CN109161552A - 增加拟南芥种子产量的基因及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及增加拟南芥种子产量的基因及其应用，属于分子生物学领域。具体而言，本发明公开了负调控拟南芥荚种子产量的基因AT3G55240，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还同时公开了基因AT3G55240的用途：敲除基因AT3G55240可有效增加拟南芥的种子产量。
Description
技术领域
本发明涉及增加拟南芥种子产量的基因及其应用，属于分子生物学领域。
背景技术
拟南芥是一年生草本植物，是目前已知高等植物基因组中第二小的，成为双子叶研究的模式植物。拟南芥属于十字花科，该科有很多重要的经济作物，如油菜、白菜、芥菜、花椰菜、萝卜等等，素有“蔬菜之邦”的美称。因此，开展对拟南芥的研究，能够为其它作物研究和分子育种应用提供了很好的借鉴。拟南芥有一个主茎和多个侧枝，果实为长角果，一般一个植株在适宜的条件下可以产生500～600个长角果和超过20000粒的种子，种子非常小，一粒成熟野生型的种子仅0.3～0.5μm长，20～30μg干重，但是其种子高产的特性是吸引科学家把拟南芥作为遗传学研究的模式植物的最主要的原因之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何有效提高拟南芥的种子产量。
为了解决上述技术问题，本发明提供一个负调控拟南芥荚种子产量的基因AT3G55240，该基因的核苷酸序列如SEQ ID ON：1所示。
本发明还同时提供了上述基因的用途：可有效增加拟南芥的种子产量。
敲除基因AT3G55240可有效增加拟南芥的种子产量。
本发明的技术方案具体如下：
本发明利用T-DNA插入的方法，本发明通过对拟南芥AT3G55240基因的野生型、敲除突变体和过表达植株进行比较分析，统计各自主茎上的荚果数和种子的千粒重，发现与野生型对照相比，敲除突变体的主茎角果数目和种子千粒重都显著性增加，而过表达植株的主茎角果数目和种子千粒重都显著性减少。这些结果表明，即该基因负调控了拟南芥的角果数目生长和种子有机物积累，敲除该基因(敲除基因AT3G55240)可以增加拟南芥的荚果数目和种子的有机物积累，从而增加种子的产量。本发明对油菜、白菜、芥菜、花椰菜、萝卜等其它重要经济作物的产量研究具有重要价值。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1拟南芥AT3G55240基因野生型、突变体和过表达植株中AT3G55240基因的表达水平；
图2拟南芥AT3G55240基因野生型、突变体和过表达植株主茎的角果数；
图3拟南芥AT3G55240基因野生型、突变体和过表达植株种子的千粒重；
*表示t检验存在显著性(P<0.05)差异；**表示t检验存在极显著性(P<0.01)差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、拟南芥的培养条件
取拟南芥种子，加入10％(体积％)的次氯酸钠800μl，200rpm摇床消毒12min后，倒掉液体，用无菌水清洗5次，置于4℃春化3d；将春化结束的种子在滤纸上风干1h，再把种子均匀地铺在1/2MS固体培养基上，在光照培养箱(22℃，16h昼8h夜)中放置7～10d，将长势良好的小苗移栽营养土中培养。
实施例2、拟南芥AT3G55240基因突变体的获得与鉴定
从拟南芥TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org/)中，购买获得AT3G55240基因T-DNA插入突变体(accession ID:CS472921)。
拟南芥基因组DNA的提取：取新鲜叶片0.1g，用液氮研磨后加200μL的提取液(0.1mol/L Tris-HCl pH8.0，500mmol/L NaCl，1.25g/L SDS)，65℃温育10min期间摇2～3次，加65μL5mol/L KAC，摇匀后，冰浴5min，再加300μL氯仿，混匀，静置5min后12000r/min离心15min，取上清液转移至1.5ml的新管中，加入180μL预冷的异丙醇摇匀至絮状沉淀出现，室温保存10min，13000r/min，4℃，离心5min，弃上清加800μL 70％乙醇，13000r/min离心5min弃上清，自然风干，加100μL ddH2O混匀，-20℃保存备用。
PCR扩增：在PCR管中分别加入2×Taq PCR Master Mix(南京博尔迪生物)1μL、引物(1+2+3混合，浓度均为10μM)1μL、ddH2O 7μL、DNA 2μL。运行程序为95℃预变性3min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳30min，用溴化乙锭(EB)进行染色。
