CN104507499A - 鲍式不动杆菌的新靶标 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在病原性生物体(例如不动杆菌(Acinetobacter))感染过程中表达的抗原性多肽,以及包含这些多肽的组合物。本发明还提供用于治疗、预防或检测细菌感染的组合物,具体是采用所述抗原性多肽的疫苗组合物。本发明还提供针对所述抗原性多肽的抗体。
Description
技术领域
本发明涉及在病原性生物体(例如不动杆菌(Acinetobacter)感染过程中表达的抗原性多肽,以及包含这些多肽的组合物。本发明还涉及其用于治疗、预防或检测细菌感染的应用,具体涉及所述抗原性多肽在疫苗接种中的应用。本发明还涉及针对所述抗原性多肽的抗体。
背景技术
不动杆菌种(Acinetobacter spp.)在自然中广泛分布。不动杆菌属被分为约20个种。其为革兰氏阴性、氧化酶阴性、非运动性、硝酸盐阴性、非发酵细菌。
鲍式不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是该属中最常被分离的种。其能够在医院环境中的各种表面(湿润和干燥表面)上存活。鲍式不动杆菌在最近才被鉴定为医院病原体。侵入型技术(例如手术)和肺部换气联合免疫功能不全的患者已致所述不动杆菌属作为医院病原体的重要程度增加。
医院和社区带来的感染频率已逐年稳定增高。并且,因为出现了(多重)抗药菌株,对于这些感染的治疗变得越来越具挑战性。
通常通过好氧细菌感染的症状结合对源自感染组织的体液的微生物培养来诊断不动杆菌感染。然后,体外鉴定培养的细菌。已开发出并应用多种遗传型性方法来研究该属的多样性或种系发生。这些方法包括采用AFLP的高分辨率指纹识别、采用消化PCR扩增序列的PCR-RFLP、以及对不同DNA序列的分析。
近期医学史上的最重要发展之一是疫苗的发展,其提供来自广泛多样病原性生物体的预防性保护。许多疫苗由失活或减毒的病原体产生,其被注射进入个体。被免疫的个体通过产生体液(抗体)应答和细胞(溶细胞型T细胞和/或辅助T细胞和/或调节型T细胞等)应答来作出响应。
然而,减毒生物体在针对某些疾病的疫苗中的应用仍有问题,这归因于缺乏关于所述减毒条件和性质的病理学知识。利用失活或减毒病原体的另一种应用是鉴定特别引起免疫系统敏感的病原体表位。就这点而言,在感染过程中由病原性生物体产生的多种病原性毒素均特别有用于开发保护该个体不受特定病原性生物体侵害的疫苗。
所谓亚单位疫苗对免疫系统呈递抗原而不引入病原性颗粒(例如完整病毒或其它)。大多数情况下,此类亚单位疫苗通过在宿主生物体中重组表达抗原,从该宿主生物体纯化然后制备成疫苗组合物来产生。
一般而言,认为不动杆菌种对于健康个体是非病原性的。最近认识到的不动杆菌种的临床重要性刺激了对这些疾病发病机理中涉及的各种细菌和宿主成分进行研究的兴趣。对于该相互作用的了解在控制所述感染中具有重要作用。不动杆菌感染通常涉及高液体含量的器官系统(例如,呼吸道、CSF(脑脊髓液)、腹膜液、尿道),体现为医院获得性肺炎(nosocomial pneumonia)、与持续性非卧床腹膜透析(CAPD)相关联的感染,或导管相关的菌尿。
Pantophlet等描述了不动杆菌脂多糖类(LPS)的O抗原和用于鉴定不动杆菌分离物的相应抗体(Pantophlet R.等,Clinical and Diagnostic LaboratoryImmunology,9,60-65(2002))。
Tomarasz等.鉴定了多顺反子csuAB基因簇并显示其在pili生成和组装以及后续生物膜(例如在医院表面和医用装置上)形成中的重要性(Tomarasz A.P.等,Microbiology,154,3398-3409(2008))。
US 6,562,958公开了关于鲍式不动杆菌的约4000种核酸和氨基酸序列,但是,这些序列中大多数的功能未经鉴定。US 6,713,062公开了OmpA和OmpA样蛋白能够刺激胃泌素和IL-8基因表达。然而,迄今为止没有开发疫苗。因缺乏有效可行的靶标,尚未开发针对不动杆菌感染的基于表面暴露型蛋白质和分泌型蛋白质的疫苗。
因此,本领域对在不动杆菌(优选鲍式不动杆菌)感染过程中表达的,并且适于开发疫苗且易于产生诊断性、预防性和治疗性抗体的抗原性多肽有高度医用需求。
已开发多种方法以从各种病原体鉴定有潜力的抗原性多肽,但是,他们不具有证明此类多肽适合作为疫苗组合物中的免疫原性靶标的一般手段。
因此,本发明要解决的技术问题是提供待用于疫苗组合物和/或用于产生诊断性、预防性和治疗性有用抗体的具有临床优势的鲍式不动杆菌靶标。
该技术问题通过提供抗原性多肽编码核酸和与所述抗原性多肽结合的抗体或抗体结合片段来解决。
发明内容
本发明提供一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包含由核酸分子编码的至少一种多肽,所述核酸分子包含选自下组的多核苷酸:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)与(a)~(d)中任一种全长多核苷酸互补的多核苷酸。
优选所述核酸分子是基因组DNA。
在本发明的一个实施方式中,所述多核苷酸源自不动杆菌属;优选所述多核苷酸源自鲍式不动杆菌种。
在本发明的另一个实施方式中,所述疫苗组合物还包含药学上可接受的运载体和/或佐剂。
在另一个实施方式中,本发明提供一种抗原性多肽,所述抗原性多肽由SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中所示任一种氨基酸序列组成;或其片段、类似物或功能衍生物,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性。
在其它实施方式中,本发明提供编码本发明抗原性多肽的核酸分子,包含所述核酸分子的表达载体和包含本发明所述载体和/或所述分子的宿主细胞。
在另一个实施方式中,本发明提供与本发明抗原性多肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段能够诱导针对鲍式不动杆菌的效应子功能。本发明提供的抗体是多克隆或单克隆抗体;优选人抗体。所述抗体可以是N末端修饰、内部修饰和/或C末端修饰(例如通过寡聚化修饰),并且可接合至药物和/或标记物的抗体。
本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够诱导针对鲍式不动杆菌的效应子功能。最优选地,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQID NO:36中所示的表位共有基序PVDFTVAI。
本发明的单克隆抗体优选通过人B细胞产生或由所述人B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤产生。因此,本发明提供能够产生本发明单克隆抗体的杂交瘤。本发明还提供编码本发明抗体的轻链和重链的核酸,包含所述核酸的载体,以及包含所述载体和/或所述核酸的宿主细胞。
在另一个实施方式中,本发明提供用于产生本发明单克隆抗体的方法,所述方法包括:如本文所述在允许抗体分泌的条件下培养所述杂交瘤,和任选地从所述培养物上清液纯化所述抗体。
在另一个实施方式中,本发明提供包含本发明所述抗原性多肽或抗体以及药学上可接受的运载体的药物组合物。在另一个实施方式中,本发明提供用于检测患者内细菌感染的包含本发明所述抗原性多肽或抗体的诊断型组合物。提供本发明抗体用于治疗、预防和/或检测哺乳动物中的细菌感染;所述哺乳动物优选是人。
在另一个实施方式中,本发明提供用于治疗和/或预防哺乳动物中的细菌感染的多肽,所述多肽由包含选自下组的多核苷酸的核酸分子编码:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)是(a)~(d)中任一种全长多核苷酸的互补体的多核苷酸。
优选的哺乳动物是人。在本发明的另一个实施方式中,待治疗、预防和/或检测的细菌感染由鲍式不动杆菌引起,所述细菌感染可以是医院获得性的。用于本发明应用的抗原性多肽组合物还可包含递送载剂;优选是病毒颗粒。
附图说明
图1显示来自康复期鲍式不动杆菌患者(左)和普通随机挑选的血液供者(右)的血清的IgG效价。
本发明的抗原性多肽经重组表达、纯化并采用来自康复期鲍式不动杆菌患者和普通随机选择的血液供者的血清以不同稀释度进行ELISA测试。图表中的数字反应测试血清的数量,并且与抗原性多肽(A-H)反应的稀释度如图例中指定的不同颜色指示。
效价定义为产生对应空白信号两倍的抗原特异性ELISA信号的最高血清稀释度。测试的患者血清大多数包含针对本发明鉴定靶标的抗体。相较于健康血液供者而言,患者血清一般包含较高效价。就所有抗原而言,个别患者血清可由极高抗体效价(≥1/6400)鉴定,前提是抗原在人中具有免疫原性并且在感染过程中表达。这强烈暗示这些新鉴定的靶标是可用于疫苗开发和预防性/治疗性抗体生产。
A:His-AB023(对应于SEQ ID NO:2);B:His-AB024(对应于SEQ ID NO:4);C:His-AB025(对应于SEQ ID NO:6);D:His-AB030(对应于SEQ ID NO:8);E:His-AB031 L1(对应于SEQ ID NO:10);F:His-FimA(对应于SEQ ID NO:12);G:His-CsuAB(对应于SEQ ID NO:14);H:His-OmpA(对应于SEQ ID NO:16)。
图2显示采用兔血清进行的ELISA。
兔用重组的带his标签的抗原性多肽免疫。在分别被覆有不同抗原性多肽的ELISA板上通过ELISA测试终血血清和免疫前血清。此外,通过ELISA在被覆有如下对照试剂的板上测试终血:带His标签的OmpA,其作为A-G的对照,以及His-CsuAB,其作为H的对照。该图显示主要免疫应答由所述靶标而非His标签引起,所述His标签也在对照中存在。免疫兔的重复组获得相当的结果。所用的免疫和免疫前血清稀释度是:
A:a-His-AB023(1:6400);B:a-His-AB024(1:6400);C:a-His-AB025(1:6400);D:a-His-AB030(1:25600);E:a-His-AB031 L1(1:12800);F:a-His-FimA(1:400);G:a-His-CsuAB(1:3200);H:a-His-OmpA(1:6400)。
图3显示免疫印迹分析。
测试所述兔抗血清的特异性。分别制备来自不同鲍式不动杆菌(AB)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(PA)菌株的细胞裂解物(作为阴性对照),在SDS-PAGE上分离蛋白质并印迹至硝酸纤维素上。以1:1000的稀释度使用针对不同多肽的兔血清(免疫血清)和免疫前血清(示例性的细节于实施例6中给出)。
细菌裂解物:1:AB:ATCC19606野生型;2:AB:ATCC19606 OmpA K.O;3:AB:ATCC19606;CsuE K.O;4:PA 011;5:AB:AB-N;6:AB:Luh8168;7:AB:Ruh134;8:AB:SAN;
免疫血清:A:a-His-AB023;B:a-His-AB024;C:a-His-AB025;D:a-His-CsuAB;E:a-His-OmpA;F:a-His-AB030;G:a-His-FimA;H:a-His-AB031L1;
图4显示另一项免疫印迹分析。
测试在培养物上清液中的兔抗血清针对多肽FimA的特异性。图4显示代表性的鲍式不动杆菌(AB-Non-类粘蛋白)、铜绿假单胞菌(PA 011)和大肠杆菌(E.coli)(DH5a)菌株的免疫印迹。
将过夜细菌培养物离心并使上清液中的蛋白质沉淀。等培养物体积的细胞团块(P)和经沉淀的上清液(SN)通过免疫印迹分析采用a-His-FimA兔抗血清检测FimA的存在。总计29株鲍式不动杆菌菌株通过免疫印迹分析上清液和细菌团块中FimA的存在。细胞团块中包含45%的可检测的量,而SN中包含55%的可检测的量。
AB:鲍式不动杆菌菌株AB-NM(无-类粘蛋白);PA:铜绿假单胞菌011;EC:大肠杆菌DH5a
图5显示另一项免疫印迹分析。
通过免疫印迹分析测试所选人血清的特异性。重组蛋白质在SDS-PAGE上分离并印迹至硝酸纤维素上。以1:500的稀释度使用针对不同多肽(1-7)的不同患者血清(A-F)(实验细节在实施例6中给出)。为了排除针对His标签的抗体伪影(artefacts),选择重组抗原的组合以在各免疫印迹中包含带His标签的蛋白质作为不被对应患者血清识别的阴性对照。
重组蛋白:1-His-AB023;2-His-AB024;3-His-AB025;4-His-AB030;5-His-FimA;6-His-CsuAB;7-His-OmpA;8-AB031-L1(还未在免疫印迹上鉴定针对AB031L1的人血清)。
图6显示FACS分析;其中
图A显示以1:200的稀释度使用患者血清的对鲍式不动杆菌菌株ATCC19606野生型(wt)、OmpA KO(OmpA-)和CsuE KO(CsuE-)的FACS分析。采用正向和侧向散射对细菌群进行门选,并检测20000个细菌。
图B显示采用与A中相同的患者血清和仪器设置对鲍式不动杆菌菌株ATCC19606野生型(wt)进行的FACS分析。所用的患者血清不采用(S)或采用重组OmpA(S+rOmpA)作为抑制剂;和
图C显示采用患者血清对鲍式不动杆菌ATCC19606野生型(1)、OmpA KO(2)作为阴性对照和CsuE KO(3)的细胞裂解物的免疫印迹分析。对印迹进行丽春红染色确认细胞裂解物的等量上样。经丽春红染色很明显地显示ATCC19606野生型和CsuE KO的细胞裂解物中的OmpA蛋白质条带。
图7涉及另一项FACS分析;其中
图A显示采用间接荧光标记的αCsuAB兔免疫血清(IS)或对应的免疫前血清(PIS)对鲍式不动杆菌菌株ATCC19606(wt)和CsuE-KO(CsuE-)的FACS分析。采用FITC标记的山羊-抗-兔-IgG作为二抗。由门选的细菌制得绘出荧光信号强度对事件数量的直方图。采用正向和侧向散射对细菌群进行门控,并检测5000个细菌。
图B显示对不同鲍式不动杆菌菌株(ATCC 19606、CsuE KO、Luh9415、Ruh134、Ruh875)的FACS分析。图表显示采用αCsuAB兔免疫血清(IS)或对应的免疫前血清(PIS)的荧光间接标记的细菌的百分比。当FL1-H信号强度>20时,认为细菌是阳性的。
图8显示凝集试验和免疫荧光分析的结果;其中
图A显示采用1.5mg/ml总兔IgG的活鲍式不动杆菌(菌株ATCC19606)的凝集,所述兔IgG纯化自αCsuAB兔免疫血清或未处理的兔血清;和
图B显示对鲍式不动杆菌(菌株ATCC 19606和CsuE KO)的免疫荧光分析。使细菌在含10%FCS的细胞培养基(IMDM)中于载玻片上生长24小时。细菌用DAPI标记以定位细菌DNA(上图),并采用αCsuAB兔免疫血清(IS)或对应的免疫前血清(PIS)和FITC标记的二抗进行荧光间接标记(下图)。
图9显示杀菌试验和免疫印迹分析;其中
图A和B显示杀菌试验。图表显示用来自兔CsuAB免疫血清(灰色短线)或来自未处理兔血清(黑色短线)的纯化的IgG的孵育后集落形成单位(cfu)的数量;其中
A关于对数生长的鲍式不动杆菌、ATCC 19606和CsuE KO(CsuE-),其与抗体(0.5μg/孔)在37℃孵育20分钟。添加作为补充来源的婴儿兔血清(BRS)并孵育2小时。最终通过在LBA上铺板来定量cfu;和
B关于对数生长的鲍式不动杆菌Ruh 134,其与抗体(5μg/孔)在37℃孵育20分钟。添加作为补充来源的婴儿兔血清(BRS)或作为对照的热失活BRS(HBRS),并且用或不用先前转化成中性白细胞的HL-60细胞(+HL60)补足。使混合物另孵育2小时。最终通过铺板至LBA上来定量cfu。
