CN102134279A

CN102134279A - 融合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102134279A
Application number: CN2010103006020A
Authority: CN
Inventors: 张智清; 徐一; 刘晓宇; 郭建强; 姚立红; 陈爱君
Original assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2030-01-22
Also published as: CN102134279B

Abstract

本发明是关于一种融合蛋白及其编码基因与应用。本发明的融合蛋白是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与1-3个拷贝的甲型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。本发明还公开了编码该融合蛋白的基因。本发明的融合蛋白可以用来制备甲型流感病毒疫苗。本发明的融合蛋白能刺激机体产生M2多克隆抗体，并且能刺激机体产生针对M2e的细胞免疫应答。

Description

融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

流感是由流感病毒引起的一种呼吸道传染病。几乎每年的流感流行都会造成世界范围内大约25～50万人的死亡，并带来很大的经济负担。流感病毒属于正粘病毒科，是一种分节段的RNA病毒，具有3个膜蛋白分别是血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白2(M2)。目前应用的人流感疫苗是针对甲型流感病毒的H1N1亚型、H3N2亚型和乙型流感病毒的三联灭活疫苗，包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和纯化的病毒表面抗原亚单位疫苗。这些疫苗主要是针对病毒的膜蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；HA和NA是流感病毒主要的跨膜蛋白，具有较好的免疫原性，但是由于其经常发生抗原漂移和抗原转变，其抗原性发生很大变异，必须不断更换制备疫苗用的毒株，给流感的预防和控制带来很大困难。

基质蛋白2(M2)是流感病毒的第三种跨膜蛋白，具有离子通道的功能，可以改变感染细胞内部的pH，以促进病毒的增殖。当M2通道被金刚烷胺阻塞后，可以影响HA的正常转运，从而抑制病毒复制(Protein Engineering 1993，6：65-74)。M2蛋白非常保守，在已发现的几乎所有甲型流感病毒中均无明显变化，特别是其胞外区，历经三次流感大流行仍未发生变化(J Virol 1991，65：5491-5498)。研究证实，M2蛋白的单克隆抗体能够在细胞培养中抑制流感病毒的复制(J Virol 1988，62：2762-2772)，并且在小鼠体内也能够抑制流感病毒的复制(J Virol 1991，65：5491-5498)。目前利用乙肝病毒核心抗原与M2e形成的M2e-HBc融合蛋白可以诱导小鼠产生足够的抗体，并能增强T细胞反应，大大降低流感病毒的致病率、致死率(Vaccine 2006，24：544-551；Virology 2005，337：149-161)。

铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)是由假单胞菌属铜绿假单胞菌分泌的细胞

毒性外毒素。成熟的毒素分子是由613个氨基酸(66kD)组成的单链蛋白，包含三个不同的结构域，分别为I区、II区和III区；其中，I区包括Ia区(1-252)和Ib区(365-404)，Ia区是其受体识别功能结构域，Ib区与PEA的生物学活性无明显关系；II区(253-364)为跨膜区；III区(405-613)为细胞毒性区。

PEA可以与呼吸道粘膜上皮细胞和抗原递逞细胞表面的巨球蛋白受体或低密度脂蛋白受

体结合(Drug Discovery Today 2002，7：247-258；Biochemica et Biophysica Acta2005，1741：234-239；The Journal of Biological Chemistry 1992，267：12420-12423)，通过N端(Ia区)结合到细胞表面特异的受体上。然后，通过受体介导的内吞作用形成胞吞泡，泡内质子泵迅速使泡内酸化，低pH环境引起毒素伸展而被细胞蛋白酶裂解。裂解后，II区一部分、Ib区，III区由C末端特异的氨基酸序列REDLK介导转位入胞浆。III区通过其ADP核糖基转移酶活性将NAD(辅酶I)上的ADP核糖基转移至延伸因子2(EF-2)上，使EF-2失活从而导致蛋白质合成中断致使细胞死亡(The Journal of Biological Chemistry，2002，277：46669-46675)。

需要说明的是，将III区中的第553位谷氨酸缺失突变后，PEA失去了ADP核糖基酶活性，变成无毒性形式(ntPE)，但突变的毒素仍能与天然毒素竞争细胞膜上的受体。因此，ntPE可以作为分子佐剂，以增强疫苗的免疫原性(Biochimica et Biophysica Acta1992，1138：162-166；Vaccine，1999，17：1425-1433)。

