PL204789B1 - Promotor, rekombinowana konstrukcja DNA, transgeniczna komórka roślinna, transgeniczna roślina i sposób wytwarzania transgenicznej rośliny - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest promotor, rekombinowana konstrukcja DNA, transgeniczna komórka roślinna, transgeniczna roślina i sposób wytwarzania transgenicznej rośliny. Wynalazek przeznaczony jest do kontrolowania ekspresji genu w roślinach, zwłaszcza nowych promotorów roślinnych.

Tło wynalazku

Jednym z celów inżynierii genetycznej roślin jest produkcja roślin o właściwościach lub cechach ważnych pod względem agronomicznym. Ostatnie osiągnięcia w inżynierii genetycznej dostarczyły niezbędnych narzędzi do transformowania roślin, umożliwiając wprowadzanie i ekspresję w roślinach obcych genów (Kahl i wsp., World Journal of Microbiology and Biotechnology 11: 449-460, 1995). Do szczególnie pożądanych cech lub właściwości, które są przedmiotem zainteresowania inżynierii genetycznej roślin należą między innymi cechy odporności na owady i inne szkodniki oraz na czynniki chorobotwórcze, odporności na herbicydy, zwiększona stabilność, wydajność lub dłuższy czas magazynowania, tolerowanie czynników środowiskowych i poprawa wartości odżywczych. Postęp technologiczny w transformowaniu i regeneracji roślin umożliwił naukowcom pobieranie odcinków DNA, takich jak gen lub geny ze źródła heterologicznego bądź ze źródła natywnego jednak zmodyfikowanego tak, aby dawało inne bądź ulepszone cechy jakościowe i wprowadzanie tego egzogennego DNA do genomu roślinnego. Taki gen lub geny mogą następnie podlegać ekspresji w komórce roślinnej, ujawniając dodaną charakterystyczną właściwość lub cechę. W jednym podejściu, ekspresja nowego genu, czyli takiego, którego ekspresja nie zachodzi w danej roślinie lub tkance roślinnej, może wywierać pożądany wpływ na fenotyp. W innym podejściu, transkrypcja genu lub części genu w orientacji antysensownej może dawać pożądany efekt przez zapobieganie lub hamowanie ekspresji genu endogennego.

Izolowane promotory roślinne są użyteczne do modyfikowania roślin techniką inżynierii genetycznej w celu nadania im pożądanych cech fenotypowych. W celu wyprodukowania takiej transgenicznej rośliny, do komórki roślinnej wprowadza się wektor zawierający heterologiczną sekwencję genu, nadającą żądany fenotyp po ekspresji w tej roślinie. Taki wektor zawiera również promotor roślinny, związany operacyjnie z heterologiczną sekwencją genu, częste, promotor nie związany z tym heterologicznym genem w stanie naturalnym. Taki wektor wprowadza się do komórki roślinnej, wytwarzając transformowaną komórkę roślinną i z tej transformowanej komórki roślinnej regeneruje się transgeniczną roślinę. Promotor rządzi ekspresją wprowadzonej sekwencji DNA, z którą został operacyjnie związany i w ten sposób wpływa na pożądaną właściwość wniesioną przez tę sekwencję DNA.

Promotor jest elementem regulacyjnym 5', odgrywającym integralną rolę w ogólnej ekspresji genu lub genów, a więc, byłoby korzystne posiadanie wielu różnych promotorów, tak, aby dopasować ekspresję genu w ten sposób, by transkrypcja tego genu (genów) przebiegała wydajnie w odpowiednim czasie wzrostu i rozwoju rośliny, w optymalnej lokalizacji w roślinie i w ilości pozwalającej uzyskać pożądany efekt. W jednym przypadku, konstytutywna ekspresja produktu genu może być np. korzystna w jednej części rośliny ale mniej korzystna w innej części tej rośliny. W innych przypadkach, może się okazać korzystne wytwarzanie produktu genu w pewnym etapie rozwoju rośliny albo w odpowiedzi na pewne bodźce środowiskowe lub chemiczne. Handlowy rozwój ulepszonej genetycznie plazmy zarodkowej osiągnął już etap wprowadzania wielu różnych cech do roślin uprawnych, zwany również podejściem stożenia genów. W podejściu tym, do rośliny można wprowadzić wiele różnych genów nadających różne pożądane właściwości. Przy wprowadzaniu do rośliny wielu różnych genów, ważne jest, aby każdy gen był modulowany lub kontrolowany pod kątem optymalnej ekspresji i aby elementy regulacyjne były zróżnicowane, tak, aby zmniejszyć możliwość wyciszenia genu, które może być spowodowane rekombinacją sekwencji homologicznych. W świetle tych i innych rozważań, oczywiste jest, że optymalna kontrola ekspresji genu i różnorodność elementów regulacyjnych są ważnymi czynnikami w biotechnologii roślin.

Dla nowo wprowadzonego przez insercję DNA muszą być obecne odpowiednie sekwencje regulatorowe i muszą się one znajdować w odpowiedniej lokalizacji względem żądanej sekwencji DNA, tak, aby mogła ona podlegać transkrypcji i następnie, jeśli to pożądane, translacji na białko w komórce roślinnej. Do takich sekwencji regulatorowych należą, między innymi: promotor, nie podlegający translacji lider 5' i sekwencja poliadenylacji 3'. Poprzez dobór odpowiednich sekwencji promotora, kontrolujących transkrypcję tych genów, możliwy jest również dobór tkanek, w których ma zachodzić tranPL 204 789 B1 skrypcja obcego DNA i dobór czasu podczas wzrostu rośliny, w którym ma przebiegać transkrypcja tego obcego DNA.

W inż ynierii genetycznej roślin moż na stosować wiele różnych typów lub klas promotorów. Promotory te można sklasyfikować na podstawie zakresu aktywności lub specyficzności względem tkanek. Przykładowo, promotory zaliczane do promotorów konstytutywnych mają zdolność wydajnej transkrypcji związanych z nimi operacyjnie sekwencji DNA i ekspresji tych sekwencji DNA w wielu tkankach. W pewnych tkankach roślinnych lub swoiście w szczególnych tkankach roślinnych znajdują się wzmacniane tkankowo bądź swoiste tkankowo promotory w kierunku 5' od związanych z nimi operacyjnie sekwencjami DNA, których transkrypcja w normalnych warunkach przebiega na wysokich poziomach. Do innych klas promotorów będą należały między innymi promotory indukowane, aktywność których jest uwalniana przez bodźce zewnętrzne, takie jak środki chemiczne, bodźce rozwojowe lub środowiskowe. Tak więc, można uzyskać różne typy żądanych promotorów przez wyizolowanie regionów 5'-regulatorowych sekwencji DNA położonych w kierunku 5', które to regiony są transkrybowane i podlegają ekspresji w sposób konstytutywny, wzmacniany tkankowo lub indukowany.

Postęp technologiczny w wysokosprawnym sekwencjonowaniu i w bioinformatyce dostarczył dodatkowych narządzi molekularnych do wykrywania promotorów. Jako materiał źródłowy do izolowania mRNA i konstruowania bibliotek cDNA można użyć, docelowe komórki, tkanki lub organy roślinne w określonym stadium rozwoju lub pozostające pod wpływem konkretnych warunków chemicznych, środowiskowych lub fizjologicznych. Biblioteki cDNA sekwencjonuje się szybko i sekwencje podlegające ekspresji kataloguje się elektronicznie. Przy użyciu oprogramowania komputerowego do analizy sekwencji, można w krótkim czasie zanalizować tysiące sekwencji i można porównywać sekwencje z wybranych bibliotek cDNA. Połączenie metod laboratoryjnych i komputerowych metod odejmujących pozwala badaczom na skanowanie i porównywanie bibliotek cDNA i identyfikację sekwencji o żądanym profilu ekspresji. Przykładowo, sekwencje, których ekspresja przebiega preferencyjnie w jednej tkance można zidentyfikować przez porównanie biblioteki cDNA z jednej tkanki z biblioteką cDNA z innych tkanek i odejmowanie technikami elektronicznymi sekwencji wspólnych, znajdują c te sekwencje, których ekspresja przebiega tylko w tkance docelowej, będącej przedmiotem zainteresowania. Taka wzmacniana tkankowo sekwencja może być następnie użyta jako sonda lub primer do klonowania odpowiedniego cDNA o pełnej długości. Następnie można wykorzystać bibliotekę genomową danej rośliny do wyizolowania odpowiedniego genu i związanych z nim elementów regulacyjnych, w tym sekwencji promotorowych.

Wiele różnych sekwencji promotorowych, nadających żądany profil ekspresji, takich jak promotory zdolne do regulowania ekspresji związanych z nimi operacyjnie genów w wielu tkankach można wyizolować przez selektywne porównywanie bibliotek cDNA docelowych tkanek z bibliotekami cDNA nie-docelowymi lub stanowiącymi tło, znajdując w docelowych bibliotekach regiony regulacyjne 5' związane z sekwencjami podlegającymi ekspresji. Wyizolowane sekwencje promotorowe można stosować do selektywnego modulowania ekspresji dowolnego, związanego operacyjnie genu, zwiększając rozmaitość dodatkowych elementów regulatorowych do użycia w roślinnych wektorach ekspresyjnych w technikach polegających na stożeniu genów.

Przedmiotem wynalazku jest pomctor zawierający sekwencję SEQ ID nr. 69.

Następnym przedmiotem wynalazku jest promotor posiadający sekwencję SEQ ID nr: 69.

Korzystnie, promotor zawiera ponadto drugą cząsteczkę polinukleotydu połączoną ze wspomnianym promotorem, przy czym ten drugi polinukleotyd zawiera cząsteczkę DNA kodującą EPSPS odporny na glifosat.

Bardziej korzystnie, że wspomniany odporny na glifosat EPSPS jest AGRTU.aroA:CP4.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowana konstrukcja DNA, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję SEQ ID nr. 69 związaną operacyjnie z sekwencją kodującą i nie ulegającym translacji regionem 3'.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna komórka roślinna zawierająca izolowaną konstrukcję DNA, która zawiera sekwencję SEQ ID nr. 69 związaną operacyjnie z sekwencją kodującą i nie ulegają cym translacji regionem 3'.

Następnym przedmiotem wynalazku jest transgeniczna roślina zawierająca komórkę rośliny według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.

PL 204 789 B1

W korzystnym wykonaniu wynalazku transgeniczna roś lina jest roś liną jednoliścienną, a bardziej korzystnie zawarta w niej wspomniana konstrukcja DNA nadaje tej roślinie cechę tolerancji herbicydu.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania transgenicznej rośliny polegający na tym, że: (i) wprowadza się do komórki roślinnej konstrukcję DNA zawierającą (a) promotor zawierający polinukleotyd o sekwencji SEQ ID nr. 69, przy czym promotor ten jest operacyjnie związany z (b) sekwencją kodującą i (c) nie ulegającym translacji regionem 3', (ii) dokonuje się selekcji tej komórki roślinnej i (iii) regeneruje się z tej komórki roślinnej całą roślinę.

Krótkie objaśnienia do rysunków

Fig. 1 przedstawia mapę plazmidu pMON19469

Fig. 2 przedstawia mapę plazmidu pMON43623

Fig. 3 przedstawia mapę plazmidu pMON42410

Fig. 4 przedstawia mapę plazmidu pMON42411

Fig. 5 przedstawia mapę plazmidu pMON25455

Fig. 6 przedstawia mapę plazmidu pMON46124

Fig. 7 przedstawia mapę plazmidu pMON43644

Fig. 8 przedstawia mapę plazmidu pMON45361

Fig. 9 przedstawia mapę plazmidu pMON43716

Fig. 10 przedstawia mapę plazmidu pMON43738

Fig. 11 przedstawia mapę plazmidu pMON45362

Fig. 12 przedstawia mapę plazmidu pMON43722

Fig. 13 przedstawia mapę plazmidu pMON43739

Fig. 14 przedstawia mapę plazmidu pMON45360.

Definicje i sposoby

Poniższe definicje i sposoby podano dla lepszego zdefiniowania wynalazku i dla dostarczenia przeciętnemu specjaliście z tej dziedziny wiedzy wskazówek odnośnie praktycznego wykonania wynalazku. O ile nie podano inaczej, terminy należy rozumieć zgodnie z ich powszechnym stosowaniem przez specjalistów z tej dziedziny. Użyto nomenklaturę dla zasad DNA podaną w 37 Kodeksie CFR § 1.822. Dla reszt aminokwasowych przyjęto standardową nomenklaturę jedno- i trzyliterową.

Kwas nukleinowy (sekwencja kwasu nukleinowego) albo polinukleotyd (sekwencja polinukleotydowa) odnosi się do jedno- lub dwuniciowego DNA lub RNA pochodzenia genomowego lub syntetycznego, czyli do polimeru odpowiednio zasad dezoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych, czytanych od końca 5' (w górę) do końca 3' (w dół). Kwas nukleinowy może reprezentować nić sensowną lub komplementarną (antysensowną).

