 영역에 단 하나의 B 세포를 배치하면 B 세포의 클론성 확장이 가능해지고, 이것은 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 시퀀스의 식별을 용이하게 할 수 있다.
특정 실시형태들에서, B 세포들은 암 세포 관련 항원이 미세유체 디바이스 안으로 로딩되기 이전에 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 고립 영역들로 이동된다. 다른 실시형태들에서, B 세포들은 암 세포 관련 항원이 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 고립 영역들 안으로 이동된 후에 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 고립 영역들 안으로 이동된다. 또 다른 실시형태들에서, B 세포들 및 암 세포 관련 항원은 동시에 (예를 들어, B 세포들 및 암 세포들 모두를 포함하는 해리된 세포 샘플의 일부로서) 미세유체 디바이스 안으로 로딩된다. 일부 실시형태들에서, 일단 B 세포들이 고립 영역들 안으로 로딩되면, 이들은 적어도 하나의 B 세포가 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산한 이후 식별될 때까지 남아있게 된다.
C. 암 세포 관련 항원들과 항체들을 생산하는 B 세포들의 접촉
개시된 방법들은 B 세포가 암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현되는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (470) 를 참조한다. 이러한 발현을 검출하기 위해, 발현된 항체는 암 세포 관련 항원과 상호작용하도록 허용되어야 한다.
암 세포 관련 항원은 간단하거나 복잡할 수 있다; 항원은 단백질, 탄수화물 그룹 또는 사슬 상의 에피토프, 단백질 또는 탄수화물 이외의 생물학적 또는 화학적 작용제, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있고; 에피토프는 선형 또는 입체형일 수 있다. 암 세포 관련 항원은 정상 세포들에서의 발현과 비교하여 암 세포들 (예를 들어, 암 세포들의 하나 이상의 특정 타입들) 을 고유하게 식별하거나 암 세포들에서 상향 조절되는 항원일 수 있다. 일반적으로, 암 세포 관련 항원은 암 세포의 표면에 존재하므로, 항체에 의해 인지될 수 있음이 보장된다. 항원은 당업계에 공지되거나 본원에 기술된 종양에서 발견될 수 있는 임의의 타입의 암 세포를 포함한 임의의 타입의 암 세포와 관련될 수 있다. 특히, 항원은 폐암, 유방암, 흑색종 등과 관련될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암 세포들과 관련된"은, 항원과 관련하여 사용될 때, 항원이 암 세포에 의해 직접 생산되거나 암 세포와 정상 세포 사이의 상호 작용에 기인한다는 것을 의미한다.
B 세포 발현된 항체가 암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는지를 결정하는 것은 본원에 기재된 미세유체 디바이스에서 수행될 수 있다. 특히, 미세유체 디바이스는 흐름 영역 (예를 들어, 미세유체 채널) 및 격리 챔버를 갖는 엔클로저를 포함할 수 있다. 격리 챔버는 고립 영역 및 접속 영역을 포함할 수 있으며, 접속 영역은 고립 영역과 흐름 영역 사이에 유체 접속을 제공한다. 격리 챔버는 체적이 약 0.5 nL 내지 약 5.0 nl, 또는 그 안의 임의의 범위 (예를 들어, 약 0.5 nl 내지 약 1.0 nl, 약 0.5 nl 내지 약 1.5 nl, 약 0.5 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.0 nl 내지 약 1.5 nl, 약 1.0 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.0 nl 내지 약 2.5 nl, 약 1.5 nl 내지 약 2.0 nl, 약 1.5 nl 내지 약 2.5 nl, 약 1.5 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.0 nl 내지 약 2.5 nl, 약 2.0 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.0 nl 내지 약 3.5 nl, 약 2.5 nl 내지 약 3.0 nl, 약 2.5 nl 내지 약 3.5 nl, 약 2.5 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.0 nl 내지 약 3.5 nl, 약 3.0 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.0 nl 내지 약 4.5 nl, 약 3.5 nl 내지 약 4.0 nl, 약 3.5 nl 내지 약 4.5 nl, 약 3.5 nl 내지 약 5.0 nl, 약 4.0 nl 내지 약 4.5 nl, 약 4.0 nl 내지 약 5.0 nl, 약 4.5 nl 내지 약 5.0 nl, 또는 상기 종점들 중 하나에 의해 한정되는 임의의 범위) 일 수 있다. 접속 영역은 본원에 일반적으로 기재된 폭 (Wcon)(예를 들어, 약 20 마이크론 내지 약 100 마이크론, 또는 약 30 마이크론 내지 약 60 마이크론) 을 가질 수 있다. 고립 영역은 마찬가지로 본원에 일반적으로 기재되는 폭 (Wiso) 을 가질 수 있다 (예를 들어, 고립 영역은 접속 영역의 폭 (Wcon) 보다 더 큰 폭 (Wiso) 을 가질 수 있다). 특정 실시형태들에서, 고립 영역은 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론인 폭 (Wiso) 을 갖는다.
흐름 영역, 격리 챔버, 및/또는 격리 챔버의 고립 영역은 항체 발현하는 B 세포 (예를 들어, 메모리 B 세포 또는 혈장 세포) 의 생존력을 촉진하는 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함할 수 있다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이, "생존력 촉진"은 비코팅된 동등한 표면에 비해 B 세포의 생존력이 코팅된 표면 상에서 더 우수함을 의미한다. 특정 실시형태들에서, 흐름 영역, 격리 챔버 및/또는 고립 영역은 B 세포 의 생존력을 촉진시키는 코팅 재료로 각각 코팅된 복수의 표면들을 갖는다. 코팅 재료는 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기술된 임의의 적합한 코팅 재료일 수 있다. 코팅 재료는 예를 들어 친수성 분자를 포함할 수 있다. 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 탄수화물기를 포함하는 중합체, 아미노산을 포함하는 중합체, 및 이들의 조합을 포함하는 중합체들의 그룹으로부터 선택될 수 있다.
흐름 영역, 격리 챔버, 및 또는 격리 챔버의 고립 영역은 B 세포 (예를 들어, 메모리 B 세포 또는 혈장 세포) 의 생존력을 촉진하는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함할 수 있다. 이 문맥에서 사용된 바와 같이, "생존력 촉진"은 B 세포의 생존력이 컨디셔닝되지 않은 등가의 표면과 비교해 컨디셔닝된 표면 상에서 더 우수함을 의미한다. 특정 실시형태들에서, 흐름 영역, 격리 챔버 및/또는 고립 영역은 각각이 B 세포의 생존력을 촉진시킬 수 있는 복수의 컨디셔닝된 표면을 갖는다. 컨디셔닝된 표면(들)은 공유 결합된 분자들을 포함할 수 있다. 공유 결합된 분자들은 예를 들어, 공유 결합된 친수성 분자들을 포함하여, 당업계에 공지된 및/또는 본원에 개시된 임의의 적합한 분자들일 수 있다. 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 탄수화물기를 포함하는 중합체, 아미노산을 포함하는 중합체, 및 이들의 조합을 포함하는 중합체들의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 친수성 분자는 본원에 기술된 바와 같이 공유 결합된 친수성 분자의 층을 형성할 수 있다.
암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 검출하는 것은 암 세포 관련 항원을 미세유체 디바이스 안으로 도입하여 항원이 B 세포(들)에 근접하여 위치되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 암 세포 관련 항원을 미세유체 디바이스에 도입하는 것은, 예를 들어, 암 세포 관련 항원을 함유하는 유체 배지를 미세유체 디바이스의 흐름 영역으로 흘려 보내고, 암 세포 관련 항원이 B 세포(들)에 근접하여 위치되는 때 유체 매칠의 흐름을 정지시키는 것을 포함할 수 있다. B 세포에 "근접한" 위치는 B 세포의 1 밀리미터 (mm) 이내 (예를 들어, B 세포의 750 마이크론 이내, 600 마이크론 이내, 500 마이크론 이내, 400 마이크론 이내, 300 마이크론 이내, 200 마이크론 이내, 100 마이크론 이내, 또는 50 마이크론 이내) 일 수 있다.
암 세포 관련 항원은 마이크로-객체의 일부로서 제공될 수 있고, 이것은 당업계에 공지된 및/또는 본원에 기재된 임의의 적합한 마이크로-객체 (예를 들어, 세포, 리포솜, 지질 나노래프트, 또는 비드) 일 수 있다. 따라서, 암 세포 관련 항원을 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 B 세포가 위치하는 격리 챔버의 접속 영역에 또는 그 내부에 그러한 마이크로-객체를 위치시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 암 세포 관련 항원을 도입하는 단계는 B 세포가 위치한 격리 챔버의 고립 영역 안으로 그러한 마이크로-객체를 이동시키는 단계를 포함할 수 있다.
마이크로-객체는 암 세포 막 제조에 발견한 막 관련 항원과 같은 암 세포들에서 분획된 항원을 포함할 수 있다. 이러한 고립된 막 관련 항원은 개시된 방법들에서 사용된 마이크로-객체들을 제조하기 위해 비드들에 콘쥬게이트될 수 있다. 대안적으로, 마이크로-객체는 실질적으로 순수한 항원 (예를 들어, 정제된 단백질) 을 포함할 수 있다. 정제된 단백질들, 세포 막 제조 등과 같은 항원성 분자들을 비드들에 콘쥬게이팅하는 방법들은 당업계에 공지되어 있고 및/또는 본원의 예에 기재되어 있다. 마찬가지로, 암 세포들로부터 항원들을 분리하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Bachleitner-Hoffmann 등 (2002), J. Clin. Endocrin. & Metab. 87 (3): 1098-1104; 및 He et al. (2016), Oncology Letters 12:1101-06). 따라서, 암 세포 관련 항원들의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 마이크로-객체는 (예를 들어, 환자의 샘플로부터 고립된) 암 세포 또는 암 세포주의 세포와 같은 세포일 수 있다.
상기한 바와 같이, 마이크로-객체들 (예를 들면, 암 세포들 또는 항원-콘쥬게이트된 비드) 은 미세유체 디바이스의 입구를 통해 흐름 영역으로 마이크로-객체를 흐르게 함으로써 (결합 항체를 검출하기 위한 목적으로) 미세유체 디바이스 안으로 로딩될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 흐름 영역은 흐름 채널을 포함하고, 마이크로-객체들을 로딩하는 단계는 마이크로-객체들을 흐름 채널 안으로 흐르게 하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스의 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 안으로 로딩되고 미세유체 디바이스로부터 반출될 때까지 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 에 잔존한다. 일부 실시형태들에서, 마이크로-객체들은 고립 영역들로 들어가지 않는다. 일부 실시형태들에서, 마이크로-객체들은 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 에 상주하는 것 이외에 고립 챔버들의 접속 영역들 안으로 침투한다. 이들 임의의 실시형태들에서, 마이크로-객체들 (예를 들어, 암 세포들 또는 항원 콘쥬게이트된 비드들) 은 적어도 1×107, 2.5×107, 5×107, 7.5×107, 또는 1×108 마이크로-객체들/ml 에서 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 안으로 로딩될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스 내의 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동된다. B 세포들과 같이, 마이크로-객체들 (예를 들어, 암 세포들 또는 항원 콘쥬게이트된 비드들) 의 이동은 (예컨대 미세유체 디바이스를 팁핑하는 것에 의한) 중력 이용, (고립 영역에 인접하거나 또는 근접하여 위치한 미세유체 디바이스의 변형 가능한 표면을 압박 또는 당기는 것에 의한) 국소화된 유체 흐름 유도, (예컨대 광전자 핀셋 (OET) 에 의한) 유전체 영동 (DEP) 힘의 인가, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 하나 이상의 (예를 들어, 단지 1, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상, 또는 약 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 1 내지 2 의) 마이크로-객체들은 미세유체 디바이스 내의 개개의 고립 영역들 안으로 이동되어, 고립된 마이크로-객체들 또는 고립된 마이크로-객체들의 그룹을 갖는 적어도 하나의 고립 영역을 수득할 수 있다. 고립된 마이크로-객체(들) 및 B 세포(들)는 동일한 고립 영역(들)에 배치될 수 있다. 대안적으로, 고립된 마이크로-객체(들) 및 B 세포(들)는 상이한 고립 영역들 (예컨대 인접한 고립 영역들) 에 배치될 수 있다.
미세유체 디바이스 내의 마이크로-객체들에 대한 원하는 위치에 상관없이, 암 세포들인 마이크로-객체들은 암 세포들을 미세유체 디바이스 안으로 로딩하기 이전에 하나 이상의 검출가능한 마커들로 표지될 수 있다. 원하는 모드가 적어도 하나의 암 세포를 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 것을 포함하는 경우, 검출가능한 마커(들)는 이동을 위해 적어도 하나의 암 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 세포 크기, 세포 형상, 핵 크기 또는 핵 구조의 형태학적 평가들은 이동을 위해 적어도 하나의 암 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 암 세포들은 또한 선택적으로 형태학적 평가와 조합하여 세포 마커의 부재에 의해 선택될 수 있다.
특정 실시형태들에서, 암 세포들은 환자로부터 취한 하나 이상의 고체 종양 샘플들로부터 얻어진 해리된 세포 샘플에서 시작하고, 따라서 환자 자신의 암 세포들이다. 상기에 논의한 바와 같이, 암 세포들은 해리된 세포 샘플로부터 선택 (또는 분획) 될 수 있고 및/또는 암 세포는 B 세포를 함유하는 동일한 해리된 세포 샘플의 일부로서 미세유체 디바이스 안으로 로딩될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 암 세포들은 암 세포들에 결합할 수 있는 항체 생산을 위해 B 세포들을 검정하기 전에 배양 및/또는 클로닝된다. 그러한 배양 및/또는 클로닝은 미세유체 디바이스 내에서 또는 암 세포를 미세유체 디바이스 안으로 로딩하기 전에 (예를 들어, 종양 샘플로부터 암 세포를 선택, 배양 및/또는 클로닝하기 위한 통상적인 기술을 사용하여) 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 암 세포는 적어도 약 1 × 107, 2.5 × 107, 5 X 107, 7.5 × 107, 또는 1 × 108 세포/ml 의 농도로 선택, 배양 및/또는 클로닝될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 종양 유래의 암 세포들의 모집단은 모집단을 구성하는 개별 세포들의 형태학적 및 유전 특성에 대해 상대적으로 불균질일 수 있다. 예를 들어, 모집단은 (천천히 분할할 수 있는) 암 줄기 세포들을 포함할 수 있고 (보다 빠르게 분할할 수 있고 전립선 암 돌연변이의 다른 하위 집합을 포함할 수 있는) 보다 차별화된 암 세포들을 포함할 수 있다. 암 세포들의 마커 기반 선택 및/또는 클로닝은 보다 균질한 세포 모집단을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태들에서, 일부 실시형태들에서, 복수의 이종 암 세포들이 미세유체 디바이스 상에 로딩될 수 있다. 대안적으로, 개별적인 암 세포들은 미세유체 디바이스 상에 로딩되기 전에 선택되고 클로닝될 수 있다. 따라서, 다른 실시형태들에서, 암 세포들의 실질적으로 균질한 모집단은 미세유체 디바이스 안으로 로딩될 수 있고 암 세포들에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 B 세포들을 식별하는데 사용될 수 있다. 실질적으로 균질인 모집단은 적어도 하나의 종양을 제공하는 환자로부터 또는 상이한 환자로부터 유래된 암 세포주일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 암 세포 관련 항원을 제공하는 것은 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 가용성 항원을 포함하는 용액을 흐르는 것 및 B 세포가 위치하는 격리 챔버 안으로 가용성 항원을 확산할 수 있도록 하는 것을 수반할 수 있다. 이러한 가용성 항원은 검출가능한 표지 (예를 들어, 형광 표지) 에 공유 결합될 수 있다.
D. B 세포들의 결합 및 프로세싱의 검출
B 세포들에 의해 생산된 항체의 암 세포 관련 항원에의 결합은 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 암 세포들이 미세유체 디바이스 안에 도입될 때, 응집 검정에서 발생할 수 있는 바와 같이 세포 군집이 검출될 수 있다. 대안으로, 항체가 결합된 마이크로-객체들 (예를 들어, 암 세포들 또는 항원 콘쥬게이트된 비드들) 을 표지하기 위해 표지 (예를 들어, 형광 표지) 에 콘쥬게이트된 항-인간 항체와 같은 2차 항체를 첨가할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 상기 방법은 암 세포 관련 항원에 앞서 또는 동시에 표지된 항체-결합제를 제공하는 단계를 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, B 세포에 의해 발현된 항원 항체의 결합의 모니터링은 표지된 항체-결합제의 암 세포-관련 항원에 대한 간접적인 결합을 검출하는 것을 포함할 수 있다. 표지된 항체 결합제는 형광으로 표지될 수 있는 표지된 항-IgG 항체일 수 있다. 특정 실시형태들에서, 표지된 항체 결합제는 암 세포 관련 항원과의 혼합물로 제공된다. 다른 실시형태들에서, 표지된 항체 결합제는 암 세포 관련 항원을 제공한 후에 제공된다.
특정 실시형태들에서, 방법은 B 세포 (예를 들면, 혈장 세포 또는 메모리 B 세포) 를 발현하는 적어도 하나의 항체를 암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 것으로 식별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이하에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 미세유체 디바이스는 신호의 시각화 (예를 들어, 암 세포의 군집 또는 마이크로-객체들의 표면에서의 라벨의 축적) 를 가능하게 하는 촬상 디바이스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 촬상 디바이스는 미세유체 디바이스를 주기적으로 촬상할 수 있고, 시간 경과에 따른 신호의 임의의 증가가 검출될 수 있다. 이미지들은 예를 들어 몇 초마다 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 초 이상 마다) 또는 몇 분마다 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 분 이상 마다) 수득될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 이미지들은 서로 중첩되어, 배경 신호를 평균화하고 실제 신호와 배경 신호 사이의 더 좋은 콘트라스트를 생성하는 일반적인 효과를 갖는 "합쳐진"이미지를 생성할 수 있다. 신호의 검출은 수동일 수 있거나, 예컨대 사람이 이미지를 검토할 때 발생할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하는여) 자동일 수 있다.
일단 암 세포 관련 항원과 B 세포에 의해 생산된 항체 사이에 결합이 검출되면, 이러한 항체들을 생산하는 B 세포들이 식별될 수 있고, 그 위치 (예를 들면, 위치하는 고립영역 또는 고립 챔버) 가 노트 및/또는 기록될 수 있다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (480) 를 참조한다. 선택적으로, 암 세포들에 결합하는 항체가 검출되면, 흐름 영역 (또는 흐름 채널) 을 플러싱할 수 있다. 이러한 플러싱은 암 세포 관련 항원 (예를 들어, 암 세포 또는 항원 콘쥬게이트된 비드) 에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포들의 식별 전후에 발생할 수 있다. 다른 선택적 단계로서, 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하지 않은 B 세포는 미세유체 디바이스로부터 폐기될 수 있다.
특정 실시형태에서, 암 세포 관련 항원에 결합하는 항체를 생산하는 것으로 식별된 B 세포는 미세유체 디바이스로부터 배출될 수 있다. 예를 들어, (예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의) 시퀀싱 또는 하이브리도마 제조를 위해 B 세포를 분리하기 위해, 암 세포에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포는 미세유체 디바이스로부터 배출될 수 있다. 일부 경우, 클로닝된 세포들의 각각의 세포 또는 모집단을 개별적으로 배출된다.
E. B 세포 활성화의 자극
전술한 실시형태 중 임의의 것에서, 미세유체 디바이스의 고립 영역으로 이동된 B 세포들은 항체 생산에 도움이 되는 조건하에서 배양될 수 있다. 일부 경우에서, 이들 항체는 미세유체 디바이스에서의 매체를 통해 암 세포 관련 항원의 위치까지 확산될 수 있다 (암 세포 또는 항원 콘쥬게이트된 비드에 의해 포함되든지, 또는 용액 중에서이든; 동일한 고립 영역, 주요 흐름 채널에서이든, 또는 인접하는 고립 영역에서이든). 인접한 고립 영역들의 경우, 일부 미세유체 디바이스에서는, 2 개의 인접한 고립 영역들 사이의 얇은 벽에 작은 갭이 있어, 인접하는 고립 영역으로 확산시키기 위한 주요 흐름 채널로 반드시 진입해야 할 필요없이 항체가 하나의 고립 영역에서 다른 고립 영역으로 직접 확산할 수 있게 한다. 그러한 작은 갭은 항체의 확산을 허용하지만 암 세포 또는 B 세포가 고립 영역을 벗어나는 것을 허용하지 않는다.
일부 경우에서, 암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포의 검출은 B 세포 활성을 자극하는 자극제와 B 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 4의 방법 (400) 의 단계 (460) 를 참조한다. 자극제는 CD40L, 이의 유도체 또는 항-CD40 항체와 같은 CD40 작용제일 수 있다. 따라서, 자극제는 CD40L+ 피더 세포를 포함할 수 있거나, 본질적으로 구성될 수 있거나, 또는 CD40L+ 피더 세포로 구성될 수 있다. CD40L+ 피더 세포는 T 세포 (예를 들어, Jurkat D1.1 세포) 또는 그 유도체일 수 있다. 대안으로, 피더 세포는 CD40L-발현 구조물로 형질 감염/형질 전환된 세포주 (예를 들어, NIH-3T3 세포) 일 수 있다. 자극제는 톨 유사 수용체 (TLR) 작용제 (예를 들어, TLR9 작용제) 를 추가로 포함한다. TLR 작용제는 예를 들어 CpG 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, CpG2006) 일 수 있다. CpG 올리고뉴클레오타이드는 약 1 마이크로그램/mL 내지 약 20 마이크로그램/mL (예를 들어, 약 1.5 내지 약 15 마이크로그램/mL, 약 2.0 내지 약 10 마이크로그램/mL, 또는 약 2.5 내지 약 5.0 마이크로그램/mL) 의 농도에서 사용될 수 있다. B 세포는 1 내지 10 일 (예를 들어, 2 내지 8 일, 3 내지 7 일, 또는 4 내지 6 일) 동안 자극제와 접촉 (예를 들어, 실질적으로 연속적으로 또는 주기적으로/간헐적으로) 될 수 있다.
암 세포 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 검출하는 단계는 B 세포 확장을 촉진하는 하나 이상의 성장 유도제를 포함하는 배양 배지를 B 세포에 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 성장 유도제는 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21 및 BAFF의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함할 수 있다. IL-2 및/또는 IL-4는 약 10 ng/mL 내지 약 1 마이크로그램/mL의 농도로 제공될 수 있다. IL-6, IL-10 및/또는 IL-21은 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 농도로 제공될 수 있다. BAFF는 약 10 ng/mL 내지 약 50 ng/mL의 농도로 제공될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 배양 배지는 1 내지 10 일 (예를 들어, 2 내지 8 일, 3 내지 7 일, 또는 4 내지 6 일) 의 기간 동안 B 세포에 제공된다. 배양 배지는 자극제 (예를 들어, CD40 작용제 및/또는 TLR 작용제) 를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 배양 배지를 B 세포에 제공하는 것은 B 세포를 활성화제와 접촉시키는 것과 동시에 수행될 수 있다. 특정 실시형태들에서, B 세포 림프구를 자극제와 접촉시키는 단계 및 B 세포 림프구에 배양 배지를 제공하는 단계는 중첩되는 시간에 (예를 들어, 실질적으로 동일한 시간 경과에 걸쳐) 수행된다. 또한, 다른 선택적 단계로서, B 세포들은 미세유체 디바이스에서 클론 집단으로 배양될 수 있다. 이러한 배양은 예를 들어 약 2 내지 3 일 동안 및/또는 약 8 내지 20 세포의 세포 수로 발생할 수 있다.
III. 미세유체 디바이스
A. 미세유체 디바이스 용어
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스는 "스윕" 영역과 "비스윕" 영역을 포함할 수 있다. 비스윕 영역은 스윕 영역에 유체적으로 접속될 수 있으며, 다만 유체 접속은 확산이지만, 실질적으로는 스윕 영역과 비스윕 영역 간에 매체가 흐르지 않는 것을 가능하게 하도록 구성된다. 따라서, 미세유체 디바이스는 실질적으로 스윕 영역에서의 매체의 흐름으로부터 비스윕 영역을 실질적으로 고립시키도록 구성될 수 있는 한편, 스윕 영역과 비스윕 영역 사이의 확산 유체 통신만을 실질적으로 가능하게 한다.
특정 생물학적 재료 (예를 들어, 단백질, 예컨대 항체) 를 생산하는 마이크로-객체들 (예를 들어, 생물학적 세포들) 의 기능은 이러한 미세유체 디바이스에서 검정될 수 있다. 예를 들어, 관심있는 분석물 (예를 들어, 항체) 의 생산을 위해 검정될 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, B 세포) 를 포함하는 샘플 재료를 미세유체 디바이스의 스윕 영역에 로딩할 수 있다. 생물학적 마이크로-객체들의 특성은 특정 특성을 위해 선택될 수 있으며 비스윕 영역에서 처분될 수 있다. 그후, 남은 샘플 재료는 스윕 영역 밖으로 흘러 나오고 검정 재료는 스윕 영역 안으로 흘러 들어간다. 선택된 생물학적 마이크로-객체는 비스윕 영역에 있기 때문에, 선택된 생물학적 마이크로-객체는 나머지 샘플 재료의 유출 또는 검정 재료의 유입에 실질적으로 영향을 받지 않는다. 선택된 생물학적 마이크로-객체는 관심 분석물을 생산하도록 허용될 수 있으며, 관심 분석물은 비스윕 영역에서 스윕 영역으로 확산될 수 있고, 여기서 관심 분석물은 검정 재료와 반응하여 국부적인 검출가능한 반응을 생산할 수 있고, 그 각각은 특정 비스윕 영역과 상관될 수 있다. 검출된 반응과 연관된 임의의 비스윕 영역은, 비스윕 영역에서의 생물학적 마이크로-객체들 중 어느 것이, 존재하는 경우, 관심 분석물의 충분한 생산자인지를 결정하도록 분석될 수 있다.
B. 미세유체 디바이스를 포함하는 시스템
도 1a 는 종양 유래의 B 세포들을 체외에서 고립 및 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 예를 예시한다. 미세유체 디바이스 (100) 의 사시도는 미세유체 디바이스 (100) 안의 부분 뷰를 제공하도록 그 커버 (110) 의 부분 컷-어웨이를 갖고 도시된다. 미세유체 디바이스 (100) 는 일반적으로, 흐름 경로 (106) 를 포함하는 미세유체 회로 (120) 를 포함하고, 이 흐름 경로를 통해 유체 배지 (180) 가 흘러 선택적으로, 하나 이상의 마이크로-객체들 (미도시) 을 미세유체 회로 (120) 안으로 운반하고/하거나 통과시킬 수 있다. 단일의 미세유체 회로 (120) 가 도 1a 에 예시되지만, 적합한 미세유체 디바이스들은 복수 (예를 들어, 2 또는 3) 의 이러한 미세유체 회로들을 포함할 수 있다. 관계없이, 미세유체 디바이스 (100) 는 나노유체 디바이스이도록 구성될 수 있다. 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 격리 챔버들 (124, 126, 128, 및 130) 을 포함할 수도 있고, 여기서 각각의 격리 챔버는 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 하나 이상의 개구들을 가질 수도 있다. 도 1a 의 디바이스의 일부 실시형태들에서, 격리 챔버들은 흐름 경로 (106) 와 유체 연통하는 단지 단일의 개구만을 가질 수도 있다. 이하에서 추가로 논의되는 바와 같이, 미세유체 격리 챔버들은, 배지 (180) 가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르고 있을 때에도, 미세유체 디바이스 (100) 와 같은 미세유체 디바이스 내에 마이크로-객체들을 보유하기 위해 최적화되어 있는 다양한 피처들 및 구조들을 포함한다. 그러나, 전술한 것을 시작하기 전에, 미세유체 디바이스 (100) 및 시스템 (150) 의 간단한 설명이 제공된다.
일반적으로 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 는 인클로저 (102) 에 의해 정의된다. 인클로저 (102) 는 상이한 구성들로 물리적으로 구조화될 수 있지만, 도 1a 에 도시된 예에서 인클로저 (102) 는 지지 구조 (104)(예를 들어, 베이스), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 를 포함하는 것으로 도시된다. 지지 구조 (104), 미세유체 회로 구조 (108), 및 커버 (110) 는 서로 부착될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 구조 (108) 는 지지 구조 (104) 의 내측 면 (109) 상에 배치될 수 있고, 커버 (110) 는 미세유체 회로 구조 (108) 위에 배치될 수 있다. 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 와 함께, 미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 엘리먼트들을 정의할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 미세유체 회로 (120) 의 하단에 있고 커버 (110) 는 상단에 있을 수 있다. 대안으로, 지지 구조 (104) 및 커버 (110) 는 다른 배향들에서 구성될 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 미세유체 회로 (120) 의 상단에 있을 수 있고 커버 (110) 는 하단에 있을 수 있다. 관계없이, 인클로저 (102) 안 또는 밖으로의 통로를 각각 포함하는 하나 이상의 포트들 (107) 이 존재할 수 있다. 통로의 예들은 밸브, 게이트, 관통 홀 (pass-through hole) 등을 포함한다. 예시된 바와 같이, 포트 (107) 는 미세유체 회로 구조 (108) 에서 갭에 의해 생성된 관통 홀이다. 그러나, 포트 (107) 는 커버 (110) 와 같은, 인클로저 (102) 의 다른 컴포넌트들에 놓일 수 있다. 단지 하나의 포트 (107) 가 도 1a 에 예시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 2 이상의 포트들 (107) 을 가질 수 있다. 예를 들어, 미세유체 회로 (120) 로 진입하는 유체에 대한 인렛로서 기능하는 제 1 포트 (107) 가 존재할 수 있고, 미세유체 회로 (120) 를 나가는 유체에 대한 아웃렛으로서 기능하는 제 2 포트 (107) 가 존재할 수 있다. 포트 (107) 가 인렛 또는 아웃렛으로서 기능하는지 여부는 유체가 흐름 경로 (106) 를 통해 흐르는 방향에 의존할 수 있다.
지지 구조 (104) 는 하나 이상의 전극들 (미도시) 및 기판 또는 복수의 상호접속된 기판들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지지 구조 (104) 는 하나 이상의 반도체 기판들을 포함할 수 있고, 이 기판들 각각은 전극에 전기적으로 접속된다 (예를 들어, 반도체 기판들의 전부 또는 서브세트는 단일 전극에 전기적으로 접속될 수 있다). 지지 구조 (104) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 ("PCBA") 를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 반도체 기판(들) 은 PCBA 상에 장착될 수 있다.
미세유체 회로 구조 (108) 는 미세유체 회로 (120) 의 회로 엘리먼트들을 정의할 수 있다. 이러한 회로 엘리먼트들은, 미세유체 회로 (120) 가 유체로 채워질 때 유체적으로 상호접속될 수 있는 공간들 또는 영역들을, 예컨대 (하나 이상의 흐름 채널들을 포함하거나 하나 이상의 흐름 채널들일 수도 있는) 흐름 영역들, 챔버들, 펜들, 트랩들 등을 포함할 수 있다. 도 1a 에 예시된 미세유체 회로 (120) 에서, 미세유체 회로 구조 (108) 는 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 를 포함한다. 프레임 (114) 은 미세유체 회로 재료 (116) 를 부분적으로 또는 완전히 인클로징할 수 있다. 프레임 (114) 은, 예를 들어 미세유체 회로 재료 (116) 를 실질적으로 둘러싸는 상대적으로 강성 구조일 수 있다. 예를 들어, 프레임 (114) 은 금속 재료를 포함할 수 있다.