发明内容

本发明的目的是提供一种能刺激机体产生M2多克隆抗体并产生针对M2e的细胞免疫应答的融合蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的融合蛋白，是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与1-3个拷贝的甲型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。

本发明的融合蛋白，其中所述2或3个甲型流感病毒M2蛋白胞外区通过连接肽串联连接。

本发明的融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中的序列15自氨基末端第1-651位或者为序列表中的序列15。序列表中的序列15含有组氨酸标签，组氨酸标签便于蛋白的纯化。

本发明的融合蛋白的氨基酸序列可为序列表中的序列16自氨基末端第1-511位或者序列表中的序列16。序列表中的序列16含有组氨酸标签，组氨酸标签便于蛋白的纯化。

本发明所述的融合蛋白可用来制备甲型流感病毒疫苗。

编码所述融合蛋白的基因包括序列表中的序列17或序列表中的序列18。

本发明的融合蛋白还可与佐剂混合制备成甲型流感病毒疫苗，佐剂能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应。佐剂可以选用多种，如不完全福氏佐剂。

所述甲型流感病毒为H1N1流感病毒、H2N2流感病毒、H3N2流感病毒、H5N1流感病毒、H7N7流感病毒或H9N2流感病毒。

甲型流感病毒疫苗可以通过皮下注射或者粘膜途径免疫动物。

本发明的融合蛋白能刺激机体产生M2多克隆抗体，并且能刺激机体产生针对M2e的细胞免疫应答。

本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

图1为重组融合蛋白的表达载体的结构示意图。

图2为pET/PEA-M2载体酶切及PCR鉴定结果的电泳图；

图3为pET/PEA-3M2载体酶切及PCR鉴定结果的电泳图；

图4为PEA-M2和PEA-3M2重组蛋白的表达与鉴定；

图5为PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白的表达与鉴定；

图6为ELISA检测PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白免疫小鼠血清中抗M2e抗体；

图7为ELISPOT法检测PEA-M2H和PEA-3M2H重组蛋白免疫小鼠的脾细胞中分泌IFN-γ的细胞斑点数；

图8为免疫小鼠感染病毒后动物肺病毒载量测定。

具体实施方式

实施例

1、铜绿假单胞菌外毒素A基因的克隆

铜绿假单胞菌(保藏编号ATCC27583)来源于卫生部临床检验中心。采用肉汤培养基培养铜绿假单胞菌，培养温度为37℃。收获菌体并提取铜绿假单胞菌基因组DNA。

采用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增外毒素A基因序列。

PCR引物：5’CGGAATTCATATGCACCTGACAC 3’(SEQ ID NO 1)；5’AACTGCAGTTACTTCAGGTCCTC 3’(SEQ ID NO 2)。

PCR反应体积为50ul，反应条件：首先94℃，5min；然后94℃，45sec，56℃1min 72℃2min；30个循环周期后，72℃延伸10min。

获得PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体获得克隆载体pGEM-PEA，转化大肠杆菌DH5α。

挑取单菌落，用PCR法进行鉴定，然后将阳性克隆作DNA测序，测序结果表明阳性克隆中的插入片段为外毒素A基因序列。

2、用PCR方法对铜绿假单胞菌外毒素A基因进行修饰

为了去除铜绿假单胞菌外毒素A的毒性，采用PCR方法，用四对引物将该蛋白第553位氨基酸缺失。

引物序列：

NTF 5’GCGGCGGGCGAGGTCCGGCTGATCGGCCATC 3’(SEQ ID NO 3)；

NTR 5’GATGGCCGATCA GCCGGACCTCGCCCGCCGC 3’(SEQ ID NO 4)；

NTP15’GGCAAGATCTACCGGGTGCTC3’(SEQ ID NO 5)；

NTP25’TCCAACGCGTTGGGAGCTCTC 3’(SEQ ID NO 6)。

以质粒pGEM-PEA为模板，分别以NTF和NTP1为一对引物，以NTR和NTP2为另一对引物进行PCR扩增。将得到的两个PCR产物分别回收，纯化；将纯化后的两种PCR产物等摩尔数混合，以混合物为模板，NTF和NTP2为引物再做PCR扩增。回收PCR产物，连接到pMD18-T载体(TaKaRa)上，测序。将获得的突变产物命名为nt-PE，其核苷酸序列为序列表中的序列20。

