WO2005028645A1 - ＭＤＲ１遺伝子の５’制御領域におけるＳＮＰｓ - Google Patents

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Morimasa Wada
Michihiko Kuwano
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Kyushu Tlo Company, Limited
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Definitions

  • the present invention provides a method for determining the haplotype and diplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 (multidrug resistance 1) gene, more specifically, the translation initiation codon ATG in the base sequence of the 5' regulatory region of the MDR1 gene.
  • the SNP at the position selected from the positions -2903, -2410, -2352, -1910, -1717 and -1325 is displayed. (—Nucleotide polymorphism) to determine the haplotype or diplotype of the 5 ′ control region of the MDR1 gene.
  • P-glycoprotein P-glycoprotein
  • the MDR1 gene is a known gene encoding P-gp, a 170 kDa transmembrane protein located on the cytoplasmic surface of cells, and its nucleotide sequence is also known.
  • P-gp is composed of two transmembrane regions and two nucleotide binding regions.
  • expression of P-gp causes cell resistance to a wide variety of anticancer drugs (eg, Scherf, U., Ross, DT, Waltham, ⁇ ., Smith, LH, Lee, JK, Tanabe, L., Kohn, KW, Reinhold, W. C, Myers, TG, Andrews, DT,
  • MDR1 gene expression in malignant cancer cells YB-1 nuclear translocations (eg, Bargou, R. C. Jurchott, ⁇ ., Wagener, C "Bergmann, S” Metzner, S., Bommert, ⁇ ., Mapara, M.
  • P-gp is expressed in normal cells of various organs such as intestine, liver, kidney, brain and placenta (eg, Thieoaut, F., Tsuruo, ⁇ ⁇ , Hamada, ⁇ ⁇ , Gottesman, ⁇ . ⁇ ., Pastan, ⁇ ⁇ , and Willin gham, MC Cellular localization of the multidrug— resistance gene product
  • P glycoprotein in normal human tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 7735-7738., 1987., Sugawara, I., Kataoka, I., Morishita, ⁇ ⁇ , Hamada, ⁇ ⁇ , Tsuruo, ⁇ ⁇ , Itoyama, S., and Mori, S. Tissue distribution of P—glycoprotein encoded by a
  • Multidrug-resistance gene (P-glycoprotein) is expressed by endothelial cells at blood-brain barrier sites. Proc Natl Acad Sci USA, 86: 695-698 ⁇ , 1989 ⁇ ). The broad substrate specificity and apical localization of P-gp strongly suggests that it plays a critical role in drug disposition in both animal models and the human body (eg, Schinkel, A. ⁇ ⁇ , Mayer, U., Wagenaar, ⁇ ⁇ , Mol, CA, van Deemter, L., Smit, JJ, van der Valk, MA, Voordouw, AC, Spits, ⁇ ⁇ , van Tellingen, ⁇ ⁇ , Zijlmans, JM, Fibbe, W.
  • Schinkel, A. ⁇ ⁇ , Mayer, U., Wagenaar, ⁇ ⁇ , Mol, CA, van Deemter, L. Smit, JJ, van der Valk, MA, Voordouw, AC, Sp
  • P-gp affects substrate uptake into the brain (eg, Thiebaut, F., Tsuruo, ⁇ ⁇ , Hamada, ⁇ ⁇ , Gottesman, ⁇ . ⁇ ., Pastan, ⁇ ⁇ , and Willingham, ⁇ . C.
  • P glycoprotein in normal human tissues.Proc Natl Acad Sci USA, 84: 7735-7738., 1987., Schumacher, U. and Mollgard, K.
  • the multidrug— resistance P-glycoprotein (Pgp, MDRl) is an early marker or blood-brain barrier development in the microvessels of the developing human brain.Histochem Cell Biol, 108:
  • c. 3435C ⁇ T (exon 26) was suggested to be involved in intestinal P-gp expression and uptake of oral dicoxin, a P-gp substrate. .
  • c 3435C> T is not associated with placental expression of P-gp in Japanese subjects (eg, Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N "Inoue , K., Ito, S "Kanamori, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and
  • T, A which is an SNP in Exon 21 (eg Kim, RB, Leake, BF, Choo, EF, Dresser, GK, Kubba, SV, Schwarz, UI, Taylor, A., Xie, HG, McKinsey, J., Zhou, S., Lan, LB, Schuetz, JD, Schuetz, EG, and Wilkinson, GR Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African
  • ABC transporters are molecular targets that are key to the sensitivity and pharmacokinetics of anticancer drugs, and clarifying the molecular background that causes individual differences in their expression is important for personalized treatment. Also, since many drugs are substrates of P-gp, the degree of P-gp expression and activity may directly affect the therapeutic efficacy of such drugs. In addition to pharmacological relevance, other clinical effects such as the following on inter-individual variation and expression levels of P-gp SNPs are also contemplated. Recently, the present inventors have found a role for P-gp in colorectal carcinogenesis in mice (Mochida, Y., Taguchi, K., Taniguchi, S., Tsuneyoshi, M., Kuwano, H.
  • mice deficient in mdrla a homologous gene to human MDRl, have significantly increased DNA damage compared to wild-type mice I also found what I was doing.
  • mdr la-deficient mice have a statistically lower number of polyps when compared to wild-type mice under the APCMin background.
  • Inter-individual variability of P-gp expression in the large intestine may be related to human colorectal carcinogenesis.
  • the SNP in the 5 'regulatory region of the human MDR1 gene is related to the expression of MDRl mRNA and P-gp in Japanese colorectal mucosa and liver, indicating that MDR1 SNP and drug reactivity It would provide a scheme for further analysis of the relationship between the two, as well as for further assessment of the importance of P-gp in inter-individual variability of drug responsiveness and cancer risk.
  • the MDR1 gene is considered to be involved in the host defense by eliminating foreign substances, the pathological conditions and diseases caused by inflammatory bowel disease and other disruptions of the host defense function by removing foreign substances, cell survival, and anti-apoptosis It is thought that it is possible to predict and diagnose the onset of the disease dependent on the function.
  • An object of the present invention is to focus on the ABC transporter, Pgp, which is expressed on the apical membrane and transports a wide range of substrates, and the haplotype of the MDR1 gene targeting the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene encoding P-gp, It is to provide a method for determining a diplotype.
  • the present inventors analyzed the nucleotide sequence polymorphism of the 5 'regulatory region (5, upstream regulatory region) in which the transcription initiation site of the Japanese MDR1 gene also extends over 4 kb, and found that 8 single nucleotides within this region.
  • a polymorphism was identified (see Figure 1). Two of these eight identified SNPs (692T> C and 934A> G) were known, but the remaining six (1325A> G, 1717T> C, 1910T> C, SNPs of 2352G> A, 2410T> C, and 2903T> C) were unreported, and three of them (--1910T> C, 2352G> A, 2410T> C) were completely unlinked.
  • the present invention provides, in the nucleotide sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene, positions -2903, 2410, A haplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene, characterized by detecting a polymorphism at a position selected from positions 2352, 1910, 1717 and 1325 And the method of determining Z or diplotype (Claim 1), and in the nucleotide sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene, the position is indicated at a position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1.
  • polymorphisms at positions 934 and / or 692 are detected
  • a method for determining the haplotype and Z or diplotype of the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene (claim 2), and a method for determining whether or not the base force at position -2903 is thymine or cytosine.
  • the method for determining the haplotype and Z or diplotype of the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene according to claim 1 or 2 (Claim 3), and checking whether the base is thymine or cytosine at position 2410
  • the present invention relates to a method for determining diplotype (claim 8).
  • the present invention provides a nucleotide sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene, wherein the base at the position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1 is thymine; 5′-regulation of the MDR1 gene, characterized in that the base at position 2352 is replaced with adenine, the base at position ⁇ 1910 is replaced with thymine, the base at position ⁇ 934 is replaced with adenine, and the base at position ⁇ 692 is replaced with thymine.
  • the base sequence of the region DNA (Claim 9) or the 5 'regulatory region of the MDR1 gene it is displayed at the position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1. Then, the base at position -2410 is replaced with cytosine, the base at position -2352 is replaced with guanine, the base at position -1910 is replaced with cytosine, the base at position -934 is replaced with guanine, and the base at position 692 is replaced with cytosine.
  • the position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1 is indicated.
  • the base at position --2410 is cytosine
  • the base at position 2352 is adenine
  • the base at position --1910 is cytosine
  • the base at position --934 is guanine
  • the base at position 692 is cytosine.
  • the present invention relates to the nucleotide sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene, wherein the position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1 is -2903 position, -2410
  • a primer set comprising a forward primer that hybridizes with a region upstream of the position where the type is detected and a reverse primer that hybridizes with a region downstream of the position where the polymorphism is detected (claim 13);
  • the present invention also provides a method for determining a diplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene according to claim 14, wherein the genotyping is performed by the TaqMan (registered trademark) method (claim 15).
  • the genotyping is performed by the TaqMan (registered trademark) method (claim 15).
  • a probe and primer set used in a method for determining the diplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene for detecting a polymorphism at a position and positions selected from positions -2410, 1910, and -692
  • the probe and primer set according to claim 16 wherein the probe and primer set are used in a method for determining the diplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene by the TaqMan (registered trademark) method.
  • a method for predicting the onset of colorectal cancer which is characterized by using a method for judging colorectal cancer (Claim 18) .
  • the first base of the translation initiation codon ATG is + If 1 When displayed at the corresponding position, it targets one or more positions selected from -2903, -2410, -235 2, 1910, 1717 and 1325, 934, and -692
  • the present invention relates to a method for developing an MDR1 expression regulator (claim 19).
  • FIG. 1 is a diagram showing the positions of SNPs in the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene.
  • FIG. 2 is a view showing the association between diplotype in the 5 ′ control region and the mRNA level of the MDR1 gene.
  • MDRl mRNA levels were measured by real-time PCR in 72 normal colorectal mucosa. The 72 samples were divided by diplotype: diplotype A (noplotype lZl), diplotype B (noplotype 1Z2), diplotype C (haplotype 1Z3), and diplotype D (noplotype 2Z2). MDRl mRNA levels were normalized by GAPDH mRNA levels.
  • B 5 polymorphisms in the 5 'control region (1 2410, 1 2352, 1 1910, -934 and
  • FIG. 3 shows the results of immunohistological staining of P-gp with the JSB-1 antibody.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of detection of a protein binding to the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene by electrophoretic mobility shift assay.
  • NE indicates a nuclear extract.
  • the first base of the translation initiation codon ATG in the base sequence of the 5' regulatory region of the MDR1 gene is +
  • the polymorphism at one or more positions selected from -2903, -2410, -2352, -1910, -1717 and -1325 is detected.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method of performing the above, the positions-2903,-2410,-2352,-1910,-1717 and-1325 are also selected.
  • the method of detecting the polymorphism at the positions -2410, 2352, 1910, -934 and 692 is preferable.
  • the position where the polymorphism is detected is indicated at a position corresponding to the case where the first base of the ATG start codon is +1.
  • the ATG start codon is located at exon 2 and the transcription start site corresponds to 699 in this numbering system.
  • SEQ ID NO: 1 contains the complementary sequence (MDR1) of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene.
  • which is complementary sequence information from one gene region. Therefore, for example, it can be seen that the complementary base "T” that forms a base pair with the 2410th base "A” in SEQ ID NO: 1 is the base at position -2410.
  • the positions-2903,-2410, -2352,-1910,-1717,-1325, -934 and 692 are also selected (hereinafter referred to as "predetermined mutation positions").
  • the method for detecting the polymorphism in (ii) is that the base at position -2903 is thymine or cytosine, or that the base at position -2410 is thymine or cytosine.
  • Power of guanine or adenine Power of base at position ⁇ 1910 is thymine or cytosine
  • power of base of position ⁇ 1717 is thymine or cytosine
  • power of base at position 1325 is adenine or guanine
  • ⁇ 934 A method for examining whether the base at the position is adenine or guanine and a method for checking whether the base at the position -692 is thymine or cytosine can be exemplified.
  • the base at position 2903 is thymine
  • the base at position 2410 is thymine
  • the base at position 2352 is guanine
  • the base at position 1910 is thymine
  • the base at position 1717 is thymine
  • the base sequence complementary to the base sequence of the 5 'regulatory region of a normal MDR1 gene in which the base at position 1325 is adenine, the base at position -934 is adenine, and the base at position -692 is thymine is shown.
  • Methods for detecting a polymorphism at a predetermined mutation position include PCR, ligand string reaction, restriction enzyme digestion, direct nucleotide sequencing, nucleic acid amplification, hybridization, immunoassay, and the like.
  • the method is not particularly limited as long as it can detect a conventionally known SNP using mass spectrometry or the like.
  • the nucleotide sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene is already known!
  • a forward primer that hybridizes with a region upstream of a predetermined mutation position (a position at which a polymorphism is detected) as shown in Table 1 below
  • a reverse primer that hybridizes with a region downstream of the predetermined mutation position.
  • a primer set SEQ ID NOS: 2-25
  • a method for examining restriction fragment length polymorphism R FLP
  • R FLP restriction fragment length polymorphism
  • ASO Hybridization ARMS method, denaturing gradient gel electrophoresis , RNaseA cleavage method, chemical cleavage method, DOL method, Invader method, MALDI-TOF, MS method, TDI method, molecular ⁇ -beacon method, dynamic 'alleles specific' novelization method, nodlock 'probe method, UCAN Method, a nucleic acid hybridization method using a DNA chip or a DNA microarray, and an ECA method.
  • a primer having a size of 15 to 40 nucleotides, preferably about 20 nucleotides is used.
  • the size of the amplification region is not particularly limited. Genomic DNA, which is the type II of PCR, can be obtained from samples containing live or dead cells, such as peripheral blood, hair roots, oral mucosa, and blood smears, in a conventional manner, regardless of the presence or absence of MDR1 expression. It can be prepared.
  • the haplotype or diplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene may be determined by detecting polymorphisms at all predetermined mutation positions. You may detect and determine. For example, if a minor allele has a certain degree of polymorphism at each of the positions ⁇ 2410, 2352, 1910, ⁇ 934 and 692, it can be reduced to a haplotype or diplotype.
  • the 5 'regulatory region DNA of the MDR1 gene of the present invention is represented by a position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1 in the base sequence of the 5' regulatory region of the MDR1 gene.
