ES2316576T3

ES2316576T3 - Nueva proteina de union a inmunoglobulina d expuesta sobre la superficie procedente de moraxella catarrhalis.

Info

Publication number: ES2316576T3
Application number: ES02741607T
Authority: ES
Inventors: Arne Forsgren; Kristian Riesbeck; Hakan Janson
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-07-04
Filing date: 2002-07-01
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2022-07-01
Also published as: JP4443922B2; EP1409684A1; AU2002314688B2; DE60230764D1; EP1409684B1; ATE420181T1; US20100098729A1; JP2005500837A; CA2452695A1; WO2003004651A1; US20050027104A1; SE0102410D0; US20110280910A1; US7981434B2; US7470432B2; NZ530291A; AU2002314688C1

Abstract

Una proteína expuesta sobre la superficie, que puede detectarse en Moraxella catarrhalis, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie, teniendo el fragmento adhesivo la capacidad de unirse a eritrocitos y a células epiteliales.

Description

Nueva proteína de unión a inmunoglobulina D expuesta sobre la superficie procedente de Moraxella catarrhalis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína expuesta sobre la superficie que puede detectarse en Moraxella catarrhalis, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, y a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína expuesta sobre la superficie, y a un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie.

Antecedentes de la invención

Moraxella catarrhalis es un diplococo Gram-negativo que, durante mucho tiempo, se consideró un comensal relativamente inofensivo en el tracto respiratorio. En la actualidad, es la tercera causa más frecuente de otitis media y también un agente significativo en la sinusitis y las infecciones del tracto respiratorio inferior en adultos con enfermedad pulmonar. M. catarrhalis también es uno de los habitantes más comunes de la faringe de niños sanos.

Hace dos décadas se demostró que Haemophilus influenzae y M. catarrhalis muestran una alta afinidad por la IgD soluble y la IgD unida a superficies (1). La unión a IgD parece ser paralela a una interacción similar con la IgD unida a superficies a nivel celular, un fenómeno que explica los fuertes efectos mitógenos que tienen H. influenzae y M. catarrhalis sobre los linfocitos humanos (2-4). Se ha aislado y clonado una proteína de la membrana externa de unión a IgD de H. influenzae (proteína D) y se ha demostrado que es un importante factor de patogenicidad (5). Sin embargo, la proteína D no se une a la mayoría de IgD de mielomas ensayados y se ha sugerido que H. influenzae encapsulado con serotipo b expresa otro receptor de IgD (6).

Estudios anteriores han demostrado que las proteínas de la membrana externa ("outer membrane proteins", OMP) procedentes de una colección diversa de aislados de Moraxella muestran un alto grado de similitud (7). Los investigadores han centrado sus esfuerzos de investigación principalmente en un grupo seleccionado de proteínas. Recientes estudios han demostrado que un antígeno de superficie de alto peso molecular, denominado UspA o HMW-OMP, está formado realmente por dos proteínas diferentes. Estas proteínas se denominan UspA1 y UspA2 (8, 9, 10). Las masas moleculares aparentes de estas OMP son mayores que 250 kDa, según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE. Una reducción con ácido fórmico produce bandas de aproximadamente 120 a 140 kDa, lo cual sugiere que las proteínas UspA forman un complejo oligómero compuesto de varias subunidades monómeras (11). La masa predicha de cada proteína, según se deduce a partir de los genes clonados, es de 88 kDa y 62 kDa para UspA1 y UspA2, respectivamente. Se cree que la diferencia en la masa deducida y la masa determinada utilizando SDS-PAGE es debida a una estructura en espiral enrollada predicha (9).

En una reciente publicación de patente se aisló una proteína de la membrana externa de M. catarrhalis con una masa molecular de aproximadamente 200 kDa (12). También se proporciona una secuencia que codifica una proteína de aproximadamente 200 kDa. Se demostró que la proteína era inmunogénica pero no se presentaron más funciones biológicas. Además, se asoció una proteína de 200 kDa con M. catarrhalis hemaglutinante (13, 14).

La CopB es una importante OMP expuesta sobre la superficie de 80 kDa que muestra una moderada conservación antigénica. Además, OMP CD es una proteína de 46 kDa altamente conservada con numerosos epitopos expuestos sobre la superficie, y OMP E es una proteína de 47 kDa detectada sobre una diversidad de cepas heterólogas. Las proteínas de unión a lactoferrina (LbpA y B) y de unión a transferrina (TbpA y B) tienen unos tamaños moleculares de 99-111 y 74-105 kDa, respectivamente.

Ciertas cepas de Staphylococcus aureus producen exotoxinas inmunoestimuladoras, tales como la toxina-1 del síndrome del choque tóxico (TSST-1), la enterotoxina A estafilocócica (SEA), SEB y SEC, estando todas asociadas con el envenenamiento alimentario y el síndrome del choque tóxico (TSS). Estas exotoxinas se han denominado superantígenos (SAg) debido a su capacidad para activar una alta frecuencia de linfocitos T. Los SAg se unen como proteínas sin procesar a moléculas HLA de clase II sobre APC y activan oligoclónicamente células T que expresan cadenas TCR V\beta concretas. La exposición in vivo a cantidades excesivas de SAg da como resultado una fuerte producción de citoquinas que incluyen IL-2, TNF-\alpha e IFN-\gamma, que están asociadas con un síndrome similar al choque tóxico.

Desde el descubrimiento de la primera proteína bacteriana que se une a inmunoglobulinas, la proteína A de S. aureus (SpA), en 1966, esta proteína se ha caracterizado a fondo. Es bien conocida la capacidad de SpA para unirse a la parte Fc de IgG, pero la SpA también se une a una fracción de moléculas de Ig de todas clases, debido a la denominada unión "alternativa", que representa una interacción con la región variable de ciertas cadenas pesadas. Se ha considerado que toda la capacidad de unión a IgG de S. aureus está mediada por SpA. Sin embargo, también se ha informado acerca de la existencia de un segundo gen en S. aureus que codifica una proteína de unión a Ig.

Otros ejemplos de bacterias que se unen a Ig son Streptococcus pyogenes y Peptostreptococcus magnus. S. pyogenes produce la proteína H, que pertenece a la familia de proteínas M, y tiene una fuerte afinidad por la región Fc de IgG. Las proteínas expresadas por algunas cepas se unen a IgA, en lugar de IgG, o a ambas IgG e IgA. La proteína Bac o el antígeno B es una proteína de unión a IgA expresada por ciertas cepas de estreptococos del grupo B. Por último, P. magnus expresa la proteína L, que muestra una afinidad alta y específica por las cadenas ligeras de Ig, en especial por las cadenas ligeras k y, por tanto, interacciona con todas las clases de Ig.

La IgD es una inmunoglobulina exclusiva que existe en forma soluble y en forma unida a la membrana. Ambas formas son codificadas por el mismo gen y son productos de corte y empalme. Todos los linfocitos B maduros tienen receptores de células B (BCR) que consisten en IgM e IgD unidas a membranas. La IgD soluble forma aproximadamente 0,25% de la cantidad total de Ig sérica. La principal función de IgD parece ser como receptor de antígenos sobre la superficie de células B, para optimizar el reclutamiento de células B y la maduración por afinidad acelerada. El antígeno es captado por la IgD mediante endocitosis, seguida de una degradación intracelular y una presentación sobre MHC de clase II para células T que, a su vez, son activadas y producen citoquinas. Por tanto se obtiene la ayuda de las células T, incluyendo numerosas citoquinas (por ejemplo, interleuquina-4) y moléculas coestimuladoras, tales como CD28.

A pesar de que los macrófagos, las células dendríticas y las células B pueden presentar antígenos contra linfocitos T, las células B son 100 veces más eficaces debido a la importancia de la inmunoglobulina que presenta el antígeno que se encuentra sobre la superficie. Una estrategia atractiva para potenciar la inmunización es dirigir directamente un antígeno diana al receptor de células B. Hace tiempo que se ha demostrado que la respuesta de anticuerpos de ratones frente a la albúmina de suero bovina (BSA) conjugada con anticuerpos monoclonales anti-IgD es 100 veces más fuerte comparada con la administración de BSA sin anticuerpos. De forma paralela, se ha demostrado que un antígeno de mieloma de ratón incorporado a la región constante de anticuerpos anti-IgD dirigidos a IgD unida a la superficie produce un aumento de la eficacia de hasta 1000 veces en la presentación de antígenos sobre MHC de clase II (15).

Puede lograrse una inducción de la tolerancia por medios experimentales mediante la activación de células B a través de la IgD de BCR sin ayuda adicional por parte de las células T. También sería posible tratar enfermedades autoinmunológicas induciendo una anergia de células B y, por tanto, inhibiendo la producción de autoanticuerpos. De hecho, ratones propensos a SLE a los que se les administran anticuerpos anti-IgD conjugados con dextrano muestran un desarrollo retrasado de la autoinmunidad. En otro estudio se demostró que la activación de células B a través de IgD disminuye la respuesta de IgE inducida por células T auxiliares 2, lo cual sugiere una terapia para disminuir la producción de IgE en individuos gravemente alérgicos mediante el desplazamiento de la respuesta de anticuerpos desde una respuesta a Th2 a una respuesta a Th1. Dirigiendo los antígenos a la IgD del receptor de las células B puede lograrse una estimulación, una tolerancia y un cambio en la producción de IgE. Además, se ha informado acerca de la activación policlonal. El resultado depende del modelo experimental utilizado. Empleando diferentes construcciones que incluyan diversos segmentos repetidos de unión a IgD es posible adaptar la respuesta.

