JPWO2005028645A1 - MDR1遺伝子の5’制御領域におけるSNPs - Google Patents
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Abstract
頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送するABCトランスポーター、P−gpに注目し、P−gpをコードするMDR1遺伝子の5’上流調節領域を標的としたMDR1遺伝子のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法を提供するものである。MDR1遺伝子の5’上流調節領域の塩基配列において、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型に加えて、−934位及び/又は−692位の位置における多型を検出することにより、MDR1遺伝子の5’上流調節領域のハプロタイプやディプロタイプを判定する。上記多型を検出する位置は、ATG開始コドンの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示されている。ATG開始コドンは、エクソン2に位置し、転写開始サイトはこの番号方式では、−699に相当する。
Description
本発明は、MDR1(multidrug resistance 1)遺伝子の5’制御領域のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法、より詳しくは、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置におけるSNP(一塩基多型)を検出して、MDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法等に関する。
薬剤はインビボで解毒、共役され、その後細胞外に排出される。解毒システムの活性は、薬剤の薬剤動態に影響する。多くの近年の研究は、シトクロムP450s(cytochrome P450s)及びグルタチオンS−トランスフェラーゼ(glutathione S−transferase)等の解毒関連遺伝子の多型と薬剤の効能と副作用とを関連づけている(例えばRoden,D.M.and George,A.L.,Jr.The genetic basis of variability in drug responses.Nat Rev Drug Discov,1:37−44.,2002.、Evans,W.E.and Relling,M.V.Pharmacogenomics:translating functional genomics into rational therapeutics.Science,286:487−491.,1999.、Gonzalez,F.J.,Skoda,R.C.,Kimura,S.,Umeno,M.,Zanger,U.M.,Nebert,D.W.,Gelboin,H.V.,Hardwick,J.P.,and Meyer,U.A.Characterization of the common genetic defect in humans deficient in debris oquine metabolism.Nature,331:442−446.,1988.参照)。他方、薬剤の排出は、ATP結合カセット(ABC3)トランスポーターに属するタンパク質のグループに関与する(例えばKonig,J.,Nies,A.T.,Cui,Y.,Leier,I.,and Keppler,D.Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein(MRP)family:localization,substrate specificity,and MRP2−mediated drug resistance.Biochim Biophys Acta,1461:377−394.,1999.、Gottesman,M.M.,Fojo,T.,and Bates,S.E.Multidrug resistance in cancer:role of ATP−dependent transporters.Nat Rev Cancer,2:48−58.,2002.、Borst,P.,Evers,R.,Kool,M.,and Wijnholds,J.A family of drug transporters:the multidrug resistance−associated proteins.J Natl Cancer Inst,92:1295−1302.,2000.、Holland,I.B.,Cole,S.P.C.,Kuchler,K.,and Higgins,C.F.ABC proteins,from bacteria to man,p.423−443.UK:Academic Press,2003.、Wada,M.,Uchiumi,T.,and Kuwano,M.Canalicular multispecific organic anion transporter,ABCC2.In:S.Broer and C.A.Wagner(eds.),MEMBRANE TRANSPORT DISEASES−Molecular basis of inherited transport defects−,NY:Kluwer Academic/Plenum Publishers,in press,2003.、Kuwano,M.,Uchiumi,T.,Hayakawa,H.,Ono,M.,Wada,M.,Izumi,H.,and Kohno,K.The basic and clinical implications of ABC transporters,Y−box−binding protein−1(YB−1)and angiogenesis−related factors in human malignancies.Cancer Sci,94:9−14.,2003.参照)。ABCトランスポーターのメンバーである、P−糖タンパク質(P−glycoprotein)(P−gp)は、吸収される比率を制限しながら、薬剤の薬剤動態に影響を及ぼす。したがって、ABCトランスポーターの活性及び発現レベルの個体間変動は、薬剤動態の発展における重要な要素となると考えられている。
MDR1遺伝子は、細胞の細胞質表面に位置する170kDaの膜貫通タンパク質であるP−gpをコードする公知の遺伝子であり、その塩基配列も知られている。P−gpは、2つの膜貫通領域及び2つのヌクレオチド結合領域で構成されている。さまざまな標的分子の内、P−gpの発現は、抗ガン剤の広い多様性に対する細胞の耐性を引き起こす(例えばScherf,U.,Ross,D.T.,Waltham,M.,Smith,L.H.,Lee,J.K.,Tanabe,L.,Kohn,K.W.,Reinhold,W.C.,Myers,T.G.,Andrews,D.T.,Scudiero,D.A.,Eisen,M.B.,Sausville,E.A.,Pommier,Y.,Botstein,D.,Brown,P.O.,and Weinstein,J.N.A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer.Nat Genet,24:236−244.,2000.、Fojo,A.T.,Ueda,K.,Slamon,D.J.,Poplack,D.G.,Gottesman,M.M.,and Pastan,I.Expression of a multidrug−resistance gene in human tumors and tissues.Proc Natl Acad Sci USA,84:265−269.,1987.参照)。P−gpの過剰発現は、様々なガン細胞における薬剤耐性の獲得に重要な役割を果たしている。悪性のガン細胞でのMDR1遺伝子の発現は、YB−1の核転位(例えばBargou,R.C.,Jurchott,K.,Wagener,C.,Bergmann,S.,Metzner,S.,Bommert,K.,Mapara,M.Y.,Winzer,K.J.,Dietel,M.,Dorken,B.,and Royer,H.D.Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB−1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression.Nat Med,3:447−450.,1997.、Ohga,T.,Uchiumi,T.,Makino,Y.,Koike,K.,Wada,M.,Kuwano,M.,and Kohno,K.Direct involvement of the Y−box binding protein YB−1 in genotoxic stress−induced activation of the human multidrug resistance 1 gene.J Biol Chem,273:5997−6000.,1998.参照)、プロモーターの再構成(例えばHarada,T.,Nagayama,J.,Kohno,K.,Mickley,L.A.,Fojo,T.,Kuwano,M.,and Wada,M.Alu−associated interstitial deletions and chromosomal re−arrangement in 2 human multidrug−resistant cell lines.Int J Cancer,86:506−511.,2000.参照)及びMDR1プロモーターのCpG部位のメチル化状態の変異(例えばKusaba,H.,Nakayama,M.,Harada,T.,Nomoto,M.,Kohno,K.,Kuwano,M.,and Wada,M.Association of 5’CpG demethylation and altered chromatin structure in the promoter region with transcriptional activation of the multidrug resistance 1 gene in human cancer cells.Eur J Biochem,262:924−932.,1999.、Nakayama,M.,Wada,M.,Harada,T.,Nagayama,J.,Kusaba,H.,Ohshima,K.,Kozuru,M.,Komatsu,H.,Ueda,R.,and Kuwano,M.Hypomethylation status of CpG sites at the promoter region and overexpression of the human MDR1 gene in acute myeloid leukemias.Blood,92:4296−4307.,1998.、Tada,Y.,Wada,M.,Kuroiwa,K.,Kinugawa,N.,Harada,T.,Nagayama,J.,Nakagawa,M.,Naito,S.,and Kuwano,M.MDR1 gene overexpression and altered degree of methylation at the promoter region in bladder cancer during chemotherapeutic treatment.Clin Cancer Res,6:4618−4627.,2000.参照)を含む様々なメカニズムに起因している。
P−gpは腸、肝臓、腎臓、脳、胎盤等様々な臓器の正常な細胞で発現する(例えばThiebaut,F.,Tsuruo,T.,Hamada,H.,Gottesman,M.M.,Pastan,I.,and Willingham,M.C.Cellular localization of the multidrug−resistance gene product P−glycoprotein in normal human tissues.Proc Natl Acad Sci USA,84:7735−7738.,1987.、Sugawara,I.,Kataoka,I.,Morishita,Y.,Hamada,H.,Tsuruo,T.,Itoyama,S.,and Mori,S.Tissue distribution of P−glycoprotein encoded by a multidrug−resistant gene as revealed by a monoclonal antibody,MRK 16.Cancer Res,48:1926−1929.,1988.、Cordon−Cardo,C.,O’Brien,J.P.,Casals,D.,Rittman−Grauer,L.,Biedler,J.L.,Melamed,M.R.,and Bertino,J.R.Multidrug−resistance gene(P−glycoprotein)is expressed by endothelial cells at blood−brain barrier sites.Proc Natl Acad Sci USA,86:695−698.,1989.参照)。P−gpの広い基質特異性及び頂膜側の局在は、動物モデルでもヒトの体でも薬の性向(drug disposition)に決定的な役割を果たしていることを強く示唆している(例えばSchinkel,A.H.,Mayer,U.,Wagenaar,E.,Mol,C.A.,van Deemter,L.,Smit,J.J.,van der Valk,M.A.,Voordouw,A.C.,Spits,H.,van Tellingen,O.,Zijlmans,J.M.,Fibbe,W.E.,and Borst,P.Normal viability and altered pharmacokinetics in mice lacking mdr1−type(drug−transporting)P−glycoproteins.Proc Natl Acad Sci USA,94:4028−4033.,1997.