  • the base at position ⁇ 2410 is thymine
  • the base at position ⁇ 2352 is guanine
  • the base at position ⁇ 1910 is thymine
  • the base at position ⁇ 934 is adenine
  • the base at position ⁇ 692 is thymine. 5 'of MDR1 gene along with DNA Configure haplotypes for your domain.
  • the primer set of the present invention includes the following sequence at the position corresponding to the case where the first base of the translation initiation codon ATG is +1 in the base sequence of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene: Primer set used in the method for determining the haplotype of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene that detects polymorphisms at positions where positions 2903, -2410, -2352, -1910, -1717 and -1325 are also selected And a forward primer that hybridizes to a region upstream of the position where the polymorphism is detected, and a reverse primer that hybridizes to a region downstream of the position where the polymorphism is detected.
  • the size of the amplification region is not particularly limited, for example, as shown in Table 1, P5FZR for detecting a polymorphism at position ⁇ 2410 (SEQ ID NOS: 10 and 11), P6FZR for detecting a polymorphism at position ⁇ 2352 ( SEQ ID NOS: 12 and 13), P7FZR for detecting polymorphism at position ⁇ 1910 (SEQ ID NOs: 14 and 15), P8FZR for detecting polymorphism at position ⁇ 1717 (SEQ ID NOs: 16 and 17), and polymorphism at position ⁇ 1325
  • P5FZR for detecting a polymorphism at position ⁇ 2410 SEQ ID NOS: 10 and 11
  • P6FZR for detecting a polymorphism at position ⁇ 2352
  • P7FZR for detecting polymorphism at position ⁇ 1910
  • P8FZR for detecting polymorphism at position ⁇ 1717 (SEQ ID NOs: 16 and
  • the first base of the translation initiation codon ATG in the base sequence of the 5' regulatory region of the MDR1 gene was set to +1.
  • the method is not particularly limited as long as it is a method for detecting the polymorphism at the position of ⁇ 2352 position and the position at which the power of ⁇ 2410, 1910, and ⁇ 692 positions are also selected.
  • polymorphisms at the positions -2352 G (A) and -692 T (C) are detected, and (1 2352, 692 Z 2352, -692) becomes (G, Diplotypes such as (T / G, T) ⁇ (G, T / A, T) ⁇ (G, T / G, C), (A, T / A, ⁇ ) ⁇ (G, C / G, C) Judgment can be classified.
  • a method of determining the diplotype of the 5 'regulatory region of the powerful MDR1 gene a method of performing genotyping by the TaqMan method can be advantageously exemplified.
  • Probes and primer sets used when performing genotyping by the TaqMan method include:-a G detection probe shown in SEQ ID NO: 61 for typing 2352, an A detection probe shown in SEQ ID NO: 62, The primer sets shown in SEQ ID NOs: 63 and 64, the T-detection probe shown in SEQ ID NO: 69, the C-detection probe shown in SEQ ID NO: 70, and the primer set shown in SEQ ID NOs: 71 and 72 for typing 692 Preferred examples can be given.
  • the appearance frequency of diplotypes that are expected to have a high expression level of the MDR1 gene is higher in the colorectal cancer patient disease group than in the general healthy control group (according to statistical analysis, the MDR1 gene
  • the diplotype A with high expression, the intermediate diplotypes B and C, and the diplotypes D and E with low MDR1 are analyzed collectively and the odds ratio is obtained.
  • D and E showed half of 0.524
  • diplotypes B and C showed an intermediate value of 0.892
  • Genomic DNA from volunteer blood samples was isolated using the QiaAmp blood kit (Qiagen), and DNA from patient tissues was isolated using the Easy DNA Kit (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Isolated. RNA was isolated using the RNA extractant TRIzol (Invitrogen Life Technologies) or Rneasy (Qiagen), respectively, according to the manufacturer's protocol.
  • Specific oligonucleotide primers for PCR amplification of the MDR1 gene fragment were derived from a known sequence [GenBank accession nos .: 5 'regulatory region, exons 1-7 for AC002457 and exons 8-28 for exons. AC005068].
  • the position of the SNP in the exon is that of the MDR1 cDNA with the first base of the ATG start codon set to +1 [GenBank accession no .: M14758, codon TTC of exon 10, F335 is missing in this sequence] Equivalent to position. Chen et aU exon is defined (Chen, C.
  • a haplotype of an individual that is heterozygous at the locus of at least one SNP is prepared using a four-primer MDR1P5F and a reverse primer MDR1P11R. Specified by PCR amplification and sequencing. Table 1 shows the nucleotide sequences (SEQ ID NOS: 2 to 25) of the 12 primer sets used for screening for the SNP of the 5 'regulatory region of the MDR1 gene over about 4 kb. PCR amplification was performed using a highly compatible DNA polymerase, KOD-Plus (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the manufacturer's protocol.
  • the fragment was inserted into pT7Blue-3 vector (Novagen) and subcloned. At least six colonies were selected and the plasmid was purified with the Qiagen DNA Kit according to the manufacturer's protocol. The SNP site was analyzed by sequencing to confirm the haplotype.
  • MDR1P1F T TATGTCTCAGCCrGGGCG 324
  • MDR1P1R TCACAGGAGAGCAGACACGT
  • MDR1P2F CTC TGCrCACTCTAGGGAC 227
  • MDR1P3F CACATATCATCTGAOAAGCCCA 233
  • MDR1P4F AGGCAGTGAAGTGOTGTGTC 453
  • MDR1P4R ACCTTCArrCAAOCGG OAr
  • DR1PSF ATOAOAGCGGAGOACAAGAA 469
  • MDR1P6R AGG rrCTAACAGG CACTA
  • MDR1P7R CTTGGCCTTACAArACAArG
  • MDR1P8F CGACAAAGCAAGACTCCG C 438
  • MDR1PSR CCITCCATAnTACTGCCAACA
  • MDR1P9F GAATTGTGCAGAITGCACG 437
  • DR1P9R TCCCACCrCrCCAATTCrGT
  • MDR1P10F AGCATGCTGAAGAAAGACCA 380
  • D 1P10R TCAGCCTCACCACAGATGAC
  • MDR1P12F GGGACCAAOTGGCGTrAGAT 474
  • fragments containing -2604 to -570 were amplified from templates corresponding to haplotypes 1 and 2 homozygotes and haplotypes 1 and 3 heterozygotes.
  • Forward primers 5'-AAAGCTAGCTGTC AGTGG AGC AAAG AAATG-3 '(SEQ ID NO: 26) and reverse primers 5'-AAAGCTAGCCTCGCGCTCCTTGGAA-3' (SEQ ID NO: 27) each containing a Nhel site were used.
  • These amplified products were inserted into the Nhel site of a pGL3 basic vector (Promega). The SNP site of the construct was confirmed by sequencing.
  • a human liver cancer cell line (HepG2) was used.
  • Cells were cultured at 37 ° C under humidified conditions containing 5% carbon dioxide.
  • the plate was incubated at 37 ° C for 6 hours after adding the DNA-LIPOFECTAMINE complex, after which the growth medium was changed. Plates were incubated for an additional 24 hours until luciferase atsey.
  • Firefly and renilla luciferase activities were measured with a luminometer using a Dual Lucifer Error Reporter Atssay System (Promega). The data were obtained by using the Renilla luciferase activity for transfection efficiency. Normalized. The transfection was performed three times in all experiments, using a 3-well of a 24-well plate containing the same transfection reaction.
  • the first antibody used was P-gpFSB-1) (mouse monoclonal, Sanbio). Immunostaining of P-gp was performed according to the description in the literature (32). For reliable quantitative detection by immunohistology, villin, an additional marker protein expressed in enterocytes, was used. ImageGauge software (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) was used for the quantitative determination.
  • the DNA sequence of the sense strand of each oligonucleotide is as follows: , —G AGCTC ATTCG AGTA GCGGCTCTTCC—3 ′ (—692T; SEQ ID NO: 30) and 5′—GAGCTCATTCGAGC AGCGGCTCTTCC-3 ′ (one 692C; SEQ ID NO: 31).
  • Nuclear extracts protein 2 ⁇ ⁇
  • various competitors were added in a final volume of 101 reaction mixtures containing 2 ⁇ l of 5 ⁇ binding buffer; 5 mM DTT; 10 ng poly (dl-dC); and 1 ⁇ 104 cpm 32P-labeled oligonucleotide probe. Incubated for 30 minutes at room temperature in the presence or absence. We tried five different types of binding buffers and identified the one that produced the sharpest and slowest appearing band, which was used in subsequent studies.
  • the composition of the 5X binding buffer used for the detailed analysis is as follows.
  • Buffer A 60 mM HEPES, 300 mM KC1, 20 mM MgC12, 5 mM EDTA, 60% (v / v) glycerol;
  • Buffer B 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 12.5 mM CaC12 , 5 mM EDTA, 40% (v / v) glycerol.
  • the samples were then run in 4% polyacrylamide gel (ratio of polyacrylamide Z bisacrylamide, 79: 1) in Tris-borate EDTA buffer (0.089M Tris, 0.089M boric acid and 0.002M EDTA). Electrophoresis It was.
  • the gel was exposed to an imaging plate and analyzed using a Fujix BAS 2000 Bioimaging Analyzer (Fuji Film Photography).
  • MDR1 mRNA levels versus diplotype results were analyzed with the Kruskato Wallis test. Differences were considered statistically significant at p ⁇ 0.05.
  • the correlation between MDR1 mRNA levels and P-gp levels was identified by Spearman's test. This test is usually used for nonparametric analysis when it is not clear whether a variable exhibits normal distribution. Probability values less than 0.05 were considered significant. Spearman's coefficient (r) and associated probabilities (P) were calculated. In a transfection experiment, an unpaired t-test was performed to compare the relative luciferase activities of reporter constructs containing haplotypes 1, 2 or 3 in the 5 'regulatory region of the MDR1 gene.
  • the ATG start codon is located at exon 2 and the transcription start site corresponds to -699 from ATG in genomic DNA.
  • a 2 kb fragment containing these polymorphic sites at -2410, -2352, 11910, -934 and 1692 was amplified by PCR.
  • analysis of homozygotes at all of these sites was omitted, and at least one of these sites used heterozygous samples.
  • After subcloning the amplified fragment into the pT7Blue3 vector its nucleotide sequence was identified.
  • the frequency of minor alleles at -2903, 1-1717 and-1325 was too low (0.02) for statistical analysis, and these three alleles were excluded from the analysis. The frequency was determined by checking the corresponding fragment of the region by PCR amplification and sequencing.
  • Each of the 72 normal colorectal mucosa was examined to determine its association with MDRl mRNA levels.
  • MDRl mRNA of diplotypes B and C each with one haplotype 1
  • the mean level was between the values of diplotypes A and D.
  • c. 3435C> T is related to the colon and liver MDRl mRNA levels in the present invention.
  • Gut (P 0.7)
  • CJ435T polymorphism in the MDRl gene affects the enterocyte expression level of CYP3A4 rather than Pgp in recipients of living-donor liver transplantation.
  • Pharmacogenetics, 12: 451-457, 2002 or placenta (Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N "Inoue, K., Ito, S., Kanamori , Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and Otsubo, K.
  • diplotype A was set to 1
  • diplotypes D and E were about half of 0.524
  • diplotypes B and C had an intermediate value of 0.892. From these facts, it can be estimated that diplotypes D and E have about half the risk of developing colorectal cancer as compared to diplotype A. [0050] [Table 4]
  • the TaqMan method is a method developed by Applied Biosystems, and uses an allele-specific probe having each SNP and a region-specific PCR primer. When the probe hybridizes to the PCR amplification region, the probe loses its orientation and emits fluorescence along with the PCR amplification. By measuring this fluorescence, it can be determined whether or not the allele-specific probe has hybridized.
  • the set of probes and primers for detecting each SNP is as follows.
  • G detection probe AGGTGAGATAAAGCAA (SEQ ID NO: 61)
  • a detection probe TCCCCAATGATTCAG (SEQ ID NO: 65)
  • G detection probe CCCCAGTGATTCAG (SEQ ID NO: 66)
  • T detection probe TTCGAGTAGCGGCTC (SEQ ID NO: 69)
  • haplotypes 1, 2 and 3 were studied on the genomic DNA of volunteers carrying three naturally occurring haplotypes (nodrotypes 1, 2 and 3). 'Closed the control region. Next, the fragment was ligated to the reporter gene in the pGL3 basic vector. Due to the low frequency of polymorphisms at -1717 and 1325, a reporter plasmid was constructed using genomic DNA having the T monomorphism at 1717 and the A monomorphism at -1325. These three constructs were then transfected into the human liver cancer cell line HepG2. After 48 hours of transfection, promoter activity was analyzed and normalized with cotransfection phRL-TK activity.
  • the relative luciferase activity is shown as a ratio when the activity of the haplotype 1 construct is 100%.
  • Data are presented as SD (standard deviation) of mean-related expression in four individual experiments. Each experiment was evaluated using three dishes (*! ⁇ Ku .. 05).
  • the minor constructs carrying haplotypes 2 and 3 were expressed in 85.3 ⁇ 4.65% and 87.1 ⁇ 1.64% of the major type constructs carrying haplotype 1, respectively. did.
  • the electrophoretic mobility shift assay was used to determine whether the SNP force of the MDR1 5 'regulatory region alters nuclear protein binding.
  • 2352G> A was examined (Fig. 4A).
  • probe 2352G was incubated with nuclear extracts of liver cells, a late appearing band was observed. This band was 3 times weaker than when -2352A was incubated.
  • the specificity of the DNA-protein interaction was demonstrated by an appropriate competition attest. That is, the upper band is almost completely absent in the presence of a 10-fold excess of unlabeled oligonucleotide 2352G.Addition of an excess of minor oligonucleotide 235 2A inhibits protein binding to probe 2352G. Did not.
  • SNPs of the human MRP2 gene encoding the ABC transporter I also looked at Genomic DNA was extracted from the bone marrow containing leukocytes obtained from children with leukemia with consent, and polymorphisms were searched for all 32 exons of the MRP2 gene and 4 kb upstream of the promoter region using the direct sequence method, and 21 SNPs were identified. Was identified. Table 5 shows the results. Similar to the MDR1 gene, the probe and primer sets for genotyping by the TaqMan method are as follows.