Las células T son jugadores importantes en la respuesta antitumoral, puesto que reconocen antígenos específicos de tumores. Sin embargo, las importantes células T muestran una actividad generalmente deprimida en pacientes con cáncer, debido a una inmunosupresión general. Por tanto, la activación de células T auxiliares sería muy beneficiosa. En fechas recientes se ha informado acerca de la vacunación contra tumores utilizando células de presentación de antígenos (APC) (17). Los protocolos de inmunización con APC pulsadas ex vivo con antígenos tumorales (péptidos) han demostrado que inducen una presentación eficaz de MHC de clase I para células T citotóxicas. También se ha demostrado que células B transformadas con EBV son capaces de presentar antígenos de melanoma para linfocitos de infiltración tumoral (TIL). En modelos experimentales también se ha demostrado que células tumorales transfectadas con MHC de clase II y moléculas de la superficie B7, que son receptores abundantes sobre células B, serían una estrategia factible para la vacunación de tumores. De forma interesante, ratones que portan el melanoma B16 que fueron inyectados con células B pulsadas con un lisado tumoral procedente de la correspondiente línea celular mostraron una mayor supervivencia debido a un aumento en las células T productoras de IFN-\gamma. También se ha demostrado que células T auxiliares inducidas evocaron una respuesta citotóxica más fuerte contra tumores sólidos. Puesto que un antígeno de mieloma dirigido a IgD induce una respuesta de células T, la estrategia propuesta que emplea proteína bacterianas que se unen a IgD conjugadas con antígenos tumorales específicos sería factible.

Para dirigir un antígeno (por ejemplo, un péptido derivado de un microbio o un tumor específico) a células B que portan IgD para activar respuestas inmunológicas humorales y celulares, una proteína de unión a IgD o un péptido de unión a IgD más corto serían vectores muy factibles. Existen varios ejemplos de estrategias con un ángulo similar de enfoque que han tenido éxito. La respuesta inmunológica humoral en ratones contra la albúmina de suero bovina (BSA) conjugada con anticuerpos monoclonales anti-IgD es 100 veces más fuerte comparada con la administración de BSA por sí sola. Una reciente publicación por Lunde et al. (15) indica que cuando un péptido derivado de un mieloma se integra en la región constante de fragmentos Fab' anti-IgD y se inyecta en ratones se logra una presentación del antígeno 1000 veces más eficaz contra el antígeno en cuestión (15). De forma paralela, el fragmento de unión a Ig de la proteína A de S. aureus condensado con la toxina del cólera aumenta significativamente la respuesta inmunológica sistémica y mucosal de 10 a 100 veces más contra la toxina del cólera (16). Por último, en un modelo tumoral de ratón que emplea el melanoma B16, bien definido desde el punto de vista experimental, los linfocitos B activados que fueron pulsados ex vivo con péptidos derivados del tejido tumoral pueden evocar una respuesta antitumoral más fuerte in vivo y, por consiguiente, una mayor supervivencia (17).

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína expuesta sobre la superficie que puede detectarse en Moraxella catarrhalis, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, o a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, o a un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD, según se describió anteriormente, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse a eritrocitos y células epiteliales.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un fragmento inmunogénico y adhesivo, según se definió anteriormente, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:8.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:2, en el que dicha secuencia de ADN codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrahalis, según se definió anteriormente, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha secuencia de ADN.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un segmento de ADN, según se definió anteriormente, que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:11, en el que dicha secuencia de ADN codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un segmento de ADN, según se definió anteriormente, que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:9, en el que dicha secuencia de ADN codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha proteína, o a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, o a un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, preferiblemente a una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico o de unión a IgD que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, según se definió anteriormente, preferiblemente a una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico y adhesivo que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:8.

En una realización preferida, dichas vacunas se combinan con otra vacuna, y en otra realización preferida, dichas vacunas se combinan con una porción inmunogénica de otra molécula.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido o a un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, o a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido o a un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, preferiblemente a un plásmido o a un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido o a un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, preferiblemente a un plásmido o a un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:8.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un hospedante no humano que comprende al menos un plásmido o un fago, según se definió anteriormente, y que es capaz de producir dicha proteína o variantes, o dicho fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, o dicho fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína, en el que dicho hospedante se elige entre bacterias, levaduras y plantas. En una realización, el hospedante es E. coli.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, o a un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen, preferiblemente a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, o a los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen, preferiblemente a una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:8.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un plásmido o a un fago que comprende dicha secuencia de ADN unida, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un hospedante no humano que comprende al menos un plásmido o un fago, según se definió anteriormente, en el que dicho hospedante se elige entre bacterias, levaduras y plantas. En una realización, el hospedante es E. coli.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína o un polipéptido de fusión, en el que una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una proteína o un polipéptido de fusión, en los que un fragmento inmunogénico o de unión de IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una proteína o un polipéptido de fusión, en los que un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante, según se definió anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto de fusión, en el que una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto de fusión, en el que un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto de fusión, en el que un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie, según se definió anteriormente, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz. Preferiblemente, un producto de fusión en el que un fragmento inmunogénico o de unión a IgD que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:10, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz. Preferiblemente, un producto de fusión en el que un fragmento inmunogénico y adhesivo que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:8, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar IgD utilizando una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, opcionalmente marcada y/o unida a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10 y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar IgD utilizando una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes, opcionalmente unida a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, opcionalmente unido a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para separar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10 y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para aislar una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes. Dicho método comprende las etapas de:

a) someter una suspensión de Moraxella catarrhalis a un proceso de extracción añadiendo un detergente bipolar o no iónico, opcionalmente en presencia de EDTA;

b) aplicar el extracto que comprende la proteína de unión a IgD de Moraxella catarrhalis de la etapa a) a una columna de absorción;

c) eluir la proteína de unión a IgD; y

d) separar la proteína de unión a IgD.

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En otra realización, la concentración del detergente en la etapa a) del método está dentro del intervalo de 0,1-5%, preferiblemente 3%.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad autoinmunológica, que comprende la circulación extracorporal de la sangre a través de un material que comprende una proteína expuesta sobre la superficie según se definió anteriormente, o un fragmento de ésta según se definió anteriormente, para la eliminación de IgD de la sangre.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo purificado que es específico para una porción inmunogénica de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de ésta, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína o variantes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo purificado, según se describió anteriormente, que es específico para un fragmento inmunogénico o de unión a IgD, según se definió anteriormente, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o los variantes que aparecen en la naturaleza o artificialmente modificados de dicho fragmento.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo purificado, según se describió anteriormente, que es específico para un fragmento inmunogénico o adhesivo, según se definió anteriormente, que tiene la capacidad de unirse a eritrocitos y células epiteliales.

Descripción de las figuras

Figura 1: Cromatografía y recromatografía sobre una columna Sephacryl S-400 de un extracto soluble de Empigen® procedente de M. catarrhalis después de una cromatografía de intercambio iónico. La línea continua indica el contenido en proteínas de la primera cromatografía y la línea discontinua es la recromatografía del primer pico. Vo indica el volumen de vacío.

Figura 2: Análisis sobre SDS-PAGE de fracciones que representan diferentes etapas de purificación de MID. Las fracciones se muestran para el extracto bruto en Empigen® al 3%, después de una cromatografía de intercambio iónico sobre una columna de Q-Sepharose, y después de la primera y la segunda filtración en gel sobre una columna de Sephacryl S-400. Se ensayaron dos geles de forma simultánea, uno se tiñó con azul de Coomassie (Tinción) y uno se transfirió sobre membranas Immobilon-P, se sondó con IgD(\kappa) de proteína de mieloma humana (IgD), anticuerpos monoclonales anti-UspA (\alphaUsp) o anti-CopB (\alphaB), seguido de una incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano apropiados. Los pesos moleculares de las proteínas marcadoras se indican a la izquierda.

Figura 3: Unión de MID a sueros de mieloma humano que representan diferentes clases de inmunoglobulinas. Todos los sueros se diluyeron en etapas de dos veces (de 4 a 0,3 \mug) y se aplicaron a una membrana de nitrocelulosa. Después de la saturación, el lavado y el bloqueo se añadió una sonda marcada con [125I]-MID. Después de una incubación durante la noche y más lavados, se visualizó la unión específica de MID-IgD mediante una autorradiografía.

Figura 4: Células B que portan IgD se unen específicamente a MID conjugada con FITC. Los PBL teñidos con mAb conjugados con RPE contra CD19+ (A) o CD3+ (D), seguido de una incubación con MID-FITC se compararon con PBL incubados con mAb anti-CD19 además de un mAb anti-IgD (B). Una doble tinción con CD3+ y mAb anti-IgD se demuestra en (E). En (C) se muestra un panel con PBL preincubados con una fracción de inmunoglobulina de conejo contra IgD humana, seguida de la adición de mAb anti-CD19 y MID-FITC. También se incluye una muestra control sin anticuerpos ni MID-FITC (F). Los PBL se aislaron a partir de sangre humana heparinizada utilizando gradientes en una etapa de Lymphoprep. Los linfocitos (2,5 x 10^{5}) se incubaron con los anticuerpos apropiados, se lavaron y se volvieron a incubar con MID-FITC (10 \mug/ml). Todas las incubaciones se realizaron en hielo y, después de los lavados finales, los PBL se analizaron mediante citometría de flujo. En este experimento particular, 68% de la población total de linfocitos fue seleccionada y analizada. Menos del 2% de las células fueron marcadas cuando se incluyeron mAb isoemparejados como controles negativos. Un suero de conejo preinmune no bloqueó significativamente la unión de MID-FITC a la IgD de los BCR (no se muestra). Se muestra un experimento con un donante típico de entre tres analizados por separado.

Figura 5: Mapa esquemático del gen mid que muestra la estrategia de clonación. Los cebadores oligonucleotídicos utilizados para la amplificación del ADN se indican mediante flechas colocadas por encima (PCR) y por debajo (PCR inversa [IPCR]) de las secuencias pertinentes. Los cebadores degenerados basados en las secuencias de aminoácidos indicadas en la tabla II y los cebadores específicos se muestran mediante líneas discontinuas y continuas, respectivamente.

Figura 6: Secuencia de nucleótidos del gen mid procedente de M. catarrhalis Bc5, junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Se indican las regiones putativas -35, -10, un posible sitio de unión a ribosomas (RBS), una repetición invertida, el péptido señal predicho, y dos codones de inicio alternativos en las posiciones de los aminoácidos 1 y 17. También se muestra el codón de fin y la repetición invertida.

