CN109652538A - 一种针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒 - Google Patents

一种针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种新的针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒，运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，由于采用的是双酶系统扩增法，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列SEQ ID NO.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在RNase H2剪切后能特异扩增；设计了针对Braf V600E突变位点的引物和探针，采用荧光PCR，封闭式检测，减少了后期污染的可能性；本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。

Description

一种针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒。
背景技术
BRAF基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从RAS转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。BRAF基因突变在多种恶性肿瘤细胞中都有报道。在结直肠癌(CRC)中，BRAF突变率约为15％左右，这些突变主要发生于编码激活区的外显子15上，其中约92％位于第1799位核苷酸上(1799T>A)，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代(V600E)。除了结直肠癌外，BRAF在恶性黑色素瘤、甲状腺癌、肺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的突变。
近年的研究结果提示，对于那些KRAS基因为野生型、但存在BRAF基因V600E(1799T>A)突变的患者，抗EGFR单抗治疗无效。意大利学者Di Nicolantonio等的研究发现，KRAS基因无突变、BRAF基因突变阳性的转移性结直肠癌(mCRC)患者对西妥昔单抗或帕尼单抗治疗无反应。值得注意的是，BRAF突变除了是预测性指标(predictive factor)之外，还是一个预后指标(prognostic factor)，Di Nicolantonio等研究结果还显示，BRAF突变的mCRC患者预后不良。因此，2010年版NCCN结直肠癌临床实践指南中已增加相应条目，明确指出如果KRAS基因无突变时，必须检测排除BRAF基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR单抗治疗。
体细胞突变目前最常用的方法是ARMS-PCR法，即扩增受阻突变系统荧光PCR法，该方法主要用来检测点突变，尤其是检测突变含量很低的体细胞突变。
荧光PCR的优点是反应灵敏、特异性高：具有模板序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高了PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响。
RNase H2是一种广泛存在于真核生物和原核生物中核糖核酸酶，可以通过断裂磷酸二酯键，有效地移除RNA/DNA杂交链中的RNA链，在DNA复制起始、转录过程中R-loop的移除、DNA的错配修复、冈崎片段中RNA引物的降解等过程发挥重要的作用。RNase H2可以水解各种类型的RNA/DNA杂交链，甚至包括仅含单个核糖核甘酸的杂交链。
目前基因分型检测方法已经层出不穷，最主流的还是测序和PCR法。RNase H2是一种专一识别RNA-DNA杂合体的酶，并能特异识别单个RNA碱基与DNA模板互补的位点。本专利利用RNase H2和PCR技术相结合开发一种针对Braf V600E突变位点基因的检测，目前还没有查到将该方法运用到Braf V600E位点基因检测中的相关技术。
发明内容
有鉴于此，本发明运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，自主设计相关基因检测的引物和探针序列，进一步提供了一种针对Braf V600E位点基因突变进行检测的试剂盒，可以更灵敏方便地对样本进行检测。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明第一方面提供了一组针对Braf V600E位点基因突变检测的引物组合，所述引物组合包括引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。其中，小写字母a代表核糖核酸碱基，大写字母代表脱氧核糖核酸碱基，所述引物序列SEQ IDNO.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够与模板序列结合，并在RNase H2剪切后能特异扩增。
本发明第二方面提供了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的探针，该探针分别位于相应靶核酸序列区域中的一段寡核苷酸单链序列，能特异地和靶核酸序列碱基配对，所述探针包括针对Braf V600E位点基因突变对应的探针序列SEQ ID NO.3，序列SEQ IDNO.3的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述SEQ ID NO.3探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
本发明第三方面提供了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的酶混合液，包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400，优选酶活性浓度比为1:250。
本发明第四方面提供了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，包括上述引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、上述探针序列SEQ ID NO.3、上述酶混合液、PCR缓冲液和4种dNTPs。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒由以下试剂组成：
(1)PCR反应预混液：成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针序列SEQ ID NO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及通用内标引物混合而成；
(2)酶混合液：成分包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400；
(3)阴性质控品：构建的Braf V600E位点突变阴性的质粒模板；
(4)阳性质控品：构建的Braf V600E位点突变阳性的质粒模板。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液中，RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:250。
本发明第五方面提供了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的方法，包括以下步骤：
(1)设计相关基因分型的引物和探针序列，所述引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，所述探针序列为SEQ ID NO.3；
(2)DNA提取试剂盒提取组织或者血浆游离DNA模板；
(3)PCR扩增检测：以步骤(2)提取的组织或者血浆游离DNA为模板，利用本发明提供的试剂盒进行相应的扩增检测，将PCR反应预混液和酶混合液按照36：0.5的体积比配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的组织或者血浆游离DNA模板4μl，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共40次循环，在退火延伸阶段收集荧光；