  • G detection probe CTGGTTGTAGGGCTTT (SEQ ID NO: 77)
  • a detection probe CCTGGTTATAGGGCTTT (SEQ ID NO: 78)
  • T detection probe ATGCTACCAATGTCAC (SEQ ID NO: 82)
  • T detection probe AAGTAAGGTCTTTTTCC (SEQ ID NO: 86)
  • Probe for C detection CATCCACTGCAGACAG (SEQ ID NO: 89)
  • T detection probe TCCACTGCAAACAG (SEQ ID NO: 90)
  • G detection probe AGGCCAAGGCAGAAG (SEQ ID NO: 93)
  • a detection probe AGGCCAAGACAGAAG (SEQ ID NO: 94)
  • a detection probe ACTGTTTCTCCAATGGTGTA (SEQ ID NO: 98)
  • C detection probe TCAAAGGAGAAGTGGTTTA (SEQ ID NO: 101)
  • the haplotype or diplotype of the MDR1 gene which targets the 5 ′ regulatory region of the MDR1 gene, which is an ABC transporter that is expressed on the apical membrane and transports a wide range of substrates.
  • the results of individual haplotype and diplotype determinations of the 5' Treatment becomes possible. Because it is useful as a marker for predicting cancer risk and progression, it can be applied to tailor-made prevention by assessing cancer risk.

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Abstract

　頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送するＡＢＣトランスポーター、Ｐ−ｇｐに注目し、Ｐ−ｇｐをコードするＭＤＲ１遺伝子の５'上流調節領域を標的としたＭＤＲ１遺伝子のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法を提供するものである。ＭＤＲ１遺伝子の５'上流調節領域の塩基配列において、−２９０３位、−２４１０位、−２３５２位、−１９１０位、−１７１７位及び−１３２５位から選ばれる位置における多型に加えて、−９３４位及び／又は−６９２位の位置における多型を検出することにより、ＭＤＲ１遺伝子の５'上流調節領域のハプロタイプやディプロタイプを判定する。上記多型を検出する位置は、ＡＴＧ開始コドンの最初の塩基を＋１とした場合に対応する位置で表示されている。ＡＴＧ開始コドンは、エクソン２に位置し、転写開始サイトはこの番号方式では、−６９９に相当する。

Description

明 細 書
MDR1遺伝子の 5，制御領域における SNPs
技術分野
[0001] 本発明は、 MDR1 (multidrug resistance 1)遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプや ディプロタイプを判定する方法、より詳しくは、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配 列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で 表示したとき、—2903位、—2410位、—2352位、—1910位、—1717位及び— 1325 位カゝら選ばれる位置における SNP (—塩基多型）を検出して、 MDR1遺伝子の 5'制 御領域のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法等に関する。
背景技術
[0002] 薬剤はインビボで解毒、共役され、その後細胞外に排出される。解毒システムの活 性は、薬剤の薬剤動態に影響する。多くの近年の研究は、シトクロム P450s ( cytochrome P450s)及びグルタチオン S—トランスフェラーゼ（glutathione S- tran sferase)等の解毒関連遺伝子の多型と薬剤の効能と副作用とを関連づけている（例 ば Roden, D. M. and ueorge, A. L., Jr. The genetic basis of variability in drug responses. Nat Rev Drug Discov, 1: 37—44., 2002.、 Evans, W. E. and Relling, M. V.
Pharmacogenomics : translating functional genomics into rational therapeutics. Science, 286: 487 - 491., 1999.、 Gonzalez, F. J., Skoda, R. C, Kimura, S., Umeno, M., Zanger, U. M., Nebert, D. W., Gelboin, H. V., Hardwick, J. P., and Meyer, U. A. Characterization of the common genetic defect in humans deficient in debris oquine metabolism. Nature, 331: 442-446., 1988.参照）。他方、薬剤の排出は、 AT P結合カセット (ABC3)トランスポーターに属するタンパク質のグループに関与する（ ί列 ば Konig, J., Nies, A. T.,し ui, Y., Leier, I., ana eppler, D. conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family: localization, substrate specificity, and MRP2— mediated drug resistance. Biochim Biophys Acta, 1461:
377-394., 1999.、 Gottesman, M. M., Fojo, T., and Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP— dependent transporters. Nat Rev Cancer, 2: 48-58., 2002.、 Borst, P., Evers, R., Kool, M., and Wijnholds, J. A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst, 92: 1295-1302., 2000.、 Holland, I. B" Cole, S. P. C, Kuchler, K., and Higgins, C. F. ABC proteins, from bacteria to man, p. 423-443. UK: Academic Press, 2003.
、 Wada, M., Uchiumi, T., and Kuwano, M. Canalicular multispecific organic anion transporter, ABCC2. In: S. Broer and C. A. Wagner (eds.), MEMBRANE
TRANSPORT DISEASES -Molecular basis of inherited transport defects-, NY: Kluwer Academic/Plenum Publishers, in press, 2003.、 Kuwano, M., Uchiumi, T., Hayakawa, H., Ono, M., Wada, M., Izumi, H., and Kohno, K. The basic and clinical implications of ABC transporters, Y- box- binding protein- 1 (YB- 1) and
angiogenesis- related factors in human malignancies. Cancer Sci, 94: 9-14., 2003.参 照）。 ABCトランスポーターのメンバーである、 P—糖タンパク質 (P- glycoprotein) (P— g P)は、吸収される比率を制限しながら、薬剤の薬剤動態に影響を及ぼす。したがって 、 ABCトランスポーターの活性及び発現レベルの個体間変動は、薬剤動態の発展に おける重要な要素となると考えられている。
MDR1遺伝子は、細胞の細胞質表面に位置する 170kDaの膜貫通タンパク質で ある P— gpをコードする公知の遺伝子であり、その塩基配列も知られている。 P— gpは 、 2つの膜貫通領域及び 2つのヌクレオチド結合領域で構成されている。さまざまな 標的分子の内、 P— gpの発現は、抗ガン剤の広い多様性に対する細胞の耐性を引き 起こす（例えば Scherf, U., Ross, D. T.， Waltham, Μ., Smith, L. H.， Lee, J. K., Tanabe, L., Kohn, K. W., Reinhold, W. C, Myers, T. G., Andrews, D. T.,
Scudiero, D. A., Eisen, M. B., Sausville, E. A., Pommier, Y., Botstein, D., Brown, P. O., and Weinstein, J. N. A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet, 24: 236-244., 2000.、 Fojo, A. T., Ueda, K., Slamon, D. J., Poplack, D. G., Gottesman, M. M., and Pastan, I. Expression of a multidrug— resistance gene in human tumors and tissues. Proc Natl Acad Sci U S A, 84: 265-269., 1987.参照）。 P— gpの過剰発現は、様々なガン細胞における薬剤耐性 の獲得に重要な役割を果たして 、る。悪性のガン細胞での MDR1遺伝子の発現は 、 YB—1の核転位（例えば Bargou, R. C" Jurchott, Κ·， Wagener, C" Bergmann, S" Metzner, S.， Bommert, Κ·， Mapara, M. Υ·， Winzer, K. J., Dietel, M., Dorken, Β·， and Royer, H. D. Nuclear localization and increased levels of transcription factor YB—1 in primary human breast cancers are associated with intrinsic MDR1 gene expression. Nat Med, 3: 447-450., 1997·、 Ohga, Τ·， Uchiumi, Τ·， Makino, Υ·， Koike, Κ·， Wada, M., Kuwano, M., and Kohno, K. Direct involvement of the Y— box binding protein YB—1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J Biol Chem, 273: 5997-6000·， 1998·参照）、プロモーターの再構 成 (例えば Harada, Τ·， Nagayama, J., Kohno, Κ·， Mickley, L. A., Fojo, Τ·， Kuwano, M., and Wada, M. Alu— associated interstitial deletions and chromosomal
re-arrangement in 2 human multidrug— resistant cell lines. Int J Cancer, 86:
506-511.， 2000.参照）及び MDR1プロモーターの CpG部位のメチル化状態の変異（ 例えば Kusaba, Η·， Nakayama, M., Harada, Τ·， Nomoto, M., Kohno, Κ·， Kuwano, M., and Wada, M. Association of 5' CpG demethylation and altered chromatin structure in the promoter region with transcriptional activation of the multidrug resistance 1 gene in human cancer cells. Eur J Biochem, 262:924 - 932·， 1999.、 Nakayama, M., Wada, M., Harada, T" Nagayama, J" Kusaba, H" Ohshima, K" Kozuru, M., Komatsu, Η·， Ueda, R.， and Kuwano, M. Hypomethylation status of CpG sites at the promoter region and overexpression of the human MDR1 gene in acute myeloid leukemias. Blood, 92: 4296—4307" 1998·、 Tada, Υ·， Wada, M., Kuroiwa, Κ·， Kinugawa, Ν·， Harada, Τ·， Nagayama, J., Nakagawa, M., Naito, S.， and Kuwano, M. MDR1 gene overexpression and altered degree of methylation at the promoter region in blaader cancer during chemotherapeutic treatment. Clin Cancer Res, 6: 4618-4627., 2000.参照）を含む様々なメカニズムに起因している。
P— gpは腸、肝臓、腎臓、脳、胎盤等様々な臓器の正常な細胞で発現する (例えば Thieoaut, F.， Tsuruo, Τ·， Hamada, Η·， Gottesman, Μ. Μ., Pastan, Ι·， and Willin gham, M. C. Cellular localization of the multidrug— resistance gene product
P— glycoprotein in normal human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A, 84: 7735-7738., 1987.、 Sugawara, I., Kataoka, I., Morishita, Υ·， Hamada, Η·， Tsuruo, Τ·， Itoyama ， S.， and Mori, S. Tissue distribution of P— glycoprotein encoded by a
multidrug— resistant gene as revealed by a monoclonal antibody, MRK 16. Cancer Res, 48: 1926-1929., 1988·、 Cordon— Cardo, C" O'Brien, J. P., Casals, D"
Rittman— Grauer, L., Biedler, J. L., Melamed, M. R.， and Bertino, J. R.
Multidrug- resistance gene (P- glycoprotein) is expressed by endothelial cells at blood-brain barrier sites. Proc Natl Acad Sci U S A, 86: 695—698·， 1989·参照）。 P— gpの広い基質特異性及び頂膜側の局在は、動物モデルでもヒトの体でも薬の性向 (drug disposition)に決定的な役割を果たしていることを強く示唆している（例えば Schinkel, A. Η·， Mayer, U., Wagenaar, Ε·， Mol, C. A., van Deemter, L., Smit, J. J.， van der Valk, M. A., Voordouw, A. C.， Spits, Η·， van Tellingen,〇·， Zijlmans, J. M., Fibbe, W. Ε·， and Borst, P. Normal viability and altered pharmacokinetics in mice lac ing mdrl -type (drug-transporting) P— glycoproteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 94: 4028-4033., 1997·、 Schinkel, A. H. Pharmacological insights from
P— glycoprotein knockout mice. Int J Clin Pharmacol Ther, 36: 9—13·， 1998.、 Ambudkar, S. V.， Dey, S.， Hrycyna, C. A., Ramachandra, M., Pastan, I., and Gottesman, M. M. Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 39: 361—398·， 1999·、 Watkins, P. B. The barrier function of CYP3A4 and P— glycoprotein in the small bowel. Adv Drug Deliv Rev, 27: 161-170., 1997·、 Fromm, M. F. The influence of MDR1 polymorpnisms on P— glycoprotein expression and function in humans. Adv Drug Deliv Rev, 54: 1295-1310.， 2002.参照）。腸では、 P— gpは、薬剤摂取後、薬剤の吸 収に参画していると考えられている（例えば Cordon-Cardo, C.， O'Brien, J. P., Boccia, J., Casals, D.， Bertino, J. R.， and Melamed, M. R. Expression of the multidrug resistance gene product (P- glycoproteinノ in human normal and tumor tissues. J Histochem Cytochem, 38: 1277-1287., 1990.、 Schuetz, E. G.， Schinkel, A. Η·， Relling, M. V.， and Schuetz, J. D. P— glycoprotein: a major determinant of rifampicin— inducible expression of cytochrome P4503A in mice ana humans. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 4001—4005·， 1996·、 Greiner, Β·， Eichelbaum, M., Fritz, P., Kreichgauer, H. P., von Richter,〇·， Zundler, J., and Kroemer, H. K. The role of intestinal P— glycoprotein in the interaction of digoxin and rifampin. J Clin Invest, 104: 147-153., 1999.参照）。血液脳関門では、 P— gpは、脳内への基質の取り込み に影響を及ぼす（例えば Thiebaut, F.， Tsuruo, Τ·， Hamada, Η·， Gottesman, Μ. Μ., Pastan, Ι·， and Willingham, Μ. C. Cellular localization of the multidrug— resistance gene product P— glycoprotein in normal human tissues. Proc Natl Acad Sci U S A, 84: 7735-7738., 1987.、 Schumacher, U. and Mollgard, K. The multidrug— resistance P- glycoprotein (Pgp, MDRl) is an early marker or blood-brain barrier development in the microvessels of the developing human brain. Histochem Cell Biol, 108:
179-182., 1997·、 Rao, V. V.， Dahlheimer, J. L., Bardgett, M. Ε·， Snyder, A. Ζ·， Finch, R. A., Sartorelli, A. C.， and Piwnica— Worms, D. Choroid plexus epithelial expression of MDRl P glycoprotein and multidrug resistance-associated protein contribute to the blood-cerebrospinal-fluid drug-permeability barrier. Proc Natl Acad Sci U S A, 96: 3900—3905" 1999·、 Thiebaut, F.， Tsuruo, Τ·， Hamada, Η·， Gottesman, M. M., Pastan, I., and Willingham, M. C. Immunohistochemical localization in normal tissues of different epitopes in the multidrug transport protein PI 70: evidence for localization in brain capillaries and crossreactivity of one antibody with a muscle protein. J Histochem Cytochem, 37: 159-164·， 1989·参照)。 MDRl発現レベルは、個人によって幅広く変動するため（例えば Hinoshita, Ε·， Uchiumi, Τ·， Taguchi, Κ·， Kinukawa, Ν·， Tsuneyoshi, Μ., Maehara, Υ·， Sugimachi, Κ., and Kuwano, M. Increased expression of an ATP— binding cassette superfamily transporter, multidrug resistance protein 2, in human colorectal carcinomas. Clin Cancer Res, 6: 2401-2407., 2000·参照）、これらの変動は、個体から個体へ、異なつ た薬の性向を通じて、薬剤の毒性及び薬剤の処理の有効性に、影響を及ぼす可能 性が考えられている。さらに、これらの変動は、ガンの危険因子等の他の臨床的な関 連性がありうる。なぜなら、本発明者ら及び他の研究者らは、近年、 MDR1のマウス 相同遺伝子である mdrlaが欠損しているマウスで、ポリープの形成の抑制を観察し たからである（例えば Mochida, Y.， Taguchi, K., Taniguchi, S.， Tsuneyoshi, M., Kuwano, H., Tsuzuki, T., Kuwano, M., and Wada, M. The role of P— glycoprotein in intestinal tumorgenesis: disruption of mdrla suppresses polyp formation in Ape Min/+ mice. Carcinogenesis, 24: 1219-1224., 2003.、 Yamada, T., Mori, Y., Hayashi, R., Takada, M., Ino, Y., Naishiro, Y., Kondo, T., and Hirohashi, S.
