JPH0731494A - 無細胞系におけるタンパク質の生産方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 無細胞系での遺伝子の発現によるタンパク質
生産方法において、１種類以上のタンパク質の大量生産
が可能であり、必要な種類のタンパク質を分別して容易
に抽出可能なタンパク質生産方法を実現する。 【構成】 反応部内で目的のタンパク質が生成される
（ステップ１００）。生成された目的のタンパク質は捕
捉部に移動され、このタンパク質と特異的な親和性を有
する充填剤により捕捉されるとともに、タンパク質の生
成に伴って生成される副生成物が除去される（ステップ
１０１）。次に、目的のタンパク質及び充填材以外の物
質が、反応部に移動され、タンパク質の生成により消費
される消費物質が反応部に供給される（ステップ１０
２）。上記処理が繰り返し実行され、目的のタンパク質
が捕捉部に蓄積される。蓄積されたタンパク質は溶離液
により捕捉部外に抽出される（ステップ１０４）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、無細胞系におけるタン
パク質の生産方法及び生産装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質（ペプチドを含む）を得るた
めの方法としては、植物や動物、微生物等から抽出する
方法が知られている。また、最近では、天然には微量に
しか存在しないタンパク質を、遺伝子工学的な手法を用
いて、微生物等に生産させることも可能となっている。
しかし、生物や細胞は、目的とするタンパク質以外にも
様々なタンパク質を生産するため、目的のタンパク質を
抽出するためには、生産されたタンパク質に対して困難
な精製作業を実行しなければならない。さらに、生物や
細胞は、自らにとって不都合な外来性のタンパク質を排
除してしまう傾向があり、そのような場合には、活性型
のタンパク質を得るのは困難である。

【０００３】そこで、タンパク質の合成に必要な成分を
細胞外で構築し、細胞や生体を使用せずにＤＮＡやｍＲ
ＮＡを鋳型として、無細胞系で遺伝子の発現によりタン
パク質を合成する試みがある。つまり、例えば、”タン
パク質の生合成・上（生化学実験講座７）”、日本生化
学会編、東京化学同人（１９７５）に記載されているよ
うに、大腸菌やウサギ網状赤血球等を利用した系が検討
されている。しかし、上記無細胞系でのタンパク質の合
成反応は、典型的に１時間以内で終了してしまい、タン
パク質の大量生産には適さないという問題があった。

【０００４】この問題の一つの解決策として、パラノ
フ、ウラジミール イワノウィチらによる、「接合転写
／翻訳の無細胞系における遺伝子の予備発現法」（特表
平３−５０３４７９号公報）という技術がある。この公
報記載の発現法においては、遺伝子の発現によるタンパ
ク質の合成反応を延長させるため、反応に伴い消費され
る物質が系内に送り出される。そして、合成反応によっ
て生成された、副生成物と最終生産物とが系から取り出
される。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記特
表平３−５０３４７９号公報記載の発現法では、プラス
ミドＤＮＡを鋳型として無細胞系でタンパク質合成を行
った場合、目的以外のタンパク質も反応に伴い出現して
しまうことが知られている。そのため、上記公報記載の
発現法においては、目的以外のタンパク質も系から取り
出されてしまう。したがって、取り出されたタンパク質
に対して、濃縮と精製の工程が必要となる。また、２種
類以上の遺伝子を同一系内で発現させ、２種類以上のタ
ンパク質を得たい場合には、さらに分離の工程も必要と
なってしまう。

【０００６】さらに、上記公報記載の発現法において、
副生成物と最終生産物の取り出しは、具体的には、限外
ろ過膜が使用され、ある分子量以下の物質を取り出すこ
とにより行なわれる。そのため、目的発現物質の分子量
が大きい場合、副生成物と最終生産物のみならず副生産
物をも取り出されてしまう可能性があり、分子量の大き
な発現物質への適用は困難であった。

【０００７】本発明の目的は、無細胞系における遺伝子
の発現によるタンパク質の生産方法及び装置において、
１種類以上のタンパク質の大量生産が可能であるととも
に、必要な種類のタンパク質を、分別して容易に抽出可
能なタンパク質の生産方法及び装置を実現することであ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明は、次のように構成される。無細胞系におけ
るタンパク質の生産方法において、目的のタンパク質を
反応部内で生成させるステップと、目的のタンパク質と
親和性を有する物質が収容された捕捉部に、反応部内の
物質を移動させ、目的のタンパク質を捕捉させるステッ
プと、反応部から捕捉部内に移動された物質のうち、目
的のタンパク質以外の物質を反応部内に移動させるとと
もに、タンパク質の生成に伴って消費された物質を反応
部内に移動させるステップと、目的のタンパク質を親和
性を有する物質から分離させる溶離液を、捕捉部内に供
給し、目的のタンパク質を抽出するステップと、を備え
る。

【０００９】また、無細胞系におけるタンパク質の生産
装置において、目的のタンパク質が生成される反応部
と、目的のタンパク質と親和性を有する物質が収納され
る捕捉部と、反応部内におけるタンパク質の生成に伴っ
て消費される物質を含む緩衝液を収容する緩衝液収容部
と、緩衝液収容部に収容された緩衝液を反応部を介して
捕捉部へ供給するか、捕捉部を介して反応部へ供給する
かを選択的に実行する第１の送液部と、目的のタンパク
質を親和性を有する物質から分離させる溶離液を収容す
る溶離液収容部と、溶離液を、捕捉部を介して、この捕
捉部の外部に配置された収容槽に供給する第２の送液部
と、を備える。