Figura 7: Se demuestran los grados de coincidencia y similitud entre MID aislada a partir de cinco cepas de M. catarrhalis y UspA1 y A2 procedentes de ATCC 25238. La coincidencia y la similitud se calcularon utilizando el programa informático Needle.

Figura 8: Comparación de la secuencia de aminoácidos de MID con la proteína presentada en el documento US 5.808.024.

Figura 9: La MID expresada de forma recombinante mantiene su capacidad de unión a IgD. El panel de la izquierda muestra el gel teñido de azul brillante de Coomassie y el panel de la derecha muestra una transferencia Western sondada con IgD humana. Se ensayó la proteína MID nativa (MID) y se comparó con las fracciones citoplásmica (C), periplásmica (P) y de membranas (M). Los números a la izquierda indican un patrón de peso molecular. Se indujo E. coli BL21DE3 que contenía pET16-MID durante 4 h mediante IPTG. Se recogieron las fracciones celulares y las proteínas se separaron mediante dos SDS-PAGE que se ensayaron en paralelo y se tiñeron con azul brillante de Coomassie o se transfirieron a una membrana Immobilon-P. La membrana se sondó con IgD humana, seguido de una incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano.

Figura 10: La MID764-913 (fragmento E) y la MID902-1200 (fragmento F) son responsables de la hemaglutinación de eritrocitos y la unión a IgD, respectivamente. Se fabricó una serie de proteínas MID truncadas (denominadas A a I). Las proteínas recombinantes que contenían marcadores de histidina en sus extremos C-terminales (A a H) o unidas a la proteína de unión a maltosa (I) se produjeron en E. coli y se purificaron sobre columnas de resina de níquel y de amilosa, respectivamente.

Figura 11: La MID962-1200 (fragmento F2) tiene una capacidad conservada de unión a IgD, comparada con la MID1-2139 de longitud completa. Se analizaron concentraciones equimolares (intervalo de 240 a 0,06 nmol) de la MID1-2139 de longitud completa purificada y 8 fragmentos truncados de MID (F1 a F8) para la unión a IgD mediante transferencias de puntos. Las proteínas MID902-1130 (F8), MID985-1130 (F7) y MID1000-1200 (F4) no atrajeron a la IgD, mientras que todos los demás fragmentos se unieron a IgD. Se clonó el ADN que codifica diversas proteínas MID truncadas en el vector de expresión pET26b (+) y se produjo en E. coli. Las proteínas recombinantes que contenían marcadores de His se purificaron y se realizó una transferencia de puntos sobre una membrana de nitrocelulosa. La membrana se sondó con IgD humana, seguido de unos anticuerpos policlonales secundarios conjugados con HRP, que se emplearon para la detección.

Figura 12: Una estructura tetrámera de MID962-1200 (F2) es un prerrequisito para una unión óptima a IgD. (A), un SDS-PAGE de MID962-1200 después de un tratamiento a 60ºC separa los monómeros y los tetrámeros. Después de un tratamiento con calor a 100ºC sólo pudieron detectarse monómeros. (B), el correspondiente análisis de la transferencia Western con IgD como sonda revela una débil unión a IgD de los monómeros. (C), la media de unión a IgD para tetrámeros y monómeros, respectivamente, en 6 experimentos diferentes. La unión a IgD se muestra como unidades arbitrarias/\mug de proteína. La MID962-1200 se trató en SDS-tampón de muestra a 60ºC o 100ºC durante 10 min, y se sometió a un SDS-PAGE y a un análisis de la transferencia Western. El gel teñido con Coomassie y la transferencia Western resultantes se analizaron mediante densitometría. El porcentaje de proteínas que migran como tetrámeros o monómeros se calculó y se comparó con la capacidad de unión a IgD.

Figura 13: La MID764-913 recombinante marcada con [125I] (fragmento E) es atraída específicamente por eritrocitos y células epiteliales. La MID marcada con [125I] y una serie de fragmentos truncados de [125I]-MID (C, E, F, G e I) se añadieron a eritrocitos humanos (A). Los fragmentos MID marcados con [125I] recombinantes también se añadieron a las células epiteliales (B). Todas las proteínas MID truncadas (excepto el fragmento I) fueron producidas en E. coli después de una purificación sobre resinas de níquel. El fragmento I es una proteína de fusión con MBP y, por consiguiente, se purificó sobre una resina de amilosa. Las proteínas recombinantes se marcaron con [125I] y se añadieron a eritrocitos o a la línea de células epiteliales A549. Después de varios lavados se midió la radiactividad unida en un contador \gamma. Los datos se presentan como valores medios de dos experimentos por duplicado. Las barras de error indican la DE.

Figura 14: La adhesión de M. catarrhalis que expresa MID a células epiteliales depende de los restos aminoácidos MID764-913 (fragmento E). Se observó una disminución en la adhesión a las células epiteliales con bacterias que expresan MID revestidas con anticuerpos policlonales de conejo anti-MID1-2139 o anti-MID764-913 comparado con un suero preinmune o pAb anti-MID1011-1446 (fragmento G). Las bacterias se preincubaron con el suero preinmune o con antisueros específicos durante 1 h a 4ºC. Se añadieron bacterias a las células epiteliales, seguido de una centrifugación y una incubación durante 30 min a 37ºC. Después de los lavados, las células se trataron con tripsina-EDTA y las suspensiones se cultivaron en placa sobre placas de agar-sangre. Se contaron las unidades formadoras de colonias después de una incubación durante la noche. Se calculó la proporción de adherencia (cfu añadidas/cfu adheridas). Los resultados se muestran como valores medios de cuatro experimentos por separado y por duplicado. Las barras de error indican la DE. *** P \leq 0,001, ** P \leq 0,01 y * P \leq 0,05.

Descripción de la invención

La MID no es idéntica a las proteínas de la membrana externa, que han sido bien caracterizadas previamente, de M. catarrhalis. No es reconocida por anticuerpos monoclonales producidos contra los antígenos de la membrana externa UspA o CopB. La MID también tiene un patrón de migración diferente en SDS-PAGE y una composición diferente, según se muestra mediante análisis de secuencia de aminoácidos y de ADN. La MID aparece como una banda de 200 kDa que concuerda con el Pm obtenido a partir de la secuencia de aminoácidos deducida, pero también como una banda extra con una masa molecular estimada de más de 1.000 kDa. La banda extra indica que la MID nativa es un complejo oligómero de una forma similar a UspA (11). Esto también está apoyado por el hecho de que MID eluyó inmediatamente después del volumen de vacío en una columna Sephacryl S-400 con un intervalo de fraccionamiento de hasta 8.000 kDa. Las secuencias de aminoácidos de MID muestran una coincidencia del 11,1% y 6,7%, respectivamente, con las proteínas de la membrana externa USPA1 y USPA2 de M. catarrhalis
(figura 7).

En una reciente publicación de patente, se aisló una proteína de la membrana externa de M. catarrhalis con una masa molecular de aproximadamente 200 kDa (12). También se proporciona una secuencia que codifica una proteína de aproximadamente 200 kDa. Sin embargo, esta secuencia de proteína no es idéntica a la secuencia proporcionada por los inventores y muestra sólo una coincidencia del 45,9% al 54,4% con MID (figura 7). Se demostró que la proteína era inmunogénica pero no se presentaron más funciones biológicas. Además, se asocia una proteína de 200 kDa con M. catarrhalis hemaglutinante (13, 14).

Parte experimental

La presente investigación describe el aislamiento, la purificación, la caracterización, la clonación y la expresión de la nueva proteína de unión a Ig denominada MID de M. catarrhalis, que tiene afinidad por la IgD humana, de un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína expuesta sobre la superficie, y de un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie.

Materiales y métodos Bacterias y plásmidos

La cepa Bc5 de M. catarrhalis es un aislado clínico procedente de un cultivo de hisopo nasofaríngeo del departamento de los inventores. Se obtuvieron 118 cepas aisladas a partir de sangre, nasofaringe y esputo de Suecia, Dinamarca, Finlandia, Hungría, Japón y EEUU. Las cepas y plásmidos secuenciados utilizados para la expresión se muestran en la tabla I.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio

1

Las bacterias se cultivaron durante la noche en caldo de cultivo de nutrientes (Oxoid, Basingstoke Hampshire, Reino Unido), se recolectaron y se lavaron en disolución salina equilibrada con fosfato (PBS), pH 7,2, mediante centrifugación.

Inmunoglobulinas, sueros y otras proteínas

Las preparaciones de Ig IgG1 (\kappa), IgG1 (\lambda), IgG2 (\kappa), IgG2 (\lambda), IgG3 (\kappa), IgG3 (\lambda), IgG4 (\kappa), IgG4 (\lambda), IgA1 (\kappa), IgA1 (\lambda), IgA2 (\kappa), IgA2 (\lambda), IgM (\kappa), IgM (\lambda), IgD (\kappa), IgD (\lambda) e IgE (\kappa) tenían todas origen humano y fueron adquiridas en The Binding Site (Birmingham, Reino Unido). Los sueros de IgD de mieloma de IgD (\kappa) e IgD (\lambda) se obtuvieron en la misma empresa, y el suero patrón de IgD OTRD 02/03 se obtuvo en Behringwerke AG (Marburgo, Alemania). Los sueros de IgD (\lambda) A, IgD (\lambda) B, IgG A, IgG B, IgG C, IgM, IgA a e IgA B de mieloma se obtuvieron en el Departamento de Química Clínica, Malmö, Suecia. La concentración de las respectivas inmunoglobulinas fue la suministrada por los fabricantes.