引物1：5’-ATCTGTACCTATGTACTCTCTAACG-3’
引物2：5’-ACATTCAATTAAAACACCACACCA-3’
引物3：5’-ATAATAACGCTGCGGACATCTACATTTT-3’。
电泳结果中，纯合野生型扩增一条大小约750bp的带，杂合野生型扩增两条带，一条大小约750bp和一条大小约500bp，纯合突变体扩增一条大小约500bp的带。鉴定出的纯合突变体即为所述的AT3G55240基因突变体。
即，本发明在基因上设计两条引物(跨T-DNA插入的位点)，另一条引物在T-DNA上，如果在目的基因处有T-DNA插入，就会扩增出基因+T-DNA的合并序列的约500bp条带，如果没有插入就只是基因上的约750bp。
实施例3、拟南芥AT3G55240基因过表达植株的构建
拟南芥叶片RNA的提取，采用Plant mini；
PCR扩增采用PrimerSTAR HS DNA Polymerase试剂盒(TaKaRa)：在PCR管中分别加入5×PrimerSTAR Buffer 4μL、dNTP Mixture 1.6μL、引物(4+5混合，浓度均为10μM)1μL、ddH2O 12.4μL、cDNA 0.8μL、PrimerSTAR HS DNA Polymerase 0.2μL。运行程序为95℃预变性5min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。
引物4：5’-AGAGCTCATGGCAGATTCTTCTTCTGCT-3’；
引物5：5’-CGGATCCGTCGTCGGATTCTTTAGATGA-3’。
PCR产物和载体pCAMBIA1300S都用Sac I(Takara)和BamH I(Takara)进行双酶切：15μL PCR产物、3μL Buffer、1.5μL Sac I、1.5μL BamH I、9μL ddH2O，37℃水浴酶切4h。
酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳30min，用溴化乙锭(EB)进行染色，分别切胶回收，用AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(Axygen)纯化DNA，按照产品说明书操作。
将纯化后的基因PCR产物与载体pCAMBIA1300S进行连接：T4DNA Ligase(Takara)0.5μL、T4DNA Ligase Buffer 1μL、PCR产物3μL、载体1μL、ddH2O 4.5μL，4℃过夜，产物用于转化。转化方法参照《分子克隆操作指南(第二版)》(北京:科学出版社，1992)。获得了pCAMBIA1300S-AT3G55240的克隆载体后，用AxyPrepTM Plasmid Minprep Kit(Axygen)提取质粒，方法按照产品说明书操作。
将提取的pCAMBIA1300S-AT3G55240载体质粒，用农杆菌介导的方法转化拟南芥，转化方法参照文献(Plant Journal,1998,16(6):735-743)。
对AT3G55240基因突变体、野生型拟南芥、AT3G55240基因过表达植株分别进行以下操作：
拟南芥RNA的提取：取0.2g叶组织，于液氮中研磨成粉末，使用PlantMini Kit试剂盒(QIAGEN)提取RNA，方法参照产品说明操作。
第一链cDNA合成：使用GoScriptTM Reverse Transcription System试剂盒(Promega)合成第一链cDNA，方法参照产品说明操作。
Real time PCR扩增：使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM试剂盒(TaKaRa)，具体操作如下：混合体系中加入TB Green Premix Ex Taq 10μL、引物(6+7混合，浓度均为10μM)1μL、ddH2O 6.6μL、cDNA 2μL、ROX Reference Dye 0.4μL。在StepOne PlusTM Real-Time PCRSystem(Applied Biosystems)运行PCR，运行程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，获得的数据采用t-Test方法进行显著性差异的分析。
引物6：5’-CTTCTTCTGCTTCTTACATTCAC-3’
引物7：5’-CTTCTGGATCATCTGGTTTGTC-3’
结果如图1所示，与野生型相比，突变体中的AT3G55240基因没有表达，而过表达植株的AT3G55240基因表达量显著性上升。
实施例4、拟南芥角果数目的统计
成熟期，随机选取拟南芥AT3G55240基因的野生型、突变体和过表达植株各24株，统计每株主茎上的角果数目，采用t-Test方法进行显著性差异的分析。
