CN111455036A - 适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法 - Google Patents

适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。该建库方法针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计针对全长扩增子的特殊结构的通用引物，并通过扩增反应获得具有特异粘性末端的PCR产物，然后连接具有相同粘性末端的测序接头，完成PacBio测序平台的文库构建。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与酶切连接，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，提升了工作效率，降低测序成本。

Description

适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及 测序方法
技术领域
本发明涉及高通量测序文库构建技术领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、所使用的通用引物及基于该建库方法的全长扩增子测序方法。
背景技术
扩增子(amplicon)为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段，更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。
扩增子测序主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及目标区域扩增子测序等。16S/18S rDNA包含可变区和保守区，原核微生物的16S rDNA基因长度约为1500bp，真核微生物18S rDNA基因长度约为1500-2000bp。保守区在菌种间差异不大，可反映物种间的亲缘关系，高变区具有属或种的特异性，根据物种亲缘关系不同而有一定的差异。因此16S/18S rDNA成为了国际公认的微生物系统发育和分类鉴定的指标。ITSl是位于真核生物的18S rRNA和5.8S rRNA之间的内转录区域，ITS2位于真核生物的5.8S rRNA和28S rRNA之间的内转录区域。由于进化相对于18S rRNA、5.8S rRNA和28SrRNA迅速而具多态性，因而适合于等级水平较低的系统学研宄。根据保守区序列设计引物，将其扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的真菌种类，是目前非常常见的分析真菌方法。
传统16S/18S扩增子测序仅针对16S/18S rDNA的单个或连续的两到三个可变区进行测序与分析，而基于三代测序平台PacBio的全长16S/18S扩增子测序可轻松读取微生物16S/18S rDNA全长序列，突破了二代测序读长较短的局限性，提高了菌株在种水平的分辨能力，真正精确到“种”的分类鉴定。全长扩增子测序获得全部变异区域序列信息不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更加真实的还原样本中微生物的群落结构。
微生物核糖体小亚基SSU rRNA可变区的测序分析方法被广泛应用于环境微生物多样的研究，16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因也是进行系统发育和分类研究时最常用的分子标记物。近年来，随着高通量测序技术及数据分析方法的不断进步，大量基于扩增子测序技术的研究在微生物生态学中得到了迅速的发展。但限于Illumina平台的短片段测序长度的限制，基于该平台对部分高变区的测序分析很难将物种精确鉴定到属以下的分类水平。
基于PacBio SMRT单分子测序技术的超长读长优势，开发了覆盖全长核糖体小亚基16S rRNA基因、18S rRNA基因和ITS基因的高通量测序分析技术，解决了Illumina平台短读长的只能针对部分可变区进行分析的技术难题，在最优成本的基础上，实现了菌群分类的精准鉴定。与此同时，基于CCS Reads的原始错误矫正，可获取精确度在99％以上的全长序列。16S rDNA是编码细菌核糖体小亚基的DNA序列，分子大小约1540bp，由9个可变区和10个保守区交叉排列组成。保守区能反映物种间亲缘关系，可变区在不同菌种间存在差异。根据保守区序列设计引物，将可变区扩增出来进行测序，通过测序数据与相应数据库的比对，即可确定微生物在进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的细菌种类。研宄表明，V4靶基因区域(约300bp)对微生物进行分类较为准确。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法，该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与酶切连接，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程，提升了工作效率，降低了测序成本。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的是提出一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，针对单个样本包括：
(1)上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、上游标签序列、全长扩增子F端通用引物；
(2)下游通用引物，所述下游通用引物包括按照按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、下游标签序列、全长扩增子R端通用引物；
所述全长扩增子F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，所述全长扩增子R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合；所述上游标签序列与下游标签序列反向互补。
进一步地，所述酶切位点序列为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶酶切序列。
进一步地，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，包括以下步骤：
(1)以上述任一项所述的用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物为引物分别扩增各个样本全长目标片段；各个样本对应的标签序列各不相同；各个样本对应引物的酶切位点序列相同；各个样本对应引物的全长扩增子F端通用引物相同、全长扩增子R端通用引物相同
(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；
(3)混合扩增产物经限制性内切酶酶切获得两端具有特异性粘性末端的酶切产物；所述限制性内切酶为提供上述上游通用引物、下游通用引物中酶切位点的酶；