미세유체 회로 재료 (116) 는 미세유체 회로 (120) 의 상호접속들 및 회로 엘리먼트들을 정의하도록 캐비티들 등으로 패터닝될 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 는, 기체 투과성일 수 있는 유연성 재료, 예컨대 유연성 폴리머 (예를 들어, 고무, 플라스틱, 엘라스토머, 실리콘, 폴리디메틸실록산 ("PDMS"), 등) 을 포함할 수 있다. 미세유체 회로 재료 (116) 를 구성할 수 있는 재료들의 다른 예들은 몰딩된 유리, 실리콘 (예를 들어, 포토-패턴 가능 실리콘 또는 "PPS") 과 같은 식각 가능 재료, 포토-레지스트 (예를 들어, SU8) 등을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 이러한 재료들 - 및 이에 따른 미세유체 회로 재료 (116) - 은 강성 및/또는 실질적으로 기체에 대해 불투과성일 수 있다. 관계없이, 미세유체 회로 재료 (116) 는 지지 구조 (104) 상에 그리고 프레임 (114) 안에 배치될 수 있다.
커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 의 일체형 부품일 수 있다. 대안으로, 커버 (110) 는 도 1a 에 예시된 바와 같이 구조적으로 별개의 엘리먼트일 수 있다. 커버 (110) 는 미세유체 회로 재료 (116) 및/또는 프레임 (114) 과 동일한 또는 상이한 재료들을 포함할 수 있다. 유사하게, 지지 구조 (104) 는 예시된 바와 같이 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 로부터 별개의 구조이거나, 또는 프레임 (114) 또는 미세유체 회로 재료 (116) 의 일체형 부품일 수 있다. 마찬가지로, 프레임 (114) 및 미세유체 회로 재료 (116) 는 도 1a 에 도시된 바와 같이 별개의 구조들이거나 또는 동일한 구조의 일체형 부분들일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 재료를 포함할 수 있다. 강성 재료는 유리 또는 유사한 특성들을 갖는 재료일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 변형 가능한 재료는 폴리머, 예컨대 PDMS 일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 강성 및 변형 가능한 재료들 양자 모두를 포함할 수 있다. 예를 들어, 커버 (110) 의 하나 이상의 부분들 (예를 들어, 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130) 위에 위치된 하나 이상의 부분들) 은 커버 (110) 의 강성 재료들과 인터페이스하는 변형 가능한 재료를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 하나 이상의 전극들을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 전극들은 유리 또는 유사한 절연 재료 상에 코팅될 수도 있는, 전도성 산화물, 예컨대 인듐-틴-옥사이드 (ITO) 를 포함할 수 있다. 대안으로, 하나 이상의 전극들은, 변형 가능한 재료, 예컨대 폴리머 (예를 들어, PDMS) 에 임베딩된, 유연성 전극들, 예컨대 단일-벽 나노튜브들, 멀티-벽 나노튜브들, 나노와이어들, 전기적으로 전도성 나노입자들의 클러스터들, 또는 이들의 조합들일 수 있다. 미세유체 디바이스들에서 사용될 수 있는 유연성 전극들은, 예를 들어 미국 2012/0325665 (Chiou 등) 에서 설명되어 있고, 이 내용들은 참조로서 본원에 통합된다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 는 세포 부착, 생존성 및/또는 성장을 지원하도록 (예를 들어, 미세유체 회로 (120) 를 향해 내측으로 대면하는 표면의 전부 또는 부분을 컨디셔닝함으로써) 변경될 수 있다. 이 변경은 합성 또는 천연 폴리머의 코팅을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 커버 (110) 및/또는 지지 구조 (104) 는 광에 투명할 수 있다. 커버 (110) 는 기체 투과성인 적어도 하나의 재료 (예를 들어, PDMS 또는 PPS) 를 포함할 수도 있다.
도 1a 는 또한, 미세유체 디바이스들, 예컨대 미세유체 디바이스 (100) 를 동작 및 제어하는 시스템 (150) 을 나타낸다. 시스템 (150) 은 전기 전원 (192), 촬상 디바이스 (촬상 모듈 (164) 내에 통합된, 여기서 디바이스 (194) 는 도 1a 자체에는 도시되지 않음), 및 틸팅 디바이스 (190) (틸팅 모듈 (166) 의 부분, 여기서 디바이스 (190) 는 도 1a 에 도시되지 않음) 를 포함한다.
전기 전원 (192) 은, 필요에 따라 바이어싱 전압들 또는 전류들을 제공하는, 미세유체 디바이스 (100) 및/또는 틸팅 디바이스 (190) 에 전기 전력을 제공할 수 있다. 전기 전원 (192) 은, 예를 들어 하나 이상의 교류 (AC) 및/또는 직류 (DC) 전압 또는 전류 소스들을 포함할 수 있다. 촬상 디바이스 (이하에 논의되는 촬상 모듈 (164) 의 부분) 는 미세유체 회로 (120) 내의 이미지들을 캡처하기 위한 디바이스, 예컨대 디지털 카메라를 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 촬상 디바이스는 (예를 들어, 낮은 광 애플리케이션들에 대해) 빠른 프레임 속도 및/또는 고 감도를 갖는 검출기를 더 포함한다. 촬상 디바이스는 또한, 시뮬레이팅 방사 및/또는 광 빔들을 미세유체 회로 (120) 로 지향시키고 미세유체 회로 (120) (또는 그 안에 포함된 마이크로-객체들) 로부터 반사 또는 방출된 방사 및/또는 광 빔들을 수집하기 위한 메커니즘을 포함할 수 있다. 방출된 광 빔들은 가시적 스펙트럼에 있을 수도 있고, 예를 들어 형광 방출들을 포함할 수도 있다. 반사된 광 빔들은 LED 또는 넓은 스펙트럼 램프, 예컨대 수은등 (예를 들어, 고 압력 수은등) 또는 크세논 아크 등에서 비롯되는 반사된 방출들을 포함할 수도 있다. 도 3b 에 대하여 논의된 바와 같이, 촬상 디바이스는 아이피스를 포함하거나 포함하지 않을 수도 있는 현미경 (또는 광학 트레인) 을 더 포함할 수도 있다.
시스템 (150) 은 하나 이상의 회전 축들을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 회전시키도록 구성된 틸팅 디바이스 (190) (이하에 논의되는 틸팅 모듈 (166) 의 부분) 를 더 포함한다. 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는, 미세유체 디바이스 (100)(및 이에 따른 미세유체 회로 (120)) 가 레벨 배향 (즉, x 및 y 축에 대해 0°), 수직 배향 (즉, x 축 및/또는 y 축에 대해 90°), 또는 그 사이의 임의의 배향에서 홀딩될 수 있도록 적어도 하나의 축을 중심으로 미세유체 회로 (120) 를 포함하는 인클로저 (102) 를 지지 및/또는 홀딩하도록 구성된다. 축에 대한 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 배향은 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 의 "틸트" 로서 본원에서 지칭된다. 예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 디바이스 (100) 를 x-축에 대하여 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.6°, 0.7°, 0.8°, 0.9°, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 35°, 40°, 45°, 50°, 55°, 60°, 65°, 70°, 75°, 80°, 90°에서 또는 그 사이의 임의의 각도에서 틸팅할 수 있다. 레벨 배향 (및 이에 따른, x- 및 y-축) 은 중력에 의해 정의된 수직 축에 대해 법선으로서 정의된다. 틸팅 디바이스는 또한, x-축 및/또는 y-축에 대해 90°보다 큰 임의의 각도까지 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하거나, 또는 x-축 또는 y-축에 대해 180°로 미세유체 디바이스 (및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅하여 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 완전히 인버팅할 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 미세유체 회로 (120) 의 일부 다른 부분 또는 흐름 경로 (106) 에 의해 정의된 회전 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100)(및 미세유체 회로 (120)) 를 틸팅한다.
일부 경우들에서, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 하나 이상의 격리 챔버들 위 또는 아래에 위치되도록 수직 배향으로 틸팅된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~위" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 챔버들보다 더 높이 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 위의 격리 챔버에서의 객체는 흐름 영역/채널에서의 객체보다 더 높은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "~아래" 는, 흐름 경로 (106) 가 중력에 의해 정의된 수직 축 상에서 하나 이상의 격리 챔버들보다 더 낮게 위치된다 (즉, 흐름 경로 (106) 아래의 격리 챔버에서의 객체는 흐름 경로에서의 객체보다 더 낮은 중력 포텐셜 에너지를 가질 것이다) 는 것을 나타낸다.
일부 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또한, 미세유체 디바이스 (100) 는, 흐름 경로 (106) 가 격리 챔버들 바로 위 또는 아래에 위치되지 않고 하나 이상의 격리 챔버들 위 또는 아래에 위치되도록 90°미만의 각도로 틸팅될 수 있다. 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 수직한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다. 또 다른 경우들에서, 틸팅 디바이스 (190) 는 흐름 경로 (106) 에 평행하지도 또는 수직하지도 않은 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅한다.
시스템 (150) 은 배지 공급원 (178) 을 더 포함할 수 있다. 배지 공급원 (178)(예를 들어, 콘테이너, 저장고 등) 은 상이한 유체 배지 (180) 를 각각 홀딩하기 위해 다수의 섹션들 또는 콘테이너들을 포함할 수 있다. 따라서, 배지 공급원 (178) 은 도 1a 에 예시된 바와 같이, 미세유체 디바이스 (100) 밖에 있는 그리고 이로부터 별개인 디바이스일 수 있다. 대안으로, 배지 공급원 (178) 은 미세유체 디바이스 (100) 의 인클로저 (102) 내에 전체적으로 또는 부분적으로 위치될 수 있다. 예를 들어, 배지 공급원 (178) 은 미세유체 디바이스 (100) 의 부분인 저장고들을 포함할 수 있다.
도 1a 는 또한, 시스템 (150) 의 부분을 구성하고 미세유체 디바이스 (100) 와 함께 이용될 수 있는 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들의 단순화된 블록도 도시들을 예시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 제어 및 모니터링 장비 (152) 의 예들은 배지 공급원 (178) 을 제어하기 위한 배지 모듈 (160), 미세유체 회로 (120) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 및/또는 배지 (예를 들어, 배지의 액적들) 의 이동 및/또는 선택을 제어하기 위한 동기 모듈 (162), 이미지들 (예를 들어, 디지털 이미지들) 을 캡처하는 촬상 디바이스 (예를 들어, 카메라, 현미경, 광원 또는 이들의 임의의 조합) 를 제어하기 위한 촬상 모듈 (164), 및 틸팅 디바이스 (190) 를 제어하기 위한 틸팅 모듈 (166) 을 포함하는 마스터 제어기 (154)를 포함한다. 제어 장비 (152) 는 또한, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 제어, 모니터링, 또는 다른 기능들을 수행하기 위한 다른 모듈들 (168) 을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 장비 (152) 는 디스플레이 디바이스 (170) 및 입/출력 디바이스 (172) 를 더 포함할수 있다.
마스터 제어기 (154) 는 제어 모듈 (156) 및 디지털 메모리 (158) 를 포함할 수 있다. 제어 모듈 (156) 은, 예를 들어 메모리 (158) 내에 비-일시적 데이터 또는 신호들로서 저장된 머신 실행가능 명령들 (예를 들어, 소프트웨어, 펌웨어, 소스 코드, 등) 에 따라 동작하도록 구성된 디지털 프로세서를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 제어 모듈 (156) 은 하드웨어 디지털 회로부 및/또는 아날로그 회로부를 포함할 수 있다. 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 유사하게 구성될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 또는 임의의 다른 미세유체 장치에 대하여 수행되는 것으로서 본원에 설명된 기능들, 프로세스들, 액트들, 액션들, 또는 프로세스의 단계들은 위에서 논의된 바와 같이 구성된 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 중 임의의 하나 이상에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 마스터 제어기 (154), 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및/또는 다른 모듈들 (168) 은 본원에 논의된 임의의 기능, 프로세스, 액트, 액션 또는 단계에서 사용된 데이터를 송신 및 수신하도록 통신 가능하게 커플링될 수도 있다.
배지 모듈 (160) 은 배지 공급원 (178) 을 제어한다. 예를 들어, 배지 모듈 (160) 은 선택된 유체 배지 (180) 를 (예를 들어, 인렛 포트 (107) 를 통해) 인클로저 (102) 안으로 입력하도록 배지 공급원 (178) 을 제어할 수 있다. 배지 모듈 (160) 은 또한, (예를 들어, 아웃렛 포트 (미도시) 를 통해) 인클로저 (102) 로부터 배지의 제거를 제어할 수 있다. 하나 이상의 배지는 따라서, 선택적으로 미세유체 회로 (120) 안으로 입력되고 이로부터 제거될 수 있다. 배지 모듈 (160) 은 또한, 미세유체 회로 (120) 내의 흐름 경로 (106) 에서의 유체 배지 (180) 의 흐름을 제어할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서 배지 모듈 (160) 은 틸팅 모듈 (166) 이 틸팅 디바이스 (190) 로 하여금 원하는 각도의 기울기로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅하게 하기 전에 인클로저 (120) 를 통해 그리고 흐름 경로 (106) 에서의 배지 (180) 의 흐름을 정지시킨다.
동기 모듈 (162) 은 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체들 (미도시) 의 선택, 트랩핑, 및 이동을 제어하도록 구성될 수 있다. 도 1b 및 도 1c 를 참조하여 이하에 논의된 바와 같이, 인클로저 (102) 는 유전영동 (DEP), 광전 트위저들 (optoelectronic tweezers; OET) 및/또는 광-전기습윤 (OEW) 구성 (도 1a 에 미도시) 을 포함할 수 있고, 동기 모듈 (162) 은 흐름 경로 (106) 및/또는 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130) 에서 배지 (미도시)의 액적 (droplet) 들 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택 및 이동시키도록 전극들 및/또는 트랜지스터들 (예를 들어, 포토트랜지스터들) 의 활성화를 제어할 수 있다.
촬상 모듈 (164) 은 촬상 디바이스를 제어할 수 있다. 예를 들어, 촬상 모듈 (164) 은 촬상 디바이스로부터 이미지 데이터를 수신 및 프로세싱할 수 있다. 촬상 디바이스로부터의 이미지 데이터는 촬상 디바이스에 의해 캡처된 정보의 임의의 타입 (예를 들어, 마이크로-객체들의 존재 또는 부재, 배지의 액적들, 형광 라벨과 같은 라벨의 축적 등) 을 포함할 수 있다. 촬상 디바이스에 의해 캡처된 정보를 사용하여, 촬상 모듈 (164) 은 또한, 객체들 (예를 들어, 마이크로-객체들, 배지의 액적들) 의 포지션 및/또는 미세유체 디바이스 (100) 내에서의 이러한 객체들의 모션 속도를 계산할 수 있다.
틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 디바이스 (190) 의 틸팅 모션들을 제어할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 틸팅 모듈 (166) 은 틸팅 속도 및 타이밍을 제어하여, 중력들을 통해 하나 이상의 격리 챔버들로의 마이크로-객체들의 트랜스퍼를 최적화할 수 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 미세유체 회로 (120) 에서 배지의 액적들 및/또는 마이크로-객체들의 모션을 설명하는 데이터를 수신하도록 촬상 모듈 (164) 과 통신 가능하게 커플링된다. 이 데이터를 사용하여, 틸팅 모듈 (166) 은, 마이크로-객체들 및/또는 배지의 액적들이 미세유체 회로 (120) 에서 이동하는 속도를 조정하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 틸트를 조정할 수도 있다. 틸팅 모듈 (166) 은 또한, 이 데이터를 사용하여 미세유체 회로 (120) 에서 마이크로-객체 및/또는 배지의 액적의 포지션을 반복적으로 조정할 수도 있다.
도 1a 에 도시된 예들에서, 미세유체 회로 (120) 는 미세유체 채널 (122) 및 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130) 을 포함하는 것으로서 예시된다. 각각의 펜은 채널 (122) 에 대한 개구를 포함하지만, 다르게는 펜들이 펜 내부의 마이크로-객체들을 채널 (122) 의 흐름 경로 (106) 내 또는 다른 펜들 내의 마이크로-객체들 및/또는 유체 배지 (180) 로부터 실질적으로 격리할 수 있도록 인클로징된다. 격리 챔버의 벽들은 베이스의 내부 표면 (109) 로부터 커버 (110) 의 내측 표면까지 연장되어 인클로저를 제공한다. 미세유체 채널 (122) 에 대한 펜의 개구는 흐름 (106) 이 펜들로 지향되지 않도록 유체 배지 (180) 의 흐름 (106) 에 대해 소정 각도로 배향된다. 그 흐름은 펜의 개구의 평면에 접하거나 직교할 수도 있다. 일부 경우들에서, 펜들 (124, 126, 128, 130) 은 미세유체 회로 (120) 내에 하나 이상의 마이크로-객체들을 물리적으로 몰아넣도록 구성된다. 본 개시에 따른 격리 챔버들은, 이하에서 상세히 논의 및 도시되는 바와 같이, DEP, OET, OEW, 유체 흐름, 및/또는 중력들과의 사용을 위해 최적화되는 다양한 형상들, 표면들 및 피처들을 포함할 수 있다.
미세유체 회로 (120) 는 임의의 수의 미세유체 격리 챔버들을 포함할 수도 있다. 5 개의 격리 챔버들이 도시되지만, 미세유체 회로 (120) 는 더 적거나 또는 더 많은 격리 챔버들을 가질 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "격리 챔버" 및 "격리 펜"은 상호교환가능하게 사용된다. 도시된 바와 같이, 미세유체 회로 (120) 의 미세유체 격리 챔버들 (124, 126, 128, 및 130) 각각은, 인접한 B 세포로부터 하나의 B 세포를 고립시키는 것과 같은, 세포 특이적 항체 분비물을 검출하는데 사용함에 있어서 유용한 하나 이상의 이익들을 제공할 수도 있는 상이한 특징들 및 형상들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 동일한 미세유체 격리 챔버들을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 미세유체 격리 펜들을 포함하며, 여기서 2 이상의 격리 펜들은 배아들을 생성하는 데 있어서의 상이한 이익들을 제공하는 상이한 구조들 및/또는 특징들을 포함한다. 하나의 비제한적인 예는 하나의 타입의 펜에 B 세포들을 유지하면서 다른 타입의 펜에 암 세포들을 유지하는 것을 포함할 수도 있다.
도 1a 에 예시된 실시형태에서, 단일의 채널 (122) 및 흐름 경로 (106) 가 도시된다. 그러나, 다른 실시형태들은 다수의 채널들 (122) 을 포함할 수도 있고, 채널들 각각은 흐름 경로 (106) 를 포함하도록 구성된다. 미세유체 회로 (120) 는 흐름 경로 (106) 및 유체 배지 (180) 와 유체 연통하는 인렛 밸브 또는 포트 (107) 를 더 포함하고, 이로써 유체 배지 (180) 는 인렛 포트 (107) 를 통해 채널 (122) 에 접근할 수 있다. 일부 경우들에서, 흐름 경로 (106) 는 단일의 경로를 포함한다. 일부 경우들에서, 그 단일의 경로는 지그재그 패턴으로 배열되고, 이에 의해 흐름 경로 (106) 는 교번하는 방향들에서 2 회 이상 미세유체 디바이스 (100) 를 가로질러 이동한다.
일부 경우들에서, 미세유체 회로 (120) 는 복수의 병렬 채널들 (122) 및 흐름 경로들 (106) 을 포함하며, 여기서 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 배지 (180) 는 동일한 방향으로 흐른다. 일부 경우들에서, 각각의 흐름 경로 (106) 내의 유체 배지는 순방향 또는 역방향 중 적어도 하나로 흐른다. 일부 경우들에서, 복수의 격리 챔버들은, 격리 챔버들이 타겟 마이크로-객체들과 병렬로 로딩될 수 있도록 (예를 들어, 채널 (122) 에 대해) 구성된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 회로 (120) 는 하나 이상의 마이크로-객체 트랩들 (132) 을 더 포함한다. 트랩들 (132) 은 일반적으로, 채널 (122) 의 경계를 형성하는 벽에 형성되고, 미세유체 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130) 중 하나 이상의 개구 반대편에 위치될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 단일의 마이크로-객체를 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 트랩들 (132) 은 흐름 경로 (106) 로부터 복수의 마이크로-객체들을 수신 또는 캡처하도록 구성된다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 체적과 거의 동일한 체적을 포함한다.
트랩들 (132) 은 타겟이 되는 마이크로-객체들의 트랩들 (132) 안으로의 흐름을 돕도록 구성되는 개구를 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩들 (132) 은 단일의 타겟 마이크로-객체의 치수들과 대략 동일한 높이 및 폭을 갖는 개구를 포함하고, 이에 의해 더 큰 마이크로-객체들이 마이크로-객체 트랩 안으로 진입하는 것이 방지된다. 트랩들 (132) 은 트랩 (132) 내에 타겟이되는 마이크로-객체들의 보유를 돕도록 구성된 다른 피처들을 더 포함할 수도 있다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 미세유체 채널 (122) 에 평행한 축을 중심으로 미세유체 디바이스 (100) 를 틸팅할 때, 트랩된 마이크로-객체가, 마이크로-객체로 하여금 격리 챔버의 개구 안으로 들어가게 하는 궤적에서 트랩 (132) 을 나가도록, 미세유체 격리 챔버의 개구에 대해 채널 (122) 의 반대 측에 놓이고 이와 정렬된다. 일부 경우들에서, 트랩 (132) 은, 트랩 (132) 을 통한 흐름을 용이하게 하고 이에 의해 트랩 (132) 에서 마이크로-객체를 캡처하는 가능성을 증가시키기 위해 타겟 마이크로-객체보다 더 작은 사이드 통로 (134) 를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 유전영동 (DEP) 힘들이 하나 이상의 전극들 (미도시) 을 통해 (예를 들어, 흐름 경로에서 및/또는 격리 챔버들에서) 유체 배지 (180) 를 가로질러 인가되어 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅한다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 단일의 마이크로-객체를 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 챔버 안으로 트랜스퍼하기 위해 미세유체 회로 (120) 의 하나 이상의 부분들에 DEP 힘들이 인가된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 격리 챔버 (예를 들어, 격리 챔버 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 마이크로-객체가 챔버로부터 변위되는 것을 방지하는데 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 마이크로-객체를 격리 챔버로부터 선택적으로 제거하는데 사용된다. 일부 실시형태들에서, DEP 힘들은 광전 트위저 (OET) 힘들을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 광전기습윤 (OEW) 력들은 미세유체 회로 (120) 내에 위치된 액적들을 조작, 수송, 분리 및 분류하기 위해 하나 이상의 전극들 (도시하지 않음) 을 통해 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들 (예를 들어, 흐름 경로 및/또는 격리 챔버들을 정의하는 것을 돕는 위치들) 에 인가된다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 흐름 경로 (106) 로부터 원하는 미세유체 격리 챔버 내로 단일의 액적을 이송하기 위해 지지 구조 (104) (및/또는 커버 (110)) 에서의 하나 이상의 위치들에 인가된다. 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 격리 챔버 (예를 들어, 격리 챔버 (124, 126, 128, 또는 130)) 내의 액적이 그것으로부터 변위되는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 일부 실시형태들에서, OEW 력들은 본 개시의 실시형태들에 따라 이전에 수집되었던 액적을 격리 챔버로부터 선택적으로 제거하기 위해 사용된다.
일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 미세유체 회로 (120) 내의 액적들 및/또는 마이크로-객체들을 조작, 이송, 분리 및 소팅하도록, 다른 힘들, 예컨대 흐름 및/또는 중력과 결합된다. 예를 들어, 인클로저 (102) 는 흐름 경로 (106)) 및 그 안에 위치된 마이크로-객체들을 미세유체 격리 챔버들 위에 위치시키도록 (예를 들어, 틸팅 디바이스 (190) 에 의해) 틸팅될 수 있고, 중력의 힘은 마이크로-객체들 및/또는 액적들을 펜들 안으로 이송할 수 있다. 일부 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 전에 인가될 수 있다. 다른 실시형태들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들 후에 인가될 수 있다. 또 다른 경우들에서, DEP 및/또는 OEW 힘들은 다른 힘들과 동시에 또는 다른 힘들과 교번하는 방식으로 인가될 수 있다.
도 1b, 도 1c, 및 도 2a 내지 도 2h 는 본 개시의 실시형태들의 실시에서 사용될 수 있는 미세유체 디바이스들의 여러 실시형태들을 도시한다. 도 1b 는 미세유체 디바이스 (200) 가 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스로서 구성되는 실시형태를 묘사한다. 광전 트위저 (OET) 구성을 갖는 디바이스들 및 광전기습윤 (OEW) 구성을 갖는 디바이스들을 포함하는 여러 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스들이 본 기술에서 알려져 있다. 적합한 OET 구성들의 예들은 각각 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 다음의 미국 특허 문서들에 예시된다: 미국 특허 제 RE 44,711 호 (Wu 등) (US 특허 제 7,612,355 호로서 특허됨); 및 US 특허 제 7,956,339 호 (Ohta 등). OEW 구성들의 예들은 양자 모두가 전체가 참조에 의해 여기에 포함되는 미국 특허 제 6,958,132 (Chiou 등) 및 US 특허 출원 공개 제 2012/0024708 호 (Chiou 등) 에 예시되어 있다. 광학적으로 작동되는 동전기적 디바이스의 또 다른 예는 결합된 OET/OEW 구성을 포함하며, 이것의 예들은 미국 특허 공보들 제 20150306598 호 (Khandros 등) 및 제 20150306599 호 (Khandros 등) 및 그들의 대응하는 PCT 공보들 WO2015/164846 호 및 WO2015/164847 호에 도시되며, 이들 모두는 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다.
B 세포들, T 세포들, 또는 암 세포들과 같은 종양-유래의 세포들이 배치, 배양, 및/또는 모니터될 수 있는 펜들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은 예를 들어 US 2014/0116881 (2013년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/060,117 호), US 2015/0151298 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/520,568 호), 및 US 2015/0165436 (2014년 10월 22일자로 출원된 출원 번호 제 14/521,447 호) 에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 여기에 포함된다. 미국 출원 번호들 제 14/520,568 호 및 제 14/521,447 호는 또한 미세유체 디바이스에서 배양된 세포들의 분비물들을 분석하는 예시적인 방법들을 기술한다. 상기 출원들 각각은 광전 트위저들 (OET) 과 같은 유전영동 (DEP) 힘들을 생산하도록 구성되거나 광-전기습윤 (OEW) 을 제공하도록 구성된 미세유체 디바이스들을 더 기술한다. 예를 들어, US 2014/0116881 의 도 2 에 도시된 광전 트위저 디바이스는 개개의 생물학적 마이크로-객체 또는 생물학적 마이크로-객체들의 그룹을 선택하고 이동시키기 위해 본 개시의 실시형태들에서 이용될 수 있는 디바이스의 예이다.
C. 미소유체 디바이스 동기 (motive) 구성들.
전술된 바와 같이, 시스템의 제어 및 모니터링은 미세유체 디바이스의 미세유체 회로에서, 마이크로-객체들 또는 액적들과 같은 객체들을 선택 및 이동시키기 위한 동기 모듈을 포함할 수 있다. 미세유체 디바이스는, 이동되고 있는 객체의 타입 및 다른 고려사항들에 따라, 다양한 동기 구성들을 가질 수 있다. 예를 들어, 유전영동 (DEP) 구성은 미세유체 회로에서 마이크로-객체들을 선택하고 이동시키기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 내의 유체 배지 (180) 내의 마이크로-객체들상에 DEP 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 DEP 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 마이크로-객체들 또는 마이크로-객체들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다. 대안적으로, 미세유체 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 및/또는 커버 (110) 는 미세유체 회로 (120) 에서의 유체 배지 (180) 내의 액적들상에 EW 힘들을 선택적으로 유도하기 위한 전기습윤 (EW) 구성을 포함할 수 있고, 이것에 의해 개개의 액적들 또는 액적들의 그룹들을 선택, 캡쳐, 및/또는 이동시킬 수 있다.
DEP 구성을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 의 하나의 예가 도 1b 및 도 1c 에 도시된다. 간단성의 목적으로, 도 1b 및 도 1c 는 영역/챔버 (202) 를 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 인클로저 (102) 의 부분의, 각각, 측단면도 및 평면 단면도를 도시하지만, 그 영역/챔버 (202) 는 성장 챔버, 격리 챔버, 흐름 영역, 또는 흐름 채널과 같은 더 상세한 구조를 갖는 유체 회로 엘리먼트의 부분일 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 더욱이, 미세유체 디바이스 (200) 는 다른 유체 회로 엘리먼트들을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 미세유체 디바이스 (200) 는, 미세유체 디바이스 (100) 에 대하여 본원에 설명된 바와 같은, 복수의 성장 챔버들 또는 격리 챔버들 및/또는 하나 이상의 흐름 영역들 또는 흐름 채널들을 포함할 수 있다. DEP 구성은 미세유체 디바이스 (200) 의 임의의 이러한 유체 회로 엘리먼트들 안에 통합되거나, 또는 그 부분들을 선택할 수도 있다. 위 또는 아래에 설명된 미세유체 디바이스 컴포넌트들 및 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나는 미세유체 디바이스 (200) 에 통합되고/되거나 이와 결합되어 사용될 수도 있다는 것이 또한 인식되어야 한다. 예를 들어, 전술된 제어 및 모니터링 장비 (152) 를 포함하는 시스템 (150) 은, 배지 모듈 (160), 동기 모듈 (162), 촬상 모듈 (164), 틸팅 모듈 (166), 및 다른 모듈들 (168) 중 하나 이상을 포함하는 미세유체 디바이스 (200) 와 함께 사용될 수도 있다.
도 1b 에서 알 수 있는 바와 같이, 미세유체 디바이스 (200) 는 하단 전극 (204) 및 하단 전극 (204) 위에 있는 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는 지지 구조 (104), 및 하단 전극 (204) 으로부터 떨어져 이격된 상단 전극 (210) 을 갖는 커버 (110) 를 포함한다. 상단 전극 (210) 및 전극 활성화 기판 (206) 은 영역/챔버 (202) 의 반대 표면들을 정의한다. 영역/챔버 (202) 에 포함된 배지 (180) 는 따라서, 상단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 간의 저항성 접속을 제공한다. 하단 전극 (204) 및 상단 전극 (210) 에 접속되고 영역/챔버 (202) 에서 DEP 힘들의 생성에 필요한 바와 같은 전극들 간의 바이어싱 전압을 생성하도록 구성된 전원 (212) 이 또한 도시된다. 전원 (212) 은, 예를 들어 교류 (AC) 전원일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 도 1b 및 도 1c 에 예시된 미세유체 디바이스 (200) 는 광학적으로-작동된 DEP 구성을 가질 수 있다. 따라서, 동기 모듈 (162) 에 의해 제어될 수도 있는 광원 (216) 으로부터의 광 (218) 의 패턴들을 변경하는 것은 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 영역들 (214) 에서 DEP 전극들의 패턴들을 변경하는 것을 선택적으로 활성화 및 비활성화할 수 있다. (이하에서, DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스의 영역들 (214) 은 "DEP 전극 영역들" 로서 지칭된다). 도 1c 에 예시된 바와 같이, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 위로 지향된 광 패턴 (218) 은 정사각형과 같은 패턴으로 DEP 전극 영역들 (214a)(화이트로 도시됨) 을 선택적으로 조명할 수 있다. 비-조명된 DEP 전극 영역들 (214)(십자-해칭됨) 은 "어두운" DEP 전극 영역들 (214) 로서 이하에서 지칭된다. DEP 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하부 전극 (204) 으로부터 흐름 영역 (106) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적인 전기적 임피던스는 각각의 어두운 DEP 전극 영역 (214) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 전기적 임피던스보다 더 크다. 그러나, 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 은, 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214a) 에서 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 작은 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 감소된 상대적 임피던스를 보인다.
