CN112176030A - 一种微生物多样性16s扩增子文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，所述构建方法为：获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。本发明主要改进三代测序的建库流程，通过将微生物16S全长的扩增产物串联处理，得到含有多个微生物16S序列的扩增子，相较于串联处理前，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本，有效CCS数提高了一倍以上，为三代全长微生物多样性在科研领域的大规模应用起到了催化作用。

Description

一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及三代测序技术领域，尤其涉及一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用。

背景技术

微生物群落结构多样性一直是现有技术研究的热点，微生物“个头小，本领强”，从人体的皮肤、口腔、胸腔、阴道到肠道、粪便，无处不在，又称为“人体第二基因组”，在人体中发挥着巨大的作用。还广泛存在于土壤、水体、发酵液、植物、空气等环境样本中，它们推动着地球物质循环，影响着人体乃至整个地球生物圈的健康。

传统研究中，是将环境样本中的微生物进行分离培养，提取已经分离培养出来的每一个纯菌的DNA，针对原核微生物的“身份证”16S rDNA区设计特异性的引物(细菌：27F和1492R)进行一代Sanger测序，通过得到的16S全长从而进行菌种鉴定，然后进行物种多样性的统计。一代测序的弊端是只能针对环境样本中可分离培养的菌进行微生物多样性的分析，不能检测出不可培养的微生物，通量低。随着高通量测序技术的发展，Illumina测序技术兴起，Illumina测序平台有读长的限制，二代微生物多样性测序一般使用PE250或PE300双端测序，因此只能针对细菌16S rDNA的某一段可变区(如16S V3+V4，16S V4+V5，16SV4，等)进行测序。提取环境样本中总的微生物DNA，设计特异性引物进行扩增，混样建库测序，可得到环境样本中可培养和不可培养微生物的物种多样性，但是通过某一两个可变区域预测物种的多样性，还是存在一定的误差，一般只能承诺注释到“属”水平。并且对引物特异性要求非常高，不同的样本以及不同的物种对不同的引物都会有偏好性。

因此，现有技术中多个公司推出Pacbio三代全长微生物多样性产品，Pacbio全长微生物多样性测序技术结合了一代Sanger测序的读长优势和Illumina测序的高通量优势，将细菌16S全长完全测通，在细菌群落结构分析中具有：覆盖度广、读长长、通量高、物种注释准，承诺注释到“种”水平，种水平注平均注释率≥60％等产品优势。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用，具体通过串联微生物16S扩增子进行建库，应用于三代测序时，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本。

第一方面，本发明提供一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，包括：

获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。

现有技术中，Pacbio测序过程中，芯片上的每个检测单元ZMW孔通常对应一个扩增子分子，本发明通过串联处理将多个微生物16S全长的扩增产物连接成一个扩增子，使得每个检测单元ZMW孔可以一次完成多个微生物16S全长分子的测序，能够有效提高单芯片混样个数，降低单个样本的检测成本。

进一步地，所述barcode序列为7-24bp的barcode序列，优选为12-18bp的barcode序列，barcode序列为测序时为每个微生物16S区域连接的条形码序列，用于和其他微生物16S区域的测序结果进行区分。

进一步地，所述串联接头序列为2-10bp串联接头序列，优选为2-8bp的串联接头序列，更优选为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的串联接头序列。正向扩增引物连接串联接头序列5’-agccgu-3’；反向扩增引物连接串联接头序列5’-acggcu-3’，二者为反向互补序列。

进一步地，所述串联处理为对于微生物的全长扩增产物先通过USER酶切处理，得到含有粘性末端的酶切产物，纯化后再通过T4连接酶对所述酶切产物进行串联、纯化得到串联产物。

本发明采用串联接头序列在微生物16S全长扩增产物中加上“U碱基”，后续通过USER酶针对“U碱基”进行酶切再通过T4连接酶进行连接可以有效防止在酶切时切掉待测序的片段，造成微生物16S片段的丢失。并且通过USER酶切处理和T4连接酶进行串联处理可以提高含有多个微生物16S全长的扩增子比例，从而更显著地提高单芯片混样个数。除此之外，本发明的串联处理流程通过采取粘性末端连接的方式有效提升串联效率，相比于平末端连接，连接效率提升30％以上

进一步地，所述USER酶切处理的反应体系为：

扩增产物2～3μg、10×CutSmart buffer 4～6μL、USER Enzyme2.5～3.5μL，余量为ddH₂O补足50μL；所述USER酶切处理的反应条件为在36～38℃下反应30～60min。

进一步地，所述获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物为对多个待测样品进行扩增得到所有微生物16S全长的扩增产物，对所有待测样品进行检测去除低质量扩增产物，所述低质量扩增产物为琼脂糖凝胶电泳结果中未出现目的条带或非特异性条带亮度超过目标条带的扩增产物。