Anticuerpos

El anti-IgD humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) se obtuvo en Biosource (Camarillo, CA). El anti-IgD humana de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), el anti-IgD humana de conejo sin marcar, y el anti-Ig de ratón de conejo marcado con HRP se obtuvieron en Dakopatts (Gentofte, Dinamarca). El anti-IgD humana de cabra y el anti-inmunoglobulinas humanas polivalentes de conejo conjugado con HRP se obtuvieron en Sigma (St. Louis, MO). El anti-CD3 y CD19 humanas de ratón conjugados con ficoeritrina (RPE) se obtuvieron en Becton Dickinson (San José, CA). Los anticuerpos monoclonales de ratón 17C7 (UspA) y 10F3 (CopB) fueron amablemente cedidos por el doctor Eric J. Hansen, Departamento de Microbiología, Universidad de Texas (Dallas, TX).

Antisueros

Se inmunizaron conejos por vía intramuscular con 200 \mug de MID purificada (Forsgren et al., 2001), fragmentos de MID recombinante, o UspA1 recombinante emulsionada en adyuvante de Freund completo (Difco, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) y se realizó una inmunización de refuerzo en los días 18 y 36 con la misma dosis de proteína en adyuvante de Freund incompleto. Se extrajo sangre de 2 a 3 semanas después. Los anticuerpos policlonales anti-UspA1 reaccionaron con UspA1 y UspA2 recombinante, según se analizó mediante transferencias Western.

SDS-PAGE y detección de proteínas sobre las membranas (análisis de la transferencia Western)

Se realizó un SDS-PAGE utilizando un sistema de electroforesis comercial que consistía en geles Bis-Tris al 10% con tampón de ensayo (MES), de muestra (LDS) y de transferencia, así como con un instrumento de análisis de la transferencia (Novex, San Diego, CA). Brevemente, las muestras se hirvieron durante 10 min, seguido de una electroforesis a temperatura ambiente utilizando células de electroforesis de plancha vertical Protein II (Novex) con un voltaje constante de 150. Los geles se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 (Bio-Rad, Sundbyberg, Suecia). Además, se realizó una transferencia electroforética de las bandas de proteínas desde el gel a una membrana Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) a 30 V durante 2-3 h. Después de la transferencia, la membrana de Immobilon-P se bloqueó en PBS con Tween 20 al 0,05% (PBS-Tween) que contenía leche en polvo al 5%. Después de varios lavados en PBS-Tween, la membrana se incubó durante 1 h temperatura ambiente con proteína de IgD de mieloma purificada (0,5 \mug/ml, hu IgD (\kappa); The Bindingsite, Birmingham, Reino Unido) en PBS-Tween que incluía leche en polvo al 2%. Se añadió el anti-IgD humana de cabra conjugado con HRP diluido 1/1000 en el mismo tampón después de varios lavados en PBS-Tween. En algunos experimentos, la proteína de IgD de mieloma fue sustituida por proteína de mieloma de otras clases de inmunoglobulinas y se empleó el anti-inmunoglobulinas humanas polivalentes marcado con HRP (Sigma) como capa secundaria. Se utilizaron los mAb 17C7 y 10F3 de ratón para detectar las proteínas de la membrana externa de Moraxella UspA1, 2 y CopB, respectivamente (7, 8). En estos experimentos se usaron anti-inmunoglobulinas de ratón de conejo marcados con HRP como capa secundaria. Después de una incubación durante 40 min a temperatura ambiente y varios lavados más en PBS-Tween se realizó el revelado con reactivos de detección de la transferencia Western ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las transferencias Western se analizaron mediante un formador de imágenes moleculares personal FX (Bio-Rad).

Ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligados (ELISA)

Se empleó un ELISA para cuantificar la proteína de unión a inmunoglobulina D. Se añadieron extractos de M. catarrhalis diluidos en etapas en cinco veces en Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0, en volúmenes de 100 \mul a placas de microvaloración (F96 Maxisorb, módulo Nunc-Immuno, Roskilde, Dinamarca), que se sellaron y se incubaron a 4ºC durante la noche. Después de lavar la placa cuatro veces en PBS-Tween se añadió tampón de bloqueo de PBS-Tween que contenía ovoalbúmina al 1,5%. La placa se incubó durante 1 h a temperatura ambiente y despés se lavó cuatro veces con PBS-Tween. Se añadió IgD(\kappa) de proteína de mieloma a 0,05 \mug en 100 \mul de PBS-Tween que contenía ovoalbúmina al 1,5% a cada pocillo, y después de una incubación durante 1 h a temperatura ambiente la placa se lavó cuatro veces con PBS-Tween. Después de 1 h de incubación con anti-IgD humana de cabra conjugado con HRP diluido 1/1000 en el mismo tampón y el posterior lavado con PBS-Tween se añadió tetrametilbenzidina (20 mM) en disolución de citrato de potasio 0,1 M, pH 4,25, mezclada con peróxido de hidrógeno (concentración final 0,002%). Después de 30 min se detuvo la reacción enzimática añadiendo ácido sulfúrico 2 M. Entonces se midió la densidad óptica (DO) a 450 nm en un lector de ELISA automático (Multiskan Plus, Labsystems, Finlandia).

Ensayo de transferencia de puntos

Se aplicó MID purificada (0,0005-0,2 \mug) en un volumen de 100 \mul en Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0, de forma manual a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dessel, Alemania). Después de la saturación, las membranas se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en PBS-Tween que contenía ovoalbúmina al 1% y leche en polvo al 5% y se lavó cuatro veces con PBS-Tween. Se añadió proteína de mieloma humana a 0,5 \mug en 100 \mul de PBS-Tween y después de 2 h de incubación, seguido de varios lavados en PBS-Tween, se empleó anti-cadenas ligeras (\kappa y \lambda) humanas marcado con HRP (Dakopatts) en una dilución 1/200 como anticuerpo secundario. El revelado se realizó como se describió anteriormente para las transferencias Western. En otro conjunto de experimentos se aplicaron en primer lugar diluciones de sueros de mieloma humano en un volumen de 100 \mul en Tris-HCl 0,1 M, pH 9,0, a las membranas. Después de la saturación se realizaron las etapas de incubación, bloqueo y lavado como se describió anteriormente. Después se añadió una sonda de proteína MID marcada con [^{125}I] (de 5 a 10 x 10^{5} cpm/ml) en PBS-Tween. Después de una noche de incubación las membranas se lavaron cuatro veces con PBS-Tween, se secaron al aire y se expusieron a películas de rayos x Kodak CEA.C a -70ºC utilizando una pantalla intensificadora regular Kodak X-Omat (Eastman Kodak, Rochester, NY).

Extracción de la proteína de unión a IgD

Se suspendieron bacterias de M. catarrhalis (1-5 x 10^{11} unidades formadoras de colonias (cfu)/ml) en tampón Tris-HCl 0,05 M (pH 8,8) que contenía Empigen al 0,1-5% (Calbiochem Novabiochem, Bedford, MA). En algunos experimentos Empigen fue sustituido por CHAPS (Sigma), n-octil-p-D-glucósido (Bachem, Budendorf, Suiza) o Triton X-100 (Sigma). Estos tres detergentes a una concentración del 0,1-5% se ensayaron con o sin EDTA 0,01 M. Las suspensiones bacterianas se mezclaron mediante agitación magnética durante 2 h a 37ºC. Después de una centrifugación a 8000 x g durante 20 min a 4ºC los sobrenadantes se filtraron con filtros estériles (0,45 \mum; Sterivex-HV, Millipore).

Purificación de la proteína de unión a IgD

Se aplicó un extracto de M. catarrhalis en Empigen® al 3% a una columna de Q-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con Tris-HCl 0,05 M (pH 8,8) que contenía Empigen® al 0,1%. La columna se eluyó utilizando un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en el mismo tampón. Las fracciones que mostraron la mayoría de la actividad de unión a IgD, según se detectó mediante ELISA y análisis de la transferencia Western, se reunieron, se dializaron en tubos de membrana Spectraphor (límite de exclusión de peso molecular de 25.000; Spectrum, Laguna Hills, CA) frente a Tris-HCl 0,05 M, pH 8,8, se concentraron sobre membranas de disco YM100 (límite de exclusión de peso molecular de 100.000; Amicon, Beverly, MA) y después se aplicaron a una cromatografía en gel. La filtración en gel de la proteína de unión a IgD se realizó sobre una columna de alta resolución Sephacryl S-400 (20 por 900 mm; Amersham Pharmacia Biotech), equilibrada con Tris-HCl 0,05 M, pH 8,8, que contenía Empigen® al 0,1%. Las fracciones que contenían la actividad de unión a IgD más fuerte se concentraron y se recromatografiaron, como se describió anteriormente.

Ruptura del péptido y análisis de la secuencia de aminoácidos

La MID purificada en Tris-HCl 0,05 (pH 8,8) que contenía Empigen® al 0,1% se trató con tripsina o quimotripsina en una proporción de enzima-proteína de 1:10 a 37ºC durante la noche. Las mezclas de ruptura se sometieron a un SDS-PAGE y las bandas peptídicas trasladadas a membranas Immobilon se secuenciaron automáticamente o se expusieron a un análisis de la transferencia Western, como se describió anteriormente. Para obtener una secuencia N-terminal de la proteína se intentó el desbloqueo de la MID intacta de un posible grupo piroglutamato. Se emplearon dos diferentes protocolos para desbloquear la proteína soluble y la proteína unida a la membrana. Se realizó un análisis de la secuencia de aminoácidos automático con un secuenciador de fase sólida-líquida-gaseosa 470A de Applied Biosystems (Foster City, CA) con la detección en línea de los derivados del aminoácido feniltiohidantoína liberados mediante un analizador de Applied Biosystems modelo 120A PTH.

Marcaje de la proteína MID

La MID purificada se radioyodó ([^{125}I]; Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) hasta una alta actividad específica con lactoperoxidasa. Las preparaciones contenían aproximadamente 0,05 moles de yodo por mol de proteína. Se conjugó FITC (Sigma) a la MID purificada utilizando un protocolo convencional. Brevemente, se incubó MID (2 mg/ml) en tampón carbonato 0,1 M, pH 9,5, con FITC 0,15 \mug/ml solubilizado en DMSO. Después de 45 min a temperatura ambiente y agitación constante la muestra se diluyó y se sometió a una columna PD10 (Pharmacia Biotech) preequilibrada con PBS, pH 7,4. El MID-FITC resultante se utilizó para los estudios de unión.