전원 (212) 이 활성화됨에 따라, 상기 DEP 구성은 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 과 인접한 어두운 DEP 전극 영역들 (214) 사이의 유체 배지 (180) 에서 전계 구배를 생성하고, 이것은 이어서 유체 배지 (180) 에서 부근의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 로컬 DEP 힘들을 생성한다. 유체 배지 (180) 내의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광원 (216) 으로부터 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 영역/챔버 (202) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 이러한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. DEP 힘들이 부근의 마이크로-객체들을 끌어당기거나 밀어내는지 여부는, 배지 (180) 및/또는 마이크로-객체들 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 파라미터들에 의존할 수 있다.
도 1c 에 예시된 조명된 DEP 전극 영역들 (214a) 의 정사각형 패턴 (220) 은 단지 일 예이다. DEP 전극 영역들 (214) 의 임의의 패턴이 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅된 광의 패턴 (218) 에 의해 조명 (및 이에 의해 활성화) 될 수 있고, 조명된/활성화된 DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴은 광 패턴 (218) 을 변경 또는 이동시킴으로써 반복적으로 변경될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 광전도 재료를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 은 특색이 없을 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 이러한 실시형태들에서, DEP 전극 영역들 (214) 은 광 패턴 (218) 에 따라, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 상에 임의의 패턴으로 그리고 어디든 생성될 수 있다. 따라서, DEP 전극 영역들 (214) 의 패턴 및 수는 고정될 필요가 없고, 광 패턴 (218) 에 대응할 수 있다. 위에서 논의된 바와 같은 광전도성 층을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 RE 44,711 (Wu 등)(미국특허 제 7,612,355 호로서 최초로 발행됨) 에서 설명되어 있고, 이 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
다른 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 복수의 도핑된 층들, 전기적으로 절연 층들 (또는 영역들), 및 반도체 분야들에서 알려진 바와 같은 반도체 집적 회로들을 형성하는 전기적으로 전도성 층들을 포함하는 기판을 포함할 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 예를 들어, 측방 바이폴러 포토레지스터들을 포함하는 복수의 포토레지스터들을 포함할 수 있고, 포토레지스터들 각각은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 대안으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들 (예를 들어, 전도성 금속 전극들) 을 포함할 수 있고, 각각의 이러한 전극은 DEP 전극 영역 (214) 에 대응한다. 전극 활성화 기판 (206) 은 이러한 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 패턴은, 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같이 행들 및 열들로 배열된 실질적으로 정사각형의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 대안으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각의 포토레지스터들 또는 포토레지스터-제어된 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, 전기 회로 엘리먼트들은 하단 전극 (210) 과 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서의 DEP 전극 영역들 (214) 간의 전기적 접속들을 형성할 수 있고, 이들 전기적 접속들 (즉, 포토레지스터들 또는 전극들) 은 광 패턴 (218) 에 의해 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다. 활성화되지 않은 경우, 각각의 전기적 접속은, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 (즉, 하단 전극 (204) 으로부터 영역/챔버 (202) 에서 배지 (180) 와 인터페이스하는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 까지의) 상대적 임피던스가 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 (즉, 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 으로부터 커버 (110) 의 상단 전극 (210) 까지의) 상대적 임피던스보다 더 크도록 높은 임피던스를 가질 수 있다. 그러나 광 패턴 (218) 에서 광에 의해 활성화되는 경우, 전극 활성화 기판 (206) 을 통한 상대적 임피던스는 각각의 조명된 DEP 전극 영역 (214) 에서 배지 (180) 를 통한 상대적 임피던스보다 더 작고, 이에 의해 위에서 논의된 바와 같이 대응하는 DEP 전극 영역 (214) 에서 DEP 전극을 활성화시킨다. 배지 (180) 내의 마이크로-객체들 (미도시) 을 끌어당기거나 밀어내는 DEP 전극들은 따라서, 광 패턴 (218) 에 의해 결정된 방식으로 영역/챔버 (202) 의 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 많은 상이한 DEP 전극 영역들 (214) 에서 선택적으로 활성화 및 비활성화될 수 있다.
포토레지스터들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국특허 제 7,956,339 (Ohta 등) (예를 들어, 도 21 및 도 22, 그 설명들에 예시된 디바이스 (300) 를 참조) 및 미국특허 공개공보 제 2016/0184821 (Ohta 등) (예를 들어, 도면, 및 그 설명들 전반에 걸쳐 예시된 디바이스들 (200, 502, 504, 600, 및 700) 을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다. 포토레지스터 스위치들에 의해 제어된 전극들을 포함하는 전극 활성화 기판들을 갖는 미세유체 디바이스들의 예들은, 예를 들어 미국 특허공개 제 2014/0124370 (Short 등) (예를 들어, 도면들 전체에 예시된 디바이스들 (200, 400, 500, 600, 및 900) 및 그 설명들을 참조) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
DEP 구성된 미세유체 디바이스의 일부 실시형태들에서, 상단 전극 (210) 은 인클로저 (102) 의 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이고, 전극 활성화 기판 (206) 및 하단 전극 (204) 은 인클로저 (102) 의 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이다. 영역/챔버 (202) 는 제 1 벽과 제 2 벽 사이에 있을 수 있다. 다른 실시형태들에서, 전극 (210) 은 제 2 벽 (또는 지지 구조 (104)) 의 부분이고, 하나 또는 양자 모두의 전극 활성화 기판 (206) 및/또는 전극 (210) 은 제 1 벽 (또는 커버 (110)) 의 부분이다. 또한, 광원 (216) 은 대안으로 아래로부터 인클로저 (102) 를 조명하도록 사용될 수 있다.
DEP 구성을 갖는 도 1b 및 도 1c 의 미세유체 디바이스 (200) 로, 동기 모듈 (162) 은, 마이크로-객체를 둘러싸고 캡처하는 패턴 (예를 들어, 정사각형 패턴 (220)) 에서 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 의 DEP 전극 영역들 (214a) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 1 세트를 활성화시키도록 광 패턴 (218) 을 미세유체 디바이스 (200) 로 프로젝팅함으로써 영역/챔버 (202) 내의 배지 (180) 에서 마이크로-객체 (미도시) 를 선택할 수 있다. 동기 모듈 (162) 은 그 후, DEP 전극 영역들 (214) 에서 하나 이상의 DEP 전극들의 제 2 세트를 활성화시키도록 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 광 패턴 (218) 을 이동시킴으로써 인 시츄 생성된 캡처된 마이크로-객체를 이동시킬 수 있다. 대안으로, 미세유체 디바이스 (200) 는 광 패턴 (218) 에 대해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전극 활성화 기판 (206) 의 내측 면 (208) 에서 DEP 전극들의 광 활성화에 의존하지 않는 DEP 구성을 가질 수 있다. 예를 들어, 전극 활성화 기판 (206) 은 적어도 하나의 전극을 포함하는 표면 (예를 들어, 커버 (110)) 의 반대편에 위치된 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함할 수 있다. 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판에서의 트랜지스터 스위치들) 은 DEP 전극 영역들 (214) 에서 DEP 전극들을 활성화 또는 비활성화시키도록 선택적으로 개방 및 폐쇄될 수도 있고, 이에 의해 활성화된 DEP 전극들 근처에서 영역/챔버 (202) 내의 마이크로-객체 (미도시) 상에 순 (net) DEP 힘을 생성한다. 영역/챔버 (202) 에서 마이크로-객체들 및/또는 배지 (미도시) 의 유전 특성들 및 전원 (212) 의 주파수와 같은 이러한 특징들에 따라, DEP 힘은 부근의 마이크로-객체를 끌어당기거나 밀어낼 수 있다. (예를 들어, 정사각형 패턴 (220) 을 형성하는 DEP 전극 영역들 (214) 의 세트에서) DEP 전극들의 세트를 선택적으로 활성화 및 비활성화시킴으로써, 영역/챔버 (202) 내의 하나 이상의 마이크로-객체들은 영역/챔버 (202) 내에서 트랩 및 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 이러한 스위치들을 제어하고, 따라서 영역/챔버 (202) 주변의 특정한 마이크로-객체들 (미도시) 을 선택, 트랩, 및 이동시키도록 DEP 전극들 중 개별의 전극들을 활성화 및 비활성화시킬 수 있다. 선택적으로 어드레싱 가능 및 에너자이징 가능한 전극들을 포함하는 DEP 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들어 미국특허 제 6,294,063 (Becker 등) 및 6,942,776 (Medoro) 에서 설명되어 있고, 그 전체 내용들은 참조로서 본원에 포함된다.
또 다른 예로서, 미세유체 디바이스 (200) 는 전기습윤 (EW) 구성을 가질 수 있으며, 이것은 DEP 구성 대신일 수 있거나 DEP 구성을 갖는 부분으로부터 분리된 미세유체 디바이스 (200) 의 부분에 위치될 수 있다. EW 구성은 광-전기습윤 구성 또는 유전체상의 전기습윤 (EWOD) 구성일 수도 있으며, 이들 양자는 본 기술에서 알려져 있다. 일부 EW 구성들에서, 지지 구조 (104) 는 유전체층 (미도시) 과 하부 전극 (204) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 갖는다. 유전체층은 이하에 기술되는 바와 같이 소수성 재료를 포함할 수 있고 및/또는 소수성 재료로 코팅될 수 있다. EW 구성을 갖는 미세유체 디바이스들 (200) 의 경우, 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 은 유전체층의 내부 표면 또는 그것의 소수성 코팅이다.
유전체층 (미도시) 은 하나 이상의 산화물 층들을 포함할 수 있고, 약 50 nm 내지 약 250 nm (예를 들어, 약 125 nm 내지 약 175 nm) 의 두께를 가질 수 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄 산화물 또는 하프늄 산화물) 과 같은 산화물의 층을 포함할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 유전체층은 실리콘 산화물 또는 질화물과 같은, 금속 산화물 이외의 유전체 재료를 포함할 수 있다. 정확한 조성 및 두께에 관계 없이, 유전체층은 약 10 kOhms 내지 약 50 kOhms 의 임피던스를 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 영역/채널 (202) 를 향해 내부로 마주하는 유전체층의 표면은 소수성 재료로 코팅된다. 소수성 재료는 예를 들어 플루오리네이티드 카본 분자들을 포함할 수 있다. 플루오리네이티드 카본 분자들의 예들은 폴리테트라플루오로에틸렌 (예를 들어, TEFLON®) 또는 폴리(2,3-디플루오로메틸렌일-퍼플루오로테트라하이드로퓨란) (예를 들어, CYTOPTM) 과 같은 퍼플루오로-폴리머들을 포함한다. 소수서 재료를 구성하는 분자들은 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, 소수성 재료의 분자들은 실록산 기, 포스포닉 애시드 기, 또는 티올 기와 같은 연결자에 의해 유전체층의 표면에 공유결합될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 소수성 재료는 알킬-말단 실록산, 알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일킬 기는 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 16, 18, 20, 22 개 또는 그 이상의 탄소들의 사슬을 갖는) 긴-사슬 탄화수소들일 수 있다. 대안적으로, 플루오리네이티드 (또는, 퍼플루오리네이티드) 카본 사슬들이 알킬 기들을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 소수성 재료는 플루오로알킬-말단 실록산, 플루오로알킬-말단 포스포닉 애시드, 또는 플루오로알킬-말단 티올을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 소수성 코팅은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 소수성 코팅은 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 갖는다.
일부 실시형태들에서, 전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스 (200) 의 커버 (110) 는 마찬가지로 소수성 재료 (미도시) 로 코팅된다. 소수성 재료는 지지 구조 (104) 의 유전체층을 코팅하기 위해 사용되는 동일한 소수성 재료일 수 있고, 소수성 코팅은 지지 구조 (104) 의 유전체층상의 소수성 코팅의 두께와 실질적으로 동일한 두께를 가질 수 있다. 게다가, 커버 (110) 는 지지 구조 (104) 의 방식으로, 유전체층과 상부 전극 (210) 사이에 샌드위치된 전극 활성화 기판 (206) 을 포함할 수 있다. 커버 (110) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층은 지지 구조 (104) 의 전극 활성화 기판 (206) 및 유전체층과 동일한 조성 및/또는 치수들을 가질 수 있다. 따라서, 미세유체 디바이스 (200) 는 2 개의 전기습윤 표면들을 가질 수 있다.
일부 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같은 광도전 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 특정 실시형태들에서, 전극 활성화 기판 (206) 은 수소화 비정질 실리콘 (a-Si:H) 의 층을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. a-Si:H 는, 예를 들어 (100 * 수소 원자들의 수/수소 및 규소 원자들의 총 수로서 계산된) 약 8% 내지 40% 수소를 포함할 수 있다. a-Si:H 의 층은 약 500 nm 내지 약 2.0 ㎛의 두께를 가질 수 있다. 대안적으로, 전극 활성화 기판 (206) 은 상술된 바와 같이 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들 (예를 들어, 도전성 금속 전극들) 을 포함할 수 있다. 광-전기습윤 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 및/또는 본 기술에서 알려져 있는 전극 활성화 기판들로 구성될 수 있다. 예를 들어, 그 전체 내용들이 참조로 여기에 포힘되는 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등) 는 a-Si:H 와 같은 광도전성 재료를 갖는 광-전기습윤 구성들을 개시하는 반면, 상술된 미국 특허 공보 제 2014/0124370 호 (Short 등) 는 포토트랜지스터 스위치들에 의해 제어되는 전극들을 갖는 전극 활성화 기판들을 개시한다.
미세유체 디바이스 (200) 는 따라서 광-전기습윤 구성을 가질 수 있고, 광 패턴들 (218) 은 전극 활성화 기판 (206) 에서의 광도전성 EW 영역들 또는 광응답성 EW 전극들을 활성화하기 위해 사용될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 의 그러한 활성화된 EW 영역들 또는 EW 전극들은 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) (즉, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면) 에서 전기습윤력을 생성할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 상에 입사하는 광 패턴들 (218) 을 변경함으로써 (또는 광원 (216) 에 대해 미세유체 디바이스 (200) 를 이동시킴으로써), 지지 구조 (104) 의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 (예를 들어, 수성 배지, 용액, 또는 용매를 포함하는) 액적들이 영역/챔버 (202) 에 존재하는 비혼성 유체 (예를 들어, 오일 배지) 를 통해 이동될 수 있다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스들 (200) 은 EWOD 구성을 가질 수 있고, 전극 활성화 기판 (206) 은 활성화를 위해 광에 의존하지 않는 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 포함할 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 은 따라서 그러한 전기습윤 (EW) 전극들의 패턴을 포함할 수 있다. 그 패턴은 예를 들어 도 2b 에 도시된 바와 같은 열들 및 행들로 배열된 실질적으로 정사각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 대안적으로, 패턴은 육각형 격자를 형성하는 실질적으로 육각형 EW 전극들의 어레이일 수 있다. 패턴에 관계없이, EW 전극들은 전기 스위치들 (예를 들어, 반도체 기판 내의 트랜지스터 스위치들) 에 의해 선택적으로 활성화 (또는 활성화해제) 될 수 있다. 전극 활성화 기판 (206) 내의 EW 전극들을 선택적으로 활성화 및 활성화해제함으로써, 오버레이잉 유전체층 또는 그것의 소수성 코팅의 내부 표면 (208) 과 접촉하는 액적들 (미도시) 은 영역/챔버 (202) 내에서 이동될 수 있다. 도 1a 에서의 동기 모듈 (162) 은 그러한 스위치들을 제어할 수 있고 따라서 영역/챔버 (202) 주위의 특정의 액적들을 선택하고 이동시키기 위해 개개의 EW 전극들을 활성화 및 활성화해제할 수 있다. 선택적으로 어드레싱가능한 및 에너자이징가능한 전극들을 갖는 EWOD 구성을 갖는 미세유체 디바이스들은 본 기술에서 알려져 있고 예를 들어 미국 특허 제 8,685,344 호 (Sundarsan 등) 에 기술되었으며, 이것의 전체 내용들은 참조에 의해 여기에 포함된다.
미세유체 디바이스 (200) 의 구성에 관계없이, 전원 (212) 은 미세유체 디바이스 (200) 의 전기 회로들에 전력을 공급하는 전위 (예를 들어, AC 전압 전위) 를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 전원 (212) 은 도 1 에서 참조되는 전원 (192) 과 동일하거나, 그 전원의 컴포넌트일 수 있다. 전원 (212) 은 상부 전극 (210) 및 하부 전극 (204) 에 AC 전압 및/또는 전류를 제공하도록 구성될 수 있다. AC 전압의 경우, 전원 (212) 은 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 내에서 개개의 마이크로-객체들 (미도시) 을 트랩하고 이동시키며, 및/또는 또한 상술된 바와 같이 영역/챔버 (202) 에서 지지 구조 (104) (예를 들어, 유전체층 및/또는 유전체층상의 소수성 코팅) 의 내부 표면 (208) 의 습윤 특성들을 변경하기에 충분히 강한 네트 DEP 힘들 (또는 습윤력들) 을 발생시키기에 충부난 주파수 범위 및 평균 또는 피크 전력 (예를 들어, 전압 또는 전류) 범위를 제공할 수 있다. 그러한 주파수 범위들 및 평균 또는 피크 전력 범위들은 본 기술에서 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,958,132 호 (Chiou 등), 미국 특허 제 RE44,711 (Wu 등) (미국특허 제 7,612,355 호로서 이슈됨), 및 미국 특허 출원 공개 제 US2014/0124370 호 (Short 등), 제 US2015/0306598 호 (Khandros 등) 및 제 US2015/0306599 호 (Khandros 등) 참조.
D. 격리 챔버들.
일반적인 격리 챔버들 (224, 226, 및 228) 의 비-제한 예들은 도 2a 내지 도 2c 에 도시된 미세유체 디바이스 (230) 내에 도시된다. 각각의 격리 챔버 (224, 226, 및 228) 는 고립 영역 (240) 및 고립 영역 (240) 을 미세유체 채널 (122) 에 유체적으로 접속시키는 접속 영역 (236) 을 정의하는 고립 구조 (232) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은 미세유체 채널 (122) 로의 근위 (proximal) 개구 (234) 및 고립 영역 (240) 로의 원위 (distal) 개구 (238) 를 포함할 수 있다. 접속 영역 (236) 은, 채널 (122) 로부터 격리 챔버 (224, 226, 228) 안으로 흐르는 유체 배지 (미도시) 의 흐름의 최대 침투 깊이가 고립 영역 (240) 안으로 확장하지 않도록 구성될 수 있다. 따라서, 접속 영역 (236) 으로 인해, 격리 챔버 (224, 226, 228) 의 고립 영역 (240) 에 배치된 마이크로-객체 (미도시) 또는 다른 재료 (미도시) 는 미세유체 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름으로부터 고립될 수 있고, 실질적으로 이에 의해 영향을 받지 않는다.
도 2a 내지 도 2c 의 격리 챔버들 (224, 226, 및 228) 은 각각 미세유체 채널 (122) 에 대해 직접 개방하는 단일 개구를 갖는다. 격리 챔버의 개구는 미세유체 채널 (122) 로부터 측면방향으로 개방된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 미세유체 채널 (122) 및 격리 챔버들 (224, 226, 및 228) 양자의 아래에 놓인다. 격리 챔버의 바닥을 형성하는, 격리 챔버의 인클로저 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면은 미세유체 디바이스의 흐름 채널 (또는 각각, 흐름 영역) 의 바닥을 형성하는, 미세유체 채널 (122) (또는 채널이 존재하지 않는 경우 흐름 영역) 내의 전극 활성화 기판 (206) 의 상부 표면의 동일한 레벨 또는 실질적으로 동일한 레벨에 배치된다. 전극 활성화 기판 (206) 은 피쳐리스 (featureless) 일 수도 있거나 그것의 최고 고도로부터 그것의 최저 함몰부까지 약 3 마이크론 이하만큼, 2.5 마이크론, 2 마이크론, 1.5 마이크론, 1 마이크론, 0.9 마이크론, 0.5 마이크론, 0.4 마이크론, 0.2 마이크론, 0.1 마이크론 이하만큼 변화하는 불규칙적이거나 패터닝된 표면을 가질 수도 있다. 미세유체 채널 (122) (또는 흐름 영역) 및 격리 챔버들 양자에 걸친 기판의 상부 표면에서의 고도의 변동은 격리 챔버의 벽들 또는 미세유체 디바이스의 벽들의 높이의 약 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.5%, 0.3% 또는 0.1% 보다 작을 수도 있다. 미세유체 디바이스 (200) 에 대해 상세히 설명되지만, 이것은 또한 여기에 기술된 미세유체 디바이스들 (100, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 450, 500, 700) 중 임의의 것에 적용된다.
미세유체 채널 (122) 은 따라서, 스윕 영역의 일 예일 수 있고, 격리 챔버들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은 스윕되지 않은 영역들의 예들일 수 있다. 주목된 바와 같이, 미세유체 채널 (122) 및 격리 챔버들 (224, 226, 228) 은 하나 이상의 유체 배지 (180) 를 포함하도록 구성될 수 있다. 도 2a 및 도 2b 에 도시된 예에서, 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 에 접속되고 유체 배지 (180) 가 미세유체 디바이스 (230) 안으로 도입되거나 이로부터 제거되는 것을 허용한다. 유체 배지 (180) 의 도입 전에, 미세유체 디바이스는 이산화탄소 기체와 같은 기체로 프라이밍될 수도 있다. 일단, 미세유체 디바이스 (230) 가 유체 배지 (180) 를 포함하면, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 선택적으로 생성 및 정지될 수 있다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 포트들 (222) 은 미세유체 채널 (122) 의 상이한 로케이션들 (예를 들어, 반대편 단부들) 에 배치될 수 있고, 배지의 흐름 (242) 은 인렛로서 기능하는 하나의 포트 (222) 로부터 아웃렛으로서 기능하는 다른 포트 (222) 로 생성될 수 있다.
도 2c 는 본 개시에 따른 격리 펜 (224) 의 일 예의 상세 뷰를 예시한다. 마이크로-객체들 (246) 의 예들이 또한, 도시된다.
알려진 바와 같이, 격리 챔버 (224) 의 근위 개구 (234) 를 지나 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 격리 챔버 (224) 의 안 및/또는 밖으로의 배지 (180) 의 세컨더리 흐름 (244) 을 야기할 수 있다. 격리 챔버 (224) 의 고립 영역 (240) 에서 마이크로-객체들 (246) 을 세컨더리 흐름 (244) 으로부터 고립시키기 위해, (즉, 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 로의) 격리 챔버 (224) 의 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (244) 의 접속 영역 (236) 안으로의 침투 깊이 (Dp) 보다 커야 한다. 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 는 미세유체 채널 (122) 에서 흐르는 유체 배지 (180) 의 속도 및 미세유체 채널 (122) 및 미세유체 채널 (122) 에 대한 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 의 구성에 관련한 다양한 파라미터들에 의존한다. 소정의 미세유체 디바이스에 대해, 미세유체 채널 (122) 및 개구 (234) 의 구성들은 고정될 것이지만 반면에, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도는 가변적일 것이다. 따라서, 각각의 격리 챔버 (224) 에 대해, 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 대한 최대 속도 (Vmax) 는, 세컨더리 흐름 (244) 의 침투 깊이 (Dp) 가 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 를 초과하지 않는 것을 보장하도록 식별될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 한, 결과의 세컨더리 흐름 (244) 은 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역 (236) 에 제한되고 고립 영역 (240) 밖에서 유지될 수 있다. 미세유체 채널 (122) 에서 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 따라서, 마이크로-객체들 (246) 을 고립 영역 (240) 밖으로 인출하지 않을 것이다. 차라리, 고립 영역 (240) 에 위치된 마이크로-객체들 (246) 은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 관계없이 고립 영역 (240) 에 머무를 것이다.
또한, 미세유체 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도가 Vmax 를 초과하지 않는 한, 미세유체 채널 (122) 에서의 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 격리 챔버 (224) 의 고립 영역 (240) 으로 잡다한 입자들 (예를 들어, 마이크로입자들 및/또는 나노입자들) 을 이동시키지 않을 것이다. 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 가 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 큰 것은 따라서, 미세유체 채널 (122) 또는 다른 격리 챔버 (예를 들어, 도 2d 에서 격리 챔버들 (226, 228)) 로부터의 잡다한 입자들로 하나의 격리 펜 (224) 의 오염을 방지할 수 있다.
격리 챔버들 (224, 226, 228) 의 접속 영역들 (236) 및 미세유체 채널 (122) 이 미세유체 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 미세유체 채널 (122) 및 접속 영역들 (236) 은 미세유체 디바이스 (230) 의 스윕 (또는 흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 한편, 격리 챔버들 (224, 226, 228) 의 고립 영역들 (240) 은, 스윕되지 않은 (또는 비-흐름) 영역들로 간주될 수 있다. 예를 들어, 미세유체 채널 (122) 에서의 제 1 유체 배지 (180) 내의 성분들 (미도시) 은 미세유체 채널 (122) 로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 고립 영역 (240) 내의 제 2 유체 배지 (248) 로의 제 1 배지 (180) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 고립 영역 (240) 에서 제 2 유체 배지 (280) 와 혼합할 수 있다. 유사하게, 고립 영역 (240) 에서의 제 2 배지 (248) 의 성분들 (미도시) 는 고립 영역 (240) 으로부터 접속 영역 (236) 을 통해 그리고 미세유체 채널 (122) 의 제 1 배지 (180) 안으로 제 2 배지 (248) 의 성분들의 확산에 의해서만 실질적으로, 미세유체 채널 (122) 에서 제 1 배지 (180) 와 혼합할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 확산에 의한 격리 챔버의 고립 영역과 흐름 영역 사이의 유체 배지 교환의 정도는 유체 교환의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 보다 더 크거나 약 99% 보다 더 크다. 제 1 배지 (180) 는 제 2 배지 (248) 와 동일한 배지이거나 상이한 배지일 수 있다. 또한, 제 1 배지 (180) 및 제 2 배지 (248) 는 동일하게 시작하고, 그 후 (예를 들어, 고립 영역 (240) 에서 하나 이상의 세포들에 의해 제 2 배지 (248) 의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (122) 을 통해 흐르는 배지 (180) 를 변경함으로써) 상이하게 될 수 있다.
미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 의해 야기된 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 는, 위에서 언급된 바와 같이 다수의 파라미터들에 의존할 수 있다. 이러한 파라미터들의 예들은: 미세유체 채널 (122) 의 형상 (예를 들어, 미세유체 채널은 접속 영역 (236) 안으로 배지를 지향시키고, 접속 영역 (236) 으로부터 멀리 배지를 전환시키고, 또는 접속 영역 (236) 의 근위 개구 (234) 에 실질적으로 수직한 방향에서 배지를 미세유체 채널 (122) 로 지향시킬 수 있음); 근위 개구 (234) 에서 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch)(또는 단면적); 및 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적); 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 속도 (V); 제 1 배지 (180) 및/또는 제 2 배지 (248) 의 속도 등을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 채널 (122) 및 격리 챔버들 (224, 226, 228) 의 치수들은 미세유체 채널 (122) 에서 유체 배지 (180) 의 흐름 (242) 의 벡터에 대하여 다음과 같이 배향될 수 있다: 미세유체 채널 폭 (Wch)(또는 미세유체 채널 (122) 의 단면적) 은 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다; 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon)(또는 단면적) 은 미세유체 채널 (122) 에서의 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 평행할 수 있다; 및/또는 접속 영역의 길이 (Lcon) 는 미세유체 채널 (122) 에서 배지 (180) 의 흐름 (242) 에 실질적으로 수직할 수 있다. 상기는 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 및 격리 챔버들 (224, 226, 228) 의 상대적 포지션은 서로에 대하여 다른 배향들에 있을 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 로부터 원위 개구 (238) 까지 균일할 수 있다. 따라서, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 클 수 있다.
도 2c 에 예시된 바와 같이, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 과 실질적으로 동일할 수 있다. 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 따라서, 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 에 대해 본원에 식별된 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다. 대안으로, 원위 개구 (238) 에서 고립 영역 (240) 의 폭은 근위 개구 (234) 에서 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 보다 더 크거나 또는 더 작을 수 있다. 또한, 원위 개구 (238) 는 근위 개구 (234) 보다 더 작을 수도 있고, 접속 영역 (236) 의 폭 (Wcon) 은 근위 개구 (234) 와 원위 개구 (238) 사이에서 좁아질 수도 있다. 예를 들어, 접속 영역 (236) 은 다양한 상이한 지오메트리들을 사용하여 (예를 들어, 접속 영역을 챔퍼링, 접속 영역을 베벨링), 근위 개구와 원위 개구 사이에서 좁아질 수도 있다. 또한, 접속 영역 (236) 의 임의의 부분 또는 하위부분 (예를 들어, 근위 개구 (234) 에 인접한 접속 영역의 부분) 이 좁아질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 는 도 1a 의 각각의 미세유체 디바이스 (100), 회로 (132) 및 채널 (134) 의 변형들인, 미세유체 회로 (262) 및 흐름 채널들 (264) 을 포함하는 미세유체 디바이스 (400) 의 다른 예시적인 실시형태를 도시한다. 미세유체 디바이스 (250) 는 또한, 전술된 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 의 추가적인 변형들인 복수의 격리 챔버들 (266) 을 갖는다. 특히, 도 2d 내지 도 2f 에 도시된 디바이스 (250) 의 격리 챔버들 (266) 은 전술된 디바이스들 (100, 200, 230, 280, 290, 300) 내의 격리 챔버들 (124, 126, 128, 130, 224, 226 또는 228) 중 어느 하나를 대체할 수 있다. 마찬가지로, 미세유체 디바이스 (400) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 다른 변형이고, 또한 전술된 미세유체 디바이스 (100, 200, 230, 280, 290, 300), 뿐만 아니라 본원에 설명된 다른 미세유체 시스템 컴포넌트들 중 어느 하나와 동일한 또는 상이한 DEP 구성을 가질 수도 있다.
도 2d 내지 도 2f 의 미세유체 디바이스 (250) 는 지지 구조 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 지지 구조 (104) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수 있음), 미세유체 회로 구조 (256), 및 커버 (도 2d 내지 도 2f 에서 보이지 않지만, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 커버 (122) 와 동일하거나 일반적으로 유사할 수도 있음) 를 포함한다. 미세유체 회로 구조 (256) 는, 도 1a 에 도시된 디바이스 (100) 의 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 와 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있는 프레임 (252) 및 미세유체 회로 재료 (260) 를 포함한다. 도 2d 에 나타낸 바와 같이, 미세유체 회로 재료 (260) 에 의해 정의된 미세유체 회로 (262) 는 다수의 격리 챔버들 (266) 이 유체적으로 접속되는 다수의 채널들 (264)(2 개가 도시되지만 더 많이 존재할 수 있음) 을 포함할 수 있다.