【００１０】好ましくは、上記タンパク質の生産装置に
おいて、反応部には、リボソーム、ＲＮＡポリメラー
ゼ、遺伝子の発現に関与する因子を含む細胞抽出物、転
移ＲＮＡ、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシン−
５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シチジ
ン−５’−三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、が収
容され、捕捉部には、マルトース結合タンパク質と親和
性を有するアミロース樹脂が収容され、緩衝液収容部に
は、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシン−５’−三
リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シチジン−５’
−三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、が収容され、
溶離液収容部には、マルトース溶液が収容され、反応部
の収容物にマルトース結合タンパク質の遺伝子を含むプ
ラスミドＤＮＡが添加され、マルトース結合タンパク質
を生産する。

【００１１】また、好ましくは、上記タンパク質の生産
装置において、反応部には、リボソーム、遺伝子の発現
に関与する因子を含む細胞抽出物、転移ＲＮＡ、マグネ
シウム塩、アミノ酸、アデノシン−５’−三リン酸、グ
アノシン−５’−三リン酸、が収容され、捕捉部には、
プロテインＡと親和性を有する免疫グロブリンＧ−セフ
ァロースが収容され、緩衝液収容部には、マグネシウム
塩、アミノ酸、アデノシン−５’−三リン酸、グアノシ
ン−５’−三リン酸、が収容され、溶離液収容部には、
酢酸溶液が収容され、反応部の収容物にプロテインＡの
メッセンジャーＲＮＡが添加され、プロテインＡを生産
する。

【００１２】また、好ましくは、上記タンパク質の生産
装置において、反応部には、リボソーム、ＲＮＡポリメ
ラーゼ、遺伝子の発現に関与する因子を含む細胞抽出
物、転移ＲＮＡ、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシ
ン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シ
チジン−５’−三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、
が収容され、捕捉部は、マルトース結合タンパク質と親
和性を有するアミロース樹脂が収容された第１の捕捉部
と、プロテインＡと親和性を有する免疫グロブリンＧ−
セファロースが収容された第２の捕捉部と、を有し、緩
衝液収容部には、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシ
ン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シ
チジン−５’−三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、
が収容され、溶離液収容部は、マルトース溶液が収容さ
れた第１の溶離液収容部と、酢酸溶液が収容された第２
の溶離液収容部と、を有し、反応部の収容物にマルトー
ス結合タンパク質とプロテインＡの遺伝子を含むプラス
ミドＤＮＡが添加され、マルトース結合タンパク質及び
プロテインＡを生産する。

【００１３】

【作用】反応部内でタンパク質が生成されると、反応部
内の物質は捕捉部内に移動される。そして、この捕捉部
内において、目的のタンパク質が親和性を有する物質に
捕捉される。次に、反応部から捕捉部に移動された物質
のうち、目的のタンパク質以外の物質が捕捉部から反応
部に移動されるとともに、タンパク質の生成に伴って消
費された物質が反応部内に供給される。これにより、反
応部内において、タンパク質の生成が再開される。上記
処理が繰り返し実行され、捕捉部内に目的のタンパク質
が蓄積される。捕捉部内に所定量のタンパク質が蓄積さ
れると、親和性を有する物質から目的のタンパク質を分
離する溶離液が捕捉部に供給され、目的のタンパク質が
分離され、捕捉部外に抽出される。したがって、目的の
タンパク質が大量に生産されるとともに、この生産され
た目的のタンパク質を容易に外部に抽出することができ
る。

【００１４】

【実施例】以下、本発明の実施例を添付図面に基づいて
説明する。図１は、本発明における無細胞系のタンパク
質の生産方法の一実施例を示すフローチャートである。
図１のステップ１００において、タンパク質を生成する
ための適切な反応部において、目的とするタンパク質が
合成される。この反応部内には、遺伝子の発現に必要な
物質と、遺伝子の発現に関与する諸因子を含む細胞抽出
物質と、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）と、マグネシウム塩
と、遺伝子の発現に伴い消費される物質と、緩衝液と、
が収容される。そして、目的とするタンパク質の遺伝子
を含むプラスミドＤＮＡが添加され、遺伝子の発現が生
じる。

【００１５】ステップ１００において、目的とするタン
パク質が生成されると、ステップ１０１に進み、上記反
応部内の物質を、捕捉部に移動させ、目的のタンパク質
を捕捉し、蓄積すると共に、副生成物を反応部及び捕捉
部内から除去する。つまり、上記捕捉部には、目的のタ
ンパク質と特異的な親和性を有する物質が充填されてお
り、この捕捉部の出口部分には、副生成物は通過可能で
あるが目的のタンパク質は通過できない半透膜が配置さ
れている。そして、適切な緩衝液が反応部内及び捕捉部
内を通過され、反応部内の物質が、捕捉部内に移動し、
目的のタンパク質が捕捉される。さらに、副生成物は半
透膜を通過して、捕捉部内から流出される。