(4)酶切产物连接哑铃型测序接头获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库；所述哑铃型测序接头包括5’端的粘性末端序列和哑铃型颈环结构的接头序列，所述粘性末端序列与酶切产物的酶切粘性末端序列反向互补，所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配。
进一步地，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。
进一步地，混合扩增产物总量大于或等于2μg。
进一步地，所述步骤(3)的限制性内切酶为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶，且无星号活性。
进一步地，酶切产物连接测序接头后依次进行外切酶消化、纯化获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。
进一步地，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。
本发明的第三个目的是提出一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，包括采用上述任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计出一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法及引物，通过该方法建库，仅需在常规扩增后进行酶切反应，获得具有特异粘性末端的PCR产物，然后设计具有相同粘性末端的测序接头，通过连接反应即可实现测序接头的添加，完成PacBio测序平台的文库构建。该方法将原有的PacBio标准建库流程优化为仅需一步扩增与酶切连接，极大的简化了全长扩增子的文库构建流程。
(2)本发明的建库方法仅需要3个小时即可完成文库的构建，原官方流程建库需要10个小时左右，极大的提高了建库效率。
(3)本发明的建库方法成本在100元以内即可实现文库的构建，使用官方流程进行建库，成本在1000元以上，极大的节约成本。
附图说明
图1为适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法流程图。
图2为全长扩增子通用引物结构示意图。
图3为本专利哑铃型粘性末端测序接头结构示意图。
图4为构建的适用于PacBio平台的18S全长扩增子文库大小分布结果示意图。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
全长扩增子测序主要包括针对细菌样本的16S全长测序、针对真菌样本的18S全长测序、针对真核生物的ITS全长测序及目标区域扩增子测序等。本发明的建库方法针对全长扩增子测序需要进行PCR的特性，结合PacBio测序平台的哑铃型文库接头结构，设计了具有酶切位点序列的扩增子引物与具有与酶切粘性末端序列匹配的哑铃型引物，仅需在常规扩增后进行酶切反应，获得具有特异粘性末端的PCR产物，然后通过连接反应即实现测序接头的添加，完成PacBio测序平台的文库构建，其技术流程如图1所示。
针对单个样本，本专利的全长扩增子引物包括上、下游通用引物，结构如图2所示，每条引物包括按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、标签序列、全长扩增子通用引物。其中酶切位点序列提供酶切位点，在后续建库过程中的内切酶酶切后可以获得粘性末端；标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列，针对多个样本，混样时需确保每个样本对应的标签序列是唯一无重复的，同一对引物的标签序列反向互补；全长扩增子通用引物序列可以与扩增子的目的片段结合，扩增获得全长扩增子的目的片段。
在一些实施方式中，酶切位点序列为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶酶切序列。
本专利的哑铃型测序接头包括5’端的粘性末端序列和哑铃型颈环结构的接头序列，其中粘性末端序列与酶切产物的酶切粘性末端序列反向互补，哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配。
实施例1：
针对全长18S全长测序，一个实施例的具体操作流程如下：
一、扩增各个样本全长目标片段
1、人工合成带barcode标签序列与通用结合序列的PCR通用引物
针对12个真菌样本(来源于酒糟发酵液残渣)的全长18S的DNA样本，共合成了24条PCR引物，它们的DNA序列如下：
SEQ ID No.1，NS1F-1-T：gcggccgcatcgctctcatgtctagtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.2，NS1F-2-T：gcggccgcacgatgtatctacgcagtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.3，NS1F-3-T：gcggccgctcgatacgcactcgatgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.4，NS1F-4-T：gcggccgccacgacacgacgatgtgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.5，NS1F-5-T：gcggccgcctgcagctcactactagtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.6，NS1F-6-T：gcggccgcctatatgagacgagtggtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.7，NS1F-7-T：gcggccgcctctcgtagacagatagtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.8，NS1F-8-T：gcggccgccgcatgacacgtgtgtgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.9，NS1F-9-T：gcggccgccacatactactactgagtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.10，NS1F-10-T：gcggccgcagtcagatgcgcactcgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.11，NS1F-11-T：gcggccgcagcgacgcgagagtgcgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.12，NS1F-12-T：gcggccgcatacactcatgtgcacgtagtcatatgcttgtctc