각각의 격리 챔버 (266) 는 고립 구조 (272), 고립 구조 (272) 내의 고립 영역 (270), 및 접속 영역 (268) 을 포함할 수 있다. 미세유체 채널 (264) 에서의 근위 개구 (274) 로부터 고립 구조 (272) 에서의 원위 개구 (276) 까지, 접속 영역 (268) 은 미세유체 채널 (264) 을 고립 영역 (270) 에 유체적으로 접속시킨다. 일반적으로, 도 2b 및 도 2c 의 상기 논의에 따르면, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 유체 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 챔버들 (266) 의 각각의 접속 영역들 (268) 안으로 및/또는 밖으로 제 1 배지 (254) 의 세컨더리 흐름들 (282) 을 생성할 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 각각의 격리 챔버 (266) 의 접속 영역 (268) 은 일반적으로, 미세유체 채널 (264) 로의 근위 개구 (274) 와 고립 구조 (272) 로의 원위 개구 (276) 사이에서 확장하는 영역을 포함한다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 는 세컨더리 흐름 (282) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 더 클 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 (도 2d 에 도시된 바와 같이) 고립 영역 (270) 을 향해 재지향되지 않고 접속 영역 (268) 으로 확장할 것이다. 대안으로, 도 2f 에 예시된 바와 같이, 접속 영역 (268) 은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 작은 길이 (Lcon) 를 가질 수 있고, 이 경우에서 세컨더리 흐름 (282) 은 접속 영역 (268) 을 통해 확장하고 고립 영역 (270) 을 향해 재지향될 것이다. 이 후자의 상황에서, 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합은 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 커서, 세컨더리 흐름 (282) 이 고립 영역 (270) 안으로 확장하지 않을 것이다. 접속 영역 (268) 의 길이 (Lcon) 가 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 또는 접속 영역 (268) 의 길이들 (LC1 및 LC2) 의 합이 최대 침투 깊이 (Dp) 보다 크든 아니든, 최대 속도 (Vmax) 를 초과하지 않는 미세유체 채널 (264) 에서의 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 은 침투 깊이 (Dp) 를 갖는 세컨더리 흐름을 생성할 것이고, 격리 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 에서 마이크로-객체들 (도시되지 않지만, 도 2e 에 도시된 마이크로-객체들 (246) 과 동일하거나 또는 일반적으로 유사할 수 있음) 은 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 의 흐름 (278) 에 의해 고립 영역 (270) 밖으로 인출되지 않을 것이다. 또한, 미세유체 채널 (264) 에서의 흐름 (278) 은 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 안으로 잡다한 재료들 (미도시) 을 인출하지도 않을 것이다. 이와 같이, 확산은, 미세유체 채널 (264) 에서 제 1 배지 (254) 내의 성분들이 미세유체 채널 (264) 로부터 격리 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 내의 제 2 배지 (258) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 마찬가지로, 확산은, 격리 챔버 (266) 의 고립 영역 (270) 에서의 제 2 배지 (258) 내의 성분들이 고립 영역 (270) 으로부터 미세유체 채널 (264) 내의 제 1 배지 (254) 로 이동할 수 있는 유일한 메커니즘이다. 제 1 배지 (254) 는 제 2 배지 (258) 와 동일한 배지일 수 있고, 또는 제 1 배지 (258) 는 제 2 배지 (258) 와 상이한 배지일 수 있다. 대안으로, 제 1 배지 (254) 및 제 2 배지 (258) 는 동일하게 시작할 수 있고, 그 후 예를 들어 고립 영역 (270) 내의 하나 이상의 세포들에 의한 제 2 배지의 컨디셔닝을 통해, 또는 미세유체 채널 (264) 을 통해 흐르는 배지를 변경함으로써 상이하게 될 수 있다.
도 2e 에 예시된 바와 같이, 미세유체 채널 (264) 내의 (즉, 도 2d 에서 화살표들 (482) 에 의해 표시된 미세유체 채널을 통한 유체 배지 흐름의 방향을 가로질러 취해진) 미세유체 채널들 (264) 의 폭 (Wch) 은 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 에 실질적으로 수직하고 따라서 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 에 실질적으로 평행할 수 있다. 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 및 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 은 그러나, 서로 실질적으로 수직할 필요는 없다. 예를 들어, 근위 개구 (274) 의 폭 (Wcon1) 이 배향되는 축 (미도시) 과 원위 개구 (276) 의 폭 (Wcon2) 이 배향되는 다른 축 간의 각도는 수직 외 및 따라서 90°이외일 수 있다. 다르게 배향된 각도들의 예들은 다음의 범위들 중 어느 하나의 각도들을 포함한다: 약 30°내지 약 90°, 약 45°내지 약 90°, 약 60°내지 약 90°등.
격리 챔버들 (예를 들어, 124, 126, 128, 130, 224, 226, 228, 또는 266) 의 다양한 실시형태들에서, 고립 영역 (예를 들어, 240 또는 270) 은 복수의 마이크로-객체들을 포함하도록 구성된다. 다른 실시형태들에서, 고립 영역은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 또는 유사한 상대적으로 작은 수의 마이크로-객체들 만을 포함하도록 구성될 수 있다. 따라서, 고립 영역의 체적은, 예를 들어 적어도 1x106, 2x106, 4x106, 6x106 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 약 50-1000 마이크론, 50-500 마이크론, 50-400 마이크론, 50-300 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 70-500 마이크론, 70-400 마이크론, 70-300 마이크론, 70-250 마이크론, 70-200 마이크론, 70-150 마이크론, 90-400 마이크론, 90-300 마이크론, 90-250 마이크론, 90-200 마이크론, 90-150 마이크론, 100-300 마이크론, 100-250 마이크론, 100-200 마이크론, 100-150 마이크론, 및 100-120 마이크론. 일부 다른 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 폭 (Wch) 은 약 200-800 마이크론, 200-700 마이크론, 또는 200-600 마이크론의 범위에 있을 수 있다. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 다른 범위들 (예를 들어, 위에 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 또한, 미세유체 채널 (122) 의 폭 (Wch) 은 격리 챔버의 근위 개구 외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 격리 챔버는 약 30 내지 약 200 마이크론, 또는 약 50 내지 약 150 마이크론의 높이를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 격리 챔버는 약 1x104 내지 3x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 2x106 제곱 마이크론, 4x104 내지 1x106 제곱 마이크론, 2x104 내지 5x105 제곱 마이크론, 2x104 내지 1x105 제곱 마이크론 또는 약 2x105 내지 2x106 제곱 마이크론의 단면적을 갖는다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 20-100 마이크론, 20-90 마이크론, 20-80 마이크론, 20-70 마이크론, 20-60 마이크론, 20-50 마이크론, 30-100 마이크론, 30-90 마이크론, 30-80 마이크론, 30-70 마이크론, 30-60 마이크론, 30-50 마이크론, 40-100 마이크론, 40-90 마이크론, 40-80 마이크론, 40-70 마이크론, 40-60 마이크론, 또는 40-50 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 높이 (Hch) 는 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다. 미세유체 채널 (122) 의 높이 (Hch) 는 격리 챔버의 근위 개구 이외의 미세유체 채널의 영역들에서 이들 범위들 중 어느 하나에 있도록 선택될 수 있다.
격리 챔버의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다음의 범위들 중 어느 하나 내에 있을 수 있다: 500-50,000 제곱 마이크론, 500-40,000 제곱 마이크론, 500-30,000 제곱 마이크론, 500-25,000 제곱 마이크론, 500-20,000 제곱 마이크론, 500-15,000 제곱 마이크론, 500-10,000 제곱 마이크론, 500-7,500 제곱 마이크론, 500-5,000 제곱 마이크론, 1,000-25,000 제곱 마이크론, 1,000-20,000 제곱 마이크론, 1,000-15,000 제곱 마이크론, 1,000-10,000 제곱 마이크론, 1,000-7,500 제곱 마이크론, 1,000-5,000 제곱 마이크론, 2,000-20,000 제곱 마이크론, 2,000-15,000 제곱 마이크론, 2,000-10,000 제곱 마이크론, 2,000-7,500 제곱 마이크론, 2,000-6,000 제곱 마이크론, 3,000-20,000 제곱 마이크론, 3,000-15,000 제곱 마이크론, 3,000-10,000 제곱 마이크론, 3,000-7,500 제곱 마이크론, 또는 3,000 내지 6,000 제곱 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 미세유체 채널 (예를 들어, 122) 의 단면적은 다른 범위들 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 약 1-600 마이크론, 5-550 마이크론, 10-500 마이크론, 15-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-500 마이크론, 40-400 마이크론, 60-300 마이크론, 80-200 마이크론, 또는 약 100-150 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 는 상기 예들과 상이한 범위 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 에 있을 수 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 다음의 범위들 중 어느 하나에 있을 수 있다: 20-500 마이크론, 20-400 마이크론, 20-300 마이크론, 20-200 마이크론, 20-150 마이크론, 20-100 마이크론, 20-80 마이크론, 20-60 마이크론, 30-400 마이크론, 30-300 마이크론, 30-200 마이크론, 30-150 마이크론, 30-100 마이크론, 30-80 마이크론, 30-60 마이크론, 40-300 마이크론, 40-200 마이크론, 40-150 마이크론, 40-100 마이크론, 40-80 마이크론, 40-60 마이크론, 50-250 마이크론, 50-200 마이크론, 50-150 마이크론, 50-100 마이크론, 50-80 마이크론, 60-200 마이크론, 60-150 마이크론, 60-100 마이크론, 60-80 마이크론, 70-150 마이크론, 70-100 마이크론, 및 80-100 마이크론. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 은 상기 예들과 상이 (예를 들어, 위에서 열거된 엔드포인트들 중 어느 하나에 의해 정의된 범위) 할 수 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 접속 영역의 근위 개구의 폭 (Wpr) 은 적어도 격리 챔버가 그에 대해 의도되는 마이크로-객체 (예를 들어, 세포와 같은 생물학적 마이크로-객체) 의 최대 치수만큼 클 수도 있다. 예를 들어, 폭 (Wpr) 은 약 50 마이크론, 약 60 마이크론, 약 100 마이크론, 약 200 마이크론, 약 300 마이크론일 수도 있거나, 약 50-300 마이크론, 약 50-200 마이크론, 약 50-100 마이크론, 약 75-150 마이크론, 약 75-100 마이크론, 또는 약 200-300 마이크론의 범위에 있을 수도 있다.
격리 챔버들의 다양한 실시형태들에서, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 다음의 비율들 중 어느 하나 이상일 수 있다: 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 또는 그 이상. 상기의 것은 단지 예들이며, 근위 개구 (예를 들어, 234) 에서 접속 영역 (236) 의 길이 (Lcon) 대 접속 영역 (예를 들어, 236) 의 폭 (Wcon) 의 비율은 상기 예들과 상이할 수 있다.
미세유체 디바이스들 (100, 200, 230, 250, 280, 290, 320, 400, 450, 500, 700) 의 다양한 실시형태들에서, Vmax 는 대략 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5 마이크로리터/초로 설정될 수 있다.
격리 챔버들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 챔버의 고립 영역 (예를 들어, 240) 의 체적은, 예를 들어 적어도 5x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 6x106, 8x106, 1x107, 5x107, 1x108, 5x108, 또는 8x108 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 격리 챔버들을 갖는 미세유체 디바이스들의 다양한 실시형태들에서, 격리 챔버의 체적은 약 5x105, 6x105, 8x105, 1x106, 2x106, 4x106, 8x106, 1x107, 3x107, 5x107, 또는 약 8x107 세제곱 마이크론, 또는 그 이상일 수 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 격리 챔버의 체적은 약 1 나노미터 내지 약 50 나노미터, 2 나노미터 내지 약 25 나노미터, 2 나노미터 내지 약 20 나노미터, 약 2 나노미터 내지 약 15 나노미터, 또는 약 2 나노미터 내지 약 10 나노미터일 수도 있다.
다양한 실시형태에서, 미세유체 디바이스는, 본원에 논의된 실시형태들 중 어느 하나로서 구성된 격리 챔버들을 갖고, 여기서 미세유체 디바이스는 약 5 내지 약 10 개의 격리 챔버들, 약 10 내지 약 50 개의 격리 챔버들, 약 100 내지 약 500 개의 격리 챔버들; 약 200 내지 약 1000 개의 격리 챔버들, 약 500 내지 약 1500 개의 격리 챔버들, 약 1000 내지 약 2000 개의 격리 챔버들, 또는 약 1000 내지 약 3500 개의 격리 챔버들을 갖는다. 격리 챔버들은 모두 동일한 사이즈일 필요는 없고 다양한 구성들 (예를 들어, 격리 챔버 내의 상이한 폭들, 상이한 특징들) 을 포함할 수도 있다.
도 2g 는 일 실시형태에 따른 미세유체 디바이스 (280) 를 예시한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스 (280) 는 미세유체 디바이스 (100) 의 양식화된 다이어그램이다. 실제로, 미세유체 디바이스 (280) 및 그 구성 회로 엘리먼트들 (예를 들어, 채널들 (122) 및 격리 챔버들 (128)) 은 본원에 논의된 치수들을 가질 것이다. 도 2g 에 예시된 미세유체 회로 (120) 는 2 개의 포트들 (107), 4 개의 별개의 채널들 (122) 및 4 개의 별개의 흐름 영역들 (106) 을 갖는다. 미세유체 디바이스 (280) 는 각각의 미세유체 채널 (122) 에서 개방된 복수의 격리 챔버들을 더 포함한다. 도 2g 에 예시된 미세유체 디바이스에서, 격리 챔버들은 도 2c 에 예시된 펜들과 유사한 지오메트리를 갖고, 따라서 양자의 접속 영역들 및 고립 영역들을 갖는다. 따라서, 미세유체 회로 (120) 는 스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내의 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 채널들 (122)) 및 비-스윕 영역들 (예를 들어, 세컨더리 흐름 (244) 의 최대 침투 깊이 (Dp) 내에 있지 않은 접속 영역들 (236) 의 부분들 및 고립 영역들 (240)) 양자 모두를 포함한다.
E. 시스템 네스트
도 3a 및 도 3b 는 본 개시에 따른 미세유체 디바이스들 (예를 들어, 100, 200, 230, 250, 280, 290, 300) 을 동작 및 관측하는데 사용될 수 있는 시스템 (150) 의 다양한 실시형태들을 나타낸다. 도 3a 에 예시된 바와 같이, 시스템 (150) 은 미세유체 디바이스 (100)(미도시), 또는 본원에 설명된 임의의 다른 미세유체 디바이스를 홀딩하도록 구성된 구조 ("네스트 (nest)")(300) 를 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 미세유체 디바이스 (320) (예를 들어, 광학적으로-작동된 동전기 디바이스 (100)) 와 인터페이스하고 전원 (192) 으로부터 미세유체 디바이스 (320) 로 전기적 접속들을 제공할 수 있는 소켓 (302) 을 포함할 수 있다. 네스트 (300) 는 집적된 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 더 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 미세유체 디바이스 (320) 내의 전극들의 쌍 양단에 인가되도록 바이어싱 전압을 소켓 (302) 에 공급하도록 구성될 수 있다. 따라서, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 전원 (192) 의 부분일 수 있다. 미세유체 디바이스 (320) 에 바이어싱 전압을 인가하는 능력은, 바이어싱 전압이, 미세유체 디바이스 (320) 가 소켓 (302) 에 의해 홀딩되는 경우 항상 인가될 것이라는 것을 의미하지는 않는다. 차라리, 대부분의 경우들에서, 바이어싱 전압은 간헐적으로, 예를 들어 미세유체 디바이스 (320) 에서 유전영동 또는 전기습윤과 같은 동전기적 힘들의 생성을 용이하게 하도록 필요할 때에만, 인가될 것이다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 네스트 (300) 는 인쇄 회로 기판 어셈블리 (PCBA)(322) 를 포함할 수 있다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 PCBA (322) 상에 장착되고 이 안에 전기적으로 집적될 수 있다. 예시적인 지지체는 PCBA (322) 상에 또한 장착된 소켓 (302) 을 포함한다.
통상적으로, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기 (미도시) 를 포함할 것이다. 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 은 파형 생성기로부터 수신된 파형을 증폭시키도록 구성된 파형 증폭 회로 (미도시) 및/또는 오실로스코프 (미도시) 를 더 포함할 수 있다. 오실로스코프는, 존재하는 경우, 소켓 (302) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 에 인가된 파형을 측정하도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 오실로스코프는 미세유체 디바이스 (320) 에 근접한 (및 파형 생성기에 대해 먼) 로케이션에서 파형을 측정하고, 따라서 디바이스에 실제로 인가된 파형을 측정하는데 있어서 더 큰 정확도를 보장한다. 오실로스코프 측정으로부터 획득된 데이터는, 예를 들어 파형 생성기에 피드백으로서 제공될 수 있고, 파형 생성기는 이러한 피드백에 기초하여 그 출력을 조정하도록 구성될 수 있다. 적합한 결합형 파형 생성기 및 오실로스코프의 예는 Red Pitaya™ 이다.
특정 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 제어기 (308), 예컨대 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 감지 및/또는 제어하는데 사용된 마이크로프로세서를 더 포함한다. 적합한 마이크로프로세서들의 예들은 Arduino™ 마이크로프로세서들, 예컨대 Arduino Nano™ 을 포함한다. 제어기 (308) 는 기능들 및 분석을 수행하는데 사용될 수도 있고, 또는 기능들 및 분석을 수행하도록 (도 1a 에 도시된) 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수도 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 제어기 (308) 는 인터페이스 (310)(예를 들어, 플러그 또는 커넥터) 를 통해 마스터 제어기 (154) 와 통신한다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 Red Pitaya™ 파형 생성기/오실로스코프 유닛 ("Red Pitaya 유닛") 및 Red Pitaya 유닛에 의해 생성된 파형을 증폭시키고 증폭된 전압을 미세유체 디바이스 (100) 로 패스하는 파형 증폭 회로를 포함하는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, Red Pitaya 유닛은 미세유체 디바이스 (320) 에서 증폭된 전압을 측정하고, 그 후, 미세유체 디바이스 (320) 에서 측정된 전압이 원하는 값이도록 필요에 따라 그 자신의 출력 전압을 조정하도록 구성된다. 일부 실시형태들에서, 파형 증폭 회로는, 미세유체 디바이스 (100) 에서 최대 13 Vpp 의 신호를 초래하는, PCBA (322) 상에 장착된 DC-DC 컨버터들의 쌍에 의해 생성된 +6.5V 내지 -6.5V 전력 공급을 가질 수 있다.
도 3a 에 예시된 바와 같이, 지지 구조 (300) (예를 들어, 네스트 (nest)) 는 열 제어 서브시스템 (306) 을 더 포함할 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 지지 구조 (300) 에 의해 홀딩된 미세유체 디바이스 (320) 의 온도를 조절하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 열 제어 서브시스템 (306) 은 펠티어 열전기 디바이스 (미도시) 및 냉각 유닛 (미도시) 을 포함할 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스는 미세유체 디바이스 (320) 의 적어도 하나의 표면과 인터페이스하도록 구성된 제 1 표면을 가질 수 있다. 냉각 유닛은, 예를 들어 냉각 블록 (미도시), 예컨대 수냉식 (liquid-cooled) 알루미늄 블록일 수 있다. 펠티어 열전기 디바이스의 제 2 표면 (예를 들어, 제 1 표면의 반대 표면) 은 이러한 냉각 블록의 표면과 인터페이스하도록 구성될 수 있다. 냉각 블록은 냉각 블록을 통해 냉각된 유체를 순환시키도록 구성된 유체 경로 (314) 에 접속될 수 있다. 도 3a 에 예시된 실시형태에서, 지지 구조 (300) 는 인렛 (316) 및 아웃렛 (318) 를 포함하여, 외부 저장소 (미도시) 로부터 냉각된 유체를 수신하고, 냉각된 유체를 유체 경로 (314) 안으로 그리고 냉각 블록을 통해 도입하며, 그 후 냉각된 유체를 외부 저장소로 리턴한다. 일부 실시형태들에서, 펠티어 열전기 디바이스, 냉각 유닛, 및/또는 유체 경로 (314) 는 지지 구조 (300) 의 케이싱 (312) 상에 장착될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 미세유체 디바이스 (320) 에 대한 목표 온도를 달성하도록 펠티어 열전기 디바이스의 온도를 조절하도록 구성된다. 펠티어 열전기 디바이스의 온도 조절은, 예를 들어 Pololu™ 열전기 전력 공급기 (Pololu Robotics and Electronics Corp.) 와 같은 열전기 전력 공급기에 의해 달성될 수 있다. 열 제어 서브시스템 (306) 은 아날로그 회로에 의해 제공된 온도 값과 같은 피드백 회로를 포함할 수 있다. 대안으로, 피드백 회로는 디지털 회로에 의해 제공될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 네스트 (300) 는 (예를 들어, 저항 1 kOhm+/-0.1 %, 온도 계수 +/-0.02 ppm/CO 를 갖는) 저항기 및 (예를 들어, 공칭 저항 1 kOhm+/-0.01 % 를 갖는) NTC 서미스터를 포함하는 아날로그 분압기 회로 (미도시) 인 피드백 회로를 갖는 열 제어 서브시스템 (306) 을 포함할 수 있다. 일부 경우들에서, 열 제어 서브시스템 (306) 은 피드백 회로로부터의 전압을 측정하고, 그 후 온-보드 PID 제어 루프 알고리즘에 대한 입력으로서 계산된 온도 값을 사용한다. PID 제어 루프 알고리즘으로부터의 출력은, 예를 들어 Pololu™ 모터 드라이브 (미도시) 상에서 방향성 및 펄스-폭-변조 신호 핀 양자 모두를 구동하여 열전기 전력 공급기를 작동시키고, 이에 의해 펠티어 열전기 디바이스를 제어할 수 있다.
네스트 (300) 는, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서가 인터페이스를 통해 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신하는 것을 허용하는 직렬 포트 (324) 를 포함할 수 있다. 또한, 제어기 (308) 의 마이크로프로세서는 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 과 (예를 들어, Plink 툴 (미도시) 을 통해) 통신할 수 있다. 따라서, 제어기 (308), 인터페이스 (310), 및 직렬 포트 (324) 의 조합을 통해, 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 및 열 제어 서브시스템 (306) 은 외부 마스터 제어기 (154) 와 통신할 수 있다. 이 방식으로, 마스터 제어기 (154) 는, 다른 것들 중에서, 출력 전압 조정들을 위한 스케일링 계산들을 수행함으로써 전기적 신호 생성 서브시스템 (308) 을 도울 수 있다. 외부 마스터 제어기 (154) 에 커플링된 디스플레이 디바이스 (170) 를 통해 제공된, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)(미도시) 는 열 제어 서브시스템 (306) 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 각각으로부터 획득된 온도 및 파형 데이터를 플롯 (p10t) 하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, GUI 는 제어기 (308), 열 제어 서브시스템 (306), 및 전기적 신호 생성 서브시스템 (304) 에 대한 업데이트들을 허용할 수 있다.
F. 시스템 촬상 디바이스
위에서 논의된 바와 같이, 시스템 (150) 은 촬상 디바이스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 촬상 디바이스는 광 조절 서브시스템 (330) (도 3b 참조) 을 포함한다. 광 조절 서브시스템 (330) 은 디지털 미러 디바이스 (DMD) 또는 마이크로셔터 어레이 시스템 (MSA) 을 포함할 수 있고, 이들 중 어느 하나는 광원 (332) 으로부터 광을 수신하고 수신된 광의 서브세트를 현미경 (450) 의 광학 트레인으로 송신하도록 구성될 수 있다. 대안으로, 광 조절 서브시스템 (330) 은 그 자신의 광을 생산하고 (따라서 광원 (332) 에 대한 필요성을 없애는) 디바이스, 예컨대 유기 발광 다이오드 디스플레이 (OLED), 액정 온 실리콘 (LCOS) 디바이스, 강유전성 액정 온 실리콘 디바이스 (FLCOS), 또는 투과형 액정 디스플레이 (LCD) 를 포함할 수 있다. 광 조절 서브시스템 (330) 은, 예를 들어 프로젝터일 수 있다. 따라서, 광 조절 서브시스템 (330) 은 구조화된 및 구조화되지 않은 광 양자 모두를 방출할 수 있다. 적합한 광 조절 서브시스템 (330) 의 일 예는 Andor Technologies™ 로부터의 Mosaic™ 시스템이다. 특정 실시형태들에서, 시스템 (150) 의 촬상 모듈 (164) 및/또는 동기 모듈 (162) 은 광 조절 서브시스템 (330) 을 제어할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스는 현미경 (350) 을 더 포함한다. 이러한 실시형태들에서, 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 상에 장착되도록 개별적으로 구성될 수 있다. 현미경 (350) 은, 예를 들어 표준 연구-등급 광 현미경 또는 형광 현미경일 수 있다. 따라서, 네스트 (300) 는 현미경 (350) 의 스테이지 (344) 상에 장착되도록 구성될 수도 있고/있거나 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 부분 상에 장착하도록 구성될 수 있다. 다른 실시형태들에서, 본원에 설명된 네스트 (300) 및 광 조절 서브시스템 (330) 은 현미경 (350) 의 일체형 컴포넌트들일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 현미경 (450) 은 하나 이상의 검출기들 (348) 을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 검출기 (348) 는 촬상 모듈 (164) 에 의해 제어된다. 검출기 (348) 는 아이 피스 (eye piece), 전하-결합 디바이스 (CCD), 카메라 (예를 들어, 디지털 카메라), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적어도 2 개의 검출기들 (348) 이 존재하면, 하나의 검출기는 예를 들어, 고속-프레임율 (fast-frame-rate) 카메라일 수 있는 한편, 다른 검출기는 고 감도 카메라일 수 있다. 또한, 현미경 (350) 은 미세유체 디바이스 (320) 로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고, 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부분을 하나 이상의 검출기들 (348) 상에 포커싱하도록 구성된 광학 트레인을 포함할 수 있다. 현미경의 광학 트레인은 또한, 각각의 검출기 상의 최종 배율이 상이할 수 있도록, 상이한 검출기들에 대한 상이한 튜브 렌즈들 (미도시) 을 포함할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 촬상 디바이스는 적어도 2 개의 광원들을 사용하도록 구성된다. 예를 들어, 제 1 광원 (332) 은 (예를 들어, 광 조절 서브시스템 (330) 을 통해) 구조화된 광을 생산하도록 사용될 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 제공하도록 사용될 수 있다. 제 1 광원 (332) 은 광학적으로-작동된 전기역학 및/또는 형광성 여기를 위해 구조화된 광을 생산할 수 있고, 제 2 광원 (334) 은 밝은 필드 조명을 제공하도록 사용될 수 있다. 이들 실시형태들에서, 동기 모듈 (164) 은 제 1 광원 (332) 을 제어하도록 사용될 수 있고, 촬상 모듈 (164) 은 제 2 광원 (334) 을 제어하도록 사용될 수 있다. 현미경 (350) 의 광학 트레인은 (1) 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 구조화된 광을 수신하고, 이 구조화된 광을 광학적으로-작동된 전기역학 디바이스와 같은 미세유체 디바이스에서의 적어도 제 1 영역에 포커싱하고, (2) 미세유체 디바이스로부터 반사 및/또는 방출된 광을 수신하고 이러한 반사 및/또는 방출된 광의 적어도 일부를 검출기 (348) 로 포커싱하도록 구성될 수 있다. 광학 트레인은 또한, 디바이스가 네스트 (300) 에 의해 홀딩되는 경우, 제 2 광원으로부터 비구조화된 광을 수신하고, 이 비구조화된 광을 미세유체 디바이스의 적어도 제 2 영역 상에 포커싱하도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 제 1 및 제 2 영역들은 오버랩하는 영역들일 수 있다. 예를 들어, 제 1 영역은 제 2 영역의 서브세트일 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 부가적으로 또는 대안적으로 임의의 적합한 파장의 광을 가질 수 있는 레이저를 포함할 수 있다. 도 3b 에 도시된 광학 시스템의 표현은 단지 개략적인 표현이며, 광학 시스템은 추가적인 필터들, 노치 필터들, 렌즈들 등을 포함할 수 있다. 제 2 광원 (334) 이 명암 및/또는 형광 여기에 대한 하나 이상의 광원(들) 뿐만 아니라 레이저 조명을 포함할 때, 광원(들)의 물리적 배열은 도 3b 에 도시된 것과 다를 수 있으며, 레이저 조명은 광학 시스템 내의 임의의 적절한 물리적 위치에 도입될 수 있다. 광원 (432) 및 광원 (402)/광 변조 서브시스템 (404) 의 개략적인 위치는 상호 교환될 수 있다.
도 3b 에서, 제 1 광원 (332) 은, 시스템 (355)(미도시) 의 현미경 (350) 의 광학 트레인에 구조화된 광을 제공하는, 광 조절 서브시스템 (330) 에 광을 공급하는 것으로 도시된다. 제 2 광원 (334) 은 비구조화된 광을 빔 스플리터 (336) 를 통해 광학 트레인에 제공하는 것으로 도시된다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 구조화된 광 및 제 2 광원 (334) 으로부터의 비구조화된 광은 빔 스플리터 (336) 로부터 광학 트레인을 통해 함께 이동하여 제 2 빔 스플리터 (또는 광 조절 서브시스템 (330) 에 의해 제공된 광에 따라, 이색성 필터 (338)) 에 도달하며, 여기서 광은 대물렌즈 (336) 를 통해 샘플 평면 (342) 으로 아래로 반사된다. 샘플 평면 (342) 으로부터 반사 및/또는 방출된 광은 그 후, 대물렌즈 (340) 를 통해, 빔 스플리터 및/또는 이색성 필터 (338) 를 통해, 이색성 필터 (346) 로 위로 다시 이동한다. 이색성 필터 (346) 에 도달하는 광의 일부 만이 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다.
일부 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 블루 광을 방출한다. 적합한 이색성 필터 (346) 로, 샘플 평면 (342) 으로부터 반사된 블루 광은 이색성 필터 (346) 를 통과하고 검출기 (348) 에 도달할 수 있다. 반대로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 구조화된 광은 샘플 평면 (342) 으로부터 반사되지만, 이색성 필터 (346) 를 통과하지 않는다. 이 예에서, 이색성 필터 (346) 는 495 nm 보다 긴 파장을 갖는 가시 광을 필터링한다. 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터의 광의 이러한 필터링은 단지, 광 조절 서브시스템으로부터 방출된 광이 495 nm 보다 짧은 임의의 파장을 포함하지 않는다면 (도시된 바와 같이) 완료될 것이다. 실제로, 광 조절 서브시스템 (330) 으로부터 오는 광이 495 nm 보다 짧은 파장들 (예를 들어, 블루 파장들) 을 포함하면, 광 조절 서브시스템으로부터의 광의 일부는 필터 (346) 를 통과하여 검출기 (348) 에 도달한다. 이러한 실시형태에서, 필터 (346) 는 제 1 광원 (332) 및 제 2 광원 (334) 으로부터 검출기 (348) 에 도달하는 광의 양 간의 균형을 변화시키도록 작용한다. 이것은, 제 1 광원 (332) 이 제 2 광원 (334) 보다 상당히 더 강한 경우 유리할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 제 2 광원 (334) 은 레드 광을 방출할 수 있고, 이색성 필터 (346) 는 레드 광 외의 가시 광 (예를 들어, 650 nm 보다 짧은 파장을 갖는 가시 광) 을 필터링할 수 있다.
G. 코팅 용액들 및 코팅제들.
이론에 의헤 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 및/또는 EW-구성된 미세유체 디바이스) 내에서의 생물학적 마이크로-객체 (예를 들어, 생물학적 세포) 의 유지보수는, 미세유체 디바이스와 그 안에 유지되는 생물학적 마이크로-객체(들) 사이의 일차 인터페이스를 제공하는 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 미세유체 디바이스의 적어도 하나 이상의 내부 표면들이 컨디셔닝 또는 코팅된 경우, 용이하게 될 수도 있다 (즉, 생물학적 마이크로-객체는 미세유체 디바이스 내에서 증가된 생존 능력, 더 큰 증식 및/또는 더 큰 운반가능성을 나타낸다). 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 내부 표면들 중 하나 이상 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스의 전극 활성화 기판의 내부표면, 미세유체 디바이스의 커버, 및/또는 회로 재료의 표면들) 은 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 원하는 층을 생성하기 우해 코팅 용액 및/또는 코팅제에 의해 처리 또는 개질될 수도 있다.