【００１６】次に、ステップ１０２において、捕捉部内
に捕捉されたタンパク質及び充填物質以外の物質を捕捉
部から反応部内に移動させるとともに、タンパク質の生
成により消費された物質も反応部内に供給される。この
場合、緩衝液と、消費された物質である、アミノ酸、Ａ
ＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸）、ＧＴＰ（グアノ
シン−５’−三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン−５’−三
リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン−５’−三リン酸）等と、
が捕捉部内及び反応部内に供給される。そして、目的と
するタンパク質及び上記消費物質が反応部に供給され
る。

【００１７】続いて、ステップ１０３において、目的と
するタンパク質を抽出するか否かを判定し、抽出しない
場合には、ステップ１００に戻る。そして、上述したス
テップ１００、１０１、１０２の処理を実行する。この
ステップ１００、１０１、１０２の処理を繰り返し実行
することにより、捕捉部内に目的のタンパク質が、所望
量蓄積される。ステップ１０３において、目的とするタ
ンパク質を抽出する場合には、ステップ１０４に進む。

【００１８】ステップ１０４において、捕捉部内に捕
捉、蓄積されたタンパク質を溶離液により抽出する。つ
まり、捕捉部内の充填物質とこの充填物質に捕捉された
タンパク質とを分離し得る溶離液を捕捉部内を通過させ
る。そして、捕捉部内を通過した溶離液を適切なタンパ
ク質収容槽に収容する。これにより、目的のタンパク質
が抽出される。次に、ステップ１０５に進み、目的のタ
ンパク質の生産を終了するか否かを判定する。生産を終
了しない場合には、ステップ１００に戻り、上記ステッ
プ１００〜１０４を実行する。

【００１９】なお、目的のタンパク質が複数種類の場合
には、反応部にて、複数種類のタンパク質を生成し、こ
れら複数種類のタンパク質のそれぞれを別個に捕捉可能
な複数種類の充填物質を捕捉部内に収容する。そして、
複数種類のタンパク質に対する複数種類の溶離液をそれ
ぞれ別々に捕捉部に供給するように構成すれば、複数種
類のタンパク質を大量生産可能で、個々種類のタンパク
質を別個に抽出する事が可能となる。

【００２０】以上のように、本発明のタンパク質の生産
方法の一実施例によれば、反応部内で生成された目的の
タンパク質が、捕捉部に移動され、捕捉されるととも
に、副生成物が除去される。次に、目的のタンパク質及
び充填物質以外の物質が、反応部に移動され、消費物質
が反応部に供給される。そして、上記処理が繰り返し実
行され、目的のタンパク質が捕捉部に蓄積され、蓄積さ
れたタンパク質が溶離液により捕捉部外に抽出される。
これにより、目的とするタンパク質の大量生産が可能で
あるとともに、この目的のタンパク質を容易に抽出可能
なタンパク質の生産方法を実現することができる。

【００２１】図２は、本発明における無細胞系のタンパ
ク質生産装置の一実施例の概略構成図であり、マルトー
ス結合タンパク質を生産する装置の例である。図２にお
いて、１７は、送液槽であり、この送液槽１７には、ア
ミノ酸と、ＡＴＰと、ＧＴＰと、ＣＴＰと、ＵＴＰと、
マグネシウム塩を含む緩衝液と、が収容される。この送
液槽１７は、恒温槽１９内に収容されており、約４℃に
維持される。そして、送液槽１７は、連結管Ｐ１、ポン
プ１５、連結管Ｐ２を介して三方コック１３に接続され
る。この三方コック１３は、連結管Ｐ３、三方コック
５、連結管Ｐ４を介して反応部１の一方端に接続され
る。この反応部１の一方端には、半透膜２が配置されて
おり、連結管Ｐ４から供給される液体等は半透膜２を介
して反応部１の内部に供給される。この半透膜２は、低
分子は通過可能で、高分子は通過不可能な構造となって
いる。

【００２２】反応部１は、内部に液体等を収容可能な構
造となっており、遺伝子の発現に必要なリボソーム、Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、遺伝子の発現に関与する諸因子を含
む細胞抽出物、ｔＲＮＡ、マグネシウム塩、アミノ酸、
ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、緩衝液が収容され
る。そして、上記リボソーム等が収容された反応部１
に、マルトース結合タンパク質の遺伝子を含むプラスミ
ドＤＮＡが添加されることにより、反応部１の内部で遺
伝子の発現が生じる。この反応部１は、恒温槽３に収容
されており、約３７℃に維持される。

【００２３】反応部１の他方端は、連結管Ｐ５を介して
三方コック４の第１入出口４-1に接続される。そして、
この三方コック４の第２入出口４-2は連結管Ｐ１４を介
してタンパク質収容槽２６に接続される。また、三方コ
ック４の第３入出口４-3は、連結管Ｐ６を介して、捕捉
部７の一方端に接続される。この捕捉部７の一方端に
は、フィルタ６が配置されており、連結管Ｐ６からの液
体等は、このフィルタ６を介して、捕捉部７内に供給さ
れる。この捕捉部７の内部は、液体等を収容可能な構造
となっており、粒状のアミロース樹脂からなる充填剤１
０が充填されている。この粒状のアミロース樹脂は、マ
ルトース結合タンパク質に対して特異的な親和性を有し
ている。また、フィルタ６は、充填剤１０は通過不可能
で、タンパク質は通過可能であり、かつ、タンパク質を
吸着しない材質により形成されている。