A和B:误差线显示三个独立孔的标准偏差;斯氏T检验(等方差,双侧)显示如下比较有<0.05的统计学显著性:
ATCC19606/ctCsuAB相较于CsuE-/αCsuAB;ATCC19606/αCsuAB相较于ATCC19606/未处理的IgG;Ruh134+BRS+HL60/ccCsuAB相较于Ruh134+HBRS+HL60/αCsuAB;Ruh134+BRS+HL60/αCsuAB相较于Ruh134+BRS+HL60/未处理的IgG;Ruh134+BRS/αCsuAB相较于Ruh134+HBRS/αCsuAB;Ruh134+BRS/αCsuAB相较于Ruh134+BRS/未处理的IgG。
图C显示野生型和CsuE KO鲍式不动杆菌菌株ATCC19606的免疫印迹分析;和
图10显示FimA蛋白质沉淀试验的结果;其中将来自FimA兔免疫血清(1)的总IgG(10μg)被覆至蛋白质A珠上(20μΙ床体积)并用于从菌株Luh9415的鲍式不动杆菌培养物上清液(0.4mL)捕获未处理的FimA,所述菌株Luh9415已知分泌FimA进入SN。采用等量的来自未处理兔血清(2)的总IgG作为阴性对照。通过煮沸10分钟使捕获的总蛋白质释放进入SDS-PAGE样品缓冲液,而7%通过SDS-PAGE分离。以1:1000的稀释度采用aFimA免疫血清通过免疫印迹分析观察未处理的FimA。
图11显示采用CsuAB兔免疫血清的被动免疫。
中性白细胞减少症小鼠在i.p.注射0.15mL免疫血清(实线)或来自未处理动物的等体积血清(虚线)后用鲍式不动杆菌感染。记录4~5天的小鼠存活率。不同菌株间和不同致死时间的鲍式不动杆菌菌株毒力不同。实验B和C平行进行,而A中所示实验在另一天进行。
图A显示菌株AB-M,10只动物/组;图B显示菌株AB-M,14只动物/组,且图C显示菌株AYE,14-15只动物/组。
图12显示主动免疫实验。主动免疫之后的鲍式不动杆菌诱导的肺炎模型中的死亡率。小鼠用抗原(实线A-F:A:AB025-9只动物,B:AB030-10只动物,C:AB031 L1-9只动物,D:FimA-9只动物,E:CsuAB-10只动物,F:OmpA-9只动物)接种疫苗,并随后通过气管内接种鲍式不动杆菌(菌株AB-M)来诱导肺炎。一组小鼠仅用佐剂接种疫苗以作为对照(虚线A-G;10只动物)。在第二对照组中,采用PBS替代疫苗或佐剂(实线G;9只动物)。就所有测试的抗原(A-F)而言,相较于佐剂对照组观察到疫苗的有利效果。对于AB030观察到了统计学显著效果,而其它抗原差一点就达到统计学显著性的5%阈值。可能有两个原因造成该效果。第一,动物数量少,第二,相较于先前实验而言对照组(G)的死亡率较低。所示死亡率较低最可能归因于主动免疫实验中的动物比被动免疫中所用的那些年长很多。这是因为主动免疫的方案需要历时数周。
图13显示被动免疫实验。小鼠通过在鲍式不动杆菌接种前第4天和第3天腹膜内注射环磷酰胺来呈现暂时性的中性白细胞减少症。在第0天,对鲍式不动杆菌接种之前3小时的小鼠腹膜内被动疫苗接种0.15mL兔抗血清、未处理兔血清或PBS。与主动免疫方案类似地诱导肺炎。监测存活率、临床评分和体重。
发明详述
根据本发明,提供一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包含由核酸分子编码的至少一种多肽,所述核酸分子包含选自下组的多核苷酸:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)与(a)~(d)中任一种全长多核苷酸互补的多核苷酸。
本文提及的本发明多肽归纳于下表1:
表1
多肽 | 氨基酸序列 | 核酸序列 |
AB023 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:1 |
AB024 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:3 |
AB025 | SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:5 |
AB030 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:7 |
AB031 | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:9 |
FimA | SEQ ID NO:12 | SEQ ID NO:11 |
CsuAB | SEQ ID NO:14 | SEQ ID NO:13 |
OmpA | SEQ ID NO:16 | SEQ ID NO:15 |
本文中所用的术语“片段”指本文定义的多肽的具有免疫刺激活性的任何片段。所述片段的最小长度是至少4、8、15、20、30、50、100个氨基酸。优选所述片段包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16中任一所示蛋白质的总长的长度为6~8个氨基酸,最短4~5个氨基酸且最长15个氨基酸的表位。“多肽类似物”意在指功能与完整分子或其片段基本相似的分子。
术语多肽的“功能衍生物”指具有相似结构和相同生物学功能的多肽。
本文所用的术语“免疫刺激活性”指诱导针对抗原的初始免疫应答。优选地,如本文定义的具有免疫刺激活性的多肽能够诱导针对不动杆菌属感染的免疫应答,最优选本发明多肽能够诱导针对鲍式不动杆菌感染的免疫应答。本文所用的术语“免疫应答”指任何体液中抗体(易与所述多肽发生反应)成分的变化,以及对所述多肽的细胞应答(例如T细胞和先天免疫系统的细胞)的变化,以及炎性标志物(例如细胞因子和趋化因子)和指示正常免疫功能调节的其它免疫学标志物的变化。针对这些病原性生物体的免疫应答通过ELISA、免疫印迹等方法监测。
本文所述的有关多肽和多核苷酸的“序列相同性”可通过已知方法测定。设想有关多肽与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16中任一所示的抗原性多肽具有至少75%,更优选地80%或85%,且最优选地90%或95%的序列相同性。通常采用带有计入特殊要求的算法的计算机程序。出于本发明目的,用于测定两条序列之间的相同性的计算机程序是BLASTP(用于比较氨基酸序列)和BLASTN(用于比较核苷酸序列),例如如下文献所述:Altschul S等,Nucl AcidRes 25:3389-3402(1997)。该BLAST程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(例如,BLAST Handbook(《BLAST手册》),Altschul S等,NCB NLMNIH Bethesda D 20894;Altschul S等,J.Mol.215:403-410(1990))获得。出于本发明目的,采用如下默认设置的BLASTN和BLASTP算法:
BLASTN:评分参数:匹配/错配打分1、-3;缺口消耗:存在:5,延伸:2;筛选与掩盖:选择低复杂性区域;选择仅掩盖检索表;不选择掩盖小写字母
BLASTP:评分参数:矩阵:BLOSUM62;缺口消耗:存在:11,延伸:1;组成调节:基于组成的统计2;筛选与掩盖:不选择;程序高级选项;对于开口-G消耗[整数];默认值=5核苷酸11蛋白质;对于延伸开口-E消耗[整数];默认值=2核苷酸1蛋白质;对于核苷酸错配的-q罚分[整数];默认值=-3;对于核苷酸匹配的-r奖励[整数];默认值=1;-e期望值[实数];默认值=10;-W字长[整数];默认值=11核苷酸3蛋白质;对于以比特计的BLAST延伸的-y降低(X)(若为零则用默认值);默认值=20,对于其它程序的BLASTN 7,对于空位联配的-X X降低值(以比特计);默认值=15对于所有程序,除了对BLASTN不应用以外;-Z最终X降低值,对于空位联配(以比特计);对于BALSTN是50对于其它程序是25。
就序列比较而言,采用完全多肽序列(分别是SEQ ID NO:2或4、6、8、10、12、14和16)作为与有关序列比较的序列。具体而言,为测定与例如含本发明SEQID NO:2的多肽具有未知同源性的多肽的特性,可将所述第一多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO:2全长范围内作比较。类似地,为测定与例如含本发明SEQ ID NO:1的多核苷酸具有未知同源性的多核苷酸的特性,可将所述第一多核苷酸的核酸序列与SEQ ID NO:1所示的核酸序列在SEQ ID NO:1全长范围内作比较。
杂交的标准“严谨条件”在如下文献中公开:Ausubel等(编),CurrentProtocols in Molecular Biology(《新编分子生物学方案》),约翰威力父子出版社(John Wiley&Sons)(2000)。示例性的严谨杂交条件包括用0.1x SSC/0,1%SDS在68℃洗涤15分钟。
本发明提供上述疫苗组合物,其中编码多肽的核酸分子是基因组DNA。
编码本发明多肽的核酸序列可采用包含适于克隆的限制性位点的引物通过PCR从鲍式不动杆菌菌株的基因组DNA扩增。
根据本发明,所述疫苗组合物包含至少一种多肽,其中所述多肽源自不动杆菌属。
更优选地,所述疫苗组合物包含至少一种多肽,其中所述多肽源自鲍式不动杆菌种。
本文所用的术语“鲍式不动杆菌”指鲍式不动杆菌种,其按照如下文献分类:Acinetobacter Molecular Biology(《不动杆菌分子生物学》),2008,编:UlrikeGerischer,凯斯特学术出版社(Caister Academic Press)。示例有:鲍式不动杆菌菌株SDF、AYE、ATCC 19606、ACICU Ruh134、Ruh875、AB-M、AB-NM和SAN,其参考文献和来源示于表6。关于分类学和菌株的参考文献和信息可参见Pubmed主页
(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Taxonomv/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=470&lyl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)。
鲍式不动杆菌引起不同类型的感染,包括,例如肺炎、菌血症和皮肤及软组织感染。在过去数十年中,鲍式不动杆菌显现为临床重要性越来越大的一种病原体,这归因于全球范围内由该生物体所致的感染发生率的增加。由该病原体所致的感染在接受机械换气的患者和灼伤患者中产生的问题尤为严重。鲍式不动杆菌可导致特护病房和创伤/灼伤病房中的感染发作,推测这由来自感染个体或移生个体以及受污染的医院器械的生物体传代至未感染患者所致。
下表2中所示的结果证明,由本发明鉴定的靶标在迄今未知测试的所有鲍式不动杆菌临床分离株中是具有代表性的。菌株SDF代表唯一不是临床分离株而是分离自体虱的鲍式不动杆菌菌株。该菌株缺乏FimA和CsuAB的基因。
下表2显示由不同鲍式不动杆菌菌株编码的蛋白质的氨基酸鉴定百分数。将对应本发明鉴定多肽(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16)的由鲍式不动杆菌基因组AB307编码的氨基酸序列与13种其它经测序的基因组作比较。在抗原AB031的情况中,仅采用胞外环L1来用于比较。
表2
不同鲍式不动杆菌菌株的氨基酸特性的保守性
*仅比较环。
-未检测同源性
不同鲍式不动杆菌菌株中蛋白质的高度氨基酸相同性显示所述抗原性蛋白质的广谱特异性,并且证实其具有高治疗价值。所述基因的高度普遍性指示该蛋白质具有重要性,可能是此类细菌生命周期过程中的基础。因此,该蛋白质可能在感染过程中表达。该高度保守点增加了诱导免疫应答或鉴定能够与大多数或可能全部临床相关鲍式不动杆菌菌株结合的多克隆或单克隆抗体的几率。并且,该高度氨基酸保守性指示这些基因罕有突变,因此减少了在治疗性处理过程中援救突变体的几率。
本发明提供本文所述的疫苗组合物,其中所述疫苗组合物还包含药学上可接受的运载体和/或佐剂。
本文所用的术语“佐剂”指与靶标抗原不同的能够增加抗原性应答的物质。所述佐剂可选字弗氏佐剂(完全和不完全)、Gerbu佐剂(德国的GERBU生物技术股份有限公司)、分枝杆菌如BCG、母牛分枝杆菌(M.vaccae)或短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、霍乱毒素或破伤风类毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、quil-皂苷混合物如QS-21(史可必成公司(SmithKline Beecham))、MF59(西龙公司(Chiron)),以及各种油/水乳剂(例如,IDEC-AF)、MALP-2、ISCOM。其它可用佐剂包括但不限于:矿物盐或矿物凝胶如氢氧化铝、磷酸铝和磷酸钙;表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、钥孔虫戚血兰素和二硝基苯酚,免疫刺激分子如皂苷、胞壁酰二肽和三肽衍生物,短核酸延伸物如CpG二核苷酸、CpG寡核苷酸、单磷酰脂质A和聚磷腈,粒状和微粒状佐剂如乳剂、脂质体、病毒颗粒、病毒样颗粒、螺旋状物或免疫刺激复合佐剂。细胞因子因其淋巴细胞刺激性质也是可用的。用于该目的的多种细胞因子是本领域普通技术人员已知的,包括白介素-2(IL-2)、IL-12、GM-CSF等。来自趋化因子家族的其它配体,例如RANTES、脂蛋白、脂肽、酵母细胞壁成分、双链RNA、细菌细胞表面脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、富U单链病毒RNA、细胞因子信号转导小干扰RNA的抑制剂(SOCS siRNA)、Pan DR表位(PADRE)及其混合物也是合适的。“药学上可接受的运载体”的定义意在涵盖任何运载体,其不干扰活性成分的生物学活性的有效性并且对给予的宿主无毒。
因此,本发明的一种或多种多肽或其片段、类似物和功能衍生物可用于制备用于给予有需要的个体的预防性或治疗性疫苗。包含一种或多种本发明多肽作为主要或组成性活性成分的所述疫苗可以很多种治疗/预防剂型在用于局部、粘膜(鼻部、口部)、全身、局部和肠胃外给予的常规载剂中给予。因此,本发明提供用于肠胃外给予的组合物,其包含本发明多肽的溶液,任选联合溶解或悬浮于可接受运载体(优选水性运载体)中的合适佐剂和/或等价递送载剂。可采用多种水性运载体,例如,水、有缓冲的水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可通过常规、熟知的灭菌技术或通过无菌过滤来灭菌。可将所得的水溶液原样包装以供使用,或者将其冻干,在临给药前将冻干制剂与无菌溶液混合。所述组合物可含有模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质,如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等,例如,乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂酸酯和三乙醇胺油酸酯等。用于制备可肠胃外给予的化合物的实际方法将会是本领域技术人员已知或显而易见的,并且在例如如下文献中有更详细描述:Remington:The Science and Practiceof Pharmacy(《雷明顿:药物科学与实践》)("Remington's PharmaceuticalSciences"(《雷明顿药物科学》))Gennaro AR编.第20版,2000:美国宾夕法尼亚州的Williams&Wilkins公司。
给予的途径和方案将视待治疗病症的阶段或严重性而不同,并且待由技术从业者确定。例如,本发明的一种或多种多肽和包含有该多肽的组合物可用于制备能够以皮下、皮内或局部或粘膜或肌肉内形式给予的药物组合物。所有这些形式是药学领域普通技术人员熟知的。