3、pET/PEA-M2表达载体的构建

表达载体pET/PEA-M2的结构如图1所示，用限制性内切酶方法将PEA基因中的Ib区换成流感病毒的M2e基因，并将此融合基因连接到表达载体pET-30(a)上。

用限制性内切酶Xcm I和Apa I酶切pMD-ntPE克隆载体，回收大片段，与同样酶切的化学合成的M2e基因片段(SEQ ID NO 7)连接，构建成PEA-M2。将PEA-M2用核酸内切酶Nde I和HindIII酶切，电泳后回收1967bp片段，连接到表达载体pET-30(a)上，得到表达载体pET/PEA-M2，用PCR法和限制性内切酶对该质粒作鉴定，鉴定结果如图2，图2中泳道1是Marker DL2000(TaKaRa)；泳道2是PCR检测产物；泳道3是Nde I和HindIII酶切pET/PEA-M2质粒结果；泳道4是pET/PEA-M2质粒对照；结果表明构建的pET/PEA-M2含有PEA-M2融合基因，PEA-M2的核苷酸序列为序列表中的序列18。

4、PEA基因I、II区的克隆和pET/PEA-3M2表达载体的构建

表达载体pET/PEA-3M2的结构见图1。首先，用PCR方法扩增PEA基因I、II区，再将三个串联的M2e基因与之连接，并将此融合基因连接到表达载体pET-30(a)上。

以克隆载体pGEM-PEA为模板，用引物CGGAATTCATATGCACCTGACAC(SEQ ID NO 8)和GCGTCGACACCACCACCGAACTCCGCGCCAGTG(SEQ ID NO 9)PCR扩增，获得PCR产物命名为PEAI-II，克隆到pGEM-T Vector(Promega)上。

化学合成3个串联的M2e基因，3个M2e基因之间由连接肽相连，其核苷酸序列见SEQ IDNO 10，命名为3M2e。

用限制性内切酶切回收然后用连接酶连接的方法将PEA I-II与3M2e连在一起，获得PEA-3M2。PEA-3M2插到表达载体pET-30(a)上，得到表达载体pET/PEA-3M2，用PCR法和限制性内切酶法对表达载体进行鉴定。

鉴定结果如图3，图3中泳道1是Marker DL2000(TaKaRa)；泳道2是PCR检测产物；泳道3是Nde I和HindIII酶切pET/PEA-3M2质粒结果；泳道4是pET/PEA-3M2质粒对照，结果表明构建的pET/PEA-3M2含有PEA-3M2融合基因，PEA-3M2的核苷酸序列为序列表中的序列17。

5、pET/PEA-M2H和pET/PEA-3M2H表达载体的构建

为了便于纯化，我们又在上述融合基因的末端加上了组氨酸(His)标签，其结构见图1。

首先采用PCR方法将融合基因的翻译终止信号TAA去掉。

以pET/PEA-M2表达载体为模板；

以引物5’CAAGATCTACCGGGTGCTCGCCG 3’(SEQ ID NO 11)和5’GCTCGAGCTTCAGGTCCTCGCGC 3’(SEQ ID NO 12)为一对引物；进行PCR扩增。

以pET/PEA-3M2表达载体为模板；

以引物5’CAAGATCTACCGGGTGCTCGCCG 3’(SEQ ID NO 13)和5’GCTCGAGATCGCTAGAATCGTTGC 3’(SEQ ID NO 14)为一对引物；进行PCR扩增。

将两个PCR产物分别插到pET-30(a)上，构建成能够表达带有His标签的重组蛋白的载体pET/PEA-M2H和pET/PEA-3M2H。

重组蛋白PEA-M2H的氨基酸序列见SEQ ID NO 15，重组蛋白PEA-3M2H的氨基酸序列见SEQ ID NO 16。

6、重组蛋白PEA-M2和PEA-3M2的表达和鉴定

将pET/PEA-M2和pET/PEA-3M2分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。转化菌在含卡那霉素的LB琼脂培养板上37℃培养。挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃培养12h，然后1∶50接种100mL LB液体培养基，37℃摇床培养。当培养物生长至OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂，继续培养4h。8000rpm离心10分钟收集菌体，用超声液(20mM Tris-Cl pH8.0，150mM NaCl)重悬菌体，400W超声破碎30分钟，然后10000rpm离心10分钟收集包涵体。取少量包涵体与2×上样缓冲液混合煮沸后作SDS-PAGE。