【００２４】捕捉部７の他方端には、半透膜８が配置さ
れている。この半透膜８は、半透膜２と同様に、低分子
は通過可能で、高分子は通過不可能な構造となってい
る。また、捕捉部７は、恒温槽９に収容され、約４℃に
維持される。捕捉部７の他方端は、連結管Ｐ７を介し
て、三方コック１２の第１入出口１２-1に接続される。
この三方コック１２の第２入出口１２-2は、連結管Ｐ８
を介して、廃液溜め容器１１に接続される。また、この
廃液溜め容器１１は、連結管Ｐ１１を介して、三方コッ
ク５の第３入出口５-3に接続される。また、三方コック
１２の第３入出口１２-3は、連結管Ｐ１０を介して、三
方コック１４の第１入出口１４-1に接続される。

【００２５】三方コック１４の第２入出口１４-2は、連
結管Ｐ９を介して、三方コック１３の第３入出口１３-3
に接続される。また、三方コック１４の第３入出口１４
-3は、連結管Ｐ１３、ポンプ１６、連結管Ｐ１２を介し
て溶離液槽１８に接続される。この溶離液槽１８には、
マルトース溶液が収容される。

【００２６】次に、図２の例の動作について、説明す
る。図３は、図２の例の動作フローチャートである。図
３のステップ２００において、反応部１にマルトース結
合タンパク質の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡが添加さ
れ、遺伝子の発現が生じ、マルトース結合タンパク質が
生成される。さらに、反応部１内では、アミノ酸、ＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等が消費され、ｍＲＮＡ
（メッセンジャーＲＮＡ）が生成されるとともに、副産
物として低分子化合物が生成される。そして、ステップ
２０１にて、生成したタンパク質を捕捉部７に移動する
か否かを判断する。移動する場合には、ステップ２０２
に進む。

【００２７】ステップ２０２において、三方コック１
３、５、４、１２が操作される。つまり、三方コック１
３は、第１入出口１３-1及び第２入出口１３-2が開とさ
れ、第３入出口１３-3が閉とされる。そして、三方コッ
ク５は、第１及び第２入出口５-1及び５-2が開、第３入
出口５-3が閉とされる。また、三方コック４は、入出口
４-1及び４-3は開、入出口４-2は閉とされ、三方コック
１２は、入出口１２-1及び１２-2が開、入出口１２-3が
閉とされる。

【００２８】次に、ステップ２０３において、反応部１
内の物質が捕捉部７へ移動される。つまり、ポンプ１５
により、送液槽１７に収容された緩衝液が、矢印Ａで示
すように、三方コック１３、５、半透膜２を介して反応
部１に供給される。これにより、反応部１内の物質が、
三方コック４及びフィルタ６を介して、捕捉部７に供給
される。すると、ステップ２０４に示すように、反応部
１から流出したマルトース結合タンパク質が捕捉部７に
捕捉され、蓄積される。さらに、反応部１内で生成され
た副生成物である低分子化合物が半透膜８、三方コック
１２を介して、廃液溜め容器１１に供給され、収容され
る。続いて、ステップ２０５において、反応部１内の物
質の捕捉部７への移動操作が終了か否かが判断される。
操作終了でなければ、ステップ２０３に戻る。そして、
ステップ２０５において、捕捉部７への移動操作を終了
する場合には、ステップ２０６に進む。

【００２９】そして、ステップ２０６において、三方コ
ック１３の入出口１３-2が閉、１３-1及び１３-3が開と
され、三方コック１４の入出口１４-1及び１４-2が開、
１４-3が閉とされる。また、三方コック１２の入出口１
２-1及び１２-3が開、１２-2が閉とされ、三方コック４
の入出口４-1及び４-3が開、４-2が閉とされる。さら
に、三方コック５の入出口５-1が閉、５-2及び５-3が開
とされる。

【００３０】次に、ステップ２０７において、捕捉部７
にあるタンパク質及び充填剤以外の物質を反応部１へ移
動させる。つまり、ポンプ１５により、送液槽１７に収
容された緩衝液、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、
ＵＴＰが、矢印Ｂで示すように、三方コック１３、１
４、１２、半透膜８を介して捕捉部７に供給される。そ
して、捕捉部７内のタンパク質及び充填剤以外の物質
が、上記緩衝液等とともに三方コック４を介して、反応
部１に供給される。これにより、タンパク質の生成によ
り消費される物質である、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、
ＣＴＰ、ＵＴＰが、反応部１に供給される（ステップ２
０８）。なお、アミロース樹脂及びこのアミロース樹脂
に吸着されたタンパク質は、フィルター６によって、捕
捉部７からの流出が阻止される。

【００３１】捕捉部７内においても、タンパク質が生成
されるが、このタンパク質の生成に伴って、低分子化合
物も生成される。この低分子化合物は、反応部１から半
透膜２及び三方コック５を通過して、廃液溜め容器１１
に供給される。これによって、反応部１内から低分子化
合物が除去される（ステップ２０９）。そして、ステッ
プ２１０において、生成したタンパク質を抽出するか否
かを判定する。タンパク質を抽出しない場合、つまり、
タンパク質の生成動作の継続の場合には、ステップ２０
０に戻り、以降、上記ステップ２００〜２０９が実行さ
れる。このステップ２００〜２０９が所定回数だけ繰り
返し実行されることにより、所望量のタンパク質が捕捉
部７内に蓄積される。