有利地,本发明的合适制剂可以例如以单剂量形式给予,其可每天、每周或每月重复。
初始剂量后可遵循本领域的免疫方案标准给予加强剂量。本发明组合物与方法的免疫刺激效果可通过结合任何上述多肽,包括其与递送载剂和/或免疫应答增效化合物的组合来进一步提高。免疫应答增效化合物可被分为佐剂或细胞因子。佐剂可通过提供抗原库(胞外或巨噬细胞内),激活巨噬细胞并刺激特定淋巴细胞组来增强免疫应答。
可将各本发明多肽联接至蛋白质或非蛋白质递送载剂。此类联接形式的示例描述于如下文献:Szaoo R.等,(Biochim Biophys Acta.2010 Dec;1798(12):2209-16.电子公开时间2010年7月24日)和"Conjugation of haptens(《半抗原的联接》)"(Lemus和Karol,Methods Mol Med.138:167-82,2008)。优选递送载剂本身具有免疫效应,这指所述递送载剂本身是免疫原性的。
所述递送载剂选自下组:免疫原性肽、免疫刺激核酸序列如GPC岛、钥孔虫戚血兰素(KLH)、破伤风类毒素(TT)、霍乱毒素亚基B(CTB)、细菌或菌影(bacterial ghost)、脂质体、壳糖体、病毒颗粒、微球、树突细胞、病毒样颗粒等。
在其它实施方式中,本发明提供还包含如上所述递送载剂的疫苗组合物。优选地,所述递送载剂是病毒颗粒。
本发明的抗原性多肽、组合物或其制剂可通过上文所述的递送载剂(优选通过病毒颗粒)递送。
本发明的预防性或治疗性组合物用于在药学上可接受的制剂中给予。此类制剂可常规地包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容运载体、补充性的免疫增效剂例如佐剂和细胞因子,以及任选的其它治疗剂。本发明的制剂以有效量给予。有效量是刺激所需应答的单独的或联合其它剂量的药物制剂的量。一般认为0.01μg/kg~500μg/kg体重(视给予模式而定)的免疫原剂量是有效的。据信优选的范围是0.1μg/kg~10μg/kg体重。绝对量将视多种因素而定,所述因素包括所选用于给予的组合物,所述给予是以单剂量还是多剂量给予,以及个体患者参数,包括年龄、生理状况、体型、体重和疾病阶段。这些因素是本领域普通技术人员所熟知的,并可以用不超出常规的实验来落实。
采用本发明组合物的给药方案根据多种因素来选择,所述因素包括例如物种、年龄、体重和患者的医疗条件、待治疗病症的阶段和严重性,以及采用的特定化合物。普通技术医师能容易地确定并指定所需以预防、逆转或阻止感染性疾病进展的疫苗有效量。在获得产生无毒或有可接受毒性的功效的药物浓度范围中的最理想精确度需要基于靶位点药物可用度动力学的方案。该过程涉及对药物分布、平衡和消除的考虑,而这在本领域技术从业者的能力范围内。
在本发明的应用中,本文详述的化合物可形成活性成分,并且通常以与合适药学稀释剂或赋形剂的掺混物形式给予,根据所需给予形式(即,口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆等)并且遵循常规制药实践来合适地选择所述药物稀释剂或赋形剂。例如,就以片剂或胶囊形式给予而言,可使所述活性疫苗成分与无毒的药学上可接受的惰性运载体(例如乙醇、甘油、水等)结合。此外,需要或必需时,也可将合适的粘合剂、润滑剂、分散剂和着色剂掺入所述混合物。合适的粘合剂包括但不限于:淀粉、明胶、天然的糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄芪胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡等。这些剂型中使用的润滑剂包括但不限于:油酸钠,硬脂酸钠,硬脂酸镁,苯甲酸钠,乙酸钠和氯化钠等。崩解剂包括但不限于:淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土和黄原胶等。
就肠胃外给予而言,希望是无菌悬浮液和溶液。当需要静脉内给予时,采用一般含有合适防腐剂的等张制剂。可使包含所述活性药物成分的食道内制剂与本领域熟知的各种运载体物质掺混,例如,醇类、芦荟胶、尿囊素、甘油、维生素A或E油、矿物油、PPG2肉豆蔻酸异丙酯等,以形成,例如含醇溶液、局部清洁剂、清洁膏、凝胶、泡沫,以及洗液,以膏状或凝胶制剂形式(尤其适合于粘膜施用)。
本发明的抗原性多肽、组合物或其制剂可以偶联于一类用于实现药物控释的生物可降解性聚合物,例如,聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
在本发明的多肽用于制备治疗感染性疾病(例如鲍式不动杆菌引起的感染)的药物组合物的情况中,所需反应是控制所述感染和/或从系统清除抗原性多肽。在预防情况中,所需反应是保护对于此类多肽的免疫性,该免疫性由暴露至所述抗原性多肽后的免疫应答来度量。这些所需反应可通过诊断方法(例如ELISA、免疫印迹等)来监测[Raem AM.Immunoassay(《免疫测定》).2007.P.Rauch[编]Spektrum Akademischer Vlg出版社,爱思唯尔股份有限公司(ElsevierGmbh)]。
本发明提供一种抗原性多肽,所述抗原性多肽由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中所示任一种氨基酸序列组成;或其片段、类似物或功能衍生物,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性。所述抗原性多肽、其片段、类似物和功能衍生物在上文中有更详细的定义。
由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示的氨基酸序列组成的抗原性多肽可包含多至50、45、40、35、30、25、20、15、10个,优选多至5个,更优选多至3个额外氨基酸;或上述抗原性多肽的片段、类似物或功能衍生物,其中所述抗原性多肽,其片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性。本文所述的氨基酸和氨基酸残基可根据公认的单字母或三字母代码来指代,所述代码参见本领域技术人员熟知的教科书,例如Stryer,Biochemistry(《生物化学》),第4版,纽约的富瑞曼公司(Freeman and Co.),1995,和Creighton,Proteins(《蛋白质》),第二版,纽约的富瑞曼公司,1993。
本文中所用的术语“肽”和“多肽”可以其最宽泛的含义同义使用,其指具有两个或更多个氨基酸残基的分子或氨基酸类似物。所述氨基酸残基可通过肽键连接,或通过其它键(如酯键、醚键等)连接。本文中所用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”指天然和/或非天然或合成的氨基酸,包括D或L对映体形式,以及氨基酸类似物。
细菌表面蛋白在所述细菌细胞与其环境的相互作用中起基础作用。它们涉及粘附至宿主细胞并侵入宿主细胞,感受外部环境的化学和物理条件并传送合适的信号至细胞质区室,提高对宿主应答的防御并产生毒性。因此,表面蛋白是以预防细菌感染和疾病为目的的药物的潜在靶标。此外,因为表面蛋白可能与宿主免疫系统相互作用,其可成为有效疫苗的组成成分。针对多种感染疾病的基于表面暴露蛋白质和分泌蛋白质的疫苗已市售可得;但是因缺乏有效可行的靶标,还未开发出针对不动杆菌感染的疫苗。
除了与细菌表面蛋白的生物学相关性以外,其特征仍不完善。这主要归因于难以确定所述细菌表面上该蛋白质的组成和拓扑结构。
为鉴定新疫苗候选物和抗体靶标,采用三种方法。选择各方法供于疫苗和抗体靶标候选物的特定需求。
第一种方法-“脱落组分析(Shedome analysis)”采用蛋白水解酶来使细菌表面“脱落”。自完整细胞产生并分离的肽通过质谱鉴定并后续采用公用数据库将其指定为蛋白质(Rodriguez-Ortega MJ等,Nature Biotechnology,24,191-197,2006)。
为区分污染物(例如高丰度胞内蛋白质如核糖体蛋白)和假定的膜靶标,采用公用在线工具来分析所述鉴定的蛋白质在细菌内的位置。(http://bp.nuap.nagova-u.ac.ip/sosui/sosuigramn/sosuigramn submit.html,如K.Imai等,Bioinformation 2(9),417-421(2008)中公开)。选择被指定为胞外或外膜蛋白质的蛋白质用于进一步分析。此外,还选择由UniprotKB数据库注释为已知胞外或外膜蛋白质的同源物的蛋白质。
第二种方法-“比较蛋白质组学”-的概念着重于靶标,所述靶标在不同不动杆菌菌株中实验性确认其表达。蛋白质组学(对于蛋白质组的研究)已由通过二维凝胶电泳的蛋白质分离法而得到成熟实践。在第一维度中,蛋白质通过等电聚焦被分离,其以荷电性质为基础来分辨蛋白质。在第二维度中,蛋白质采用SDS-PAGE由分子量分离。凝胶用考马斯亮蓝或银染色以观察蛋白质。凝胶上的点是已迁移至特定位置的蛋白质。
质谱强化了蛋白质组学。肽质量指纹图谱通过将蛋白质切割成短肽来鉴定蛋白,然后通过针对序列数据库来匹配观察到的肽质量来演绎该蛋白质的特性。
根据本发明,通过五种不同鲍式不动杆菌菌株的质谱来确定对外膜蛋白质富集的蛋白质制剂的全蛋白质组。基于其不同分离来源选择五种鲍式不动杆菌菌株ATCC19606、BMBF65、SDF、ACICU、AYE。ATCC19606是从1948年分离的古老鲍式不动杆菌(Hugh R.,Reese R.,Int.J.Syst.Bacteriol.17:245-254,1967),其被许多研究实验室用作参比菌株。AYE是2001年间在法国流行的鲍式不动杆菌菌株(Vallenet等,PLoS One 3′E1805-Ε1805(2008))。ACICU是从2005年意大利罗马疾病爆发过程中分离的(lacono M.等,Antimicrob.Agents Chemother.52:2616-2625(2008))。
BMBF-65是2004年从新加坡一名患者分离的。SDF是鲍式不动杆菌的唯一非临床分离株,其分离自1997年于法国马赛收集的体虱(Vallenet等,PLoS One3′E1805-Ε1805(2008))。
为了富集胞外表面上存在的推测靶标,在MS分析之前根据外膜蛋白质的亲水和疏水性质来对其富集蛋白质制备物。采用公用数据库将通过质谱鉴定的肽指定为蛋白质,并根据IT-预测和文献检索来对其进行选择。
第三种方法指对于通过康复期鲍式不动杆菌患者血清中存在的抗体所识别的靶标的鉴定。因此,对外膜(OM)蛋白质富集的蛋白质制备物通过二维凝胶电泳(2DE)分离。所述2DE由等电聚焦(IEF)和之后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)步骤构成以分辨OM蛋白质。使由患者血清识别的蛋白质通过免疫印迹分析确定。为提高鉴定多种不同菌株表达的蛋白质的几率,将至少两种鲍式不动杆菌菌株的免疫印迹作比较,并选择全部分析菌株中存在的蛋白质供于通过MS分析的蛋白质鉴定。对所述蛋白质进行单独表征,并根据IT-预测和文献检索进行选择。选择被鉴定为鲍式不动杆菌蛋白并预测是或标记为外膜蛋白质的蛋白质作为推测的靶标。以防本领域预测此类靶标的同源物在抗生素耐受鲍式不动杆菌菌株中下调或不存在,将这些靶标排除不进行进一步分析。
根据本发明的一方面,提供通过本发明方法鉴定的至少一种多肽。
在本发明的一个优选实施方式中,根据本发明任何前述方面或实施方式,所述多肽与某一生物体(优选是鲍式不动杆菌)的感染病原性相关联。
更优选地,所述多肽是氨基酸序列SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16或其片段、类似物或功能衍生物中的至少一种。选择用于疫苗开发的靶标需满足以下三个要求中的至少两个:
1.该靶标能够接近大分子(方法1:由脱落组分析鉴定的表面蛋白)。
2.该靶标由多种鲍式不动杆菌菌株表达,优选由代表重要临床分离株的菌株表达(方法2:比较蛋白质组学)。
3.该靶标诱导免疫应答并且在感染过程中于患者内表达(方法3:特异性靶标鉴定)。
满足各选择步骤的需求的潜在靶标的数量示于表3。通过该方法选择的潜在靶标被指定在最后一排。
下表3显示通过不同方法的靶标鉴定选择法。各方法着眼于上述特定要求。粗体数字指示满足相应选择步骤的要求的蛋白质数量。实施例1.2中详细描述该选择方法。
表3
IT预测如下进行:通过HMM-HMM-比较进行的蛋白质同源性检测和结构预测采用在线软件工具HHpred(http://toolkit.tuebingen.mpq.de/hhpred),Soding J.,第951-960页,(2005)进行,利用HMM数据库pdb70_3Sep11、HHblits作为具有最大3个迭代和局部比对模式的MSA生成方法。
表4显示由数据银行(databank)分析确定的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16的结构同源物。表4
1:结构同源物的蛋白质ID(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Wang Y等,Nucleic Acids Res.2007年1月;35(数据库期):D298-300.)在最后一栏包括简短描述(名称、功能、物种)。
2:HMM:隐马尔可夫模型。在查询和模板间产生同源性的氨基酸序列。数字指示查询中的氨基酸序列(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16)或产生同源性的模板(蛋白质ID)序列的位置。3:可能性:“成为正确肯定模板的可能性”。
4:E值:“预计值。E值和P值的计算不考虑二级结构。E值给出假阳性(“错误击中”)的平均数量,在扫描数据库时,所述假阳性的得分高于模板得分。这是关于可靠性的度量:接近0的E值表示极可靠击中,E值为10表示在该数据库中预计发现得分至少有这么高的10次错误击中。”
5:P值:“P值是E值除以数据库中序列的数量。其为成对比较中错误击中将得到至少这么高的分数的可能性。”
具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16的任何多肽具有免疫刺激活性。表5关于本发明抗原性多肽在鲍式不动杆菌临床分离株中的表达。该研究包括分离自入院患者的血液、尿液、脑脊液、脓和气管吸出物的总计36株临床菌株。采用这些临床分离株(实施例1.1.4)来分离细菌裂解物或沉淀的培养物上清液,其在经凝胶电泳后通过免疫印迹分析测试。为了检测各抗原性多肽,采用对应的兔抗血清(实施例5)。
表5显示鲍式不动杆菌临床分离株的百分比和实际数量,其中通过对来自细菌细胞团块的制备物进行免疫印迹分析来显示鉴定的任何个体抗原性多肽(靶标)的存在或不存在。
表5
*不同菌株间的csuAB表达水平不同。19%显示无表达,24%峰值表达而62%中等至强表达。图2显示具有免疫刺激活性的本发明多肽。兔用所述多肽免疫接种。这些兔的血清被证明呈多肽特异性抗体阳性。
根据本发明的另一个方面,提供编码所述抗原性多肽的核酸分子。
在另一方面中,本发明涉及包含本发明核酸分子的载体。此外,本发明涉及包含该载体的宿主细胞。
关于表达载体构建和重组表达的多肽纯化有相当大量的已出版文献(Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆:实验室手册》),纽约冷泉港的冷泉港实验室公司(Cold Spring Harbour Laboratory),及其中参考文献;DNA Cloning(DNA克隆):F M Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology(《新编分子生物学方案》),约翰威力父子公司(John Wiley&Sons,Inc.)(1994)。