SDS-PAGE结果如图4A，其中泳道1是Marker(Fermentas)；泳道2是含pET-30(a)空载体的菌体对照；泳道3是PEA-M2包涵体；泳道4是PEA-3M2包涵体；泳道5是PEA-M2上清；泳道6是PEA-3M2上清。

SDS-PAGE后，在恒流220mA的条件下将胶上的蛋白电转至0.45um的硝酸纤维素膜上，用M2e单克隆抗体(abcam)做Western Blot鉴定。

Western Blot鉴定结果如图4B，其中泳道1是Marker(Fermentas)；泳道2是PEA-3M2包涵体；泳道3是PEA-M2包涵体；泳道4是pET-30(a)空载体对照。

结果表明重组蛋白PEA-M2和PEA-3M2以包涵体的形式表达。

7、重组蛋白PEA-M2H和PEA-3M2H的表达和纯化

将含有质粒pET/PEA-M2H和pET/PEA-3M2H的大肠杆菌在LB液体培养基中37℃培养至O.D.约为0.6时，加入IPTG(终浓度1mM)诱导四小时，然后8000rpm离心10分钟收集菌体。用超声液(20mM Tris-Cl pH8.0，150mM NaCl)重悬菌体，400W超声30分钟，然后10000rpm离心10分钟收集包涵体，包涵体洗涤后置于-20℃保存。

将包涵体用裂解液(50mM Tris-Cl pH7.4，100mM NaCl，8M尿素，10mM咪唑)裂解，在摇床上轻摇3h，10000rpm离心十分钟收集上清。将上清过Ni-NTA Agroase(Invitrogen)柱层析，以洗脱液(50mM Tris-Cl pH7.4，100mM NaCl，8M尿素，50mM咪唑)洗脱目的蛋白。取少量纯化的样品做SDS-PAGE，然后用M2e单克隆抗体(abcam)做Western Blot检测。

SDS-PAGE结果如图5A，其中泳道1是Marker(Fermentas)；泳道2是重组蛋白PEA-3M2H；泳道3是重组蛋白PEA-M2H。

Western Blot鉴定结果如图5B，其中泳道1是Marker；泳道2是重组蛋白PEA-M2H；泳道3是重组蛋白PEA-3M2H；泳道4是pET-30空载体对照。

结果表明制备的重组蛋白PEA-M2H和重组蛋白PEA-3M2H具有甲型流感病毒M2e蛋白的抗原性。

8、用重组蛋白PEA-M2H和重组蛋白PEA-3M2H免疫小鼠

购买60只6周龄雌性BALB/c小鼠(中国医科院动物所)，将小鼠随机分成三组，第一组为PBS对照组，第二组为PEA-M2H免疫组，第三组为PEA-3M2H免疫组，每组20只。

重组蛋白PEA-M2H稀释至2μg/μl，取1.5mL加入等体积弗氏不完全佐剂，充分混匀，获得PEA-M2H免疫原。

重组蛋白PEA-3M2H稀释至2μg/μl，取1.5mL加入等体积弗氏不完全佐剂，充分混匀，获得PEA-3M2H免疫原。

PBS对照组：用50μl PBS与等体积弗氏不完全佐剂混合物皮下接种免疫小鼠；

PEA-M2H免疫组：用PEA-M2H免疫原皮下接种免疫小鼠，每只100μl；

PEA-3M2H免疫组：用PEA-3M2H免疫原皮下接种免疫小鼠，每只100μl；

隔三周加强免疫一次，共加强两次；

免疫前、初次免疫后两周、第一次加强免疫后两周和第二次加强免疫后两周从小鼠眼眶采血，分离血清用于测定抗体水平。

ELISA检测小鼠血清抗体效价

采用间接ELISA法检测小鼠血清中的抗M2e抗体。

首先用包被液稀释化学合成的M2e多肽，使其终浓度为1ng/μl，100ul/孔包被ELISA板，封闭过夜后加入用含1％BSA的PBS倍比稀释的动物血清，再依次加入HRP标记羊抗鼠IgG，ELISA A、B显色剂显色，用酶标仪读取结果。