、Schinkel,A.H.Pharmacological insights from P−glycoprotein knockout mice.Int J Clin Pharmacol Ther,36:9−13.,1998.、Ambudkar,S.V.,Dey,S.,Hrycyna,C.A.,Ramachandra,M.,Pastan,I.,and Gottesman,M.M.Biochemical,cellular,and pharmacological aspects of the multidrug transporter.Annu Rev Pharmacol Toxicol,39:361−398.,1999.、Watkins,P.B.The barrier function of CYP3A4 and P−glycoprotein in the small bowel.Adv Drug Deliv Rev,27:161−170.,1997.、Fromm,M.F.The influence of MDR1 polymorphisms on P−glycoprotein expression and function in humans.Adv Drug Deliv Rev,54:1295−1310.,2002.参照)。腸では、P−gpは、薬剤摂取後、薬剤の吸収に参画していると考えられている(例えばCordon−Cardo,C.,O’Brien,J.P.,Boccia,J.,Casals,D.,Bertino,J.R.,and Melamed,M.R.Expression of the multidrug resistance gene product(P−glycoprotein)in human normal and tumor tissues.J Histochem Cytochem,38:1277−1287.,1990.、Schuetz,E.G.,Schinkel,A.H.,Relling,M.V.,and Schuetz,J.D.P−glycoprotein:a major determinant of rifampicin−inducible expression of cytochrome P4503A in mice and humans.Proc Natl Acad Sci USA,93:4001−4005.,1996.、Greiner,B.,Eichelbaum,M.,Fritz,P.,Kreichgauer,H.P.,von Richter,O.,Zundler,J.,and Kroemer,H.K.The role of intestinal P−glycoprotein in the interaction of digoxin and rifampin.J Clin Invest,104:147−153.,1999.参照)。血液脳関門では、P−gpは、脳内への基質の取り込みに影響を及ぼす(例えばThiebaut,F.,Tsuruo,T.,Hamada,H.,Gottesman,M.M.,Pastan,I.,and Willingham,M.C.Cellular localization of the multidrug−resistance gene product P−glycoprotein in normal human tissues.Proc Natl Acad Sci USA,84:7735−7738.,1987.、Schumacher,U.and Mollgard,K.The multidrug−resistance P−glycoprotein(Pgp,MDR1)is an early marker of blood−brain barrier development in the microvessels of the developing human brain.Histochem Cell Biol,108:179−182.,1997.、Rao,V.V.,Dahlheimer,J.L.,Bardgett,M.E.,Snyder,A.Z.,Finch,R.A.,Sartorelli,A.C.,and Piwnica−Worms,D.Choroid plexus epithelial expression of MDR1 P glycoprotein and multidrug resistance−associated protein contribute to the blood−cerebrospinal−fluid drug−permeability barrier.Proc Natl Acad Sci USA,96:3900−3905.,1999.、Thiebaut,F.,Tsuruo,T.,Hamada,H.,Gottesman,M.M.,Pastan,I.,and Willingham,M.C.Immunohistochemical localization in normal tissues of different epitopes in the multidrug transport protein P170:evidence for localization in brain capillaries and crossreactivity of one antibody with a muscle protein.J Histochem Cytochem,37:159−164.,1989.参照)。MDR1発現レベルは、個人によって幅広く変動するため(例えばHinoshita,E.,Uchiumi,T.,Taguchi,K.,Kinukawa,N.,Tsuneyoshi,M.,Maehara,Y.,Sugimachi,K.,and Kuwano,M.Increased expression of an ATP−binding cassette superfamily transporter,multidrug resistance protein 2,in human colorectal carcinomas.Clin Cancer Res,6:2401−2407.,2000.参照)、これらの変動は、個体から個体へ、異なった薬の性向を通じて、薬剤の毒性及び薬剤の処理の有効性に、影響を及ぼす可能性が考えられている。さらに、これらの変動は、ガンの危険因子等の他の臨床的な関連性がありうる。なぜなら、本発明者ら及び他の研究者らは、近年、MDR1のマウス相同遺伝子であるmdr1aが欠損しているマウスで、ポリープの形成の抑制を観察したからである(例えばMochida,Y.,Taguchi,K.,Taniguchi,S.,Tsuneyoshi,M.,Kuwano,H.,Tsuzuki,T.,Kuwano,M.,and Wada,M.The role of P−glycoprotein in intestinal tumorgenesis:disruption of mdr1a suppresses polyp formation in ApcMin/+ mice.Carcinogenesis,24:1219−1224.,2003.、Yamada,T.,Mori,Y.,Hayashi,R.,Takada,M.,Ino,Y.,Naishiro,Y.,Kondo,T.,and Hirohashi,S.Suppression of intestinal polyposis in Mdr1−deficient ApcMin/+ mice.Cancer Res,63:895−901.,2003.参照)。しかし、分子を基盤とする、基本的な発現レベルでの個体間変異におけるメカニズムは、知られていない。
また、MDR1における遺伝的多型とP−gpレベルとの関連性が、近年報告されている(例えばHoffmeyer,S.,Burk,O.,von Richter,O.,Arnold,H.P.,Brockmoller,J.,Johne,A.,Cascorbi,I.,Gerloff,T.,Roots,I.,Eichelbaum,M.,and Brinkmann,U.Functional polymorphisms of the human multidrug−resistance gene:multiple sequence variations and correlation of one allele with P−glycoprotein expression and activity in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,97:3473−3478.,2000.、Ito,S.,Ieiri,I.,Tanabe,M.,Suzuki,A.,Higuchi,S.,and Otsubo,K.Polymorphism of the ABC transporter genes,MDR1,MRP1 and MRP2/cMOAT,in healthy Japanese subjects.Pharmacogenetics,11:175−184.,2001.参照)。Hoffmeyer et al.により、健康な白人における、コード領域に6つ含まれる15の一塩基多型(SNP)が報告されている。そのうちの1つのSNPである、c.3435C<T(エクソン26)は、腸内のP−gp発現と、P−gp基質である経口ジコキシンの取り込みとに関与していることを示唆した。しかし、日本人の被験者では、c.3435C>Tは、P−gpの胎盤での発現と関連していないことが報告されている(例えばTanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.参照)。さらに、Hoffmeyer et al.の報告とは対照的に、c.3435C>TのT対立遺伝子は、健康な日本人の被験者の十二指腸の腸細胞のMDR1 mRNA発現レベルを上昇させた(例えばNakamura,T.,Sakaeda,T.,Horinouchi,M.,Tamura,T.,Aoyama,N.,Shirakawa,T.,Matsuo,M.,Kasuga,M.,and Okumura,K.Effect of the mutation(C3435T)at exon 26 of the MDR1 gene on expression level of MDR1 messenger ribonucleic acid in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects.Clin Pharmacol Ther,71:297−303.,2002.参照)。c.3435C>Tは、アミノ酸置換を伴わないサイレント変異である。Kim et al.により、P−gp機能が、Ala893Thr及びAla893Serをそれぞれ生成し、部分的にc.3435C>Tとリンクしているエクソン21におけるSNPであるc.2677G>T、Aによって影響を受け得ることが報告されている(例えばKim,R.B.,Leake,B.F.,Choo,E.F.,Dresser,G.K.,Kubba,S.V.,Schwarz,U.I.,Taylor,A.,Xie,H.G.,McKinsey,J.,Zhou,S.,Lan,L.B.,Schuetz,J.D.,Schuetz,E.G.,and Wilkinson,G.R.Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans.Clin Pharmacol Ther,70:189−199.,2001.参照)。Tanabe et al.により、胎盤のP−gp発現レベルは、c.2677G>T、Aによって影響を受けることが報告されている(例えばTanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.参照)。したがって、c.3435C>T遺伝子型と生化学的な表現型P−gp活性との関係は、近年報告(例えばSakaeda,T.,Nakamura,T.,and Okumura,K.Pharmacogenetics of MDR1 and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs.Pharmacogenomics,4:397−410,2003.参照)されているように、明確でないように思われる。
その他、ヒトMDR1遺伝子の、cDNA配列のコード領域における位置で第2677番目の塩基がグアニンであるか、アデニン又はチミンであるかを調べて、タクロリムスやシクロスポリン等の免疫抑制剤の副作用を予測する方法(例えば特開2002−223769号公報参照)や、p53遺伝子が正常に機能しないことが関与して発生している癌において、p53遺伝子に生じた機能変化が癌の発生に関与していることを、p53遺伝子の機能変化によって影響を受けているIL−1α遺伝子、PAI−1遺伝子、MDR1遺伝子、MMP−3遺伝子等の下流遺伝子群の発現状態を測定することによって判定する疾病原因の診断方法(例えば特開2002−269号公報参照)が提案されている。