此外,本发明提供包含所述载体和/或适于表达所述载体的核酸的宿主细胞。本领域中已知多种原核与真核表达系统,其中优选真核宿主细胞例如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞,例如HEK293-细胞、PerC6-细胞、CHO-细胞、COS-细胞或HELA-细胞及其衍生物。特别优选人产生的细胞系。优选该转染的宿主细胞分泌产生的抗体进入培养基。若获得胞内表达,那么按照例如Benetti P.H.等所述的标准方法进行复性Benetti P.H.等,Protein Expr.Purif.13(3):283-290(1998)。
根据本发明任何前述方面或实施方式进行的多肽生成包括:(i)提供用本发明载体转化/转染的细胞;(ii)使所述细胞在有益于所述多肽生成的条件下生长;和(iii)从所述细胞或其生长环境纯化所述多肽。
在本发明的一个优选实施方式中,所述细胞是原核细胞。
或者,所述细胞是选自如下生物的真核细胞:真菌、酵母、昆虫、藻类、哺乳动物、植物。
本发明提供与上述多肽特异性结合的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段能够中和鲍式不动杆菌。
术语“抗原结合片段”指能够结合至权利要求中所限定的任何多肽的抗体的任何片段。所述片段的长度是至少10个,优选20个,更优选50个氨基酸。优选所述片段包含所述抗体的结合区域。优选所述片段是Fab或F(ab')2片段或其混合物。
抗体介导的“效应子功能”可以是对靶抗原特定功能的抑制,例如对分泌的细菌毒素影响的中和,由此防止该毒素对蛋白质相互作用、酶促功能、细胞功能、细胞完整性、组织结构和其它生物过程的有害影响。其它抗体介导的效应子功能可以是使特定细菌蛋白质(例如,孔蛋白(porin)和细胞表面上的其它蛋白质或结构)的功能失活,由此影响正常细菌生命周期。其它抗体介导的效应子功能可由令免疫过程激活组成,所述免疫过程激活例如激活补体级联,诱导细胞因子和趋化因子生成,激活免疫系统的细胞组成成分,和导致细菌细胞破坏和移除的其它免疫反应。
在本发明的一个优选实施方式中,所述抗体是多克隆或单克隆抗体,其中所述抗体对所述多肽具有特异性。
为了在宿主(例如小鼠或兔)中产生多克隆抗体,用所述抗原性多肽或其片段或类似物或功能衍生物(优选联合佐剂)免疫所述宿主。随后从所述宿主的血清收集针对所述抗原性多肽的抗体。所述多克隆抗体可针对显示对其有特异性的抗原进行亲和纯化。此类多克隆抗体制剂也可源自人供者(经疫苗接种的、康复期的或正常健康供者),通过对血浆分级分离来产生多克隆免疫球蛋白分级分离部分,并进一步针对对其有特异性的抗原进行富集。
此类多克隆抗体通过用所述抗原性多肽AB023、AB024、AB025、AB030、AB031 L、ABFimA、ABCsuAB和ABOmpA免疫兔产生。在免疫后4~8周收集血液样品,并测试血清中多肽特异性抗体的存在;参见图3和4。
多克隆抗体识别许多不同表位。相反,单克隆抗体对单一表位有特异性。关于抗体结构及其不同功能的更详细描述可参见"Using Antibodies:Alaboratory manual(《抗体应用:实验室手册》),冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbour Laboratory Press),1999。
在另一个优选实施方式中,本发明抗体是单克隆抗体或其抗原结合部分,其能够诱导针对鲍式不动杆菌的效应子功能。最优选地,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:36中所示的表位共有基序PVDFTVAI。
术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白的任何决定簇,优选多肽决定簇。在某些实施方式中,表位决定簇包括有化学活性的成组表面分子(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团),而在某些实施方式中,表位决定簇可具有特定的三维结构特点和/或特定的荷电特点。表位是抗原被抗体结合的区域。单克隆抗体通常结合至这些共有基序,其大部分长5个氨基酸,或长6、7或8个氨基酸。在一个优选实施方式中,本发明提供的抗体是单克隆抗体并且特异性结合至长为8个氨基酸的表位共有基序。在某些实施方式中,当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时,称该抗体特异性结合抗原,。在优选实施方式中,当解离常数小于或等于约10 nM,更优选地当解离常数小于或等于约100 pM,或当解离常数小于或等于约10 pM时,称抗体特异性结合抗原。
在另一个实施方式中,本发明的抗体是人抗体。本文所用的术语“人”涵盖独立于抗体获得来源的任何部分或完全的人抗体。优选通过杂交瘤产生人单克隆抗体。例如,由人氨基酸序列组成的人单克隆抗体可获自杂交瘤,其中的B细胞是人B细胞。所述单克隆抗体还可通过遗传工程改造来获得。
也设想“人源化的”抗体,其为来自小鼠、大鼠或其它物种的携带人恒定区结构域和/或可变区结构域的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程改造的抗体及其片段。“人源化”技术通常涉及采用重组DNA技术来处理编码所述抗体分子的多肽链的DNA序列。用于人源化单克隆抗体(MAB)的早期方法涉及:产生嵌合抗体,其中使包含一种抗体的完全可变结构域的抗原结合位点连接至源自另一种抗体的恒定结构域。用于进行所述嵌合法的方法在如下文献中有描述:EP0120694(细胞技术有限公司(Celltech Limited))、EP0125023(基因泰克公司(Genentech Inc.)和希望之城公司(City of Hope))、EP-A-0171496(日本的Rev.Dev.Corp.公司)、EP-A-0173494(斯坦福大学)和WO 86/01 533(细胞技术有限公司)。这些申请文件一般公开了用于制备具有小鼠MAb可变结构域和人免疫球蛋白恒定结构域的抗体分子的方法。替代性的方法在EP-A 0239400(Winter)中有描述,其中通过采用长寡核苷酸的定点突变将小鼠MAb的互补决定区(CDR)移植至人免疫球蛋白的可变结构域的构架区上。此类方法的示例参见美国专利号7,262,050。
人源化的抗体还可获自转基因动物。例如,响应免疫能够产生人抗体的完全组成部分的转基因突变小鼠,其已经文献描述(参见,例如,Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.,7:33(1993))。具体而言,这些嵌合与胚系突变小鼠中的抗体重链接合区(J(H))基因的纯合缺失导致对内源性抗体生成的完全抑制,而将所述人胚系抗体基因阵列成功转移进入此类胚系突变小鼠导致在抗原刺激后产生人抗体。
人单克隆抗体的人氨基酸序列阻止产生不希望的负面作用,例如排斥反应或过敏性休克。
根据另一个优选实施方式,本发明抗体是N末端、内部和/或C末端修饰的抗体。所述修饰选自如下至少一种:例如通过采用二环己基碳二亚胺的交联进行的单体形式的二聚化、寡聚化或多聚化。由此产生的二聚物、寡聚物或聚合物可通过凝胶过滤彼此分离。其它修饰包括侧链修饰,例如对ε-氨基-赖氨酸残基的修饰,或分别对氨基和羧基末端的修饰。其它修饰包括翻译后修饰,例如对蛋白质进行糖基化和/或部分或完全去糖基化修饰,以及二硫键形成。还可使所述抗体连接标记物,例如酶促标记物、荧光标记物或放射性标记物。
发明的抗体通过人B细胞或由所述人B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤产生。
本发明还提供能够产生单克隆抗体的杂交瘤。采用杂交瘤细胞产生单克隆抗体是本领域熟知的。所述用于产生单克隆抗体的方法在如下文献中公开:Kohler和Milstein,Nature 256,495-497(1975),以及Donillard和Hoffman,"BasicFacts about Hybridomas(杂交瘤基础知识)"收录于Compendium ofImmunology(免疫学概论)V.II Schwartz编,1981。
作为杂交瘤技术的替代,所述人单克隆抗体还可通过重组表达编码所述抗体轻链和重链的核酸获得。
因此,本发明提供编码所述抗体轻链和重链的核酸,包含所述抗体的载体,以及包含所述载体和/或所述核酸的宿主细胞。
优选地,本发明的载体选自腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、SV 40病毒、逆转录病毒、植物病毒或噬菌体,例如λ衍生物或M13,其包含编码所述轻链的至少一种核酸和编码所述重链的至少一种核酸。用所述载体转化并在适于重组表达经编码抗体链的条件下培养的宿主细胞能够组装人单克隆抗体,从而其产生的三维结构等同于由人B细胞产生的单克隆抗体的三维结构。若所述轻链与所述重链分开产生,则可将这两种链纯化并后续组装产生基本具有人B细胞产生的人单克隆抗体三维结构的人单克隆抗体。
此外,提供用于产生上述抗体的方法,所述方法包括:在允许分泌抗体的条件下培养杂交瘤,和任选地从培养物上清液纯化所述抗体。
此外,提供包含上述抗原性多肽或上述抗体的药物组合物。
所述药物组合物还可包含本领域已知的药学上可接受的成分。
优选地,应用所述药物组合物来治疗由鲍式不动杆菌感染所引起的疾病,例如主要发生在免疫力低下患者和/或呼吸功能受损患者中的血流感染、肺炎、慢性支气管炎、局部感染(包括创伤感染和侵入性关节感染)。所述药物组合物还意在用于但不限于预防和/或治疗医院获得性(医院内)感染。由于鲍式不动杆菌感染的主要受害者是插管患者、灼伤受害者、手术和/或医院重症监护病房中的患者、癌症和艾滋病患者、免疫力低下患者、免疫抑制患者、糖尿病患者、军队人士、作战人士和相关的支持人士,以及静脉内药物滥用者,所述药物组合物尤其意在用于预防和/或治疗由鲍式不动杆菌所引起的所述患者组的疾病。
所述药物组合物还可包含抗生素药物。
所述药物组合物所含抗原性多肽或抗体的浓度范围是0.1-30 mg/kg体重。
所述药物组合物可以任何已知方式给予,例如静脉内、肌内、皮内、皮下、腹膜内、局部、鼻内给予,或吸入式喷雾。
本发明的另一个方面涉及包含上述抗原性多肽或抗体的用于检测患者内细菌感染的诊断组合物。对于细菌感染,尤其是由本发明所述鲍式不动杆菌所引起的细菌感染的检测,可基于分离的细菌DNA或直接来自临床样品,例如痰、支气管肺泡灌洗物或气管抽吸物,通常经超纯H2O稀释。优选直接获自人(例如患有肺部疾病的人患者)的肺灌洗物的样品。临床样品还可包含身体物质,例如血液、血清、尿液、组织等。通常所述样品可取自人或动物的创伤、灼伤、肺和尿道感染物。本发明的抗原性多肽可用于检查血清中的抗体。抗体适合用于检测例如临床样品中的抗原性多肽(靶标)。作为所述抗原性多肽或对其有特异性的抗体的诊断工具的高值示于表1和图3。
本发明提供用于治疗和/或预防哺乳动物中细菌感染的多克隆或单克隆抗体。
优选的哺乳动物是人。所述抗体优选用于治疗和/或预防由鲍式不动杆菌所引起的细菌感染,最优选该感染是医院获得性的。
目前特别可供于基于抗体的治疗的疾病范围包括癌症、免疫调节异常和感染。基于疾病和靶标生物学,用于治疗的抗体(治疗性抗体)可具有不同的作用机制。治疗性单克隆抗体可结合靶标并中和靶标的正常功能。例如,阻断癌细胞存活所需蛋白质活性的单克隆抗体导致所述细胞死亡。另一种治疗性单克隆抗体可结合靶标并激活靶标靶标的正常功能。例如,单克隆坑体可结合至细胞上的蛋白质并触发凋亡信号。最终,若单克隆抗体结合至仅在疾病组织上表达的靶标,则使所述单克隆抗体连接毒性载荷(有效剂),例如化疗或放射性试剂,能够产生用于特异性递送所述毒性载荷至疾病组织的导向武器,以减少对健康组织的损害。
预防性抗体阻止或保障免于疾病或感染的传播或发生。
由其结构/序列确定的抗体的潜在预防和治疗功能取决于给予时间。
此外,本发明提供用于治疗和/或预防哺乳动物中的细菌感染的多肽,所述多肽由包含选自下组的多核苷酸的核酸分子编码:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)是(a)~(d)中任一种全长多核苷酸的互补体的多核苷酸。
优选所述多肽用于哺乳动物。更优选所述多肽用于治疗和/或预防细菌感染,其中所述感染由鲍式不动杆菌所引起;最优选本发明的抗原性多肽用于治疗和/或预防细菌感染,其中所述感染是医院获得性的。
本发明通过纳入以下实施例和附图中所述的特定实施方式来作进一步说明。
实施例
实施例1:靶标(抗原性多肽)鉴定
1.1 材料
除非另有说明,化学范围试剂是分析级的并且源自合格供应商,主要来自西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(瑞士Buchs)。
1.1.1 细菌培养基
由1%(w/v)胰蛋白胨(瑞士的伏路卡(Fluka)/西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司)、0.5%(w/v)酵母提取物(伏路卡)、1%(w/v)NaCI组成的LB培养基。LB在制备后立即高压灭菌(121℃,20分钟)并在室温下无菌保持多至3个月。对于LB-琼脂(LBA)板而言,在该培养基高压灭菌之前向LB添加0.75%(w/v)琼脂(伏路卡)。之后,将热LBA铺在塑料皮氏培养皿(Sterilin,英国剑桥)中,然后使该培养基冷却至50℃以下。一旦该皮氏培养皿中的LBA凝固,即将该LBA板在4℃保持多至3个月。BHI-琼脂板订自BD公司(德国海德堡)。
1.1.2 细菌菌株
采用若干细菌菌株。用于产生数据的最相关细菌菌株和实验方法列于表5。此外,鲍式不动杆菌的若干临床分离株获自Seifert教授(德国克隆大学,医学微生物与卫生学院)、Dijkshoorn教授(荷兰莱顿的莱顿大学医学中心)、Nordmann教授(法国德比塞特大学医疗中心,细菌学-病毒学部门,克里姆林宫-比塞特委员会(Le Kremlin-Bicetre cedex))。
表6
NCBI:国家生物技术信息中心;ATCC:美国典型培养物保藏中心,(美国弗吉尼亚州)
1.1.3 鲍式不动杆菌参比基因组
若干已公开的基因组用于对表7中归纳的已鉴定靶标进行鉴定和表征。
表7:基因组序列
1.1.3 患者血清
在不同的医院中收集患者血清。来自20位患者的血清在先前的研究中有描述(Pantophlet,R.等.Clin.Diagn.Lab.Immunol.7(2),293-295,(2000))并获自Seifert教授(德国克隆大学,医学微生物与卫生学院)。
另外57位患者的血清收集自雅典(希腊)、塞维利亚(西班牙)、匹兹堡(美国宾夕法尼亚州)和耶路撒冷(以色列)的医院。应用如下入选标准:
1.患者具有经确认的鲍式不动杆菌血流感染、肺炎或严重创伤感染,
2.患者的健康状况允许血液收集,和
3.患者是85岁以下的成人。排除经确认具有病毒感染(例如,甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎,HIV)、贫血或免疫系统抑制的患者。全部患者签有知情同意书。来自健康供者的血清收集自瑞士伯尔尼的瑞士红十字血液捐赠中心。
1.2 鉴定合适靶标的方法
1.2.1 "脱落组"分析
本方法的设想是鉴定鲍式不动杆菌膜上的多肽对大分子(例如抗体)的可接纳性。因此,用胰蛋白酶(23 kDa蛋白酶)对鲍式不动杆菌细菌做脱落处理,然后通过质谱分析(MS)。利用公用数据库将鉴定的多肽分配至蛋白质。可预计除了高丰度蛋白质和裂解的细菌污染物意外,消化物包含源自该细菌细胞膜的胞外侧上存在的蛋白质的多肽。
1.2.1.1 细菌培养物的制备