Natywna odnosi się do sekwencji kwasu nukleinowego występującej w stanie naturalnym! (typu dzikiego).

Termin: sekwencja heterologiczna oznacza sekwencję pochodzącą z obcego źródła lub gatunku albo, jeśli sekwencja pochodzi z tego samego źródła, wówczas jest zmodyfikowana w stosunku do formy oryginalnej.

Wyizolowana sekwencja kwasu nukleinowego jest zasadniczo oddzielona lub oczyszczona od innych sekwencji kwasu nukleinowego, z którymi ten kwas nukleinowy jest normalnie związany w komórce organizmu, w którymi ten kwas nukleinowy występuje w stanie naturalnym, a więc od innego DNA chromosomalnego lub poza chromosomalnego. Termin ten obejmuje kwasy nukleinowe, które są oczyszczone biochemicznie tak, aby usunąć z nich zasadniczo zanieczyszczające kwasy nukleinowe i inne składniki komórkowe. Termin ten również obejmuje rekombinacyjne kwasy nukleinowe i kwasy nukleinowe wytworzone na drodze syntezy chemicznej.

Termin zasadniczo oczyszczony, w znaczeniu stosowanym w opisie odnosi się do cząsteczki oddzielonej w zasadzie od wszystkich innych cząsteczek normalnie towarzyszących tej cząsteczce w stanie naturalnym. Bardziej korzystnie, zasadniczo oczyszczona cząsteczka jest składnikiem dominującym w danym preparacie. Zasadniczo oczyszczoną cząsteczką może być cząsteczka wolna od innych cząsteczek występujących w mieszaninie naturalnej w ponad 60%, korzystnie w 75%, bardziej korzystnie w 90% (za wyjątkiem rozpuszczalnika). Termin zasadniczo oczyszczony nie obejmuje cząsteczek występujących w stanie naturalnym.

Pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego wykazuje zasadniczą identyczność z referencyjną sekwencją kwasu nukleinowego jeśli po optymalnym przyłożeniu (przy założeniu, że odpowiednie insercje lub delecje nukleotydów będą wynosiły mniej niż 20% sekwencji referencyjnej

PL 204 789 B1 w oknie porównawczym) do innego kwasu nukleinowego (lub jego nici komplementarnej) wystę puje identyczność co najmniej 75% sekwencji nukleotydowej, korzystnie co najmniej około 80%-owa identyczność a jeszcze korzystniej, co najmniej około 85%-owa identyczność a najkorzystniej, co najmniej około 90% identyczność w obrębie okna porównawczego obejmującego co najmniej 20 pozycji nukleotydowych, korzystnie, co najmniej 50 pozycji nukleotydowych, jeszcze korzystniej, co najmniej 100 pozycji nukleotydowych a najkorzystniej w całej długości pierwszego kwasu nukleinowego. Optymalne przykładanie sekwencji do celów nakładania okna porównawczego można przeprowadzić według algorytmu homologii miejscowej Smith'a i Waterman'a (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981), metodą algorytmu homologii nakładania Needleman'a i Wunsch'a (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), metodą poszukiwania podobieństwa Pearson'a i Lipman'a (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), korzystnie z użyciem komputerowych implementacji tych algorytmów (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA w oprogramowaniu Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Referencyjny kwas nukleinowy może być cząsteczką o pełnej długości albo częścią dłuższej cząsteczki. Alternatywnie, dwa kwasy nukleinowe mają rzeczywiście zasadniczą identyczność jeśli jeden hybrydyzuje z drugim w warunkach wysokich wymagań, zdefiniowanych poniżej.

Pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego jest operacyjnie związana z drugą sekwencją kwasu nukleinowego, jeśli sekwencje te są tak uszeregowane, że pierwsza sekwencja kwasu nukleinowego wpływa na funkcję drugiej sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystnie, te dwie sekwencje są częścią jednej, ciągłej cząsteczki kwasu nukleinowego a jeszcze korzystniej, sąsiadują ze sobą. Przykładowo, promotor jest operacyjnie związany z genem jeśli promotor ten reguluje lub wpływa na transkrypcję tego genu w komórce.

Rekombinacyjny kwas nukleinowy wytwarza się przez sztuczne połączenie dwóch oddzielnie wyodrębnionych segmentów sekwencji, np. przez syntezę chemiczną albo przez manipulację wyizolowanymi segmentami kwasów nukleinowych technikami inżynierii genetycznej. Techniki manipulacji kwasami nukleinowymi są dobrze znane (patrz np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, II wydanie, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork, 1989 i Ausubel i wsp., 1992).

Metody syntezy chemicznej kwasów nukleinowych są opisane np. przez Beaucage'a i Carruthers'a w Tetr. Letts. 22: 1859-1862 (1981) i przez Matteucci'iego i wsp. w J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981). Syntezę chemiczną kwasów nukleinowych można przeprowadzić np. w przemysłowych zautomatyzowanych syntetyzerach oligonukleotydów.

Syntetyczną sekwencję kwasu nukleinowego można zaprojektować i zsyntetyzować chemicznie do celów wzmożonej ekspresji w określonych komórkach gospodarza i do celów klonowania do odpowiednich wektorów. Komórki gospodarza często wykazują preferencję użycia wzoru kodonów (Murray i wsp., 1989). Syntetyczne DNA zaprojektowane do celów wzmagania ekspresji w konkretnym gospodarzu powinny zatem odzwierciedlać wzór użycia kodonu w komórce gospodarza. Do tych celów są dostępne programy komputerowe, w tym między innymi programy BestFit lub Gap zawarte w pakiecie Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Inc., z University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711.

Terminy amplifikacja kwasów nukleinowych lub reprodukcja kwasu nukleinowego odnoszą się do produkcji dodatkowych kopii sekwencji kwasu nukleinowego prowadzonej z użyciem technologii łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Jest wiele znanych i opisanych metod amplifikacji. Między innymi, metody te są opisane w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.683.195 i US 4.683.202 oraz w protokoł ach PCR: A Guide to Methods and Applications (Poradnik metod i zastosowań), wyd. Innis i wsp., Academic Press, San Diego, 1990. W odniesieniu do reakcji PCR, terminem primer określa się krótki oligonukleotyd o zdefiniowanej sekwencji, który przyłącza się do matrycy DNA, inicjując łańcuchową reakcję polimerazy.

Terminy transformowany, transfekowany lub transgeniczny odnoszą się do komórki, tkanki, organu lub organizmu, do którego został wprowadzony obcy kwas nukleinowy, taki jak rekombinantowy wektor. Korzystnie, wprowadzony kwas nukleinowy ulega integracji z genomowym DNA przyjmującej komórki, tkanki, organu lub organizmu, w taki sposób, że ten wprowadzony kwas nukleinowy jest dziedziczony przez następne pokolenie. Terminy transgeniczna lub transformowana komórka lub organizm obejmują również komórki lub organizmy potomne oraz potomstwo wyprodukowane w programie hodowli stosującym taką transgeniczną roślinę jako organizm rodzicielski do krzyżowania, wykazujące zmieniony fenotyp, będący wynikiem obecności rekombinantowej konstrukcji lub wektora.

PL 204 789 B1

Termin gen oznacza DNA chromosomalny, DNA plazmidowy, cDNA, syntetyczny DNA albo inny DNA, kodujący peptyd, polipeptyd, białko albo cząsteczkę RNA oraz regiony flankujące tę sekwencję kodującą, zaangażowane w regulowaniu ekspresji. Niektóre geny podlegają transkrypcji do mRNA i translacji do polipeptydów (geny strukturalne), inne geny mogą ulegać transkrypcji do RNA (np. rRNA, tRNA) a inne typy genów mają funkcje regulatorów ekspresji (geny regulatorowe).

Ekspresja genu oznacza transkrypcję genu z wytworzeniem odpowiedniego mRNA i translację tego mRNA z wytworzeniem odpowiedniego produktu tego genu, a więc, peptydu, polipeptydu lub białka. Ekspresję genu kontrolują lub modulują elementy regulacyjne, w tym elementy regulacyjne 5', takie jak promotory.

Termin komponent genetyczny odnosi się do każdej sekwencji kwasu nukleinowego lub elementu genetycznego, która również może być składnikiem lub częścią wektora ekspresyjnego. Przykłady komponentów genetycznych obejmują bez ograniczeń regiony promotorowe, nie podlegające translacji lidery 5', introny, geny, regiony nie podlegające translacji 3' i inne sekwencje regulacyjne albo sekwencje wpływające na transkrypcję lub translację jednej lub większej ilości sekwencji kwasu nukleinowego.

Terminy: rekombinacyjna konstrukcja DNA, wektor rekombinacyjny, wektor ekspresyjny albo kaseta ekspresyjna odnosi się do każdego czynnika, takiego jak plazmid, kosmid, wirus, BAC (sztuczny chromosom bakteryjny), autonomicznie replikująca się sekwencja, fag lub liniowy bądź kulisty, jednoniciowy lub dwuniciowy DNA lub nukleotydowa sekwencja RNA, pochodzącego z dowolnego źródła, zdolnego do integracji z genomem lub do replikacji autonomicznej, zawierającego cząsteczkę DNA, w której jedna lub większa ilość sekwencji DNA została związana operacyjnie w sposób zapewniający funkcje biologiczne.

Komplementarny oznacza naturalne połączenie sekwencji kwasu nukleinowego przez parowanie zasad (par A-G-T z komplementarną sekwencją T-C-A). Komplementarność między dwiema jednoniciowymi cząsteczkami może być częściowa jeśli tylko niektóre pary kwasów nukleinowych są komplementarne albo całkowita, jeśli wszystkie pary zasad są komplementarne. Stopień komplementarności wpływa na wydajność i siłę reakcji hybrydyzacji i amplifikacji.

Termin homologia oznacza poziom podobieństwa pomiędzy sekwencjami kwasów nukleinowych lub aminokwasowymi i wyraża się ją jako procent identyczności położenia odpowiednio nukleotydu lub aminokwasu, a więc, podobieństwo lub identyczność sekwencji. Termin homologia odnosi się również do pojęcia podobnych właściwości funkcyjnych wśród różnych kwasów nukleinowych i biał ek.

EST albo etykietki sekwencji kodujących Tag, są to krótkie sekwencje losowo wybranych klonów z biblioteki cDNA (lub komplementarnego DNA), reprezentujące inserty cDNA tych losowo wybranych klonów [McCombie i wsp., Nature Genetics, 1: 124, (1992), Kurata i wsp., Nature Genetics, 8: 365 (1994) i Okubo i wsp., Nature Genetics, 2: 173 (1992)].

Termin elektroniczny Northern oznacza komputerową analizę sekwencji, pozwalającą na elektroniczne porównanie sekwencji z wielu bibliotek cDNA w oparciu o parametry podane przez badacza, w tym w oparciu o częstość występowania (rozpowszechnienie) populacji EST w wielu różnych bibliotekach cDNA albo wyłącznie w oparciu o zbiory EST z jednej biblioteki lub z kombinacji bibliotek.

Analiza podzbioru oznacza każdą metodę porównywania sekwencji kwasu nukleinowego z róż nych lub z wielu ź ródeł , która to metoda moż e być uż yta do zidentyfikowania profilu sekwencji kwasu nukleinowego odzwierciedlającego aktywność transkrypcyjną genu i trwałość sygnału (message stability) w konkretnej tkance, w określonym czasie lub w danych warunkach.

Termin promotor oznacza sekwencję kwasu nukleinowego znajdującą się w górę od albo w kierunku 5' od kodonu począ tku translacji w ramce odczytu (albo w regionie kodującym biał ko) genu i która jest zaangaż owana w rozpoznawaniu i wią zaniu RNA polimerazy II i innych białek (trans-czynników transkrypcyjnych, trans-acting factors) w celu zainicjowania transkrypcji. Promotor roślinny jest promotorem natywnym lub nie natywnym funkcjonującym w komórkach roślinnych. Promotory konstytutywne funkcjonują w większości lub we wszystkich tkankach roślinnych w ciągu całego cyklu rozwoju rośliny. Ekspresja promotorów swoistych tkankowo, narządowo lub komórkowo przebiega jedynie lub głównie odpowiednio w określonej tkance, narządzie lub typie komórek. Ekspresja promotora, zamiast przebiegać swoiście w określonej tkance, organie albo typie komórek, może przebiegać ze wzmożoną siłą, czyli na wyższym poziomie w jednej części rośliny (np. w typie komórek, tkance lub w organie) w porównaniu z innymi częściami tej rośliny. Promotory regulowane czasem funkcjonują jedynie lub głównie w pewnych okresach rozwoju rośliny albo w pewnych porach dnia, tak

PL 204 789 B1 jak się to np. dzieje w przypadku genów związanych z rytmem dobowym. Promotory indukowalne selektywnie inicjują ekspresję operacyjnie związanej sekwencji DNA w odpowiedzi na endogenny lub egzogenny bodziec, np. na związki chemiczne (induktory chemiczne) albo w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, hormonalne, chemiczne i/lub rozwojowe. Do promotorów indukowalnych lub regulowanych należą np. promotory regulowane światłem, ciepłem, stresem, zalaniem wodą lub suszą, fitohormonami, okaleczeniem lub związkami chemicznymi, takimi jak etanol, jasmonian, kwas salicylowy lub środkami ochrony.