ABCトランスポータは抗ガン剤の感受性や体内動態の鍵を握る分子標的であり、その発現の個人差が生じる分子的背景を明らかにすることは個別化治療に重要である。また、多くの薬剤がP−gpの基質であるため、P−gpの発現及び活性の程度が、かかる薬剤の治療効果に直接影響を及ぼす可能性がある。薬理学的な関連性の他に、P−gp SNPの個体間変異及び発現レベルには、以下のような他の臨床的な影響も考えられる。近年、本発明者らは、マウスの結腸直腸の発ガンにおけるP−gpの役割を見い出し(Mochida,Y.,Taguchi,K.,Taniguchi,S.,Tsuneyoshi,M.,Kuwano,H.,Tsuzuki,T.,Kuwano,M.,and Wada,M.The role of P−glycoprotein in intestinal tumorgenesis:disruption of mdr1a suppresses polyp formation in Apc Min/+ mice.Carcinogenesis,24:1219−1224.,2003.、Yamada,T.,Mori,Y.,Hayashi,R.,Takada,M.,Ino,Y.,Naishiro,Y.,Kondo,T.,and Hirohashi,S.Suppression of intestinal polyposis in Mdr1−deficient ApcMin/+ mice.Cancer Res,63:895−901.,2003.参照)、ヒトMDR1の相同遺伝子であるmdr1aが欠損しているマウスは、野生型マウスと比較すると、DNAの損傷が著しく増加していることも見い出した。驚くことに、本発明者ら及び他の研究者らは、APCMinバックグラウンド下の野生型マウスと比較すると、mdr1a欠損マウスでは、ポリープの発生数が統計的に少ないことも見い出している。大腸でのP−gp発現の個体間変動は、ヒトの結腸直腸の発ガンと関連性が考えられる。ヒトMDR1遺伝子の5’制御領域のSNPは、日本人の結腸直腸粘膜及び肝臓における、MDR1 mRNA及びP−gp発現と関連性があり、このことは、MDR1のSNPと薬剤反応性との関係のさらなる分析にも、薬剤反応性の個体間変動及びガンのリスクにおけるP−gpの重要性のさらなる評価にも、スキームを提供すると考えられる。またMDR1遺伝子は、異物の排除による生体防御に関与すると考えられるので、炎症性腸疾患や、その他、異物の排除による生体防御機能の破綻により発症する病態・疾患や、細胞の生存・抗アポトーシス機能に依存する病態・疾患や、その破綻による病態・疾患の発症を予測、診断出来ると考えられる。さらに、予測、診断を超えてMDR1を標的とした薬剤開発により、上記疾患の予防と治療に展開することが可能である。本発明の課題は、頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送するABCトランスポータ、P−gpに注目し、P−gpをコードするMDR1遺伝子の5’制御領域を標的としたMDR1遺伝子のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法を提供することにある。
本発明者らは、日本人のMDR1遺伝子の転写開始部位から4kbにわたる5’制御領域(5’upstream regulatory region)のヌクレオチド配列多型を分析し、この領域内で8個の一塩基多型(SNP)を同定した(図1参照)。これら同定した8個のSNPsの内の2個(−692T>C及び−934A>G)は既知であったが、残りの6個(−1325A>G、−1717T>C、−1910T>C、−2352G>A、−2410T>C及び−2903T>C)のSNPsは未報告のものであり、その内の3個(−1910T>C、−2352G>A、−2410T>C)は完全な連鎖不均衡を示した。そして、ハプロタイプやディプロタイプと大腸正常粘膜におけるMDR1遺伝子の発現レベルとが相関することや、大腸癌患者にはMDR1遺伝子の発現レベルが低いと予想されるディプロタイプが見い出せなかったことや、逆に、MDR1遺伝子の発現レベルが高いと予想されるディプロタイプの出現頻度は一般健常者対照群に比べ、大腸癌患者疾患群において高いことや(統計解析により、MDR1が高いディプロタイプA、中間的なディプロタイプBとCそして、MDR1が低いディプロタイプDとEをまとめて解析してオッズ比を出すと、ディプロタイプAを1としたとき、ディプロタイプD,Eが半分の0.524、ディプロタイプB,Cは中間的な値の0.892を示した)、MDR1遺伝子の5’制御領域に結合する蛋白質の結合能がSNPsにより大きく変化することや、95%以上が3つのハプロタイプに収束することなどを見い出し、MDR1遺伝子の5’制御領域のSNPsが薬剤応答性及び発癌リスクを予測するマーカーとして有用であるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づき完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項1)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型に加えて、−934位及び/又は−692位の位置における多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項2)や、−2903位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1又は2記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項3)や、−2410位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項4)や、−2352位の塩基が、グアニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項5)や、−1910位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項6)や、−1717位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項7)や、−1325位の塩基が、グアニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法(請求項8)に関する。
また本発明は、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がアデニン、−692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA(請求項9)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がグアニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA(請求項10)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA(請求項11)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA(請求項12)に関する。
さらに本発明は、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型を検出するMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプを判定する方法に用いられるプライマーセットであって、多型を検出する位置の上流の領域とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、多型を検出する位置の下流の領域とハイブリダイズするリバース側プライマーとからなることを特徴とするプライマーセット(請求項13)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2352位の位置と、−2410位、−1910位、−692位から選ばれる位置とにおける多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法(請求項14)に関する。
また本発明は、TaqMan(登録商標)法により遺伝子タイピングを実施することを特徴とする請求項14記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法(請求項15)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2352位の位置と、−2410位、−1910位、−692位から選ばれる位置とにおける多型を検出するMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられるプローブ及びプライマーセット(請求項16)や、TaqMan(登録商標)法によりMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられることを特徴とする請求項16記載のプローブ及びプライマーセット(請求項17)や、請求項1〜8のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法又は請求項14若しくは15記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法を用いることを特徴とする大腸癌発症の予測方法(請求項18)や、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位、−934位、−692位から選ばれる1以上の位置を標的とすることを特徴とするMDR1発現制御薬の開発方法(請求項19)に関する。
A:5’制御領域で5つの多型(−2410、−2352、−1910、−934及び−692)を分析し、MDR1 mRNAレベルを72の正常な直腸結腸粘膜で、リアルタイムPCRにより測定した。72のサンプルは、ディプロタイプにより分けた:ディプロタイプA(ハプロタイプ1/1)、ディプロタイプB(ハプロタイプ1/2)、ディプロタイプC(ハプロタイプ1/3)、ディプロタイプD(ハプロタイプ2/2)。MDR1 mRNAレベルは、GAPDH mRNAレベルでノーマライズした。
B:5’制御領域で5つの多型(−2410、−2352、−1910、−934及び−692)を分析し、MDR1 mRNAレベルを、43の正常な肝臓組織で測定した。第3図は、JSB−1抗体による、P−gpの免疫組織学的染色の結果をを示す図である。
P−gpの陽性染色は、上皮領域の表面の頂膜側組織で観察した。塗りつぶした矢頭は、抗P−gp抗体(JSB−1)により染色されたP−gpを示す。各サンプルのMDR1 mRNAレベルの値が示されている。第4図は、電気泳動度シフトアッセイによる、MDR1遺伝子の5’調節領域に結合するタンパク質の検出結果を示す図である。
実験は、3回ずつ行い、同様の結果を得た。図4中、NEは核抽出物を示す。
結合緩衝液B(−2352G>A;パネルA)又は結合緩衝液A(−692T>C;パネルB)中で32P標識オリゴヌクレオチドとインキュベートした核抽出物(1−2μgのタンパク質)は、ゲル電気泳動により分別した。コンペティション用に、10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチド(−2352G又は−2352A)を追加した。塗りつぶした矢頭は、遅延したDNAタンパク質複合体を示し、アステリックスは、核タンパク質の非特異結合を示す。
本発明のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法としては、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる1又は2以上の位置における多型を検出する方法であれば特に制限されるものではないが、上記−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置に加えて、−934位及び/又は−692位の位置における多型を検出する方法が好ましく、中でも−2410位、−2352位、−1910位、−934位及び−692位の位置における多型を検出する方法が好ましい。ここで、多型を検出する位置は、ATG開始コドンの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示されている。ATG開始コドンは、エクソン2に位置し、転写開始サイトはこの番号方式では、−699に相当する。なお、遺伝子タイピング実験により得られるデータは直接的にはディプロタイプであるが、ディプロタイプから逆にハプロタイプを予測することは可能である。発現レベルや発がんリスクとの相関解析は何れもディプロタイプとの相関を解析しており、また、TaqMan(登録商標)法による遺伝子タイピングで得られるデータもディプロタイプである。また、配列番号1には、MDR1遺伝子の5’制御領域の相補配列(MDR1遺伝子領域からみて相補配列情報であるGenBank accession nos.gi|19697556|gb|AC002457.2|の一部)が示されている。したがって、例えば、配列番号1の2410番目の塩基“A”と塩基対を形成する相補的塩基“T”が、上記−2410位の塩基であることがわかる。
上記−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位、−1325位、−934位及び−692位から選ばれる位置(以下、「所定の変異位置」ということがある。)における多型を検出する方法として、具体的には、−2903位の塩基がチミン又はシトシンであるか、−2410位の塩基がチミン又はシトシンであるか、−2352位の塩基がグアニン又はアデニンであるか、−1910位の塩基がチミン又はシトシンであるか、−1717位の塩基がチミン又はシトシンであるか、−1325位の塩基がアデニン又はグアニンであるか、−934位の塩基がアデニン又はグアニンであるか、−692位の塩基がチミン又はシトシンであるかをそれぞれ調べる方法を例示することができる。なお、配列番号1には、−2903位の塩基がチミン、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がグアニン、−1910位の塩基がチミン、−1717位の塩基がチミン、−1325位の塩基がアデニン、−934位の塩基がアデニン、−692位の塩基がチミンである通常のMDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列の相補的塩基配列が示されている。