(4)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在；没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。
本发明的试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明开发了一种新的针对Braf V600E位点基因突变检测的方法及试剂盒，运用了双相酶系统RNase H2和DNA聚合酶技术，由于采用的是双酶系统扩增法，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列SEQ ID NO.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在RNase H2剪切后能特异扩增；
(2)利用了Taqman探针技术的优点，结合RNase H2的特点，采用双酶系统针对BrafV600E位点设计探针和引物，来检测低浓度体细胞突变的目的；
(3)设计了针对Braf V600E突变位点的引物探针序列，采用荧光PCR，封闭式检测，减少了后期污染的可能性；
(4)本发明提供的试剂盒的敏感度高，检测快速，稳定性好，封闭式检测，减少了后期污染的可能性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的Braf V600E位点突变为阳性时的扩增曲线；
图2为本发明的Braf V600E位点突变为阴性时的扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例设计了针对Braf V600E位点基因突变检测的引物和探针序列，设计针对Braf V600E位点基因突变检测的引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，设计针对BrafV600E位点基因突变检测的探针序列SEQ ID NO.3，具体序列如下：
5'-AATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGaGAAAT-x，序列如SEQ ID NO.1所示；
5'-TCTAGTAACTCAGCAGCATCTC-3'，序列如SEQ ID NO.2所示；
FAM-TGGAGTGGGTCCCATCAGTTTG-BHQ1，序列如SEQ ID NO.3所示；
上述引物与普通引物不同的是，本发明专利由于采用的是双酶系统扩增法，即RNase H2和Taq DNA聚合酶双酶系统，因此，在普通引物的基础上有所改变，即在引物序列SEQ ID NO.1的3'端连接有间隔臂x，这样使引物能够特异地与模板序列结合，并在RNaseH2剪切后能特异扩增；本发明专利经过对序列的分析和引物探针的优化设计，最终筛选出了本发明专利所示的能够对针对BrafV600E位点突变基因检测的引物组合和探针序列。
实施例二
本实施例设计了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。
试剂盒具体设计如下：
(1)PCR反应预混液：成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针SEQ ID NO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及通用内标引物混合而成；
(2)酶混合液：成分包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:50；
(3)阴性质控品：构建的Braf V600E位点突变阴性的质粒模板；
(4)阳性质控品：构建的Braf V600E位点突变阳性的质粒模板；
由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。
实施例三
本实施例设计了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。
试剂盒具体设计如下：
(1)PCR反应预混液：成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针SEQ ID NO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及通用内标引物混合而成；
(2)酶混合液：成分包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:250；
(3)阴性质控品：构建的Braf V600E位点突变阴性的质粒模板；
(4)阳性质控品：构建的Braf V600E位点突变阳性的质粒模板；
由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。
实施例四
本实施例设计了一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，为了保证检测系统的可靠性，本发明专利引入了阳性和阴性质控品。
试剂盒具体设计如下：
(1)PCR反应预混液：成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针SEQ ID NO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及通用内标引物混合而成；
(2)酶混合液：成分包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:400；
(3)阴性质控品：构建的Braf V600E位点突变阴性的质粒模板；
(4)阳性质控品：构建的Braf V600E位点突变阳性的质粒模板；
由上述四种试剂按照不同规格包装成不同大小的试剂盒。
实施例五
本实施例采用实施例三制备得到的针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒检测样本，具体检测步骤如下：
(1)设计相关基因分型的引物和探针序列，所述引物为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，所述探针为SEQ ID NO.3；
(2)用DNA提取液提取组织或者血浆游离DNA模板；
(3)PCR扩增检测：以步骤(2)提取的组织或者血浆游离DNA为模板，利用本发明提供的试剂盒进行相应的扩增检测，将PCR反应预混液和酶混合液按照36：0.5的体积比配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的组织或者血浆游离DNA模板4μl，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共40次循环，在退火延伸阶段收集荧光；
(4)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在；没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。
按实施例五方法测定的Braf V600E位点基因突变阳性样本的扩增曲线如附图1所示；测定的Braf V600E位点基因突变阴性样本的扩增曲线如附图2所示。
将针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒用于某组织或者血浆样本的检测，采用DNA提取液提取组织或者血清样本中的DNA模板，按实施例五方法步骤进行检测，检测所得扩增曲线如附图1所示，图1显示该样本Braf V600E突变为阳性，试剂盒检测结果与测序结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉千麦医学检验所有限公司
<120> 一种针对Braf V600E位点突变检测的试剂盒
<130> 2018-10-31
<141> 2018-11-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
aataggtgat tttggtctag ctacagagaa at 32
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 2
tctagtaact cagcagcatc tc 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 3
tggagtgggt cccatcagtt tg 22