코팅은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 전 또는 후에 도포될 수도 있거나, 생물학적 마이크로-객체(들) 과 동시에 도입될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 은 하나 이상의 코팅제들을 포함하는 유체 배지에서 미세유체 디바이스 내로 들여와 질 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (예를 들어, DEP-구성된 미세유체 디바이스) 의 내부 표면(들) 은 미세유체 디바이스 내로 생물학적 마이크로-객체(들) 의 도입 이전에 코팅제를 포함하는 코팅 용액으로 처리 또는 "프라이밍" 된다.
일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 적어도 하나의 표면은 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지 및/또는 증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하는 (예를 들어, 이하에 기술된 바와 같이 컨디셔닝된 표면을 제공하는) 코팅 재료를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 실질적으로 모든 내부 표면들은 코팅 재료를 포함한다. 코팅된 내부 표면(들) 은 흐름 영역 (예를 들어, 채널), 챔버, 또는 격리 챔버, 또는 이들의 조합의 표면을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 챔버들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 다른 실시형태들에서, 복수의 흐름 영역들 또는 채널들 각각은 코팅 재료들로 코팅된 적어도 하나의 내부 표면을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 복수의 격리 챔버들 각각 및 복수의 채널들 각각의 적어도 하나의 내부 표면은 코팅 재료들로 코팅된다.
코팅제/용액. 혈청 또는 혈청 인자들, 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리머들, 계면활성제들, 효소들, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 코팅제/코팅 용액이 사용될 수 있다.
폴리머-기반 코팅 재료들. 적어도 하나의 내부 표면은 폴리머를 포함하는 코팅 재료를 포함할 수도 있다. 폴리머는 적어도 하나의 표면에 공유결합 또는 비공유결합될 수도 있다 (또는 비특정적으로 부착될 수도 있다). 폴리머는 예를 들어 블록 폴리머들 (및 코폴리머들), 성형 폴리머들 (성형 코폴리머들), 및 그래프트 또는 빗살모양 폴리머들 (그래프트 코폴리머들) 에서 발견되는 다양한 구조성 모티프들을 가질 수도 있으며, 이들 모두는 여기에 개시된 방법들에 적합할 수도 있다.
폴리머는 알킬렌 에테르 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 매우 다양한 알킬렌 에테르 함유 폴리머들이 여기에 기술된 미세유체 디바이스들에서의 사용을 위해 적합할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 비제한적인 예시의 클래스는 폴리머 사술 내에 상이한 비율들로 및 상이한 위치들에서 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 폴리프로필렌 옥사이드 (PPO) 서브유닛들의 블록들을 포함하는 양쪽 친매성 비이온 블록 코폴리머들이다. Pluronic® 폴리머들 (BASF) 은 이러한 타입의 블록 코폴리머들이고, 살아있는 세포들과 접촉할 때 사용하기에 적합한 것으로 본 기술에서 알려져 있다. 폴리머들은 평균 분자 질량 (MW) 에서 약 2000Da 로부터 약 20KDa 까지의 범위에 있을 수도 있다. 일부 실시형태들에서, PEO-PPO 블록 코폴리머는 약 10 (예를 들어, 12-18) 보다 큰 친수성-친유성 밸런스 (HLB) 를 가질 수 있다. 코팅된 표면을 산출하기 위해 유용한 특정의 Pluronic® 폴리머들은 Pluronic® L44, L64, P85, 및 F127 (F127NF 를 포함) 을 포함한다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 다른 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에티렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 카르복실릭 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 카르복실릭 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리락틱 애시드 (PLA) 이다. 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 폴리머 백본의 말단 또는 폴리머의 백본으로부터의 펜던트 (pendant) 에서 포스페이트 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 술포닉 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 술포닉 애시드 서브유닛은 알킬, 알케닐 또는 방향족 모이어티 포함 서브유닛일 수도 있다. 하나의 비제한적인 예는 폴리스티렌 술포닉 애시드 (PSSA) 또는 폴리아네톨 술포닉 애시드이다. 추가의 실시형태들에서, 코팅 재료는 아민 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 폴리아미노 폴리머는 천연 폴리아민 폴리머 또는 합성 폴리아민 폴리머를 포함할 수도 있다. 천연 폴리아민들의 예들은 스페르민, 스페르미딘, 및 푸트레신을 포함한다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 당류 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 비제한적인 예에서, 크산탄 검 또는 덱스트란과 같은 다당류들은 미세유체 디바이스에서 세포 스티킹 (sticking) 을 감소시키거나 방지할 수 있는 재료를 형성하는데 적합할 수도 있다. 예를 들어, 약 3kDa 의 사이즈를 갖는 덱스트란 폴리머는 미세유체 디바이스 내의 표면을 위한 코팅 재료를 제공하기 위해 사용될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 뉴클레오티드 모이어티들을 포함하는 폴리머, 즉 핵산을 포함할 수도 있으며, 이것은 리보뉴클레오티드 모이어티들 또는 데옥시리보뉴클레오티드 모이어티들을 가져서 고분자전해질 표면을 제공할 수도 있다. 핵산은 천연 뉴클레오티드 모이어티들만을 포함할 수도 있거나 제한 없이 7-디아자아데닌, 펜토오스, 메틸 포스포네이트 또는 포스포로티오에이트 모이어티들과 같은 핵염기, 리보오스 또는 포스페이트 모이어티 유사체들을 포함하는 비천연 뉴클레오티브 모이어티들을 포함할 수도 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 아미노 애시드 모이어티들을 포함하는 폴리머는 천연 아미노 액시드 포함 폴리머 또는 비천연 아미노 액시드 포함 폴리머를 포함할 수도 있으며, 이들 중 어느 것은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 단백질은 코팅제들로서 알부민 및/또는 하나 이상의 다른 유사한 단백질들을 포함하는 소 혈청 알부민 (BSA) 및/또는 혈청 (또는 다수의 상이한 형청들의 조합) 일 수도 있다. 혈청은 신생 우아 혈청, 양 혈청, 염소 혈청, 말 혈청 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 임의의 편리한 소스로부터일 수 있다. 특정 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 BSA 는 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 1 mg/mL 로부터 약 100 mg/mL 까지의 범위에서 존재한다. 특정 실시형태들에서, 코팅 용액 내의 혈청은 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 값을 포함하는 약 20% (v/v) 로부터 약 50% v/v 까지의 범위에서 존재할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, BSA 는 5 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있지만, 다른 실시형태들에서, BSA 는 70 mg/mL 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재할 수도 있다. 특정 실시형태들에서, 혈청은 30% 로 코팅 용액 내에서 코팅제로서 존재한다. 일부 실시형태들에서, 세포외 기질 (ECM) 단백질은 세포 성장을 조성하기 위해 최적화된 세포 부착을 위해 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다. 코팅 재료에 포함될 수도 있는 세포 기질 단백질은 콜라겐, 엘라스틴, RGD-함유 펩티드 (예를 들어, 피브로넥틴), 또는 라미닌을 포함할 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또 다른 실시형태들에서, 성장 인자들, 사이토킨들, 호르몬들 또는 다른 세포 시그널링 종이 미세유체 디바이스의 코팅 재료 내에 제공될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 또는 아미노 애시드 모이어티들 중 2 이상을 함유하는 폴리머를 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 폴리머 컨디셔닝된 표면은 각각 알킬렌 옥사이드 모이어티들, 카르복실릭 애시드 모이어티들, 술포닉 애시드 모이어티들, 포스페이트 모이어티들, 당류 모이어티들, 뉴클레오티드 모이어티들, 및/또는 아미노 애시드 모이어티들을 갖는 2 이상의 폴리머의 혼합물을 포함할 수도 있으며, 그것은 코팅 재료 내로 독립적으로 또는 동시에 통합될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료들. 일부 실시형태들에서, 적어도 하나의 내부 표면은 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하는 공유결합으로 연결된 분자들을 포함하여, 그러한 세포들에 대한 컨디셔닝된 표면을 제공한다.
공유결합으로 연결된 분자들은 연결기를 포함하며, 여기서 연결기는 이하에 기술된 바와 같이 미세유체 디바이스의 하나 이상의 표면들에 공유결합으로 연결된다. 연결기는 또한 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 공유결합으로 연결된다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 또는 플루오로알킬 (퍼플루오로알킬을 포함함) 모이어티들; (덱스트란을 포함할 수도 있지만 이것에 제한되지 않는) 단당류 또는 다당류; (프로파르길 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 알콜류; 폴리비닐 알콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 폴리알콜류; 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것에 제한되지 않는 알킬렌 에테르류; (폴리아크릴릭 애시드 또는 폴리비닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는) 고분자 전해질류; 아미노기들 (알킬레이티드 아민류, 히드록시알킬레이티드 아미노기, 구아니디늄과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 그것의 유도체들, 및 모르폴리닐 또는 피페라지닐과 같은, 그러나 이들에 제한되지 않는 비방향화된 질소 고리 원자를 함유하는 헤테로실릭 기들을 포함); (카르복실레이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 프로피올릭 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 카르복실릭 애시드류; (포스포네이트 음이온성 표면을 제공할 수도 있는) 에티닐 포스포닉 애시드를 포함하지만 이것에 제한되지 않는 포스포닉 애시드류; 술포네이트 음이온들; 카르복시베타인류; 술포베타인류; 술파믹 애시드류; 또는 아미노 애시드류를 포함할 수도 있다.
다양한 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식을 위해 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 공유결합으로 연결된 모이어티는 알킬 모이어티와 같은 비-폴리머 모이어티들, (퍼플루오로알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는) 플루오로알킬 모이어티와 같은 치환된 알킬 모이어티, 아미노 애시드 모이어티, 알콜 모이어티, 아미노 모이어티, 카르복실릭 애시드 모이어티, 포스포닉 애시드 모이어티, 술포닉 애시드 모이어티, 술파믹 애시드 모이어티, 또는 당류 모이어티를 포함할 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있는 폴리머 모이어티들을 포함할 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 알킬 모이어티는 선형 체인 (예를 들어, 적어도 10 개의 탄소들, 또는 적어도 14, 16, 18, 20, 22 개, 또는 그 이상의 탄소들의 선형 체인) 을 형성하는 탄소 원자들을 포함할 수도 있고, 비분기형 알킬 모이어티일 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 치환된 알킬 기 (예를 들어, 알킬 기에서의 탄소들의 일부는 플루오르화 또는 퍼플루오르화될 수 있음) 를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 알킬 기는 비-치환된 알킬 기를 포함할 수도 있는 제 2 분절 (segment) 에 결합된, 퍼플루오로알킬 기를 포함할 수도 있는 제 1 분절을 포함할 수도 있고, 여기서 제 1 및 제 2 분절들은 직접적으로 또는 (예를 들어, 에테르 결합에 의해) 간접적으로 결합될 수도 있다. 알킬 기의 제 1 분절은 연결 기에서 멀리 위치될 수도 있고, 알킬 기의 제 2 분절은 연결기에 근접하여 위치될 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 2 이상의 타입의 아미노 애시드를 포함할 수도 있는 적어도 하나의 아미노 애시드를 포함할 수도 있다. 따라서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 펩티드 또는 단백질을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 세포 성장, 생존 능력, 운반가능성, 또는 이들의 임의의 조합을 지원하기 위해 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있는 아미노 애시드를 포함할 수도 있다.
다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티는 적어도 하나의 알킬렌 옥사이드 모이어티를 포함할 수도 있고, 상술된 바와 같은 임의의 알킬렌 옥사이드 폴리머를 포함할 수도 있다. 알킬렌 에테르 함유 폴리머들의 하나의 유용한 클래스는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG MW < 100,000Da) 또는 대안적으로 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO, MW > 100,000) 이다. 일부 실시형태들에서, PEG 는 약 1000Da, 5000Da, 10,000Da 또는 20,000Da 의 MW 를 가질 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 당류를 포함할 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 단당류, 이당류, 또는 다당류일 수도 있다. 공유결합으로 연결된 당류는 표면에 대한 부착을 위해 커플링 또는 정교화 (elaboration) 를 허용하는 반응성 페어링 (pairing) 모이어티를 도입하기 위해 개질될 수도 있다. 예시적인 반응성 페어링 모이어티들은 알데히드, 알킨 또는 할로 모이어티들을 포함할 수도 있다. 다당류는 랜덤한 양식으로 개질될 수도 있으며, 여기서 당류 모노머들 각각이 개질될 수도 있거나 다당류 내의 당류 모노머들의 일부만이 표면에 직접 또는 간접으로 커플링될 수도 있는 반응성 페어링 모이어티를 제공하기 위해 개질된다. 하나의 예는 비분기형 연결자를 통해 표면에 간접적으로 커플링될 수도 있는 덱스트란 다당류를 포함할 수도 있다.
공유결합으로 연결된 모이어티는 하나 이상의 아미노기들을 포함할 수도 있다. 아미노기는 치환된 아민 모이어티, 구아니딘 모이어티, 질소 함유 헤테로시클릭 모이어티 또는 헤테로아릴 모이어티일 수도 있다. 아미노 함유 모이어티들은 미세유체 디바이스 내의, 및 선택적으로 격리 챔버들 및/또는 흐름 영역들 (예를 들어, 채널들) 내의 환경의 pH 변경을 허용하는 구조들을 가질 수도 있다.
컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 단지 한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있거나 2 이상의 상이한 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함할 수도 있다. 예를 들어, (퍼플루오로알킬을 포함하는) 플루오로알킬 컨디셔닝된 표면들은 모두 동일한, 예를 들어, 표면에 대한 동일한 연결기 및 공유결합 부착, 동일한 전체 길이, 및 플루오로알킬 모이어티를 포함하는 동일한 수의 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 복수의 공유결합으로 연결된 모이어티들을 가질 수도 있다. 대안적으로, 코팅 재료는 표면에 부착된 2 이상의 종류의 공유결합으로 연결된 모이어티를 가질 수도 있다. 예를 들어, 코팅 재료는 특정의 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 가지는 공유결합으로 연결된 알킬 또는 플루오로알킬 모이어티들을 갖는 분자들을 포함할 수도 있고, 더 큰 수의 메틸렌 또는 플루오로메틸렌 유닛들을 갖는 알킬 또는 플루오로알킬 사슬에 공유결합으로 부착된 대전된 모이어티들을 갖는 분자들의 추가의 세트를 더 포함할 수도 있으며, 이것은 코팅된 표면에서 더 덩치가 큰 (bulkier) 모이어티들을 제공하는 용량을 제공할 수도 있다. 이러한 예에서, 상이한, 덜 입체구조로 요구하는 말단들 및 더 적은 백본 원자들을 갖는 분자들의 제 1 세트는 전체 기판 표면을 기능화하고, 이것에 의해 기판 자체를 구성하는 실리콘/실리콘 옥사이드, 하프늄 옥사이드 또는 알루미나와의 원하지 않는 부착 또는 접촉을 방지하는 것을 도울 수 있다. 다른 예에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들은 표면상에서 랜덤한 양식으로 교번하는 전하들을 제시하는 양쪽성 이온 표면을 제공할 수도 있다.
컨디셔닝된 표면 특성들. 컨디셔닝된 표면의 조성은 별문제로 하고, 소수성 재료의 물리적 두께와 같은 다른 인자들은 DEP 힘에 영향을 줄 수 있다. 컨디셔닝된 표면이 기판상에 형성되는 방식 (예를 들어, 기상증착, 액상 증착, 스핀 코팅, 플러딩, 및 정전 코팅) 과 같은 여러 인자들이 컨디셔닝된 표면의 물리적 두께를 변경할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 약 1 nm 내지 약 10 nm; 약 1 nm 내지 약 7 nm; 약 1 nm 내지 약 5 nm 의 범위의 또는 이들 사이의 임의의 개개의 값의 두께를 갖는다. 다른 실시형태들에서, 공유결합으로 연결된 모이어티들에 의해 형성된 컨디셔닝된 표면은 약 10 nm 내지 약 50 nm 의 두께를 가질 수도 있다. 여러 실시형태들에서, 여기에 기술된 바와 같이 준비된 컨디셔닝된 표면은 10 nm 미만의 두께를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면의 공유결합으로 연결된 모이어티들은 미세유체 디바이스의 표면 (예를 들어, DEP 구성 기판 표면) 에 공유결합으로 연결될 때 단분자층을 형성할 수도 있고, 10 nm 미만 (예를 들어, 5 nm 미만, 또는 약 1.5 내지 3.0 nm) 의 두께를 가질 수도 있다. 이들 값들은 약 30 nm 의 범위에서의 두께를 갖는 CYTOP® (Asahi Glass Co., Ltd. JP) 플루오로폴리머 스핀 코팅의 값들과 대조적이다. 일부 실시형태들에서, 컨디셔닝된 표면은 완벽하게 형성된 단분자층이 DEP 구성 미세유체 디바이스 내에서의 동작을 위해 적합하게 기능적이도록 요구하지 않는다.
여러 실시형태들에서, 미세유체 디바이스의 컨디셔닝된 표면을 제공하는 코팅 재료는 바람직한 전기적 특성들을 제공할 수도 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 특정의 코팅 재료로 코팅된 표면의 강건성에 영향을 주는 하나의 인자는 본질적 (intrinsic) 전하 트랩핑이다. 상이한 코팅 재료들이 전자들을 트랩할 수도 있고, 이것은 코팅 재료의 고장을 야기할 수 있다. 코팅 재료에서의 결함들은 전하 트랩핑을 증가시킬 수도 있고 코팅 재료의 추가의 고장을 야기할 수도 있다. 유사하게, 상이한 코팅 재료들은 전하 트랩핑에 영향을 줄 수도 있는 상이한 절연 내력들 (즉, 절연 파괴를 야기하는 최소 인가 전계) 을 갖는다. 특정 실시형태들에서, 코팅 재료는 전하 트랩핑의 양을 감소시키거나 제한하는 전체 구조 (예를 들어, 빽빽히 채워진 단분자층 구조) 를 가질 수 있다.
그것의 전기적 특성들에 더하여, 컨디셔닝된 표면은 또한 생물학적 분자들과 함께 사용하는데 유익한 특성들을 가질 수도 있다. 예를 들어, 플루오리네이티드 (또는 퍼플루오리네이티드) 탄소 사슬들을 함유하는 컨디셔닝된 표면은 표면 부착물의 양을 감소시킴에 있어서 알킬-말단 사슬들에 비해 이익을 제공할 수도 있다. 여기서 사용된 표면 부착물은 미세유체 디바이스의 표면상의 무분별한 재료 증착의 양을 지칭하며, 그것은 단백질 및 그것의 분해 생성물들, 핵산들 및 각각의 분해 생성물들 등과 같은 생체재료들의 영구적인 또는 반영구적인 증착을 포함할 수도 있다.
유니터리 (unitary) 또는 멀티-파트 컨디셔닝된 표면. 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 이하에 기술되는 바와 같이, 미세유체 디바이스 내의 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자들의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 이미 함유하는 분자의 반응에 의해 형성될 수도 있다. 대안적으로, 공유결합으로 연결된 코팅 재료는 그자신이 표면에 공유결합으로 연결된 표면 개질 리간드에 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티를 커플링함으로써 2-파트 시퀀스에서 형성될 수도 있다.
공유결합으로 연결된 코팅 재료를 준비하는 방법들. 일부 실시형태들에서, (예를 들어, 격리 챔버들 및/또는 흐름 영역들의 적어도 하나의 표면을 포함하는) 미세유체 디바이스의 표면에 공유결합으로 연결되는 코팅 재료는 식 1 또는 식 2 의 구조를 갖는다. 코팅 재료가 하나의 단계에서 표면에 도입될 때, 그것은 식 1 의 구조를 갖는 반면, 코팅 재료가 다수의 단계 프로세스에서 도입되는 경우, 그것은 식 2 의 구조를 갖는다.
Figure pct00001
식 1 ,
또는,
Figure pct00002
식 2
코팅 재료는 DEP-구성 또는 EW-구성 기판의 표면의 산화물들에 공유결합으로 연결될 수도 있다. DEP- 또는 EW-구성 기판은 실리콘, 실리콘 옥사이드, 알루미나, 또는 하프늄 옥사이드를 포함할 수도 있다. 산화물들은 기판의 본래의 화학적 구조의 부분으로서 제공될 수도 있거나 이하에 논의된 바와 같이 도입될 수도 있다.
코팅 재료는 산화물들과 실록산 또는 포스포닉 애시드기의 반응으로부터 형성된 실록시 또는 포스포네이트 에스테르기일 수도 있는 연결기 ("LG") 를 통해 산화물들에 부착될 수도 있다. 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 여기에 기술된 모이어티들 중 임의의 것일 수 있다. 연결기 (LG) 는 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 직접 또는 간접으로 연결될 수도 있다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 직접 연결되는 경우, 선택적 연결자 ("L") 는 존재하지 않고 n 은 0 이다. 연결기 (LG) 가 모이어티에 간접으로 연결되는 경우, 연결자 (L) 는 존재하고 n 은 1 이다. 연결자 (L) 는 선형 부분을 포함할 수도 있으며, 여기서 그 선형 부분의 백본은 본 기술에서 알려진 바와 같은 화학 결합 제한들을 받는, 규소, 탄소, 질소, 산소, 황 및 인 원자들의 임의의 조합으로부터 선택된 1 내지 200 개의 비수소 원자들을 포함할 수도 있다. 그것은 에테르, 아미노, 카르보닐, 아미도, 또는 포스포네이트 기들, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 또는 헤테로시클릭 기들의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 모이어티들의 임의의 조합으로 차단될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 10 내지 20 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 다른 실시형태들에서, 연결자 (L) 의 백본은 약 5 개의 원자들 내지 약 200 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 80 개의 원자들; 약 10 개의 원자들 내지 약 50 개의 원자들; 또는 약 10 개의 원자들 내지 약 40 개의 원자들을 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 백본 원자들은 모두 탄소 원자들이다.
일부 실시형태들에서, 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티는 다중-단계 프로세스에서 기판의 표면에 첨가될 수도 있고, 상술된 바와 같이 식 2 의 구조를 갖는다. 그 모이어티는 상술된 모이어티들 중 임의의 것일 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 반응성 모이어티 (RX) 와 반응성 페어링 모이어티 (RPX) (즉, 반응성 모이어티 (RX) 와 반응하도록 구성된 모이어티) 의 반응으로부터의 결과의 기를 나타낸다. 예를 들어, 하나의 통상적인 커플링기 (CG) 는 활성화된 에스테르, 애시드 클로라이드 등과 같은 카르복실릭 애시드의 유도체와 아미노기의 반응의 결과인 카로복사미딜기를 포함할 수도 있다. 다른 CG 는 트리아졸릴렌기, 카르복사미딜, 티오아미딜, 옥심, 메르캅틸, 디술피드, 에테르, 또는 알케닐기, 또는 반응성 모이어티의 그의 각각의 반응성 페어링 모이어티와의 반응 시에 형성될 수도 있는 임의의 다른 적합한 기를 포함할 수도 있다. 커플링기 (CG) 는 상술된 바와 같은 원소들의 임의의 조합을 포함할 수도 있는 연결자 (L) 의 제 2 단부 (즉, 미세유체 디바이스 내에서 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티에 근접한 단부) 에 위치될 수도 있다. 일부 다른 실시형태들에서, 커플링기 (CG) 는 연결자 (L) 의 백본을 차단할 수도 있다. 커플링기 (CG) 가 트리아졸릴렌인 경우, 그것은 클릭 커플링 반응으로부터 야기되는 생성물일 수도 있고 더 치환될 수도 있다 (예를 들어, 디벤조시클로옥테닐 용융 트리아졸릴렌기).
일부 실시형태들에서, 코팅 재료 (또는 표면 개질 리간드) 는 화학적 기상 증착을 사용하여 미세유체 디바이스의 내부 표면들에 증착된다. 기상 증착 프로세스는 예를 들어, 용매 배스, 음파처리, 또는 이들의 조합에 노출함으로써 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판 (DEP-구성 기판의 전극 활성화 기판 (206) 의 내부 표면 (208), 또는 EW-구성 기판의 지지 구조 (104) 의 유전체층) 을 사전 세정함으로써 선택적으로 향상될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 그러한 사전 세정은 동시에 산화된 표면 (여기에 기술된 바와 같이 공유결합으로 개질될 수도 있는 표면에서의 산화물들) 을 도입하면서 여러 불순물들을 제거할 수 있는 산소 플라즈마 클리너에서 커버 (110), 미세유체 회로 재료 (116), 및/또는 기판을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하이드로클로릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 또는 설퓨릭 애시드와 하이드로전 페록사이드의 혼합물 (예를 들어, 약 3:1 내지 약 7:1 의 범위의 설퓨릭 애시드 대 하이드로전 페록사이드의 비를 가질 수도 있는 피라냐 용액) 과 같은 액상 처리들은 산소 플라즈마 클리너 대신에 사용될 수도 있다.
일부 실시형태들에서, 기상 증착은 미세유체 디바이스 (200) 가 미세유체 회로 (120) 를 정의하는 인클로저 (102) 를 형성하기 위해 조립된 후 미세유체 디바이스 (200) 의 내부 표면을 코팅하기 위해 사용된다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 완전히 조립된 미세유체 회로 (120) 상에 그러한 코팅 재료를 증착하는 것은 미세유체 회로 재료 (116) 와 전극 활성화 기판 (206) 유전체층 및/또는 커버 (110) 사이의 약해진 결합에 의해 야기되는 박리를 방지하는데 유익할 수도 있다. 2-단계 프로세스가 채용되는 실시형태들에서, 표면 개질 리간드는 생물학적 마이크로-객체(들) 의 유지보수/증식에 적합한 생체 분자 및/또는 친수성 분자의 층을 제공하도록 구성된 모이어티의 후속적인 도입으로, 상술된 바와 같은 기상 증착을 통해 도입될 수도 있다. 후속적인 반응은 용액 내의 적합한 커플링 시약에 표면 개질된 미세유체 디바이스를 노출시킴으로써 수행될 수도 있다.
도 2h 는 컨디셔닝된 표면을 제공하는 예시적인 공유결합으로 연결된 코팅 재료를 갖는 미세유체 디바이스 (290) 의 단면도를 도시한다. 도시된 바와 같이, (개략적으로 도시된) 코팅 재료들 (298) 은 DEP 기판일 수도 있는 베이스 (286) 의 내부 표면 (294), 및 미세유체 디바이스 (290) 의 커버 (288) 의 내부 표면 (292) 양자에 공유결합으로 결합된 빽빽하게 채워진 분자들의 단분자층을 포함할 수 있다. 코팅 재료 (298) 는 일부 실시형태들에서 그리고 상술된 바와 같이 미세유체 디바이스 (290) 내의 회로 소자들 및/또는 구조들을 정의하기 위해 사용되는 미세유체 회로 재료 (미도시) 의 표면들을 포함하는, 미세유체 디바이스 (290) 의 인클로저 (284) 에 근접하고, 그것을 향해 내부로 마주하는 실질적으로 모든 내부 표면들 (294, 292) 에 증착될 수 있다. 대안적인 실시형태들에서, 코팅 재료들 (298) 은 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들의 단지 하나 또는 일부에만 증착될 수 있다.
도 2h 에 도시된 실시형태에서, 코팅 재료 (298) 는 오르가노실록산 분자들의 단분자층을 포함할 수 있고, 각각의 분자는 실록시 연결자 (296) 를 통해 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면들 (292, 294) 에 공유결합된다. 상술된 코팅 재료들 (298) 중 임의의 것이 사용될 수 있으며 (예를 들어, 알킬-말단, 플루오로알킬 말단 모이어티, PEG-말단 모이어티, 덱스트란 말단 모이어티, 또는 오르가노실록시 모이어티들에 대한 포지티브 또는 네거티브 전하들을 함유하는 말단 모이어티), 여기서 말단 모이어티는 그것의 인클로저 대향 말단 (즉, 내부 표면들 (292, 294) 에 결합되지 않고 인클로저 (284) 에 근접한 코팅 재료 (298) 의 단부자층의 부분) 에 배치된다.
다른 실시형태들에서, 미세유체 디바이스 (290) 의 내부 표면(들) (292, 294) 을 코팅하기 위해 사용되는 코팅 재료 (298) 는 음이온성, 양이온성, 또는 양쪽성 이온 모이어티들, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이론에 의해 제한되도록 의도하지 않고, 미세유체 회로 (120) 의 인클로저 (284) 의 내부 표면들에 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들을 제공함으로써, 코팅 재료 (298) 는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다. 또, 코팅 재료 (298) 가 코팅제들과 함께 사용되는 실시형태들에서, 코팅 재료 (298) 의 음이온들, 양이온들, 및/또는 양쪽성 이온들은 인클로저 (284) 내의 배지 (180) (예를 들어, 코팅 용액) 에 존재하는 비공유결합 코팅제들 (예를 들어, 용액 내의 단백질들) 의 대전된 부분들과 이온성 결합들을 형성할 수 있다.
또 다른 실시형태들에서, 코팅 재료는 친수성 코팅제를 그것의 인클로저-대향 말단에 포함하거나 제공하도록 화학적으로 개질될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 PEG 와 같은 알킬렌 에테르 함유 폴리머를 포함할 수도 있다. 일부 실시형태들에서, 코팅 재료는 덱스트란과 같은 다당류를 포함할 수도 있다. 상술된 대전된 모이어티들 (예를 들어, 양이온성 모이어티들, 음이온성 모이어티들, 및/또는 양쪽성 이온 모이어티들) 처럼, 친수성 코팅제는 수화의 결과의 물이 비생물학적 분자들 (예를 들어, 기판의 실리콘 및/또는 실리콘 산화물) 과의 상호작용들로부터 생물학적 마이크로-객체들을 분리하는 층 (또는 "실드 (shield)") 으로서 작용하도록 물 분자들과 강한 수소 결합들을 형성할 수 있다.
적절한 코팅 처리들 및 개질들의 추가의 상세들이 2016 년 4월 22일자로 출원되고, 그 전체가 참조에 의해 포함되는 미국 출원 번호 제 15/135,707 호에서 발견될 수도 있다.
H. 미세유체 디바이스의 격리 챔버들 내의 세포들의 생존 능력의 유지보수를 위한 추가적인 시스템 성분들.
세포 개체수들의 성장 및/또는 증식을 증진시키기 위해, 기능성 세포들을 유지하게 하는 환경적 조건들은 시스템의 추가적인 성분들에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 그러한 추가적인 성분들은 영양분들, 세포 성장 시그널링 종, pH 조절, 가스 교환, 온도 제어, 및 세포들로부터의 쓰레기 산물들의 제거를 제공할 수 있다.
IV. 추가 실시형태들
A. T 또는 NK 세포들을 이용한 실시형태들
어떤 경우, T 세포들은 해리된 세포 샘플에 제시될 수 있다. 이러한 경우, 방법은 해리된 세포 샘플에 대한 선택을 수행하는 단계를 더 포함하여 원래의 해리된 샘플보다 큰 백분율 및/또는 농도의 T 세포들을 갖는 분획을 고립시킨다. 이러한 방식으로, 종양 침윤 림프구 (TIL) 가 동일한 환자의 종양 샘플로부터 수득될 수 있다. 다른 경우, T 세포는 동일한 환자의 혈액에서 수득될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 동일한 환자에게서 수득된 혈액 샘플 (또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플) 중에서 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, T 세포는 적어도 하나의 고체 종양 (예를 들어, 헌혈자 또는 조직 공여자인 개체) 을 제공하는 환자가 아닌 개체로부터 수득될 수 있다. T 세포는 CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, 및 CD3으로부터 선택된 적어도 하나의 T 세포 마커를 사용함으로써 해리된 세포 샘플 또는 혈액/PBMC 샘플에서 다른 세포들로부터 분리될 수 있다. T 세포의 기원 또는 사용된 선택 절차 (존재하는 경우) 에 관계없이, 수득된 T 세포는 본원에 개시된 방법에서 클로닝 및/또는 사용될 수 있다. 예를 들어, (환자 특이적이든 또는 공여체 유래이든) T 세포들은 CAR-T 치료제를 제조하는데 사용될 수 있거나 또는 다른 타입의 면역요법, 예컨대 TILS 및 다른 치료제 (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 항체) 를 수반하는 병용 요법에 사용될 수 있다.