所定の変異位置における多型を検出する方法として、PCR、リガンドストリングス反応、制限酵素消化法、直接塩基配列決定法、核酸増幅技法、ハイブリダイゼーション技法、免疫アッセイ法、質量分析法等を用いる従来公知のSNPを検出しうる方法であれば特に制限されず、例えば、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列は既にわかっていることから(配列番号1参照)、後述する表1に示すような所定の変異位置(多型を検出する位置)の上流の領域とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、所定の変異位置の下流の領域とハイブリダイズするリバース側プライマーとからなるプライマーセット(配列番号2〜25)を用いて、PCR等の公知の核酸増幅法により増幅し、その増幅断片の塩基配列を決定するダイレクトシーケンシングする方法、TaqMan(登録商標)プローブを用いる方法や、増幅断片の制限酵素断片長多型(RFLP)を調べる方法や、SSCP(single−strand conformation polymorphism)のような方法の他、ASOハイブリダイゼーション、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、インベーダー法、MALDI−TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップ又はDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ECA法によっても行うことができる。上記プライマーはMDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズするサイズを有していればよく、通常、15塩基〜40塩基、好ましくは20塩基程度のサイズを有するものが用いられ、増幅領域のサイズも特に限定されるものではない。また、PCRの鋳型となるゲノムDNAは、MDR1発現の有無に拘わらず、抹消血、毛根、口腔粘膜、血液塗抹標本など、生細胞や死細胞が含まれる試料から、常法により調製することができる。
MDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプやディプロタイプの判定は、すべての所定の変異位置における多型を検出して判定してもよいが、一部の所定の変異位置における多型を検出して判定してもよい。例えば、マイナー対立遺伝子の頻度がある程度−2410位、−2352位、−1910位、−934位及び−692位の各位置における多型を検出した場合、ハプロタイプやディプロタイプを集約することができる。
本発明のMDR1遺伝子の5’制御領域DNAとしては、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がアデニン、−692位の塩基がチミンに置換されているDNAや、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がグアニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されているDNAや、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されているDNAや、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がチミンに置換されているDNAを挙げることができる。これらDNAは、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がグアニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がアデニン、−692位の塩基がチミンに置換されているDNAと共に、MDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプを構成する。
本発明のプライマーセットとしては、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型を検出するMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプを判定する方法に用いられるプライマーセットであって、多型を検出する位置の上流の領域とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、多型を検出する位置の下流の領域とハイブリダイズするリバース側プライマーとからなり、これら各プライマーはMDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダイズするサイズを有していればよく、通常、15塩基〜40塩基、好ましくは20塩基程度のサイズを有するものが用いられ、増幅領域のサイズも特に限定されないが、例えば、表1記載に示される、−2410位における多型を検出するP5F/R(配列番号10と11)、−2352位における多型を検出するP6F/R(配列番号12と13)、−1910位における多型を検出するP7F/R(配列番号14と15)、−1717位における多型を検出するP8F/R(配列番号16と17)、及び−1325位における多型を検出するP9F/R(配列番号18と19)の各プライマーセットを具体的に例示することができる。
また、本発明のMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法としては、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2352位の位置と、−2410位、−1910位、−692位から選ばれる位置とにおける多型を検出する方法であれば特に制限されず、後述する実施例12の表3に示すように、−2410T(C)、−1910T(C)及び−692T(C)は連鎖不平衡のために、ほとんどの場合、各クローンで一緒に検出されるが、−2352位G(A)は独立していることから、−2352位と−2410位との位置とにおける多型を検出する方法、−2352位と−1910位との位置とにおける多型を検出する方法、−2352位と−692位との位置とにおける多型を検出する方法を具体的に挙げることができる。例えば、−2352位G(A)と−692位T(C)との位置とにおける多型を検出し、(−2352位,−692位/−2352位,−692位)が、(G,T/G,T)、(G,T/A,T)、(G,T/G,C)、(A,T/A,T)、(G,C/G,C)等のディプロタイプに判定・分類することができる。かかるMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法には、TaqMan法により遺伝子タイピングを実施する方法を有利に例示することができる。TaqMan法により遺伝子タイピングを実施する際に用いられるプローブ及びプライマーセットとしては、−2352タイピング用には配列番号61に示されるG検出用プローブ、配列番号62に示されるA検出用プローブ、配列番号63及び64に示されるプライマーセット、−692タイピング用には配列番号69に示されるT検出用プローブ、配列番号70に示されるC検出用プローブ、配列番号71及び72に示されるプライマーセットを好適に例示することができる。
前記のように、MDR1遺伝子の発現レベルが高いと予想されるディプロタイプの出現頻度は一般健常者対照群に比べ、大腸癌患者疾患群において高い(統計解析により、MDR1遺伝子の発現が高いディプロタイプA、中間的なディプロタイプBとC、そして、MDR1が低いディプロタイプDとEをまとめて解析してオッズ比を出すと、ディプロタイプAを1としたとき、ディプロタイプD,Eが半分の0.524、ディプロタイプB,Cは中間的な値の0.892を示した)ことから、上記本発明のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法や、MDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法を用いると、大腸癌発症の予測が可能となる。また、MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位、−934位、−692位から選ばれる1以上の位置を標的とするMDR1発現制御薬の開発が可能となる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
(ボランティアと患者)
血液サンプルは、九州大学の25人の健康な日本人のボランティアから入手した。正常な結腸直腸粘膜の臨床サンプルは、1993年9月から1998年8月の間に、九州大学病院第二外科(福岡県)、大腸肛門病センター高野病院(熊本県)又は群馬大学病院第一外科(前橋市)でガンの外科的切除を受けた72人の日本人の患者から入手した。これらの血液サンプル及び非ガン性粘膜は、倫理審査委員会(IRB)承認のプロトコルに準じて入手した。被験者は全員、インフォームドコンセントに同意している。サンプルは、液体窒素内で冷凍し、RNA及びDNAを抽出するまで−80℃で保存した。どの患者も、外科的切除まで化学療法を受けていなかった。正常な肝臓組織の臨床サンプルは、九州大学病院第二外科(福岡県)で、ガンの外科的切除を受けた43人の肝臓ガン患者の、ガンの周囲の非ガン性組織とした。
血液サンプルは、九州大学の25人の健康な日本人のボランティアから入手した。正常な結腸直腸粘膜の臨床サンプルは、1993年9月から1998年8月の間に、九州大学病院第二外科(福岡県)、大腸肛門病センター高野病院(熊本県)又は群馬大学病院第一外科(前橋市)でガンの外科的切除を受けた72人の日本人の患者から入手した。これらの血液サンプル及び非ガン性粘膜は、倫理審査委員会(IRB)承認のプロトコルに準じて入手した。被験者は全員、インフォームドコンセントに同意している。サンプルは、液体窒素内で冷凍し、RNA及びDNAを抽出するまで−80℃で保存した。どの患者も、外科的切除まで化学療法を受けていなかった。正常な肝臓組織の臨床サンプルは、九州大学病院第二外科(福岡県)で、ガンの外科的切除を受けた43人の肝臓ガン患者の、ガンの周囲の非ガン性組織とした。
(DNA及びRNAの単離)
ボランティアの血液サンプルのゲノムDNAは、QiaAmp blood kit(Qiagen社製)を使用して単離し、患者の組織のDNAは、Easy DNA Kit(Invitrogen社製)を製造者のプロトコルに従って使用して単離した。RNAは、RNA抽出剤であるTRIzol(Invitrogen Life Technologies社製)又はRneasy(Qiagen社製)をそれぞれ製造者のプロトコルに従って使用して単離した。
ボランティアの血液サンプルのゲノムDNAは、QiaAmp blood kit(Qiagen社製)を使用して単離し、患者の組織のDNAは、Easy DNA Kit(Invitrogen社製)を製造者のプロトコルに従って使用して単離した。RNAは、RNA抽出剤であるTRIzol(Invitrogen Life Technologies社製)又はRneasy(Qiagen社製)をそれぞれ製造者のプロトコルに従って使用して単離した。
(DNAシーケンシング及びMDR1遺伝子におけるSNPの同定)
MDR1遺伝子断片のPCR増幅用の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の配列から派生させた[GenBank accession nos.:5’制御領域、エクソン1−7にはAC002457及びエクソン8−28にはAC005068]。エクソン内のSNPの位置は、ATG開始コドンの最初の塩基が+1にセットされたMDR1 cDNA[GenBank accession no.:M14758、エクソン10のコドンTTC、F335はこの配列で欠如している]の位置に相当する。Chen et al.によりエクソンが定義され(Chen,C.J.,Clark,D.,Ueda,K.,Pastan,I.,Gottesman,M.M.,and Roninson,I.B.Genomic organization of the human multidrug resistance(MDR1)gene and origin of P−glycoproteins.J Biol Chem,265:506−514.,1990)、ヒトゲノム機能(Human Genome Organisation)推薦の命名法(Antonarakis,S.E.Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations.Nomenclature Working Group.Hum Mutat,11:1−3.,1998)をSNP命名法に使用した。プライマーは、以前に報告されているSNPを含む配列を含む領域を増幅するか、又は表1に示すようにMDR1上流調節領域の約4kbをカバーするように、設定した。これらのプライマーのPCRの条件は、本発明者らに依頼すれば入手できる。精製したPCR断片の配列は、BigDye Terminator cycle sequencing reactions(Perkin−Elmer社製)を使用して、ABI3700(毛細血管)シークエンサーで、自動DNAシーケンシングにより入手した。