Każdy promotor roślinny może być użyty jako sekwencja regulatorowa 5' do modulowania ekspresji szczególnego genu lub genów. Jednym z korzystnych promotorów mógłby być roślinny promotor RNA polimerazy II. Roślinne promotory RNA polimerazy II, tak jak inne z wyższych organizmów eukariotycznych, posiadają skomplikowane struktury i są złożone z kilku oddzielnych elementów. Jednym z takich elementów jest skrzynka TATA albo skrzynka Goldberga-Hognessa, niezbędna dla prawidłowej ekspresji genów eukariotycznych in vitro i precyzyjnej, wydajnej inicjacji transkrypcji in vivo. Skrzynka TATA jest typowo usytuowana w pozycji około -25 do -35, to znaczy, w miejscu od 25 do 35 pary zasad (bp) w górę (5') od miejsca inicjacji transkrypcji albo miejsca cup, które określa się jako pozycję +1 [Breathnach i Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349-383 (1981), Messing i wsp. w publikacji: Genetic Engineering of Plants, wyd. Kosuge i wsp., str. 211-227 (1983)]. Inny element wspólny, skrzynka CCAAT, jest zlokalizowana pomiędzy -70 a -100 parą zasad. W roś linach, skrzynka CCAAT moż e mieć sekwencję consensus inną niż analogiczna funkcjonalnie sekwencja w promotorach ssaków (analogiczna skrzynka w roślinach jest nazwana skrzynką AGGA dla odróżnienia jej od odpowiednika u zwierząt [Messing i wsp. w publikacji: Genetic Engineering of Plants, wyd. Kosuge i wsp., str. 211-227 (1983)]. Poza tym, rzeczywiście wszystkie promotory zawierają dodatkowe sekwencje aktywujące albo wzmacniacze znajdujące się w kierunku 5 [Benoist i Chambon, Nature 290: 304-310 (1981), Gruss i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 943-947 (1981) i Khoury i Gruss, Cell 27: 313-314 (1983)], rozciągające się od około -100 pary zasad do -1000 pary zasad albo bardziej w górę od miejsca inicjacji transkrypcji.

Po fuzji z heterologicznymi sekwencjami DNA, promotory takie na ogół powodują, że przyłączona sekwencja podlega transkrypcji w sposób podobny do transkrypcji sekwencji genu, z którym promotor ten jest związany w stanie naturalnym. Można dodać fragmenty promotora zawierające sekwencje regulacyjne (np. przyłączony przez fuzję do jego końca 5' albo wbudowany do niego przez insercję, aktywny promotor posiadający własne częściowe lub całkowite sekwencje regulacyjne [Fluhr i wsp., Science 232: 1106-1112 (1986), Ellis i wsp., EMBO J. 6: 11-16 (1987), Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Poulsen i Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23 (1988), Comai i wsp., Plant Mol. Biol. 15: 373-381 (1991)]. Alternatywnie, można dodać heterologiczne sekwencje regulatorowe w kierunku 5', do regionu 5' nieaktywnego promotora skróconego, np. promotora zawierającego jedynie rdzeń TATA i czasami elementy CCAAT [Fluhr i wsp., Science 232: 1106-1112 (1986), Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Aryan i wsp., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71 (1991)].

Promotory na ogół składają się z wielu odrębnych elementów cis (cis-acting elements) regulujących transkrypcję albo po prostu elementów cis. Każdy z tych elementów wydaje się nadawać inny aspekt w ogólnej kontroli ekspresji genu [Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Ellis i wsp., EMBO J. 6: 11-16 (1987), Benfey i wsp., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990)]. Elementy cis wiążą czynniki białkowe trans (trans-acting factors) regulujące transkrypcję. Niektóre elementy cis wiążą więcej niż jeden czynnik, natomiast czynniki transkrypcji trans mogą wchodzić w reakcję z róż nym powinowactwem z wię cej niż jednym elementem cis [Johnson i McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58: 799-839 (1989)]. Roślinne czynniki transkrypcyjne odpowiadające elementom cis oraz analiza ich działania są opisane np. w publikacjach: Martin, Curr. Opinions Biotech. 7: 130-138 (1996), Murai, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, wyd. Dashek, CRC Press (1997), str. 397-422 i Methods in Plant Molecular Biology, wyd.: Maliga i wsp., Cold Spring Harbor Press (1995), str. 233-300. Sekwencje promotorowe według wynalazku mogą zawierać elementy cis, które mogą powodować lub modulować ekspresję genu.

Elementy cis można identyfikować wieloma technikami, w tym analizą przez delecję, to znaczy, usuwając jeden lub większą ilość nukleotydów z końca 5' albo z wewnętrznej części promotora, analizą białka wiążącego DNA z użyciem odcisku palca DNA-zy I, interferencji metylowania, przesunięcia pasm w próbach elektroforezy, genomowego odcisku palca in vivo w reakcji PCR z udziałem reakcji

PL 204 789 B1 ligacji i innymi dogodnymi analizami bądź też, metodami analizy podobieństwa sekwencji ze znanymi motywami elementu cis, znanymi metodami porównania sekwencji. Dokładna struktura elementu cis może być przedmiotem dalszych badań przez mutagenezę (lub substytucję) jednego lub większej ilości nukleotydów albo innymi znanymi metodami [Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, wyd. Dashek, CRC Press (1997), str. 397-422 i Methods in Plant Molecular Biology, wyd.: Maliga i wsp., Cold Spring Harbor Press (1995), str. 233-300].

Elementy cis można otrzymać przez syntezę chemiczną albo przez klonowanie z promotorów, które zawierają te elementy i można je syntetyzować z dodatkowymi sekwencjami flankującymi zawierającymi użyteczne miejsca dla enzymów restrykcyjnych, dla ułatwienia następnych manipulacji. W jednym rozwią zaniu, promotory te skł adają się z wielu odrę bnych elementów cis regulują cych transkrypcję albo po prostu elementów cis, z których każdy wydaje się nadawać inny aspekt w ogólnej kontroli ekspresji genu [Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Ellis i wsp., EMBO J. 6: 11-16 (1937), Benfey i wsp., EMBO J. 9: 1677-1684 (1990)]. W korzystnym rozwiązaniu, regiony sekwencji zawierające elementy cis z sekwencji kwasu nukleinowego SEQ ID nr. 53-75 identyfikuje się z użyciem programów komputerowych zaprojektowanych specjalnie do identyfikacji elementów cis albo domen bądź motywów w obrębie tych sekwencji.

Niniejszym wynalazkiem są objęte elementy cis w sekwencjach SEQ ID nr. 53-75 albo homologi elementów cis, o których wiadomo, że mają udział w regulacji genu i wykazują homologię z sekwencjami kwasu nukleinowego wedł ug wynalazku. W piś miennictwie znanych jest wiele tego rodzaju elementów, takich jak elementy regulowane wieloma czynnikami, takimi jak światło, ciepło lub stres, elementy regulowane lub indukowane przez patogeny lub środki chemiczne i podobnych. Takie elementy mogą albo pozytywnie albo negatywnie regulować ekspresję genu, zależnie od warunków. Przykłady elementów cis obejmują między innymi, elementy reagujące na tlen [Cowen i wsp., J. Biol. Chem. 268 (36): 26904 (1993)], elementy regulacyjne reagujące na światło [patrz np. Bruce i Quaill, Plant Cell 2(11): 1081 (1990) i Bruce i wsp., EMBO J. 10: 3015 (1991)], element cis wrażliwy na traktowanie jasmonianem metylu [Beaudoin i Rothstein, Plant Mol. Biol. 33: 835 (1997)], elementy reagujące na kwas salicylowy [Strange i wsp., Plant J. 11: 1315 (1997)], elementy reagujące na szok cieplny [Pelham i wsp., Trends Genet. 1: 31 (1985)], elementy wrażliwe na okaleczenie i stres abiotyczny [Loace i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 9230 (1992), Mhiri i wsp., Plant Mol. Biol. 33: 257 (1997)], elementy reagujące na niską temperaturę (Backer i wsp., Plant Mol. Biol. 24: 701 (1994), Jiang i wsp., Plant Mol. Biol. 30: 679 (1996), Nordin i wsp., Plant Mol. Biol. 21: 641 (1993), Zhou i wsp., J. Biol. Chem. 267: 23515 (1992)] i elementy reagujące na susze (Yamaguchi i wsp., Plant Cell 6: 251-264 (1994), Wang i wsp., Plant Mol. Biol. 28: 605 (1995), Bray E. A., Trends in Plant Science 2: 48 (1997)].

Przedmiotem wynalazku są zatem objęte fragmenty lub elementy cis ujawnionych cząsteczek kwasu nukleinowego i te fragmenty kwasu nukleinowego mogą zawierać dowolny region ujawnionych sekwencji. Regiony promotorowe albo częściowe regiony promotorowe według wynalazku przedstawione na SEQ ID nr. 53-75 mogą zawierać jeden lub większą ilość elementów regulacyjnych, obejmujących między innymi elementy cis albo domeny zdolne do regulowania transkrypcji związanych operacyjnie sekwencji DNA w wielu tkankach.

Promotory roślinne mogą obejmować promotory wytwarzane przez manipulację znanych promotorów, z wytworzeniem promotorów syntetycznych, chimerycznych lub hybrydowych. W takich promotorach mogą być również zblokowane elementy cis z jednego lub z większej ilości promotorów, np. w wyniku dodania do aktywnego promotora heterologicznej sekwencji regulatorowej z jej własnymi częściowymi lub całkowitymi sekwencjami regulacyjnymi [Ellis i wsp., EMBO J. 6: 11-16 (1987), Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Poulsen i Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23 (1988), Comai i wsp., Plant Mol. Biol. 15: 373-381 (1991)]. Opracowano również promotory chimeryczne przez dodanie heterologicznej sekwencji regulacyjnej w kierunku 5' do regionu 5' nieaktywnego promotora skróconego, to znaczy, do promotora, który zawiera tylko rdzeń TATA i ewentualnie elementy CCAAT [Fluhr i wsp., Science 232: 1106-1112 (1986), Strittmatter i Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990 (1987), Aryan i wsp., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71 (1991)]. Projektowanie, konstruowanie i użycie chimerycznych lub hybrydowych promotorów zawierających co najmniej jeden element cis z SEQ ID nr. 69 do modulowania ekspresji związanych operacyjnie sekwencji kwasu nukleinowego jest również objęte wynalazkiem.

Promotorowe sekwencje, fragmenty, regiony i elementy cis z sekwencji SEQ ID nr. 69 mają zdolność transkrybowania związanych z nimi operacyjnie sekwencji DNA w wielu tkankach i mogą

PL 204 789 B1 selektywnie regulować ekspresję genów w tych tkankach. W odniesieniu do szeregu cech agronomicznych, ekspresja żądanego genu lub genów jest pożądana w wielu tkankach dla nadania żądanych cech. Dostępność odpowiednich promotorów regulujących transkrypcję operacyjnie związanych genów w określonych, docelowych żądanych tkankach ma duże znaczenie, gdyż może się okazać, że ekspresja powinna przebiegać nie we wszystkich tkankach lecz tylko w niektórych. Dla przykładu, jeśli potrzebna jest kontrola szkodników owadzich atakujących pewne tkanki, wówczas będzie pożądana ekspresja produktu żądanego genu w tych tkankach. Dla nadania cechy odporności na herbicydy, może się okazać pożądane posiadanie promotora inicjującego transkrypcję operacyjnie związanych genów w sposób, który nadaje cechę odporności na herbicyd na żądanych poziomach zarówno w tkankach wegetatywnych jak i reprodukcyjnych. Tak więc, ważne jest aby dysponować szerokimi możliwościami wyboru elementów regulacyjnych 5' dla każdej strategii stosowanej w biotechnologii roślin.