Aislamiento y secuenciación del ADN

Se extrajo ADN genómico de cinco cepas de M. catarrhalis (véase la tabla I) utilizando un kit de preparación de ADN genómico (Qiagen, Hilden, Alemania) y se empleó posteriormente como molde para la amplificación del gen MID mediante PCR. Se sintetizaron cebadores degenerados según las secuencias amino-terminales de los cuatro fragmentos peptídicos (Tabla II).

TABLA II Secuencias de aminoácidos derivadas de MID muy purificada después de digestiones con proteasas

2

En algunas de las reacciones de PCR (sistema de PCR de alta fidelidad; Roche, Bromma, Suecia) se emplearon cebadores específicos junto con cebadores degenerados. Se aislaron las secuencias de ADN que flanquean la región central del gen, a partir de la cual se originaron los fragmentos peptídicos, utilizando PCR inversa (IPCR). Brevemente, se rompió el ADN genómico con las siguientes enzimas de restricción, utilizadas por separado: EcoRV, SphI y PstI para el aislamiento del codón de inicio, y AccI, AsuI y, por último, HincII para el aislamiento de las secuencias de los codones de fin. Los fragmentos resultantes se reacoplaron sobre sí mismos (kit de acoplamiento rápido de ADN; Roche) y el ADN se utilizó en una IPCR. Para amplificar las áreas de los codones de inicio y fin del gen se diseñaron cebadores específicos y se emplearon en una PCR de moldes largos (LTPCR) (sistema PCR de expansión de moldes largos; Roche). Todos los productos de PCR se clonaron en pPCR-Script-Amp (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenciaron utilizando el kit Big Dye Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). Se diseñaron cebadores para la amplificación del ADN genómico utilizando el programa informático Oligo Primer Analysis (Molecular Biology Insights, Cascade, Co). Se dedujo el péptido señal utilizando el programa SignalP V1.1 del World Wide Web Prediction Server Center for Biological Sequence Analysis (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).

Amplificación mediante PCR del gen mid

Se amplificó el marco de lectura abierto completo de 6,4 kb del gen mid mediante PCR utilizando el ADN genómico de la cepa Bc5 de M. catarrhalis como molde. Los cebadores oligonucleotídicos que contenían las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción BamHI fueron:

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5'-cgggatccgatggccgtggcggaatatgcc-3'	(cebador A, SEQ ID NO:3) y

5'-cgcggatccgaaaagtgaaaacctgcaccaactgctgc-3'	(cebador B, SEQ ID NO:4)

que generaron un producto de PCR de 6391 pares de bases. El inserto digerido con BamHI se acopló en pET16 (b) y el plásmido resultante pET16-MID se transformó en DH5\alpha. Ambas cadenas del producto de PCR clonado se secuenciaron.

Para estudiar el gen mid de longitud completa en otras cepas de M. catarrhalis se emplearon los cebadores A y B. Además los cebadores utilizados para reducir la búsqueda de la secuencia que codifica el péptido señal fueron el cebador A o:

5'-tgtcagcatgtatcatttttttaaggtaaaccaccatg-3' (cebador C; detecta el codon de inicio superior, SEQ ID NO:3) en combinación con:

5'-catcaattgcgatatgtctgggatcttg-3' (cebador D; colocado en una región conservada justo fuera del péptido señal, SEQ ID NO:6)

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generando productos de PCR con una longitud de 192 y 266 pares de bases (utilizando el ADN genómico de Bc5 como molde), respectivamente. Además, el cebador A o C en combinación con:

5'-cttcaccccatcagtgccatagacc-3' (cebador E, SEQ ID NO:7)

se utilizó para confirmar la existencia del gen mid y dieron como resultado fragmentos con una longitud de 1355 y 1429 pares de bases, respectivamente. En todas las reacciones se empleó el sistema de PCR de expansión de moldes largos y las condiciones fueron las recomendadas por el fabricante (Roche, Bromma, Suecia).

Expresión del producto del gen mid en E. coli y fracción celular

Para expresar el producto del gen mid, pET16-MID se transformó en el hospedante de expresión BL21DE3, que contenía una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa de T7 bajo el control de lacUV5. Las bacterias recombinantes se cultivaron en medio LB suplementado con glucosa al 2% y ampicilina. Se logró la sobreexpresión cultivando células en fase de crecimiento logarítmico a una DO_{600} de 0,6, seguido de la adición de IPTG 1 mM. Después de 4 h de inducción las bacterias se sonicaron según un protocolo convencional y las proteínas resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE.

La localización de la proteína recombinante a partir de pET16-MID se realizó mediante choque osmótico como se describe. Brevemente, se recolectaron los caldos de cultivo de células inducidas y no inducidas, y se resuspendieron en Tris-HCl 30 mM, pH 8, que contenía sacarosa al 20%. Se añadió EDTA a una concentración final de 1 mM y la disolución se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 10 min. Después de 0una centrifugación a 10.000 g durante 10 min a 4ºC, las células se resuspendieron en MgSO_{4} 5 mM enfriado en hielo y se agitaron durante 10 min en hielo. Durante esta etapa, las proteínas periplásmicas se liberaron hacia el tampón. El sobrenadante que contenía la fracción periplásmica se recogió mediante centrifugación. Las bacterias se lisaron completamente con lisozima a una concentración final de 100 mg/ml, seguido de una sonicación. Por último, las fracciones de membranas insolubles y citoplásmicas solubles se recogieron.

Proteínas recombinantes derivadas de MID truncada

En la figura 10 se muestran los diferentes fragmentos de MID truncada denominados A a I con sus cebadores y tamaños específicos para generar las proteínas. El marco de lectura abierto del gen mid para M. catarrhalis Bc5 (en pET26-MID) (Forsgren et al., 2001) se utilizó como molde. Todos los constructos de MID, excepto MID367-590 (C), se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores específicos que introducen sitios de las enzimas de restricción BamHI y HindIII. Debido a un sitio de la enzima de restricción HindIII interno en el fragmento C, se empleó un sitio XhoI en lugar de HindIII en el extremo 3'. Todos los productos de PCR, excepto MID1616-2139 (I), se clonaron en pET26 (Novagen, Madison, WI). El producto de PCR que codifica el fragmento I se clonó en pMAL-c2 (New England Biolabs, Beverly, MA). Para evitar una presunta toxicidad, los plásmidos resultantes primero se transformaron en el hospedante no expresante E. coli DH5\alpha. Después los plásmidos que codifican los fragmentos A a D, G y H se transformaron en E. coli BL21 (DE3), mientras que se empleó el hospedante BL21 (DE3) -pLysS para los vectores que contenían fragmentos E y F. Ambas cepas de E. coli se incubaron en presencia de kanamicina, mientras que también se suministró cloranfenicol cuando se utilizaron transformantes BL21 (DE3) -pLysS. El fragmento I se expresó en DH5\alpha. Las bacterias se cultivaron hasta la fase mediologarítmica, seguido de una induccón con isopropil-1-tio-\beta-D-galactósido (IPTG) 1 mM. Después de 3,5 h los transformantes se sonicaron y las proteínas sobreexpresadas se purificaron según las instrucciones del fabricante. Las proteínas recombinantes resultantes que tenían un marcador de histidina o que estaban condensados con la proteína de unión a maltosa se purificaron sobre resinas que contenían níquel y amilosa, respectivamente. Las concentraciones de las proteínas eluidas se determinaron utilizando el kit de ensayo de proteína
BCA (Pierce). Después las proteínas recombinantes se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencias Western.

Hemaglutinación

Se obtuvieron eritrocitos humanos a partir de sangre humana heparinizada recién extraída. Los eritrocitos se lavaron dos veces en PBS (pH 7,2) y se suspendieron en PBS a una concentración final de 1%. Bacterias cultivadas en caldo de cultivo de nutrientes se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron y se suspendieron hasta 1-2 x 10^{9}/ml en PBS. Las bacterias y la suspensión de eritrocitos (50 \mul de cada una) se mezclaron en placas de microvaloración de fondo redondo (Sarstedt, Newton, NC). En algunos experimentos los eritrocitos se mezclaron con MID-Sepharose o BSA-Sepharose en 150 \mul de PBS. La aglutinación se leyó a ojo desnudo.

Línea celular y ensayo de adherencia

La línea celular de carcinoma pulmonar A549 (células epiteliales alveolares de tipo II; CCL-185) se obtuvo en ATCC. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Escocia) suplementado con suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, y gentamicina 12 \mug/ml (denominado medio de cultivo). En el día antes de los experimentos de adherencia las células se recolectaron, se lavaron dos veces en medio RMI 1640 exento de gentamicina y se añadieron a placas de cultivo de tejido de 12 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a una concentración de 1 x 10^{4} células/pocillo en 2,0 ml de medio de cultivo exento de gentamicina. Después las células se incubaron durante la noche a 37ºC en CO_{2} al 5%. En el día del experimento se inoculó M. catarrhalis (aproximadamente 2 x 10^{8}) en PBS, gelatina al 0,15% (Sigma) sobre las monocapas. En experimentos de neutralización con antisueros específicos las bacterias se preincubaron con anticuerpos policlonales (dilución 1/250). Después de 1 h a 4ºC se añadieron las bacterias a las células epiteliales. En todos los experimentos las placas de cultivo de tejidos se centrifugaron a 3.000 g durante 5 min y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después de 30 min las monocapas infectadas se enjuagaron dos veces con PBS, gelatina al 0,15% con un balanceo suave para eliminar las bacterias no adherentes y después se trataron con tripsina-EDTA (tripsina al 0,05%, EDTA 0,5 mM) para liberarlas del soporte de plástico. Después la suspensión de células/bacterias resultante se sembró en placas de agar que contenían isovitalex al 1,1%, sangre humana al 7,8% y, por último, proteosa peptona al 0,9%. Los datos se calcularon a partir de cultivos por duplicado.