MDR1遺伝子断片のPCR増幅用の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、既知の配列から派生させた[GenBank accession nos.:5’制御領域、エクソン1−7にはAC002457及びエクソン8−28にはAC005068]。エクソン内のSNPの位置は、ATG開始コドンの最初の塩基が+1にセットされたMDR1 cDNA[GenBank accession no.:M14758、エクソン10のコドンTTC、F335はこの配列で欠如している]の位置に相当する。Chen et al.によりエクソンが定義され(Chen,C.J.,Clark,D.,Ueda,K.,Pastan,I.,Gottesman,M.M.,and Roninson,I.B.Genomic organization of the human multidrug resistance(MDR1)gene and origin of P−glycoproteins.J Biol Chem,265:506−514.,1990)、ヒトゲノム機能(Human Genome Organisation)推薦の命名法(Antonarakis,S.E.Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations.Nomenclature Working Group.Hum Mutat,11:1−3.,1998)をSNP命名法に使用した。プライマーは、以前に報告されているSNPを含む配列を含む領域を増幅するか、又は表1に示すようにMDR1上流調節領域の約4kbをカバーするように、設定した。これらのプライマーのPCRの条件は、本発明者らに依頼すれば入手できる。精製したPCR断片の配列は、BigDye Terminator cycle sequencing reactions(Perkin−Elmer社製)を使用して、ABI3700(毛細血管)シークエンサーで、自動DNAシーケンシングにより入手した。
(PCR増幅及びシーケンシングによる5’制御領域におけるハプロタイプの特定)
少なくとも1つのSNPの座位でヘテロ接合型である個体のハプロタイプは、フォーワードプライマーMDR1P5F及びリバースプライマーMDR1P11Rを使用して、PCR増幅及びシーケンシングにより特定した。約4kbにわたるMDR1遺伝子の5’制御領域のSNPのスクリーニングに使用した12のプライマーセットのヌクレオチド配列(配列番号2〜25)を表1に示す。製造者のプロトコルに従って高い適合性を有するDNAポリメラーゼ、KOD−Plus(東洋紡株式会社製)を使用し、PCR増幅を行った。断片は、pT7Blue−3ベクター(Novagen社製)内に挿入し、サブクローニングした。少なくとも6つのコロニーを選択し、プラスミドは、製造者のプロトコルに従ってQiagen DNA Kitで精製した。SNP部位は、シーケンシングにより分析し、ハプロタイプを確認した。
少なくとも1つのSNPの座位でヘテロ接合型である個体のハプロタイプは、フォーワードプライマーMDR1P5F及びリバースプライマーMDR1P11Rを使用して、PCR増幅及びシーケンシングにより特定した。約4kbにわたるMDR1遺伝子の5’制御領域のSNPのスクリーニングに使用した12のプライマーセットのヌクレオチド配列(配列番号2〜25)を表1に示す。製造者のプロトコルに従って高い適合性を有するDNAポリメラーゼ、KOD−Plus(東洋紡株式会社製)を使用し、PCR増幅を行った。断片は、pT7Blue−3ベクター(Novagen社製)内に挿入し、サブクローニングした。少なくとも6つのコロニーを選択し、プラスミドは、製造者のプロトコルに従ってQiagen DNA Kitで精製した。SNP部位は、シーケンシングにより分析し、ハプロタイプを確認した。
(定量的逆転写(RT)−PCR分析)
文献(Gibson,U.E.,Heid,C.A.,and Williams,P.M.A novel method for real time quantitative RT−PCR.Genome Res,6:995−1001.,1996)記載に準じて、real−time Taqman TM technology and Model 7900 Sequence Detectors(Perkin−Elmer社製)により、定量的PCRを行った。本発明で使用したプライマーの対の配列及びプローブは、文献(Hinoshita,E.,Uchiumi,T.,Taguchi,K.,Kinukawa,N.,Tsuneyoshi,M.,Maehara,Y.,Sugimachi,K.,and Kuwano,M.Increased expression of an ATP−binding cassette superfamily transporter,multidrug resistance protein 2,in human colorectal carcinomas.Clin Cancer Res,6:2401−2407.,2000.)記載の通りである。
文献(Gibson,U.E.,Heid,C.A.,and Williams,P.M.A novel method for real time quantitative RT−PCR.Genome Res,6:995−1001.,1996)記載に準じて、real−time Taqman TM technology and Model 7900 Sequence Detectors(Perkin−Elmer社製)により、定量的PCRを行った。本発明で使用したプライマーの対の配列及びプローブは、文献(Hinoshita,E.,Uchiumi,T.,Taguchi,K.,Kinukawa,N.,Tsuneyoshi,M.,Maehara,Y.,Sugimachi,K.,and Kuwano,M.Increased expression of an ATP−binding cassette superfamily transporter,multidrug resistance protein 2,in human colorectal carcinomas.Clin Cancer Res,6:2401−2407.,2000.)記載の通りである。
(MDR1の5’制御領域のルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターへのクローニング)
タイプ3の対立遺伝子を抽出するために、−2604から−570を含む断片は、ハプロタイプ1及び2のホモ接合体、並びにハプロタイプ1及び3のヘテロ接合体に相当するテンプレートから増幅した。それぞれNheI部位を含む、フォーワードプライマー5’−AAAGCTAGCTGTCAGTGGAGCAAAGAAATG−3’(配列番号26)及びリバースプライマー5’−AAAGCTAGCCTCGCGCTCCTTGGAA−3’(配列番号27)を使用した。これらの増幅後の産生物を、pGL3ベーシックベクター(Promega社製)のNheI部位に挿入した。コンストラクトのSNP部位は、シーケンシングにより確認した。
タイプ3の対立遺伝子を抽出するために、−2604から−570を含む断片は、ハプロタイプ1及び2のホモ接合体、並びにハプロタイプ1及び3のヘテロ接合体に相当するテンプレートから増幅した。それぞれNheI部位を含む、フォーワードプライマー5’−AAAGCTAGCTGTCAGTGGAGCAAAGAAATG−3’(配列番号26)及びリバースプライマー5’−AAAGCTAGCCTCGCGCTCCTTGGAA−3’(配列番号27)を使用した。これらの増幅後の産生物を、pGL3ベーシックベクター(Promega社製)のNheI部位に挿入した。コンストラクトのSNP部位は、シーケンシングにより確認した。
(細胞の培養及びトランジェント・トランスフェクション)
本発明では、ヒト肝臓ガン細胞株(HepG2)を使用した。細胞は、二酸化炭素5%を含む加湿された条件下で、37℃にて培養した。全量1μgのpGL3ベーシックベクターDNA又はレポーターコンストラクトをトランスフェクトし、製造者のプロトコルに従ってLIPOFECTAMINE 2000(Life Technologies社製)試薬を使用して、100ngのphRL−TKベクターDNA(Promega社製)を、トランスフェクションコントロールとして、全てのウェルにコトランスフェクションした。プレートは、DNA−LIPOFECTAMINE複合体を加えた後、37℃にて6時間インキュベートし、その後成長培地を交換した。プレートは、ルシフェラーゼアッセイまで、さらに24時間インキュベートした。デュアル・ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega社製)を使用して、ホタル及びウミシイタケ(renilla)のルシフェラーゼ活性を照度計で測定した。データは、トランスフェクションの効率用にウミシイタケルシフェラーゼ活性(Renilla luciferase activity)により、ノーマライズ(normalize)した。同一のトランスフェクション反応を含む、24ウェルプレートの3ウェルを使用して、全ての実験でトランスフェクションを3回行った。
本発明では、ヒト肝臓ガン細胞株(HepG2)を使用した。細胞は、二酸化炭素5%を含む加湿された条件下で、37℃にて培養した。全量1μgのpGL3ベーシックベクターDNA又はレポーターコンストラクトをトランスフェクトし、製造者のプロトコルに従ってLIPOFECTAMINE 2000(Life Technologies社製)試薬を使用して、100ngのphRL−TKベクターDNA(Promega社製)を、トランスフェクションコントロールとして、全てのウェルにコトランスフェクションした。プレートは、DNA−LIPOFECTAMINE複合体を加えた後、37℃にて6時間インキュベートし、その後成長培地を交換した。プレートは、ルシフェラーゼアッセイまで、さらに24時間インキュベートした。デュアル・ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム(Promega社製)を使用して、ホタル及びウミシイタケ(renilla)のルシフェラーゼ活性を照度計で測定した。データは、トランスフェクションの効率用にウミシイタケルシフェラーゼ活性(Renilla luciferase activity)により、ノーマライズ(normalize)した。同一のトランスフェクション反応を含む、24ウェルプレートの3ウェルを使用して、全ての実験でトランスフェクションを3回行った。
(定量的免疫組織学)
最初に使用した抗体は、P−gp(JSB−1)(マウスモノクローナル、Sanbio社製)であった。P−gpの免疫染色は、文献(32)記載に準じて行った。免疫組織学による確実な定量的検出を行うために、腸細胞で発現する追加的マーカタンパク質であるビリン(villin)を使用した。定量化には、ImageGaugeソフトウエア(富士写真フィルム株式会社製)を使用した。
最初に使用した抗体は、P−gp(JSB−1)(マウスモノクローナル、Sanbio社製)であった。P−gpの免疫染色は、文献(32)記載に準じて行った。免疫組織学による確実な定量的検出を行うために、腸細胞で発現する追加的マーカタンパク質であるビリン(villin)を使用した。定量化には、ImageGaugeソフトウエア(富士写真フィルム株式会社製)を使用した。
電気泳動度シフトアッセイ
各オリゴヌクレオチドのセンス鎖のDNA配列は、5’−AAATGAAAGGTGAGATAAAGCAACAA−3’(−2352G;配列番号28)、5’−AAATGAAAGGTGAAATAAAGCAACAA−3’(−2352A;配列番号29)、5’−GAGCTCATTCGAGTAGCGGCTCTTCC−3’(−692T;配列番号30)及び5’−GAGCTCATTCGAGCAGCGGCTCTTCC−3’(−692C;配列番号31)であった。核抽出物(タンパク質2μg/μl)は、文献(40、41)記載に準じて、HepG2細胞から調製した。次に、2μlの5x結合緩衝液;5mM DTT;10ngポリ(dI−dC);及び1×104cpm 32P標識オリゴヌクレオチドプローブを含む最終容量10μlの反応混合物中で、様々なコンペティターの存在下又は非存在下で、室温にて30分間インキュベートした。本発明者らは、5つの異なった種類の結合緩衝液で試みて、最も鮮明で遅れて現れるバンドを作成するものを特定し、それを次の研究に使用した。
各オリゴヌクレオチドのセンス鎖のDNA配列は、5’−AAATGAAAGGTGAGATAAAGCAACAA−3’(−2352G;配列番号28)、5’−AAATGAAAGGTGAAATAAAGCAACAA−3’(−2352A;配列番号29)、5’−GAGCTCATTCGAGTAGCGGCTCTTCC−3’(−692T;配列番号30)及び5’−GAGCTCATTCGAGCAGCGGCTCTTCC−3’(−692C;配列番号31)であった。核抽出物(タンパク質2μg/μl)は、文献(40、41)記載に準じて、HepG2細胞から調製した。次に、2μlの5x結合緩衝液;5mM DTT;10ngポリ(dI−dC);及び1×104cpm 32P標識オリゴヌクレオチドプローブを含む最終容量10μlの反応混合物中で、様々なコンペティターの存在下又は非存在下で、室温にて30分間インキュベートした。本発明者らは、5つの異なった種類の結合緩衝液で試みて、最も鮮明で遅れて現れるバンドを作成するものを特定し、それを次の研究に使用した。
詳細な分析に使用した5×結合緩衝液の構成は以下の通りである。緩衝液A:60mM HEPES、300mM KCl、20mM MgCl2、5mM EDTA、60%(v/v)グリセロール;緩衝液B:50mM Tris−HCl(pH7.5)、250mM NaCl、12.5mM CaCl2、5mM EDTA、40%(v/v)グリセロール。次に、サンプルを、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液(0.089M Tris、0.089Mホウ酸及び0.002M EDTA)中で、4%ポリアクリルアミドゲル(ポリアクリルアミド/ビスアクリルアミドの比率、79:1)で電気泳動した。ゲルをイメージングプレートにさらし、Fujix BAS 2000バイオイメージングアナライザー(富士フィルム写真株式会社製)を使用して分析した。