将鲍式不动杆菌菌株ATCC19606划线至LBA板上,并在37℃孵育过夜(16h~24h)。使具有可见细菌集落的LBA板在4℃保持多至1个月。开始培养时,用来自LBA板的鲍式不动杆菌集落接种25ml LB,并在37℃以200转/分钟(rpm)振荡孵育过夜。在600nm测量过夜培养物的光密度(OD600)。LB(0.4I)用过夜培养物接种(初始OD600是0.05)并在37℃以200rpm振荡孵育3.5h直至OD600达到0.68。
1.2.1.2活细菌的胰蛋白酶消化
Rodriguez-Ortega等(Nature Biotechnology,24,191-197,2006)先前描述了用于胰蛋白酶消化革兰氏阳性细菌的方法,利用该方法建立了用于革兰氏阴性鲍式不动杆菌的如下方法。使该细菌以3500g在4℃离心10分钟。通过在4℃重悬并离心,在40ml PBS(8%(w/v)NaCI、2%(w/v)KCI、1.1%(w/v)Na2HP04、0.2%(w/v)KH2P04,pH=7.4)中洗涤沉淀。沉淀在2ml蔗糖缓冲液(包含40%(w/v)蔗糖、5mM DTT(二硫苏糖醇)的PBS)中洗涤一次,最后使该沉淀在2ml蔗糖缓冲液(包含20g测序级胰蛋白酶(普洛麦格(Promega),V5113))中重悬。使该悬浮液在37℃孵育30分钟,然后在4℃以3500rcf离心10分钟。移去上清液并在4℃以14000rcf再次离心5分钟。再次移出上清液,并过滤通过注射器型无菌滤器(0.2μm,纳尔金(Nalgene)#94-2520)。向0.75ml滤液添加0.75μl甲酸,混合并储存在-70℃直至通过MS分析。
1.2.1.3胰蛋白酶消化物的MS-分析
肽通过瑞士伯尔尼大学的临床研究学院的质谱由Manfred Heller博士的团队进行鉴定(采用数据依赖的碰撞诱导的分级分离的纳米LC-MS/MS)。采用UniprotKB数据库(The UniProt Consortium(UniProt协会),Nucleic Acids Res.39:D214-D219,2011),除去来自厚壁菌和大肠杆菌条目,将肽分配至蛋白质。简言之,将3μl或6μl的体积以约5μl/分钟的流速与溶剂A(0.1%甲酸在水/乙腈98:2中)加载至前置柱(Magic C18,5μm,300A,0.15mm i.d.x30mm长度)上。加载后,采用乙腈梯度为5%~40%的溶剂B(0.1%甲酸在水/乙腈4.9:95中)以约400nl/分钟的流速在60分钟内使肽以回冲模式洗脱至分析型纳米柱(Magic C18,5μm,100A,0.075mm i.d.x75mm长度)上。将柱流出物通过以1.700kV操作的纳米喷雾ESI源直接联接至LTQ-orbitrap XL质谱(美国马萨诸塞州的赛默飞科学公司(Thermo Fisher Scientific))。以数据依赖模式(带有在傅里叶变换检测器(FT)中以60'000分辨率(m/z=400)记录的母离子扫描,其平行于线性离子阱中最密集母离子的五种片段谱(CID))获取数据。CID模式设定为:宽谱带激活开启;母离子选择在m/z范围360-1400之间;强度阈值在500;母离子排除15秒。CID图谱解释采用本地PHENYX、在Linux系统下运行的双四核处理器服务器采用UniprotKB SwissProt和TrEMBL数据库进行。允许的可变的修改有:Met氧化(限制到2)、Asn/Gln脱酰胺(2)和N末端Glu上的吡咯烷酮羧酸(1)。将母质量公差和片段质量公差分别设置为20ppm和0.5Da。若鉴定出至少两个不同的肽,导致蛋白质得分≥10.0,则认为蛋白质鉴定为真阳性。
1.2.1.4.数据分析和靶标选择
若干经鉴定的蛋白质是高丰度胞内蛋白质(例如核糖体蛋白质)。为了分辨此类污染物和假定的膜靶标,采用线上公用工具来分析经鉴定蛋白质在细菌中的定位(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosuigramn/sosuigramn_submit.html,K.Imai等,Bioinformation 2(9),417-421,2008)。选择被指定为胞外或外膜蛋白质的蛋白质用于进一步分析。此外,还选择由UniprotKB数据库注释为已知胞外或外膜蛋白质的同源物的蛋白质。
1.2.2.对比蛋白质组学
该方法的设想是着眼于其表达已经在各种和不同不动杆菌菌株中得到实验性证实的多肽。因此,通过质谱测定五种鲍式不动杆菌菌株的全蛋白质组。基于其分离的不同来源来选择所述五种菌株。为了富集胞外表面上存在的推测靶标,在MS分析之前根据外膜蛋白质的亲水和疏水性质来对其富集蛋白质制备物。采用公用数据库将通过质谱鉴定的肽指定为蛋白质,并根据IT-预计和文献检索来对其进行选择。
1.2.2.1 细菌培养物的制备
将鲍式不动杆菌菌株ATCC19606、BMBF65、SDF、ACICU、AYE(参见上表6)划线至BHI-琼脂板上,并在37℃孵育过夜(16h~24h)。采用包含可见细菌集落的琼脂板来接种75ml LB并使培养物在37℃以200rpm振荡孵育25h。检测培养物的OD600,并用过夜培养物接种LB(0.5l)(起始OD600为0.02)。使0.5l培养物在37℃以200rpm振荡孵育过夜。检测OD600并采用900OD/ml各培养物进行蛋白质制备。
1.2.2.2 外膜(OM)蛋白质制备物
OM-蛋白质基本如Arnold和Linke先前所述那样加以稍许修改来制备(CurrProtoc Protein Sci.(《新编蛋白质科学技术》)第4章:第4.8.1~4.8.30.单元,2008),以制备OM-蛋白质供于进一步下游分析。900OD/ml在4℃4000g离心20分钟。所有如下步骤在冰上采用0℃~4℃预冷的溶液和设备进行。使细菌重悬于7ml重悬缓冲液(0.1M NaCl,10mM MgCl2,50mM Tris-HCl,pH=8.0,10mg/l DNA酶I(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)))中,并添加0.1ml蛋白酶抑制剂混合物(西格玛-奥德里奇)。采用Sonifier B-12(美国康涅狄格州的不让松声能公司(Branson Sonic Power Company)),以第5水平,以1分钟为间隔,在冰上对悬液进行5次10秒超声处理。使裂解物在冰上孵育30分钟,然后以2000g离心15分钟以去除完整细菌。将上清液移至可供超速离心的离心管,并添加重悬缓冲液至12ml终体积。使溶液在4℃以100'000g离心1小时。弃去上清液,并使沉淀重悬于包含0.1ml蛋白酶抑制剂混合物的12ml重悬缓冲液。重复超速离心,并使沉淀重悬于12ml CM缓冲液(0.1M NaCl,50mM Tris-HCl,pH=8.0,1%(w/v)月桂酰肌氨酸钠(伏路卡公司(Fluka)))。向该悬液添加0.1ml蛋白酶抑制剂混合物,并通过在设置成90°角和25次翻转/分钟的intelli-搅拌器(德国的LTF实验室仪器公司(LTF Labortechnik))上翻转该管使该混合物在室温孵育30分钟。溶液经超速离心,并使沉淀通过上述悬浮和超离心在12ml冰冷ddH20中洗涤三次。在该阶段,使沉淀在-20℃冷冻直至进一步使用。OM-蛋白质制备物通过氯仿/甲醇沉淀(Wessel D.和Fliigge U.,Anal.Biochem.138,141-143,1984),将该OM-蛋白质制备物分成包含45%的两等份和包含剩余10%的一份。沉淀贮存在-20℃。对于蛋白质定量,将氯仿/甲醇沉淀的10%份重悬在0.1ml水中,其中50μl用50μl1M的NaOH在室温下水解两分钟并用0.1ml0.5M的HCl中和。水解的样品用滴定法测量,并用Bradford蛋白试剂(美国加利福尼亚州的伯乐公司(Biorad))根据生产商说明对蛋白质定量。滴定测量的牛血清白蛋白以与样品相同的方式水解,用作定量标准。
1.2.2.3 OM-蛋白质组测定-LC-MS和数据分析
使蛋白质在8M尿素溶液中溶解,用1mM DTT在37℃还原30分钟,并用55mM碘乙酰胺在25℃避光烷基化30分钟。然后,样品用0.1M碳酸氢铵缓冲液稀释至终尿素浓度为1M。蛋白质通过在37℃与测序级修饰的胰蛋白酶(1/100;w/w,威斯康星州麦迪逊的普洛麦格(Promega))孵育过夜来消化。根据生产商说明(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus),Microspin)使肽在C18反向离心柱上脱盐,在真空下干燥并贮存在-80℃直至进一步使用。
肽混合物采用高分辨率纳米-LC-MS在由线性四极离子阱和轨道阱(Orbitrap)(LTQ-Orbitrap XL,赛默飞科学公司(Thermo Fisher Scientific))组成的组装质谱仪上进行分析。肽在Eksigent Nano LC系统(埃可西简特技术公司(Eksigent Technologies))上分析两次,该系统连接至由线性四极离子阱和轨道阱(Orbitrap)(LTQ-Orbitrap XL,赛默飞科学公司(Thermo Fisher Scientific))组成的组装质谱仪,其配置有纳米电喷雾离子源(赛默飞科学公司)。肽的分离在内部充满C18树脂(Magic C18 AQ 3 pm;迈克如沐生物资源公司(MichromBioresources))的RP-HPLC柱(内径75pm,长度10cm)上进行,采用如下线性梯度:在60分钟内以0.3μl/分钟的流速从95%溶剂A(水,0.1%甲酸和2%乙腈)和5%溶剂B(水,0.1%甲酸和98%乙腈)至72%溶剂A和28%溶剂B。该LTQ-Orbitrap采用Xcalibur软件以数据依赖获取模式操作。该Orbitrap中在350-2000m/z范围上需要分辨率设置为60,000值的全局扫描MS谱。每次全局扫描选择五个强度最高的离子供于碰撞诱导解离(CID)分级分离,并且在线性阱(LTQ)中分析所得片段。在30秒内采用动态排除,以防止对相同的肽的重复选择。将单一带电的离子和具有未定荷电状态的离子从触发MS/MS扫描中排除。
来自MS仪器的原始数据文件采用ReAdW转换成mzXML文件,并且用Sorcerer-SEQUEST(Eng等,J Am Soc Mass Spectrom.1994;5(11):976-989)针对mzXML文件在鲍式不动杆菌蛋白质数据库(ACIB3)中进行检索,该ACIB3数据库来自包含3453个蛋白质条目(292在UniProtKB/Swiss-Prot中+3161在UniProtKB/TrEMBL中)的UniProtKB/Swiss-Prot蛋白质知识库(56.9版)。各LC-MS分析的各检索结果的统计学分析采用反式蛋白质组学管道TPP进行(Keller等,Mol Syst Biol.2005;1:2005.0017):v4.0 JETSTREAM rev 2,其包括PeptideProphet(Keller A等,Anal.Chem.2002;74(20):5383-5392)和ProteinProphet(Nesvizhskii等,Anal.Chem.2003;75(17):4646-4658)。将ProteinProphet的可能性评分设置成0.9,其导致由ProteinProphet和PeptideProphet估计的所有检索结果的平均蛋白质和肽假性发现率小于1%。所述数据库检索标准包括:50ppm质量公差(对于母离子)、可变修饰为15.994920Da(对于甲硫氨酸)(代表氧化的甲硫氨酸)、57.021465 Da(对于脲基甲基化,作为半胱氨酸的静态修饰),至少一个胰蛋白酶末端/肽,和多至两个丢失的切割位点。
1.2.2.4 数据分析和靶标选择为了从OM-蛋白质组选择假定靶标,采用公用线上工具(PSORTb v3.0,Yu等,Bioinformatics 26(13):1608-1615,2010)分析5种不同菌株(参见上表6)的经鉴定的蛋白质在该细菌中的定位。对存在于所有5种菌株的OM-蛋白质组中且预计位于胞外或外膜的蛋白质进行详细的个体分析。这包括14个公用参比基因组之间的基因组保守(genomic conversation)(基因的存在/缺失和氨基酸相同性的百分比)和外膜中蛋白质的预测拓扑学,这采用公用线上工具HHpred进行(Soding等,Nucleic Acids Res.2005年7月1日;33(网络服务器问题):W244-8.)。若可用,也可考虑有关已鉴定的或在其它物种中同源的不动杆菌蛋白质的文献。
认为(1)由经分析氨基酸保守(amino acid conversation)≥90%的14个基因组中至少13个编码的蛋白质,和(2)预计显示外膜的胞外侧上的蛋白质序列的部分的蛋白质,是假定的抗体靶标。在文献预测此种假定抗体靶标的同源性在抗生素抗性鲍式不动杆菌菌株中下调或不存在的那些情况中,不再跟进所述靶标。例如,先前已显示外膜蛋白CarO在碳青霉烯抗性鲍式不动杆菌菌株中下调(Mussi等,Antimicrob Agents Chemother.四月;49(4):1432-40,2005)。尽管该靶标经比较蛋白质组学以及特定靶标选择鉴定,但仍认为CarO是几乎没有临床相关性的靶标,由此不再研究该靶标。
1.2.3.特定靶标鉴定
该方法着眼于特定靶标,所述特定靶标由康复期鲍式不动杆菌患者血清中存在的抗体识别。因此,对外膜蛋白质富集的OM蛋白质制备物通过二维凝胶电泳(2DE)分离。所述2DE由等电聚焦(IEF)和之后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)步骤构成以分辨OM蛋白质。使由患者血清识别的蛋白质通过免疫印迹分析测定。为提高鉴定不同菌株表达的蛋白质的几率,将至少两种鲍式不动杆菌菌株的免疫印迹作比较,并选择全部分析菌株中存在的蛋白质供于通过MS分析的蛋白质鉴定。对所述蛋白质进行单独表征,并根据IT-预测和文献检索进行选择。
1.2.3.1 细菌培养物和OM-蛋白质制备物的制备
采用鲍式不动杆菌菌株ATCC19606、BMBF-65和柏林-95(Berlin-95)(参见表6)来产生如1.2.2.2中所述的OM-蛋白质制备物。
1.2.3.2 二维凝胶电泳(2DE)
根据生产商说明(英国的GE医疗保健公司(GE Healthcare))采用EttanTMIPGphorTM3 IEF系统(GE医疗保健公司)进行等电聚焦(IEF)。简言之,使固定因子(Immobiline)pH3-10 NL 7cm干试条(DryStrips)(GE医疗保健公司)在室温下于125μl再水合溶液(8M尿素(西格玛-奥德里奇)、2%CHAPS(西格玛-奥德里奇)、40mM DTT(伏路卡)、0.5%IPG缓冲液(GE医疗保健公司)、0.002%溴酚蓝)中再水合过夜。使OM-制备物(20-30μg)溶解于50-100μl再水合溶液中,涡旋30秒并在室温孵育数分钟。然后,使样品以>14000g离心2分钟并取上清液用于IEF。采用杯式上样系统(cup-loading system)将重复的样品加载至再水合的固定因子干试条上,并用矿物油覆盖。蛋白质采用如下运行条件来分离:300V持续1小时,线性梯度300V-1000V持续30分钟,线性梯度1000V-5000V持续1小时30分钟和5000V持续36分钟。将所述试条立即置于-20℃冷冻。
按照生产商说明(美国英杰公司(Invitrogen))采用Novex 4-12%Bis-Tris凝胶(英杰公司)和10μl的明亮预染蛋白标准品(SharpPre-stained Protein Standard)(英杰公司)进行第二次二维试验。采用一块重复的凝胶用于在硝化纤维素膜(英杰公司)上印迹,按照生产商关于Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司)的说明,采用30V下跑动80分钟作为跑胶条件。硝化纤维素膜用丽春红S溶液(西格玛-奥德里奇)染色,并记录图片。该膜在室温下于封闭缓冲液(含5%脱脂牛奶(伏路卡)的PBS-T(含0.05%吐温(西格玛-奥德里奇)的PBS)中孵育1小时。个体患者血清或混合物以1:500在封闭缓冲液中稀释并与该膜在4℃孵育过夜。膜在PBS-T中清洗三次×5分钟,并用人IgG特异性二抗(英杰公司)以1:1000在封闭缓冲液中于室温下孵育1小时。该膜另清洗三遍并用TMB底物(普洛麦格(Promega))检测结合的抗体。选择由以所有经测试的鲍式不动杆菌菌株形式的给定患者血清检测出的蛋白质用于蛋白质鉴定。因此,所述2DE-凝胶的第二个重复中的蛋白质用瞬时蓝(Instant BlueTM(英国剑桥的埃克斯派顿公司(Expedeon)))观察。通过比较该凝胶的蛋白质图案与丽春红S染色膜和免疫印迹信号的蛋白质图案,在重复凝胶中定位免疫印迹中呈阳性的蛋白质。切下蛋白质斑点并贮存于-80℃直至通过MS分析进行蛋白质鉴定。