ELISA结果见附图6，PBS组的抗体滴度平均为1∶80；PEA-M2H组初次免疫后抗体滴度为1∶620，第一次加强免疫后抗体滴度为1∶2300，第二次加强免疫后抗体滴度达到1∶7800；PEA-3M2H组初次免疫后抗体滴度为1∶1500，第一次加强免疫后抗体滴度为1∶13000，第二次加强免疫后抗体滴度达到1∶40000。PEA-M2H免疫组和PEA-3M2H免疫组的抗体效价明显高于PBS组。

上述的结果表明，PEA-M2H和PEA-3M2H都能诱导小鼠产生抗M2e抗体。

ELISPOT检测小鼠细胞免疫应答

末次免疫5天后无菌取脾，制备脾细胞悬液，用于ELISPOT实验。

用ELISPOT检测试剂盒(BD^TM ELISPOT Mouse IFN-γSet)检测在体外培养的小鼠脾细胞中，用化学合成的M2e刺激后，能够分泌IFN-γ的脾细胞数量。

ELISPOT结果见图7，每1×10⁷个脾细胞中，PBS组的斑点数为4个，PEA-M2H免疫组的斑点数为163个，PEA-3M2H免疫组的斑点数为232个。实验结果表明，PEA-M2H免疫组和PEA-3M2H免疫组的细胞免疫反应明显高于对照组，表明融合蛋白免疫刺激了小鼠针对M2e的细胞免疫应答。

病毒攻击后小鼠肺病毒载量测定

末次免疫后两周用甲型流感病毒PR8株经鼻腔感染小鼠。攻毒后第五天，每组取5只小鼠处死、无菌取肺，制成肺悬液。将倍比稀释的肺悬液接种于体外培养的MDCK细胞培养板中。每日观察细胞病变，当CPE达到+++～++++时收获上清。取50ul待测样品，加入等体积的1％火鸡红血球做血细胞凝集试验。观察红细胞凝集现象并记录结果。根据Reed-Muench方法计算TCID50。

结果见图8，在病毒感染第五天，PBS组、PEA-M2H免疫组和PEA-3M2H免疫组的lgTCID₅₀分别为6.5、5.3和5.1，免疫组病毒载量显著低于PBS组，说明融合蛋白免疫后对小鼠提供了一定的保护作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>

<120>

<160>16

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>1

cggaattcat atgcacctga cac 23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>2

aactgcagtt acttcaggtc ctc 23

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>3

gcggcgggcg aggtccggct gatcggccat c 31

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>4

gatggccgat cagccggacc tcgcccgccg c 31

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>5

ggcaagatct accgggtgct c 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>6

tccaacgcgt tgggagctct c 21

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>7

cggaattcat atgcacctga cac 23

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>8

gcgtcgacac caccaccgaa ctccgcgcca gtg 33

<210>9

<211>77

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>9

Thr Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

1 5 10 15

Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Ser Leu Leu Thr

20 25 30

Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp

35 40 45

Ser Ser Asp Gly Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile

50 55 60

Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

65 70 75

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>10

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

1 5 10 15

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>11

caagatctac cgggtgctcg ccg 23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>12

gctcgagctt caggtcctcg cgc 23

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>13

caagatctac cgggtgctcg ccg 23

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>14

gctcgagatc gctagaatcg ttgc 24

<210>15

<211>657

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>15

Met His Leu Thr Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ala Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu

20 25 30

Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val

35 40 45

Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly

50 55 60

Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu

85 90 95

Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr

100 105 110

Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val

115 120 125

Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu

130 135 140

Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile

145 150 155 160

Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe

165 170 175

Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile

180 185 190

Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg

195 200 205

Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu

210 215 220

Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn

225 230 235 240

Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn

245 250 255

Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg

260 265 270

Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln

275 280 285

Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg

290 295 300

Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val

325 330 335

Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu

340 345 350

Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala

355 360 365

Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu

370 375 380

Ala Gly Ala Ala Ser Ala Asp Val Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

385 390 395 400

Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

405 410 415

Gly Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro

420 425 430

Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr

435 440 445

Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg

450 455 460

Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe

465 470 475 480

Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser

485 490 495

Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro

500 505 510

Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly

515 520 525

Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser

530 535 540

Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala

545 550 555 560

Ala Gly Glu Val Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp

565 570 575

Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu

580 585 590

Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro

595 600 605

Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro

610 615 620

Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro

625 630 635 640

Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys Leu Glu His His His His His