Narodzenie się genomiki, która obejmuje techniki molekularne i bioinformatyczne, zaowocowało szybkim sekwencjonowaniem i analizami ogromnej ilości próbek DNA pochodzących z ogromnej iloś ci celi, w tym również , mię dzy innymi, z gatunków roś lin o duż ym znaczeniu agronomicznym. Dla identyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku z bazy danych lub z kolekcji sekwencji cDNA, w pierwszym etapie konstruuje się biblioteki cDNA z okreś lonych tkanek roślinnych będących celem badań. Pokrótce, na początku konstruuje się biblioteki cDNA z tych tkanek, które zostały zebrane w okreś lonym stadium rozwoju albo w okreś lonych warunkach środowiska. Przez identyfikację genów podlegających w tkankach roślinnych zróżnicowanej ekspresji w różnych stadiach rozwojowych albo w różnych warunkach, można zidentyfikować i izolować odpowiednie sekwencje regulacyjne dla tych genów. Obrazowanie transkryptu umoż liwia identyfikację sekwencji preferowanych przez tkanki w oparciu o swoiste obrazowanie sekwencji kwasu nukleinowego z biblioteki cDNA. Pod terminem obrazowanie transkryptu rozumie się analizę porównującą częstość występowania (rozpowszechnienie) genów podlegających ekspresji w jednej lub w kilku bibliotekach. Klony zawarte w bibliotece cDNA sekwencjonuje się i porównuje się uzyskane sekwencje z sekwencjami w bazach powszechnie dostępnych. Metody komputerowe pozwalają badaczowi na wprowadzenie pytań (parametrów), na podstawie których porównywane są sekwencje z wielu bibliotek. Ten proces umożliwia szybką identyfikację poszukiwanych klonów w porównaniu z tradycyjnymi metodami eliminowania przez hybrydyzację , znanymi specjalistom.

Stosując znane metodologie, można skonstruować biblioteki cDNA z mRNA (informacyjnego RNA) z danej tkanki lub organizmu, stosując primery dT i odwrotną transkryptazę [Efstratiadis i wsp., Celi 7: 279 (1976), Higuchi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3146 (1976), Maniatis i wsp., Cell 8: 163 (1976), Land i wsp., Nucleic Acids Res. 9: 2251 (1981), Okayama i wsp., Mol. Cell Biol. 2: 161 (1982), Gubler i wsp., Gene 25: 263 (1983)].

Dla uzyskania konstrukcji cDNA o pełnej długości można wykorzystać szereg metod. Dla przykładu, można użyć terminalną transferazę w celu dodania ogonów homopolimerowych złożonych z reszt dC do wolnych grup hydroksylowych 3' [Land i wsp., Nucleic Acids Res. 9: 2251 (1981)]. Te ogony można następnie poddać hybrydyzacji z poli dG oligo, który może służyć jako primer do syntezy drugiej nici cDNA o pełnej długości. Okayama i Berg opisali sposób otrzymywania konstrukcji cDNA o pełnej długości. Sposób ten został uproszczony przez użycie syntetycznych primerów-adaptorów posiadających zarówno ogony homopolimerowe służące jako primery do syntezy pierwszej i drugiej nici, jak i miejsca restrykcyjne do klonowania do wektorów plazmidowych [Coleclough i wsp., Gene 34: 305 (1985)] i bakteriofagowych [Krawinkel i wsp., Nucleic Acids Res. 14: 1913 (1986) i Han i wsp. Nucleic Acids Res. 15: 6304 (1987)].

Do celów izolowania rzadkich populacji mRNA można połączyć powyższe strategie ze strategiami dodatkowymi. Przykładowo, typowa komórka ssaka zawiera od 10000 do 30000 różnych sekwencji mRNA [Davidson, Gene Activity in Early Development, II wyd., Academic Press, Nowy Jork (1976)]. Dla uzyskania określonego prawdopodobieństwa, że mRNA o niskiej częstości występowania będzie obecny w bibliotece cDNA, ilość klonów musi wynosić N = [In(1-P)]/[ln(1-1/n)], gdzie N oznacza liczbę wymaganych klonów, P oznacza żądane prawdopodobieństwo a 1/n oznacza proporcję frakcji całkowitego mRNA do jednego rzadkiego mRNA (Sambrook i wsp., 1989).

Jedną z metod wzbogacania preparatów mRNA w sekwencje żądane jest frakcjonowanie według wielkości. Jedną z takich technik jest frakcjonowanie metodą elektroforezy w żelu agarozowym [Pennica i wsp., Nature 301: 214 (1983)].

PL 204 789 B1

W innej technice stosuje się wirowanie w gradiencie sacharozy wobec czynnika, takiego jak wodorotlenek metylortęciowy, który deneturuje strukturę drugorzędową w RNA [Schweinfest i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4997-5000 (1982)]. Często stosowaną metodą jest konstruowanie bibliotek cDNA zrównanych lub znormalizowanych [Ko, Nucleic Acids Res. 18: 5705 (1990), Patanjali S. R. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1943 (1991)]. Na ogół, populację cDNA normalizuje się przez hybrydyzację odejmującą [Schmid i wsp., J. Neurochem. 48: 307 (1987), Fargnoli i wsp., Anal. Biochem. 187: 364 (1990), Travis i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1696 (1988), Kato, Eur. J. Neurosci. 2: 704 (1990) i Schweinfest i wsp., Genet. Anal. Tech. Appl. 7: 64 (1990)]. Odejmowanie jest inną metodą ograniczania populacji niektórych sekwencji w bibliotece cDNA [Swaroop i wsp., Nucleic Acids Res. 19: 1954 (1991)]. Znormalizowane biblioteki można kostruować wykorzystując procedurę Scares'a (Scares i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9228 (1994)]. To podejście jest przeznaczone do obniżania początkowego zróżnicowania 10000-krotnego w poszczególnych częstościach występowania cDNA potrzebnych do osiągnięcia częstości występowania w granicach jednego rzędu wielkości, przy jednoczesnym utrzymaniu pełnej złożoności sekwencji w tej bibliotece. W procesie normalizacji, przewaga klonów cDNA o dużej częstości występowania obniża się gwałtownie, klony o średnim poziomie liczebności pozostają w zasadzie niezmienione a liczebność klonów dla rzadkich transkryptów efektywnie się zwiększa.

Analizę sekwencji EST można prowadzić wieloma metodami. Do sekwencjonowania DNA można stosować dwie podstawowe metody, metodę terminacji łańcucha opracowaną przez Sangera i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)] i metodę degradacji chemicznej Maxam'a i Gilberta [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 (1977)]. Automatyzacja i postęp w technologii, np. zastąpienie sekwencjonowania z użyciem radioizotopów w metodach opartych na fluorescencji, zmniejszyły uciążliwość sekwencjonowania DNA [Craxton, Methods, 2: 20 (1991), Ju i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347 (1995), Tabor i Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6339 (1995)]. Automatyczne aparaty do sekwencjonowania dostawcza wielu wytwórców, np. Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey (Pharmacia ALF), LI-COR, Inc., Lincoln, Nebraska (LI-COR 4000) i Millipore, Berdford, Massachusetts (Millipore BaseStation).

Sekwencje EST dłuższe od 150 par zasad okazały się użyteczne do badań podobieństwa i mapowania [Adams i wsp., Science 252: 1651 (1991)]. Sekwencje EST mają na ogół długość od 150 do 450 zasad. Jest to ta długość sekwencji, która zapewnia informację o sekwencji, która jest rutynowo i rzetelnie generowana w pojedynczym przebiegu sekwencjonowania. Na ogó ł , Z biblioteki cDNA wyprowadza się dane na podstawie tylko jednego przebiegu sekwencjonowania [Adams i wsp., Science 252: 1651 (1991)]. Automatyczny pojedynczy przebieg sekwencjonowania daje wyniki na ogół z błędem lub stopniem jednoznaczności zasad wynoszącym około 2-3% (Boguski i wsp., Nature Genetics, 4: 332 (1993).

Bazy danych o EST konstruuje się lub częściowo konstruuje się np. z C. elegans (McCombrie i wsp., Nature Genetics 1: 124, 1992), z ludzkiej linii komórek wątrobowych HepG2 (Okubo i wsp., Nature Genetics 2: 173, 1992), z RNA mózgu człcwieka (Adams i wsp., Science 252: 1651, 1991; Adams i wsp., Nature 355: 632, 1992) z Arabidopsis (Newman i wsp., Plant Physiol. 106: 1241, 1994) i z ryż u (Kurata i wsp., Nature Genetics 8: 365, 1994). W niniejszym wynalazku, jako narzędzie do identyfikacji genów podlegających ekspresji w żądanych tkankach stosuje się EST z wielu bibliotek sporządzonych z wielu tkanek kukurydzy, i dzięki temu ułatwia się izolację sekwencji regulatorowych 5', takich jak promotory, które regulują geny.

Do identyfikacji sekwencji, których ekspresja jest zróżnicowana, w tym sekwencji (lecz nie tylko takich sekwencji), których ekspresja przebiega w jednej tkance w porównaniu do ekspresji w innej tkance, można zastosować komputerowe analizy sekwencji. Przykładowo, inny zbiór sekwencji można wyprowadzić z cDNA wyizolowanego z tkanki roślinnej korzeni a inny z tkanki liścia. Można również porównywać sekwencje z bibliotek cDNA sporządzonych z roślin rosnących w różnych warunkach środowiskowych lub fizjologicznych. Po zidentyfikowaniu preferowanych sekwencji z żądanej biblioteki cDNA, można wyizolować klony genomowe z biblioteki genomowej przygotowanej z tej tkanki roślinnej, po czym identyfikować i izolować odpowiednie sekwencje regulatorowe, w tym również, chociaż nie wyłącznie, sekwencje regulatorowe 5'.

W jednym z korzystnych rozwią zań , kataloguje się w bazie danych o sekwencjach etykietki sekwencji kodujących tag (EST) z wielu różnych bibliotek cDNA. Tę bazę danych stosuje się do identyfikacji poszukiwanych promotorów z konkretnej, badanej tkanki. Wyboru etykietek sekwencji kodujących tag do następnej izolacji promotora dokonuje się na podstawie obecności jednej lub

PL 204 789 B1 większej ilości sekwencji spośród reprezentatywnych EST pochodzących z losowego pobierania próbek z indywidualnej biblioteki cDNA albo z kolekcji bibliotek cDNA. Dla przykładu, identyfikację sekwencji regulatorowych, regulujących ekspresję transkryptów w tkance liści i korzeni prowadzi się przez identyfikację EST znajdujących się w bibliotekach cDNA z liści i z korzeni a nieobecnych albo występujących nielicznie w innych bibliotekach cDNA i określa się profil ekspresji dla danej EST. Termin częstość występowania, w znaczeniu tu użytym, oznacza, ile razy klon lub zgrupowanie klonów pojawia się w bibliotece. W ten sposób identyfikuje się sekwencje, które są wzmocnione lub występują bardzo licznie w określonej tkance lub w organie, które to sekwencje reprezentują docelowy profil ekspresji i z tych zidentyfikowanych sekwencji EST projektuje się primery. Do amplifikacji regionów flankujących z genomowej biblioteki badanej rośliny można zastosować techniki oparte na reakcji PCR. Specjalistom z tej dziedziny znanych jest wiele metod amplifikacji nieznanych sekwencji DNA sąsiadujących z regionem rdzeniowym sekwencji znanej. Do metod tych należą między innymi PCR inwersyjna (IPCR), PCR wektorowa (vectorette PCR), PCR-Y (Yshaped PCR) i metoda spaceru po genomie.

W korzystnym rozwiązaniu, genomowy DNA, zligowany z sekwencją adaptorową poddaje się pierwszej reakcji amplifikacji PCR, stosując primer swoisty dla genu i primer, który łączy się z sekwencją adaptorową . Produkt tej reakcji PCR stosuje się nastę pnie jako matrycę do gniazdowej amplifikacji PCR z użyciem drugiego primera swoistego dla genu i drugiego adaptora. Fragmenty uzyskane z gniazdowej reakcji PCR izoluje się, oczyszcza i subklonuje do odpowiedniego wektora. Fragmenty sekwencjonuje się i identyfikuje się miejsca startu translacji wówczas, gdy EST pochodzi ze skróconego cDNA. Fragmenty te można klonować do roślinnych wektorów ekspresyjnych jako fuzje transkrypcyjne lub translacyjne z genem reporterowym, takim jak gen β-glukuronidazy (GUS). Konstrukty te można testować w analizach przejściowych i następnie wiązać operacyjnie regiony 5'-regulatorowe z innymi genami i sekwencjami regulacyjnymi będącymi przedmiotem zainteresowania w odpowiednim roślinnym wektorze transformacyjnym i analizować transformowane rośliny na ekspresję żądanego genu (żądanych genów) wieloma metodami znanymi specjalistom.