1.2.3.3.胰蛋白酶消化物的MS-分析
由瑞士功能基因组学苏黎世中心的蛋白质分析工作组通过LC/ESI/MS/MS采用标准法鉴定已切下凝胶片段中的蛋白质。简言之,凝胶块用100μl100mMNH4HCO3/50%乙腈清洗两次,用50μl乙腈清洗。弃去所有三份上清液,并添加10μl胰蛋白酶(含100ng的10mM Tris/2mM CaCl2,pH8.2)、20μl缓冲液(10mMTris/2mM CaCl2,pH8.2)然后在37℃孵育过夜。移出上清液,且凝胶片段用100μl0.1%TFA/50%乙腈提取两次。将所有三份上清液合并然后干燥。使样品溶解于25μl0.1%甲酸并转移至用于LC/MS/MS的自动取样器小瓶。然后注射5μl供于肽鉴定。通过使用ProteinLynx全球服务器(SwissProt,所有物种)和Mascot(NCBInr,所有物种)检索程序进行数据库检索。1.2.3.4.数据分析和靶标选择。
选择被鉴定为鲍式不动杆菌蛋白并预测是或标记为膜外部蛋白质的蛋白质作为推测的靶标。若在文献预测此种假定抗体靶标的同源性在抗生素抗性鲍式不动杆菌菌株中下调或不存在,则不再跟进所述靶标。
实施例2:IT预测
对于蛋白质结构的IT预测,采用来自图宾根的进化生物学马普学院(Max-Planck Institute for developmental Biology)的生物信息工具箱(Bioinformatics Toolkit)(Biegert等,Nucleic Acids Res.34,W335-339)。采用工具HHpred(Soding J.等,Bioinformatics,2005,21,951-960,)预测三级结构,该工具构建查询序列的隐马尔可夫模型(HMM)并将其与HMM数据库作比较,该数据库代表有评注的蛋白质家族(例如,PFAM、SMART、CDD、COG、KOG)或具有已知结构的结构域(PDB、SCOP)。作为线上预测的设置,采用HMM数据库pdb70_3Sep11并将HHblits设置成MSA生成法(最多3个迭代和局部比对模式)。假定真阳性可能性高(>90%)且同源性覆盖大多数查询序列的预测结构为真。当多个结果符合要求时,采用具有最高可能性和最低E值与P值的两个结果来代表三级结构。对SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16的代表性预测三级结构示于表4并可从pubmed线上服务器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(Wang Y.等,Nucleic Acids Res.2007年1月;35(数据库卷):D298-300.)下载。
N末端前导序列的预测:
N-末端前导序列采用用于革兰氏阴性细菌的SignalP 3.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SianalP.Bendtsen J.D.等,J.Mol.Biol.,340:783-795,2004.),利用隐马尔可夫模型和神经网络预测。
亚细胞蛋白质定位的预测:
采用公用线上工具Psortb v3.0(http://www.psort.org/psortb/,Yu等,2010,Bioinformatics 26(13):1608-1615)预测亚细胞定位。预测设置选择"细菌"和"革兰氏阴性菌株"。以单字母氨基酸代码输入蛋白质序列。
对于脱落组分析,采用公用线上工具SOSUIGramN(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosuigramn/sosuigramn_submit.html;Imai等,Bioinfomation 2(9),417-421(2008)),以单字母氨基酸代码输入蛋白质序列。氨基酸保守性和基因普遍性的测定:
对于基因普遍性和蛋白质保守性的测定,将待分析的氨基酸序列以单个氨基酸单字母代码输入基因组blast线上工具"tblastn"(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi,Cummings L,等,FEMSMicrobiol Lett.2002 Nov 5;216(2):133-8;Altschul等,Nucl Acid Res.,25:3389-3402,(1997))作为查询序列。选择全部鲍式不动杆菌基因组数据库。选择默认BlastP参数(BLOSUM62矩阵,开放缺口消耗=11,延伸缺口消耗=1,采用低复杂性筛选和基于组成的统计)。待接受的预期-值保持在默认设置10。结果中,普遍性和参比基因组中的氨基酸相同性百分比(表4)用于靶标选择。
万一DNA序列被用作查询序列,利用blastn作为替代,采用默认设置(BLOSUM62矩阵,开放缺口消耗=5,延伸缺口消耗=2,匹配评分=2,错配评分=-3)。视序列长度而定,程序采用低复杂性筛选或高复杂性筛选。
实施例3:用于生成重组抗原的表达载体的构建
编码本发明多肽的核酸序列用包含适于克隆的限制性位点的引物通过PCR从鲍式不动杆菌(ATCC19606)的基因组DNA扩增。PCR产物框架内克隆进入表达载体pET-28a(+)(德国诺瓦基公司(Novagen)),该表达载体产生带有N末端His-标签的重组蛋白。在Microsynth仪(瑞士巴尔加赫)生成全部寡核苷酸。对于AB023、AB024、AB025、AB030、FimA、CsuAB和OmpA,克隆不带N末端信号肽的全编码序列(cds)。N末端前导序列经测定并移除以供重组蛋白的克隆和表达。对于AB031,克隆胞外环的78个氨基酸,因为它是该分子中预期处于胞外侧并因而可接触抗体的多于2个氨基酸的唯一区域。表达质粒在Microsynth仪测序以排除PCR矫作物。SEQ ID NO:33和34分别显示测序引物T7和T7 term(端)的核苷酸序列。由SEQ ID NO:35所示核苷酸序列组成的额外测序引物用于实施例3.4中所述AB030的表达载体。
3.1 AB023的表达载体(SEQ ID NO:1)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:2的第1-26位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oAB023wss GGCAGGATCCGCTGCTGCATTTGACCC(SEQ ID NO:17)和oAB023as CGGAATGTCGACTTAGAATGCAGTTG(SEQ ID NO:18)以分别结合SEQ ID NO:1的76-95位和第1241-1254位。向寡核苷酸oAB023wss和oAB023as添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。通过PCR采用Pfx聚合酶(英杰公司)和寡核苷酸对oAB023wss/oAB023as从ATCC19606的基因组DNA扩增SEQ ID NO:1的第76-1254位的cds同源物。每50μl反应采用50ng基因组DNA、1 U Pfx聚合酶、1mM MgSO4、2x pfx缓冲液、0.3mM dNTP(每种)、0.3μΜ寡核苷酸(每种)。PCR热循环程序是:(94℃,4分钟)35x(94℃,15秒;55℃,30秒;65℃,2分钟)(65℃,5分钟).PCR产物采用QIA快速凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QIAGEN),28704)根据生产商说明纯化。纯化的PCR产物和100ng载体pET-28a(+)用限制性酶BamHI和SalI(Fermetas,ER0051,ER0641)消化,并通过采用QIA快速PCR纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN),28104)根据生产商说明来纯化消化物。随后将50ng载体以1:2的摩尔比与PCR产物采用2个单位的连接酶(富酶泰斯(Fermentas),加拿大)在总体积20μl中与1x连接酶缓冲液(补充有连接酶)在室温下连接2小时。将连接反应物转化进入化学感受态大肠杆菌(DH5a)中,并采用标准法(Maniatis)在含50μg/ml卡那霉素(Applicem公司)的LBA板上挑选。选择抗性集落用于采用市售可得试剂盒(美国威斯康星州的普洛麦格公司或德国的凯杰公司)进行的质粒DNA纯化,然后纯化的质粒在Microsynth仪(瑞士巴尔加赫)采用标准测序引物T7(TAATACGACTCACTATAGG)和T7 term(TGCTAGTTATTGCTCAGCGG)测序以验证PCR产物的正确整合。AB023的表达载体编码与按ATCC19606(D0CDE3)不动杆菌基因组序列预期相同序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-26)被His-标签从该载体上替代。
3.2 AB024表达载体(SEQ ID NO:3)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:4的第1-29位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oAB024wss GGCAGGATCCGCAACTTCTGATAAAGAG(SEQ ID NO:19)和oAB024as C AAAGTCGACTTAGAAGCTATATTTAGCC(SEQ ID NO:20)以分别结合SEQ ID NO:3的第88-105位和第1287-1305位。向寡核苷酸oAB024wss和oAB024as添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。SEQ IDNO:3的第88-1305位的cds同源物经PCR扩增并准确按照关于AB023表达载体所述克隆进入pET-28a(+)。
AB024的表达载体编码与按ATCC19606(D0CDN5)不动杆菌基因组序列预期相同序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-29)被His-标签从该载体上替代。
3.3 AB025表达载体(SEQ ID NO:5)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:6的第1-21位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oAB025wss TCGCGGATCCCAAGGTTTAGTGCTTAATAATGATG(SEQ ID NO:21)和oAB025asCGACAAGCTTAGAAACCAAACATTTTACGCTC(SEQ ID NO:22)以分别结合SEQ ID NO:5的第67-88位和第1422-1446位。向寡核苷酸oAB025wss和oAB025as添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。seq5的第67-1446位的cds同源物通过PCR扩增并准确按照关于AB023表达载体所述那样克隆进入pET-28a(+),修改之处在于用限制性酶HindIII(富酶泰斯(Fermentas),ER0501)替代SalI。
AB025的表达载体编码与按ATCC19606(D0C8X7)不动杆菌基因组序列预期相同序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-21)被His-标签从该载体上替代。
3.4 AB030的表达载体(SEQ ID NO:7)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:8的第1-44位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oAB030wss CTTGTGGATCCCAAAGTTCGGCTGAGACC(SEQ IDNO:23)和oAB030as AAAGTCGACTTAAAGTTGTGGACCAATAAAGAAATG(SEQ ID NO:24)以分别结合SEQ ID NO:7的第133-150位和第2695-2721位。向寡核苷酸oAB030wss和oAB030as添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。SEQ ID NO:7的第133-2721位的cds同源物经PCR扩增并准确按照关于AB023表达载体的描述克隆进入pET-28a(+),修改之处在于PCR的延长时间增长至2分钟30秒而循环数减少至30轮。AB030表达载体编码与按ATCC19606(D0C629)不动杆菌基因组序列预期相同的序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-44)以及编码苏氨酸的第58位氨基酸替代丝氨酸。由于其它鲍式不动杆菌菌株(例如,AB307-B7H123)中的AB030同源性在该位置包含苏氨酸,因此来自预期序列的该差异是允许的。3.5 AB031 L的表达载体(SEQ ID NO:9)
采用同源性检测和结构预测软件HHPred(http://toolkit.tuebingen.mpg.de/hhpred.Soding等,Nucleic Acids Res.;33(网络服务器问题):W244-8,2005年7月1日)来预测AB031的结构。AB031的结构同源物(Pubmed蛋白质ID 1ek9-外膜蛋白质TOLC)预测有最高可能性(100%)和具有最高统计学显著性的E-值(0)。比对预测SEQ ID NO:10的第87-164位的78个氨基酸的序列位于该细菌的胞外侧。设计寡核苷酸oAB031 L1wssAAAGGATCCAGAGCATATGCTTTTCATAGTG(SEQ ID NO:25)和oAB031L1as AAAGTCGACTTAAGATGGTCGGACTACTTGGTCTTCT(SEQ ID NO:26)以通过PCR扩增该78个氨基酸环。向寡核苷酸oAB031 L1ss和oAB031 L1as添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。所述78个氨基酸序列的cds同源物采用Dream-Taq聚合酶(富酶泰斯(Fermentas),EP0701)和寡核苷酸对oAB031L1wss/oAB031 L1as通过PCR从ATCC19606的基因组DNA扩增。每50μl反应采用50ng基因组DNA、0.5U的taq聚合酶、1x taq缓冲液、0.2mM dNTP(每种)、0.2μΜ寡核苷酸(每种)。PCR热循环程序是(94℃,3分钟)5x(94℃,15秒;50℃,15秒;72℃,2分钟)25x(94℃,15秒;55℃,15秒;72℃,2分钟)(72℃,5分钟)。按照关于AB023表达载体所述那样将PCR产物克隆进入pET-28a(+)。AB031 L1的表达载体编码与按SEQ ID NO:10的78个氨基酸序列预计相同的氨基酸序列。