结果如图2所示，与野生型相比，突变体主茎的角果数显著性增加了16％，而过表达植株的角果数显著性减少了20％。可见，AT3G55240基因负调控了拟南芥角果数的生长，敲除该基因可有效增加拟南芥角果的数目，且角果中的种子数与野生型没有显著性差异。
实施例5、拟南芥千粒重测定
成熟期，随机选取拟南芥AT3G55240基因的野生型、突变体和过表达植株各14株，收取种子，28℃风干两周后，野生型、突变体及过表达植株各取1000粒种子称重，生物性重复4次，采用t-Test方法进行显著性差异的分析。
结果如图3所示，比野生型相比，突变体主茎的千粒重显著性增加了11％，而过表达植株的千粒重显著性减少了9％。可见，AT3G55240基因也同时负调控了拟南芥种子有机物的积累，敲除该基因可有效增加拟南芥种子千粒重，有效提高种子的产量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 增加拟南芥种子产量的基因及其用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atggcagatt cttcttctgc ttcttacatt cacatggtgc agcacatgat agagaaatgt 60
ttgatcttcc atatgagcaa agaagagtgt gtggaagctc tctctaagca tgcaaacatc 120
actcctgtca tcacctctac tgtgtggaag gagctggaga aagagaacaa ggaattcttc 180
aaggcgtatg aggagaggca aagcaaacaa gagcaaatgt cggaggaaga gacaaaccag 240
atgatccaga agattatctc ggattcatct aaagaatccg acgactga 288
Claims (2)
1.负调控拟南芥荚种子产量的基因AT3G55240，其特征是：该基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的基因AT3G55240的用途：其特征是：能有效增加拟南芥的种子产量。
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| CN (1) | CN109161552B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113755501A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-12-07 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种控制三百草叶片颜色转变的基因ScPEL及其应用 |
| CN113832163A (zh) * | 2021-10-20 | 2021-12-24 | 浙江师范大学 | 有效提高植物果实生物量的方法 |
Citations (5)
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| US20090005296A1 (en) * | 2004-05-05 | 2009-01-01 | The Royal Veterinary And Agricultural University | Ammonium/Ammonia Transporter |
| CN101516180A (zh) * | 2006-08-14 | 2009-08-26 | 独立行政法人理化学研究所 | 早熟的转基因植物 |
| CN104099345A (zh) * | 2014-07-24 | 2014-10-15 | 贵州省草业研究所 | 一种拟南芥功能未知基因h38的编码序列及应用 |
| CN106636191A (zh) * | 2017-01-13 | 2017-05-10 | 中国科学院昆明植物研究所 | 拟南芥At‐UGE2基因及其过表达突变株和缺失突变株在调节植物性状中的应用 |
| CN107177610A (zh) * | 2017-06-28 | 2017-09-19 | 西北农林科技大学 | 一种调控种子大小的拟南芥mpk基因及增加种子大小的方法 |
-
2018
- 2018-09-28 CN CN201811138974.0A patent/CN109161552B/zh active Active
Patent Citations (5)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109161552B (zh) | 2021-05-25 |
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