Suppression of intestinal polyposis in Mdrl— deficient ApcMin/ + mice. Cancer Res, 63: 895-901., 2003.参照）。しかし、分子を基盤とする、基本的な発現レベルでの個 体間変異におけるメカニズムは、知られて ヽな 、。
また、 MDR1における遺伝的多型と P— gpレベルとの関連性力 近年報告されてい る（例えば Hoffineyer, S" Burk, O., von Richter, O., Arnold, H. P., Brockmoller, J" Johne, A., Cascorbi, I., Gerloff, T., Roots, I., Eichelbaum, M., and Brinkmann, U. Functional polymorphisms of the human multidrug— resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P— glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 3473-3478., 2000.、 Ito, S., Ieiri, I., Tanabe, M., Suzuki, A., Higuchi, S., and Otsubo, K. Polymorphism of the ABC transporter genes, MDR1, MRP1 and MRP2/cMOAT, in healthy Japanese subjects. Pharmacogenetics, 11: 175-184., 2001.参照）。 Hoffineyer et aUこより、健康な白人 における、コード領域に 6つ含まれる 15の一塩基多型（SNP)が報告されている。そ のうちの 1つの SNPである、 c. 3435C<T (ェクソン 26)は、腸内の P— gp発現と、 P— gp基質である経口ジコキシンの取り込みとに関与していることを示唆した。しかし、日 本人の被験者では、 c 3435C >Tは、 P— gpの胎盤での発現と関連していないこと が報告されている（例えば Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N" Inoue, K., Ito, S" Kanamori, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and
Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)- 1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143., 2001.参照）。さらに、 Hoffineyer et al.の報告とは対照的に、 c. 34 35C >Tの T対立遺伝子は、健康な日本人の被験者の十二指腸の腸細胞の MDR1 mRNA発現レベルを上昇させた（例えば Nakamura, T., Sakaeda, T.， Horinouchi, M., Tamura, T., Aoyama, N., bhirakawa, T., Matsuo, M., Kasuga, M., and
Okumura, K. Effect of the mutation (C3435T) at exon 26 of the MDR1 gene on expression level of MDR1 messenger ribonucleic acid in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects. Clin Pharmacol Ther, 71: 297-303" 2002.参照）。 c. 343 5C >Tは、アミノ酸置換を伴わないサイレント変異である。 Kim et aUこより、 P-gp機 能が、 Ala893Thr及び Ala893Serをそれぞれ生成し、部分的に c. 3435C >Tとリ ンクしているェクソン 21における SNPである c. 2677G >T、 Aによって影響を受け得 ることが報告されている（例えば Kim, R. B., Leake, B. F.， Choo, E. F.， Dresser, G. K., Kubba, S. V., Schwarz, U. I., Taylor, A., Xie, H. G., McKinsey, J., Zhou, S., Lan, L. B., Schuetz, J. D., Schuetz, E. G., and Wilkinson, G. R. Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African
Americans. Clin Pharmacol Ther, 70: 189-199., 2001.参照）。 Tanabe et aUこより、胎 盤の P— gp発現レベルは、 2677G >T、 Aによって影響を受けることが報告されて ヽる (f列 ま i，anabe, M., Iein, I., Nagata, N., Inoue, K., Ito, S., Kanamon, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)- 1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143., 2001.参照)。したがって、 c. 3435C >T遺伝子型と生化学的な表現型 P— gp活性と の関係は、近年報告（例えば Sakaeda, T., Nakamura, T.， and Okumura, K.
Pharmacogenetics of MDR1 and its impact on the pharmaco inetics and
pharmacodynamics of drugs. Pharmacogenomics , 4: 397—410, 2003.参照)されている ように、明確でないように思われる。
その他、ヒト MDR1遺伝子の、 cDNA配列のコード領域における位置で第 2677番 目の塩基がグァニンである力、アデニン又はチミンであるかを調べて、タクロリムスや シクロスポリン等の免疫抑制剤の副作用を予測する方法 (例えば特開 2002— 223 769号公報参照）や、 p53遺伝子が正常に機能しないことが関与して発生している癌 において、 p53遺伝子に生じた機能変化が癌の発生に関与していることを、 p53遺 伝子の機能変化によって影響を受けている IL 1 α遺伝子、 ΡΑΙ— 1遺伝子、 MDR1 遺伝子、 MMP - 3遺伝子等の下流遺伝子群の発現状態を測定することによって判 定する疾病原因の診断方法 (例えば特開 2002-269号公報参照）が提案されてい る。
ABCトランスポータは抗ガン剤の感受性や体内動態の鍵を握る分子標的であり、 その発現の個人差が生じる分子的背景を明らかにすることは個別化治療に重要であ る。また、多くの薬剤が P-gpの基質であるため、 P-gpの発現及び活性の程度が、か 力る薬剤の治療効果に直接影響を及ぼす可能性がある。薬理学的な関連性の他に 、 P-gp SNPの個体間変異及び発現レベルには、以下のような他の臨床的な影響も 考えられる。近年、本発明者らは、マウスの結腸直腸の発ガンにおける P— gpの役割 を見 ヽ出し (Mochida, Y., Taguchi, K., Taniguchi, S., Tsuneyoshi, M., Kuwano, H., Tsuzuki, T., Kuwano, M., and Wada, M. The role of P— glycoprotein in intestinal tumorgenesis: disruption of mdrla suppresses polyp formation in Ape Min/+ mice. Carcinogenesis, 24: 1219-1224., 2003.、 Yamada, T., Mori, Y., Hayashi, R., Takada, M., Ino, Y., Naishiro, Y., Kondo, T., and Hirohashi, S. Suppression of intestinal polyposis in Mdrl- deficient ApcMin/+ mice. Cancer Res, 63: 895-901., 2003.参照;） 、ヒト MDRlの相同遺伝子である mdrlaが欠損しているマウスは、野生型マウスと比 較すると、 DNAの損傷が著しく増加していることも見い出した。驚くことに、本発明者 ら及び他の研究者らは、 APCMinバックグラウンド下の野生型マウスと比較すると、 m dr la欠損マウスでは、ポリープの発生数が統計的に少ないことも見い出している。大 腸での P— gp発現の個体間変動は、ヒトの結腸直腸の発ガンと関連性が考えられる。 ヒト MDR1遺伝子の 5'制御領域の SNPは、日本人の結腸直腸粘膜及び肝臓におけ る、 MDRl mRNA及び P— gp発現と関連性があり、このことは、 MDR1の SNPと薬 剤反応性との関係のさらなる分析にも、薬剤反応性の個体間変動及びガンのリスク における P— gpの重要性のさらなる評価にも、スキームを提供すると考えられる。また MDR1遺伝子は、異物の排除による生体防御に関与すると考えられるので、炎症性 腸疾患や、その他、異物の排除による生体防御機能の破綻により発症する病態，疾 患や、細胞の生存'抗アポトーシス機能に依存する病態 ·疾患や、その破綻による病 態'疾患の発症を予測、診断出来ると考えられる。さらに、予測、診断を超えて MDR 1を標的とした薬剤開発により、上記疾患の予防と治療に展開することが可能である 。本発明の課題は、頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送する ABCトランスポータ、 P gpに注目し、 P— gpをコードする MDR1遺伝子の 5'制御領域を標的とした MDR1 遺伝子のハプロタイプやディプロタイプを判定する方法を提供することにある。
[0008] 本発明者らは、 日本人の MDR1遺伝子の転写開始部位力も 4kbにわたる 5'制御 領域（5， upstream regulatory region)のヌクレオチド配列多型を分析し、この領域内 で 8個の一塩基多型（SNP)を同定した（図 1参照）。これら同定した 8個の SNPsの内 の 2個（一 692T>C及び 934A>G)は既知であつたが、残りの 6個（一 1325A>G 、 一 1717T>C、 一 1910T>C、— 2352G>A、 一 2410T>C及び— 2903T>C)の SNPsは未報告のものであり、その内の 3個（― 1910T>C、 一 2352G>A、— 2410T >C)は完全な連鎖不均衡を示した。そして、ハプロタイプやディプロタイプと大腸正 常粘膜における MDR1遺伝子の発現レベルとが相関することや、大腸癌患者には MDR1遺伝子の発現レベルが低いと予想されるディプロタイプが見い出せなかった ことや、逆に、 MDR1遺伝子の発現レベルが高いと予想されるディプロタイプの出現 頻度は一般健常者対照群に比べ、大腸癌患者疾患群において高いことや (統計解 祈により、 MDR1が高いディプロタイプ A、中間的なディプロタイプ Bと Cそして、 MD R1が低!、ディプロタイプ Dと Eをまとめて解析してォッズ比を出すと、ディプロタイプ A を 1としたとき、ディプロタイプ D, Eが半分の 0. 524、ディプロタイプ B, Cは中間的な 値の 0. 892を示した）、 MDR1遺伝子の 5'制御領域に結合する蛋白質の結合能が SNPsにより大きく変化することや、 95%以上が 3つのハプロタイプに収束することな どを見い出し、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の SNPsが薬剤応答性及び発癌リスクを 予測するマーカーとして有用であるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づき完 成するに至ったものである。
発明の開示
[0009] すなわち本発明は、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始 コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、 -2903 位、 2410位、 2352位、 1910位、 1717位及び一 1325位力ら選ば、れる位置に おける多型を検出することを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ 及び Z又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 1)や、 MDR1遺伝子の 5'制御領 域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応 する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—2352位、—1910位、—1717位 及び 1325位力も選ばれる位置における多型に加えて、— 934位及び/又は 692 位の位置における多型を検出することを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領域の ハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 2)や、—2903位の 塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項 1又 は 2記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを 判定する方法 (請求項 3)や、 2410位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べ ることを含むことを特徴とする請求項 1一 3のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制 御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 4)や、 23 52位の塩基力 グァニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする 請求項 1一 4のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z 又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 5)や、 1910位の塩基力 チミン又はシ トシンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項 1一 5のいずれか記載の M DR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 6)や、—1717位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むこ とを特徴とする請求項 1一 6のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロ タイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法 (請求項 7)や、—1325位の塩基が 、グァニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴とする請求項 1一 7の いずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイ プを判定する方法 (請求項 8)に関する。
また本発明は、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩 基がチミン、—2352位の塩基がアデニン、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩 基がアデニン、—692位の塩基がチミンに置換されて 、ることを特徴とする MDR1遺 伝子の 5'制御領域 DNA (請求項 9)や、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列に おいて、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示 したとき、—2410位の塩基がシトシン、—2352位の塩基がグァニン、—1910位の塩 基がシトシン、—934位の塩基がグァニン、 692位の塩基がシトシンに置換されてい ることを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領域 DNA (請求項 10)や、 MDR1遺伝 子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とし た場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩基がシトシン、 2352位の塩 基がアデニン、—1910位の塩基がシトシン、—934位の塩基がグァニン、 692位の 塩基がシトシンに置換されていることを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領域 DNA (請求項 11)や、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩 基がチミン、—2352位の塩基がアデニン、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩 基がグァニン、—692位の塩基がチミンに置換されて 、ることを特徴とする MDR1遺 伝子の 5'制御領域 DNA (請求項 12)に関する。
[0011] さらに本発明は、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コド ン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、― 2410位、 2352位、 1910位、—1717位及び 1325位から選ばれる位置におけ る多型を検出する MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプを判定する方法に用 いられるプライマーセットであって、多型を検出する位置の上流の領域とハイブリダィ ズするフォワード側プライマーと、多型を検出する位置の下流の領域とハイブリダィズ するリバース側プライマーとからなることを特徴とするプライマーセット（請求項 13)や 、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2352位の位置と、 -2410 位、—1910位、—692位カゝら選ばれる位置とにおける多型を検出することを特徴とす る MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法 (請求項 14)に関す る。