Análisis de citometría de flujo

Se aislaron linfocitos de sangre periférica humanos (PBL) a partir de sangre heparinizada procedente de donantes sanos mediante centrifugación en un gradiente discontinuo de Ficoll-Isopaque (Lymphoprep; Pharmacia, Uppsala, Suecia). Para los análisis de citometría de flujo se empleó un protocolo de tinción convencional con BSA al 0,5% (p/v) en PBS como tampón. Los PBL (2,5 x 10^{5} en 100 \mul) se marcaron con mAb anti-CD3 o anti-CD19 con o sin mAb anti-IgD conjugado con FITC en hielo durante 30 min según las instrucciones del fabricante. En los experimentos de bloqueo, los linfocitos también se preincubaron con inmunoglobulinas anti-IgD durante 30 min. Después de dos lavadas se suplementaron 10 \mug/ml de MID conjugada con FITC purificada a las células, seguido de una incubación durante 45 min en hielo. Después de 4 lavados finales con un exceso de PBS y BSA al 0,5% se analizaron 105 células para cada muestra en un citómetro EPICS®XL-MCL (Coulter, Hialeah, Florida). Cuando resultó apropiado se incluyeron sueros preinmunes de conejo y de cabra e IgG1 e IgG2a de ratón como controles negativos (Dakopatts).

Resultados Extracción y purificación de MID

La solubilización de MID fue un obstáculo importante en el proceso de purificación. Entre varios detergentes ensayados, sólo Empigen® y n-octil-b-D-glucósido solos a una concentración final de 3% solubilizaron la MID a partir de una suspensión de M. catarrhalis de una manera eficaz, según se estimó mediante ELISA y análisis de la transferencia Western. Los dos detergentes fueron igualmente eficaces. El Triton X-100 solo no solubilizó la MID, pero el Triton X-100 más EDTA 0,01 M solubilizó la MID de forma eficaz. El CHAPS solo o el CHAPS con EDTA o el EDTA solo no solubilizaron la MID. En los siguientes experimentos, se empleó una extracción con Empigen® para la solubilización y posterior purificación de MID. Cuando el extracto de Empigen® de M. catarrhalis se aplicó a una columna de Q-Sepharose, todo el material de unión a IgD eluyó de la columna con Empigen® al 0,1% en Tris HCl 0,05 M, pH 8,8. No pudo eluirse más material de unión a IgD cuando se aplicó un gradiente de NaCl de hasta 1 M a la misma columna. Después de la concentración del material de unión a IgD obtenido después de la separación en Q-Sepharose, se logró el fraccionamiento del extracto mediante filtración en gel en presencia de Empigen® al 0,1% sobre una columna de Sephacryl S-400 (figura 1). La mayoría del material de unión a IgD eluyó en este primer pico inmediatamente después del volumen de vacío. La MID se purificó aún más mediante la recromatografía del primer pico bajo las mismas condiciones.

La figura 2 muestra que, tras la purificación, la MID aparece como dos bandas, una banda de 200 kDa y una segunda banda con una masa molecular aparente mayor que 1.000 kDa. Se realizaron experimentos de transferencia Western para confirmar que la MID no era idéntica a las proteínas de la membrana externa UspA1 y 2, previamente descritas, con una masa molecular aparente que varía de 350 a 720 kD (8-10) o CopB, con un peso molecular de 80 kDa. El extracto bruto de Empigen® de M. catarrhalis o las preparaciones parcialmente purificadas de MID se sometieron a SDS-PAGE, se trasladaron a filtros Immobilon y se realizó una transferencia con anticuerpos contra estas proteínas de Moraxella y también con IgD humana. Como puede observarse en la figura 2, la MID (según fue revelado mediante unión a IgD) no es idéntica a las proteínas de la membrana externa UspA y CopB.

Se realizaron tres intentos para determinar la secuencia de aminoácidos terminal de la MID purificada. Se aplicaron aproximadamente 1000 pmol de MID cada vez en un secuenciador de aminoácidos automático. Como no se obtuvieron derivados del aminoácido feniltiohidantoína es probable que el extremo amino-terminal de la única cadena polipeptídica de MID esté bloqueado. En fechas recientes se ha determinado que las proteínas UspA1 y UspA2 de Moraxella, que también son resistentes a la degradación de Edman, contienen un resto piroglutamilo que se elimina mediante un tratamiento con piroglutamato aminopeptidasa. Sin embargo, cuando la MID purificada a partir de M. catarrhalis o la MID recombinante se trata con esta enzima según dos protocolos diferentes (dos veces para cada método) y después se somete a una degradación de Edman no se obtiene una secuencia de aminoácidos N-terminal.

Propiedades de unión a IgD de MID

Extractos brutos de Empigen® de M. catarrhalis y MID muy purificada sometida a SDS-PAGE y trasladada a filtros se expusieron a preparaciones de Ig muy purificadas disponibles en el mercado que representan todas las clases y las subclases de Ig humanas (tabla III).

TABLA III Resumen de los análisis de la transferencia Western y de transferencia de puntos que muestra la especificidad de unión de prepaciones de inmunoglobulina D de mieloma muy purificadas disponibles en el mercado frente a un extracto bruto de Empigen® de M. catarrhalis y MID muy purificada. Inmunoglobulina Proteína de 200 kDa en el extracto MID purificada

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Sólo las dos preparaciones de IgD interaccionaban con la banda de MID en la posición de 200 kDa de una forma similar a como se muestra para IgD en la figura 2. Cuando se realizaron experimentos de transferencia de puntos y primero se añadió MID purificada en diluciones a las membranas y posteriormente se aplicaron proteínas de mieloma humanas purificadas y anticuerpos secundarios, sólo las dos IgD de mieloma interaccionaron con MID. En uno de los dos mielomas se detectó sólo 0,001 \mug de MID sobre la membrana. La especificidad de la interacción entre MID e IgD se volvió a verificar utilizando MID radiomarcada en otros experimentos de transferencia de puntos. En la figura 3 se demuestra que MID une de forma eficaz cuatro sueros de IgD de mieloma. Pudo detectarse una reacción diferenciada en el intervalo de 0,03-4 \mug de IgD. Para el suero patrón de IgD (B.W.) se observó reactividad a concentraciones aún más bajas (no se muestra). Por contraste, 6 sueros de Ig de mieloma diferentes que representan a IgG, IgA e IgM no mostraron una reacción visible con MID a 4 \mug.

La MID purificada atrae específicamente la IgD soluble humana, según se reveló en análisis de la transferencia de puntos y Western (figura 2 y 3, tabla III). Para ensayar si la MID se une a la IgD del receptor de células B (BCR) expresada sobre la superficie se aislaron linfocitos de sangre periférica humanos (PBL). Se conjugó FITC a la MID, seguido de una incubación con PBL durante 45 min en hielo. En paralelo, los PBL se marcaron con mAb conjugados con RPE dirigidos contra el marcador CD3 de células T o el antígeno de la superficie CD19 específico de células B, y posteriormente se analizó mediante citometría de flujo (figura 4). De manera interesante, una gran fracción de linfocitos CD19^{+} unió cantidades significativas de MID-FITC (figura 4A), mientras que las células T (linfocitos CD3^{+}) sólo mostraron una unión de fondo no específica (figura 4D). La señal de MID-FITC se corresponde bien con las células CD19^{+} incubadas con mAb anti-IgD que revelan las células B positivas a IgD (figura 4B). Para esclarecer aún más la especificidad de la unión de MID-FITC a linfocitos CD19^{+} que portan IgD se preincubaron PBL con un anti-fracción de inmunoglobulina IgD humana de conejo. Después de la incubación y los lavados se analizó la unión de MID-FITC mediante citometría de flujo según el procedimiento convencional. El antisuero inhibió casi completamente la unión específica de MID-FITC a la IgD de BCR cuando se compara con células incubadas con el suero preinmune. La intensidad de la fluorescencia media disminuyó de 79,2 a 14,6 unidades arbitrarias. Se obtuvieron unos resultados similares con inmunoglobulinas de cabra generadas contra IgD (no se muestra). Por tanto, las células B que expresan IgD estimulan la unión específica de MID-FITC a la IgD de BCR expresada sobre la superficie.

Clonación del gen que codifica la MID y análisis de la secuencia de ADN

Se diseñaron cebadores degenerados según las secuencias amino-terminales obtenidas de cuatro fragmentos peptídicos que se originan de MID (tabla II) y se emplearon en PCR en todas las combinaciones posibles. Los cebadores específicos 2982+ y 3692- (figura 5) se sintetizaron utilizando la secuencia deducida de un producto de PCR diferenciado generado con la pareja de cebadores degenerados 2629+/3693-. Una reacción de PCR que empleaba los cebadores específicos en combinación con los degenerados (718+ y 5772-) produjo en total 5054 pares de bases del gen que codifica MID. Las secuencias flanqueantes que rodean el núcleo del gen mid se obtuvieron mediante PCR inversa (IPCR). Una IPCR del ADN genómico de M. catarrhalis digerido con EcoRV y AsuI/AccI con las parejas de cebadores 2982+/945- y 3668+/120-, respectivamente, proporcionó la secuencia para el área del codón de inicio. Además, una IPCR del ADN genómico de Moraxella digerido con HincIII con la pareja de cebadores 5898+/5511- generó la secuencia 3' que incluye el codón de fin. La secuencia de nucleótidos completa del gen que codifica MID en M. catarrhalis Bc5 se muestra en SEQ ID NO:2, y la secuencia de aminoácidos resultante se muestra en SEQ ID NO:1. Se revelan dos marcos de lectura abiertos alternativos y se indican en las posiciones de los aminoácidos 1 y 17 (véase la figura 6). Por consiguiente, la longitud del producto del gen mid es de 2123 ó 2139 aminoácidos. Además de un sitio de unión a ribosomas putativo (AAGG), se identificaron cajas de secuencia consenso en -10 (TAATTA) y -35 (TTGAAT). Además, 62 bases cadena abajo del codón de fin TAA se encontró una repetición invertida con el potencial de formación del tallo-bucle necesario para la terminación de la transcripción. Para obtener una visión global de la similitud y la coincidencia entre diferentes genes mid se analizaron las secuencias de cinco ORF de proteínas MID. Para 4 cepas, el grado de coincidencia y similitud fue del \geq 75,8% y \geq 78,3%, respectivamente (figura 7). Por contraste, se obtuvieron unos valores ligeramente inferiores, \geq 65,3% y \geq 71,2%, respectivamente, para el quinto aislado (RH4). La coincidencia y la similitud con UspA1 fue del 5,5-11,1% y 8,3-17,9%, respectivamente, y con UspA2 del 6,5-7,5% y 11,1-12,4%, respectivamente.