統計学的分析
Statview 5.0ソフトウエア(SAS Institute社製)を統計学的分析に使用した。MDR1 mRNAレベル対ディプロタイプの結果は、Kruskal−Wallis testで分析した。差異はp<0.05で統計的に有意であると考えられた。MDR1 mRNAレベルとP−gpレベルとの相関性は、Spearman’s testで特定した。この試験は、通常、変数が普通の分配を示すかどうか明確でない時に、ノンパラメトリック分析に使用する。0.05未満の確率値が有意とされた。Spearmanの係数(r)及び関連した確率(P)を計算した。トランスフェクション実験で、MDR1遺伝子の5’制御領域においてハプロタイプ1、2又は3を含むレポーターコンストラクトの相対的なルシフェラーゼ活性を比較するために、無対のt−検定を行った。
Statview 5.0ソフトウエア(SAS Institute社製)を統計学的分析に使用した。MDR1 mRNAレベル対ディプロタイプの結果は、Kruskal−Wallis testで分析した。差異はp<0.05で統計的に有意であると考えられた。MDR1 mRNAレベルとP−gpレベルとの相関性は、Spearman’s testで特定した。この試験は、通常、変数が普通の分配を示すかどうか明確でない時に、ノンパラメトリック分析に使用する。0.05未満の確率値が有意とされた。Spearmanの係数(r)及び関連した確率(P)を計算した。トランスフェクション実験で、MDR1遺伝子の5’制御領域においてハプロタイプ1、2又は3を含むレポーターコンストラクトの相対的なルシフェラーゼ活性を比較するために、無対のt−検定を行った。
(日本人のMDR1の5’制御領域における新しい6つのSNPの同定)
5’制御領域におけるMDR1多型を見い出すために、25人の健康な日本人のボランティアの末梢血から単離したゲノムDNAを分析した。転写開始部位から約4kb広がる上流領域は、PCRにより増幅し、ダイレクトシーケンシング(direct sequencing)により分析した。5’制御領域において、8つのSNPを同定した。その内の6つは以前に報告されていなかった。50の染色体で観察したこれらのSNPの対立遺伝子頻度(allele frequency)を表2に示す。ATG開始コドンは、エクソン2に位置し、転写開始部位は、ゲノムDNAのATGから−699に相当する。この番号方式で、SNP−692T>C及び−934A>Gは、以前に報告(Tanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.)されている−129T>C及び−41aA>Gとそれぞれ同一であった。
5’制御領域におけるMDR1多型を見い出すために、25人の健康な日本人のボランティアの末梢血から単離したゲノムDNAを分析した。転写開始部位から約4kb広がる上流領域は、PCRにより増幅し、ダイレクトシーケンシング(direct sequencing)により分析した。5’制御領域において、8つのSNPを同定した。その内の6つは以前に報告されていなかった。50の染色体で観察したこれらのSNPの対立遺伝子頻度(allele frequency)を表2に示す。ATG開始コドンは、エクソン2に位置し、転写開始部位は、ゲノムDNAのATGから−699に相当する。この番号方式で、SNP−692T>C及び−934A>Gは、以前に報告(Tanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.)されている−129T>C及び−41aA>Gとそれぞれ同一であった。
本発明者らがメジャー型と定義した本来のMDR1配列(GenBank acessesion nos.:AC002457;AC005068)からの偏差を見るために配列を検査した。5’制御領域の8個のSNP(配列番号32〜47)、他の6個のSNP(配列番号48〜60)もエクソン及びイントロンで分析した。これらの6つのSNPは、白人でも日本人でも、0.05以上の対立遺伝子頻度を有することが以前に報告されている(Hoffmeyer,S.,Burk,O.,von Richter,O.,Arnold,H.P.,Brockmoller,J.,Johne,A.,Cascorbi,I.,Gerloff,T.,Roots,I.,Eichelbaum,M.,and Brinkmann,U.Functional polymorphisms of the human multidrug−resistance gene:multiple sequence variations and correlation of one allele with P−glycoprotein expression and activity in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,97:3473−3478.,2000.、Ito,S.,Ieiri,I.,Tanabe,M.,Suzuki,A.,Higuchi,S.,and Otsubo,K.Polymorphism of the ABC transporter genes,MDR1,MRP1 and MRP2/cMOAT,in healthy Japanese subjects.Pharmacogenetics,11:175−184.,2001.及びTanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.)。本発明者らの分析により入手したこれらのSNPの対立遺伝子頻度を、表2に示す。表2中の頻度は、5’調節領域、コード領域及びイントロン領域のSNPの、25人の健康なボランティアの末梢血のゲノムDNA分析の結果から算出した。対立遺伝子頻度は、以前に報告されているサンプルのサイズから予測した範囲内であった。c.3435C>Tとc.2677G>T、Aとの強い関連性を、以前報告(Tanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.、Kim,R.B.,Leake,B.F.,Choo,E.F.,Dresser,G.K.,Kubba,S.V.,Schwarz,U.I.,Taylor,A.,Xie,H.G.,McKinsey,J.,Zhou,S.,Lan,L.B.,Schuetz,J.D.,Schuetz,E.G.,and Wilkinson,G.R.Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans.Clin Pharmacol Ther,70:189−199.,2001.)されている通りに観察した。しかし、5’制御領域とc.1236C>T、c.2677G>T、A及びc.3435C>Tを含むコード領域の多型との間には、関連性がなかった。−692T>Cとc.2677G>T、A又はc.3435C>Tとの関連性も、以前の報告(Kim,R.B.,Leake,B.F.,Choo,E.F.,Dresser,G.K.,Kubba,S.V.,Schwarz,U.I.,Taylor,A.,Xie,H.G.,McKinsey,J.,Zhou,S.,Lan,L.B.,Schuetz,J.D.,Schuetz,E.G.,and Wilkinson,G.R.Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans.Clin Pharmacol Ther,70:189−199.,2001.、Horinouchi,M.,Sakaeda,T.,Nakamura,T.,Morita,Y.,Tamura,T.,Aoyama,N.,Kasuga,M.,and Okumura,K.Significant genetic linkage of MDR1 polymorphisms at positions 3435 and 2677:functional relevance to pharmacokinetics of digoxin.Pharm Res,19:1581−1585,2002)と一致しなかった。
(日本人の5’制御領域におけるハプロタイプの特定)
調節領域におけるハプロタイプの頻度を明白に特定するために、−2410、−2352、−1910、−934及び−692でこれらの多型部位を含む2kb断片を、PCRにより増幅した。25の血液サンプルの内、これらの全ての部位のホモ接合体の分析を省略し、少なくともこれらの部位の1つにおいて、ヘテロ接合体のサンプルを使用した。pT7Blue3ベクター内に、増幅した断片をサブクローニングした後、そのヌクレオチド配列を特定した。−2903、−1717及び−1325におけるマイナー対立遺伝子の頻度が、統計学分析には低すぎた(0.02)ため、この3つの対立遺伝子を分析から除外した。頻度は、領域の対応する断片をPCR増幅及びシークエンシングにより確認した、健康な日本人ボランティアの25サンプルの遺伝子型より計算した。表3に示すように、−2410T(C)、−1910T(C)及び−692T(C)は、各クローンで一緒に検出されたが、−2352G(A)は独立していた。次に、以下の通りにハプロタイプを定義した:ハプロタイプ1(−2410T、−2352G、−1910T、−934A、−692T)、ハプロタイプ2(−2410T、−2352A,−1910T,−934A,−692T)及びハプロタイプ3(−2410C、−2352G、−1910C、−934G、−692C)。3つのハプロタイプ(ハプロタイプ1、2及び3)は、人口の95%以上を占めた。プロモーターハプロタイプは、日本人で調べたコード領域でもイントロン領域のいずれのSNPとも関連していなかった。
調節領域におけるハプロタイプの頻度を明白に特定するために、−2410、−2352、−1910、−934及び−692でこれらの多型部位を含む2kb断片を、PCRにより増幅した。25の血液サンプルの内、これらの全ての部位のホモ接合体の分析を省略し、少なくともこれらの部位の1つにおいて、ヘテロ接合体のサンプルを使用した。pT7Blue3ベクター内に、増幅した断片をサブクローニングした後、そのヌクレオチド配列を特定した。−2903、−1717及び−1325におけるマイナー対立遺伝子の頻度が、統計学分析には低すぎた(0.02)ため、この3つの対立遺伝子を分析から除外した。頻度は、領域の対応する断片をPCR増幅及びシークエンシングにより確認した、健康な日本人ボランティアの25サンプルの遺伝子型より計算した。表3に示すように、−2410T(C)、−1910T(C)及び−692T(C)は、各クローンで一緒に検出されたが、−2352G(A)は独立していた。次に、以下の通りにハプロタイプを定義した:ハプロタイプ1(−2410T、−2352G、−1910T、−934A、−692T)、ハプロタイプ2(−2410T、−2352A,−1910T,−934A,−692T)及びハプロタイプ3(−2410C、−2352G、−1910C、−934G、−692C)。3つのハプロタイプ(ハプロタイプ1、2及び3)は、人口の95%以上を占めた。プロモーターハプロタイプは、日本人で調べたコード領域でもイントロン領域のいずれのSNPとも関連していなかった。
(MDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ又はディプロタイプと日本人の大腸及び肝臓のMDR1 mRNAレベルとの関連性)
5’制御領域の5つの多型(−2410、−2352、−1910、−934及び−692)と、MDR1 mRNAレベルとの関連性を調べるために、72の正常な結腸直腸粘膜をそれぞれ検査した。72のサンプルは、ディプロタイプにより、4つのグループに分けた:ディプロタイプA(ハプロタイプ1/1)、ディプロタイプB(ハプロタイプ1/2)、ディプロタイプC(ハプロタイプ1/3)及びディプロタイプD(2/2)である。そこで、ハプロタイプ1を2つ有するディプロタイプAのMDR1 mRNAレベルの平均値が、ハプロタイプ1を有さないディプロタイプDの値より高いことを見い出した(p=0.04)(図2A)。それぞれハプロタイプ1を1つ有する、ディプロタイプB及びCのMDR1 mRNAレベルの平均値は、ディプロタイプAとDと値の中間であった。MDR1 mRNAレベルは、GAPDH mRNAレベルでノーマライズした。MDR1 mRNAレベルを正常な肝臓のサンプルで分析したところ、大腸からのサンプルと同様の結果を得た(図2B)。しかし、大腸と比較すると、関連性は、統計的にかなり低かった(p=0.2)。
5’制御領域の5つの多型(−2410、−2352、−1910、−934及び−692)と、MDR1 mRNAレベルとの関連性を調べるために、72の正常な結腸直腸粘膜をそれぞれ検査した。72のサンプルは、ディプロタイプにより、4つのグループに分けた:ディプロタイプA(ハプロタイプ1/1)、ディプロタイプB(ハプロタイプ1/2)、ディプロタイプC(ハプロタイプ1/3)及びディプロタイプD(2/2)である。そこで、ハプロタイプ1を2つ有するディプロタイプAのMDR1 mRNAレベルの平均値が、ハプロタイプ1を有さないディプロタイプDの値より高いことを見い出した(p=0.04)(図2A)。それぞれハプロタイプ1を1つ有する、ディプロタイプB及びCのMDR1 mRNAレベルの平均値は、ディプロタイプAとDと値の中間であった。MDR1 mRNAレベルは、GAPDH mRNAレベルでノーマライズした。MDR1 mRNAレベルを正常な肝臓のサンプルで分析したところ、大腸からのサンプルと同様の結果を得た(図2B)。しかし、大腸と比較すると、関連性は、統計的にかなり低かった(p=0.2)。