3.6 FimA的表达载体(SEQ ID NO:11)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:12的第1-20位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oFimAwss GGACGAGGATCCGCTGATGGTACAATTACA(SEQ IDNO:27)和FimAas AACTAAGCTTTCAACCCATTGATTGAGCAC(SEQ ID NO:28)以分别结合SEQ ID NO:12的第61-78位和392-407位。向寡核苷酸添加以用于克隆的限制性位点用下划线表示。seq11的第61-407位的cds同源物经PCR扩增并准确按照关于AB025的表达载体所述那样克隆进入pET-28a(+)。
FimA的表达载体编码与按ATCC19606(D0C767)不动杆菌基因组序列预期相同的序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-20)被His-标签从该载体上替代。
3.7 CsuAB的表达载体(SEQ ID NO:13)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:14的第1-23位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oCsuABwss AATACTGGATCCGCTGTTACTGGTCAG(SEQ ID NO:29)和oCsuABas AACTAAGCTTTTAGAAATTTACAGTGACTAATAGAG(SEQID NO:30)以分别结合SEQ ID NO:13的第70-84位和第512-537位。向寡核苷酸oCsuABwss和oCsuABas添加以用于克隆的限制性位点以下划线表示。与SEQ IDNO:13的第70-537位具有同源性的cds经PCR扩增并按照关于AB025表达载体所述克隆进入pET-28a(+)。
CsuAB的表达载体编码与按ATCC19606(D0C5S9)不动杆菌基因组序列预期相同序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-23)被His-标签从该载体上替代。
3.8 OmpA的表达载体(SEQ ID NO:15)
SignalP 3.0服务器预测了SEQ ID NO:16的第1-22位的N末端信号序列。设计寡核苷酸oOmpAwss CTGCTGAATTCGGCGTAACAGTTACTCC(SEQ IDNO:31)和oOmpAas CAAGAAAGCTTATTATTGAG(SEQ ID NO:32)以分别结合SEQ ID NO:15的第67-83位和第1064-1071位。向寡核苷酸oOmpAwss和oOmpAas添加的用于克隆的限制性位点以下划线表示。SEQ ID NO:15第67-1071位的cds同源物经PCR扩增并准确按照关于AB023的表达载体描述的那样克隆进入pET-28a(+),修改之处在于采用EcoRI和HindIII(富酶泰斯(Fermentas),ER0271,ER0501)作为替代。
OmpA的表达载体编码与按ATCC19606(D0CDF2)不动杆菌基因组序列预期相同序列,不同之处在于信号肽(氨基酸1-22)被添加的His-标签从该载体上替代。
实施例4:重组蛋白的表达和纯化
4.1 大肠杆菌中重组蛋白的表达
对于带His-标签的蛋白质的重组表达,化学感受态大肠杆菌BL-21(DE3)用上述个体表达载体转染,并采用标准方法在含50μg/ml卡那霉素的LBA-板上挑选。采用含50μg/ml卡那霉素的LB板中的抗性集落过夜培养物以起始0.5l LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)中的培养(OD600为0.2或更低)。培养物在37℃以200rpm孵育直至OD600达到0.5-1。以1mM浓度添加IPTG(西格玛-奥德里奇)并使细菌在37℃以200rpm另孵育3-4小时。将细菌离心(3500g,10分钟)并使沉淀在-20℃冷冻。
4.2 从大肠杆菌细菌沉淀提取重组蛋白。
使细菌细胞沉淀在10ml细胞裂解缓冲液(0.15M NaCI,10mM MgCI2,10mM MnCl2,20mM Tris-HCI,pH=8.0,10mg/l DNA酶I)中重悬,该悬液如1.2.2.2中所述在冰上声处理并在冰上孵育30分钟。将该悬液离心(4000 g,4℃下10分钟),弃去上清液并通过机械力使沉淀重悬于10ml去污剂缓冲液(0.15M NaCl,20mM Tris-HCI,pH=8.0,1%曲通X 100)。将该悬液以8000g在4℃离心10分钟。在带his标签的AB031 L1情况中,向上清液补充5mM DTT以产生AB031 L1结合缓冲液,并立即用于Ni-NTA亲和纯化。对于所有其它重组蛋白,弃去上清液并使沉淀在20ml去离子冷水中通过重悬该沉淀并重复离心洗涤两次。将经洗涤的沉淀冷冻在-20℃直至进一步使用。
通过使重悬的沉淀在室温下振荡孵育30分钟来从10-20ml结合缓冲液提取重组蛋白。对于带His-标签的FimA,沉淀用结合缓冲液G(6M GuHCl,0.5MNaCl,20mM咪唑(德国默克公司(Merck)),5mM DTT,20mM Tris-HCI,pH=9.0)提取,而对于带His-标签的AB023、AB024、AB025、AB030、CsuAB和OmpA,沉淀用结合缓冲液U(8M尿素,0.5M NaCl,20mM咪唑,5mM DTT,20mMTris-HCI,pH=8.0)提取。
4.3 重组带his标签的蛋白质的Ni-NTA纯化。
采用HisTrapTM HP柱(GE医疗保健公司,17-5247-01)对带his-标签的蛋白质进行亲和纯化。采用Akta先锋仪器(GE医疗保健公司)以1ml/分钟的系统流速和0.5MPa压强和0.3MPaΔ柱压限进行所述纯化。所述柱用5柱体积(CV)的运行缓冲液平衡。所述运行缓冲液由用于各抗原的结合缓冲液中相同组分组成,不同之处在于不含DTT。向柱施加包含提取的重组蛋白的结合缓冲液,然后该柱用运行缓冲液冲洗直至紫外线280nm信号记录稳定。用10CV的线性梯度的含20mM~500mM咪唑的运行缓冲液从该柱洗脱结合的蛋白质。以0.5ml为一部分收集并通过SDS-PAGE和考马斯(Coomassie)染色分别分析重组蛋白的存在、纯度和质量。汇集纯度和浓度的最高的重组蛋白部分并通过在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上比较采用滴定BSA标准品(0.5、1、2、4、6μg/泳道)滴定的重组蛋白来定量。
FimA通过添加乙醇至90%(v/v),冷却至-80℃并以>14'000rcf在4℃离心30分钟来沉淀,然后通过真空浓缩系统(Speed Vac)干燥。FimA以沉淀形式贮存或以1mg/ml的浓度在结合缓冲液U中贮存于-20℃。所有其他蛋白质在运行缓冲液中稀释至1mg/ml或2mg/ml并贮存于-20℃。
4.4 OmpA的重折叠
根据McConnell等所述使OmpA重折叠(McConnell,Michael J.;Pachon,Jeronimo(2011):Protein Expression and Purification 77(1),S.98-103)。简言之,使带his标签的OmpA(1ml,1-2mg/ml)在50ml重折叠缓冲液(10mg/ml正-辛基-对-D-吡喃葡萄糖苷,20mM NaPi,pH7.4)中稀释50倍,然后在42℃孵育过夜。采用10kDa截止值的Amicon Ultra-15过滤装置(美国马萨诸塞州的密理博公司(Millipore))将该体积浓缩至1mg/ml OmpA。
实施例5:多克隆兔血清的生成和兔IgG的纯化
单独制备抗原用于生成兔免疫血清。AB030经乙醇沉淀并以1.2mg/ml的浓度重悬于1M尿素缓冲液(1M尿素,10mM Tris-HCl,pH=8.0,0.1%SDS)。使AB031-L1沉淀并使该沉淀以2.5mg/ml的浓度溶解于1M尿素缓冲液。将各抗原(各1.5mg)送至生物基因公司(Biogenes)(德国柏林),在此处生成兔抗血清。在免疫之前取各兔免疫前血清。用各抗原免疫两只兔子并在免疫后7天和14天加强。在第28天,对动物加强并制备20ml血清,然后采用重组蛋白通过ELISA和免疫印迹分析所述血清。总血清在免疫后第42天和第56天之间制备。血清包含0.02%硫汞撒作为防腐剂。
通过蛋白质A亲和纯化,采用标准方法从血清纯化总IgG。纯化的总IgG在Tris-甘氨酸缓冲液(pH=7.5,250mM NaCl,0.02%硫汞撒)中或在Tris-甘氨酸缓冲液(pH=7.5)。
在用活细菌实验之前通过透析移除硫汞撒。简言之,采用10kDa截止值的Slide-A-Lyzer透析盒(美国马萨诸塞州的赛默飞科学公司)使血清和总IgG针对1-2l PBS在室温下透析两次(30分钟)并在4℃透析一次过夜。
实施例6:免疫印迹分析
使参比菌株(大肠杆菌、铜绿假单胞菌或鲍氏不动杆菌)或鲍氏不动杆菌的临床分离株在LB培养基中生长(若无另外说明)至稳定期或对数期(OD6000.3-1.2),并以4000g离心5-10分钟。使细菌细胞沉淀重悬于水中,并用等体积的2x SDS样品缓冲液(0.1M Tris-HCl pH=6.8,4%(w/v)SDS,0.2%(w/v)溴酚蓝,20%甘油,0.2M DTT)或含还原剂(LC2676,英杰公司)的2xTris-甘氨酸SDS样品缓冲液以等同于12OD600/ml的终浓度裂解并在98℃加热10分钟。使纯化的蛋白质在SDS样品缓冲液中稀释,因而达到1-2μg/10μl或等同于OD600/ml的浓度。4-20%Tris-甘氨酸凝胶(英杰公司)的每条泳道中加载10μl的细菌悬液或纯化的抗原。将5-10μl分子量标准品(预染的或明亮预染的蛋白质标准品,英杰公司)加载至分开的泳道。按照生产商说明采用140V跑动90分钟的跑胶条件使蛋白质通过SDS-PAGE分离(英杰公司)。在仅分离纯化抗原的情况中,采用4%-20%Bis-Tris凝胶(NP0322BOX,英杰公司)作为替代,并根据生产商说明采用MES跑动缓冲液(英杰公司)就变性、还原的样品进行分离。
凝胶如上所述采用考马斯染色或印迹至硝化纤维素膜上并通过上文关于2DE的丽春红S染色和免疫印迹分析描述的那样进行分析。兔抗血清以1:500-1:1000稀释,而人抗血清以1:500稀释。二抗(HRP-山羊抗-兔IgG(西格玛-奥德里奇)和HRP-山羊抗-人IgG(英杰公司))以1:2000的稀释度使用。
免疫印迹分析的结果示于图3、4、5、6C和9C。
实施例7:ELISA
96孔ELISA板(Nun,439454)用以1μg/ml稀释于被覆缓冲液中且0.1ml/孔的抗原性多肽在4℃被覆过夜,或在室温下就各抗原性多肽被覆2小时。尿素跑动缓冲液[8M尿素,0.5M NaCl,20mM咪唑,20mM Tris-HCI,pH8.0]用于带His-标签的AB023、AB024、AB025、AB030、FimA和CsuAB作为被覆缓冲液。PBS用作重折叠的OmpA和AB031 L1的被覆缓冲液。
被覆的ELISA板用PBS-T(0.35ml/孔,采用Skan洗剂400,Skatran公司)清洗三遍。人血清或兔血清用作一抗。一抗在PBS-T中稀释并每孔添加0.1ml。作为一抗使用之前,人血清以1:200的稀释度开始滴定而兔血清以1:100或1:200的稀释度开始滴定。ELISA板在室温下用一抗孵育1小时,然后在PBS-T中清洗三次。HRP-山羊抗-人IgG(英杰公司)或HRP-山羊抗-兔IgG(西格玛-奥德里奇)用作二抗,分别以1:2000和1:5000的稀释度使用。ELISA板在PBS-T中另清洗三遍,然后通过O-苯二胺(伏路卡)的颜色变化检测结合的HRP。该反应用1M HCl终止并通过检测490nm处OD值检测来定量。
采用人血清作为一抗能够检测靶标,而采用兔血清证明所述靶标的免疫原性。
ELISA示于图1和2。
实施例8:细菌FACS分析
检测稳定期细菌或对数生长期细菌的OD600。使细菌在含0.5%(w/v)BSA作为封闭剂的PBS中稀释至OD600为0.1。各反应使用0.05ml的细菌悬液并与0.05ml一抗在圆底96-孔细胞培养皿(美国纽约州的康宁公司(Corning))中合并。未结合的抗体通过两轮清洗循环来去除,所述清洗循环如下组成:使细菌在0.2ml封闭剂中重悬,以1700g离心10分钟并去除上清液。任选在该阶段,结合的抗体通过在4%(w/v)甲醛/PBS中冰上孵育10分钟来固定。若采用固定剂,则将细菌洗涤两次。二抗,山羊抗-人IgG-Alexa Fluor 488、山羊抗-人IgM-Alexa Fluor488或山羊抗-兔IgG-FITC(英杰公司),以0.1ml/孔,以1:1000的稀释度添加并孵育30分钟。细菌再次清洗并采用FACS Calibur仪分析。将仪器设定调节至最优地辨别所述细菌群并区分碎片及弱荧光信号与强荧光信号(正面散射:电压E01,放大器增益:7.0,log.侧面散射:电压659,放大器增益:1.0,log.,FI-1:电压767,放大器增益:1.0,log.)。使用仅洗涤缓冲液(无一抗或免疫前血清)作为阴性对照。患者血清或兔免疫血清用作阳性对照(强信号)。所有溶液(除细菌溶液以外)经无菌过滤以减少FACS矫作物。
结果示于图6A和B以及图7。
实施例9:免疫荧光分析(IFA)
使用各种方法制备细菌供于IFA。使来自LBA或BHI板的细菌集落以高密度重悬于50μl水(OD600>1)并涂至10-孔玻璃玻片(美国MP生物医药公司(MPBiomedicals Inc.))的孔上。将液体细菌培养物直接涂至所述玻片上。涂片空气干燥并用含4%(w/v)甲醛的PBS固定10分钟,然后用PBS三步清洗。或者,使细菌在-20℃丙酮中固定10分钟并空气干燥。另一种制备细菌供于IFA的方法是,是液体细菌培养物直接在玻璃破片(美国新泽西州的BD生物科学公司(BDBiosciences))上生长以形成生物薄膜。移出培养物且如上所述固定贴附至玻璃玻片的细菌。
如下进行IFA:固定的细菌与封闭剂(含1%(w/v)BSA的PBS)孵育至少30分钟。用在封闭剂中稀释的一抗代替缓冲液。兔免疫血清以1:50-1:500稀释。孵育1小时后,细菌用PBS清洗3-4次。用以1:200-1:400的稀释度在封闭剂中稀释的二抗(山羊抗-兔IgG-FITC(F2765,英杰公司)孵育45分钟并用PBS清洗3-4次。玻片用含DAPI的Vectashield(H-1200,载体实验室公司(Vector labs))覆盖并用盖玻片和指甲油密封。分析玻片并用瑞士伯尔尼大学解剖学院的尼康(Nikon)荧光显微镜"fluonik"的100-倍油浸物镜拍照。所有步骤均在室温下进行。
结果示于图8B。
实施例10:凝集试验
使稳定期细菌在PBS中稀释至OD600约为3。对数期细菌通过离心浓缩并在PBS中重悬至OD600约为3。在多孔玻璃玻片上,将10μl细菌悬液与等体积的0.2-1.5mg/ml浓度的抗体混合,所述抗体针对从兔血清纯化的总IgG。该浓度取决于个体抗体的特点。单克隆抗体和亲和纯化的多克隆抗体需要比纯化自免疫血清的总IgG低很多的浓度。轻轻振荡玻片并在室温下孵育10分钟。采用Motic系统显微镜(B1系列)以10x~40x的放大倍率观察凝集。
结果示于图8A。
实施例11:直接FimA牵出试验(pull down assay)