【００３２】捕捉部７内に所望量のタンパク質が蓄積さ
れると、処理はステップ２１１に進む。そして、このス
テップ２１１において、三方コック１４の入出口１４-1
及び１４-3が開、１４-2が閉、三方コック１２の入出口
１２-1及び１２-3が開、１２-2が閉、三方コック４の入
出口４-1が閉、４-2及び４-3が開とされる。すると、ポ
ンプ１６によって、溶離液槽１８内のマルトース溶液
が、矢印Ｃで示すように、三方コック１４及び１２を介
して捕捉部７に供給される（ステップ２１２）。

【００３３】マルトース溶液が捕捉部７に供給される
と、充填剤１０に捕捉されたタンパク質は、充填剤１０
から分離され、三方コック４を介して、外部に配置され
たタンパク質収容槽２６に供給される。これにより、目
的のタンパク質が抽出される（ステップ２１３）。続い
て、ステップ２１４において、三方コック１３、１４、
１２、４が操作される。つまり、三方コック１３は、入
出口１３-1及び１３-3が開、１３-2が閉、三方コック１
４は、入出口１４-1及び１４-2が開、１４-3が閉とされ
る。また、三方コック１２は、入出口１２-1及び１２-3
は開、１２-2が閉、三方コック４の入出口４-1が閉、４
-2及び４-3が開とされる。そして、ポンプ１５により、
送液槽１７内の緩衝液が三方コック１３、１４、１２、
捕捉部７、三方コック４、連結管Ｐ１４を通過する。こ
れにより、捕捉部７等に残留するマルトース溶液の除去
が実行される（ステップ２１５）。

【００３４】次に、ステップ２１６において、タンパク
質の生産を終了するか否かを判定する。タンパク質の生
産を終了しない場合には、ステップ２００に戻り、上述
した処理が繰り返し実行される。なお、上記タンパク質
の生産装置により、抽出された物質は、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量マーカーとの比
較と抗マルトース結合タンパク質抗体を使用したウエス
タンブロットにより、目的のタンパク質であることが実
験により、確認された。

【００３５】以上のように、本発明のタンパク質生産装
置の一実施例によれば、反応部１内で生成されたマルト
ース結合タンパク質が、捕捉部７に移動され、アミロー
ス樹脂により、捕捉されるとともに、副生成物である低
分子化合物が除去される。次に、アミロース樹脂及びこ
のアミロース樹脂に捕捉されたタンパク質以外の物質
が、反応部１に移動されとともに、消費物質であるアミ
ノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰが反応部１に供
給される。そして、上記処理が繰り返し実行され、マル
トース結合タンパク質が捕捉部７に蓄積され、蓄積され
たタンパク質がマルトース溶液により捕捉部７外に抽出
され、タンパク質収容槽２６に収容される。これによ
り、マルトース結合タンパク質の大量生産が可能である
とともに、このマルトース結合タンパク質を容易に抽出
可能なタンパク質の生産装置を実現することができる。

【００３６】なお、リボソーム、ＲＮＡポリメラーゼ、
遺伝子の発現に関与する諸因子を含む細胞抽出物は、公
知の方法により、調製することが可能である。つまり、
大腸菌を培養した後に、集菌し、ガラスビーズにより破
壊する。そして、これを緩衝液に懸濁したものを遠心分
離し、その上清を透析したものを使用することができ
る。また、ｔＲＮＡ、マグネシウム塩、アミノ酸、ＡＴ
Ｐ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰは、一般に市販されている
ものを使用することができる。また、上述した例におい
ては、充填材１０として、粒状のアミロース樹脂を使用
したが、粒状のものに限らず、膜状、フィルター状又は
ゲル状であってもよい。

【００３７】なお、図２に示した例においては、目的の
タンパク質をマルトース結合タンパク質としたが、他の
タンパク質を生産することも可能である。例えば、プロ
テインＡを生産することも可能である。このプロテイン
Ａを生産する場合には、反応部１は約３０℃、捕捉部７
及び送液槽１７は約４℃に維持される。そして、反応部
１には、遺伝子の発現に必要なリボソームと発現に関与
する諸因子、ｔＲＮＡを含む細胞抽出物、マグネシウム
塩、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、緩衝液が収容される。
ここで、リボソーム、遺伝子の発現に関与する諸因子、
ｔＲＮＡを含む細胞抽出物は、公知の方法により調製さ
れる。つまり、小麦胚芽をガラスビーズにより破壊し、
これを緩衝液に懸濁したものを遠心分離し、その上清か
ら低分子化合物を除去して使用する。捕捉部７にはＩｇ
Ｇ（免疫グロブリンＧ）−セファロースが収容され、送
液槽１７にはアミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰとマグネシウム
塩を含む緩衝液が収容される。また、溶離液槽１８に
は、酢酸溶液が収容される。そして、反応部１にプロテ
インＡのｍＲＮＡを添加することにより、遺伝子の発現
が生じる。以降、上述したマルトース結合タンパク質の
生産と同様にして、プロテインＡの生成、捕捉、蓄積が
実行され、蓄積されたプロテインＡが酢酸溶液により、
外部に抽出される。このように、図２に示したタンパク
質の生産装置は、マルトース結合タンパク質だけではな
く、例えば、プロテインＡの大量生産も可能であり、こ
のプロテインＡを容易に抽出可能である。