[0012] また本発明は、 TaqMan (登録商標）法により遺伝子タイピングを実施することを特徴 とする請求項 14記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方 法 (請求項 15)や、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コド ン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、 2352位の 位置と、—2410位、 1910位、—692位カゝら選ばれる位置とにおける多型を検出す る MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられるプロ一 ブ及びプライマーセット（請求項 16)や、 TaqMan (登録商標）法により MDR1遺伝子 の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられることを特徴とする請求項 16記載のプローブ及びプライマーセット（請求項 17)や、請求項 1一 8のいずれか記 載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定す る方法又は請求項 14若しくは 15記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイ プを判定する方法を用いることを特徴とする大腸癌発症の予測方法 (請求項 18)や、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列にお 、て、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—235 2位、 1910位、 1717位及び 1325位、 934位、—692位から選ばれる 1以上の 位置を標的とすることを特徴とする MDR1発現制御薬の開発方法 (請求項 19)に関 する。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]第 1図は、 MDR1遺伝子の 5'調節領域の SNPsの位置を示す図である。
[図 2]第 2図は、 5'制御領域におけるディプロタイプと MDR1遺伝子の mRNAレベル との関連性を示す図である。
[0014] A: 5'制御領域で 5つの多型（一 2410、 一 2352、 一 1910、—934及び
692)を分析し、 MDRl mRNAレベルを 72の正常な直腸結腸粘膜で、リアル タイム PCRにより測定した。 72のサンプルは、ディプロタイプにより分けた：ディプロタ ィプ A (ノヽプロタイプ lZl)、ディプロタイプ B (ノヽプロタイプ 1Z2)、ディプロタイプ C ( ハプロタイプ 1Z3)、ディプロタイプ D (ノヽプロタイプ 2Z2)。 MDRl mRNAレベルは 、 GAPDH mRNAレベルでノーマライズした。
[0015] B: 5'制御領域で 5つの多型（一 2410、 一 2352、 一 1910、—934及び
—692)を分析し、 MDRl mRNAレベルを、 43の正常な肝臓組織で測定した。
[図 3]第 3図は、 JSB-1抗体による、 P-gpの免疫組織学的染色の結果をを示す図で める。
[0016] P - gpの陽性染色は、上皮領域の表面の頂膜側組織で観察した。塗りつぶした矢 頭は、抗 P— gp抗体 (JSB— 1)により染色された P— gpを示す。各サンプルの MDR1 mRNAレベルの値が示されて!/、る。
[図 4]第 4図は、電気泳動度シフトアツセィによる、 MDR1遺伝子の 5'調節領域に結 合するタンパク質の検出結果を示す図である。
[0017] 実験は、 3回ずつ行い、同様の結果を得た。図 4中、 NEは核抽出物を示す。
[0018] 結合緩衝液 B (-23520A;パネル A)又は結合緩衝液 A (― 692T > C；パネル B )中で 32P標識オリゴヌクレオチドとインキュベートした核抽出物（1—2 μ gのタンパク 質）は、ゲル電気泳動により分別した。コンペティション用に、 10倍過剰の未標識オリ ゴヌクレオチド (一 2352G又は— 2352A)を追カ卩した。塗りつぶした矢頭は、遅延した DNAタンパク質複合体を示し、アステリックスは、核タンパク質の非特異結合を示す 発明を実施するための最良の形態
[0019] 本発明の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判 定する方法としては、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始 コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、 -2903 位、 -2410位、 -2352位、—1910位、—1717位及び- 1325位から選ばれる 1又は 2以上の位置における多型を検出する方法であれば特に制限されるものではないが 、上記— 2903位、—2410位、—2352位、—1910位、—1717位及び— 1325位力も選 ばれる位置に加えて、ー934位及び Z又は 692位の位置における多型を検出する 方法が好ましぐ中でも— 2410位、 2352位、 1910位、—934位及び 692位の 位置における多型を検出する方法が好ましい。ここで、多型を検出する位置は、 AT G開始コドンの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示されている。 AT G開始コドンは、ェクソン 2に位置し、転写開始サイトはこの番号方式では、 699に 相当する。なお、遺伝子タイピング実験により得られるデータは直接的にはデイブロタ ィプであるが、ディプロタイプ力も逆にハプロタイプを予測することは可能である。発 現レベルや発がんリスクとの相関解析は何れもディプロタイプとの相関を解析してお り、また、 TaqMan (登録商標）法による遺伝子タイピングで得られるデータもデイブロタ ィプである。また、配列番号 1には、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の相補配列（MDR 1遺伝子領域からみて相補配列情報である GenBank accession nos. gi|l9697556|gb|AC002457.2|の一部）が示されている。したがって、例えば、配列番号 1の 2410番目の塩基" A"と塩基対を形成する相補的塩基" T"が、上記 - 2410位の 塩基であることがわかる。
[0020] 上記— 2903位、—2410位、—2352位、—1910位、—1717位、—1325位、—934 位及び 692位力も選ばれる位置（以下、「所定の変異位置」ということがある。）にお ける多型を検出する方法として、具体的には、—2903位の塩基がチミン又はシトシン であるか、—2410位の塩基がチミン又はシトシンである力 —2352位の塩基がグァ- ン又はアデニンである力、—1910位の塩基がチミン又はシトシンである力、—1717位 の塩基がチミン又はシトシンである力 — 1325位の塩基がアデニン又はグァニンであ る力、—934位の塩基がアデニン又はグァニンである力、—692位の塩基がチミン又 はシトシンであるかをそれぞれ調べる方法を例示することができる。なお、配列番号 1 には、—2903位の塩基がチミン、—2410位の塩基がチミン、—2352位の塩基がグァ ニン、—1910位の塩基がチミン、—1717位の塩基がチミン、—1325位の塩基がアデ ニン、—934位の塩基がアデニン、—692位の塩基がチミンである通常の MDR1遺伝 子の 5'制御領域の塩基配列の相補的塩基配列が示されている。
[0021] 所定の変異位置における多型を検出する方法として、 PCR、リガンドストリングス反 応、制限酵素消化法、直接塩基配列決定法、核酸増幅技法、ハイブリダィゼーショ ン技法、免疫アツセィ法、質量分析法等を用いる従来公知の SNPを検出しうる方法 であれば特に制限されず、例えば、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列は既に わかって!/、ることから (配列番号 1参照）、後述する表 1に示すような所定の変異位置 (多型を検出する位置）の上流の領域とハイブリダィズするフォワード側プライマーと、 所定の変異位置の下流の領域とハイブリダィズするリバース側プライマーとからなる プライマーセット（配列番号 2— 25)を用いて、 PCR等の公知の核酸増幅法により増 幅し、その増幅断片の塩基配列を決定するダイレクトシーケンシングする方法、 TaqMan (登録商標)プローブを用いる方法や、増幅断片の制限酵素断片長多型 (R FLP)を調べる方法や、 SSCP ^single-strand conformation polymorphism)のよつな方 法の他、 ASOハイブリダィゼーシヨン、 ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法 、 RNaseA切断法、化学切断法、 DOL法、インベーダー法、 MALDI— TOF,MS 法、 TDI法、モレキュラ^ ~ ·ビーコン法、ダイナミック 'アレルスぺシフィック'ノヽイブリダ ィゼーシヨン法、ノ ドロック'プローブ法、 UCAN法、 DNAチップ又は DNAマイクロ アレイを用いた核酸ノヽイブリダィゼーシヨン法、 ECA法〖こよっても行うことができる。上 記プライマーは MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダィズ するサイズを有していればよぐ通常、 15塩基一 40塩基、好ましくは 20塩基程度の サイズを有するものが用いられ、増幅領域のサイズも特に限定されるものではな 、。 また、 PCRの铸型となるゲノム DNAは、 MDR1発現の有無に拘わらず、抹消血、毛 根、 口腔粘膜、血液塗抹標本など、生細胞や死細胞が含まれる試料から、常法によ り調製することがでさる。
[0022] MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプやディプロタイプの判定は、すべての 所定の変異位置における多型を検出して判定してもよいが、一部の所定の変異位置 における多型を検出して判定してもよい。例えば、マイナー対立遺伝子の頻度がある 程度—2410位、 2352位、 1910位、—934位及び 692位の各位置における多 型を検出した場合、ハプロタイプやディプロタイプ^^約することができる。
[0023] 本発明の MDR1遺伝子の 5'制御領域 DNAとしては、 MDR1遺伝子の 5'制御領 域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応 する位置で表示したとき、—2410位の塩基がチミン、—2352位の塩基がアデニン、― 1910位の塩基がチミン、—934位の塩基がアデニン、—692位の塩基がチミンに置 換されている DNAや、—2410位の塩基がシトシン、—2352位の塩基がグァニン、 - 1910位の塩基がシトシン、—934位の塩基がグァニン、—692位の塩基がシトシンに 置換されている DNAや、—2410位の塩基がシトシン、—2352位の塩基がアデニン、 —1910位の塩基がシトシン、—934位の塩基がグァニン、—692位の塩基がシトシン に置換されている DNAや、—2410位の塩基がチミン、—2352位の塩基がアデニン 、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩基がグァニン、—692位の塩基がチミンに 置換されている DNAを挙げることができる。これら DNAは、—2410位の塩基がチミ ン、—2352位の塩基がグァニン、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩基がアデ ニン、—692位の塩基がチミンに置換されている DNAと共に、 MDR1遺伝子の 5'制 御領域のハプロタイプを構成する。
[0024] 本発明のプライマーセットとしては、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列にお いて、翻訳開始コドン ATGの最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示し たとき、—2903位、—2410位、—2352位、—1910位、—1717位及び— 1325位力も 選ばれる位置における多型を検出する MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ を判定する方法に用いられるプライマーセットであって、多型を検出する位置の上流 の領域とハイブリダィズするフォワード側プライマーと、多型を検出する位置の下流の 領域とハイブリダィズするリバース側プライマーと力もなり、これら各プライマーは MD R1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列に特異的にハイブリダィズするサイズを有してい ればよぐ通常、 15塩基一 40塩基、好ましくは 20塩基程度のサイズを有するものが 用いられ、増幅領域のサイズも特に限定されないが、例えば、表 1記載に示される、 - 2410位における多型を検出する P5FZR (配列番号 10と 11)、—2352位における 多型を検出する P6FZR (配列番号 12と 13)、—1910位における多型を検出する P 7FZR (配列番号 14と 15)、—1717位における多型を検出する P8FZR (配列番号 16と 17)、及び- 1325位における多型を検出する P9FZR (配列番号 18と 19)の各 プライマーセットを具体的に例示することができる。
[0025] また、本発明の MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法として は、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初 の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2352位の位置と、 -2410 位、 1910位、—692位力も選ばれる位置とにおける多型を検出する方法であれば 特に制限されず、後述する実施例 12の表 3に示すように、 2410T (C)、— 1910T ( C)及び 692T (C)は連鎖不平衡のために、ほとんどの場合、各クローンで一緒に 検出されるが、—2352位 G (A)は独立していることから、 -2352位と- 2410位との位 置とにおける多型を検出する方法、—2352位と 1910位との位置とにおける多型を 検出する方法、—2352位と 692位との位置とにおける多型を検出する方法を具体 的に挙げることができる。例えば、—2352位 G (A)と- 692位 T (C)との位置とにおけ る多型を検出し、（一 2352位， 692位 Z 2352位，—692位）が、 (G, T/G, T)ゝ ( G, T/A, T)ゝ (G, T/G, C)、 (A, T/A, Τ)ゝ (G, C/G, C)等のディプロタイプ に判定'分類することができる。力かる MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプ を判定する方法には、 TaqMan法により遺伝子タイピングを実施する方法を有利に例 示することができる。 TaqMan法により遺伝子タイピングを実施する際に用いられるプ ローブ及びプライマーセットとしては、— 2352タイピング用には配列番号 61に示され る G検出用プローブ、配列番号 62に示される A検出用プローブ、配列番号 63及び 6 4に示されるプライマーセット、— 692タイピング用には配列番号 69に示される T検出 用プローブ、配列番号 70に示される C検出用プローブ、配列番号 71及び 72に示さ れるプライマーセットを好適に例示することができる。
[0026] 前記のように、 MDR1遺伝子の発現レベルが高いと予想されるディプロタイプの出 現頻度は一般健常者対照群に比べ、大腸癌患者疾患群において高い (統計解析に より、 MDR1遺伝子の発現が高いディプロタイプ A、中間的なディプロタイプ Bと C、 そして、 MDR1が低いディプロタイプ Dと Eをまとめて解析してォッズ比を出すと、ディ プロタイプ Aを 1としたとき、ディプロタイプ D, Eが半分の 0. 524、ディプロタイプ B, C は中間的な値の 0. 892を示した)ことから、上記本発明の MDR1遺伝子の 5'制御領 域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法や、 MDR1遺伝子の 5' 制御領域のディプロタイプを判定する方法を用いると、大腸癌発症の予測が可能と なる。また、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATG の最初の塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410 位、—2352位、—1910位、—1717位及び— 1325位、—934位、—692位力も選ばれ る 1以上の位置を標的とする MDR1発現制御薬の開発が可能となる。
[0027] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0028] (ボランティアと患者）
血液サンプルは、九州大学の 25人の健康な日本人のボランティア力 入手した。 正常な結腸直腸粘膜の臨床サンプルは、 1993年 9月力も 1998年 8月の間に、九州 大学病院第二外科 (福岡県)、大腸肛門病センター高野病院 (熊本県)又は群馬大 学病院第一外科 (前橋巿)でガンの外科的切除を受けた 72人の日本人の患者から 入手した。これらの血液サンプル及び非ガン性粘膜は、倫理審査委員会 (IRB)承認 のプロトコルに準じて入手した。被験者は全員、インフォームドコンセントに同意して いる。サンプルは、液体窒素内で冷凍し、 RNA及び DNAを抽出するまで—80°Cで 保存した。どの患者も、外科的切除までィ匕学療法を受けていな力つた。正常な肝臓 組織の臨床サンプルは、九州大学病院第二外科 (福岡県)で、ガンの外科的切除を 受けた 43人の肝臓ガン患者の、ガンの周囲の非ガン性組織とした。
実施例 2
[0029] (DNA及び RNAの単離）
ボランティアの血液サンプルのゲノム DNAは、 QiaAmp blood kit (Qiagen社製）を使 用して単離し、患者の組織の DNAは、 Easy DNA Kit (Invitrogen社製)を製造者のプ ロトコルに従って使用して単離した。 RNAは、 RN A抽出剤である TRIzol (Invitrogen Life Technologies社製）又は Rneasy (Qiagen社製）をそれぞれ製造者のプロトコルに 従って使用して単離した。
実施例 3
[0030] (DNAシーケンシング及び MDR1遺伝子における SNPの同定）
MDR1遺伝子断片の PCR増幅用の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、既 知の配列から派生させた [GenBank accession nos.: 5'制御領域、ェクソン 1—7には A C002457及びェクソン 8— 28には AC005068]。ェクソン内の SNPの位置は、 AT G開始コドンの最初の塩基が + 1にセットされた MDR1 cDNA [GenBank accession no. : M14758、ェクソン 10のコドン TTC、 F335はこの配列で欠如している]の位置 に相当する。 Chen et aUこよりェクソンが定義され（Chen, C. J" Clark, D.， Ueda, K., Pastan, I., ottesman, M. M., and Roninson, I. B. Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of P— glycoproteins. J Biol Chem, 265: 506-514., 1990)、ヒトゲノム機能（Human Genome Organisation)推薦の 命名法 (Antonarakis, S. E. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. Hum Mutat, 11: 1-3., 1998)を SNP 命名法に使用した。プライマーは、以前に報告されている SNPを含む配列を含む領 域を増幅する力、又は表 1に示すように MDR1上流調節領域の約 4kbをカバーする ように、設定した。これらのプライマーの PCRの条件は、本発明者らに依頼すれば入 手できる。精製した PCR断片の配列は、 BigDye Terminator cycle sequencing reactions (Perkin- Elmer社製)を使用して、 ABI3700 (毛細血管）シークェンサ一で 、 自動 DNAシーケンシングにより入手した。