T 세포와 유사하게, 자연 킬러 (NK) 세포는 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, NK 세포는 Topfer et al. (2015), J. Immunol. 194 (7) : 3201-3212 에 기술된 바와 같이 CAR 치료제를 제조하는데 사용될 수 있다. NK 세포는 예를 들어 혈액 샘플 또는 조직 샘플 (예를 들어, 종양에서 수득된 해리된 세포 샘플) 에서 수득될 수 있다. NK 세포는 CD56과 같은 적어도 하나의 NK 마커를 사용하여 샘플 내의 다른 세포로부터 분리될 수 있다.
B. 외부 세포 공급처에 의존하는 실시형태들
일부 실시형태들에서, 모든 세포 공급원은 단일 환자로부터의 것이다. 이 서브섹션에서 논의된 것과 같은 다른 실시형태들에서, 세포 공급원은 상이한 환자 또는 상이한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 방법은 (예를 들어, 2 단계 프로세스로) 환자의 암 세포 및 다른 공급원으로부터의 암 세포 모두에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 적어도 하나의 B 세포를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 환자 자신의 암 세포는 (예를 들어, 환자의 암 세포가 미세유체 디바이스 상에 로딩되기 이전에) 제조 및/또는 배양되는 한편 B 세포는 암 세포주에 대해 테스트된다. T 세포 또는 NK 세포는 또한 동일한 환자 또는 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
C. 정상 세포를 이용하는 실시형태
원하는 경우, B 세포에 의해 생산되는 항체의 특이성은 암 세포 또는 비-암 세포 (예를 들어, 정상 세포) 에 결합하는 능력을 비교함으로써 평가될 수 있다. 이와 같이, 선택적으로, 상기 방법은 B 세포에 의해 생상된 항체가 비-암 세포를 결합시킬 수 있는지 여부를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 것을 더 포함할 수 있다. 비-암 세포 및 암 세포는 동일한 종양 샘플로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 비-암 세포 및/또는 암 세포는 적어도 하나의 고체 종양 샘플을 제공하는 환자 이외의 개체로부터 유래할 수 있다.
암 세포 및 비-암 세포에 항체의 결합을 식별하기 위해 동일한 미세유체 디바이스가 사용될 수 있다. 암 세포 및 비-암 세포는 미세유체 디바이스의 상이한 부분으로 로딩될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 (또는 비-암 세포) 는 B 세포와 동일한 고립 챔버 안으로 배치될 수 있고, 비-암 세포 (또는 암 세포) 는 고립 챔버가 흐름 채널 안으로 개방되는 곳에 근접한 위치까지 흐름 채널 안으로 흐를 수 있다. 다른 예에서, 암 세포 (또는 비-암 세포) 는 B 세포를 포함하는 고립 챔버에 인접하는 고립 챔버 안으로 배치될 수 있고, 그리고 비-암 세포 (또는 암 세포) 는 B 세포를 포함하는 고립 챔버가 흐름 채널 안으로 개방되는 곳에 근접한 위치까지 흐름 채널 안으로 흐를 수 있다. 또 다른 예에서, 암 세포 (또는 비-암 세포) 는 B 세포와 함께 고립 챔버에 놓일 수 있고, 비-암 세포 (또는 암 세포) 는 B 세포를 포함하는 고립 챔버에 인접하는 고립 챔버 안으로 배치될 수 있다. 암 세포 및/또는 비-암 세포의 배치와 관계없이, 동일한 마이크로유체 디바이스를 사용하여 (예를 들어, B 세포에 의해 생성된 것과 같은) 항체가 암 세포 및/또는 비-암 세포에 결합하는지 여부를 동시에 평가할 수 있다. 다른 실시형태들에서, 암 및 비-암 세포는 동일한 흐름 경로 (또는 동일한 고립 영역) 에서 순차적으로 로딩되어, (1) 항체와 암 세포 사이 및 (2) 항체 및 비-암 세포 사이의 결합의 순차적 검출을 허용할 수 있다.
V. 치료 및 치료 조성물의 방법
암이 있는 환자는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체 또는 그 단편으로 처리될 수 있다. 하나의 경우, 종양 샘플은 치료받는 동일한 환자에서 채취된다. 이 방법의 한가지 이점은 개인화된 치료가 주어진 환자를 위해 설계될 수 있고, 경우에 따라서는 개인화된 치료가 비교적 짧은 시간 내에 준비될 수 있어, 환자의 질병 상태에 필요한 시간 내에 치료 효능을 허용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태들에서, 종양 샘플을 수득한 후부터 치료까지의 시간은 최대 약 2 개월일 수 있다.
일단 B 세포에 의해 생산되는 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역이 결정되고 나면, 모든 또는 일부의 가변 시퀀스를 포함하는 다양한 다른 항체 또는 항체 단편 구조가 준비될 수 있다. 경우에 따라, 환자는 단일 사슬 항체로 치료될 수 있다. 다른 경우, 환자는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 갖는 항체 또는 그의 단편으로 치료될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔지니어링된 항체 구조물은 Fab 또는 Fab'(2) 단편, scFv, 다가 scFvs (예를 들어, 디아바디 또는 트리바디), 미니바디 (예를 들어, scFv-CH3 다이머), 이중 특이적 Abs, 또는 카멜 가변 기능성 중쇄 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 엔지니어링된 항체 구조물은 본원의 방법에 의해 식별된 항체의 임의의 변형체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 단편은 고립된 형태로 투여될 수 있다.
예를 들면, 엔지니어링된 항체 구조물은 (a) 적어도 본원의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 CDR들; (b) 적어도 본원의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR; (c) 적어도 본원의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 가변 영역; 또는 (d) 본원의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
다른 경우, 다양한 구조물이 항체 또는 단편을 사용하여 준비될 수 있다. 예를 들어, 항체는 엔지니어링된 T 세포 또는 엔지니어링된 NK 세포 상에 표시될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엔지니어링된 T 세포는 키메릭 항원 수용체 T 세포이다. T 세포는 예를 들어 환자의 종양 샘플 또는 환자로부터 수득된 혈액 샘플과 같은 항체를 디스플레이하도록 엔지니어링되기 이전에 동일한 환자로부터 수득될 수 있다. 이러한 T 세포는 항체 또는 그 단편을 발현하도록 유전적으로 엔지니어링될 수 있다. 유사하게, 다른 실시형태에서, 엔지니어링된 NK 세포는 키메릭 항원 수용체 NK 세포이다. NK 세포는 예를 들어 환자의 종양 샘플 또는 환자로부터 수득된 혈액 샘플과 같은 항체를 디스플레이하도록 엔지니어링되기 이전에 동일한 환자로부터 수득될 수 있다. 이러한 NK 세포는 항체 또는 그 단편을 발현하도록 유전적으로 엔지니어링될 수 있다.
일부 모드에서, 항체 또는 그 단편은 다른 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 이러한 경우, 병용 요법은 수술, 방사선, 화학요법, CAR-T 치료, T 세포 치료 (예컨대, 단순히 환자 자신의 T 세포, 예컨대 TILS을 증폭시키고 그것을 재도입하는 것에 의함), 다른 면역요법 (PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, VISTA, BTLA 또는 이들의 임의의 조합에 대한 억제성 항체와 같은 기능 차단 항체와 T 세포 기능을 억제하는 공지된 항원을 타겟팅하는 것에 의함), 또는 ICOS, OX40, 41BB, 항 종양 백신, 사이토카인 또는 종양 특이적 바이러스와 같은 면역 자극제의 투여일 수 있다.
VI. 표지 및 검출 방법
본원의 방법에 따라 생산된 항체는 또한 검출 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 검출가능한 표지로 표지될 수 있고, 생체내 또는 생체외에서 암 세포 (환자 자신의 종양 세포를 포함) 를 검출하거나 표지하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양을 강조하고, 수술 절제술을 개선하고, 생존율을 높이기 위해 형광단-콘쥬게이트된 (fluorophore-conjugated) 항체를 사용하여 형광 안내의 수술을 수행할 수 있다. Alexa Fluor 488과 같은 형광단이 사용될 수 있다. 항체-형광단 콘쥬게이트는 정맥 내로 주사되거나 수술 중에 절제 표면에 적용될 수 있다. 본원에서 생성된 항체는 또한 검출 또는 표지의 다른 방법에 사용될 수 있다.
예들
예 1. 종양 생검의 프로세싱 및 해리된 세포 샘플의 단편화
A. 종양 샘플의 해리
종양 샘플은 자신의 종양 절제술을 갖는 환자로부터 수득된다. 종양 절제술 당일에, 시편은 시술 직후 실험실에서 받는다. 시편은 멸균 용기에서 멸균 생리 식염수로 목욕된다. 생존 가능한 종양 조직은 메스 및 무균 포셉을 사용하여 층류 흐름 후드에서 비생존 조직 및 건강한 (비-암) 조직으로부터 해부된다. 다른 평가를 위해 생존 가능한 종양 조직의 다른 샘플이 수득될 수 있다. 해리용 종양 샘플을 칭량하고 소량의 멸균된 HBSS를 함유하는 50ml 원심분리 튜브에 보관한다. 배양 세포를 위한 배지는 10% 인간 혈청 (열은 56℃에서 30 분간 비활성화) 을 갖고, 그리고 페니실린 G (100 units/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 겐타마이신 (50 μg/ml), 헤페스 (25 mM), 및 2-메르캅토에탄올 (5.5x10-5 M) 의 최종 농도를 갖는 RPMI 1640 보충함으로써 준비된다.
조직 시편은 (기판 또는 개방 페트리 접시를 절단한) 멸균 절삭면 상에 배치된다. 멸균 메스와 포셉을 사용하여, 시편을 작은 (3 ~ 5mm) 단편으로 절단한다. 절단 단편은 gentleMACS® C 튜브로 옮겨진다. 효소 배지 (EM) 를 튜브 (0.2 - 2g 조직의 경우 5ml, 2 - 5g의 경우 10ml) 에 넣고 살짝 찰칵 소리가 들릴 때까지 캡을 돌려서 튜브를 단단히 닫는다. EM은 gentleMACS® 프로그램 실행 사이의 짧은 잠복기 동안 수술 시편에서 세포를 분산시키는데 사용된다. 효소 함유 배지, RPMI 1640은 혈청을 포함하지 않지만, 페니실린 G (100 units/ml), 스트렙토마이신 (100 μg/ml), 겐타마이신 (50 μg/ml), Fungizone® (1.25 μg/ml), 콜라게나아제 (1 mg/ml), 및 Pulmozyme® (~ 30 units/ml) 을 포함한다. 효소 스톡은 -20℃에서 보관된 건조 분말이다.
C 튜브는 수직으로 설치되어 gentleMACs 슬리브 안으로 캡측이 아래로 간다. 올바른 설치로 C 튜브가 회전 및 축방향의 힘에 견딜 수 있게 한다. 사전 정의된 프로그램은 내부 gentleMACS® 해리자 메모리에 의해 제공됩니다. 프로그램의 강도가 다양하므로, 처리할 조직의 질감에 따라 적절한 프로그램이 선택된다. 부드러운 조직은 보다 부드러운 회전 (저속) 이 필요하고 더 단단한 조직은 더 거칠고 긴 회전이 필요하다. 여러 해리 실행은 실행 사이에서 수행되는 해리 상태 평가에 의해 수행될 수 있다. 해리된 조직은 250ml 원심분리 튜브의 상부에 있는 오토클레이브된 깔때기에 배치된 오토클레이브된 와이어 메쉬를 통해 여과한다. 와이어 메쉬는 멸균 HBSS로 린싱되고 튜브는 추가 멸균 HBSS로 충진된다. 다음, 해리된 조직을 1500rpm에서 10 분간 원심 분리하여 한 번 세척한다. 상등액을 흡인하고 펠릿을 공지된 부피의 HBSS에서 재현탁한다.
B. 종양 해리를 위한 대안의 절차
gentleMACS® 기구를 사용하여 종양 해릴를 수행하는 대안으로서, 분해 완충액이 사용될 수 있다. 종양 조직은 포셉을 사용하여 쪼갠 다음 작은 조각 (2 ~ 5 mm) 으로 절단한다. 조직을 해리 완충액 (RPMI에서의 100 μg/ml DNase 및 100 unit/ml 콜라게나아제 및 10% 인간 혈청 (열은 56℃에서 30 분간 비활성화됨)) 에 배치한다. 분해는 37℃에서 30 분 동안 인큐베이터에서 진행된다. 배양 후, 샘플을 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 쉽게 흐르는 단일 세포 현탁액을 얻는다.
현탁액은 70 마이크론 필터를 통해 여과하고 10% 인간 혈청 (열은 56℃에서 30 분간 비활성화됨) 이 보충된 MACs 분리 완충액으로 세척된다. 세포 현탁액을 400xg에서 10 분간 원심 분리한다. 펠렛을 10 ml MACs 완충액으로 린싱하고 동일한 세팅에서 다시 원심 분리한다. 다음, 해리된 세포를 100 μl MACs 완충액에 재현탁한다.
C. 해리된 세포 샘플에서 세포 타입의 단편화
단일의 세포를 포함하는 해리된 세포 샘플이 상기 프로토콜, B 세포, T 세포, NK 세포 중 어느 하나를 사용하여 준비되고, 암 세포는 해리된 세포 샘플로부터 단편화될 수 있다. 항-CD20 자기 비드들은 B 세포들을 선택하는데 사용될 수 있다. 항-CD4 및/또는 항-CD8 자성 비드들은 T 세포에 대해 선택하는데 사용될 수 있다. 항-CD56 자기 비드들은 NK 세포들을 선택하는데 사용될 수 있다. 암 세포들에 특이적인 항체에 부착된 자성 비드를 사용하여 암 세포를 선택하거나 암 세포를 형태학적 평가를 사용하여 수동으로 제거할 수 있다.
제 1 세포 타입이 단편화되는 것을 타겟팅하는 항체 표지된 마이크로비드들 (108 세포당 대략 10 μl) 은 해리된 세포 샘플에 첨가되었다. 튜브는 튜브의 부드러운 플릭킹 (flicking) 과 4-8℃에서 15분 동안 배양함으로써 잘 혼합되어, 빛으로부터 차단된다. 세포에 MACs 완충액 10ml를 가하고 400xg에서 10 분간 원심 분리하여 세척한다. 상등액을 부어 (또는 흡인하여) 꺼내고 세포를 500 μl의 MACs 완충액에 재현탁한다. 새로운 컬럼이 자성 분리기에 적용된다. 컬럼은 선택된 컬럼에 대해 적절한 양의 MAC 완충액으로 린싱하는 것에 의해 프라이밍된다. 컬럼을 프라이밍한 후, 세포 현탁액을 컬럼의 상부에 적용하고, 1 x 108 세포들마다 하나의 컬럼을 사용하였다. 표지가 없는 모든 세포 (통과) 가 수집되어 다른 세포 타입의 고립을 위해 예약된다. 제 1 워시를 들어, 컬럼은 유체 세척의 총 1.5 내지 2.5 ml 에 대한 500 μl 체적으로 최소 3 회 및 최대 5 회 세척된다. 유체 흐름은, 순도에 영향을 미칠 수 있고 세포 생존력을 잃게 할 수 있는, 건조 주행을 하도록 허용되지 않고 컬럼 내에서 보존된다.
제 2 세척의 경우, 컬럼은 죽거나 또는 건조한 종양 세포들로부터의 끈적한 잔해를 세척하기 위해 콜라게나제와 DNase를 포함하는 해리 완충액 혼합물 (RPMI에서의 100 μg/ml DNase 및 100 unit/ml 콜라게나아제 및 10% 인간 혈청 (열은 56℃에서 30 분간 비활성화됨)) 로 세척된다. 제 3 세척의 경우, MACs 완충액은 세척이 완전히 깨끗해질 때까지 다시 사용된다.
컬럼은 자기 분리기로부터 제거되고, 적합한 포집 관에 배치된다. 완충액 2ml를 컬럼에 배치하고 자기적으로 표지된 세포들을 컬럼과 함께 공급된 플런저를 단단히 가함으로써 수집한다.
대안적으로, 자성 분리가 AutoMACS®에 의해 수행될 수 있다.
추가 분리 단계들은 B 세포, T 세포, NK 세포 및 암 세포들 각각을 고립시키도록 수행된다. 원하는 경우 자성 비드가 세포에서 제거된다.
예 2. 미세유체 디바이스에서의 IgG 항체들의 분비를 위한 마우스 지라세포 (mouse splenocyte) 를 스크리닝
스크린은 인간 CD45에 결합하는 IgG 타입 항체를 분비하는 마우스 지라세포를 식별하기 위해 수행되었다. 실험 설계는 다음 단계들을 포함하였다:
1. CD45 항원 코팅된 비드의 생성;
2. 마우스 지라세포 수확;
3. 세포를 미세유체 디바이스 안으로 로딩; 및
4. 항원 특이성에 대한 검정.
이들을 포함한 실험에 사용된 시약은 표 1에 나타낸다.
-시약들
명칭 벤더 카달로그 번호 로트 번호
1 슬라이드-A-라이저 MINI 투석 디바이스, 7K MWCO, 0.1mL　 써머 피어스 69560 OJ189254
2 CD45 단백질 R&D 시스템들 1430-CD 112722
3 Mg2+ 및 Ca2+를 갖는 PBS pH 7.2 피셔 BP29404
4 스트렙타비딘 코팅된 비드들 (8 μm) 스페로테크 SVP-60-5 AC01
5 EZ-링크 NHS-PEG4-바이오틴, 무중량 포맷　 피어스 21329
6 하이브리도마 SFM 미디어 라이프 테크 12045-076
7 소태아혈청 하이클론 #SH30084.03
8 페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL) 라이프 15140-122
9 코트 항-마우스 F(ab')2-알렉사 568 라이프 Cat# A11019 로트
#1073003
10 스트렙타비딘-488 라이프 카달로그
#S32354		 로트
#1078760
11 마우스 항 CD45 IgG1 R&D 시스템들 MAB1430 ILP0612061
12 BD FalconTM 세포 여과기들,
40μm, 청색		 BD 352340
CD45 항원 코팅된 비드들의 생성
CD45 항원 코팅된 마이크로비드들이 하기의 방식으로 생성되었다:
Figure pct00003
50 μg 캐리어 없는 CD45를 500 μL PBS (pH 7.2) 에 재현탁시켰다.
Figure pct00004
슬라이드-a-라이저 (slide-a-lyzer) 미니 컵을 500 μL PBS로 린싱한 다음, 미세다관 (microfuge tube) 에 넣었다.
Figure pct00005
0.1 μg/μL CD45 용액 50 μL를 린싱한 슬라이드-a-라이저 미니 컵에 넣었다.
Figure pct00006
170 μL PBS를 2 mg의 NHS-PEG4-바이오틴에 첨가하고, 그 후 4.1 μL의 NHS-PEG4-바이오틴을 CD45 항원을 포함하는 슬라이드-a-라이저 미니 컵에 넣었다.
Figure pct00007
NGS-PEG4-바이오틴을 CD45 항원과 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하였다.
Figure pct00008
배양 후, 슬라이드-a-라이저 미니 컵을 미세다관으로부터 꺼내어, 제 2 미세다관에서 1.3 mls PBS (pH 7.2) 에 넣고, 그리고 처음 1 시간 주기 동안 4℃에서 흔들면서 배양했다. 슬라이드-a-라이저 미니 컵을 후속하여 1.3 mls의 신선한 PBS (pH 7.2) 를 포함하는 제 3 미세다관으로 옮기고, 두번째 1 시간 주기 동안 4℃에서 흔들면서 배양했다. 이 마지막 단계를 3 번 더 반복하여 총 5회의 1 시간 배양을 실시했다.
Figure pct00009
100 μL의 바이오틴이 첨가된 CD45 용액 (~ 50 ng/μL) 을 표지된 튜브에 옮겼다.
Figure pct00010
500 μL 스페로테크 스트렙타비딘 코팅된 비드들을 미세다관으로 피펫팅한 다음, PBS (pH 7.4) 에서 3회 (1000 μL/세척) 세척한 다음, 3000 RCF에서 5 분 동안 원심 분리하였다.
Figure pct00011
비드들을 500 ㎕ PBS (pH 7.4) 에 재현탁하여, 5 ㎎/㎖의 비드 농도를 얻었다.
Figure pct00012
50 μL의 바이오틴이 첨가된 단백질을 재현탁된 스페로테크 스트렙타비딘 코팅된 비드들과 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 2 시간 동안 흔들면서 배양한 다음, 3000 RCF에서 5 분 동안 4° 원심 분리하였다. 상등액을 폐기하고, CD45 코팅된 비드들을 1 mL PBS (pH 7.4) 에서 3 회 세척하였다. 다음, 3000CF로 4 ℃에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 마지막으로, CD45 비드들을 500 μL PBS pH 7.4에 재현탁하고 4℃에서 보관하였다.
마우스 비장세포 수확
CD45으로 면역화된 마우스로부터 비장을 수확하고 DMEM 배지 + 10% FBS에 위치시켰다. 가위는 비장을 가는데 사용되었다.
갈아진 비장을 40 ㎛ 세포 여과기에 넣었다. 단일 세포를 10 ml 피펫으로 세포 여과기를 통해 세척하였다. 유리 막대를 사용하여 비장을 더 세분화하고 세포 여과기를 통해 단일 세포를 강제로 만들고, 그 후 단일 세포를 다시 10 ml 피펫으로 세포 여과기를 통해 세척하였다.
적혈구는 상용 키트와 함께 용해시켰다.
세포를 200xG에서 스핀 다운시키고, 원료 비장세포를 2e8 cells/ml의 농도로 10 ml의 피펫으로 DMEM 배지 + 10% FBS에 재현탁시켰다.
세포를 미세유체 디바이스에 로딩
비장세포를 미세유체 칩으로 도입하고 펜당 20-30개의 세포를 함유하는 펜에 로딩하였다. 100 마이크로리터의 배지를 1 μL/s 에서 디바이스를 통해 흘려서 원하지 않는 세포를 제거하였다. 온도를 36℃로 설정하고, 배양 배지를 0.1 μL/초로 30 분간 관류하였다.
항원 특이성 검정
1:2500 고우트 항-마우스 F(ab')2-Alexa 568 을 포함하는 세포 배지를 준비하였다.
100 μL 의 CD45 비드들을 고우트 항-마우스 F(ab')2-Alexa 568의 1:2500 희석액을 포함하는 세포 배지 22 μL 에 재현탁시켰다.
재현탁된 CD45 비드들은 다음, 비장세포를 포함하는 펜에 인접하여, 바로 옆에 위치할 때까지 1μL/초의 속도로 미세유체 칩의 주요 채널로 유입되었다. 다음, 유체 흐름이 중단되었다.
다음, 미세유체 칩은 그 비드들의 위치를 식별하기 위해 명시야 (bright field) 에서 촬상되었다.
다음, 텍사스 레드 필터는 세포와 비드의 이미지를 캡처하는데 사용되었다. 이미지는 1 시간 동안 매 5 분마다 촬영되었으며, 각 노출은 1000ms 지속되고 5 이득이 지속되었다.
결과들
비드들 상에서 디벨럽하고, 어떤 펜들 밖으로 및 주요 채널 안으로 확산하는 IgG-이소타입 항체들의 확산을 반영하는 양성 신호가 관찰되었고, 여기서 이들은 CD45 코팅된 비드들에 결합할 수 있었다. 비드들에 대한 항-CD45 항체의 결합은 보조 고우트 항-마우스 IgG-568이 비드들이 결합하여 검출 가능한 신호를 생성하도록 허용하였다. 도 5c, 백색 화살표를 참조한다.
본원에 개시된 방법들을 사용하여, 양성 신호와 연관된 각각의 그룹의 비장세포들을 분리하고, 단일 세포로서 새로운 펜으로 이동시키고 재검정시켰다. 이러한 방식으로, 항 CD45 IgG 항체를 발현하는 단일 세포를 검출할 수 있다.
예 3. 막 준비 및 막 항원과 비드들의 콘쥬게이션
다음 프로토콜은 관심 샘플 세포들로부터 단백질 (및 다른 생체분자) 및 특히 막 결합 또는 막 관련 단백질을 포함하는 샘플을 얻을 가능성을 나타낸다. 프로토콜은 Jurkat 세포에서 수행되어 그러한 세포에 존재하는 것으로 알려진 단백질에 대한 결과 샘플의 테스트를 가능하게 한다. 이 프로토콜은, 종양 생검에서 고립된 암 세포를 포함하여 다른 세포 타입으로 쉽게 확장될 수 있어, 항원에 대한 반응성을 위해 면역 세포 (예를 들어, B 세포) 를 스크리닝하는데 유용한 종양 세포 특이적 (또는 다른 세포 타입 특이적) 항원을 포함하는 샘플을 생성한다.
재료들:
Figure pct00013
Jurkat 세포들 (ATCC TIB-152)
Figure pct00014
LiDS-샘플 완충액: 0.02 g/mL LiDS, 10% 글리세롤, 0.51 mM EDTA, 247 mM 트리스, pH8.5 (ThermoFisher B0008)
Figure pct00015
Qiashredder (Qiagen 79654)
Figure pct00016
DPBS (칼슘 및 마그네슘 포함, ThermoFisher 14040-182)
Figure pct00017
초순수 워터 (ThermoFisher 10977-015)
Figure pct00018
EZ-링크 술포-NHS-SS-바이오틴 (ThermoFisher 21328): -20℃에서 보관하고, 꺼내서 사용하기전 ~30 분 동안 RT에서 가온시키고; 튜브의 바닥에서 모든 것을 모으기 위해 잠깐 스핀 다운하고; 사용 직전에 1 mg 술포-NHS-SS-바이오틴을 포함하는 1개의 튜브에 164 μL의 초순수를 넣고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 용해시킨다 (그 결과 10 mM 용액이 형성됨)
Figure pct00019
컴플리트 울트라 미니 (Sigma 5892791001): 20x 용액 준비: 볼텍싱으로 500 μL 물에 1개의 태블릿을 용해한다 (4℃ 또는 -20℃에서 4 주 동안 안정).
Figure pct00020
극미한 플라즈마 막 단백질 분리 키트 (Invent Biotechnologies SM-005): 사용 전에, 용액 A와 B를 해동하고 프로테아제 억제제를 추가한다:
Figure pct00021
각 샘플 500 μL 완충액 A + 25 μL 20x 프로테아제 억제제 (얼음에 저장) 에 대해
Figure pct00022
각 샘플 200 μL 완충액 B + 10 μL 20x 프로테아제 억제제 (얼음에 저장)
Figure pct00023
얼음 위의 각 샘플에 대해 1 개의 필터 카트리지를 준비한다.
Figure pct00024
BSA: Chromatopur Bovine Albumin (MP Biomedicals 02180561)
Figure pct00025
스트렙타비딘 코팅된 자성 마이크로구 (Bangs Laboratories CM01N Lot# 11806), 사용 전에 세척 및 블로킹:
Figure pct00026
볼텍스 비드들, 300 μL/샘플을 꺼내고 1.5 mL 튜브로 옮김
Figure pct00027
PBS로 세척
Figure pct00028
0.5% BSA 에서 재현탁하고 4℃ 에서 (회전) 적어도 1h 동안 배양
Figure pct00029
PBS 로 세척, 500 μL DPBS (+ 프로테아제 억제제)/샘플에서 재현탁
Figure pct00030
항-알파 1 나트륨 칼륨 ATPase (Na/K-ATPase) 항체 (Abcam ab7671)
Figure pct00031
항-인간 CD3 항체, 클론 SK7 (BioLegend 344802)
Figure pct00032
항-인간 CD45 항체, 클론 HI30 (BioLegend 304002)
Figure pct00033
F(ab')2-고우트 항-마우스 IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (ThermoFisher A-11017)
막 단백질의 바이오틴 첨가:
Figure pct00034
Jurkat 세포들을 카운트
Figure pct00035
웨스턴 블롯 분석을 위한 분취량 준비:
Figure pct00036
2x106 세포들을 원심 분리
Figure pct00037
PBS로 세척
Figure pct00038
LiDS-샘플 완충액에 용해하고 Qiashredder 컬럼을 통해 원심분리하여 DNA를 전단한다
Figure pct00039
며칠 동안 4℃에서 보관하고 -80℃에서 더 오래 보관한다
Figure pct00040
다수의 15x106 세포들을 원심 분리에 의해 DPBS로 3 회 세척한다
Figure pct00041
500 μL DPBS에서 각각의 펠렛을 재현탁하고, 1.5 mL 관으로 옮기고 신선하게 준비된 10 mM 술포-NHS-SS-바이오틴을 첨가한다
Figure pct00042
RT에서 30분 회전시킨다
Figure pct00043
냉 DPBS로 3회 세척하고 세포 펠렛들로 처리하여 막 분획을 풍부하게 한다.
Figure pct00044
웨스턴 블롯 분석에 대해 1 샘플을 프로세싱한다 (상기 참조).
도 6은 Na/K-ATPase 에 대해 염색된 예시적인 웨스턴 블롯, 플라즈마 막에 존재하는 단백질, 및 GAPDH, 시토솔릭 단백질 (cytosolic protein) 을 도시한다.
극미한 플라즈마 막 고립 키트를 사용한 막 분획의 풍부화:
Figure pct00045
얼음 위에서 모든 단계를 수행하고 4℃에서 원심 분리한다.
Figure pct00046
완충액 A에 펠렛을 재현탁시키고: < 5x106 세포의 경우 200 μl, > 5x106 세포의 경우 500 μl
Figure pct00047
얼음 위에서 10 분간 배양한다
Figure pct00048
10-30 초동안 격렬하게 볼텍싱하고, 즉시 얼음 위에서 필터 카트리지로 옮긴다
Figure pct00049
필터 카트리지를 캡핑하고 16,000 g에서 30 초간 원심 분리한다 (세포 용해물이 통과하지 않을 경우 2 분으로 증가한다)
Figure pct00050
수집관에 펠렛을 재현탁시키고, 동일한 필터 및 원심분리기로 다시 옮긴다
Figure pct00051
필터를 폐기하고, 10 초 동안 격렬하게 볼텍싱하여 펠렛을 재현탁시킨다
Figure pct00052
700g에서 1 분간 원심 분리한다 (온전한 핵을 펠렛화한다)
Figure pct00053
16,000g/4℃ 에서 신선한 1.5 ml 관에서 30 분간 상등액을 원심 분리한다 (→ 상등액은 시토솔을 포함한다, 펠렛 = 전체 막 단백질 분획)
Figure pct00054
200 μl 완충액 B에 볼텍싱에 의해, 또는 위아래 피펫팅에 의해 펠렛을 재현탁시킨다
Figure pct00055
7,800g/4 ℃에서 20 min 간 원심분리한다 → 펠렛은 세포기관 막 단백질을 포함한다
Figure pct00056
조심스럽게 상등액 (막 분획) 을 신선한 2.0 ml 관에 옮긴다
막 분획을 스트렙타비딘 코팅된 자성 마이크로구에 결합:
Figure pct00057
80 μL 의 각각의 막 분획을 500 μL 비드들에 추가한다
Figure pct00058
4℃ 에서 o/n 회전시킨다
Figure pct00059
웨스턴 블롯에 의한 분석을 위해 언바운드 분획을 저장한다
Figure pct00060
0.5% BSA/PBS + 프로테아제 억제제에서 30분 회전시킨다
Figure pct00061
PBS로 세척한다
Figure pct00062
250 μL 0.1% BSA/PBS + 프로테아제 억제제에 재현탁시킨다
Figure pct00063
비드로부터 막 분획을 방출한다 (DTT를 사용하여 S-S 결합을 절단한다):
Figure pct00064
50 μL 비드들의 분취량을 꺼낸다
Figure pct00065
자석을 착용하고 용액을 제거한다.