【００３８】図４は、本発明における無細胞系のタンパ
ク質生産装置の他の実施例の概略構成図であり、マルト
ース結合タンパク質及びプロテインＡを生産する装置の
例である。この図４の例においては、図２の例との異な
り、充填剤２７としてアミロース樹脂が収容されたマル
トース結合タンパク質の捕捉部２０と、充填剤２８とし
ＩｇＧ−セファロースが収容されたプロテインＡの捕捉
部２３とを備えている。そして、捕捉部２０は、フィル
タ６が配置されており、このフィルタ６は、連結管Ｐ６
を介して、三方コック４の入出口４-3に接続されてい
る。捕捉部２０は、さらに、フィルタ２１を備えてお
り、このフィルタ２１は、連結管Ｐ１５を介して、捕捉
部２３に配置されたフィルタ２２に接続される。また、
捕捉部２３は、半透膜８を備えており、この半透膜８
は、連結管Ｐ７を介して三方コック１２の入出口１２-1
に接続される。

【００３９】また、この図４の例においては、ポンプ１
６は連結管Ｐ１２を介して三方コック２４の第１の入出
口２４-1に接続される。この三方コック２４の第２の入
出口２４-2は、連結管Ｐ１７を介して溶離液槽２５に接
続される。この溶離液槽２５には、酢酸溶液が収容され
る。また、三方コック２４の第３入出口２４-3は連結管
Ｐ１６を介して溶離液槽１８に接続される。この溶離液
槽１８には、マルトース溶液が収容される。他の構成
は、図２の例と同様となっている。

【００４０】図５は、図４の例の動作フローチャートで
ある。図５のステップ２００において、反応部１にて、
マルトース結合タンパク質及びプロテインＡが生成され
る。これは、反応部１内にマルトース結合タンパク質と
プロテインＡの遺伝子を含むプラスミドＤＮＡが添加さ
れることにより、２種類の遺伝子が発現される。次に、
図３と同様のステップ２０１、２０２、２０３が実行さ
れ、反応部１内の物質が捕捉部２０に移動される。

【００４１】次に、ステップ２０４Ａにおいて、捕捉部
２０にて、マルトース結合タンパク質が捕捉され、ステ
ップ２０４Ｂにおいて、捕捉部２３にて、プロテインＡ
が捕捉される。そして、ステップ２０４Ｃにおいて、低
分子化合物が廃液溜め容器１１に収容される。続いて、
図３と同様なステップ２０５及び２０６が実行され、そ
の後、ステップ２０７Ａに進む。

【００４２】ステップ２０７Ａにおいて、捕捉部２０及
び２３内にあるマルトース結合タンパク質、プロテイン
Ａ、充填剤２７、２８以外の物質が反応部１に移動され
る。そして、ステップ２０８Ａにおいて、アミノ酸、Ａ
ＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ等の消費物質が、反応部
１に供給され、ステップ２０９おいて、低分子化合物が
反応部１から除去され、廃液溜め容器１１に収容され
る。次に、ステップ２１０Ａにおいて、マルトース結合
タンパク質及びプロテインＡを抽出するか否かを判定
し、抽出しない場合には、ステップ２００に戻る。ステ
ップ２１０Ａにおいて、タンパク質を抽出する場合に
は、ステップ２１１Ａに進む。

【００４３】そして、ステップ２１１Ａにおいて、三方
コック２４は、入出口２４-1及び２４-3が開、２４-2が
閉、三方コック１４は、入出口１４-1及び１４-3が開、
１４-2が閉、三方コック１２は、入出口１２-1及び１２
-3が開、１２-2が閉、三方コック４は、４-1が閉、４-2
及び４-3が開とされる。すると、ステップ２１２及び２
１３において、マルトース溶液が捕捉部２３を介して、
捕捉部２０に供給され、マルトース結合タンパク質が三
方コック４を介して、タンパク質収容槽２６に供給され
る。

【００４４】次に、ステップ２１３Ａにおいて、三方コ
ック２４の入出口２４-3が閉、２４-1及び２４-2が開と
される。そして、ステップ２１３Ｂにおいて、酢酸溶液
が捕捉部２３に供給され、ステップ２１３Ｃに示すよう
に、捕捉部２３に吸着されたプロテインＡが抽出され、
捕捉部２０、三方コック４を介して、タンパク質収容槽
２６（マルトース結合タンパク質を収容した収容槽とは
異なる新たな収容槽）に供給される。

【００４５】続いて、ステップ２１４において、三方コ
ック１３の入出口１３-1及び１３-3は開、１３-2は閉、
三方コック１４の入出口１４-1及び１４-2は開、１４-3
は閉、三方コック１２及び４は、前回と同様な開閉状態
とされる。そして、ステップ２１５Ａにおいて、緩衝液
により捕捉部２０、２３等に残留するマルトース溶液及
び酢酸溶液が、外部に除去される。次に、ステップ２１
６において、タンパク質の生産を終了するか否かを判定
し、終了しない場合は、ステップ２００に戻り、上述し
たステップが繰り返し実行される。なお、図２の例と同
様に、上記タンパク質の生産装置により、抽出された物
質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量マーカーとの比較と抗マルトース結合タンパク質
抗体を使用したウエスタンブロットにより、目的のタン
パク質であることが実験により、確認された。