実施例 4
[0031] (PCR増幅及びシーケンシングによる 5'制御領域におけるハプロタイプの特定） 少なくとも 1つの SNPの座位でヘテロ接合型である個体のハプロタイプは、フォーヮ 一ドプライマ一 MDR1P5F及びリバースプライマー MDR1P11Rを使用して、 PCR 増幅及びシーケンシングにより特定した。約 4kbにわたる MDR1遺伝子の 5'制御領 域の SNPのスクリーニングに使用した 12のプライマーセットのヌクレオチド配列（配列 番号 2— 25)を表 1に示す。製造者のプロトコルに従って高 、適合性を有する DNA ポリメラーゼ、 KOD— Plus (東洋紡株式会社製)を使用し、 PCR増幅を行った。断片 は、 pT7Blue— 3ベクター（Novagen社製）内に挿入し、サブクローユングした。少なく とも 6つのコロニーを選択し、プラスミドは、製造者のプロトコルに従って Qiagen DNA Kitで精製した。 SNP部位は、シーケンシングにより分析し、ハプロタイプを確認した。
[0032] [表 1]
2004/013839
Sequences of oligonucleotide primers used for direct sequecciog
Primer pair Product length (bp)
MDR1P1F: T TATGTCTCAGCCrGGGCG 324
MDR1P1R: TCACAGGAGAGCAGACACGT
MDR1P2F: CTC TGCrCACTCTAGGGAC 227
NfDR]P2 : CAAATATGATCATGAGCCAC
MDR1P3F: CACATATCATCTGAOAAGCCCA 233
MD 1P3R: AGGACACACCACTFCACTGC
MDR1P4F: AGGCAGTGAAGTGOTGTGTC 453
MDR1P4R: ACCTTCArrCAAOCGG OAr
DR1PSF: ATOAOAGCGGAGOACAAGAA 469
MDR1?5RJ AACCXnXCCTAAACAGTGCA
Figure imgf000021_0001
MDR1P6R: AGG rrCTAACAGG CACTA
MDRIP7F; AACAATCCTCTAC^CTTGCA 443
MDR1P7R: CTTGGCCTTACAArACAArG
MDR1P8F: CGACAAAGCAAGACTCCG C 438
MDR1PSR: CCITCCATAnTACTGCCAACA
MDR1P9F: GAATTGTGCAGAITGCACG 437
DR1P9R: TCCCACCrCrCCAATTCrGT
MDR1P10F: AGCATGCTGAAGAAAGACCA 380
D 1P10R: TCAGCCTCACCACAGATGAC
DR1P11F: CrCGAGGAArCAGCATTCAO 472
MDRIPIIR: CTCCA iTGCCACIACGGTrT
MDR1P12F: GGGACCAAOTGGCGTrAGAT 474
MDR1P12R: CrrCnTGCTCCTCC/OTGC
The nucleotide sequences of 12 primer pairs used to screen the S Ps al the 5' regulatory region of the MDR! gene spanning about 41c . 実施例 5
(定量的逆転写 (RT) - PCR分析）
文献（Gibson, U. Ε.' Heid, C. Α.' and Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT- PCR. Genome Res, 6: 995-1001., 1996)記載に準じて、 real-time TaqmanTM technology and Model 7900 Sequence Detectors (
Perkin-Elmer社製)により、定量的 PCRを行った。本発明で使用したプライマーの対 の配列及びプローブは、文献（Hinoshita, E.， Uchiumi, T.， Taguchi, Κ., Kinukawa, N., Tsuneyoshi, M., Maehara, Y., Sugimachi, K., and Kuwano, M. Increased expression of an ATP— binding cassette superfamily transporter, multidrug resistance protein 2, in human colorectal carcinomas. Clin Cancer Res, 6: 2401-2407., 2000.) 記載の通りである。
実施例 6
[0034] (MDR1の 5'制御領域のルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクターへのクロー-ング )
タイプ 3の対立遺伝子を抽出するために、—2604から— 570を含む断片は、ハプロ タイプ 1及び 2のホモ接合体、並びにハプロタイプ 1及び 3のへテロ接合体に相当す るテンプレートから増幅した。それぞれ Nhel部位を含む、フォーワードプライマー 5'— AAAGCTAGCTGTC AGTGG AGC AAAG AAATG-3 ' (配列番号 26)及びリバ ースプライマー 5'— AAAGCTAGCCTCGCGCTCCTTGGAA— 3' (配列番号 27 )を使用した。これらの増幅後の産生物を、 pGL3ベーシックベクター（Promega社製） の Nhel部位に挿入した。コンストラクトの SNP部位は、シーケンシングにより確認した 実施例 7
[0035] (細胞の培養及びトランジェント ·トランスフエクシヨン）
本発明では、ヒト肝臓ガン細胞株 (HepG2)を使用した。細胞は、二酸化炭素 5%を 含む加湿された条件下で、 37°Cにて培養した。全量: L gの pGL3ベーシックベクタ 一 DNA又はレポーターコンストラクトをトランスフエタトし、製造者のプロトコルに従つ て LIPOFECTAMINE 2000(Life Technologies社製)試薬を使用して、 lOOngの phRL TKベクター DNA(Promega社製)を、トランスフエクシヨンコントロールとして、全ての ゥエルにコトランスフエクシヨンした。プレートは、 DNA— LIPOFECTAMINE複合体 を加えた後、 37°Cにて 6時間インキュベートし、その後成長培地を交換した。プレート は、ルシフェラーゼアツセィまで、さらに 24時間インキュベートした。デュアル ·ルシフ エラーゼレポーターアツセィシステム（Promega社製）を使用して、ホタル及びゥミシィ タケ (renilla)のルシフェラーゼ活性を照度計で測定した。データは、トランスフエクショ ンの効率用にゥミシィタケルシフェラーゼ活性 (Renilla luciferase activity)により、ノー マライズ (normalize)した。同一のトランスフエクシヨン反応を含む、 24ゥエルプレートの 3ゥエルを使用して、全ての実験でトランスフエクシヨンを 3回行った。
実施例 8
[0036] (定量的免疫糸且織学）
最初に使用した抗体は、 P— gp FSB— 1) (マウスモノクローナル、 Sanbio社製)であ つた。 P— gpの免疫染色は、文献（32)記載に準じて行った。免疫組織学による確実 な定量的検出を行うために、腸細胞で発現する追加的マーカタンパク質であるビリン (villin)を使用した。定量ィ匕には、 ImageGaugeソフトウェア（富士写真フィルム株式会 社製)を使用した。
実施例 9
[0037] 電気泳動度シフトアツセィ
各オリゴヌクレオチドのセンス鎖の DNA配列は、 5'— AAATGAAAGGTGAGAT AAAGCAACAA-3' (一 2352G ;配列番号 28)、 5 '-AAATG AAAGGTG AAA TAAAGC AAC AA-3 ' (— 2352A ;配列番号 29)、 5，—G AGCTC ATTCG AGTA GCGGCTCTTCC— 3' (— 692T ;配列番号 30)及び 5'— GAGCTCATTCGAGC AGCGGCTCTTCC-3 ' (一 692C ;配列番号 31)であった。核抽出物（タンパク質 2 μ \)は、文献 (40、 41)記載に準じて、 HepG2細胞力ら調製した。次に、 2 μ \ の 5χ結合緩衝液； 5mM DTT ; lOngポリ（dl— dC)；及び 1 X 104cpm 32P標識オリ ゴヌクレオチドプローブを含む最終容量 10 1の反応混合物中で、様々なコンペティ ターの存在下又は非存在下で、室温にて 30分間インキュベートした。本発明者らは 、 5つの異なった種類の結合緩衝液で試みて、最も鮮明で遅れて現れるバンドを作 成するものを特定し、それを次の研究に使用した。
[0038] 詳細な分析に使用した 5 X結合緩衝液の構成は以下の通りである。緩衝液 A： 60 mM HEPES、 300mM KC1、 20mM MgC12、 5mM EDTA、 60% (v/v)グリセ口 ール；緩衝液 B : 50mM Tris— HCl (pH7. 5)、 250mM NaCl、 12. 5mM CaC12、 5mM EDTA、 40% (v/v)グリセロール。次に、サンプルを、トリスーホウ酸 EDTA 緩衝液（0. 089M Tris, 0. 089Mホウ酸及び 0. 002M EDTA)中で、 4%ポリア クリルアミドゲル (ポリアクリルアミド Zビスアクリルアミドの比率、 79 : 1)で電気泳動し た。ゲルをイメージングプレートにさらし、 Fujix BAS 2000バイオイメージングアナライ ザ一 (富士フィルム写真株式会社製)を使用して分析した。
実施例 10
[0039] 統計学的分析
Statview 5.0ソフトウェア（SAS Institute社製）を統計学的分析に使用した。 MDR1 mRNAレベル対ディプロタイプの結果は、 Kruska卜 Wallis testで分析した。差異は p < 0. 05で統計的に有意であると考えられた。 MDR1 mRNAレベルと P— gpレベル との相関性は、 Spearman's testで特定した。この試験は、通常、変数が普通の分配を 示すかどうか明確でない時に、ノンパラメトリック分析に使用する。 0. 05未満の確率 値が有意とされた。 Spearmanの係数 (r)及び関連した確率 (P)を計算した。トランスフ ェクシヨン実験で、 MDR1遺伝子の 5'制御領域においてハプロタイプ 1、 2又は 3を含 むレポーターコンストラクトの相対的なルシフェラーゼ活性を比較するために、無対の t 検定を行った。
実施例 11
[0040] (日本人の MDR1の 5'制御領域における新しい 6つの SNPの同定）
5'制御領域における MDR1多型を見い出すために、 25人の健康な日本人のボラ ンティアの末梢血から単離したゲノム DNAを分析した。転写開始部位力も約 4kb広 がる上流領域は、 PCRにより増幅し、ダイレクトシーケンシング（direct sequencing)に より分析した。 5'制御領域において、 8つの SNPを同定した。その内の 6つは以前に 報告されて 、な力つた。 50の染色体で観察したこれらの SNPの対立遺伝子頻度（ allele frequency)を表 2に示す。 ATG開始コドンは、ェクソン 2に位置し、転写開始部 位は、ゲノム DNAの ATGから— 699に相当する。この番号方式で、 SNP— 692T> C及び 934A>Gは、以前に報告（Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N" Inoue, K., Ito, S., Kanamori, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)- 1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143., 2001.)されている— 129T>C及び 41aA>Gとそれぞれ同一で あった。 本発明者らがメジャー型と定義した本来の MDR1配列（GenBank acessesion nos. : AC002457 ;AC005068)からの偏差を見るために配列を検査した。 5'制御領域の 8個の SNP (配列番号 32 47)、他の 6個の SNP (配列番号 48 60)もェクソン及 びイントロンで分析した。これらの 6つの SNPは、白人でも日本人でも、 0. 05以上の 対立遺伝子頻度を有することが以前に報告されている（Hoffineyer, S. Burk, 0· von
Richter,〇· Arnold, H. P., Brockmoller, J., Johne, A., Cascorbi, I., uerloif, Τ· Roots, I., Eichelbaum, M., and Brinkmann, U. Functional polymorphisms of the human multidrug— resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P— glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 3473-3478., 2000· Ito, S. Ieiri, I., Tanabe, M., Suzuki, A., Higuchi, S. and Otsubo, K. Polymorphism of the ABC transporter genes, MDR1, MRP1 and MRP2/cMOAT, in healthy Japanese subjects. Pharmacogenetics, 丄丄： 175—184· 2001·及び Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, Ν· I e Κ· Ito, S. Kanamori, Υ·
Takahashi, M., Kurata, Υ· Kigawa, J., Higuchi, S. Terakawa, Ν· and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)-1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143· 2001.)。本発明者らの分析により入手したこれらの SNPの対立遺伝子頻度を、表 2に 示す。表 2中の頻度は、 5'調節領域、コード領域及びイントロン領域の SNPの、 25人 の健康なボランティアの末梢血のゲノム DNA分析の結果から算出した。対立遺伝子 頻度は、以前に報告されているサンプルのサイズ力 予測した範囲内であった。 c 3 435C〉Tと c. 2677G >T, Aとの強い関連性を、以前報告（Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, Ν· Inoue, Κ· Ito, S. Kanamori, Υ· Takahashi, M., Kurata, Υ· Kigawa, J., Higuchi, S. Terakawa, N., and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)-1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143· 2001· Kim, R. Β· Leake, B. F. Choo, E. F. Dresser, G. Κ· Kubba, S. V. Schwarz, U. I., Taylor, A., Xie, H. G. McKinsey, J., Zhou, S. Lan, L. Β· Schuetz, J. D. Schuetz, E. G. and Wilkinson, G. R. Identification of functionally variant MDR1 alleles among European Americans and African Americans. Clin Pharmacol Ther, 70: 189—199·， 2001·)されている通りに 観察した。し力し、 5， IJ御領域と c. 12360T, c 2677G〉T、 A及び c. 3435C 〉Tを含むコード領域の多型との間には、関連性がなかった。— 692T〉Cと c. 2677 G〉T、 A又は c. 3435C〉Tとの関連性も、以前の報告（Kim, R. Β·， Leake, Β· F.， Choo, E. F.， Dresser, G. Κ·， Kubba, S. V.， Schwarz, U. I., Taylor, A., Xie, H. G.， McKinsey, J., Zhou, S.， Lan, L. Β·， Schuetz, J. D.， Schuetz, E. G.， and Wilkinson, G. R. Identification of functionally variant MDRl alleles among European Americans and African Americans. Clin Pharmacol Ther, 70: 189—199·， 2001.、 Horinouchi, M., Sakaeda, Τ·， Nakamura, Τ·， Morita, Υ·， Tamura, Τ·， Aoyama, Ν·， Kasuga, M., and Okumura, K. significant genetic linkage of MDRl polymorpnisms at positions 3435 and 2677: functional relevance to pharmacokinetics of digoxin. Pharm Res, 19: 1581-1585， 2002)と一致しなかった。
[表 2]
Frequencies of SNPi in Ihe MDR1 gene in the Js ajKse population
LocatiraA Nuctctc t ld iubttitud a Allele ffcqu«ac *
substitulioil (iTujor/niinor)
-2 10T>C AGGGXTTAA AGCGCTTAA 0.90 0,10
■2352G>A GTGAGATAA GTGAAATAA 0.72ノ 0·28
-1910T>C ATGGICFrGA /ArGCCGTGA 0.90/0.10
^1717 T>C ATIAICOCT/ ATDVCOGCT O.9S /0.0Z
-1325A>G CTGGAAAAA/ CTGCilAAAA 0.98 / 0.02
-93 A >0 CCCAAT AT CCCAflTGAT Q. 0/0.10
>C CGAOXAQCO / CGAGCAOCO 0.90/0.10
Coding reghu
c.1236 C >T (exon 12) AOOOCCTOA / AGOOTCTOA 01y41201y 0.66/0.34
c^6T7 G>Tt A(eama 21> AGOTOCTGOy AOGTICTOO Alag93Ser 030 /0J6
/AQOTdCTOO /0.14
t343S C T(exou 26> AGAT CTGA/ AGAHOTOA Itell45Be 0J8 /0.42
rc£ioa
IVS -25 G>T<ittl«ii ) AATGirTATG / AATGITATG 0.96 /0.04
GCAACAATG/ GCAAIAATG 0^2 0.48
IVSie-76T>A (tolioa 16) TTACEAATT / TTACAAATT D.64/0J6
A. t e lo atioju of llie SNFs corfetpoad to podtioii倉 of the MDR1 cDNA, with the fiis hue of Ihe ΧΓΟ start oodoa set to
+1. Ίΐκ ΑΓΟ stmt o4 a locates In exoo2 ud Ihe truKriptkm tlvt li e orrespondi to -699 in thii numbering »ysicni.