Claims (9)

1.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的引物组合，其特征在于：所述引物组合包括：引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的探针，其特征在于：所述探针包括针对Braf V600E位点基因突变对应的探针序列SEQ ID NO.3，序列SEQ ID NO.3的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
3.如权利要求2所述的一种针对Braf V600E位点基因突变检测的探针，其特征在于：所述SEQ ID NO.3探针5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有淬灭基团BHQ1。
4.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的酶混合液，其特征在于：包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400。
5.如权利要求4所述的一种针对Braf V600E位点基因突变检测的酶混合液，其特征在于：所述酶混合液中，RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:250。
6.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、权利要求书2所述探针序列SEQ ID NO.3、权利要求4所述酶混合液、PCR缓冲液和4种dNTPs。
7.如权利要求6所述的一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，其特征在于：包括如下试剂：
(1)PCR反应预混液：成分包括PCR缓冲液、4种dNTPs、探针序列SEQ ID NO.3和通用人源性内标探针、引物由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2及通用内标引物混合而成；
(2)酶混合液：成分包括RNase H2和Taq DNA聚合酶，所述RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:50～1:400；
(3)阴性质品控：构建的Braf V600E位点突变阴性的质粒模板；
(4)阳性质品控：构建的Braf V600E位点突变阳性的质粒模板。
8.如权利要求7所述的一种针对Braf V600E位点基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述酶混合液中，RNase H2与Taq DNA聚合酶酶活性浓度比为1:250。
9.一种针对Braf V600E位点基因突变检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计相关基因分型的引物和探针序列，所述引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，所述探针序列为SEQ ID NO.3；
(2)用DNA提取试剂盒提取组织或者血浆游离DNA模板；
(3)PCR扩增检测：以步骤(2)提取的组织或者血浆游离DNA为模板，利用权利要求7所述的试剂盒进行相应的扩增检测，将PCR反应预混液和酶混合液按照36：0.5的体积比配成混合液后，加入到相应的反应孔中，然后加入提取的组织或者血浆游离DNA模板4μl，同时做一个阴性对照孔和一个阳性对照孔，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性10秒，60℃退火延伸45秒，共40次循环，在退火延伸阶段收集荧光；
(4)结果判定：根据各荧光通道的信号值来判断是否有扩增，有扩增就代表该荧光通道对应的检测位点为阳性，即有突变存在；没有扩增，就说明该通道对应的检测位点突变低于本试剂盒检测限。
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