645 650 655

His

<210>16

<211>517

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<230>

<400>16

Met His Leu Thr Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ala Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu

20 25 30

Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val

35 40 45

Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly

50 55 60

Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu

85 90 95

Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr

100 105 110

Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val

115 120 125

Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu

130 135 140

Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile

145 150 155 160

Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe

165 170 175

Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile

180 185 190

Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg

195 200 205

Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu

210 215 220

Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn

225 230 235 240

Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn

245 250 255

Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser His Arg

260 265 270

Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln

275 280 285

Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg

290 295 300

Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val

305 310 315 320

Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val

325 330 335

Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu

340 345 350

Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala

355 360 365

Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu

370 375 380

Ala Gly Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala

385 390 395 400

Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu

405 410 415

Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Gly Gly Gly Val Asp Ala Ile

420 425 430

Thr Ser Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

435 440 445

Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Gly Gly Gly Ser Leu Leu Thr

450 455 460

Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp

465 470 475 480

Ser Ser Asp Gly Gly Gly Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile

485 490 495

Arg Asn Glu Trp Gly Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Leu Glu His

500 505 510

His His His His His

515

<210>17

<211>1530

<212>DNA

<213>

<400>17

atgcacctga caccccattg gatccccctg gtcgccagcc tcggcctgct cgccggcggc 60

tcgttcgcgt ccgccgccga ggaagccttc gacctctgga acgaatgcgc caaggcctgc 120

gtgctcgacc tcaaggacgg cgtgcgttcc agccgcatga gcgtcgaccc ggccatcgcc 180

gacaccaacg gccagggcgt gctgcactac tccatggtcc tggagggcgg caacgacgcg 240

ctcaagctgg ccatcgacaa cgccctcagc atcaccagcg acggcctgac catccgcctc 300

gaaggcggcg tcgagccgaa caagccggtg cgctacagct acacgcgcca ggcgcgcggc 360

agttggtcgc tgaactggct ggtaccgatc ggccacgaga agccctcgaa catcaaggtg 420

ttcatccacg aactgaacgc cggtaaccag ctcagccaca tgtcgccgat ctacaccatc 480

gagatgggcg acgagttgct ggcgaagctg gcgcgcgatg ccaccttctt cgtcagggcg 540

cacgagagca acgagatgca gccgacgctc gccatcagcc atgccggggt cagcgtggtc 600

atggctcagg cccagccgcg ccgggaaaag cgctggagcg aatgggccag cggcaaggtg 660

ttgtgcctgc tcgacccgct ggacggggtc tacaactacc tcgcccagca gcgctgcaac 720

ctcgacgata cctgggaagg caagatctac cgggtgctcg ccggcaaccc ggcgaagcat 780