Do identyfikacji genów i sekwencji regulatorowych można wybrać każdą roślinę. Przykłady odpowiednich roślin docelowych do izolacji genów i sekwencji regulatorowych obejmują między innymi, Acadia, lucernę, jabłonie, morele, Arabidopsis, karczochy, arugulę, szparagi, avocado, banany, jęczmień, fasolę, buraki, jeżynę, czarną jagodę, czarną borówkę amerykańską, brokuły, brukselkę, kapustę, canolę, cantaloupe (odmiana Cucumic melo cantalupensis), marchew, kasawę, rycynus, kalafiory, selery, czereśnie, cykorię, cilantro (pol. kolendrę siewną), cytrusy, klementynki, koniczynę, kokosy, kawę, kukurydzę, bawełnę, ogórki, jodłę Douglasa, bakłażany, cykorię jadalną, eskarolę, eukaliptus, koper włoski, figi, czosnek, tykwę, winorośl, grapefruity, słodką rosę, Ipomoea jicama, kiwi, sałatę, pory, drzewo cytrynowe, limonę, sosnę amerykańską Loblolly, siemię lniane, mango, melony, grzyby jadalne, brzoskwinie, orzechy, owies, palmę olejową, rzepak, piżmian jadalny, drzewo oliwkowe, cebulę, pomarańcze, rośliny ozdobne, palmę, papaję, pietruszkę, pasternak, groch, śliwę brzoskwiniową, orzechy arachidowe, gruszę, pieprz, śliwę daktylową, sosnę, ananasy, babkę zwyczajną, śliwę, granaty, topolę, ziemniaki, dynię zwyczajną, pigwę, sosnę promieniową, radiscchio, rzodkiew, rzepak, maliny, ryż, żyto, sorgo, sosnę południową, soję, szpinak, dynię, truskawki, buraki cukrowe, trzcinę cukrową, słoneczniki, słodkie ziemniaki, Liquidambar styraciflua, mandarynki, herbatę, tytoń, pomidory, triticale, darń, rzepę polną, winorośl, arbuzy, pszenicę, słodkie ziemniaki i cukinię. Do szczególnie korzystnych celów roślinnych należą kukurydza, bawełna, soja i pszenica.

Cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku izoluje się z kukurydzy (Zea mays). Roślina kukurydzy wydaje około 20-21 liści, wiechy po około 65 dniach od wzejścia i dojrzewa po 125 dniach od wzejścia. Normalne rośliny kukurydzy podlegają ogólnym prawidłom rozwoju, jednak występują różnice w odstępach czasu pomiędzy różnymi stadiami i w morfologii różnych hybryd oraz u roślin rosnących w różnych warunkach wzrostu i środowiskowych.

Rozróżnia się szereg dających się zidentyfikować faz rozwoju rośliny kukurydzy. Fazy te dzieli się na wegetatywne (V) i reprodukcyjne (R). Fazy V dzielą się na podfazy, oznaczane numerami V1, V2, V3 i tak dalej, do V(n), gdzie (n) oznacza stadium ostatniego liścia przed pojawieniem się kwiatostanu męskiego (VT). Pierwszą fazą V jest stadium kiełkowania (VE). Dla przykładu, VE oznacza stadium kiełkowania z gleby liścia młodej siewki, V1 oznacza stadium pierwszego normalnego liścia, V2 oznacza stadium drugiego liścia i tak dalej. Fazy reprodukcyjne obejmują okres między pierwszym pojawieniem się wiechy a dojrzewaniem nasion. Są to stadia następujące: R1 - tworzenie się wiechy,

PL 204 789 B1

R2 - tworzenie się ziarniaków w kolbach, R3 - stadium dojrzałości mlecznej, R4 -stadium dojrzałości woskowej, R5 - stadium powstawania zębów i R6 - stadium dojrzałości fizjologicznej (patrz np. Ritchie SW i wsp., How a Corn Plant Develops (Jak rozwija się roślina kukurydzy), Iowa State University of Science and Technology Cooperative Extension Service, Ames, IA 48: 1-21, 1986).

Każdy typ tkanki roślinnej można użyć jako tkankę doceIową do identyfikacji genów i związanych z nimi elementów regulatorowych, w tym sekwencji promotorowych. W niniejszym wynalazku stosuje się liczne tkanki kukurydzy. Bardziej korzystnie, do identyfikacji sekwencji promotorowych, jako tkanki docelowe stosuje się merystem (tkankę twórczą), niedojrzały kwiatostan męski, liście, korzenie, blednące sadzonki, pochwy, pierwsze pędy, kolby, wiechy i bielmo.

Do wyizolowania genów lub żądanych sekwencji regulatorowych można wykorzystać dowolny sposób pozwalający na różnicujące porównanie różnych typów lub klas sekwencji. Przykładowo, w jednym podejś ciu róż nicowego przesiewania, bibliotekę cDNA z mRNA wyizolowanego z okreś lonej tkanki można sporządzić w gospodarzu bakteriofagowym, wykorzystując dostępny w handlu zestaw do klonowania. Następnie bakteriofagi wysiewa się na płytki zawierające warstwę gospodarza bakteryjnego, takiego jak E. coli, dla wygenerowania łysinek bakteriofagów. Na błony wiążące DNA można przenieść około 105-106 łysinek. Duplikaty błon poddaje się sondowaniu, stosując sondy generowane z mRNA pochodzą cego z tkanki docelowej i nie docelowej albo z tkanki tł a. Sondy znakuje się , co ułatwia wykrywanie po hybrydyzacji i wywołaniu błon. Do dalszej analizy można wyselekcjonować te łysinki, które hybrydyzują z sondami pochodzącymi z docelowej tkanki ale nie hybrydyzują z sondami pochodzącymi z tkanki nie docelowej, a więc wykazują pożądany zróżnicowany wzór ekspresji. Z wybranych gatunków można również sporządzić biblioteki genomowego DNA, przez częściowe trawienie enzymem restrykcyjnym i selekcję fragmentów tego DNA według wielkości, w danym zakresie wielkości. Taki genomowy DNA można klonować do odpowiedniego wektora, między innymi do bakteriofaga i preparować go w odpowiednim zestawie opisanym wcześ niej (patrz np. Strafagene, La Jolla, CA albo Gibco BRL, Gaithersburg, MD).

Opisane powyżej techniki hybrydyzacji różnicowej są dobrze znane specjalistom. Można je stosować do izolowania żądanych klas sekwencji. Terminem klasy sekwencji określa się w niniejszym opisie sekwencje, które można zgrupować w oparciu o wspólną cechę identyfikacyjną, w tym również, między innymi, sekwencje wyizolowane z tej samej docelowej rośliny, ze wspólnej biblioteki albo ze wspólnego typu tkanki roślinnej. W korzystnym rozwiązaniu, identyfikuje się sekwencje będące przedmiotem zainteresowania w oparciu o analizę sekwencji i przeszukiwanie (przez stawianie pytań) kolekcji różnych sekwencji cDNA z bibliotek różnych typów tkanek. Ten ujawniony sposób jest przykładem podejścia różnicowego przesiewania opartego na elektronicznych analizach roślinnych sekwencji EST pochodzących z różnych bibliotek cDNA.

Szereg metod stosowanych do oceny ekspresji genu jest opartych na oznaczaniu poziomu mRNA w próbce narządu, tkanki lub komórki. Do typowych metod należą między innymi blottingi mRNA, próby zabezpieczenia przed rybonukleazą i poprzedzona odwrotną transkrypcją łańcuchowa reakcja polimerazy (RT-PCR).

W innym korzystnym rozwiązaniu, stosuje się wysokowydajną metodę, w której sekwencje regulatorowe identyfikuje się na podstawie oznaczenia profilu transkryptu. Rozwój technologii mikropaneli cDNA daje możliwość systematycznego monitorowania profili ekspresji genu dla tysięcy genów (Schena i wsp., Science 270: 467, 1995). W tej technologii chip-based, szereguje się tysiące sekwencji cDNA na powierzchni nośnika. Szeregi jednocześnie hybrydyzuje się z wieloma wyznakowanymi sondami cDNA przygotowanymi z próbek RNA z różnych typów komórek lub tkanek, co pozwala na bezpośrednią, porównawczą analizę ekspresji. Tę technologię po raz pierwszy zademonstrowano na przykładzie analizy 48 genów Arabidopsis na zróżnicowaną ekspresję w korzeniach i w pędach (Schena i wsp., Science 270: 467, 1995). Bardziej współcześnie, monitorowano profile ekspresji ponad 1400 genów z użyciem mikropaneli cDNA (Ruan i wsp., The Plant Journal 15: 821, 1998). Mikropanele dostarczają wysokowydajnej, ilościowej i powtarzalnej metody analizowania ekspresji genu i charakteryzowania funkcji genu. Podejście polegające na oznaczeniu profilu transkryptu z użyciem mikropaneli dostarcza innego cennego narzędzia do izolowania sekwencji regulatorowych, takich jak promotory związane z tymi genami.

W niniejszym wynalazku stosuje się wysokowydajną analizę sekwencji, tworzą c fundamenty szybkiej, komputerowej identyfikacji sekwencji będących przedmiotem zainteresowania. Specjalistom znane są środki dostępne do analizy sekwencji. Porównania sekwencji można dokonać przez oznaczenie podobieństwa sekwencji badanej lub poszukiwanej z sekwencjami dostępnymi w publicznie

PL 204 789 B1 dostępnych lub prywatnych bazach danych (analiza podobieństwa) albo przez poszukiwanie pewnych motywów (dogłębna analiza sekwencji; intrinsic sequence analysis) (np. elementów cis) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76, 1994; Birren i wsp., Genome Analysis, 1: 543, 1997). Sekwencja nukleotydowa przedstawiona na SEQ ID nr. 69 lub jej fragmenty bądź sekwencje do nich komplementarne albo sekwencje nukleotydowe identyczne w co najmniej 90%, korzystnie identyczne w 95% a nawet bardziej korzystnie w 99% lub 100% z sekwencją przedstawioną na SEQ ID nr. 69 albo ich fragmentami lub sekwencjami komplementarnymi do tych sekwencji, mogą być dostarczone w wielu różnych nośnikach, dla ułatwienia ich użycia. Takie medium może również dostarczać ich podzbiór w formie, która umoż liwi specjaliście z tej dziedziny wiedzy badanie sekwencji.

W jednym z zastosowań tego rozwią zania, sekwencja nukleotydowa wedł ug wynalazku moż e być zarejestrowana na nośniku czytanym komputerowo. Użyty termin nośnik czytany komputerowo odnosi się do każdego nośnika, który może być odczytany i bezpośrednio zaakceptowany przez komputer. Do takich nośników należą między innymi: nośniki z zapisem magnetycznym, takie jak dyskietki, dyski twarde, nośniki pamięciowe i taśmy magnetyczne, nośniki oparte na optycznym magazynowaniu informacji, takie jak CD-ROM, nośniki oparte na elektronicznym przechowywaniu informacji, takie jak RAM i ROM oraz połączenia tych kategorii, takie jak nośniki magnetyczno-optyczne. Specjaliści z tej dziedziny wiedzy z łatwością ocenią, w jaki sposób znane obecnie nośniki czytane komputerowo mogą być użyte do tworzenia i produkcji nośników komputerowych zawierających zarejestrowane w nich sekwencje nukleotydowe opisane w wynalazku.

Dzięki dostarczeniu jednej lub większej ilości sekwencji nukleotydowych opisanych w wynalazku, specjaliści mogą rutynowo dotrzeć do informacji o sekwencji i użyć tę informację do wielu celów. Powszechnie dostępne jest oprogramowanie komputerowe, umożliwiające specjaliście dotarcie do informacji o sekwencji zawartej w nośniku czytanym komputerowo. Do przykładów publicznie dostępnych baz danych należą między innymi japońska baza danych DNA Database of Japan (DDBJ) (http://www.ddbj.nigac.jp/): bank genów Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank/lndex.html) i baza danych European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMEL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html) albo ich wersje. Opracowano wiele różnych algorytmów poszukiwań, w tym między innymi takie, które pasują do programów określanych jako programy BLAST. Istnieje pięć implementacji BLAST, z czego trzy przeznaczone są do zapytań o sekwencje nuleotydcwe (BLASTN, BLASTX i TBLASTX) i dwie przeznaczone do zapytań o sekwencje białkowe (BLASTP i TBLASTN) (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80, 1994; Birren i wsp., Genome Analysis, 1: 543, 1997).