El gen mid puede detectarse en todas las cepas de M. catarrhalis

Mediante análisis de PCR se detectó el gen mid-1 en todas las 118 cepas de M. catarrhalis, mientras que los controles relacionados con Moraxella (Nesseria) fueron negativos. Además, el tamaño del gen mid-1 fue confirmado utilizando cebadores que abarcan el gen completo, incluyendo los codones de inicio y de fin.

El análisis de la secuencia de aminoácidos de MID deducida se diferencia de UspA1, UspA2 y de la proteína descrita en el documento US 5.808.024

El marco de lectura abierto define una proteína con una masa molecular calculada justo por debajo de 220 kDa que se corresponde fácilmente con el valor empírico de aproximadamente 200 kDa encontrado mediante SDS-PAGE. La secuencia de aminoácidos N-terminal muestra las características típicas de un péptido señal con un sitio de ruptura potencial entre los aminoácidos 66 y 67. A pesar de que el primer aminoácido después del sitio de ruptura de peptidasas señal es muy probablemente un resto glutamina, ninguna secuencia pudo ser determinada mediante una degradación de Edman. Además, no se obtuvo ninguna secuencia de aminoácidos después de un tratamiento con piroglutamato aminopeptidasa. La secuencia de aminoácidos predicha también se sometió a un análisis del perfil de hidrofobicidad mediante el método de Kyte y Doolittle, y mostró propiedades principalmente hidrófilas, excepto para el péptido señal putativo que era fuertemente hidrófobo. La secuencia de aminoácidos deducida para MID se diferencia significativamente de la de la proteína descrita en el documento US 5.808.024 y también de las proteínas UspA (figura 7 y 8).

El gen mid está distribuido en todas las cepas de M. catarrhalis. Para investigar si el gen mid existe o no en todas las cepas de M. catarrhalis se eligieron cebadores basándose en un área conservada cadena arriba del marco de lectura abierto (ORF) y un área conservada cadena abajo que incluye la secuencia del codón de fin (Forsgren et al., 2001). El gen mid se detectó en todos los 86 aislados clínicos y se analizaron 7 tipos de cepas, y la longitud del ADN genómico de mid fue de aproximadamente 6.000 pares de bases. La existencia se volvió a verificar mediante análisis de la transferencia Southern utilizando una sonda que contenía una secuencia seleccionda del extremo 3' del gen. Experimentos de transferencia Southern revelaron que las cepas de Moraxella contenían sólo un gen mid.

Expresión de MID recombinante en E. coli

Para confirmar que el gen mid clonado se corresponde con la proteína de unión a IgD purificada, el gen que incluye el codón de inicio y la secuencia señal predicha se subclonó en el vector de expresión pET16 (b) y, por tanto, bajo el control de un promotor de T7. El pET16-MID resultante posteriormente se transformó en E. coli BL21DE3, seguido de una inducción con IPTG. Las células bacterianas se lisaron y se subfraccionaron, y la MID recombinante se localizó mediante análisis de la transferencia Western utilizando IgD humana como sonda. Mediante los experimentos de expresión se obtuvieron importantes características de verificación de MID (figura 9). En primer lugar, tras la inducción, las células que contenían pET16-MID fueron capaces de producir MID recombinante, confirmando el marco de lectura correcto del gen. En segundo lugar, la MID recombinante (según se demuestra mediante SDS-PAGE) muestra una masa molecular de aproximadamente 200 kDa, que se corresponde con los 217 kDa del valor calculado para la secuencia de aminoácidos. En tercer lugar, la proteína recombinante era, en efecto, el producto del gen mid en E. coli, puesto que su fenotipo de unión a IgD fue confirmado mediante un análisis de la transferencia Western. El total de proteínas de E. coli que contenía el vector pET16 (b) inducido sin el inserto no mostró ninguna capacidad de unión a IgD (los datos no se muestran). En cuarto lugar, la localización subcelular de la proteína recombinante demuestra que la MID estaba igualmente localizada en las fracciones citoplásmica y de membranas, pero no en el espacio periplásmico. La localización de las MID en la fracción de membranas se correlaciona muy bien con la localización conocida en la membrana externa en M. catarrhalis.

La unión a IgD se conserva en 238 aminoácidos de MID

Para determinar en detalle la región de unión a IgD de MID se clonaron 9 secuencias derivadas de la MID de longitud completa en pET26b (+) y se expresaron en E. coli. Las proteínas recombinantes cubrían la secuencia entera de MID, y sus longitudes y posiciones individuales fueron como se demuestra en la figura 10. Las proteínas recombinantes que comprenden los restos aminoácidos 69-1111 ó 1011-2139 de MID no se unían a IgD, según revelan los análisis de la transferencia Western y de puntos. Por contraste, la proteína MID902-1200 (fragmento F1 de la proteína) atraía a IgD, lo cual sugiere con gran fuerza que la única región de unión a IgD de MID está dentro de esta secuencia particular.

Para concretar la secuencia responsable de la unión a IgD, la MID902-1200 truncada fue sistemáticamente acortada en los extremos N- y C-terminales (figura 11). Se compararon concentraciones equimolares de las diversas proteínas recombinantes con la MID1-2139 nativa de longitud completa aislada de M. catarrhalis. Las diferentes proteínas recombinantes se diluyeron en etapas de cuatro veces, se añadieron a las membranas y se incubaron con IgD humana. En una base molar, se detectó una capacidad de unión a IgD fundamentalmente conservada para la proteína MID truncada que se extiende desde el resto aminoácido 962 al 1200. La proteína truncada más corta que aún interacciona con IgD se localizó entre MID985 y MID1142 (fragmento F6). La propiedad de unión a IgD se perdió cuando el N-terminal se redujo hasta el resto MID1000 (fragmento F4) o cuando el C-terminal se redujo hasta el resto MID1130 (fragmento F7). Por último, un fragmento (MID902-1130; F8) con un extremo N-terminal más largo y un extremo C-terminal más corto (comparados con MID985-1200; F3) también se fabricó y se analizó. Sin embargo, esta MID truncada no interaccionaba con IgD, lo cual sugiere que la capacidad de unión depende de un extremo C-terminal más largo.

Para caracterizar aún más la unión a IgD específica dependiente de MID, se construyó un ELISA de IgD utilizando IgD humana como cebo. Todos los fragmentos de MID truncada recombinante se sometieron a ELISA, seguido de una incubacón con un antisuero de conejo específico dirigido contra MID902-1200. El ELISA se reveló utilizando anticuerpos policlonales anti-conejo de cabra conjugados con HRP. Se observó el mismo patrón que con la transferencia de puntos (figura 11), es decir, los fragmentos F4, F7 y F8 no fueron atraídos por la IgD en fase sólida, mientras que los otros fragmentos se unieron en un grado variable comparados con la MID de longitud completa (no se muestra).

La interacción óptima entre MID962-1200 - IgD depende de una estructura tetrámera

Para arrojar más luz sobre la necesidad de la existencia de una estructura tetrámera para obtener una unión óptima a IgD, se incubó MID962-1200 (F2, SEQ ID NO:10) a 60ºC o 100ºC, seguido de un análisis sobre SDS-PAGE y transferencias Western. El MID962-1200 formó un monómero y un tetrámero después de un pretratamiento a 60ºC (figura 12A). Sin embargo, la estructura tetrámera se rompió a 100ºC y produjo una forma monómera que mostró una unión considerablemente más débil a IgD cuando se estudió en transferencias Western (figura 12A y B). Para investigar la capacidad del tetrámero para unirse a IgD en comparación con la forma monómera, el fragmento MID962-12000, SEQ ID NO:10, se sometió a un análisis a 60ºC en 6 experimentos diferentes. La proteína tratada con calor se sometió a un SDS-PAGE y la actividad de unión a IgD se analizó mediante transferencias Western. Los geles y filtros resultantes se analizaron mediante densitometría, y la concentración de proteínas (densidad) del monómero se dividió entre la correspondiente concentración de tetrámero. El valor obtenido (%) se relacionó con la concentración (\mug) de la proteína total cargada en los geles. De forma interesante, cuando se comparó la unión a IgD de la forma tetrámera con respecto a la forma monómera, se encontró una unión a IgD 23 veces más eficaz en el MID962-1200 tetrámero (figura 12C).

La proteína de unión a IgD (MID) de M. catarrhalis hemaglutina eritrocitos humanos

Para investigar una implicación putativa de MID en la hemaglutinación se seleccionó una serie de aislados clínicos que expresaban MID o que, mediante variación de fase, se había apagado el gen mid. De forma interesante, todos los 21 aislados que expresan MID hemaglutinan eritrocitos humanos, mientras que sólo cuatro de las cepas MID-negativas (n = 21) hemaglutinan eritrocitos. Se observó una correlación casi absoluta entre la capacidad de hemaglutinación y la expresión de MID. La expresión de UspA1/2 fue similar y es independiente de la expresión de MID.

Estos experimentos iniciales inspiraron a los inventores a estudiar si la proteína MID purificada a partir de la capa modelo de M. catarrhalis Bc5 (Forsgren et al., 2001) hemaglutina o no eritrocitos. Para imitar la superficie bacteriana, la MID se conjugó con esferas de Sepharose y se incubó con eritrocitos humanos. Se incluyó albúmina de suero bovina (BSA) unida a Sepharose como control negativo. De forma interesante, los eritrocitos humanos se hemaglutinaron en presencia de MID-Sepharose, mientras que BSA-Sepharose no interfirió con los eritrocitos (los datos no se muestran).