SEQ ID No.13，NS8R-1-T：gcggccgctagacatgagagcgattccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.14，NS8R-2-T：gcggccgctgcgtagatacatcgttccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.15，NS8R-3-T：gcggccgcatcgagtgcgtatcgatccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.16，NS8R-4-T：gcggccgcacatcgtcgtgtcgtgtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.17，NS8R-5-T：gcggccgctagtagtgagctgcagtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.18，NS8R-6-T：gcggccgccactcgtctcatatagtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.19，NS8R-7-T：gcggccgctatctgtctacgagagtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.20，NS8R-8-T：gcggccgcacacacgtgtcatgcgtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.21，NS8R-9-T：gcggccgctcagtagtagtatgtgtccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.22，NS8R-10-T：gcggccgcgagtgcgcatctgacttccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.23，NS8R-11-T：gcggccgcgcactctcgcgtcgcttccgcaggttcacctacgga
SEQ ID No.24，NS8R-12-T：gcggccgcgtgcacatgagtgtattccgcaggttcacctacgga
其中，引物的前8bp为酶切位点序列，本次实施例使用的酶切位点为Not I酶切序列，该序列可以替换为其余的六碱基及以上的限制性内切酶，Not I的酶切位点序列为GC^GGCCGC；位于NS1F命名的引物的末端19bp碱基为全长18S扩增的F端通用引物，序列为GTAGTCATATGCTTGTCTC，位于NS8R命名的引物的末端20bp碱基为全长18S扩增的R端通用引物，序列为TCCGCAGGTTCACCTACGGA；中间的16bp为barcode标签序列。
设计好的引物可以在引物合成公司进行合成，如上海生工等。
2、PCR扩增各个样本全长目标片段
使用本专利设计的引物进行各个样本全长扩增子的扩增。每个样本使用一对相同编号引物，如样本1使用NS1F-1-T与NS8R-1-T引物。反应体系如表1所示：
表1
Figure BDA0002444320580000081
按照表1的反应体系将试剂充分混匀，瞬时离心，按照如下的PCR条件进行PCR扩增；
Figure BDA0002444320580000091
反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用11μL洗脱缓冲液，洗脱。
取1μL纯化产物，使用无核酸酶水稀释10倍，取2μL稀释液进行Qubit定量，确定PCR产物的浓度与总量；取1μL稀释液进行安捷伦2100检测，确定片段的大小分布。
二、12个样本的扩增产物混样
1、根据Qubit定量结果与安捷伦2100检测结果，按照期望的数据产出进行等比例的混样(按照最终需要测序的数据量的比例作为混样的摩尔比例，一般要求每个样本数据产出一样，取等摩尔数的扩增产物进行混样)，要求混样后的总量在2ug以上。
2、涡旋混匀，瞬时离心，获得混样的全长扩增子样本。本实施例满足混样的各样本均带有不同的barcode标签序列的要求。
三、全长扩增子样本的酶切
本步骤使用的限制性内切酶要求是六碱基或以上，且要求内切酶无星号活性，这类内切酶可以基本确保除两端额外添加的酶切位点外，在其余PCR产物部分不存在酶切位点，确保在引物的两端进行酶切，获得一致的粘性末端。本实施例中使用限制性内切酶NotI酶，酶切反应体系如表2所示。
表2
Figure BDA0002444320580000101
按表2反应体系将各试剂充分混匀，瞬时离心，37℃孵育1h。
反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行1X磁珠纯化，去除酶切产生的末端小片段，最后使用40μL洗脱缓冲液洗脱，获得的酶切产物两端已经具有Not I酶切的粘性末端。
四、酶切产物连接哑铃型测序接头
通过酶切获得的酶切产物在末端具有特异性的酶切粘性末端，通过加入具有与酶切末端匹配的测序接头，在连接酶的作用下即可实现接头的连接。本实施例所采用的测序接头为哑铃型粘性末端接头，其结构如图3所示。接头序列如SEQ ID No.25所示。5’端的粘性末端序列与扩增子的3’端的酶切粘性末端序列反向互补，通过连接反应可以结合至全长扩增子的两端；哑铃型颈环结构的接头序列，为与PacBio测序仪适配的测序接头序列。
同时，由于酶切与连接反应存在一定的效率问题，需要使用外切酶III和外切酶VII将结构不完整的文库消化掉。具体实施例的操作流程如下：
1、连接反应
表3
Figure BDA0002444320580000102
Figure BDA0002444320580000111
按表3所示反应体系将各试剂混匀，瞬时离心，20℃孵育120min，置于冰上。
带粘性末端接头序列与使用限制性内切酶的酶切位点互补，在18S全长扩增子实施例中使用的接头序列为：
SEQ ID No.25：5’-ggccatctctctcaacaacaacaacggaggaggaggaaaagagagagat-3’2、外切酶消化
表4
Figure BDA0002444320580000112
按表4所示反应体系将各试剂混匀，瞬时离心，37℃孵育60min，置于冰上。
反应完成后，按照AMPure磁珠的使用说明进行磁珠纯化，最后使用20μL洗脱缓冲液洗脱，获得的适用于PacBio测序平台的哑铃型的环状文库。
五、文库质检与上机测序
取1μL文库进行Qubit定量，获得文库浓度，该文库浓度为12ng/μL；取3μL文库进行凝胶电泳检测，确定文库大小。18S全长扩增子实施例的文库进行安捷伦2100的片段大小分析，结果如图4所示，从图中可以看出，文库平均大小为1968bp，这与真核微生物18S rDNA基因长度约为1500-2000bp一致，即PCR扩增出来的DNA目的条带长度与目的基因的大小一致，文库大小也与目的基因大小相符，说明制备的文库合格。