20μl床体积的蛋白质A珠(MabCaptureTM,美国加利福尼亚州的Applied(应用生物系统公司))通过离心(300g,1分钟)并去除上清液在1ml PBS中洗涤两次。通过将珠与10μg抗体在0.2ml PBS中孵育30分钟并室温30rpm来用抗体被覆所述珠。使珠在1ml PBS中另清洗两遍,然后将珠加入鲍式不动杆菌的LB过夜培养物的0.4ml上清液中。上清液通过以>4000g离心该细菌培养物5分钟并将该上清液过滤通过0.2pm的注射器用滤器(Nalgene#194-2520)来制备。混合物孵育1小时并室温30rpm。使珠在1ml PBS中另清洗两次。最后,使珠重悬于30μl裂解缓冲液(用于4%-20%Bis-Tris凝胶(NP0322BOX,英杰公司))并在98℃孵育5分钟。如上所述按照生产商对于变性还原的4%-20%Bis-Tris凝胶的说明采用MES跑动缓冲液(IM-8042 H版,英杰公司)通过免疫印迹分析来测试样品中天然FimA的存在。采用针对FimA的兔免疫血清供于FimA检测。
结果见图11。
实施例12:动物中的主动与被动免疫
主动与被动免疫研究采用小鼠不动杆菌肺炎模型进行,因为该模型的读出百分比存活率、临床评分和体重已经Eveillard等人于先前开发,Eveillard等,2010,Journal of Infection 60(2),S.154-161。
12.1 主动免疫
在第0、14、28、42天,用含10g抗原的0.1ml50%(v/v)Gerbu佐剂(德国的GERBU生物技术股份有限公司(GERBU Biotechnik GmbH))/PBS腹膜内免疫各小鼠(135 C3H/HeN小鼠,18-20g,6周龄.法国萨尔特的Elevage Janvier公司)。作为阴性对照,小鼠用50%(v/v)Gerbu佐剂/PBS或仅PBS免疫。
在第49天,根据Marie Laure Joly-Guillou和Matthieu Eveillard已建立的方案(Eveillard等,Journal of Infection 60(2),S.154-161,2010)开始处理所述肺炎模型。简言之,通过在鲍式不动杆菌接种前的第4天和第3天腹膜内注射(150 mg/kg体重,0.15ml)注射环磷酰胺(美国伊利诺伊州的巴克斯特公司(Baxter))使小鼠暂时患中性白细胞减少症。小鼠用异氟烷联合纯氧麻醉。如先前所述进行鲍式不动杆菌气管内滴注(Joly-Guillou等,Antimicrob Agents Chemother.Feb;41(2):345-51,1997)。简言之,气管用钝(blint)针头插管,并沉积50μl的含108cfu/mL的细菌悬液。接种物多少由定量培养物确定。
在气管内滴注接种物后,将小鼠放回其笼子(第0天)并观察以评估自发结果。每天评估该结果(包括第0天)并考虑死亡率、小鼠体重变化,以及基于小鼠活动性建立的临床评分(对于自发活动评分=0,当仅在刺激后观察到活动时评分=1,而对于无活动评分=2)、结膜炎的发展(无结膜炎时评分=0,当有结膜炎时评分=1),以及毛发方面(对于正常毛发评分=0,而对于竖起毛发评分=1)。总体而言,该临床品分由0(对于正常小鼠)至4(对于严重疾病)不等。
结果见图12。
12.2被动免疫
根据Marie Laure Joly-Guillou和Matthieu Eveillard已建立的方案(Eveillard等,Journal of Infection 60(2),S.154-161,2010)开始处理所述肺炎模型。简言之,通过在鲍式不动杆菌接种前的第4天和第3天腹膜内注射(150 mg/kg体重,0.15ml)注射环磷酰胺使小鼠暂时患中性白细胞减少症。在鲍式不动杆菌接种之前第0天3小时,对小鼠腹膜内被动疫苗接种0.15ml兔抗血清、未处理兔血清或PBS。与主动免疫方案类似地,由麻醉小鼠起始诱导肺炎。类似地,监测存活率、临床评分和体重。结果如图11和13所示。
实施例13:mAbs生成
使通过Ficoll-Paque梯度离心从40ml全血样品纯化的外周血淋巴细胞重悬于3ml细胞培养基(IMDM/Ham's F1250:50;10%FCS)和EBV-分泌型B-95-8绒猴细胞的3ml细胞培养物上清液中。在37℃和6.5%CO2孵育3~15小时后,在HANKS缓冲液中进行一次洗涤/离心步骤之后将脱落的和贴壁的细胞转移至含1μg/ml环孢菌素A+/-补充物的18ml细胞培养基中。细胞以200μl/孔的体积接种于96孔圆底培养板中并培养1~3周直至可辨认出快速生长集落、幼成淋巴细胞系(LCL)且培养基因pH变化而变黄。通过ELISA分析细胞上清液的抗原特异性抗体。随后将抗体生成细胞传代五次直至获得足以供于后续融合法的细胞数量。一次电融合采用2.5x105或1.25x105个以及相同量的融合伴侣细胞(例如,小鼠-人杂交瘤LA55)。细胞在指数生长时收集并用PBS然后用电融合缓冲液清洗一次。LCL上清液贮存于4℃并随后在筛选ELISA中用作阳性对照。在结合所述两种细胞类型之后,将细胞离心下来,并将形成的沉淀小心重悬于200μl电融合缓冲液中。为了融合,将细胞混合物转移至细胞融合仪(Multiporator)(Eppendorf)的螺旋-融合(Helix-Fusion)室中,并应用如下细胞融合程序(对齐:5伏特,30秒;脉冲:30伏特,30秒,脉冲号:3;对齐后:5伏特,30秒)。之后,使细胞在室温下孵育5~10分钟,在4ml不含FCS的细胞培养基中重悬并分配至24孔板的4个孔中。在37℃和6.5%CO2下孵育3小时后,汇集细胞悬液,并与4ml选择培养基混合,然后转移至96-孔圆底培养板(200μl/孔)。一周后培养基用不含选择性试剂的细胞培养基替代。之后培养细胞直至可辨认快速生长杂交瘤集落。然后通过ELISA分析上清液中特定抗体的存在。使辨认的杂交瘤长大,通过两次单细胞培养再克隆,并冷藏供开发。
实施例14:杀菌试验
HL-60细胞(ATCC CCL-240)在各含20%(v/v)热失活(56℃,40分钟)胎牛血清(FCS)(德国柏林的生物色品公司(Biochrome))和2mM GlutaMAX-l(美国的吉布可(Gibco)/英杰公司)的IMDM(西格玛-奥德里奇)或RPMI-1640(西格玛-奥德里奇)中于37℃下在6%CO2细胞培养孵育箱中培养。通过每3~4天将细胞传代至新细胞培养瓶并用新鲜培养基替换80%-90%的细胞培养物来使细胞保持在105~106个细胞/ml的细胞密度。HL-60细胞培养不超过4个月。杀菌试验之前四天,通过添加310μl二甲基甲酰胺(德国的西格玛-奥德里奇)使HL-60细胞分化至40ml培养基中的8x106个HL-60细胞。细胞在37℃孵育4天。
在杀菌试验的当天,LB中的鲍式不动杆菌过夜培养物以1:150在3 ml新鲜LB培养基中稀释并在37℃以200rpm孵育3小时直至OD600达到0.5-1.5。使培养物在室温预暖的含0.1(w/v)%BSA的IMDM中稀释至OD600为3.8x10-6。抗体或血清与对应的对照在PBS中等同稀释。使各稀释的抗体(20μl)与80μl细菌悬液在96孔细胞培养板的孔中合并。抗体浓度取决于所用的鲍式不动杆菌菌株、血清和抗体。采用来自兔免疫血清(αCsuAB)或未处理兔血清的总IgG的抗体(对于ATCC 19606和CsuE KO,0.5μg/孔;对于Ruh134,5μg/孔)。
使抗体在37℃以130rpm孵育20分钟。添加分化的HL-60细胞(60μl)或培养基和20μl新生兔血清(BRS)(德国的查尔斯河维嘉股份有限公司(Charles RiverWiga GMBH))作为补充或预先热失活的BRS(通过在56℃孵育40分钟)(HBRS),并使孔在37℃以130rpm孵育120分钟。如下确定集落形成单位(cfu)。各孔彻底重悬并将10μl未稀释的悬液和1:5稀释的悬液在LBA上涂板。LBA-板在37℃孵育并在16-20小时后对cfu计数。结果见图9A和B。
实施例15:肽/表位作图
由派帕普林特股份有限公司(德国海德堡)通过微阵列分析来进行对兔免疫血清和对应的免疫前血清的肽作图。从Seq ID NO 2、4、6、8、10、12、14和16中,合成所有可能的由5、8和15个氨基酸组成的线性肽片段。将片段用两个β-丙氨酸和天冬氨酸的接头被覆至PEGMA共聚物薄膜上。由来自Seq ID NO 2、4、6、8、10、12、14和16的肽片段组成的微阵列以重复形式用兔免疫前血清和针对对应重组蛋白产生的特定免疫血清染色(例如,用Seq ID NO 2的肽片段被覆的微阵列用免疫前血清和Seq ID NO 2的重组蛋白免疫的兔的免疫血清染色)。重组蛋白的生成由实施例3和4描述。免疫血清的生成由实施例5描述。抗体染色方案如下进行:在标准缓冲液(PBS,pH 7.4+0.05%吐温20)中预膨胀30分钟并在封闭缓冲液(罗克兰(Rockland)封闭缓冲液B-070)中30分钟之后,使经肽片段被覆的肽微阵列与兔免疫前血清(稀释度1:1000)在4℃以500rpm振荡孵育16小时。在标准缓冲液中清洗两次(1分钟)之后,该微阵列用二抗山羊抗-兔lgG(H+L)DyLight680抗体以1:5000稀释度在室温下染色30分钟。肽微阵列用标准缓冲液清洗两次(1分钟),用蒸馏水漂洗并在空气气流中干燥。用Odyssey成像系统以21pm的分辨率和7/7的绿/红强度进行读出。读出后,用对应的免疫血清由预膨胀步骤开始重复所述染色处理。跳过封闭缓冲液中的孵育。比较对应的免疫前和免疫血清的信号强度。采用来自分析器的软件算法来计算各肽的中值染色强度,将各重复平均化并计算标准偏差。基于平均强度,生成强度作图并鉴定该肽作图中的特异性结合物。肽与强度作图通过对微阵列扫描的视查来校正以鉴定共有基序和与兔免疫血清特异性相互作用的不同的肽。
结果实施例15
为了验证肽片段的免疫原性,如实施例15所述进行微阵列分析。将Seq IDNO 2、4、6、8、10、12、14和16翻译成由5、8和15个氨基酸组成的线性肽片段,并用特定兔免疫血清分析相互作用。通过该方法,对于所有兔免疫血清,鉴定具有不同长度的抗体表位。共有性最高的基序由5个氨基酸组成,而其它长6、7或8个氨基酸。用作对照的免疫前血清仅显示极小背景。基于由8个氨基酸组成的该片段,对Seq ID NO 14具有特异性的免疫血清显示单一表位共有基序PVDFTVAI(SEQ ID NO:36)并因而显示单克隆反应性。
Claims (35)
1.一种疫苗组合物,所述疫苗组合物包含由含有选自下组的多核苷酸的核酸分子编码的至少一种多肽:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)与(a)~(d)中任一种全长多核苷酸互补的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物,其特征在于,所述核酸分子是基因组DNA。
3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物,其特征在于,所述多肽源自不动杆菌(Acinetobacter)属。
4.如权利要求1~3中任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述多肽源自鲍式不动杆菌(Acinetobacter baumanii)种。
5.如权利要求1~4中任一项所述的疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物还包含药学上可接受的运载体和/或佐剂。
6.一种抗原性多肽,所述抗原性多肽由SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列组成;或其片段、类似物或功能衍生物,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性。
7.一种编码如权利要求6所述抗原性多肽的核酸分子。
8.一种表达载体,所述表达载体包含如权利要求7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含如权利要求8所述的载体和/或如权利要求7所述的核酸。
10.一种特异性结合权利要求6所述的多肽的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段能够诱导针对鲍式不动杆菌的效应子功能。
11.如权利要求10所述的抗体,其特征在于,所述抗体是多克隆抗体。
12.如权利要求10所述的抗体,其特征在于,所述抗体是单克隆抗体。
13.一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID NO:36中所示的表位共有基序PVDFTVAI。
14.如权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段能够诱导针对鲍式不动杆菌的效应子功能。
15.如权利要求10~14中任一项所述的抗体,其特征在于,所述抗体是人抗体。
16.如权利要求10~15中任一项所述的抗体,其特征在于,所述抗体有N末端修饰、内部修饰和/或C末端修饰。
17.如权利要求16所述的抗体,其特征在于,所述修饰选自寡聚化、与药物和/或标记物偶联中的至少一种。
18.如权利要求12~15中任一项所述的抗体,其特征在于,所述抗体由人B细胞产生或由将所述人B细胞与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞融合获得的杂交瘤产生。
19.一种杂交瘤,所述杂交瘤能够产生如权利要求12~15中任一项所述的抗体。
20.一种核酸,所述核酸编码如权利要求10~15或18中任一项所述的抗体的轻链和重链。
21.一种包含权利要求20所述核酸的载体。
22.一种宿主细胞,所述宿主细胞包含如权利要求21所述的载体和/或如权利要求20所述的核酸。
23.一种用于产生如权利要求12~15中任一项所述抗体的方法,所述方法包括在允许抗体分泌的条件下培养如权利要求19所述的杂交瘤,和任选地从所述培养物上清液纯化所述抗体。
24.一种药物组合物,所述药物组合物包含如权利要求6所述的抗原性多肽或如权利要求10~18中任一项所述的抗体以及药学上可接受的运载体。
25.一种诊断组合物,所述诊断组合物包含如权利要求6所述的抗原性多肽或如权利要求10~18中任一项所述的抗体,其用于检测患者中的细菌感染。
26.如权利要求10~18中任一项所述的抗体,所述抗体用于治疗和/或预防哺乳动物中的细菌感染。
27.如权利要求26所述应用的抗体,其特征在于,所述哺乳动物是人。
28.如权利要求26或27所述应用的抗体,其特征在于,所述感染由鲍式不动杆菌引起。
29.如权利要求26~28中任一项所述应用的抗体,其特征在于,所述感染是医院获得性的。
30.一种用于治疗和/或预防哺乳动物中的细菌感染的多肽,所述多肽由包含选自下组的多核苷酸的核酸分子编码:
a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13和15中任一所示核酸序列的多核苷酸;
b)编码由(a)的多核苷酸编码的多肽的片段、类似物或功能衍生物的多核苷酸,其中所述片段、类似物或功能衍生物具有免疫刺激活性;
c)编码所具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14和16中任一所示氨基酸序列有至少80%相同性并且具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
d)与(a)的多核苷酸具有至少80%相同性并且编码具有免疫刺激活性的多肽的多核苷酸;
e)在严谨条件下与(a)~(d)中任一种多核苷酸杂交的多核苷酸;和
f)是(a)~(d)中任一种全长多核苷酸的互补体的多核苷酸。
31.如权利要求30所述应用的多肽,其特征在于,所述哺乳动物是人。
32.如权利要求30或31所述应用的多肽,其特征在于,所述感染由鲍式不动杆菌引起。
33.如权利要求30~32中任一项所述应用的多肽,其特征在于,所述感染是医院获得性的。
34.如权利要求1~5中任一项所述的疫苗组合物或如权利要求30~33中任一项所述应用的多肽,其还包含递送载剂。
35.如权利要求34所述应用的疫苗组合物或多肽,其特征在于,所述递送载剂是病毒颗粒。
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