进一步地，所述对多个待测样品进行扩增的扩增体系中使用的DNA聚合酶为KODFX Neo和

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase；所述KOD FX Neo和

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase的用量优选与所述扩增体系的体积比为0.3～0.5∶20和0.4～0.6∶20。

进一步地，所述建库包括：将所述串联产物浓缩至25～35μL进行切胶片筛并纯化，再进行DNA损伤修复、连接SMRT接头和纯化。

进一步地，所述切胶片筛为筛选长度范围2-6个微生物16S全长扩增子的串联产物。例如：使用sage science公司Blue Pippin自动切胶仪Pippin Gel Cassette(0.75％Agarose Dye-Free 40μL EM)和S1 Marker进行切胶片筛，参数设置3-10K。

进一步地，在所述建库后还包括：

对文库进行2100检测，当检测结果中文库大小的主峰在3K以上，且文库浓度>15ng/μL时，判断为合格的文库。

本发明进一步提供所述构建方法在提高三代测序效率中的应用。

本发明具备如下有益效果：本发明开发的细菌16S全长串联建库方式将多个不同的16S扩增子串联后再进行测序的方法可以得到含有多个微生物16S全长的扩增子，在进行Pacbio时，够有效提高单芯片混样个数，从而大大降低单个样品的测序成本，为三代全长微生物多样性在科研领域的大规模应用起到了催化作用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1一种微生物多样性全长16S扩增子串联测序文库的构建方法

本实施例提供一种微生物多样性全长16S扩增子串联测序文库的构建方法，具体如下：

1、微生物16S全长扩增产物的制备：

1.1微生物全长16S扩增

1.1.1在96孔PCR板里按表1配制反应体系，每个样品对应一对barcode引物，barcode引物5’末端连接有串联接头序列，具体地正向扩增引物连接串联接头序列5’-agccgu-3’；反向扩增引物连接串联接头序列5’-acggcu-3’，涡旋混匀后短暂离心，使反应液集中在反应孔的底部。

表1全长16S目标区域扩增反应体系

1.1.2将96孔PCR板置于PCR仪中，关闭热盖，运行表2中的扩增程序进行16S全长区域的扩增。

表2全长16S目标区域扩增程序

1.1.3使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit，按照说明书操作步骤对全长16S扩增产物进行定量。

1.1.4全长16S扩增产物电泳检测；

制备1.8％的琼脂糖凝胶，250bp Marker点3.5μL，取3μL PCR产物加入2μL二甲苯氰上样缓冲液，配置新的1×TAE电泳缓冲液，电压120V，45min。电泳结束后胶块置于染色液中染色20min，凝胶成像仪下观察电泳结果。如果PCR扩增未出现目的条带或者非特异性条带亮度超过目标条带则判定为样品不合格，不再进入后续建库流程。

1.2不同样品全长16S扩增产物混样；

根据Qubit浓度及样品需求数据量占总数据量的比例分别吸取不同体积的扩增产物到混样管中，全部混样完成后轻弹混匀，瞬时离心。

1.3不同样品全长16S扩增产物混样产物磁珠纯化；

(1)MagicPure Size Selection DNA Beads(实验室通用名称：全式金磁珠)室温平衡30min；

(2)将上面混样根据混样总体积加入0.8×的磁珠，吹吸10次混匀；

(3)室温孵育5min后置于磁力架上5min，直至磁珠被完全吸附，液体变澄清；

(4)吸弃上清，不要碰到磁珠；

(5)加入200μL新配制的80％乙醇清洗磁珠，室温放置30s后吸弃上清，重复此步骤一次；

(6)保持1.5mL EP管在磁力架上干燥3-10min，磁珠干燥的标准是磁珠表面由光滑变粗糙，但是不出现裂纹；

(7)取下1.5mL EP管，用100μL ddH₂O重悬磁珠，反复吹吸十次混匀，室温孵育5min；

(8)将1.5ml EP管至于磁力架上5min，至磁珠完全被吸附，液体变澄清；

(9)吸取100μL液体至新的1.5ml EP管中。

(10)使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit，按照说明书操作步骤对混样纯化产物进行定量。

2、微生物16S全长扩增产物的串联

2.1USER酶切处理；

每个反应取混样产物2.5ug，按下表配制反应体系，每个混样文库重复10个反应。轻弹混匀后PCR仪上37℃反应30min(热盖温度设置65℃)。

表3 USER酶切体系

试剂组分	体积
		混样产物	X
ddH<sub>2</sub>O	(42-X)ul
		10×CutSmart buffer	5ul
USER Enzyme	3ul
		Total	50ul