gacctggaca tcaagcccac ggtcatcagt catcgcctgc atttccccga gggcggcagc 840

ctggccgcgc tgaccgcgca ccaggcctgc cacctgccgc tggagacctt cactcgtcat 900

cgccagccgc gcggctggga acaactggag cagtgcggct atccggtgca gcggctggtc 960

gccctctacc tggcggcgcg actgtcgtgg aaccaggtcg accaggtgat ccgcaacgcc 1020

ctggccagcc ccggcagcgg cggcgacctg ggcgaagcga tccgcgagca gccggagcag 1080

gcccgtctgg ccctgaccct ggccgccgcc gagagcgagc gcttcgtccg gcagggcacc 1140

ggcaacgacg aggccggcgc ggccagcgcc gacgtggtga gcctgacctg cccggtcgcc 1200

gccggtgaat gcgcgggccc ggcggacagc ggcgacgccc tgctggagcg caactatccc 1260

actggcgcgg agttcggtgg tggtgtcgac gcaatcacta gtagcctgct gaccgaagtg 1320

gagacgccga ttcgtaacga gtggggctgt cgctgtaatg attctagtga cggcggtggt 1380

agtctgctga cggaagttga aaccccgatc cgcaatgagt ggggttgccg ttgtaatgac 1440

tctagcgatg gtggcggcag cctgctgact gaggtcgaaa ctccaattcg caacgaatgg 1500

ggctgccgtt gcaacgattc tagcgattaa 1530

<210>18

<211>1530

<212>DNA

<213>

<400>18

atgcacctga caccccattg gatccccctg gtcgccagcc tcggcctgct cgccggcggc 60

tcgttcgcgt ccgccgccga ggaagccttc gacctctgga acgaatgcgc caaggcctgc 120

gtgctcgacc tcaaggacgg cgtgcgttcc agccgcatga gcgtcgaccc ggccatcgcc 180

gacaccaacg gccagggcgt gctgcactac tccatggtcc tggagggcgg caacgacgcg 240

ctcaagctgg ccatcgacaa cgccctcagc atcaccagcg acggcctgac catccgcctc 300

gaaggcggcg tcgagccgaa caagccggtg cgctacagct acacgcgcca ggcgcgcggc 360

agttggtcgc tgaactggct ggtaccgatc ggccacgaga agccctcgaa catcaaggtg 420

ttcatccacg aactgaacgc cggtaaccag ctcagccaca tgtcgccgat ctacaccatc 480

gagatgggcg acgagttgct ggcgaagctg gcgcgcgatg ccaccttctt cgtcagggcg 540

cacgagagca acgagatgca gccgacgctc gccatcagcc atgccggggt cagcgtggtc 600

atggctcagg cccagccgcg ccgggaaaag cgctggagcg aatgggccag cggcaaggtg 660

ttgtgcctgc tcgacccgct ggacggggtc tacaactacc tcgcccagca gcgctgcaac 720

ctcgacgata cctgggaagg caagatctac cgggtgctcg ccggcaaccc ggcgaagcat 780

gacctggaca tcaagcccac ggtcatcagt catcgcctgc atttccccga gggcggcagc 840

ctggccgcgc tgaccgcgca ccaggcctgc cacctgccgc tggagacctt cactcgtcat 900

cgccagccgc gcggctggga acaactggag cagtgcggct atccggtgca gcggctggtc 960

gccctctacc tggcggcgcg actgtcgtgg aaccaggtcg accaggtgat ccgcaacgcc 1020

ctggccagcc ccggcagcgg cggcgacctg ggcgaagcga tccgcgagca gccggagcag 1080

gcccgtctgg ccctgaccct ggccgccgcc gagagcgagc gcttcgtccg gcagggcacc 1140

ggcaacgacg aggccggcgc ggccagcgcc gacgtgggta gccttctaac cgaggtcgaa 1200

acacctatca gaaacgaatg ggggtgcaga tgcaacgatt caagtgacgg gggcccggcg 1260

gacagcggcg acgccctgct ggagcgcaac tatcccactg gcgcggagtt cctcggcgac 1320

ggcggcgacg tcagcttcag cactcgcggc acgcagaact ggacggtgga gcggctgctc 1380

caggcgcacc gccaactgga ggagcgcggc tatgtgttcg tcggctacca cggcaccttc 1440

ctcgaagcgg cgcaaagcat cgtcttcggc ggggtgcgcg cgcgcagcca ggacctcgac 1500

gcgatctggc gcggtttcta tatcgccggc gatccggcgc tggcctacgg ctacgcccag 1560

gaccaggaac ccgacgcgcg cggccggatc cgcaacggtg ccctgctgcg ggtctatgtg 1620

ccgcgctgga gtctgccggg cttctaccgc accggcctga ccctggccgc gccggaggcg 1680

gcgggcgagg tccggctgat cggccatccg ctgccgctgc gcctggacgc catcaccggc 1740

cccgaggagg aaggcgggcg cctggagacc attctcggct ggccgctggc cgagcgcacc 1800

gtggtgattc cctcggcgat ccccaccgac ccgcgcaacg tcggcggcga cctcgacccg 1860

tccagcatcc ccgacaagga acaggcgatc agcgccctgc cggactacgc cagccagccc 1920

ggcaaaccgc cgcgcgagga cctgaagctc gagcaccacc accaccacca ctga 1974

<210>20

<211>2128

<212>DNA

<213>

<400>20

gacggccagt gattgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggcccgac gtcgcatgct 60