【００４６】以上のように、図４に示したタンパク質生
産装置によれば、反応部１内で生成されたマルトース結
合タンパク質及びプロテインＡが、それぞれ、捕捉部２
０及び２３７に移動され、アミロース樹脂及びＩｇＧ−
セファロースにより、捕捉されるとともに、副生成物で
ある低分子化合物が除去される。次に、捕捉されたマル
トース結合タンパク質及びプロテインＡ以外の物質が、
反応部１に移動されとともに、消費物質であるアミノ
酸、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰが反応部１に供給
される。そして、上記処理が繰り返し実行され、マルト
ース結合タンパク質が捕捉部２０に蓄積され、プロテイ
ンＡが捕捉部２３に蓄積される。次に、蓄積されたマル
トース結合タンパク質及びプロテインＡがマルトース溶
液及び酢酸溶液により捕捉部２０及び２３外に抽出さ
れ、タンパク質収容槽２６に収容される。これにより、
マルトース結合タンパク質及びプロテインＡの２種類の
タンパク質の大量生産が可能であるとともに、これらマ
ルトース結合タンパク質及びプロテインＡを容易に抽出
可能なタンパク質の生産装置を実現することができる。

【００４７】なお、図４の例においては、捕捉部２０と
２３とが直列に配置される構成としたが、並列に配置す
る構成も考えられる。この場合、反応部１内で生成され
たタンパク質は、選択された、どちらか一方の捕捉部に
供給されるので、同時に２種類のタンパク質の生産はで
きない。

【００４８】また、上述した例において、捕捉部に充填
される物質として、アミロース樹脂及びＩｇＧ−セファ
ロースを用いたが、これらの他に、例えば、セルロース
やＡＰＴＧ（アミノ−フェニル−β−Ｄ−チオガラクト
シド）を使用することもできる。また、遺伝子の発現方
法としては、大腸菌を利用した方法（例えば、Zubay,
G.,Annu.Rev.Genet.,7,267(1973)）、小麦胚芽を利用し
た方法（例えば、C.W.Anderson,J.W.Straus,B.S.Dudoc
k,"Methods in Enzymology",ed.by.R.Wu,et al.,101,63
5,Academic Press,New York(1983)）等公知の方法を使
用することができる。

【００４９】また、上述した例において、三方コック
４、５、１２、１３、１４、２４の開閉動作や、ポンプ
１５及び１６の動作を制御するコントローラを配置し、
自動的にタンパク質の生産を実行できるように、構成す
ることも可能である。

【００５０】

【発明の効果】本発明は、以上説明したように構成され
ているため、次のような効果がある。無細胞系における
タンパク質の生産方法において、目的のタンパク質を反
応部内で生成させるステップと、上記タンパク質と親和
性を有する物質が収容された捕捉部に、反応部内の物質
を移動させ、上記タンパク質を捕捉させるステップと、
反応部から捕捉部内に移動された物質のうち、目的のタ
ンパク質以外の物質を反応部内に移動させるとともに、
消費された物質を反応部内に移動させるステップと、目
的のタンパク質を親和性を有する物質から分離させる溶
離液を、捕捉部内に供給し、目的のタンパク質を抽出す
るステップと、を備える。したがって、目的とするタン
パク質の大量生産が可能であるとともに、この目的のタ
ンパク質を容易に抽出可能なタンパク質の生産方法を実
現することができる。

【００５１】また、無細胞系におけるタンパク質の生産
装置において、目的のタンパク質が生成される反応部
と、上記タンパク質と親和性を有する物質が収納される
捕捉部と、タンパク質の生成に伴って消費される物質を
含む緩衝液を収容する緩衝液収容部と、緩衝液収容部に
収容された緩衝液を反応部を介して捕捉部へ供給する
か、捕捉部を介して反応部へ供給するかを選択的に実行
する第１の送液部と、目的のタンパク質を親和性を有す
る物質から分離させる溶離液を収容する溶離液収容部
と、溶離液を、捕捉部を介して、この捕捉部の外部に配
置された収容槽に供給する第２の送液部と、を備える。
したがって、目的とするタンパク質の大量生産が可能で
あるとともに、この目的のタンパク質を容易に抽出可能
なタンパク質の生産装置を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における無細胞系のタンパク質生産方法
の一実施例を示すフローチャートである。

【図２】本発明における無細胞系のタンパク質生産装置
の一実施例の概略構成図である。

【図３】図２に示したタンパク質生産装置の動作フロー
チャートである。

【図４】本発明における無細胞系のタンパク質生産装置
の他の実施例の概略構成図である。

【図５】図４に示したタンパク質生産装置の動作フロー
チャートである。

【符号の説明】

１ 反応部 ２、８ 半透膜 ３、９ 恒温槽 ４、５ 三方コック ６ フィルタ ７ 捕捉部 １０ 充填剤 １１ 廃液溜め容器 １２、１３、１４ 三方コック １５、１６ ポンプ １７ 送液槽 １８ 溶離液槽 １９ 恒温槽 ２０、２３ 捕捉部 ２１、２２ フィルタ ２４ 三方コック ２５ 溶離液槽 ２６ タンパク質収容槽