* Freqneqc wu alcnhl«d froa the rnutti of gentMik DNA loaljrsk of the p tip tnA btood of 25 healthy valuntecn
Jar the SNPs it tb 5' regnbtoiy region M well fe* ii tlie coding ud istnnk icgions. 実施例 12
(日本人の 5'制御領域におけるハプロタイプの特定）
調節領域におけるハプロタイプの頻度を明白に特定するために、—2410、 -2352 、一 1910、—934及び一 692でこれらの多型部位を含む 2kb断片を、 PCRにより増幅 した。 25の血液サンプルの内、これらの全ての部位のホモ接合体の分析を省略し、 少なくともこれらの部位の 1つにおいて、ヘテロ接合体のサンプルを使用した。 pT7B lue3ベクター内に、増幅した断片をサブクローユングした後、そのヌクレオチド配列を 特定した。—2903、一 1717及び- 1325におけるマイナー対立遺伝子の頻度力 統 計学分析には低すぎた (0. 02)ため、この 3つの対立遺伝子を分析から除外した。頻 度は、領域の対応する断片を PCR増幅及びシークェンシングにより確認した、健康 な日本人ボランティアの 25サンプルの遺伝子型より計算した。表 3に示すように、—2 410T(C)、— 1910T(C)及び- 692T(C)は、各クローンで一緒に検出されたが、— 2352G (A)は独立していた。次に、以下の通りにハプロタイプを定義した:ノヽプロタイ プ 1 (— 2410T、 -2352G,— 1910Τ、— 934Α、— 692Τ)、 ノヽプロタイプ 2 (— 2410T 、 -2352Α, -1910T, -934Α,— 692Τ)及び/、プロタイプ 3(— 2410C、— 2352G、 一 1910C、—934G、 一 692C)。 3つのハプロタイプ（ハプロタイプ 1、 2及び 3)は、人 口の 95%以上を占めた。プロモーターハプロタイプは、 日本人で調べたコード領域 でもイントロン領域の 、ずれの SNPとも関連して 、なかった。
[0044] [表 3]
HtpJoiypet al the rtgu lory rvgi a
Figure imgf000028_0001
。，
実施例 13
[0045] (MDRl遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ又はディプロタイプと日本人の大腸及 び肝臓の MDRl mRNAレベルとの関連性）
5'制御領域の 5つの多型（—2410、 -2352,—1910、—934及び— 6
92)と、 MDRl mRNAレベルとの関連性を調べるために、 72の正常な結腸直腸 粘膜をそれぞれ検査した。 72のサンプルは、ディプロタイプにより、 4つのグループに 分けた：ディプロタイプ A (ノヽプロタイプ lZl)、ディプロタイプ B (ノヽプロタイプ 1Z2)、 プロタイプ 1を 2つ有するディプロタイプ Aの MDRl mRNAレベルの平均値が、ハプ 口タイプ 1を有さないディプロタイプ Dの値より高いことを見い出した (p = 0. 04) (図 2 A)。それぞれハプロタイプ 1を 1つ有する、ディプロタイプ B及び Cの MDRl mRNA レベルの平均値は、ディプロタイプ Aと Dと値の中間であった。 MDRl mRNAレべ ルは、 GAPDH mRNAレベルでノーマライズした。 MDRl mRNAレベルを正常な 肝臓のサンプルで分析したところ、大腸からのサンプルと同様の結果を得た（図 2B) 。しかし、大腸と比較すると、関連性は、統計的にかなり低力つた (p = 0. 2)。
[0046] また、 mRNAレベルとの個別の関連性を、それぞれの SNPで観察した。—692T> Cと大腸の mRNAレベルとの関連は、本発明では統計的に有意でなかった力 Ύ/ Cヘテロ接合体の方力 TZTホモ接合体よりも mRNAレベルが低!、傾向性があつ た（p = 0. 2、データは示されていない）。 2352G >Aでは、 AZ Aホモ接合体は、 G/Gホモ接合体よりも低!、mRNAレベルを示した（p = 0. 07)。
[0047] 次に、 MDR1の mRNA発現レベルと P— gp発現レベルとの相関性を確認した。各 サンプノレが、ウェスタンブロッテイングに必要な量を入手できなかったので、 JSB—1 抗体を使用して免疫組織学分析法により、 P— gpレベルを測定した。したがって、測 定は、定量的というより半定量的であった。 72のサンプルの内、 14を調査し、 MDR1 mRNAレベル力 P— gpレベルと有意な相関性を示すことを、 Spearman's testにより 見い出した (r=0. 428、 p = 0. 01)。代表的なデータを図 3に示す。
[0048] 腸の P— gpレベル及び Z又は機能に影響すると報告（Hoffineyer, S., Burk, 0., von
Richter, 0., Arnold, H. P., Brockmoller, J., Johne, A., Cascorbi, I., uerlolf, T., Roots, I., Eichelbaum, M., and Brinkmann, U. Functional polymorphisms of the human multidrug— resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P— glycoprotein expression and activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 3473-3478., 2000.、 Nakamura, T., Sakaeda, T., Horinouchi, M., Tamura, T., Aoyama, N., Shirakawa, T., Matsuo, M., Kasuga, M., and Okumura, K. Effect of the mutation (C3435T) at exon 26 of the MDRl gene on expression level of MDRl messenger ribonucleic acia in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects. Clin Pharmacol Ther, 71: 297-303., 2002.)されている c. 3435C >Tは、本発明で は大腸及び肝臓の MDRl mRNAレベルと関連性がなく（p = 0. 7)、腸（Goto, M., Masuda, baito, H., Uemoto, Kiuchi, T. , Tanaka, K., ana mm, K. CJ435T polymorphism in the MDRl gene affects the enterocyte expression level of CYP3A4 rather than Pgp in recipients of living-donor liver transplantation. Pharmacogenetics, 12: 451-457, 2002)又は胎盤（Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N" Inoue, K., Ito, S.， Kanamori, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)- 1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143.,2001.)を分析した以前の報告と一致した。胎盤の MDRlZP— gp 発現レべノレと相関すると報告（Tanabe, M., Ieiri, I., Nagata, N.， Inoue, K., Ito, S.， Kanamori, Y., Takahashi, M., Kurata, Y., Kigawa, J., Higuchi, S., Terakawa, N., and Otsubo, K. Expression of P— glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)- 1 gene. J Pharmacol Exp Ther, 297: 1137-1143., 2001.)されている c. 2677G >T、 Aは、本発明では大腸及び肝臓 の MDR1 mRNAレベルと関連性がなく（p = 0. 89)、腸の mRNAレベルを分析し た結果と一致した（上記 Pharmacogenetics, 12: 451-457, 2002)。本発明で調べた他 の SNPはどれも、結腸直腸の上皮組織又は肝臓での MDR1 mRNAレベルと関連 '性がなかった。
実施例 14
(大腸癌患者と一般健常者における MDR1遺伝子 SNP頻度の比較解析） 九州北部地区の大腸癌患者 443人と地域一般住民 758人に対して、研究目的を 説明し同意を得た上で、末梢血 lOccを採取し、抽出したゲノム DNAを铸型として、 ABI7900HT (Applied Biosystems社製）を用いて TaqMan法によりタイピングをした。 結果を表 4に示す。表 4から明らかなように、ディプロタイプ Eは対照（一般健常者)で は 9人見受けられるが、大腸癌患者では 1人も見受けられな力つた。また、 MDR1遺 伝子発現量が高!、ディプロタイプ A、 MDR1遺伝子発現量が中間的なディプロタイ プ B, C、 MDR1遺伝子発現量が低いディプロタイプ D, Eをまとめて解析してォッズ 比を求めると、ディプロタイプ Aを 1としたとき、ディプロタイプ D, Eは約半分の 0. 524 、ディプロタイプ B, Cは中間的な値の 0. 892であった。これらのことから、ディプロタ イブ D, Eは、ディプロタイプ Aと比べて、大腸癌の発症のリスクが約半減すると推定 できる。 [0050] [表 4]
Figure imgf000031_0001
[0051] 上記 TaqMan法は、 Applied Biosystems社が開発した方法であり、それぞれの SNP を持つ allele特異的なプローブと領域特異的 PCRプライマーを用いる。 PCRの増幅 領域にプローブがハイブリダィズした場合、 PCRの増幅に伴ってプローブのタエンチ ヤーがはずれ蛍光が発生する。この蛍光を測定することにより、 allele特異的なプロ一 ブがハイブリダィズしたか否かを判定できる。各 SNPを検出するためのプローブ、プ ライマーのセットは以下である。
2352タイピング用
G検出用プローブ: AGGTGAGATAAAGCAA (配列番号 61)
A検出用プローブ： TGAAAGGTGAAATAAA (配列番号 62)
プライマーペア： Forwaard: AAGGCCATTCAAAAGGATACATAAAA (配列番号 63)
Reverse: TCTGTTTTCACTTTTGTTTTGCTTTG (配列番号 64；) 934タイピング用
A検出用プローブ： TCCCCAATGATTCAG (配列番号 65)
G検出用プローブ： CCCCAGTGATTCAG (配列番号 66)
プライマーペア： Forwaard: TGTGAACTTTGAAAGACGTGTCTACA (配列番号 67)
Reverse: CAAGTAGAGAAACGCGCATCAG (配列番号 68)
692タイピング用
T検出用プローブ： TTCGAGTAGCGGCTC (配列番号 69)
C検出用プローブ： TCGAGCAGCGGCT (配列番号 70)
プライマーペア： Forwaard: CCGCTTCGCTCTCTTTGC (配列番号 71)
Reverse: CCTCTGCTTCTTTGAGCTTGGA (配列番号 72)
3435タイピング用 C検出用プローブ： CTCACGATCTCTTC (配列番号 73)
T検出用プローブ： CCTCACAATCTCTT (配列番号 74)
プライマーペア： Forwaard: AACAGCCGGGTGGTGTCA (配列番号 75)
Reverse: ATGTATGTTGGCCTCCTTTGCT (配列番号 76)
実施例 15
[0052] (ハプロタイプとレポーターコンストラクトの基礎プロモーター活性との関連性）
ハプロタイプと MDR1プロモーター活性との直接の関連性を調査するために、 自然 発生する 3つのハプロタイプ（ノヽプロタイプ 1、 2及び 3)を保有するボランティアのゲノ ム DNAの— 2604と— 570間の 5'制御領域をクローユングした。次に、断片を pGL3 ベーシックベクター内のレポーター遺伝子に連結した。—1717及び 1325における 多型の頻度が低いため、 1717で T単一形態を有し、—1325で A単一形態形性を 有するゲノム DNAを使用してレポータープラスミドを構築した。次にこれらの 3つのコ ンストラタトは、ヒト肝臓ガン細胞株 HepG2に、トランジエンド 'トランスフエクシヨンした 。 48時間のトランスフエクシヨン後、プロモーター活性を分析し、コトランスフエクシヨン した phRL— TK活性でノーマライズした。また、相対的ルシフェラーゼ活性は、ハプロ タイプ 1コンストラクトの活性を 100%としたときの比率で示されている。データは、 4つ の個別実験における、平均値士関連した発現の S. D. (標準偏差)として示す。各実 験は、 3枚のディッシュを使用して評価した（※！^く。. 05)。表 4に示すように、ハプロ タイプ 2及び 3を保有するマイナー型コンストラクトは、ハプロタイプ 1を保有するメジャ 一型コンストラクトのそれぞれ 85. 3±4. 65%及び 87. 1 ± 1. 64%で発現した。こ れらの実験は、 5'制御領域における多型力 ヒト MDR1遺伝子上流プロモーター領 域を含むレポーターコンストラクトの基礎プロモーター活性に影響を及ぼすことを示し た。
[0053] [表 5] promoter ictivlty of icponer comlmci, coauininc lo of the kumu MDR1 gene hvturiDg
uch haplot pe hiploiype -2410 -2352 -1 910 -934 -692 i-udfenw utivity {%)
1 Γ G T A T
2 T A T A T 53 ± 4.6S*
3 c G C G c a?.] ± j ,6 *
Relitlve bcUense Ktivllln ue given u
Figure imgf000033_0001
which considered
】009, Tie dtla an cxpreaed meut ± 5 . of relative «ρκιβίθΒ is four independenl exp rifDeati. Each cxpcrimciit
tsuycd vfiiB tnplkHe d fao. *Ρ< Λ5 実施例 16
[0054] (メジャー及びマイナー対立遺伝子に個別に結合するタンパク質の同定）
MDR1 5'制御領域の SNP力 核タンパク質の結合を変化させるかどうかを調べ てみるために、電気泳動度シフトアツセィを用いた。まず、 2352G>Aを調べた（図 4A)。プローブ 2352Gが肝臓細胞の核抽出物とインキュベートしたときに、遅れて 現れるバンドが観察された。このバンドは、—2352Aをインキュベートしたときより 3倍 弱かった。 DNA タンパク質の相互作用の特異性は、適切なコンペティションアツセ ィにより証明された。すなわち、上方のバンドは、 10倍過剰の未標識オリゴヌクレオチ ドー 2352Gの存在下にほぼ完全に消失した力 マイナー型オリゴヌクレオチド 235 2Aの過剰量の追加は、プローブ 2352Gへのタンパク質の結合を抑制しなかった。 次に、 692T>Cを調べた（図 4B)。対立遺伝子に特異的な、遅れて現れるバンド の出現は、プローブ 692Tが核抽出物とインキュベートしたときにも観察された。コン ペティシヨンアツセィにおいては、上方のバンドは、 10倍過剰の未標識オリゴヌクレオ チドー 692Tの存在下にほぼ完全に消失し、コンペテイタ一— 692Cでは、かなり弱い（ —692Tと比較して 9倍)結合の抑制が観察された。他のオリゴヌクレオチドプローブ（ — 2410T>C、— 1910T>C及び 934A>G)は、この条件下では、メジャー型とマ イナ一型との間で、タンパク質結合特性になんの相違も示さな力つた。
実施例 17
[0055] MDR1遺伝子同様に、 ABCトランスポータをコードするヒト MRP2遺伝子の SNPs につ ヽても調べた。小児白血病患者から同意を得て採取した白血球細胞を含む骨 髄よりゲノム DN Aを抽出し、 MRP2遺伝子の全 32ェクソン及びプロモータ領域上流 4kbについてダイレクトシークェンス法により多型を検索し、 21箇所の SNPsを同定し た。結果を表 5に示す。 MDR1遺伝子と同様に、 TaqMan法による遺伝子タイピング 用のプローブ、プライマーセットは以下のようである。
3925タイピング用
G検出用プローブ： CTGGTTGTAGGGCTTT (配列番号 77)
A検出用プローブ： CCTGGTTATAGGGCTTT (配列番号 78)
プライマーペア： Forwaard: CGGGCTTCATTCAGAATTTTTTATCTTTGATT (配列 番号 79)
Reverse: CACCAAGTAGAACAAATGCCAAACA (配列番号 80) 3972タイピング用
C検出用プローブ： ATGCTACCGATGTCAC (配列番号 81)
T検出用プローブ: ATGCTACCAATGTCAC (配列番号 82)
プライマーペア： Forwaard: TGGTCCTCAGAGGGATCACTT (配列番号 83)
Reverse: TCCTTCACTCCACCTACCTTCTC (配列番号 84) 3993タイピング用
C検出用プローブ： AAGTAAGGTCTCTTTCC (配列番号 85)
T検出用プローブ: AAGTAAGGTCTTTTTCC (配列番号 86)
プライマーペア： Forwaard: GCTTGCTGAGGAAAAGTTGGACATA (配列番号 87)
Reverse: AGTTGCAGGAAATCAAAGATAAAAAATTCTGAA (配列番 号 88)
2366タイピング用
C検出用プローブ： CATCCACTGCAGACAG (配列番号 89)
T検出用プローブ： TCCACTGCAAACAG (配列番号 90)
プライマーペア： Forwaard: GCCAGAGCTACCTACCAAAATTTAGA (配列番号 91 )
Reverse: GCCTTTCAACAGGCCATTGG (配列番号 92) 924タイピング用
G検出用プローブ: AGGCCAAGGCAGAAG (配列番号 93)
A検出用プローブ： AGGCCAAGACAGAAG (配列番号 94)
プライマーペア： Forwaard: GCAATCCCAGCCCTTTGG (配列番号 95)
Reverse: CTCAAACTCCAGGCTTCAACAATC (配列番号 96)
1249タイピング用
G検出用プローブ： CTGTTTCTCCAACGGTGTA (配列番号 97)
A検出用プローブ： ACTGTTTCTCCAATGGTGTA (配列番号 98)
プライマーペア： Forwaard: CCAACTTGGCCAGGAAGGA (配列番号 99)
Reverse: GGCATCCACAGACATCAGGTT (配列番号 100) イントロン 19タイピング用
C検出用プローブ： TCAAAGGAGAAGTGGTTTA (配列番号 101)