El dominio de hemaglutinación de MID está localizado entre los restos aminoácidos alanina-764 y serina-913

Para diseccionar la molécula y concretar el sitio específico de la molécula que es responsable de la hemaglutinación se clonó una serie de fragmentos de ADN truncados del gen mid y se expresaron de modo recombinante en E. coli (figura 10). Se generaron en conejos anticuerpos policlonales contra las proteínas MID truncadas y se emplearon en un ELISA. En experimentos preparatorios, anticuerpos contra MID y las proteínas derivadas de MID se valoraron para producir unos valores similares cuando se ensayan en ELISA contra sus respectivos antígenos. La capacidad de las proteínas MID truncadas para unirse a eritrocitos lisados entonces se midió en ELISA utilizando los anticuerpos específicos a concentraciones apropiadas. La MID o el MID764-913 (fragmento E) produjeron unos valores mayores de ELISA (de 4 a 16 veces), comparados con las otras proteínas MID truncadas. Por tanto, la estructura hemaglutinante de MID parece estar localizada dentro de los restos aminoácidos 764-913 de MID (SEQ ID NO:8).

El MID764-913 (fragmento E, SEQ ID NO:8) se une directamente a eritrocitos y a células epiteliales alveolares de tipo II

Para confirmar aún más la importancia de MID764-913 como adhesina se radiomarcaron MID y una selección de proteínas derivadas de MID truncadas y se ensayaron en experimentos de unión directa con eritrocitos humanos y células epiteliales alveolares (figura 13). Ambos [125I]-MID y [125I]-MID764-913 se unían con fuerza a los eritrocitos, mientras que los fragmentos de MID truncados MID367-590 (fragmento C), MID902-1200 (F), MID1011-1446 (G) y MID1616-2139 (I) no se unían por encima de niveles de fondo (figura 13A). De forma paralelo, la línea de células epiteliales alveolares A549 también atrajo a la MID marcada con [125I] de longitud completa y a la MDI764-913 truncada (figura 13B). Todos los demás fragmentos no se unían a las células epiteliales. Tomado todo en consideración, el fragmento MID764-913 (SEQ ID NO:8) resulta ser la parte crucial de la adhesina MID que media en la unión a células de mamífero.

Los anticuerpos contra MID1-2139 de longitud completa y MID764-913 inhiben la adherencia de M. catarrhalis a las células epiteliales alveolares de tipo II

Para analizar más a fondo la influencia de la MID de longitud completa y MID764-963 sobre la adherencia de M. catarrhalis a las células epiteliales alveolares de tipo II se preincubaron una cepa de M. catarrhalis que expresaba MID y otra cepa deficiente en MID con anticuerpos contra MID y, posteriormente, se añadieron a células epiteliales alveolares para determinar la adherencia. Según se demuestra en la figura 14, anticuerpos policlonales dirigidos contra MID1-2139 de longitud completa y MID763-913 (fragmento E, SEQ ID NO:8) inhiben la adherencia de forma eficaz en el aislado que expresa MID. Por contraste, un suero preinmune y un pAb dirigido contra MID1011-1466 (fragmento G) no interfirieron significativamente con la adhesión.

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<110> Forsgren, Arne

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<120> Nueva proteína de unión a IgD expuesta sobre la superficie procedente de Moraxella catarrhalis

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<130> 2021373

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<150> SE 0102410-8

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<151> 04/07/2001

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<160> 11

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<170> PatentIn versión 2.1

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<210> 1

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<211> 2139

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 1

\hskip1cm

4

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5

\hskip1cm

6

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7

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8

\hskip1cm

9

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10

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<210> 2

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<211> 6889

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 2

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12

\hskip1cm

13

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14

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<210> 3

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 3

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15

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<210> 4

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 4

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16

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<210> 5

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 5

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17

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<210> 6

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 6

\hskip1cm

18

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<210> 7

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 7

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19

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<210> 8

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<211> 150

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 8

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\hskip1cm

20

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<210> 9

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<211> 450

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 9

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21

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<210> 10

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<211> 239

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<212> PRT

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 10

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22

\hskip1cm

23

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<210> 11

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<211> 717

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<212> ADN

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<213> Moraxella catarrhalis

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<400> 11

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24

Claims

1. Una proteína expuesta sobre la superficie, que puede detectarse en Moraxella catarrhalis, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie, teniendo el fragmento adhesivo la capacidad de unirse a eritrocitos y a células epiteliales.

2. Un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas.

3. Un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según la reivindicación 2, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:10.

4. Un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse a eritrocitos y células epiteliales.

5. Un fragmento inmunogénico y adhesivo según la reivindicación 4, que tiene una secuencia de aminoácidos según se describe en SEQ ID NO:8.

6. Un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:2, en el que dicha secuencia de ADN codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrahalis según se define en la reivindicación 1.

7. Un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 2.

8. Un segmento de ADN según la reivindicación 7, que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:11, en el que dicha secuencia de ADN codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 3.

9. Un segmento de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 4.

10. Un segmento de ADN según la reivindicación 9, que comprende una secuencia de ADN, según se muestra en SEQ ID NO:9, en el que dicha secuencia de ADN codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo según se define en la reivindicación 5.

11. Una vacuna que contiene una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, o un fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína expuesta sobre la superficie, teniendo el fragmento adhesivo la capacidad de unirse a eritrocitos y a células epiteliales.

12. Una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis según se define en la reivindicación 1, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas.

13. Una vacuna según la reivindicación 12, que contiene un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 3.

14. Una vacuna que contiene un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis según se define en la reivindicación 4.

15. Una vacuna según la reivindicación 14, que contiene un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 5.

16. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, combinada con otra vacuna.

17. Una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, combinada con una porción inmunogénica de otra molécula.

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18. Un plásmido o un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína.

19. Un plásmido o un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas.

20. Un plásmido o un fago según la reivindicación 19, que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 3.

21. Un plásmido o un fago que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales.

22. Un plásmido o un fago según la reivindicación 21, que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 5.

23. Un hospedante no humano que comprende al menos un plásmido o un fago según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 18-22, y que es capaz de producir dicha proteína, o dicho fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, o dicho fragmento inmunogénico y adhesivo de dicha proteína, en el que dicho hospedante se elige entre bacterias, levaduras y plantas.

24. Un hospedante según la reivindicación 23, que es E. coli.

25. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

26. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a a IgD soluble o a IgD unida a membranas, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

27. Una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 26, que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 3, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

28. Una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

29. Una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 28, que comprende una secuencia de ADN que codifica un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 5, en la que la secuencia de ADN está unida a otro gen.

30. Un plásmido o un fago que comprende una secuencia de ADN unida según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 25-29.

31. Un hospedante no humano que comprende al menos un plásmido o un fago según se define en la reivindicación 30, en el que dicho hospedante se elige entre bacterias, levaduras y plantas.

32. Un hospedante según la reivindicación 31, que es E. coli.

33. Una proteína o un polipéptido de fusión, en los que una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante según se define en la reivindicación 25.

34. Una proteína o un polipéptido de fusión, en los que un fragmento inmunogénico o de unión de IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante según se define en la reivindicación 26.

35. Una proteína o un polipéptido de fusión según la reivindicación 34, en los que un fragmento inmunogénico o de unión de IgD según se define en la reivindicación 3, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante según se define en la reivindicación 27.

36. Una proteína o un polipéptido de fusión, en los que un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 1, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante según se define en la reivindicación 28.

37. Una proteína o un polipéptido de fusión según la reivindicación 36, en los que un fragmento inmunogénico y adhesivo según se define en la reivindicación 5, se combina con otra proteína mediante el uso de una molécula de ADN recombinante según se define en la reivindicación 29.

38. Un producto de fusión, en el que una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

39. Un producto de fusión, en el que un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 2, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

40. Un producto de fusión según la reivindicación 39, en el que un fragmento inmunogénico o de unión a IgD según se define en la reivindicación 3, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

41. Un producto de fusión, en el que un fragmento inmunogénico y adhesivo de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 2, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a eritrocitos y células epiteliales, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

42. Un producto de fusión según la reivindicación 41, en el que un fragmento inmunogénico y adhesivo según se define en la reivindicación 5, se une covalentemente o mediante cualquier otro medio a una proteína, un carbohidrato o una matriz.

43. Un método para detectar IgD utilizando una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, opcionalmente marcada y/o unida a una matriz.

44. Un método para detectar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 2, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

45. Un método para detectar IgD según la reivindicación 44, utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis según se define en la reivindicación 3, y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

46. Un método para separar IgD utilizando una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, opcionalmente unida a una matriz.

47. Un método para separar IgD utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie según se define en la reivindicación 2, pudiendo detectarse dicho fragmento en Moraxella catarrhalis y que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, opcionalmente unido a una matriz.

48. Un método para separar IgD según la reivindicación 47, utilizando un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis según se define en la reivindicación 3, que tiene la capacidad de unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, opcionalmente marcado y/o unido a una matriz.

49. Un método para aislar una proteína expuesta sobre la superficie de Moraxella catarrhalis, teniendo dicha proteína una secuencia de aminoácidos según se muestra en SEQ ID NO:1, un peso molecular aparente de 200 kDa según se determina mediante un análisis de SDS-PAGE, y una capacidad para unirse de forma selectiva a IgD soluble o a IgD unida a membranas, o un fragmento inmunogénico o de unión a IgD de dicha proteína, que comprendiendo dicho método las etapas de:

c) eluir la proteína de unión a IgD; y

d) separar la proteína de unión a IgD.

50. Un método según la reivindicación 49, en el que el detergente se selecciona del grupo que comprende Empigen, n-octil-\beta-glucósido y Triton X-100 + EDTA 0,01 M.

51. Un método según la reivindicación 49 ó 50, en el que la concentración del detergente en la etapa a) está dentro del intervalo de 0,1-5%, preferiblemente 3%.