2.2USER酶切产物磁珠纯化；

(1)Agencourt AMPure XP磁珠使用前，室温旋转混匀30min，以提高核酸结合效率；

(2)将USER酶处理产物转移到新的1.5mL低吸离心管中，加入等体积ddH₂O进行稀释后再加入总体积0.8×磁珠，轻弹混匀后室温静置10min；

(3)将样品管置于磁力架上，静置5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；

(4)离心管置于磁力架上，用200ul新鲜配置的75％乙醇清洗磁珠(要求移液器垂直于孔中央吹吸，不可对着磁珠吹吸)，磁力架上静置30s，移弃上清液；

(5)重复清洗一次，第二次移弃上清后瞬时离心，置于磁力架上用10ul枪头将上清液去除干净；

(6)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥2-5min使残留乙醇挥发干净；

(7)加入25 0.1×TE，轻弹混匀，37℃金属浴孵育10min；而后磁力架上静置3min，吸取25μL洗脱液转入新的1.5mL离心管中(不要吸到磁珠)。

(8)使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit，按照说明书操作步骤对混样纯化产物进行定量。

2.3串联反应；

按照表4的顺序依次加入各反应试剂，轻弹或吹吸混匀后20℃金属浴反应60min。

表4串联反应体系

试剂组分	体积
		USER处理产物	240ul
B0202A buffer	30ul
		M0202M Enzyme	30ul
Total	300ul

2.4串联产物磁珠纯化；

(1)Agencourt AMPure XP磁珠使用前，室温旋转混匀30min，以提高核酸结合效率；

(2)往上述串联产物管中加入等体积的ddH₂O进行稀释，再加入总体积0.8×磁珠，轻弹混匀后室温静置10min；

(3)将样品管置于磁力架上，静置2-5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；

(4)离心管置于磁力架上，用200μL新鲜配置的75％乙醇清洗磁珠(要求移液器垂直于孔中央吹吸，不可对着磁珠吹吸)，磁力架上静置30s，移弃上清液；

(5)重复清洗一次，第二次移弃上清后瞬时离心，置于磁力架上用10ul枪头将上清液去除干净；

(6)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥2-5min使残留乙醇挥发干净；

(7)加入原串联产物等体积的0.1×TE，轻弹混匀，37℃金属浴孵育10min；而后磁力架上静置3min，将洗脱液转入新的1.5mL离心管中(不要吸到磁珠)；

(8)使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit，按照说明书操作步骤对混样纯化产物进行定量。

(9)使用0.5％琼脂糖凝胶电泳对串联产物进行电泳检测。电泳条件：90v，90min，5μL NEB 1kb Extend Marker，串联产物上样量100ng。

3、串联产物建库

3.1串联产物体积浓缩；

使用真空浓缩仪将串联产物浓缩至30ul，以方便后续切胶片筛步骤上样。

3.2串联产物切胶片筛

使用sage science公司Blue Pippin自动切胶仪Pippin Gel Cassette(0.75％Agarose Dye-Free 40ul EM)和S1 Marker进行切胶片筛，参数设置3-10K。

3.3切胶产物磁珠纯化；

(1)处理过的XP磁珠使用前，室温旋转混匀30min，以提高核酸结合效率；

(2)往上述切胶产物管中加入1×磁珠，轻弹混匀后室温静置10min；

(3)将样品管置于磁力架上，静置2-5min使磁珠被完全吸附到磁铁一侧，移弃上清液；

(4)离心管置于磁力架上，用200μL新鲜配置的75％乙醇清洗磁珠(要求移液器垂直于孔中央吹吸，不可对着磁珠吹吸)，磁力架上静置30s，移弃上清液；

(5)重复清洗一次，第二次移弃上清后瞬时离心，置于磁力架上用10μL枪头将上清液去除干净；

(6)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥2-5min使残留乙醇挥发干净；

(7)加入40ul的Elution Buffer，轻弹混匀，37℃金属浴孵育10min；而后磁力架上静置3min，将洗脱液转入新的1.5ml离心管中(不要吸到磁珠)；