また、mRNAレベルとの個別の関連性を、それぞれのSNPで観察した。−692T>Cと大腸のmRNAレベルとの関連は、本発明では統計的に有意でなかったが、T/Cヘテロ接合体の方が、T/Tホモ接合体よりもmRNAレベルが低い傾向性があった(p=0.2、データは示されていない)。−2352G>Aでは、A/Aホモ接合体は、G/Gホモ接合体よりも低いmRNAレベルを示した(p=0.07)。
次に、MDR1のmRNA発現レベルとP−gp発現レベルとの相関性を確認した。各サンプルが、ウエスタンブロッティングに必要な量を入手できなかったので、JSB−1抗体を使用して免疫組織学分析法により、P−gpレベルを測定した。したがって、測定は、定量的というより半定量的であった。72のサンプルの内、14を調査し、MDR1 mRNAレベルが、P−gpレベルと有意な相関性を示すことを、Spearman’s testにより見い出した(r=0.428、p=0.01)。代表的なデータを図3に示す。
腸のP−gpレベル及び/又は機能に影響すると報告(Hoffmeyer,S.,Burk,O.,von Richter,O.,Arnold,H.P.,Brockmoller,J.,Johne,A.,Cascorbi,I.,Gerloff,T.,Roots,I.,Eichelbaum,M.,and Brinkmann,U.Functional polymorphisms of the human multidrug−resistance gene:multiple sequence variations and correlation of one allele with P−glycoprotein expression and activity in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,97:3473−3478.,2000.、Nakamura,T.,Sakaeda,T.,Horinouchi,M.,Tamura,T.,Aoyama,N.,Shirakawa,T.,Matsuo,M.,Kasuga,M.,and Okumura,K.Effect of the mutation(C3435T)at exon 26 of the MDR1 gene on expression level of MDR1 messenger ribonucleic acid in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects.Clin Pharmacol Ther,71:297−303.,2002.)されているc.3435C>Tは、本発明では大腸及び肝臓のMDR1 mRNAレベルと関連性がなく(p=0.7)、腸(Goto,M.,Masuda,S.,Saito,H.,Uemoto,S.,Kiuchi,T.,Tanaka,K.,and Inui,K.C3435T polymorphism in the MDR1 gene affects the enterocyte expression level of CYP3A4 rather than Pgp in recipients of living−donor liver transplantation.Pharmacogenetics,12:451−457,2002)又は胎盤(Tanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.)を分析した以前の報告と一致した。胎盤のMDR1/P−gp発現レベルと相関すると報告(Tanabe,M.,Ieiri,I.,Nagata,N.,Inoue,K.,Ito,S.,Kanamori,Y.,Takahashi,M.,Kurata,Y.,Kigawa,J.,Higuchi,S.,Terakawa,N.,and Otsubo,K.Expression of P−glycoprotein in human placenta:relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance(MDR)−1 gene.J Pharmacol Exp Ther,297:1137−1143.,2001.)されているc.2677G>T、Aは、本発明では大腸及び肝臓のMDR1 mRNAレベルと関連性がなく(p=0.89)、腸のmRNAレベルを分析した結果と一致した(上記Pharmacogenetics,12:451−457,2002)。本発明で調べた他のSNPはどれも、結腸直腸の上皮組織又は肝臓でのMDR1 mRNAレベルと関連性がなかった。
(大腸癌患者と一般健常者におけるMDR1遺伝子SNP頻度の比較解析)
九州北部地区の大腸癌患者443人と地域一般住民758人に対して、研究目的を説明し同意を得た上で、末梢血10ccを採取し、抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABI7900HT(Applied Biosystems社製)を用いてTaqMan法によりタイピングをした。結果を表4に示す。表4から明らかなように、ディプロタイプEは対照(一般健常者)では9人見受けられるが、大腸癌患者では1人も見受けられなかった。また、MDR1遺伝子発現量が高いディプロタイプA、MDR1遺伝子発現量が中間的なディプロタイプB,C、MDR1遺伝子発現量が低いディプロタイプD,Eをまとめて解析してオッズ比を求めると、ディプロタイプAを1としたとき、ディプロタイプD,Eは約半分の0.524、ディプロタイプB,Cは中間的な値の0.892であった。これらのことから、ディプロタイプD,Eは、ディプロタイプAと比べて、大腸癌の発症のリスクが約半減すると推定できる。
九州北部地区の大腸癌患者443人と地域一般住民758人に対して、研究目的を説明し同意を得た上で、末梢血10ccを採取し、抽出したゲノムDNAを鋳型として、ABI7900HT(Applied Biosystems社製)を用いてTaqMan法によりタイピングをした。結果を表4に示す。表4から明らかなように、ディプロタイプEは対照(一般健常者)では9人見受けられるが、大腸癌患者では1人も見受けられなかった。また、MDR1遺伝子発現量が高いディプロタイプA、MDR1遺伝子発現量が中間的なディプロタイプB,C、MDR1遺伝子発現量が低いディプロタイプD,Eをまとめて解析してオッズ比を求めると、ディプロタイプAを1としたとき、ディプロタイプD,Eは約半分の0.524、ディプロタイプB,Cは中間的な値の0.892であった。これらのことから、ディプロタイプD,Eは、ディプロタイプAと比べて、大腸癌の発症のリスクが約半減すると推定できる。
上記TaqMan法は、Applied Biosystems社が開発した方法であり、それぞれのSNPを持つallele特異的なプローブと領域特異的PCRプライマーを用いる。PCRの増幅領域にプローブがハイブリダイズした場合、PCRの増幅に伴ってプローブのクエンチャーがはずれ蛍光が発生する。この蛍光を測定することにより、allele特異的なプローブがハイブリダイズしたか否かを判定できる。各SNPを検出するためのプローブ、プライマーのセットは以下である。
−2352タイピング用
G検出用プローブ:AGGTGAGATAAAGCAA(配列番号61)
A検出用プローブ:TGAAAGGTGAAATAAA(配列番号62)
プライマーペア:Forwaard:AAGGCCATTCAAAAGGATACATAAAA(配列番号63)
Reverse:TCTGTTTTCACTTTTGTTTTGCTTTG(配列番号64)
−934タイピング用
A検出用プローブ:TCCCCAATGATTCAG(配列番号65)
G検出用プローブ:CCCCAGTGATTCAG(配列番号66)
プライマーペア:Forwaard:TGTGAACTTTGAAAGACGTGTCTACA(配列番号67)
Reverse:CAAGTAGAGAAACGCGCATCAG(配列番号68)
−692タイピング用
T検出用プローブ:TTCGAGTAGCGGCTC(配列番号69)
C検出用プローブ:TCGAGCAGCGGCT(配列番号70)
プライマーペア:Forwaard:CCGCTTCGCTCTCTTTGC(配列番号71)
Reverse:CCTCTGCTTCTTTGAGCTTGGA(配列番号72)
3435タイピング用
C検出用プローブ:CTCACGATCTCTTC(配列番号73)
T検出用プローブ:CCTCACAATCTCTT(配列番号74)
プライマーペア:Forwaard:AACAGCCGGGTGGTGTCA(配列番号75)
Reverse:ATGTATGTTGGCCTCCTTTGCT(配列番号76)
−2352タイピング用
G検出用プローブ:AGGTGAGATAAAGCAA(配列番号61)
A検出用プローブ:TGAAAGGTGAAATAAA(配列番号62)
プライマーペア:Forwaard:AAGGCCATTCAAAAGGATACATAAAA(配列番号63)
Reverse:TCTGTTTTCACTTTTGTTTTGCTTTG(配列番号64)
−934タイピング用
A検出用プローブ:TCCCCAATGATTCAG(配列番号65)
G検出用プローブ:CCCCAGTGATTCAG(配列番号66)
プライマーペア:Forwaard:TGTGAACTTTGAAAGACGTGTCTACA(配列番号67)
Reverse:CAAGTAGAGAAACGCGCATCAG(配列番号68)
−692タイピング用
T検出用プローブ:TTCGAGTAGCGGCTC(配列番号69)
C検出用プローブ:TCGAGCAGCGGCT(配列番号70)
プライマーペア:Forwaard:CCGCTTCGCTCTCTTTGC(配列番号71)
Reverse:CCTCTGCTTCTTTGAGCTTGGA(配列番号72)
3435タイピング用
C検出用プローブ:CTCACGATCTCTTC(配列番号73)
T検出用プローブ:CCTCACAATCTCTT(配列番号74)
プライマーペア:Forwaard:AACAGCCGGGTGGTGTCA(配列番号75)
Reverse:ATGTATGTTGGCCTCCTTTGCT(配列番号76)
(ハプロタイプとレポーターコンストラクトの基礎プロモーター活性との関連性)
ハプロタイプとMDR1プロモーター活性との直接の関連性を調査するために、自然発生する3つのハプロタイプ(ハプロタイプ1、2及び3)を保有するボランティアのゲノムDNAの−2604と−570間の5’制御領域をクローニングした。次に、断片をpGL3ベーシックベクター内のレポーター遺伝子に連結した。−1717及び−1325における多型の頻度が低いため、−1717でT単一形態を有し、−1325でA単一形態形性を有するゲノムDNAを使用してレポータープラスミドを構築した。次にこれらの3つのコンストラクトは、ヒト肝臓ガン細胞株HepG2に、トランジェンド・トランスフェクションした。48時間のトランスフェクション後、プロモーター活性を分析し、コトランスフェクションしたphRL−TK活性でノーマライズした。また、相対的ルシフェラーゼ活性は、ハプロタイプ1コンストラクトの活性を100%としたときの比率で示されている。データは、4つの個別実験における、平均値±関連した発現のS.D.(標準偏差)として示す。各実験は、3枚のディッシュを使用して評価した(※P<0.05)。表4に示すように、ハプロタイプ2及び3を保有するマイナー型コンストラクトは、ハプロタイプ1を保有するメジャー型コンストラクトのそれぞれ85.3±4.65%及び87.1±1.64%で発現した。これらの実験は、5’制御領域における多型が、ヒトMDR1遺伝子上流プロモーター領域を含むレポーターコンストラクトの基礎プロモーター活性に影響を及ぼすことを示した。
ハプロタイプとMDR1プロモーター活性との直接の関連性を調査するために、自然発生する3つのハプロタイプ(ハプロタイプ1、2及び3)を保有するボランティアのゲノムDNAの−2604と−570間の5’制御領域をクローニングした。次に、断片をpGL3ベーシックベクター内のレポーター遺伝子に連結した。−1717及び−1325における多型の頻度が低いため、−1717でT単一形態を有し、−1325でA単一形態形性を有するゲノムDNAを使用してレポータープラスミドを構築した。次にこれらの3つのコンストラクトは、ヒト肝臓ガン細胞株HepG2に、トランジェンド・トランスフェクションした。48時間のトランスフェクション後、プロモーター活性を分析し、コトランスフェクションしたphRL−TK活性でノーマライズした。また、相対的ルシフェラーゼ活性は、ハプロタイプ1コンストラクトの活性を100%としたときの比率で示されている。データは、4つの個別実験における、平均値±関連した発現のS.D.(標準偏差)として示す。各実験は、3枚のディッシュを使用して評価した(※P<0.05)。表4に示すように、ハプロタイプ2及び3を保有するマイナー型コンストラクトは、ハプロタイプ1を保有するメジャー型コンストラクトのそれぞれ85.3±4.65%及び87.1±1.64%で発現した。これらの実験は、5’制御領域における多型が、ヒトMDR1遺伝子上流プロモーター領域を含むレポーターコンストラクトの基礎プロモーター活性に影響を及ぼすことを示した。
(メジャー及びマイナー対立遺伝子に個別に結合するタンパク質の同定)