W niniejszym wynalazku znajduje zastosowanie również każdy program przeznaczony do poszukiwań motywów. Programy analizy sekwencji zaprojektowane do poszukiwań motywów można stosować do identyfikacji elementów cis. Korzystne programy komputerowe mogłyby między innymi obejmować programy MEME, SIGNAL SCAN i GENESCAN. Meme jest programem identyfikującym motywy konserwatywne (kwasów nukleinowych bądź peptydowe) w grupie sekwencji nie nakładających się. Meme zachowuje te motywy jako zestaw profili. Profile te mogą być użyte do poszukiwań bazy danych o sekwencjach. Algorytm MEME (wersja 2.2) znajduje się w wersji 10.0 pakietu GCG. MEME jest opisany przez T. Bailey'a i C. Elkan'a (Machine Learning, 21 (1-2): 51-80, 1995) i ma następującą lokalizację w sieci internetowej: http://www.sdsc.edu/MEME/meme/website/COPYRlGHT.html.). SignalScan jest programem, który identyfikuje znane motywy w badanych sekwencjach, wykorzystując informację z innych baz danych o motywach (Prestidge, D. S., CABIOS 7, 203-206, 1991). Informacja o SignalScan, wersja 4.0 jest dostępna w sieci pod adresem: http://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. Adresem ftp dla Signal Scan jest ftp://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. Do baz danych znajdujących się w Signal Scan należą PLACE (http://www.dna.affrc.go.ip/htdocs/PLACE (Higo i wsp., Nucleic Acid Research 27(1): 297-300, 1999) i TRANSFAC (Heinemeye X. i wsp., Nucleic Acid Research 27(1): 318-322). Można je znaleźć pod adresem internetowym http://transfac.gbf.de/. GeneScan jest następnym programem użytecznym do poszukiwań motywów (Burge C. i Karlin S., J. Mol. Biol. 268, 78-94, 1997) a informacja o wersji 1.0 jest dostępna pod adresem internetowym: http://gnomic.stanford.edu/GENESCANW.html. Stosowany w opisie termin docelowy motyw strukturalny lub motyw docelowy odnosi się do dowolnej, racjonalnie wybranej sekwencji lub kombinacji sekwencji, w której sekwencja jest wybrana w oparciu o strukturę trójwymiarową, utworzoną w wyniku sfałdowania docelowego motywu. Specjalistom znanych jest wiele motywów docelowych. Do białkowych motywów docelowych należą między innymi miejsca aktywne enzymatycznie i sekwencje sygnałowe. Korzystne motywy docelowe

PL 204 789 B1 według wynalazku obejmują między innymi sekwencje promotorowe, elementy cis, struktury szpilki do włosów i inne elementy ekspresyjne, takie jak sekwencje wiążące białka.

Stosowane w opisie określenie środki poszukiwań odnosi się do jednego lub kilku programów włączonych do systemu komputerowego w celu umożliwienia porównania sekwencji docelowej lub docelowego motywu strukturalnego z informacją o sekwencjach przechowywaną w środkach przechowywania danych. Takie środki stosuje się do identyfikacji fragmentów lub regionów sekwencji według wynalazku, które pasują do konkretnej sekwencji docelowej lub docelowego motywu. Można również dokonywać porównania wielu sekwencji w celu identyfikacji wspólnych regionów lub motywów, które mogą być odpowiedzialne za określone funkcje. Dla przykładu, można identyfikować elementy cis lub domeny sekwencji nadające określony profil ekspresji w wyniku nakł adania i analizowania w pewnych pakietach oprogramowania wielu regionów promotorowych podobnych klas promotorów.

Niniejszy wynalazek pozwala ponadto na dostarczenie systemów, zwłaszcza systemów komputerowych, zawierających opisaną informację o sekwencji. Określenie system komputerowy odnosi się w niniejszym opisie do urządzeń komputerowych, oprogramowania i środków przechowywania danych stosowanych do analizowania informacji o sekwencji nukleotydowej według wynalazku. W skład minimalnych urządzeń komputerowych w systemach komputerowych według wynalazku wchodzi centralna jednostka procesora (CPU), urządzenia wprowadzające, urządzenia wyprowadzające i środki przechowywania danych. Specjaliści z pewnością uznają, że dowolne, dostępne systemy komputerowe nadają się do użycia w wynalazku.

Sekwencje SEQ ID nr. 6-52 są primerami zaprojektowanymi na podstawie sekwencji cDNA zidentyfikowanych na podstawie porównań sekwencji zawartych w bazach komputerowych. Sekwencje te stosuje się do wydłużenia sekwencji kwasu nukleinowego technikami amplifikacji z uż yciem ł a ń cuchowej reakcji polimerazy (PCR) (patrz np. Mullis i wsp., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1986; Erlich i wsp., publikacje zgłoszeń patentowych europejskich EP 50.424, EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; Mullis, publikacja zgłoszenia patentowego europejskiego EP 201.184; Mullis i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 4.683.202; Erlich, opis patentowy US 4.582.788 i Saiki i wsp., opis patentowy US 4.683.194). Specjalistom znanych jest wiele metod amplifikacji PCR stosowanych do identyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego sąsiadujących z sekwencją znaną. Przykładowo, zostały opisane metody inwersyjne PCR (IPCR) do amplifikacji nieznanych sekwencji DNA sąsiadujących z regionem rdzeniowym sekwencji znanej. Dostępne są również inne metody, takie jak wychwytowa PCR (capture PCR) (Lagerstrom M. i wsp., PCR Methods Applic. 1:111, 1991) i walking PCR (Parker JD i wsp., Nucleic Acids Res. 19: 3055, 1991). Do celów identyfikacji żądanych sekwencji, wielu producentów opracowało również zestawy oparte o modyfikacje tych metod. Postęp w wyposażeniu technicznym obejmujący ulepszenia w projektowaniu primerów i sekwencji adaptorowych, ulepszenia w enzymie polimerazy i w parametrach technicznych termocyklerów przyczynił y się do uł atwienia wprowadzenia szybszych, wydajnych metod izolowania żądanych sekwencji.

W korzystnym rozwiązaniu, izoluje się sekwencje flankują ce zawierające elementy regulatorowe 5' według wynalazku wykorzystując podejście spaceru po genomie (zestaw o nazwie Universal GenomeWalker™ Kit, Clonthech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Pokrótce, oczyszczony genomowy DNA poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym dającym fragmenty genomowego DNA z końcami, które liguje się z sekwencjami adaptorowymi GenomeWalker™. Równolegle z primerami specyficznymi dla genu wykorzystuje się primery GenomeWalkers™ w dwu następujących po sobie reakcjach PCR: pierwszorzędowej i gniazdowej, wytwarzając produkty reakcji PCR zawierające sekwencje regulatorowe 5', które następnie klonuje się i sekwencjonuje.

Poza zastosowaniem do modulowania ekspresji genu, sekwencje promotorowe według wynalazku mogą być używane jako sondy lub primery w próbach hybrydyzacji kwasów nukleinowych. Sondy i primery kwasu nukleinowego według wynalazku mogą hybrydyzować w wysokich wymaganiach z docelową sekwencją DNA. Termin wysokie wymagania hybrydyzacji definiuje się jako warunki, w których sonda lub primer hybrydyzuje swoiście z sekwencją (sekwencjami) docelowymi a nie hybrydyzuje z sekwencjami nie-docelowymi, które to warunki można oznaczyć doświadczalnie. Termin wymagania wysokie jest zdefiniowany funkcjonalnie w odniesieniu do hybrydyzacji sondy kwasu nukleinowego z docelowym kwasem nukleinowym (czyli określoną, interesującą badacza sekwencją kwasu nukleinowego) jako specyficzna procedura hybrydyzacji opisana przez Sambrook'a i wsp. w rozdziałach 9,52-9.55 (1989) [Sambrook i wsp. rozdziały 9.47-9.52,

PL 204 789 B1

9.56-9.58 (1989); Karehis, Nucl. Acids Res. 12: 203-213 (1984); Wetmur i Davidson, J. Mol. Biol. 31: 349-370 (1958)]. Odpowiednimi wymaganiami wysokimi, pobudzającymi hybrydyzację DNA są przykładowo warunki następujące: 6,0 x chlorek sodu/cytrynian sodu (SSC) w temperaturze około 45°C, następnie płukanie roztworem 2,0 x SSC w temperaturze 50°C. Są one znane specjalistom i są opisane w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Dla przykładu, w etapie płukania można stosować stężenie soli w zakresie od niskich wymagań, w których stosuje się okoł o 2,0 x SSC w temperaturze 50° C do wysokich wymagań , wynoszących około 0,2 x SSC w temperaturze 50°C. Ponadto, w etapie płukania można zwiększać temperaturę od warunków niskich wymagań określanych jako w temperatura pokojowa, około 22°C, do warunków wysokich wymagań, wynoszących około 65°C. Zarówno temperaturę jak i stężenie soli można zmieniać, lub też można utrzymywać na stałym poziomie albo temperaturę albo stężenie soli natomiast zmieniać drugą zmienną.

Dla przykładu, można przeprowadzić hybrydyzację z użyciem sond lub primerów DNA lub RNA w temperaturze 65°C w roztworze o składzie: 6 x SSC, 0,5% SDS, 5 x roztwór Denhardta, 100 μg/ml nieswoistego DNA (np. sonifikowany DNA ze spermy łososia) z płukaniem w roztworze: 0,5 x SSC, 0,5% SDS w temperaturze 65°C dla hybrydyzacji wysokich wymagań.

Należy zaznaczyć, że hybrydyzację niskich wymagań, a więc, niższe temperatury hybrydyzacji i/lub płukania można stosować do identyfikacji sekwencji pokrewnych, posiadających niższy stopień podobieństwa sekwencji jeśli zachowana jest swoistość wiązania sondy lub primera z sekwencją docelową (sekwencjami docelowymi). Zgodnie z powyższym, sekwencja nukleotydowa według wynalazku może być stosowana ze względu na jej zdolność do selektywnego tworzenia cząsteczek dupleksowych z komplementarnymi nićmi fragmentów DNA. Wykrywanie segmentów DNA przez hybrydyzację jest znane specjalistom, a zatem, zależnie od przewidywanego zastosowania, można stosować różne warunki hybrydyzacji dla uzyskania różnego stopnia selektywności sondy w stosunku do docelowej sekwencji i wybrany sposób będzie zależał od zakładanych wyników.

Sekwencja kwasu nukleinowego przedstawione na SEQ ID nr. 69 i jej dowolne warianty mają zdolność hybrydyzacji z innymi sekwencjami kwasu nukleinowego w odpowiednio dobranych wymaganiach. W niniejszym opisie przyjmuje się, że dwie cząsteczki kwasu nukleinowego mają zdolność wzajemnej, specyficznej hybrydyzacji jeśli te dwie cząsteczki mogą tworzyć antyrównoległą, dwuniciową strukturę kwasu nukleinowego. Przyjmuje się, że cząsteczka kwasu nukleinowego jest komplementarna do innej cząsteczki kwasu nukleinowego jeśli wykazują one całkowitą komplementarność. Przyjmuje się również, że cząsteczki wykazują całkowitą komplementarność gdy każdy nukleotyd jednej z cząsteczek jest komplementarny z nukleotydem w drugiej. Przyjmuje się, że dwie cząsteczki wykazują minimalną komplementarność, jeśli mogą ze sobą hybrydyzować ze stabilnością wystarczającą do utrzymania ich w stanie wzajemnego związania w warunkach co najmniej typowych niskich wymagań. Podobnie, przyjmuje się, że cząsteczki są komplementarne, jeśli mogą ze sobą hybrydyzować ze stabilnością wystarczającą do utrzymania ich w stanie wzajemnego związania w warunkach typowych wysokich wymagań hybrydyzacyjnych. Typowe wymagania hybrydyzacji są opisane przez Sambrook'a i wsp. w podręczniku: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, II wyd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989) i przez Haymes'a i wsp., w Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).

W korzystnym rozwiązaniu, sekwencje kwasu nukleinowego, SEQ ID nr. 53-75 bądź fragmenty, regiony, elementy cis lub oligomery każdej z tych sekwencji mogą być użyte w próbach hybrydyzacji z innymi tkankami roślinnymi, do identyfikacji ściśle pokrewnych lub homologicznych genów i związanych sekwencji regulatorowych. Próby te obejmują bez ograniczeń próby hybrydyzacji typu Southern lub Northern'a prowadzone na każdym substracie, między innymi na odpowiednio spreparowanej tkance roślinnej, celulozie, nylonie lub na filtrze złożonym, skrawku lub szkiełku mikroskopowym. Metodologie te są dobrze znane w technice i są dostępne w zestawach lub preparatach, które mogą być dostarczone przez handlowców.

Oczywiście, fragmenty można również uzyskać innymi drogami, takimi jak bezpośrednia synteza danego fragmentu metodą chemiczną, co praktykuje się powszechnie wykorzystując zautomatyzowane syntetyzery oligonukleotydów. Fragmenty można również otrzymać z użyciem technologii reprodukcji kwasu nukleinowego, takiej jak technologia PCR™ (łańcuchowa reakcja polimerazy) technikami rekombinacji DNA, ogólnie znanymi przez specjalistów z dziedziny biologii molekularnej. W odniesieniu do amplifikacji docelowej sekwencji kwasu nukleinowego (np. w re16

PL 204 789 B1 akcji PCR) z użyciem konkretnej pary primerów amplifikacji, wysokie wymagania PCR oznaczają warunki zapewniające, że para primerów będzie hybrydyzcwać jedynie z docelową sekwencją kwasu nukleinowego, z którą powinien się związać primer posiadający korespondującą sekwencję typu dzikiego (lub sekwencję komplementarną) i korzystnie bezie dawać unikalny produkt amplifikacji.