(8)使用ExKubit dsDNA HS Assay Kit，按照说明书操作步骤对混样纯化产物进行定量。

3.4DNA损伤修复；

(1)取一新的0.2mL低吸PCR管，加入如表5所示试剂：

表5 DNA损伤修复体系

(2)吹吸10-15次混匀，瞬时离心；

(3)37℃孵育30min，4℃保存，反应完成后，置于冰上，待下一步反应。

3.5末端修复及3’端加A；

(1)向上步反应体系中加入如表6所示试剂：

表6末端修复体系

(2)吹吸10-15次混匀，瞬时离心；

(3)在PCR仪上运行以下程序：

20℃ 30min

65℃ 30min

4℃ ∞。

3.6连接SMRT接头；

(1)向上步产物的0.2mL离心管中加入下表中试剂：

表7 SMRT接头连接体系

(2)吹吸10-15次混匀，瞬时离心，平均分至2个0.2mL离心管中，每管47.5μL；

(3)20℃孵育60min，4℃暂时保存。

3.7SMRT文库纯化；

(1)处理好的AMPure PB XP磁珠提前取出，室温旋转混匀30min备用；

(2)将连接接头后的文库导入一新的1.5mL低吸离心管中；

(3)加入0.8X(77.6μL)体积的

PB磁珠，充分混匀，瞬时离心；

(4)室温孵育10min；

(5)瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清(约2min)；

(6)弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加入200μL新配置的75％乙醇，静置30s；

(7)弃上清，重复漂洗一次；

(8)弃尽上清，室温干燥30s；

(9)加入12μL EB，轻弹混匀，室温放置10-15min；

(10)置于磁力架上2min，转移上清液(11μL)至新的1.5mL低吸离心管。

3.8SMRT文库质检；

取1μL文库，EB稀释5倍，取2μL稀释液进行Qubit定量，计算文库浓度；取1μL稀释液进行2100检测，确定文库大小。

文库合格标准：

1、文库大小：2100结果主峰在3K以上；

2、文库浓度：浓度>15ng/μL。

对比例1

本对比例与实施例1的区别是在建库过程中使用不含串联接头序列的扩增引物进行16S全长进行扩增；未对微生物全长16S扩增子进行USER酶切和串联反应，即省去第2步骤微生物16S全长扩增产物的串联至3.3的步骤，以及省去切胶片筛的步骤。

本发明对比实施例1和对比文件1的建库效果如下：

表8实施例1和对比例1的效果对比

指标类型	实施例一统计结果	对比例一统计结果
			总产出碱基数(G)	287.45	178.34
总产出reads数	4178770	416580
			总CCS数(分割前)	1782785	2024581
总CCS数(分割后)	3825655	—
			有效CCS数(识别barcode)	3710885	1788986
有效CCS占比	97.0％	88.4％

从表中可以看出，实施例一有效产出CCS Reads数(CCS Reads即CircularConsensus Sequence Reads，The consensus sequence resulting from alignmentbetween subreads taken from a single ZMW)是对比例一的207.4％，单cell有效产出大幅提升。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京百迈客生物科技有限公司

<120> 一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法及其应用

<130> KHP201115322.7

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agccgu 6

<210> 3

<211> 6

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acggcu 6

Claims (10)

1.一种微生物多样性16S扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括：

获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物，所述扩增产物的5’端连接有barcode序列和串联接头序列；依据所述串联接头序列对所述扩增产物进行串联处理，对串联产物进行建库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述barcode序列为7-24bp的barcode序列，优选为12-18bp的barcode序列，和/或，所述串联接头序列为2-10bp串联接头序列，优选为2-8bp的串联接头序列，更优选为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的串联接头序列。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述串联处理为对于微生物的全长扩增产物先通过USER酶切处理，得到含有粘性末端的酶切产物，纯化后再通过T4连接酶对所述酶切产物进行串联、纯化得到串联产物。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述USER酶切处理的反应体系为：

扩增产物2～3μg、10×CutSmart buffer 4～6μL、USER Enzyme 2.5～3.5μL，余量为ddH₂O补足50μL，和/或，

所述USER酶切处理的反应条件为在36～38℃下反应30～60min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述获得待测样品中所有微生物16S全长的扩增产物为对多个待测样品进行扩增得到所有微生物16S全长的扩增产物，对所有待测样品进行检测去除低质量扩增产物，所述低质量扩增产物为琼脂糖凝胶电泳结果中未出现目的条带或非特异性条带亮度超过目标条带的扩增产物。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述对多个待测样品进行扩增的扩增体系中使用的DNA聚合酶为KOD FX Neo和

Hot Start High-Fidelity DNAPolymerase；所述KOD FX Neo和

Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase的用量优选与所述扩增体系的体积比为0.3～0.5∶20和0.4～0.6∶20。

7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述建库包括：将所述串联产物浓缩至25～35μL进行切胶片筛并纯化，再进行DNA损伤修复、连接SMRT接头和纯化。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述切胶片筛为筛选长度范围在2-6个微生物16S全长的串联产物。

9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法，其特征在于，在所述建库后还包括：

对文库进行2100检测，当检测结果中文库大小的主峰在3K以上，且文库浓度>15ng/μL时，判断为合格的文库。

10.权利要求1-9任一项所述的构建方法在提高三代测序效率中的应用。