cccggccgcc atggccgcgg gattggaatt catatgcacc tgacacccca ttggatcccc 120

ctggtcgcca gcctcggcct gctcgccggc ggctcgttcg cgtccgccgc cgaggaagcc 180

ttcgacctct ggaacgaatg cgccaaggcc tgcgtgctcg acctcaagga cggcgtgcgt 240

tccagccgca tgagcgtcga cccggccatc gccgacacca acggccaggg cgtgctgcac 300

tactccatgg tcctggaggg cggcaacgac gcgctcaagc tggccatcga caacgccctc 360

agcatcacca gcgacggcct gaccatccgc ctcgaaggcg gcgtcgagcc gaacaagccg 420

gtgcgctaca gctacacgcg ccaggcgcgc ggcagttggt cgctgaactg gctggtaccg 480

atcggccacg agaagccctc gaacatcaag gtgttcatcc acgaactgaa cgccggtaac 540

cagctcagcc acatgtcgcc gatctacacc atcgagatgg gcgacgagtt gctggcgaag 600

ctggcgcgcg atgccacctt cttcgtcagg gcgcacgaga gcaacgagat gcagccgacg 660

ctcgccatca gccatgccgg ggtcagcgtg gtcatggctc aggcccagcc gcgccgggaa 720

aagcgctgga gcgaatgggc cagcggcaag gtgttgtgcc tgctcgaccc gctggacggg 780

gtctacaact acctcgccca gcagcgctgc aacctcgacg atacctggga aggcaagatc 840

taccgggtgc tcgccggcaa cccggcgaag catgacctgg acatcaagcc cacggtcatc 900

agtcatcgcc tgcatttccc cgagggcggc agcctggccg cgctgaccgc gcaccaggcc 960

tgccacctgc cgctggagac cttcactcgt catcgccagc cgcgcggctg ggaacaactg 1020

gagcagtgcg gctatccggt gcagcggctg gtcgccctct acctggcggc gcgactgtcg 1080

tggaaccagg tcgaccaggt gatccgcaac gccctggcca gccccggcag cggcggcgac 1140

ctgggcgaag cgatccgcga gcagccggag caggcccgtc tggccctgac cctggccgcc 1200

gccgagagcg agcgcttcgt ccggcagggc accggcaacg acgaggccgg cgcggccagc 1260

gccgacgtgg tgagcctgac ctgcccggtc gccgccggtg aatgcgcggg cccggcggac 1320

agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat cccactggcg cggagttcct cggcgacggc 1380

ggcgacgtca gcttcagcac tcgcggcacg cagaactgga cggtggagcg gctgctccag 1440

gcgcaccgcc aactggagga gcgcggctat gtgttcgtcg gctaccacgg caccttcctc 1500

gaagcggcgc aaagcatcgt cttcggcggg gtgcgcgcgc gcagccagga cctcgacgcg 1560

atctggcgcg gtttctatat cgccggcgat ccggcgctgg cctacggcta cgcccaggac 1620

caggaacccg acgcgcgcgg ccggatccgc aacggtgccc tgctgcgggt ctatgtgccg 1680

cgctggagtc tgccgggctt ctaccgcacc ggcctgaccc tggccgcgcc ggaggcggcg 1740

ggcgaggtcc ggctgatcgg ccatccgctg ccgctgcgcc tggacgccat caccggcccc 1800

gaggaggaag gcgggcgcct ggagaccatt ctcggctggc cgctggccga gcgcaccgtg 1860

gtgattccct cggcgatccc caccgacccg cgcaacgtcg gcggcgacct cgacccgtcc 1920

agcatccccg acaaggaaca ggcgatcagc gccctgccgg actacgccag ccagcccggc 1980

aaaccgccgc gcgaggacct gaagtaactg cagttaatca ctagtgcggc cgcctgcagg 2040

tcgaccatat gggagagctc ccaacgcgtt ggatgcatag cttgagtatt ctatagtgtc 2100

acctaaatag cttggcgtaa tcatgtca 2128

Claims

1.一种融合蛋白，是铜绿假单胞菌外毒素A的非必需区或羧基末端与1-3个拷贝的甲型流感病毒M2蛋白胞外区融合获得的融合蛋白；所述铜绿假单胞菌外毒素A的氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-392位及第407-657位。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述2或3个甲型流感病毒M2蛋白胞外区通过连接肽串联连接。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中的序列15自氨基末端第1-651。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中的序列15。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中的序列16自氨基末端第1-511位。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中的序列16。

7.权利要求1-6中任意所述的融合蛋白在制备甲型流感疫苗中的应用。

8.编码权利要求1-7中任意所述蛋白的基因。

9.根据权利要求8所述的融合基因，其特征在于：其核苷酸序列为序列表中的序列17。

10.

根据权利要求9所述的融合基因，其特征在于：其核苷酸序列为序列表中的序列18。