Fragmentem kwasu nukleinowego w znaczeniu przyjętym w niniejszym opisie jest każda część kwasu nukleinowego, która jest mniejsza od kwasu nukleinowego o pełnej długości. Przykładowo, do celów niniejszego wynalazku, przyjmuje się, że fragmentem jest każda sekwencja kwasu nukleinowego o długości mniejszej od ujawnionej w sekwencji nukleotydowej SEQ ID nr. 69. Fragmentem jest również sekwencja o długości przynajmniej minimalnej, przy której jeszcze jest zachowana zdolność hybrydyzacji swoiście z natywnym kwasem nukleinowym w warunkach wysokich wymagań hybrydyzacyjnych zdefiniowanych powyżej. Długość takiego minimalnego fragmentu wynosi korzystnie co najmniej osiem nukleotydów, bardziej korzystnie, 15 nukleotydów, jeszcze bardziej korzystnie, co najmniej 20 nukleotydów a najkorzystniej, co najmniej 30 nukleotydów natywnej sekwencji kwasu nukleinowego.

Sekwencja kwasu nukleinowego według wynalazku może być również stosowana jako sonda i primer. Sondy i primery kwasu nukleinowego można sporządzać w oparciu o sekwencję natywnego genu. Sondą jest wyizolowany kwas nukleinowy, do którego została przyłączona cząsteczka konwencjonalnego wykrywalnego znacznika lub cząsteczka reporterowa, np. izotop radioaktywny, ligand, środek chemiluminescencyjny lub enzym. Primerami są wyizolowane kwasy nukleinowe, które łączą się z komplementarną nicią docelowego DNA przez hybrydyzację kwasu nukleinowego z utworzeniem hybrydu pomiędzy tym primerem i nicią docelowego DNA i następnie wydłużają nić docelowego DNA z udział em polimerazy, np. polimerazy DNA. Pary primerów moż na uż yć do amplifikacji sekwencji kwasu nukleinowego, np. w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) albo z użyciem innych znanych metod amplifikacji kwasu nukleinowego.

Sondy i primery mają na ogół długość 15 nukleotydów lub więcej, korzystnie 20 nukleotydów lub więcej, bardziej korzystnie 25 nukleotydów a najkorzystniej 30 nukleotydów lub więcej. Takie sondy i primery hybrydyzują swoiście z docelową sekwencją DNA lub RNA w warunkach wysokich wymagań i hybrydyzują swoiście z docelową sekwencją natywną innych gatunków w warunkach niższych wymagań hybrydyzacji. Korzystnie, sondy i primery według wynalazku mają całkowite podobieństwo sekwencji z sekwencją natywną, chociaż można skonstruować znanymi sposobami sondy różniące się od sekwencji natywnej, jednak zachowujące zdolność hybrydyzacji z docelowymi sekwencjami natywnymi. Sposoby preparowania i stosowania sond i primerów są opisane np. w podręczniku Molecular Cloning: A Laboratory Manual, II wyd., tomy 1-3, wydawca: Sambrook i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (dalej cytowanym jako Sambrook i wsp. 1989), w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. Ausubel i wsp., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nowy Jork, 1992 (z okresowymi aktualizacjami) (dalej cytowanym jako Ausubel i wsp.,1992); i w podręczniku Innis'a i wsp., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pary primerów PCR mogą być wyprowadzone ze znanej sekwencji, np. przy użyciu programów komputerowych opracowanych do tego celu, takich jak Primer (wersja 0.5 © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Primery i sondy oparte na ujawnionych w opisie natywnych sekwencjach promotorowych mogą być użyte do potwierdzenia tożsamości i o ile to potrzebne, do modyfikowania ujawnionych sekwencji znanymi sposobami, np. przez reklonowanie i resekwencjonowanie.

W innym rozwiązaniu, moż na modyfikować sekwencje nukleotydowe promotorów ujawnione w niniejszym opisie. Specjaliś ci mogą wytwarzać cząsteczki DNA posiadające róż nice w tych sekwencjach nukleotydowych. Sekwencję nukleotydową według wynalazku przedstawioną na SEQ ID nr. 69 można modyfikować lub zmieniać w kierunku wzmocnienia ich właściwości kontrolnych. Jedną z korzystnych metod zmiany sekwencji kwasu nukleinowego jest użycie reakcji PCR w celu modyfikacji wybranych nukleotydów lub regionów sekwencji. Metody te są znane specjalistom. Sekwencje można modyfikować np. przez insercję, delecję lub zamianę sekwencji matrycy w modyfikacji DNA opartej na reakcji PCR. Wariantowymi cząsteczkami DNA są cząsteczki DNA zawierające zmiany polegające na tym, że jeden lub większa ilość nukleotydów w sekwencji natywnej została wycięta, dodana i/lub zastąpiona, korzystnie przy zachowaniu zasadniczej funkcji promotora. W przypadku fragmentu promotora, wariantowy DNA może zawierać zmiany wpływające na transkrypcję minimalnego promotora, z którym jest operacyjnie związany. Wariantowe cząsteczki DNA można wytwarzać

PL 204 789 B1 np. standardowymi technikami mutagenezy DNA albo przez chemiczną syntezę takiej wariantowej cząsteczki DNA lub jej części.

W innym rozwią zaniu, sekwencja nukleotydowa przedstawiona na SEQ ID nr. 69 obejmuje każdą długość tej sekwencji, przy której zachowana jest zdolność regulowania związanej operacyjnie sekwencji DNA. Przykładowo, sekwencja ujawniona na SEQ ID nr. 69 może być skrócona lub może być wycięta jej część i pomimo tego będzie ona ciągle miała zdolność regulowania transkrypcji związanej operacyjnie sekwencji DNA. W pokrewnym rozwiązaniu, element cis ujawnionej sekwencji może nadawać konkretną swoistość, np. nadawać zwiększoną ekspresję związanych operacyjnie sekwencji DNA w niektórych tkankach, a zatem, ma również zdolność regulowania transkrypcji związanych operacyjnie sekwencji DNA. W konsekwencji, dowolne fragmenty, części lub regiony ujawnionej sekwencji SEQ ID nr. 69 mogą być użyte jako sekwencje regulatorowe, w tym mię dzy innymi również elementy cis lub motywy ujawnionych sekwencji. Dla przykł adu, jedną lub większą ilość par zasad można usunąć z końca 5' albo 3' sekwencji promotorowej, uzyskując promotor skrócony. Można również dokonać insercji, delecji lub substytucji jednej lub większej ilości par zasad wewnątrz sekwencji promotora. Promotory mogą być konstruowane w taki sposób, że fragmenty lub elementy promotora wiąże się operacyjnie, np. przez umieszczenie takiego fragmentu w kierunku 5' od promotora minimalnego. Promotorem minimalnym lub podstawowym jest odcinek DNA zdolny do uruchamiania i wiązania podstawowej maszynerii transkrypcji. Przykładem podstawowej maszynerii transkrypcji w komórkach eukariotycznych jest kompleks RNA polimerazy II i towarzyszących jej białek. Komponenty enzymatyczne tej podstawowej maszynerii transkrypcji mają zdolność inicjowania i elongacji transkrypcji danego genu przy użyciu promotora minimalnego lub podstawowego. Oznacza to, że nie występują dodane sekwencje cis w regionie promotora zdolne do rekrutacji i wiązania czynników transkrypcji modulujących transkrypcję, takich, które wzmacniają, tłumią, sprawiają, że transkrypcja staje się hormono-zależna i tym podobne. W celu uzyskania końcowej konstrukcji można łączyć ze sobą substytucje, delecje, insercje lub dowolne ich kombinacje.

Natywne lub syntetyczne kwasy nukleinowe opisane w niniejszym opisie można wbudowywać do rekombinantowych konstruktów kwasu nukleinowego, na ogół konstruktów DNA, zdolnych do wejścia do komórki gospodarza i replikacji w tej komórce. W jednym z korzystnych rozwiązań, sekwencja nukleotydowa według wynalazku, tak jak jest ona przedstawiona na SEQ ID nr. 69 lub ich fragmenty, warianty lub pochodne, są wbudowane do kasety wektora ekspresyjnego zawierającej regiony prmotorowe według wynalazku związane operacyjnie z komponentą genetyczną, taką jak gen selekcyjny, dający możliwość przesiewania lub gen markerowy umożliwiający zliczanie. Ujawnione sekwencje kwasu nukleinowego według wynalazku są korzystnie związane operacyjnie z komponentą genetyczną, taką jak kwas nukleinowy, nadający pożądaną cechę charakterystyczną związaną z morfologią rośliny, jej fizjologią, wzrostem i rozwojem, wydajnością, zwiększoną wartością odżywczą, odpornością na choroby lub szkodniki lub tolerancją środowiska lub chemikalii. Te komponenty genetyczne, takie jak geny markerowe lub interesujące geny rolnicze, mogą spełniać funkcję w identyfikacji transformowanej komórki roślinnej lub rośliny albo dawać produkt o znaczeniu agronomicznym.

W korzystnym rozwiązaniu, jedna komponenta genetyczna daje produkt, który s łuży jako narzędzie selekcji i funkcjonuje w zdolnej do regeneracji tkance roślinnej, dając związek, który będzie nadawał tkance roślinnej odporność na skąd indziej toksyczny związek. Geny interesujące do stosowania jako markery selekcyjne, dające możliwość przesiewania lub zliczania mogą między innymi obejmować sekwencję kodującą glukuronidazę (GUS), sekwencję kodującą białko o zielonej fluorescencji (GFP), sekwencję kodująca lucyferazę (LUX), geny tolerancji antybiotyku lub herbicydu. Przykładami transposonów i związanych genów oporności na antybiotyk są transposony Tns (bla), Tn5 (nptll), Tn7 (dhfr), penicyliny, kanamycyny (i neomycyny, G418, bleomycyny), metotreksatu (i trimetoprimu), chloramfenikolu, kanamycyny i tetracykliny.

Właściwości użyteczne jako markery selekcyjne w roślinach zostały opisane w raporcie na temat użycia mikroorganizmów (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, lipiec 1994). Obejmują one selekcję w wysokich wymaganiach, przy minimalnej ilości nie transformowanych tkanek, dużej ilości niezależnych wydarzeń transformacji, przy nieznacznym zakłócaniu regeneracji, możliwości zastosowania do dużej ilości gatunków i możliwości wykonania próby tak, aby można było zliczać tkanki, w których występuje dany znacznik.

PL 204 789 B1

Znanych jest wiele selekcyjnych genów markerowych a kilka markerów oporności na antybiotyki odpowiada tym kryteriom. Należą do nich: gen oporności na kanamycynę (nptll), higromycynę B (aph IV) i gentamycynę (aac3 i aacC4). Do użytecznych dominujących genów selekcyjnych należą geny kodujące oporność na antybiotyk (np. oporność na higromycynę, kanamycynę, bleomycynę, G418, streptomycynę lub spektynomycynę) i geny oporności na herbicyd (np. gen dla acetylotransferazy fosfinotrycyny). Użyteczna strategia selekcji transformantów z cechą odporności na herbicyd jest opisana np. w publikacji: Vasil'a, Cell Culture and Somatic Cell. Genetics of Plants, tomy I-III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, Nowy Jork, 1984. Szczególnie korzystnymi, selekcyjnymi genami markerowymi do użycia w niniejszym wynalazku powinny być geny nadające odporność na związki takie jak antybiotyki, np. kanamycynę i herbicydy, np. na glifozat (Della-Cioppa i wsp., Bio/Technology 5(6), 1987, opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.463.175 i US 5.633.435). Można również stosować inne narzędzia selekcji i będą one w dalszym ciągu objęte zakresem wynalazku.

W praktycznym wykonaniu wynalazku stosuje się znane kompozycje i sposoby przygotowywania i stosowania wektorów i komórek gospodarza. Są one między innymi opisane w podręczniku Sambrooka i wsp. (1989). W korzystnym rozwiązaniu, komórką gospodarza jest komórka roślinna. Opisano wiele wektorów nadających się do trwałej transfekcji komórek roślinnych albo do zaprowadzenia hodowli transgenicznych roślin [np. Pouwels i wsp., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, suppl. 1987); Weissbach i Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin i wsp., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990 i R. R. D. Croy, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993]. Roślinne wektory ekspresyjne mogą przykładowo obejmować jeden lub większą ilość sklonowanych genów roślinnych pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych 5' i 3'. Mogą one również zawierać opisany marker selekcyjny dla umożliwienia selekcji komórek gospodarza zawierających ten wektor ekspresyjny. Takie roślinne wektory ekspresyjne zawierają również na ogół promotorowy region regulacyjny (np. region regulacyjny kontrolujący ekspresję indukowaną albo konstytutywną, regulowaną warunkami środowiska lub stadium rozwoju rośliny albo ekspresję swoistą dla komórki lub tkanki), miejsce początku transkrypcji, miejsce wiązania z rybosomem, sygnał przetwarzania RNA, miejsce zakańczania transkrypcji i sygnał poliadenylacji. Włączone są w nim również inne sekwencje pochodzenia bakteryjnego, umożliwiając klonowanie tego wektora do gospodarza bakteryjnego. Wektor będzie również na ogół zawierał prokariotyczne źródło replikacji dla szerokiego zakresu gospodarzy. W szczególnie korzystnym rozwiązaniu, komórką gospodarza jest komórka roślinna a wektor ekspresyjny zawiera region promotora ujawniony na sekwencjach SEQ ID nr. 69, związaną operacyjnie sekwencję podlegającą transkrypcji i sekwencję zakańczania transkrypcji. Poza miejscami dla enzymów restrykcyjnych do celów klonowania można również włączyć inne sekwencje regulatorowe, takie jak 5' lidery nie podlegające translacji.