Figure pct00066
50 mM DTT (1x 환원제, ThermoFisher B0009) 을 포함하는 50 μL LiDS-샘플 완충액에서 비드들을 재현탁시킨다
Figure pct00067
RT 에서 2 hr 배양한다 (~30 min 마다 혼합)
항체 염색:
Figure pct00068
다음 희석액에서 각 항체에 대한 (단계 24로부터) 비드들의 50 μL 분취량을 취한다
Figure pct00069
CD3 (1:200)
Figure pct00070
CD45 (1:100)
Figure pct00071
Na/K-ATPase (1:100)
Figure pct00072
1차 항체 없음
Figure pct00073
4℃ 에서 30 min 회전시킨다
Figure pct00074
800 μL PBS 를 세척하기 위해 추가하고, 추가로 PBS로 1x 세척한다
Figure pct00075
4℃에서 30 분 동안 (회전, 체적: 0.5% BSA/PBS + 프로테아제 억제제에서 200 μL) 1:300 을 보조 항체 (Alexa488-콘쥬게이트된 고우트 항-마우스) 에서 배양시킨다.
Figure pct00076
800 μL PBS 를 세척하기 위해 추가하고, 추가로 PBS로 1x 세척한다
Figure pct00077
20 μL 0.5% BSA/PBS + 프로테아제 억제제에서 재현탁시킨다
Figure pct00078
형광 현미경 상에서 촬상한다
도 7 은 CD3, CD45 또는 NA/K-ATPase 에 대해 염색된 Jurkat 세포 막 분획으로 코팅된 비드를 도시한다. CD3 및 CD45는 NA/K-ATPase와 비교하여 모두 강하게 표현되며, 이는 페인터 스폿 (fainter spot) 으로 보인다. 도 8 은 HEK293 세포들과의 비교를 나타낸다. 여기서 Na/K-ATPase는 동일하게 염색되지만, CD3과 CD45는 존재하지 않는다.
결과들은 세포 막 준비로부터 고립된 단백질들이 성공적으로 비드들에 커플링될 수 있음을 보여준다. 이러한 비드들은 면역 세포와 혼합되어 어떤 세포들이 세포 막 준비에 존재하는 항원들 (단백질이든 또는 다른 것이든) 과 반응하는지를 결정할 수 있다.
예 4. 비드-콘쥬게이트된 암 세포-유래의 항원들에 결합하는 항체들을 발현하는 B 세포들을 식별
스크린은 환자 자신의 골수 유방 암 세포에 결합하는 항체를 발현하는 환자 특이적 B 세포를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 실험 설계는 다음 단계들을 포함할 수 있다:
Figure pct00079
B 세포와 암 세포의 수확 및 선택하는 단계;
Figure pct00080
암 세포에서 세포 막 준비를 수득하고 막 항원을 비드에 콘쥬게이팅하는 단계;
Figure pct00081
B 세포를 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계;
Figure pct00082
암 세포 유래의 막 항원에 콘쥬게이팅된 비드를 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계; 및
Figure pct00083
B 세포에 의해 생성된 항체의 비드에의 결합에 대해 검정하는 단계.
A. 세포 수확 및 선택
골수 유방 암 종양의 생검은 환자로부터 수득되고, 예 1 (상기) 에 기재된 바와 같이 생검의 세포는 해리된다. B 세포는 항-CD-20 자성 비드들을 사용하여 생성된 해리된 세포 샘플로부터 선택되어 B 세포가 풍부한 세포 샘플을 생성한다. 다음, B 세포-고갈 해리된 세포 샘플에 남아있는 세포는 항-ER (에스트로겐 수용체), 항-PR (프로게스테론 수용체) 및 항-HER2 자성 비드의 혼합물을 사용하여 비-골수 유방 암 세포를 고갈시켜 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플을 생성한다.
B. 유방 암 세포로부터의 세포 막의 준비 및 막 항원의 비드에의 콘쥬게이션
파트 A에서 수득된 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플로 시작하여, 상기 3에 기재된 바와 같이, 암 세포로부터의 세포 막이 준비되고 비드에 콘쥬게이트된다.
C. 세포를 미세유체 디바이스 안으로 로딩
다음 B 세포가 풍부한 세포 샘플은 0.1-1.0 마이크로리터/초의 속도로 흐름 채널 안으로 1-3 마이크로미터의 샘플을 흐르게 함으로써 미세유체 칩 안으로 로딩된다. 그후 샘플의 흐름은 정지되고, 그리고 샘플 내의 세포가 흐름 채널에 위치하는 동안, B 세포는 DEP 힘 (예를 들어, OET) 을 사용하여 선택적으로 캡처되고 흐름 채널에 접속된 고립 챔버의 고립 영역 안으로 이동된다. 단일 B 세포는 복수의 고립 챔버 각각에 배치된다. 사용된 미세유체 칩의 크기에 따라, 단일 칩에서 3000 개 이상의 B 세포가 개별적으로 고립될 수 있다. 일반적으로, 샘플에 더 적은 B 세포가 존재할 것으로 예상된다. 결과적으로, 샘플에서의 모든 B 세포들이 고립될 수 있다. 일단 B 세포가 고립 챔버로 이동되면, 흐름 채널은 새로운 매체와 플러시되어 원치않는 세포 및 잔해의 흐름 채널을 클리어한다.
흐름 채널을 클리어한 후, 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플이 칩으로 로딩된다. B 세포가 풍부한 샘플과 유사하게, 1-3 마이크로미터의 암 세포가 풍부한 샘플이 0.1-1.0 마이크리터/sec의 속도로 흐름 채널로 흐른 다음, 흐름이 정지된다. 형태학적 특징을 이용하여, 복수의 암 세포 (예를 들어, 3-6) 를 DEP 힘 (예를 들어, OET) 를 사용하여 선택하고 B 세포를 포함하는 각각의 고립 챔버로 이동시킨다. 일단 암 세포가 고립 챔버 안으로 이동하면, 흐름 채널은 새로운 매체로 플러시되어 원치않는 세포 및 잔해의 흐름 채널을 클리어한다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩 내의 복수의 고립 챔버는 단일 B 세포 및 복수의 골수 유방 암 세포와 함께 로딩된다.
D. 미세유체 디바이스로 비드를 로딩
이 흐름 채널을 클리어한 후, 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플로부터 수득된 막 항원에 콘쥬게이트된 비드가 이 칩으로 로딩된다. B 세포가 풍부한 샘플과 유사하게, 1-3 마이크로미터의 암 세포 관련 항원-콘쥬게이트된 비드가 0.1-1.0 마이크리터/sec의 속도로 흐름 채널로 흐른 다음, 흐름이 정지된다. 비드는 B 세포를 포함하는 각각의 고립 챔버 안으로 이동된다. 일단 비드들이 고립 챔버 안으로 이동되면, 흐름 채널은 후속해서 신선한 매체와 플러시되어 원치 않는 비드 및 잔해의 흐름 채널을 클리어한다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩 내의 복수의 고립 챔버는 단일 B 세포 및 복수의 암 세포 관련 항원-콘쥬게이트 비드와 함께 로딩된다. 대안으로, 비드는 상기 예 2에서 설명한 바와 같이 채널에 남겨질 수 있다.
E. 항체 결합 검정
임의의 고립된 B 세포가 암 세포 관련 항원에 결합하는 항체를 생성하고 있는지 여부를 결정하기 위해, 미세유체 칩 내의 B 세포는 항체 발현에 도움이 되는 조건하에서 배양된다. 이러한 배양 후, 인간 항체의 불변 영역에 결합하는 보조 항체의 혼합물을 함유하는 배지가 미세유체 칩 안으로 유입된 다음, 정지된다. 형광 표지된 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgM 항체, 및 선택적으로 인간 IgA, IgE 및/또는 IgD에 대한 항체를 함유할 수 있는 항체 혼합물 중의 항체를 고립 챔버 내로 확산되게 하고 B 세포에 의해 생성된 항체에 결합되게 한다. B 세포에 의해 생성된 항체가 해당 고립 챔버의 비드에 콘쥬게이트된 암 세포 관련 항원 중 하나 이상에 결합되면, 항-인간 보조 항체 (및 이들의 표지) 가 비드의 표면에 검출가능하게 결합되게 될 것이다. 비드가 채널에 남아있는 경우, 비드가 미세유체 디바이스로 흐르기 전에 형광 표지된 보조 항체가 비드와 혼합될 수 있다.
보조 항체 배양 단계 동안, 미세유체 칩은 형광 신호의 검출을 위한 필터 (예를 들어, 텍사스 레드 필터) 를 사용하여 주기적으로 촬상된다. 이미지는 1 시간 동안 5 분마다 촬영될 수 있으며 각 노출은 1000ms 지속된다.
F. 결과들
암 세포 관련 항원에 결합되는 항체를 발현하는 B 세포를 포함하는 임의의 고립 챔버에서 (또는 그에 근접하여) 비드의 표면 상에서 디벨럽하는 양성 신호가 관찰될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 관심있는 항체를 발현하는 개별 B 세포를 특이적으로 식별할 수 있다. 임의의 관심있는 항체를 생성하지 않는 B 세포는 그 고립 챔버 밖으로 이동되어 미세유체 칩 밖으로 반출되어 폐기될 수 있다. 환자의 골수 유방 암 세포 유래의 항원에 결합하는 항체를 발현하는 것으로 식별된 B 세포는 (예를 들어, OET 같이 DEP 힘을 사용하여) 고립 챔버 밖으로 이동될 수 있고 발현된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 증폭 및 시퀀싱을 위해 반출된다. B 세포가 항체를 발현하도록 유도되면서 팽창되면, B 세포의 클론성 모집단이 발현된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 증폭 및 시퀀싱을 위해 반출될 수 있다.
예 5. 암 세포에 결합하는 항체를 발현하는 B 세포의 식별
대안으로, 스크린은 환자 자신의 골수 유방 암 세포에 결합하는 항체를 표현하는 환자 특이적 B 세포들을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 실험 설계는 다음 단계들을 포함할 수 있다:
Figure pct00084
B 세포들과 암 세포들의 수확 및 선택;
Figure pct00085
미세유체 디바이스로의 로딩; 및
Figure pct00086
B 세포에 의해 생성된 항체를 암 세포에 결합하기 위한 검정.
A. 세포 수확 및 선택
골수 유방 암 종양의 생검은 환자로부터 수득되고, 예 1 (상기) 에 기재된 바와 같이 생검의 세포는 해리된다. B 세포는 항-CD-20 자성 비드들을 사용하여 생성된 해리된 세포 샘플로부터 선택되어 B 세포가 풍부한 세포 샘플을 생성한다. 다음, B 세포-고갈 해리된 세포 샘플에 남아있는 세포는 항-ER (에스트로겐 수용체), 항-PR (프로게스테론 수용체) 및 항-HER2 자성 비드의 혼합물을 사용하여 비-골수 유방 암 세포를 고갈시켜 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플을 생성한다.
B. 세포를 미세유체 디바이스 안으로 로딩
다음 B 세포가 풍부한 세포 샘플은 0.1-1.0 마이크로리터/초의 속도로 흐름 채널 안으로 1-3 마이크로미터의 샘플을 흐르게 함으로써 미세유체 칩 안으로 로딩된다. 그후 샘플의 흐름은 정지되고, 그리고 샘플 내의 세포가 흐름 채널에 위치하는 동안, B 세포는 DEP 힘 (예를 들어, OET) 을 사용하여 선택적으로 캡처되고 흐름 채널에 접속된 고립 챔버의 고립 영역 안으로 이동된다. 단일 B 세포는 복수의 고립 챔버 각각에 배치된다. 사용된 미세유체 칩의 크기에 따라, 단일 칩에서 3000 개 이상의 B 세포가 개별적으로 고립될 수 있다. 일반적으로, 샘플에 더 적은 B 세포가 존재할 것으로 예상된다. 결과적으로, 샘플에서의 모든 B 세포들이 고립될 수 있다. 일단 B 세포가 고립 챔버로 이동되면, 흐름 채널은 새로운 매체와 플러시되어 원치않는 세포 및 잔해의 흐름 채널을 클리어한다.
흐름 채널을 클리어한 후, 삼중 음성 유방 암 세포가 풍부한 샘플이 칩으로 로딩된다. B 세포가 풍부한 샘플과 유사하게, 1-3 마이크로미터의 암 세포가 풍부한 샘플이 0.1-1.0 마이크리터/sec의 속도로 흐름 채널로 흐른 다음, 흐름이 정지된다. 형태학적 특징을 이용하여, 복수의 암 세포 (예를 들어, 3-6) 를 DEP 힘 (예를 들어, OET) 를 사용하여 선택하고 B 세포를 포함하는 각각의 고립 챔버로 이동시킨다. 일단 암 세포가 고립 챔버 안으로 이동하면, 흐름 채널은 새로운 매체로 플러시되어 원치 않는 세포 및 잔해의 흐름 채널을 클리어한다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩 내의 복수의 고립 챔버는 단일 B 세포 및 복수의 골수 유방 암 세포와 함께 로딩된다.
C. 항체 결합 검정
임의의 고립된 B 세포가 암 세포 관련 항원에 결합하는 항체를 생성하고 있는지 여부를 결정하기 위해, 미세유체 칩 내의 B 세포는 항체 발현에 도움이 되는 조건하에서 배양된다. 이러한 배양 후, 인간 항체의 불변 영역에 결합하는 보조 항체의 혼합물을 함유하는 배지가 미세유체 칩 안으로 유입된 다음, 정지된다. 형광 표지된 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgM 항체, 및 선택적으로 인간 IgA, IgE 및/또는 IgD에 대한 항체를 함유할 수 있는 항체 혼합물 중의 항체를 고립 챔버 내로 확산되게 하고 B 세포에 의해 생성된 항체에 결합되게 한다. B 세포에 의해 생성된 항체가 해당 고립 챔버의 비드에 콘쥬게이트된 암 세포 관련 항원 중 하나 이상에 결합되면, 항-인간 보조 항체 (및 이들의 표지) 가 골수 유방 암 세포의 표면에 검출가능하게 결합되게 될 것이다.
보조 항체 배양 단계 동안, 미세유체 칩은 형광 신호의 검출을 위한 필터 (예를 들어, 텍사스 레드 필터) 를 사용하여 주기적으로 촬상된다. 이미지는 1 시간 동안 5 분마다 촬영될 수 있으며 각 노출은 1000ms 지속된다.
D. 결과들
암 세포에 결합되는 항체를 발현하는 B 세포를 포함하는 임의의 고립 챔버에서 암 세포의 표면 상에서 디벨럽하는 양성 신호가 관찰될 수 있다. 이 방법을 사용하여, 관심있는 항체를 발현하는 개별 B 세포를 특이적으로 식별할 수 있다. 임의의 관심있는 항체를 생성하지 않는 B 세포는 그 고립 챔버 밖으로 이동되어 미세유체 칩 밖으로 반출되어 폐기될 수 있다. 환자의 골수 유방 암 세포에 결합하는 항체를 발현하는 것으로 식별된 각각의 B 세포는 (예를 들어, OET 와 같이 DEP 힘을 사용하여) 고립 챔버 밖으로 이동될 수 있고 발현된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 증폭 및 시퀀싱을 위해 반출된다. B 세포가 항체를 발현하도록 유도되면서 팽창되면, B 세포의 클론성 모집단이 발현된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 증폭 및 시퀀싱을 위해 반출될 수 있다.
예 6. CAR-T들과 온콜리틱 바이러스를 사용하는 병용 요법
키메릭 항원 수용체 (CAR) 리디렉팅된 T 세포들은 암 치료의 상승 혜택을 제공하는 잠재력을 가지고 있다. 신경아세포종과 같은 암이 있는 환자는 생검 또는 외과적 절제술을 수행하고, 그리고 암에 결합하는 항체를 생성하는 B 세포들은 이전 예들을 사용하여 식별된다. CAR-T 세포주는 식별된 B 세포에 의해 생성된 항체에 상응하는 항체 또는 그의 단편을 발현하도록 엔지니어링된다 (상응하여, 적어도 동일한 중쇄 CDR, 적어도 동일한 중쇄 및 경쇄 CDR, 적어도 가변하는 중쇄, 또는 적어도 가변하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 것을 의미함). 이 환자의 경우, CAR-T 세포주는 scFv를 발현하도록 엔지니어링되고, 여기서 중쇄 및 경쇄 가변의 영역을 코딩하는 유전자는 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 조합 scFv 유전자는 PCR을 스플라이싱-바이-오버랩 (splicing-by-overlap) 하는 것에 의해 생성된 다음 벡터 파지 DNA의 제한 부위에 연결된다.
scFv 시퀀스가 SFG 레트로바이러스 백본과 같은 레트로바이러스 백본으로 프레임에서 클로닝된다. 레트로바이러스 상등액은 239T 세포를 사용하여 준비된다. 레트로바이러스를 함유하는 상등액은 48 시간 후 및 72 시간 후에 수집된다. 형질 도입의 경우, OKT3 (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ) 및 CD28 (Becton Dickinson, Mountain View, CA) 항체로 활성화된 0.5×106/ml 주연 혈액 단핵 세포들 (PBMC들) 및 재조합 인간 IL-12 (100 개 단위/ml; Proleukin, Chiron, Emeryville, CA) 를, 재조합 피브로넥틴 단편 (FN CH-296, Retronectin, Takara Shuzo, Otsu, Japan) 으로 사전 코팅된 24-웰 플레이트들에서 완전 배지 (RPMI 1640 45%, 클릭 배지 45%, 및 10% 열-멸균된 인간 혈청 및 2 mM L-글루타민) 에서 플레이팅한다. 바이러스 상등액을 첨가한 후, 세포를 회전시키고 37℃의 5% CO2에서 배양한다. 72 시간 후에 T 림프구에 대한 CAR 발현을 측정하고 세포를 rIL-2 (50 units/ml) 를 3 일마다 첨가하여 완전 배지에서 배양 유지하였다.
이러한 CAR-T 세포는 온콜리틱 아데노바이러스 (oncolytic adenovirus) 와 같은 온콜리틱 바이러스의 투여와 함께 환자에 적응적으로 옮겨진다. 온콜리틱 안데노바이러스는 재조합 IL15, RANTES 또는 이들의 조합물을 선택적으로 발현하는 Ad5D24일 수 있다. 환자는 상당한 임상적 개선이 있을 것으로 예상된다.
예시적인 실시형태의 리스팅
1. 환자로부터 수득된 적어도 하나의 고체 종양 샘플로부터 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계; 해리된 세포 샘플을 흐름 영역 및 흐름 영역에 유체적으로 접속된 적어도 하나의 고립 영역을 갖는 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계; 적어도 하나의 B 세포를 해리된 세포 샘플로부터 미세유체 디바이스에서 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계; 및 암 세포들에 결합시킬 수 있는 항체들을 생성하는 적어도 하나의 B 세포를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 포함하는 항체 치료제의 제조 방법.
2. 상기 고립 영역은 B 세포 림프구 생존력을 촉진시키는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함하고, 상기 컨디셔닝된 표면은 공유 결합된 분자들을 포함하는, 실시형태 1의 방법.
3. 상기 고립 영역은 B 세포 림프구 생존력을 촉진시키는 복수의 컨디셔닝된 표면들을 포함하고, 각각의 컨디셔닝된 표면은 공유 결합된 분자를 포함하는, 실시형태 1의 방법.
4. 상기 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면 또는 상기 복수의 컨디셔닝된 표면 각각은 공유 결합된 친수성 분자들의 층을 포함하는, 실시형태 2 또는 3의 방법.
5. 상기 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 중합체들, 아미노산들을 포함하는 중합체들, 및 그 조합들의 그룹으로부터 선택되는, 실시형태 4의 방법.
6. 상기 고립 영역은 B 세포 생존력을 촉진시키는 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함하는, 실시형태 1의 방법.
7. 상기 고립 영역은 B 세포 생존력을 촉진시키는 코팅 재료로 각각 코팅된 복수의 표면들을 포함하는, 실시형태 1의 방법.
8. 상기 코팅 재료는 친수성 분자들을 포함하는, 실시형태 6 또는 7의 방법.
9. 상기 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 중합체들, 아미노산들을 포함하는 중합체들, 및 그 조합들의 그룹으로부터 선택되는, 실시형태 8의 방법.
10. 상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 상기 미세유체 디바이스에서 데드-엔드 (dead-end) 를 형성하고, 그리고 상기 흐름 영역이 실질적으로 흐르는 제 1 유체 배지로 충진되고 상기 고립 영역(들)이 실질적으로 제 2 유체 배지로 충진될 때: 상기 제 2 배지의 성분들은 상기 제 1 배지 안으로 확산될 수 있고 상기 제 1 배지의 성분들은 제 2 배지 안으로 확산될 수 있으며; 그리고 상기 흐름 영역으로부터 상기 고립 영역으로의 상기 제 1 배지의 흐름은 실질적으로 없는, 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 방법.
11. 상기 미세유체 디바이스의 상기 흐름 영역은 미세유체 채널을 포함하는, 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 방법.
12. 상기 적어도 하나의 고립 영역의 각각은 대응하는 격리 챔버의 일부이고, 각각의 격리 챔버는 대응하는 고립 영역을 상기 미세유체 채널로 유체적으로 접속하는 접속 영역을 더 포함하는, 실시형태 11의 방법.
13. 상기 접속 영역은 약 20 마이크론 내지 약 60 마이크론의 폭 (Wcon) 을 갖는, 실시형태 12의 방법.
14. 상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 대응하는 접속 영역의 폭 (Wcon) 보다 큰 폭 (Wiso) 을 갖는, 실시형태 12 또는 13의 방법.
15. 상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론인 폭 (Wiso) 을 갖는, 실시형태 14의 방법.
16. 상기 격리 챔버들의 각각은 약 0.5 nl 내지 약 2.5 nl의 체적을 포함하는, 실시형태 12 내지 15 중 어느 하나의 방법.
17. 상기 적어도 하나의 B 세포는 중력 및/또는 국부화된 유체 흐름을 이용하여 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동되는, 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 방법.
18. 상기 미세유체 디바이스는 DEP 구성을 갖는 기판을 포함하는, 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 방법.
19. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 DEP 힘을 사용하여 상기 적어도 하나의 B 세포를 이동시키는 단계를 포함하는, 실시형태 18의 방법.
20. 상기 해리된 세포 샘플을 로딩하기 이전에, 상기 방법은 상기 해리된 세포 샘플 내의 B 세포들을 검출가능한 마커로 표지하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법.
21. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 상기 검출가능한 마커의 검출에 기초하여 이동을 위한 적어도 하나의 B 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 실시형태 20의 방법.
22. 적어도 하나의 B 세포를 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 복수의 개별적인 B 세포들을 대응하는 복수의 분리된 고립 영역들로 이동시키는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나의 방법.
23. B 세포 활성화를 자극하는 자극제와 상기 적어도 하나의 B 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나의 방법.
24. 상기 자극제는 CD40 작용제를 포함하는, 실시형태 23의 방법.
25. 상기 CD40 작용제는 CD40L, 그 유도체, 또는 항-CD40 항체를 포함하는, 실시형태 24의 방법.
26. 상기 자극제는 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들을 포함하는, 실시형태 23의 방법.
27. 상기 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들은 T 세포들 또는 이들의 유도체인, 실시형태 26의 방법.
28. 상기 자극제는 톨 유사 (toll-like) 수용체 (TLR) 작용제를 포함하는, 실시형태 23 내지 27 중 어느 하나의 방법.
29. 상기 TLR 작용제는 CpG 올리고뉴클레오티드인, 실시형태 28의 방법.
30. 상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 주기 동안 상기 자극제와 접촉되는, 실시형태 23 내지 29 중 어느 하나의 방법.
31. 상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 상기 주기 동안 실질적으로 연속적으로 상기 자극제와 접촉되는, 실시형태 30의 방법.
32. 상기 적어도 B 세포에 배양 배지를 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 배양 배지는 B 세포 팽창을 촉진하는 하나 이상의 성장 유도제들을 포함하는, 실시형태 23 내지 31 중 어느 하나의 방법.
33. 상기 하나 이상의 성정 유도제들은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21 및 BAFF의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함하는, 실시형태 32의 방법.
34. 제공된 상기 배양 배지는 자극제를 포함하는, 실시형태 32 또는 33의 방법.
35. 상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 주기 동안 제공된 배양 배지인, 실시형태 32 내지 34 중 어느 하나의 방법.
36. 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포(들)의 각각의 B 세포는 상기 미세유체 디바이스의 고립 영역에서 8 내지 20 세포들의 세포 카운트까지 배양되는, 실시형태 32 내지 35 중 어느 하나의 방법.
37. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계 및 상기 적어도 하나의 B 세포로 배양 배지를 제공하는 단계는 실질적으로 동연의 시간 주기에 걸쳐 예비 성형되는, 실시형태 32 내지 36 중 어느 하나의 방법.
38. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 해리된 세포 샘플을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하기 이전에 수행되는, 실시형태 23 내지 27 중 어느 하나의 방법.
39. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 적어도 이동시킨 후에 수행되는, 실시형태 23 내지 38 중 어느 하나의 방법.
40. 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생성하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계 동안 수행되는, 실시형태 23 내지 39 중 어느 하나의 방법.
41. 상기 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생성하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계는 상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나의 방법.
42. 상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 상기 암 세포 관련 항원을 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하는, 실시형태 41의 방법.
43. 상기 암 세포 관련 항원은 상기 유체 배지에 용해되는, 실시형태 42의 방법.
44. 상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 마이크로-객체들을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 마이크로-객체들은 암 세포 관련 항원을 포함하는, 실시형태 41의 방법.
45. 상기 마이크로-객체들은 세포들, 리포솜들, 지질 나노래프트들, 및 비드들로부터 선택되는, 실시형태 44의 방법.
46. 상기 마이크로-객체들은 비드들이고, 그리고 상기 암 세포 관련 항원은 상기 비드들에 콘쥬게이트되는, 실시형태 45의 방법.
47. 상기 암 세포 관련 항원은 적어도 하나의 종양 샘플에 존재하는 암 세포들의 세포 표면 상에 존재하는 막 관련 항원인, 실시형태 45 또는 46의 방법.
48. 상기 비드들에 콘쥬게이트되는 상기 암 세포 관련 항원은 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 고립된 암 세포들로부터 수득된 세포 막 제조로부터의 것인, 실시형태 47의 방법.
49. 상기 마이크로-객체들은 암 세포들인, 실시형태 45의 방법.
50. 상기 암 세포들은 환자로부터 수득된 적어도 하나의 종양 샘플로부터의 암 세포들에 의해 발현되는 마커들을 발현하는, 실시형태 49의 방법.
51. 상기 암 세포들은 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 고립되는, 실시형태 49의 방법.
52. 상기 암 세포들은 다른 환자로부터 수득된 하나 이상의 종양 샘플들로부터 고립되는, 실시형태 49 또는 50의 방법.
53. 상기 환자로부터 상기 적어도 하나의 고형 종양 샘플이 수득되었고, 다른 환자가 동일한 타입의 암으로 진단된, 실시형태 52의 방법.
54. 암 세포들은 암 세포주에서 유래된 것인, 실시형태 49 또는 50의 방법.
55. 암 세포 관련 항원을 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는: 상기 암 세포 관련 항원을 포함하는 마이크로-객체들을 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 흐르게 하는 단계; 및 상기 배지에서의 상기 마이크로-객체들의 적어도 일부가 상기 적어도 하나의 고립 영역에 근접하는 상기 흐름 영역의 일 부분에 위치할 때 상기 유체 배지의 흐름을 정지시키는 단계를 포함하는, 실시형태 41 내지 54 중 어느 하나의 방법.
56. 상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 상기 마이크로-객체들 중 적어도 하나의 마이크로-객체를 상기 미세유체 디바이스에서의 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계를 더 포함하는, 실시형태 54의 방법.
57. 상기 적어도 하나의 마이크로-객체를 상기 미세유체 디바이스에서의 상기 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계는 적어도 하나의 마이크로-객체를 복수의 고립 영역들 각각의 안으로 이동시키는 단계를 포함하는, 실시형태 56의 방법.
58. 상기 적어도 하나의 마이크로-객체는 적어도 하나의 B 세포를 포함하는 적어도 하나의 고립 영역(들) 안으로 이동되고, 이로써 적어도 하나의 마이크로-객체 및 적어도 하나의 B 세포를 갖는 적어도 하나의 고립 영역을 생성하는, 실시형태 56 또는 57의 방법.
59. 상기 적어도 하나의 마이크로-객체 및 상기 적어도 하나의 B 세포는 다른 고립 영역들 안으로 이동되는, 실시형태 56의 방법.
60. 상기 다른 고립 영역들은 상기 미세유체 디바이스 내에서 서로 인접하는, 실시형태 59의 방법.
61. 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생성하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계는: 표지된 항체 결합제를 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 흐르게 하는 단계; 상기 유체 배지에서의 상기 표지된 항체 결합제의 적어도 일부가 상기 적어도 하나의 고립 영역에 근접하는 상기 흐름 영역의 일 부분에 위치할 때 상기 유체 배지의 흐름을 정지시키는 단계; 및 상기 표지된 항체 결합제를 상기 암 세포 관련 항원에 결합시키는 것을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 41 내지 60 중 어느 하나의 방법.
62. 상기 표지된 항체 결합제는 표지된 항-IgG 항체인, 실시형태 61의 방법.
63. 상기 표지된 항체 결합제는 형광 표지에 공유 결합되는, 실시형태 61 또는 62의 방법.
64. 상기 표지된 항체 결합제는 상기 암 세포 관련 항원과의 혼합물로 제공되는, 실시형태 61 내지 63 중 어느 하나의 방법.
65. 상기 표지된 항체 결합제는 상기 암 세포 관련 항원을 제공한 이후 제공되는, 실시형태 61 내지 63 중 어느 하나의 방법.
66. 상기 표지된 항체 결합제를 상기 암 세포 관련 항원에 결합시키는 것을 모니터링하는 단계는 상기 미세유체 디바이스를 촬상하는 단계를 포함하는, 실시형태 61 내지 65 중 어느 하나의 방법.
67. 상기 촬상은 형광 촬상을 포함하는, 실시형태 66의 방법.
68. 촬상은 복수의 이미지들을 촬영하는 단계를 포함하는, 실시형태 66 또는 67의 방법.
69. 상기 복수의 이미지들은 고정된 시간 간격들로 촬영되는, 실시형태 68의 방법.
70. 해리된 세포 샘플은 하나의 고형 종양 샘플로부터 수득되는, 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나의 방법.
71. 해리된 세포 샘플은 다수의 고형 종양 샘플들로부터 수득되는, 실시형태 1 내지 69 중 어느 하나의 방법.
72. 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계는 상기 적어도 하나의 고형 종양 샘플을 수득하는 단계, 및 상기 적어도 하나의 고형 종량 샘플로부터 단일 세포들을 해리하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 71 중 어느 하나의 방법.
73. 상기 해리된 세포 샘플의 개별적인 세포들은: 콜라게나아제 플러스 DNase 분해; 및/또는 세포 해리기에 의해 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 해리되는, 실시형태 1 내지 72 중 어느 하나의 방법.
74. 상기 해리된 세포 샘플을 로딩하는 단계는: 원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 B 세포들을 갖는 B 세포가 풍부한 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플을 분획하는 단계; 및 상기 B 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 72 중 어느 하나의 방법.