由实施例获得的18S全长扩增子文库在PacBio Sequel II测序平台上进行混合测序，每个样本获得了5000条以上的环形一致性序列，说明文库质量合格且可获得符合测序要求的数据。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于真核微生物18S rDNA全长扩增子的建库及测序，还包括原核微生物的16S rDNA建库及测序、真核生物的ITS建库及测序、目标区域扩增子建库及测序，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉菲沙基因信息有限公司
<120> 适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法、通用引物及测序方法
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<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcat acactcatgt gcacgtagtc atatgcttgt ctc 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcta gacatgagag cgattccgca ggttcaccta cgga 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgctg cgtagataca tcgttccgca ggttcaccta cgga 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcat cgagtgcgta tcgatccgca ggttcaccta cgga 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcac atcgtcgtgt cgtgtccgca ggttcaccta cgga 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcta gtagtgagct gcagtccgca ggttcaccta cgga 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcca ctcgtctcat atagtccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcta tctgtctacg agagtccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcac acacgtgtca tgcgtccgca ggttcaccta cgga 44
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gcggccgctc agtagtagta tgtgtccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcga gtgcgcatct gacttccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcgc actctcgcgt cgcttccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcggccgcgt gcacatgagt gtattccgca ggttcaccta cgga 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggccatctct ctcaacaaca acaacggagg aggaggaaaa gagagagat 49

Claims (10)

1.一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，针对单个样本包括：
(1)上游通用引物，所述上游通用引物包括按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、上游标签序列、全长扩增子F端通用引物；
(2)下游通用引物，所述下游通用引物包括按照按照5’至3’的方向依次排列的酶切位点序列、下游标签序列、全长扩增子R端通用引物；
所述全长扩增子F端通用引物与扩增子的目的片段F端结合，所述全长扩增子R端通用引物与扩增子的目的片段R端结合；所述上游标签序列与下游标签序列反向互补。
2.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，所述酶切位点序列为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶酶切序列。
3.根据权利要求1所述的一种用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物，其特征在于，所述上游标签序列、下游标签序列用于区分不同的扩增子样本，每个标签为10～30bp的特异核苷酸序列。
4.一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以权利要求1-3任一项所述的用于PacBio平台的全长扩增子文库构建的通用引物分别扩增对应样本全长目标片段；各个样本对应的标签序列各不相同；各个样本对应引物的酶切位点序列相同；各个样本对应引物的全长扩增子F端通用引物相同、全长扩增子R端通用引物相同；
(2)将步骤(1)获取的若干个样本的扩增产物混样；
(3)混合扩增产物经限制性内切酶酶切获得两端具有特异性粘性末端的酶切产物；所述限制性内切酶为提供权利要求1-3所述酶切位点的酶；
(4)酶切产物连接哑铃型测序接头获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库；所述哑铃型测序接头包括5’端的粘性末端序列和哑铃型颈环结构的接头序列，所述粘性末端序列与酶切产物的酶切粘性末端序列反向互补，所述哑铃型颈环结构的接头序列与PacBio测序仪适配。
5.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，步骤(2)中若干个样本的扩增产物等摩尔混样。
6.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，混合扩增产物总量大于或等于2μg。
7.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，所述步骤(3)的限制性内切酶为六碱基或六碱基以上的限制性内切酶，且无星号活性。
8.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，酶切产物连接测序接头后依次进行外切酶消化、纯化获得适用于PacBio测序平台的全长扩增子文库。
9.根据权利要求4所述的一种适用于PacBio平台的全长扩增子快速建库方法，其特征在于，所述方法还包括文库质检以确定文库大小。
10.一种适用于PacBio平台的全长扩增子测序方法，其特征在于，包括采用权利要求4-9任一项所述的建库方法进行全长扩增子建库，然后采用高通量PacBio测序平台进行测序。
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