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無細胞系におけるタンパク質の生産方法
   において、 少なくとも１種類の目的のタンパク質を反応部内で生成
   させるステップと、 上記目的のタンパク質と親和性を有する物質が収容され
   た捕捉部に、上記反応部内の物質を移動させ、上記目的
   のタンパク質を上記親和性を有する物質に捕捉させるス
   テップと、 上記反応部から捕捉部内に移動された物質のうち、上記
   目的のタンパク質以外の物質を反応部内に移動させると
   ともに、タンパク質の生成に伴って消費された物質を反
   応部内に移動させるステップと、 上記目的のタンパク質を上記親和性を有する物質から分
   離させる溶離液を、上記捕捉部内に供給し、目的のタン
   パク質を捕捉部内から抽出するステップと、 を備えることを特徴とする無細胞系におけるタンパク質
   の生産方法。
2. 【請求項２】 無細胞系におけるタンパク質の生産装置
   において、 少なくとも１種類の目的のタンパク質が生成される反応
   部と、 上記目的のタンパク質と親和性を有する物質が収納され
   る捕捉部と、 上記反応部内におけるタンパク質の生成に伴って消費さ
   れる物質を含む緩衝液を収容する緩衝液収容部と、 上記緩衝液収容部に収容された緩衝液を上記反応部を介
   して捕捉部へ供給するか、捕捉部を介して反応部へ供給
   するかを選択的に実行する第１の送液部と、 上記親和性を有する物質に捕捉された目的のタンパク質
   を、上記親和性を有する物質から分離させる溶離液を収
   容する溶離液収容部と、 上記溶離液を、上記捕捉部を介して、この捕捉部の外部
   に配置された収容槽に供給する第２の送液部と、 を備えることを特徴とする無細胞系におけるタンパク質
   の生産装置。
3. 【請求項３】 請求項２記載のタンパク質の生産装置に
   おいて、 上記反応部には、リボソーム、ＲＮＡポリメラーゼ、遺
   伝子の発現に関与する因子を含む細胞抽出物、転移ＲＮ
   Ａ、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシン−５’−三
   リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シチジン−５’
   −三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、が収容され、 上記捕捉部には、マルトース結合タンパク質と親和性を
   有するアミロース樹脂が収容され、 上記緩衝液収容部には、マグネシウム塩、アミノ酸、ア
   デノシン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン
   酸、シチジン−５’−三リン酸、ウリジン−５’−三リ
   ン酸、が収容され、 上記溶離液収容部には、マルトース溶液が収容され、 上記反応部の収容物にマルトース結合タンパク質の遺伝
   子を含むプラスミドＤＮＡが添加され、マルトース結合
   タンパク質を生産することを特徴とする無細胞系におけ
   るタンパク質の生産装置。
4. 【請求項４】 請求項２記載のタンパク質の生産装置に
   おいて、 上記反応部には、リボソーム、遺伝子の発現に関与する
   因子を含む細胞抽出物、転移ＲＮＡ、マグネシウム塩、
   アミノ酸、アデノシン−５’−三リン酸、グアノシン−
   ５’−三リン酸、が収容され、 上記捕捉部には、プロテインＡと親和性を有する免疫グ
   ロブリンＧ−セファロースが収容され、 上記緩衝液収容部には、マグネシウム塩、アミノ酸、ア
   デノシン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン
   酸、が収容され、 上記溶離液収容部には、酢酸溶液が収容され、 上記反応部の収容物にプロテインＡのメッセンジャーＲ
   ＮＡが添加され、プロテインＡを生産することを特徴と
   する無細胞系におけるタンパク質の生産装置。
5. 【請求項５】 請求項２記載のタンパク質の生産装置に
   おいて、 上記反応部には、リボソーム、ＲＮＡポリメラーゼ、遺
   伝子の発現に関与する因子を含む細胞抽出物、転移ＲＮ
   Ａ、マグネシウム塩、アミノ酸、アデノシン−５’−三
   リン酸、グアノシン−５’−三リン酸、シチジン−５’
   −三リン酸、ウリジン−５’−三リン酸、が収容され、 上記捕捉部は、マルトース結合タンパク質と親和性を有
   するアミロース樹脂が収容された第１の捕捉部と、プロ
   テインＡと親和性を有する免疫グロブリンＧ−セファロ
   ースが収容された第２の捕捉部と、を有し、 上記緩衝液収容部には、マグネシウム塩、アミノ酸、ア
   デノシン−５’−三リン酸、グアノシン−５’−三リン
   酸、シチジン−５’−三リン酸、ウリジン−５’−三リ
   ン酸、が収容され、 上記溶離液収容部は、マルトース溶液が収容された第１
   の溶離液収容部と、酢酸溶液が収容された第２の溶離液
   収容部と、を有し、 上記反応部の収容物にマルトース結合タンパク質とプロ
   テインＡの遺伝子を含むプラスミドＤＮＡが添加され、
   マルトース結合タンパク質及びプロテインＡを生産する
   ことを特徴とする無細胞系におけるタンパク質の生産装
   置。