75. 상기 분획하는 단계는 CD19, CD20, IgM, IgD, CD38, CD27, CD138, PNA, 및 GL7로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 사용하여 상기 해리된 세포 샘플로부터 B 세포들을 선택하는 단계를 포함하는, 실시형태 74의 방법.
76. 상기 해리된 세포 샘플 또는 상기 B 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하기 전에, 상기 방법은 상기 해리된 세포 샘플의 암 세포들을 검출 가능한 마커로 표지하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 75 중 어느 하나의 방법.
77. 상기 해리된 세포 샘플을 로딩하는 단계는: 원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 암 세포들을 갖는 암 세포가 풍부한 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플을 분획하는 단계; 및 상기 암 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 76 중 어느 하나의 방법.
78. 상기 방법은 적어도 하나의 고립 영역 안으로의 이동을 위한 적어도 하나의 암 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 76의 방법.
79. 상기 방법은 적어도 하나의 고립 영역으로 안으로의 이동을 위한 적어도 하나의 암 세포를 선택하는 단계를 더 포함하고, 상기 적어도 하나의 암 세포는 검출 가능한 마커의 검출에 기초하여 선택되는, 실시형태 77의 방법.
80. 상기 적어도 하나의 암 세포들은, 상기 B 세포들이 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 고립 영역들 안으로 이동되기 이전에, 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 미세유체 디바이스의 고립 영역 안으로 이동되는, 실시형태 79의 방법.
81. 상기 암 세포가 풍부한 분획은, 상기 B 세포들이 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 고립 영역들 안으로 이동된 이후에 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역 안으로 로딩되는, 실시형태 77의 방법.
82. 상기 암 세포들은 고립 영역들에 진입하지 않는, 실시형태 77의 방법.
83. 상기 암 세포들은 해리된 세포 샘플로부터 선택되거나 또는 상기 암에 특이적인 적어도 하나의 마커 (예를 들어, 본원에 개시된 암 관련 마커들 중 임의의 마커) 를 사용하여 풍부하게 되는, 실시형태 76 내지 82 중 어느 하나의 방법.
84. 상기 암 세포들은 해리된 세포 샘플로부터 분리되거나 또는 형태학적 차이들을 이용하여 풍부하게 되는, 실시형태 76 내지 83 중 어느 하나의 방법.
85. 암 세포들에서 다운 규제되는 적어도 하나의 마커를 이용하여 상기 해리된 세포 샘플로부터 암 세포들이 선택되어, 정상 세포들을 상기 암 세포들로부터 고립시키는, 실시형태 76 내지 84 중 어느 하나의 방법.
86. 상기 B 세포들 및/또는 암 세포들은 FACS에 의해 해리된 세포 샘플로부터 선택되는, 실시형태 74 내지 85 중 어느 하나의 방법.
87. 상기 B 세포들 및/또는 암 세포들은 자성 비드 기반의 분류에 의해 해리된 세포 샘플로부터 선택되는, 실시형태 74 내지 86 중 어느 하나의 방법.
88. 고형 종양 샘플은 종양 생검인, 실시형태 1 내지 87 중 어느 하나의 방법.
89. 상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 상기 종양은 3차 림프 구조를 포함하는, 실시형태 1 내지 88 중 어느 하나의 방법.
90. 상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 종양은 유방암, 비뇨생식기 암 (예를 들어, 고환암, 전립선 암, 또는 정액 소낭, 정액 도관 또는 음경의 암); 또는 여성 생식기관의 암 (예를 들어, 난소 암, 자궁 암, 자궁 경부암, 질암, 또는 난관의 암)), 신경계의 암 (예컨대, 신경아세포종), 장암 (예를 들어, 직장암), 폐암, 흑색종, 또는 다른 타입의 암인, 실시형태 1 내지 89 중 어느 하나의 방법.
91. 상기 종양은 골수 유방암인, 실시형태 90의 방법.
92. 상기 종양은 중피종 (mesothelioma) 인, 실시형태 90의 방법.
93. 상기 방법은 적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 클로닝된 B 세포들의 모집단을 미세유체 디바이스로부터 반출하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 92 중 어느 하나의 방법.
94. 각각의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 클로닝된 B 세포들의 모집단은 개별적으로 반출되는, 실시형태 93의 방법.
95. 상기 적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 B 세포들의 클론성 모집단의 일부 또는 전부에 대해 항체 시퀀싱을 수행하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 94 중 어느 하나의 방법.
96. 항체 시퀀싱을 수행하는 단계는 상기 적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 B 세포들의 클론성 모집단의 일부 또는 전부로부터 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변의 도메인 항체 시퀀스들을 결정하는 단계를 포함하는, 실시형태 95의 방법.
97. 상기 방법은 상기 적어도 하나의 식별된 B 세포로부터의 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변의 도메인 시퀀스들의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 치료제를 생성하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 96 중 어느 하나의 방법.
98. T 또는 NK 세포들은 상기 해리된 세포 샘플에 존재하는, 실시형태 1 내지 97 중 어느 하나의 방법.
99. 상기 방법은 원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 T 또는 NK 세포들을 갖는 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플 상에서 선택을 수행하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 98의 방법.
100. 상기 T 또는 NK 세포들은 동일한 환자의 고형 종양 샘플(들)로부터 수득되는, 실시형태 98 또는 99의 방법.
101. 상기 T 세포들은 CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, 및 CD3으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 사용하여 해리된 세포 샘플로부터 분리되거나; 또는 상기 NK 세포들은 마커로서 CD56을 사용함으로써 해리된 세포 샘플로부터 분리되는, 실시형태 98 내지 100 중 어느 하나의 방법.
102. 개별적인 T 또는 NK 세포들이 환자로부터 선택 및 클로닝되는, 실시형태 98 내지 101 중 어느 하나의 방법.
103. 상기 방법은 환자의 암 세포들 및 다른 공급원으로부터의 암 세포들 모두에 결합할 수 있는 항체들을 생성하는 적어도 하나의 B 세포를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 포함하는, 실시형태 1 내지 102 중 어느 하나의 방법.
104. 상기 방법은 상기 B 세포(들)에 의해 생성되는 항체들이 비-암 세포들에 결합할 수 있는지 여부를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 더 포함하는, 실시형태 1 내지 103 중 어느 하나의 방법.
105. 상기 비-암 세포들 및 상기 암 세포들은 상기 적어도 하나의 종양 샘플을 제공한 환자로부터의 것인, 실시형태 104의 방법.
106. 동일한 미세유체 디바이스는 항체들을 암 세포 및 비-암 세포에 결합하는 것을 식별하는데 사용되는, 실시형태 104 또는 105의 방법.
107. 상기 암 세포 및 비-암 세포는 동일한 흐름 경로에서 순차적으로 로딩되는, 실시형태 106의 방법.
108. 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 항체 또는 그 단편으로 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
109. 상기 종양 샘플은 치료받는 동일한 환자로부터 취해지는, 실시형태 108의 방법.
110. 치료를 위한 상기 종양 샘플을 수득하기까지의 시간은 최대 약 2 개월인, 실시형태 108 또는 109의 방법.
111. 상기 항체 또는 그 단편은 단일 사슬 항체인, 실시형태 108 내지 110 중 어느 하나의 방법.
112. 상기 항체 또는 그 단편은 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 갖는, 실시형태 108 내지 110 중 어느 하나의 방법.
113. 상기 항체는 엔지니어링된 T 또는 NK 세포 상에 디스플레이되는, 실시형태 108 내지 111 중 어느 하나의 방법.
114. 상기 엔지니어링된 T 세포는 키메릭 항원 수용체 T 세포이거나 엔지니어링된 NK 세포는 키메릭 항원 수용체 NK 세포인, 실시형태 113의 방법.
115. 상기 T 또는 NK 세포는 상기 항체를 디스플레이하기 위해 엔지니어링되기 이전에 동일한 환자로부터 수득된, 실시형태 113 또는 114의 방법.
116. 상기 T 또는 NK 세포는 환자의 종량 샘플로부터 수득된, 실시형태 115의 방법.
117. 상기 항체 또는 그 단편은 다른 요법과 병용하여 투여되는, 실시형태 108 내지 116 중 어느 하나의 방법.
118. 병용 요법은 수술, 방사선, 항암 화학요법, CAR-T 세포 요법, CAR-NK 세포 요법, T 세포 요법, 다른 면역요법, 또는 면역 자극 분자 또는 종양 특이 바이러스의 투여인, 실시형태 117의 방법.
119. 검출 가능한 표지에 콘쥬게이트된 항체 또는 그 단편을 투여하는 단계를 포함하는 환자의 암을 표지 또는 검출하는 방법으로서, 상기 항체 또는 그 단편은 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된다.
120. 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 CDR들; 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 경쇄 CDR들; 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR; 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 가변 영역; 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 경쇄 가변 영역; 또는 적어도 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 엔지니어링된 항체 구조물.
121. 엔지니어링된 항체 구조물은 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된 항체의 변형예 (식별된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변의 영역들에서 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 1 내지 5개의 아미노산 치환들, 첨가들 또는 삭제들을 갖는 변형예) 인, 엔지니어링된 항체 구조물.
122. 상기 구조물은 Fab, Fab'(2), scFv, 다가 scFv, 미니바디, 이중특이적 항체, 또는 카멜 가변적인 기능성 중쇄 도메인인, 실시형태 120 또는 121의 엔지니어링된 항체 구조물.
123. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 T 또는 NK 세포로서, 상기 항체 또는 그 단편은 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 의해 식별된다.
124. 상기 T 또는 NK 세포 및 항체 또는 그 단면은 동일한 환자로부터 수득되는, 실시형태 123의 엔지니어링된 T 또는 NK 세포.
125. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 T 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 따라 종양 샘플을 결합시키는 항체를 식별하는 단계; 및 항체 또는 그 단편을 발현하기 위해 T 세포를 유전적으로 엔지니어링하는 단계를 포함한다.
126. 상기 T 세포, 상기 항체를 발현하는 상기 B 세포, 및 상기 종양 샘플이 동일한 환자로부터 수득된, 실시형태 125의 방법.
127. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 NK 세포를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 실시형태 1 내지 107 중 어느 하나의 방법에 따라 종양 샘플에 결합하는 항체를 식별하는 단계; 및 항체 또는 그 단편을 발현하기 위해 NK 세포를 유전적으로 엔지니어링하는 단계를 포함한다.
128. 상기 NK 세포, 상기 항체를 발현하는 상기 B 세포, 및 상기 종양 샘플은 동일한 환자로부터 수득된, 실시형태 127의 방법.
등가물들
상기 기재된 명세서는 당업자가 실시형태들을 실시할 수 있을 정도로 충분할 것이 고려된다. 상기 기재 및 예들은 특정 실시형태들을 상술하고 숙고된 최상의 모드를 기재한다. 그러나, 본 발명의 내용이 텍스트로 상술될 수 있음에도 불구하고, 실시형태는 많은 방식으로 실시될 수 있으며, 첨부된 청구항 및 그 등가물에 따라 해석되어야 함을 이해할 수 있다.

Claims (128)

  1. 항체 치료제의 제조 방법으로서,
    a. 환자로부터 수득된 적어도 하나의 고형 종양 샘플로부터 해리된 세포 샘플을 제공하는 단계;
    b. 상기 해리된 세포 샘플을 적어도 하나의 흐름 영역 및 상기 흐름 영역에 유체적으로 접속된 적어도 하나의 고립 영역을 갖는 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계;
    c. 적어도 하나의 B 세포를 상기 해리된 세포 샘플로부터 상기 미세유체 디바이스에서의 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시켜, 적어도 하나의 고립된 B 세포를 수득하는 단계; 및
    d. 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고립 영역은 B 세포 림프구 생존력을 촉진시키는 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면을 포함하고, 상기 컨디셔닝된 표면은 공유 결합된 분자들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 고립 영역은 B 세포 림프구 생존력을 촉진시키는 복수의 컨디셔닝된 표면들을 포함하고, 각각의 컨디셔닝된 표면은 공유 결합된 분자들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 컨디셔닝된 표면 또는 상기 복수의 컨디셔닝된 표면들 중 각각의 컨디셔닝된 표면은 공유 결합된 친수성 분자들의 층을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 중합체들, 아미노산들을 포함하는 중합체들, 및 그 조합들의 그룹으로부터 선택되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 고립 영역은 B 세포 생존력을 촉진시키는 코팅 재료로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 고립 영역은 B 세포 생존력을 촉진시키는 코팅 재료로 각각 코팅된 복수의 표면들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 코팅 재료는 친수성 분자들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 친수성 분자들은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는 중합체들, 아미노산들을 포함하는 중합체들, 및 그 조합들의 그룹으로부터 선택되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 상기 미세유체 디바이스에서 데드-엔드 (dead-end) 를 형성하고, 그리고 상기 흐름 영역이 실질적으로 흐르는 제 1 유체 배지로 충진되고 상기 고립 영역(들)이 실질적으로 제 2 유체 배지로 충진될 때:
    a. 상기 제 2 배지의 성분들은 상기 제 1 배지 안으로 확산될 수 있고 상기 제 1 배지의 성분들은 제 2 배지 안으로 확산될 수 있으며; 그리고
    b. 상기 흐름 영역으로부터 상기 고립 영역으로의 상기 제 1 배지의 흐름은 실질적으로 없는, 항체 치료제의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스의 상기 흐름 영역은 미세유체 채널을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 고립 영역의 각각은 대응하는 격리 챔버의 일부이고, 각각의 격리 챔버는 대응하는 고립 영역을 상기 미세유체 채널로 유체적으로 접속시키는 접속 영역을 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 접속 영역은 약 20 마이크론 내지 약 60 마이크론의 폭 (Wcon) 을 갖는, 항체 치료제의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 대응하는 접속 영역의 폭 (Wcon) 보다 큰 폭 (Wiso) 을 갖는, 항체 치료제의 제조 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 고립 영역(들)의 각각은 약 50 마이크론 내지 약 250 마이크론인 폭 (Wiso) 을 갖는, 항체 치료제의 제조 방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 격리 챔버들의 각각은 약 0.5 nl 내지 약 2.5 nl의 체적을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미세유체 디바이스는 DEP (dielectrophoretic) 구성을 갖는 기판을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 DEP 힘을 사용하여 상기 적어도 하나의 B 세포를 이동시키는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  19. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포는 중력 및/또는 국부화된 유체 흐름을 이용하여 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플을 로딩하기 이전에, 상기 방법은 상기 해리된 세포 샘플 내의 B 세포들을 검출가능한 마커로 표지하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 상기 검출가능한 마커의 검출에 기초하여 이동을 위한 적어도 하나의 B 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  22. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    적어도 하나의 B 세포를 적어도 하나의 고립 영역으로 이동시키는 단계는 복수의 개별적인 B 세포들을 대응하는 복수의 분리된 고립 영역들로 이동시키는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    B 세포 활성화를 자극하는 자극제와 상기 적어도 하나의 B 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 자극제는 CD40 작용제를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 CD40 작용제는 CD40L, 그 유도체, 또는 항-CD40 항체를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  26. 제 23 항에 있어서,
    상기 자극제는 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 CD40L+ 피더 세포들은 T 세포들 또는 이들의 유도체인, 항체 치료제의 제조 방법.
  28. 제 24 항에 있어서,
    상기 자극제는 톨 유사 (toll-like) 수용체 (TLR) 작용제를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 TLR 작용제는 CpG 올리고뉴클레오티드인, 항체 치료제의 제조 방법.
  30. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 주기 동안 상기 자극제와 접촉되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 상기 주기 동안 실질적으로 연속적으로 상기 자극제와 접촉되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  32. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 B 세포에 배양 배지를 제공하는 단계를 더 포함하고, 상기 배양 배지는 B 세포 팽창을 촉진하는 하나 이상의 성장 유도제들을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 성장 유도제들은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21 및 BAFF의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  34. 제 32 항에 있어서,
    제공된 상기 배양 배지는 자극제를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  35. 제 32 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포는 1 내지 10 일의 주기 동안 제공된 배양 배지인, 항체 치료제의 제조 방법.
  36. 제 32 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포(들)의 각각의 B 세포는 상기 미세유체 디바이스의 고립 영역에서 약 8 내지 20 세포들의 세포 카운트까지 배양되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  37. 제 32 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계 및 상기 적어도 하나의 B 세포로 배양 배지를 제공하는 단계는 실질적으로 동연의 시간 주기에 걸쳐 예비 성형되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  38. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 적어도 상기 해리된 세포 샘플을 상기 미세유체 디바이스에 로딩하기 이전에 수행되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  39. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 적어도 하나의 고립 영역으로 적어도 이동시킨 후에 수행되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  40. 제 23 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 B 세포를 상기 자극제와 접촉시키는 단계는 상기 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계 동안 적어도 수행되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  41. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계는 상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 상기 암 세포 관련 항원을 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원은 상기 유체 배지에 용해되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  44. 제 41 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 상기 암 세포 관련 항원을 포함하는 마이크로-객체들을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 마이크로-객체들은 세포들, 리포솜들, 지질 나노래프트들, 및 비드들로부터 선택되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 마이크로-객체들은 비드들이고, 그리고 상기 암 세포 관련 항원은 상기 비드들에 콘쥬게이트되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원은 적어도 하나의 종양 샘플에 존재하는 암 세포들의 세포 표면 상에 존재하는 막 관련 항원인, 항체 치료제의 제조 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    상기 비드들에 콘쥬게이트되는 상기 암 세포 관련 항원은 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 고립된 암 세포들로부터 수득된 세포 막 제조로부터의 것인, 항체 치료제의 제조 방법.
  49. 제 45 항에 있어서,
    상기 마이크로-객체들은 암 세포들인, 항체 치료제의 제조 방법.
  50. 제 49 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 환자의 적어도 하나의 종양 샘플로부터의 암 세포들에 의해 발현되는 마커들을 발현하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  51. 제 49 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 고립되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  52. 제 50 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 다른 환자로부터 수득된 하나 이상의 종양 샘플들로부터 고립되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  53. 제 52 항에 있어서,
    상기 환자로부터 상기 적어도 하나의 고형 종양 샘플이 수득되었고, 다른 환자가 동일한 타입의 암으로 진단된, 항체 치료제의 제조 방법.
  54. 제 49 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 암 세포주에서 유래된 것인, 항체 치료제의 제조 방법.
  55. 제 44 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는:
    상기 암 세포 관련 항원을 포함하는 마이크로-객체들을 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 흐르게 하는 단계; 및
    상기 배지에서의 상기 마이크로-객체들의 적어도 일부가 상기 적어도 하나의 고립 영역에 근접하는 상기 흐름 영역의 일 부분에 위치할 때 상기 유체 배지의 흐름을 정지시키는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    상기 암 세포 관련 항원을 상기 미세유체 디바이스 안으로 도입하는 단계는 상기 마이크로-객체들 중 적어도 하나의 마이크로-객체를 상기 미세유체 디바이스에서의 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 마이크로-객체를 상기 미세유체 디바이스에서의 상기 적어도 하나의 고립 영역 안으로 이동시키는 단계는 적어도 하나의 마이크로-객체를 복수의 고립 영역들 안으로 이동시키는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  58. 제 56 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 마이크로-객체는 적어도 하나의 B 세포를 포함하는 적어도 하나의 고립 영역(들) 안으로 이동되고, 이로써 적어도 하나의 마이크로-객체 및 적어도 하나의 B 세포를 갖는 적어도 하나의 고립 영역을 생성하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  59. 제 56 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 마이크로-객체 및 상기 적어도 하나의 B 세포는 다른 고립 영역들 안으로 이동되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  60. 제 59 항에 있어서,
    상기 다른 고립 영역들은 상기 미세유체 디바이스 내에서 서로 인접하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  61. 제 41 항에 있어서,
    암 세포 관련 항원에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 상기 적어도 하나의 고립된 B 세포를 식별하는 단계는:
    표지된 항체 결합제를 포함하는 유체 배지를 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역을 통해 흐르게 하는 단계;
    상기 유체 배지에서의 상기 표지된 항체 결합제의 적어도 일부가 상기 적어도 하나의 고립 영역에 근접하는 상기 흐름 영역의 일 부분에 위치할 때 상기 유체 배지의 흐름을 정지시키는 단계; 및
    상기 표지된 항체 결합제를 상기 암 세포 관련 항원에 결합시키는 것을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제는 표지된 항-IgG 항체인, 항체 치료제의 제조 방법.
  63. 제 61 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제는 형광 표지에 공유 결합되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  64. 제 61 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제는 상기 암 세포 관련 항원과의 혼합물로 제공되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  65. 제 61 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제는 상기 암 세포 관련 항원을 제공한 이후 제공되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  66. 제 61 항에 있어서,
    상기 표지된 항체 결합제를 상기 암 세포 관련 항원에 결합시키는 것을 모니터링하는 단계는 상기 미세유체 디바이스를 촬상하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 촬상은 형광 촬상을 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  68. 제 66 항에 있어서,
    상기 촬상은 복수의 이미지들을 촬영하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  69. 제 68 항에 있어서,
    상기 복수의 이미지들은 고정된 시간 간격들로 촬영되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  70. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플은 하나의 고형 종양 샘플로부터 수득되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  71. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플은 다수의 고형 종양 샘플들로부터 수득되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  72. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    해리된 세포 샘플을 제공하는 단계는 상기 적어도 하나의 고형 종양 샘플을 수득하는 단계, 및 상기 적어도 하나의 고형 종량 샘플로부터 단일 세포들을 해리하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  73. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플의 개별적인 세포들은:
    a. 콜라게나아제 플러스 DNase 분해; 및/또는
    b. 세포 해리기에 의해 상기 적어도 하나의 종양 샘플로부터 해리되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  74. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플을 로딩하기 이전에, 상기 방법은:
    원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 B 세포들을 갖는 B 세포가 풍부한 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플을 분획하는 단계; 및
    상기 B 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    상기 분획하는 단계는 CD19, CD20, IgM, IgD, CD38, CD27, CD138, PNA, 및 GL7로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 사용하여 상기 해리된 세포 샘플로부터 B 세포들을 선택하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  76. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플 또는 상기 B 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으에 로딩하기 전에, 상기 방법은 상기 해리된 세포 샘플의 암 세포들을 검출 가능한 마커로 표지하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  77. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 해리된 세포 샘플을 로딩하기 이전에, 상기 방법은:
    원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 암 세포들을 갖는 암 세포가 풍부한 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플을 분획하는 단계; 및
    상기 암 세포가 풍부한 분획을 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  78. 제 76 항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 하나의 고립 영역 안으로의 이동을 위한 적어도 하나의 암 세포를 선택하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  79. 제 77 항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 하나의 고립 영역으로의 이동을 위한 적어도 하나의 암 세포를 선택하는 단계를 더 포함하고, 상기 적어도 하나의 암 세포는 검출 가능한 마커의 검출에 기초하여 선택되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  80. 제 79 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 암 세포는, 상기 B 세포들이 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 고립 영역들 안으로 이동되기 이전에, 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 미세유체 디바이스의 고립 영역 안으로 이동되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  81. 제 77 항에 있어서,
    상기 암 세포가 풍부한 분획은, 상기 B 세포들이 상기 미세유체 디바이스 안으로 로딩되고 상기 고립 영역들 안으로 이동된 이후에 상기 미세유체 디바이스의 흐름 영역 안으로 로딩되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  82. 제 81 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 고립 영역들에 진입하지 않는, 항체 치료제의 제조 방법.
  83. 제 77 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 상기 암에 특이적인 적어도 하나의 마커를 사용하여 풍부하게 되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  84. 제 77 항에 있어서,
    상기 암 세포들은 형태학적 차이들을 이용하여 풍부하게 되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  85. 제 77 항에 있어서,
    암 세포들에서 다운 규제되는 적어도 하나의 마커를 이용하여 상기 암 세포들을 풍부하게 하여, 정상 세포들을 상기 암 세포들로부터 고립시키는, 항체 치료제의 제조 방법.
  86. 제 74 항에 있어서,
    상기 B 세포들은 FACS를 이용하여 상기 해리된 세포 샘플을 프로세싱함으로써 풍부하게 되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  87. 제 74 항에 있어서,
    상기 B 세포들은 자기 비드 기반의 분류를 이용하여 상기 해리된 세포 샘플을 프로세싱함으로써 풍부하게 되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  88. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 고형 종양 샘플은 종양 생검인, 항체 치료제의 제조 방법.
  89. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 상기 종양은 3차 림프 구조를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  90. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 상기 종양은 유방암, 비뇨생식기 암, 신장암, 고환암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁 경부암, 신경계의 암, 신경아세포종, 장암, 직장암, 폐암, 또는 흑색종인, 항체 치료제의 제조 방법.
  91. 제 90 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 상기 종양은 골수 유방암인, 항체 치료제의 제조 방법.
  92. 제 90 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 종양 샘플을 수득한 상기 종양은 중피종 (mesothelioma) 인, 항체 치료제의 제조 방법.
  93. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은:
    적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 클로닝된 B 세포들의 모집단을 상기 미세유체 디바이스로부터 반출하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  94. 제 93 항에 있어서,
    각각의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 클로닝된 B 세포들의 모집단은 개별적으로 반출되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  95. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 B 세포들의 클론성 모집단의 일부 또는 전부에 대해 항체 시퀀싱을 수행하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  96. 제 95 항에 있어서,
    항체 시퀀싱을 수행하는 단계는 상기 적어도 하나의 식별된 B 세포, 또는 그로부터 유래된 B 세포들의 클론성 모집단의 일부 또는 전부로부터 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변의 도메인 항체 시퀀스들을 결정하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  97. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 적어도 하나의 식별된 B 세포로부터의 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 가변의 도메인 시퀀스들의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 치료제를 생성하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  98. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    T 또는 NK 세포들은 상기 해리된 세포 샘플에 존재하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  99. 제 98 항에 있어서,
    상기 방법은 원래의 해리된 샘플보다 더 큰 농도의 T 또는 NK 세포들을 갖는 분획을 고립시키기 위해 상기 해리된 세포 샘플 상에서 선택을 수행하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  100. 제 98 항에 있어서,
    상기 T 또는 NK 세포들은 동일한 환자의 고형 종양 샘플(들)로부터 수득되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  101. 제 99 항에 있어서,
    a. 상기 T 세포들은 CD4, CD8, CD25, CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, 및 CD3로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 사용함으로써 상기 해리된 세포 샘플로부터 분리되거나, 또는
    b. 상기 NK 세포들은 마커로서 CD56을 사용함으로써 상기 해리된 세포 샘플로부터 분리되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  102. 제 99 항에 있어서,
    개별적인 T 또는 NK 세포들은 환자로부터 선택 및 클로닝되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  103. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 환자의 암 세포들 및 다른 공급원으로부터의 암 세포들 모두에 결합할 수 있는 항체들을 생산하는 적어도 하나의 B 세포를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  104. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 방법은 상기 B 세포(들)에 의해 생산되는 항체들이 비-암 세포들에 결합할 수 있는지 여부를 식별하기 위해 미세유체 디바이스를 사용하는 단계를 더 포함하는, 항체 치료제의 제조 방법.
  105. 제 104 항에 있어서,
    상기 비-암 세포들 및 상기 암 세포들은 상기 적어도 하나의 종양 샘플을 제공한 환자로부터의 것인, 항체 치료제의 제조 방법.
  106. 제 104 항에 있어서,
    동일한 미세유체 디바이스는 항체들을 암 세포 및 비-암 세포에 결합하는 것을 식별하는데 사용되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  107. 제 106 항에 있어서,
    상기 암 세포 및 비-암 세포는 동일한 흐름 경로에서 순차적으로 로딩되는, 항체 치료제의 제조 방법.
  108. 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 생산된 항체 또는 그 단편으로 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  109. 제 108 항에 있어서,
    상기 종양 샘플은 치료받는 동일한 환자로부터 취해지는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  110. 제 108 항에 있어서,
    치료를 위한 상기 종양 샘플을 수득하기까지의 시간은 최대 약 2 개월인, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  111. 제 108 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 단편은 단일 사슬 항체인, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  112. 제 108 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 단편은 2개의 중쇄들 및 2개의 경쇄들을 갖는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  113. 제 108 항에 있어서,
    상기 항체는 엔지니어링된 T 또는 NK 세포 상에 디스플레이되는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  114. 제 113 항에 있어서,
    상기 엔지니어링된 T 세포는 키메릭 항원 수용체 T 세포이거나 또는 상기 엔지니어링된 NK 세포는 키메릭 항원 수용체 NK 세포인, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  115. 제 113 항에 있어서,
    상기 T 또는 NK 세포는 상기 항체를 디스플레이하기 위해 엔지니어링되기 이전에 동일한 환자로부터 수득되는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  116. 제 115 항에 있어서,
    상기 T 또는 NK 세포는 환자의 종량 샘플로부터 수득된, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  117. 제 108 항에 있어서,
    상기 항체 또는 그 단편은 다른 요법과 병용하여 투여되는, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  118. 제 117 항에 있어서,
    병용 요법은 수술, 방사선, 항암 화학요법, CAR-T 세포 요법, CAR-NK 세포 요법, T 세포 요법, 다른 면역요법, 또는 면역 자극 분자 또는 종양 특이 바이러스의 투여인, 암이 있는 환자의 치료 방법.
  119. 환자의 암을 표지 또는 검출하는 방법으로서,
    검출 가능한 표지에 콘쥬게이트된 항체 또는 그 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항체 또는 그 단편은 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 생산되는, 환자의 암을 표지 또는 검출하는 방법.
  120. 엔지니어링된 항체 구조물로서,
    a. 적어도 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 CDR들;
    b. 적어도 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR들;
    c. 적어도 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 가변 영역; 또는
    d. 적어도 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 포함하는, 엔지니어링된 항체 구조물.
  121. 엔지니어링된 항체 구조물은 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별된 항체의 변형예인, 엔지니어링된 항체 구조물.
  122. 제 120 항에 있어서,
    상기 구조물은 Fab, Fab'(2), scFv, 다가 scFv, 미니바디, 이중특이적 항체, 또는 카멜 가변적인 기능성 중쇄 도메인인, 엔지니어링된 항체 구조물.
  123. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 T 또는 NK 세포로서,
    상기 항체 또는 그 단편은 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 의해 식별되는, 엔지니어링된 T 또는 NK 세포.
  124. 제 123 항에 있어서,
    상기 T 또는 NK 세포 및 상기 항체 또는 그 단면은 동일한 환자로부터 수득된, 엔지니어링된 T 또는 NK 세포.
  125. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 T 세포를 제조하는 방법으로서,
    a. 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 따라 종양 샘플에 결합하는 항체를 식별하는 단계;
    b. 상기 항체 또는 그 단편을 발현하기 위해 T 세포를 유전적으로 엔지니어링하는 단계를 포함하는, 엔지니어링된 T 세포를 제조하는 방법.
  126. 제 125 항에 있어서,
    상기 T 세포, 상기 항체를 발현하는 상기 B 세포, 및 상기 종양 샘플이 동일한 환자로부터 수득된, 엔지니어링된 T 세포를 제조하는 방법.
  127. 외부 표면 상에 디스플레이된 항체 또는 그 단편을 포함하는 엔지니어링된 NK 세포를 제조하는 방법으로서,
    a. 제 1 항 또는 제 2 항의 방법에 따라 종양 샘플에 결합하는 항체를 식별하는 단계;
    b. 상기 항체 또는 그 단편을 발현하기 위해 NK 세포를 유전적으로 엔지니어링하는 단계를 포함하는, 엔지니어링된 NK 세포를 제조하는 방법.
  128. 제 127 항에 있어서,
    상기 NK 세포, 상기 항체를 발현하는 상기 B 세포, 및 상기 종양 샘플은 동일한 환자로부터 수득된, 엔지니어링된 NK 세포를 제조하는 방법.
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