MDR1 5’制御領域のSNPが、核タンパク質の結合を変化させるかどうかを調べてみるために、電気泳動度シフトアッセイを用いた。まず、−2352G>Aを調べた(図4A)。プローブ−2352Gが肝臓細胞の核抽出物とインキュベートしたときに、遅れて現れるバンドが観察された。このバンドは、−2352Aをインキュベートしたときより3倍弱かった。DNA−タンパク質の相互作用の特異性は、適切なコンペティションアッセイにより証明された。すなわち、上方のバンドは、10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチド−2352Gの存在下にほぼ完全に消失したが、マイナー型オリゴヌクレオチド−2352Aの過剰量の追加は、プローブ−2352Gへのタンパク質の結合を抑制しなかった。次に、−692T>Cを調べた(図4B)。対立遺伝子に特異的な、遅れて現れるバンドの出現は、プローブ−692Tが核抽出物とインキュベートしたときにも観察された。コンペティションアッセイにおいては、上方のバンドは、10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチド−692Tの存在下にほぼ完全に消失し、コンペティター−692Cでは、かなり弱い(−692Tと比較して9倍)結合の抑制が観察された。他のオリゴヌクレオチドプローブ(−2410T>C、−1910T>C及び−934A>G)は、この条件下では、メジャー型とマイナー型との間で、タンパク質結合特性になんの相違も示さなかった。
MDR1 5’制御領域のSNPが、核タンパク質の結合を変化させるかどうかを調べてみるために、電気泳動度シフトアッセイを用いた。まず、−2352G>Aを調べた(図4A)。プローブ−2352Gが肝臓細胞の核抽出物とインキュベートしたときに、遅れて現れるバンドが観察された。このバンドは、−2352Aをインキュベートしたときより3倍弱かった。DNA−タンパク質の相互作用の特異性は、適切なコンペティションアッセイにより証明された。すなわち、上方のバンドは、10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチド−2352Gの存在下にほぼ完全に消失したが、マイナー型オリゴヌクレオチド−2352Aの過剰量の追加は、プローブ−2352Gへのタンパク質の結合を抑制しなかった。次に、−692T>Cを調べた(図4B)。対立遺伝子に特異的な、遅れて現れるバンドの出現は、プローブ−692Tが核抽出物とインキュベートしたときにも観察された。コンペティションアッセイにおいては、上方のバンドは、10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチド−692Tの存在下にほぼ完全に消失し、コンペティター−692Cでは、かなり弱い(−692Tと比較して9倍)結合の抑制が観察された。他のオリゴヌクレオチドプローブ(−2410T>C、−1910T>C及び−934A>G)は、この条件下では、メジャー型とマイナー型との間で、タンパク質結合特性になんの相違も示さなかった。
MDR1遺伝子同様に、ABCトランスポータをコードするヒトMRP2遺伝子のSNPsについても調べた。小児白血病患者から同意を得て採取した白血球細胞を含む骨髄よりゲノムDNAを抽出し、MRP2遺伝子の全32エクソン及びプロモータ領域上流4kbについてダイレクトシークエンス法により多型を検索し、21箇所のSNPsを同定した。結果を表5に示す。MDR1遺伝子と同様に、TaqMan法による遺伝子タイピング用のプローブ、プライマーセットは以下のようである。
−3925タイピング用
G検出用プローブ:CTGGTTGTAGGGCTTT(配列番号77)
A検出用プローブ:CCTGGTTATAGGGCTTT(配列番号78)
プライマーペア:Forwaard:CGGGCTTCATTCAGAATTTTTTATCTTTGATT(配列番号79)
Reverse:CACCAAGTAGAACAAATGCCAAACA(配列番号80)
3972タイピング用
C検出用プローブ:ATGCTACCGATGTCAC(配列番号81)
T検出用プローブ:ATGCTACCAATGTCAC(配列番号82)
プライマーペア:Forwaard:TGGTCCTCAGAGGGATCACTT(配列番号83)
Reverse:TCCTTCACTCCACCTACCTTCTC(配列番号84)
−3993タイピング用
C検出用プローブ:AAGTAAGGTCTCTTTCC(配列番号85)
T検出用プローブ:AAGTAAGGTCTTTTTCC(配列番号86)
プライマーペア:Forwaard:GCTTGCTGAGGAAAAGTTGGACATA(配列番号87)
Reverse:AGTTGCAGGAAATCAAAGATAAAAAATTCTGAA(配列番号88)
2366タイピング用
C検出用プローブ:CATCCACTGCAGACAG(配列番号89)
T検出用プローブ:TCCACTGCAAACAG(配列番号90)
プライマーペア:Forwaard:GCCAGAGCTACCTACCAAAATTTAGA(配列番号91)
Reverse:GCCTTTCAACAGGCCATTGG(配列番号92)
−924タイピング用
G検出用プローブ:AGGCCAAGGCAGAAG(配列番号93)
A検出用プローブ:AGGCCAAGACAGAAG(配列番号94)
プライマーペア:Forwaard:GCAATCCCAGCCCTTTGG(配列番号95)
Reverse:CTCAAACTCCAGGCTTCAACAATC(配列番号96)
1249タイピング用
G検出用プローブ:CTGTTTCTCCAACGGTGTA(配列番号97)
A検出用プローブ:ACTGTTTCTCCAATGGTGTA(配列番号98)
プライマーペア:Forwaard:CCAACTTGGCCAGGAAGGA(配列番号99)
Reverse:GGCATCCACAGACATCAGGTT(配列番号100)
イントロン19タイピング用
C検出用プローブ:TCAAAGGAGAAGTGGTTTA(配列番号101)
T検出用プローブ:TTCAAAGGAGAAATGGTTTA(配列番号102)
プライマーペア:Forwaard:CTGGATCTGAGTTTCTGGATTCTGT(配列番号103)
Reverse:GGGATGTTTTGCAAACTGTTCTTTG(配列番号104)
−3925タイピング用
G検出用プローブ:CTGGTTGTAGGGCTTT(配列番号77)
A検出用プローブ:CCTGGTTATAGGGCTTT(配列番号78)
プライマーペア:Forwaard:CGGGCTTCATTCAGAATTTTTTATCTTTGATT(配列番号79)
Reverse:CACCAAGTAGAACAAATGCCAAACA(配列番号80)
3972タイピング用
C検出用プローブ:ATGCTACCGATGTCAC(配列番号81)
T検出用プローブ:ATGCTACCAATGTCAC(配列番号82)
プライマーペア:Forwaard:TGGTCCTCAGAGGGATCACTT(配列番号83)
Reverse:TCCTTCACTCCACCTACCTTCTC(配列番号84)
−3993タイピング用
C検出用プローブ:AAGTAAGGTCTCTTTCC(配列番号85)
T検出用プローブ:AAGTAAGGTCTTTTTCC(配列番号86)
プライマーペア:Forwaard:GCTTGCTGAGGAAAAGTTGGACATA(配列番号87)
Reverse:AGTTGCAGGAAATCAAAGATAAAAAATTCTGAA(配列番号88)
2366タイピング用
C検出用プローブ:CATCCACTGCAGACAG(配列番号89)
T検出用プローブ:TCCACTGCAAACAG(配列番号90)
プライマーペア:Forwaard:GCCAGAGCTACCTACCAAAATTTAGA(配列番号91)
Reverse:GCCTTTCAACAGGCCATTGG(配列番号92)
−924タイピング用
G検出用プローブ:AGGCCAAGGCAGAAG(配列番号93)
A検出用プローブ:AGGCCAAGACAGAAG(配列番号94)
プライマーペア:Forwaard:GCAATCCCAGCCCTTTGG(配列番号95)
Reverse:CTCAAACTCCAGGCTTCAACAATC(配列番号96)
1249タイピング用
G検出用プローブ:CTGTTTCTCCAACGGTGTA(配列番号97)
A検出用プローブ:ACTGTTTCTCCAATGGTGTA(配列番号98)
プライマーペア:Forwaard:CCAACTTGGCCAGGAAGGA(配列番号99)
Reverse:GGCATCCACAGACATCAGGTT(配列番号100)
イントロン19タイピング用
C検出用プローブ:TCAAAGGAGAAGTGGTTTA(配列番号101)
T検出用プローブ:TTCAAAGGAGAAATGGTTTA(配列番号102)
プライマーペア:Forwaard:CTGGATCTGAGTTTCTGGATTCTGT(配列番号103)
Reverse:GGGATGTTTTGCAAACTGTTCTTTG(配列番号104)
本発明によると、頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送するABCトランスポータであるMDR1遺伝子の5’制御領域を標的としたMDR1遺伝子のハプロタイプやディプロタイプを判定することができ、MDR1遺伝子の5’制御領域のSNPsに関する基礎的知見の他、各個人におけるMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプやディプロタイプの判定結果を薬剤応答性のマーカーとして利用することにより、テーラーメード治療が可能となる。加えて、発癌リスクと進行を予測するマーカーとしても有用であるので、癌のリスク評価によるテーラーメード予防へと展開が可能である。
Claims (19)
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型に加えて、−934位及び/又は−692位の位置における多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −2903位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1又は2記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −2410位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −2352位の塩基が、グアニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −1910位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −1717位の塩基が、チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- −1325位の塩基が、グアニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がアデニン、−692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がグアニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がシトシン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がシトシン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2410位の塩基がチミン、−2352位の塩基がアデニン、−1910位の塩基がチミン、−934位の塩基がグアニン、−692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域DNA。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位から選ばれる位置における多型を検出するMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプを判定する方法に用いられるプライマーセットであって、多型を検出する位置の上流の領域とハイブリダイズするフォワード側プライマーと、多型を検出する位置の下流の領域とハイブリダイズするリバース側プライマーとからなることを特徴とするプライマーセット。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2352位の位置と、−2410位、−1910位、−692位から選ばれる位置とにおける多型を検出することを特徴とするMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法。
- TaqMan(登録商標)法により遺伝子タイピングを実施することを特徴とする請求項14記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2352位の位置と、−2410位、−1910位、−692位から選ばれる位置とにおける多型を検出するMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられるプローブ及びプライマーセット。
- TaqMan(登録商標)法によりMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられることを特徴とする請求項16記載のプローブ及びプライマーセット。
- 請求項1〜8のいずれか記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のハプロタイプ及び/又はディプロタイプを判定する方法又は請求項14若しくは15記載のMDR1遺伝子の5’制御領域のディプロタイプを判定する方法を用いることを特徴とする大腸癌発症の予測方法。
- MDR1遺伝子の5’制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドンATGの最初の塩基を+1とした場合に対応する位置で表示したとき、−2903位、−2410位、−2352位、−1910位、−1717位及び−1325位、−934位、−692位から選ばれる1以上の位置を標的とすることを特徴とするMDR1発現制御薬の開発方法。
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