T検出用プローブ： TTCAAAGGAGAAATGGTTTA (配列番号 102)
プライマーペア： Forwaard: CTGGATCTGAGTTTCTGGATTCTGT (配列番号 103)
Reverse: GGGATGTTTTGCAAACTGTTCTTTG (配列番号 104)
[表 6]
Figure imgf000036_0001
産業上の利用可能性
本発明によると、頂膜側に発現し、幅広い基質を輸送する ABCトランスポータであ る MDR1遺伝子の 5'制御領域を標的とした MDR1遺伝子のハプロタイプやディプロ タイプを判定することができ、 MDR1遺伝子の 5'制御領域の SNPsに関する基礎的 知見の他、各個人における MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプやディプロタ イブの判定結果を薬剤応答性のマーカーとして利用することにより、テーラーメード 治療が可能となる。カロえて、発癌リスクと進行を予測するマーカーとしても有用である ので、癌のリスク評価によるテーラーメード予防へと展開が可能である。

Claims

請求の範囲
[1] MDRl遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—235 2位、 1910位、—1717位及び 1325位カゝら選ばれる位置における多型を検出す ることを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタ イブを判定する方法。
[2] MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—235
2位、—1910位、—1717位及び- 1325位力も選ばれる位置における多型に加えて、
—934位及び/又は 692位の位置における多型を検出することを特徴とする MDR
1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はディプロタイプを判定する方法。
[3] —2903位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする 請求項 1又は 2記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z又はデイブ 口タイプを判定する方法。
[4] —2410位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする 請求項 1一 3のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z 又はディプロタイプを判定する方法。
[5] —2352位の塩基力 グァニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴と する請求項 1一 4のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及 び Z又はディプロタイプを判定する方法。
[6] —1910位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする 請求項 1一 5のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z 又はディプロタイプを判定する方法。
[7] —1717位の塩基力 チミン又はシトシンであるかを調べることを含むことを特徴とする 請求項 1一 6のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z 又はディプロタイプを判定する方法。
[8] —1325位の塩基力 グァニン又はアデニンであるかを調べることを含むことを特徴と する請求項 1一 7のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及 び z又はディプロタイプを判定する方法。
[9] MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩基がチミン、 -2 352位の塩基がアデニン、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩基がアデニン、― 692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領 域 DNA。
[10] MDRl遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩基がシトシン、 —2352位の塩基がグァニン、—1910位の塩基がシトシン、—934位の塩基がグァ- ン、 692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とする MDR1遺伝子の 5' 制御領域 DNA。
[11] MDRl遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩基がシトシン、 —2352位の塩基がアデニン、—1910位の塩基がシトシン、—934位の塩基がグァ- ン、 692位の塩基がシトシンに置換されていることを特徴とする MDR1遺伝子の 5' 制御領域 DNA。
[12] MDRl遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2410位の塩基がチミン、 -2 352位の塩基がアデニン、—1910位の塩基がチミン、—934位の塩基がグァニン、 - 692位の塩基がチミンに置換されていることを特徴とする MDR1遺伝子の 5'制御領 域 DNA。
[13] MDRl遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—235
2位、 1910位、—1717位及び 1325位カゝら選ばれる位置における多型を検出す る MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプを判定する方法に用いられるプライマ 一セットであって、多型を検出する位置の上流の領域とハイブリダィズするフォワード 側プライマーと、多型を検出する位置の下流の領域とハイブリダィズするリバース側 プライマーとからなることを特徴とするプライマーセット。
[14] MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2352位の位置と、 -2410 位、—1910位、—692位カゝら選ばれる位置とにおける多型を検出することを特徴とす る MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法。
[15] TaqMan (登録商標）法により遺伝子タイピングを実施することを特徴とする請求項 14 記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法。
[16] MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2352位の位置と、 -2410 位、 1910位、—692位カゝら選ばれる位置とにおける多型を検出する MDR1遺伝子 の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法に用いられるプローブ及びプライマー セット。
[17] TaqMan (登録商標）法により MDR1遺伝子の 5'制御領域のディプロタイプを判定す る方法に用いられることを特徴とする請求項 16記載のプローブ及びプライマーセット
[18] 請求項 1一 8のいずれか記載の MDR1遺伝子の 5'制御領域のハプロタイプ及び Z 又はディプロタイプを判定する方法又は請求項 14若しくは 15記載の MDR1遺伝子 の 5'制御領域のディプロタイプを判定する方法を用いることを特徴とする大腸癌発症 の予測方法。
[19] MDR1遺伝子の 5'制御領域の塩基配列において、翻訳開始コドン ATGの最初の 塩基を + 1とした場合に対応する位置で表示したとき、—2903位、—2410位、—235 2位、 1910位、 1717位及び 1325位、 934位、—692位から選ばれる 1以上の 位置を標的とすることを特徴とする MDR1発現制御薬の開発方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110050073A (zh) * 2017-03-14 2019-07-23 香港科技大学 单倍型和双倍型的确定方法

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8532930B2 (en) * 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US8515679B2 (en) * 2005-12-06 2013-08-20 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US20070027636A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Matthew Rabinowitz System and method for using genetic, phentoypic and clinical data to make predictions for clinical or lifestyle decisions
US20070178501A1 (en) * 2005-12-06 2007-08-02 Matthew Rabinowitz System and method for integrating and validating genotypic, phenotypic and medical information into a database according to a standardized ontology
ATE490344T1 (de) 2006-07-14 2010-12-15 Govt Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services Abcbi-genotypisierung zur vorhersage der mikrotubuli-stabilisatorwirkstoffinduzierten toxizität
CA3116156C (en) 2008-08-04 2023-08-08 Natera, Inc. Methods for allele calling and ploidy calling
EP2473638B1 (en) 2009-09-30 2017-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2854057B1 (en) 2010-05-18 2018-03-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
BR112013016193B1 (pt) 2010-12-22 2019-10-22 Natera Inc método ex vivo para determinar se um suposto pai é o pai biológico de um feto que está em gestação em uma gestante e relatório
BR112013020220B1 (pt) 2011-02-09 2020-03-17 Natera, Inc. Método para determinar o estado de ploidia de um cromossomo em um feto em gestação
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US9499870B2 (en) 2013-09-27 2016-11-22 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
CN109971852A (zh) 2014-04-21 2019-07-05 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US10894976B2 (en) 2017-02-21 2021-01-19 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004042081A1 (de) * 2002-11-04 2004-05-21 Charité-Universitätsme Dizin Berlin Spezifische haplotypen des mdr1-gens und deren anwendung in der diagnose und therapie

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1408972A2 (en) * 2001-07-23 2004-04-21 Epidauros Biotechnologie AG Methods for treatment of cancer with irinotecan based on mdr1

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004042081A1 (de) * 2002-11-04 2004-05-21 Charité-Universitätsme Dizin Berlin Spezifische haplotypen des mdr1-gens und deren anwendung in der diagnose und therapie

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] 17 September 2003 (2003-09-17), XP002982430, Database accession no. 2003:304986 *
HOFFMEYER, S. ET AL.: "Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 97, no. 7, 2000, pages 3473 - 3478, XP000996164 *
JOHNE, A. ET AL.: "Modulation of steady-state kinetics of digoxin by haplotypes of the P-glycoprotein NDR1 gene", CLIN PHARMACOL THER, vol. 72, no. 5, 2002, pages 584 - 594, XP009026200 *
KROETZ, D.L. ET AL.: "Sequence diversity and haplotype structure in the human ABCB1 (MDR1, multidrug resistance transporter) gene", PHARMACOGENETICS, vol. 13, no. 8, August 2003 (2003-08-01), pages 481 - 494, XP002982428 *
POTOCNIK, U. ET AL.: "Functional MDR1 polymorphisms (G2677T and C3435T) and TCF4 mutations in colorectal tumors with high microsatellite instability", CELL MOL BIOL LETT, vol. 7, no. 1, 2002, pages 92 - 95, XP002982432 *
POTOCNIK, U. ET AL.: "Naturally occurring mutations and functional polymorphisms in multidrug resistance 1 gene: correlation with microsatellite instability and lymphoid infiltration in colorectal cancers", J MED GENET, vol. 39, no. 5, 2002, pages 340 - 346, XP002982433 *
POTOCNIK, U. ET AL.: "The role of P-glycoprotein (MDR1) polymorphismsand mutations in colorectal cancer", PFLUGER ARCH, vol. 422, no. 1, 2001, pages R182 - R183, XP002982431 *
SAITI, K. ET AL.: "Detection of the four sequence variations of MDR1 gene using TaqMan MGB probe based real-time PCR and haplotype analysis in healthy Japanese subjects", CLIN BIOCHEM, vol. 36, no. 7, October 2003 (2003-10-01), pages 511 - 518, XP002982436 *
SAKAEDA, T. ET AL.: "MDR1 genotype-related pharmacokinetics and pharmacodynamics", BIOL PHARM BULL, vol. 25, no. 11, 2002, pages 1391 - 1400, XP002982434 *
SAKAEDA, T. ET AL.: "Pharmacogenetics of MRD1 and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs", PHARMACOGENOMICS, vol. 4, no. 4, July 2003 (2003-07-01), pages 397 - 410 *
See also references of EP1669447A4 *
TANABE, M. ET AL.: "Expression of P-glycoprotein in human placenta: relation to genetic polymorphism of the multidrug resistance (MDR)-1 gene", J PHARMACOL EXP THER, vol. 297, no. 3, 2001, pages 1137 - 1143, XP001030013 *
TANIGUCHI, S. ET AL.: "Genetic polymorphism at the 5'regulatory region of multidrug resistance 1 (MDR1) and its association with interindividual variation of expression level in the colon", MOL CANCER THER, vol. 2, no. 12, December 2003 (2003-12-01), pages 1351 - 1359, XP002982435 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110050073A (zh) * 2017-03-14 2019-07-23 香港科技大学 单倍型和双倍型的确定方法

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