Wiele promotorów znajduje zastosowanie do ekspresji w roślinach dowolnego interesującego genu, w tym między innymi markerów selekcyjnych, markerów umożliwiających zliczanie, genów tolerancji szkodników, tolerancji choroby, zwiększenia wartości odżywczych i dowolnego innego genu ważnego z punktu widzenia agronomii. Przykłady promotorów konstytutywnych użytecznych do ekspresji genu w roślinach obejmują między innymi promotor 35S z wirusa mozaiki kalafiorowej (CaMV), nadający konstytutywną ekspresję na wysokim poziomie w większości tkanek roślinnych (patrz np. Odel i wsp., Nature 313:810, 1985), w tym w roślinach jednoliściennych (patrz np. Dekeyser i wsp., Plant Cell 2: 591, 1990; Terada i Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990), promotor syntazy nopalinowej (An i wsp., Plant Physiol. 88: 547, 1988) i promotor syntazy oktopinowej (Fromm i wsp.,

Plant Cell: 977, 1989) oraz promotor wirusa mozaiki tredownika (FMV).

Do ekspresji operacyjnie związanego genu w komórkach roślinnych można użyć wiele różnych promotorów genów roślinnych, które są regulowane w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, hormonalne, chemiczne i/lub rozwojowe, w tym promotory regulowane przez (1) ciepło (Callis i wsp., Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) światło (np. promotor rbcS-3A z grochu, Kuhlemeier i wsp., Plant Cell 1: 471, 1989; promotor RbcS z kukurydzy, Schaffner i Sheen, Plant Cell 3: 997, 1991; lub promotor dla białka a/b wiążącego chlorofil, Simpson i wsp., EMBO J. 4: 2723, 1985), (3) hormony, takie jak kwas abscyzynowy (Marcotte i wsp., Plant Cell 1: 969, 1989), (4) skaleczenie (np. wunl, Siebertz i wsp., Plant Cell 1: 961, 1989) albo (5) związki chemiczne, takie jak jasmonian metylu, kwas salicylowy albo środek ochrony. Może się również okazać korzystne użycie

PL 204 789 B1 (6) promotorów specyficznych dla narządów (np. Roshal i wsp., EMBO J. 6: 1155, 1987; Schernthaner i wsp., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos i wsp., Plant Cell 1: 839, 1989).

Promotory opisane w wynalazku są promotorami roślinnymi posiadającymi zdolność transkrypcji związanych operacyjnie sekwencji DNA w wielu tkankach. Mogą być one związane operacyjnie z dowolnym genem będącym przedmiotem zainteresowania w wektorze ekspresyjnym.

Roślinne wektory ekspresyjne mogą zawierać sygnały przetwarzania RNA, np. introny, które mogą być usytuowane w kierunku 5' albo 3' od sekwencji kodującej polipeptyd w transgenie. Ponadto, takie wektory ekspresyjne mogą zawierać dodatkowe sekwencje regulatorowe z nie podlegającego translacji regionu 3' genów roślinnych (Thornburg i wsp., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84: 744, 1987); An i wsp., Plant Cell 1: 115, 1989), np. region 3'-terminatora, w celu zwiększenia stabilności mRNA, taki jak region terminatora PI-II ziemniaka lub regiony terminatorowe 3' z genów syntazy oktopiny lub nopaliny. Nie podlegające translacji regiony 5' mRNA mogą spełniać ważną rolę w inicjacji translacji i również mogą stanowić komponentę genetyczną w roślinnym wektorze ekspresyjnym. Przykładowo, wykazano, że nie podlegające translacji sekwencje liderowe 5' pochodzące z genów dla białek szoku cieplnego wzmacniają ekspresję genu w roślinach (patrz np. opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.362.865, włączony do niniejszego opisu w całości jako odnośnik). Takie dodatkowe sekwencje regulatorowe w kierunku 5' i w kierunku 3' mogą pochodzić ze źródła, które jest natywne lub heterologiczne w odniesieniu do innych elementów obecnych w wektorze ekspresyjnym.

Sekwencje promotorowe opisane w wynalazku stosuje się do kontroli ekspresji genu w komórkach roślinnych. Ujawnione sekwencje promotorowe są komponentami genetycznymi stanowiącymi części wektorów stosowanych do transformowania roślin. Sekwencje promotorowe według wynalazku mogą być użyte z dowolnym plazmidem lub wektorem odpowiednim do transformacji roślin, zawierającymi marker selekcyjny lub umożliwiający próby przesiewowe oraz związane elementy regulacyjne, jak opisano, oraz jeden lub większą ilość kwasów nukleinowych podlegających ekspresji w sposób wystarczający do nadania danej pożądanej cechy. Przykłady odpowiednich genów strukturalnych interesujących z punktu widzenia rolnictwa, przewidywanych w niniejszym wynalazku obejmują między innymi jeden lub większą ilość genów odporności na owady, takich jak gen z Bacillus thuringiensis, geny odporności na szkodniki, takie jak geny kontrolujące choroby wywołane grzybami, tolerancji herbicydów, takie jak geny nadające tolerancję na glifosat i geny polepszające jakość, np. plonowanie, wartości odżywcze, wymagania środowiskowe lub znoszenia stresu bądź wprowadzające pożądane zmiany w fizjologii roślin, we wzroście, rozwoju, morfologii lub w produkcie (produktach) pochodzących z danej rośliny. Do szczególnie korzystnych genów będzie należał gen tolerancji herbicydu, nadający odporność na herbicyd glifosat. Do genów tych będą między innymi należały geny AGRTU.aroA:CP4 i GOX opisane w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.463.175 wprowadzonym w całości do niniejszego opisu jako odnośnik i US 5.633.435, wprowadzonym w całości do niniejszego opisu jako odnośnik.

Alternatywnie, sekwencje kodujące DNA będą wpływać na te fenotypy przez kodowanie nie podlegającej translacji cząsteczki RNA powodującej celowane hamowanie ekspresji genu endogennego, np. drogą mechanizmów antysensownych lub kosupresji (patrz np. Bird i wsp., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 201, 1991). Takim RNA mogłaby być również katalityczna cząsteczka RNA (np. rybozym), skonstruowana tak, aby rozszczepiała pożądany endogenny produkt mRNA (patrz np. Gibson i Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125, 1997). Tak więc, w praktycznym wykonaniu wynalazku jest przydatny każdy gen, który wytwarza białko lub mRNA i którego ekspresja daje pożądaną zmianę fenotypu lub morfologii.

Poza regulatorowymi elementami lub sekwencjami zlokalizowanymi w kierunku 5' albo wewnątrz sekwencji DNA, istnieją sekwencje w kierunku 3' wpływające na ekspresję genu, a zatem, termin sekwencja regulatorowa w znaczeniu stosowanym w opisie, odnosi się do każdej sekwencji nukleotydowej zlokalizowanej w kierunku 5', wewnątrz lub w kierunku 3' od sekwencji DNA, która kontroluje, pośredniczy lub wpływa na ekspresję produktu danego genu w powiązaniu z aparatem syntezy białka w komórce.

Sekwencje promotorowe opisane w wynalazku można modyfikować, np. do celów ekspresji w innych układach roślinnych. W innym podejściu, można zaprojektować lub skonstruować nowe promotory hybrydowe, wykorzystując różne techniki. Wiele promotorów zawiera sekwencje 5' (w górę), które aktywują, wzmacniają lub określają siłę i/lub swoistość danego promotora (Atchi20

PL 204 789 B1 son, Ann. Rev. Cell Biol. 4: 127, 1988). Geny T-DNA zawierają np. skrzynki TATA definiujące miejsce inicjacji transkrypcjii a inne elementy 5' zlokalizowane w kierunku 5' od miejsca inicjacji transkrypcji modulują poziomy transkrypcji [Gelvin, In Transgenic Plants (wyd. Kung S. D. i Us R.), San Diego: Academic Press, str. 49-87, 1988). Opisano też inny promotor chimeryczny stanowiący trimer aktywatora syntazy oktopinowej (ocs) do aktywatora syntazy mannopinowej (mas) i promotora, zwiększający ekspresję genu reporterowego (Min Ni i wsp., The Plant Journal 7: 661, 1995). Sekwencje regulatorowe w kierunku 5' według wynalazku można użyć do konstruowania takich promotorów chimerycznych lub hybrydowych. Metody konstruowania promotorów wariantowych opisane w wynalazku obejmują między innymi łączenie elementów kontrolnych z różnych promotorów lub powielanie części lub regionów promotora (patrz np. w opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.110.732 i US 5.097.025, wprowadzone w całości do niniejszego opisu jako odnośniki). Specjalistom z tej dziedziny wiedzy znane są standardowe materiały źródłowe, w których są opisane specyficzne warunki i procedury konstruowania, manipulacji i izolowania makrocząsteczek (np. cząsteczek DNA, plazmidów i podobnych), generowania organizmów rekombinantowych oraz przesiewania i izolowania genów [patrz np. Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga i wsp., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren i wsp., Genome Analysis: tom I, Analyzing DNA (1997), tom II, Detecting Genes (1998), tom III, Cloning Systems (1999), tom IV, Mapping Genomes (1999), Cold Spring Harbor, Nowy Jork].

Sekwencje promotorowe opisane w wynalazku można wprowadzać do wektora ekspresyjnego z użyciem opisanych powyżej markerów umożliwiających identyfikację opartą na przesiewaniu lub zliczaniu i testować je, prowadząc analizy przejściowe wykrywające ekspresję genu w stabilnych układach roślinnych. Metody testowania ekspresji genu w analizach przejściowych są znane specjalistom z tej dziedziny. Opisano przejś ciową ekspresję genów markerowych z uż yciem wielu róż nych roś lin, tkanek i układów dostarczania DNA. Przykładowe typy analiz przejściowych mogą obejmować między innymi bezpośrednie dostarczanie genu przez elektroporację lub bombardowanie tkanek cząstkami w dowolnej przejś ciowej analizie na roś linie z uż yciem interesują cych badacza gatunków roś lin. Takimi układami przejściowymi mogą być między innymi protoplasty z hodowli zawiesinowych pszenicy (Zhou i wsp., Plant Cell Reports 12: 612, 1993), poddane elektroporacji protoplasty z liś cia pszenicy (Sethi i wsp., J. Crop Sci. 52: 152, 1983), poddane elektroporacji protoplasty z tkanki kukurydzy (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) albo bombardowane cząstkami określone tkanki interesujące badacza. Wynalazek obejmuje użycie dowolnego przejściowego układu ekspresyjnego do oceny sekwencji regulatorowych związanych operacyjnie z wybranymi genami reporterowymi, genami markerowymi lub genami ważnymi z punktu widzenia rolnictwa. Przykłady tkanek roślinnych przewidywanych do testowania w analizach przejściowych w odpowiednim układzie dostarczania mogłyby między innymi obejmować tkanki nasady liścia, kallusową, liścienie, korzenie, bielmo, zarodki, tkankę kwiatową, pyłek kwiatowy i tkankę okrywającą.

W analizie przejś ciowej może być użyty każdy marker umożliwiający selekcję przez skrining lub zliczanie. Do korzystnych genów markerowych do analiz przejściowych promotorów lub sekwencji regulatorowych 5' według wynalazku należą: gen GUS (kodujący sekwencję dla β-glukuronidazy) albo gen GFP (kodujący sekwencję dla białka zielonej fluorescencji). Wektory ekspresyjne zawierające sekwencje regulatorowe 5' operacyjnie związane z genem markerowym dostarcza się do tkanek i tkanki te analizuje się według odpowiedniego mechanizmu, zależnie od markera. Takie analizy ilościowe i jakościowe stosuje się jako narzędzie do oceny potencjalnego profilu ekspresji sekwencji regulatorowych 5' po ich operacyjnym związaniu z genami ważnymi z punktu widzenia rolnictwa w trwałych roślinach. Ostatecznie, sekwencje promotorowe opisane w wynalazku wprowadza się bezpośrednio do wektorów ekspresyjnych odpowiednich do transformowania roślin, zawierających sekwencje regulatorowe 5' operacyjnie związane z markerami selekcyjnymi i żądanymi genami, transfomuje się nimi rośliny i rośliny te analizuje się na żądany profil ekspresji nadawany przez te sekwencje regulatorowe 5'.

Specjalistom z tej dziedziny wiedzy znane są wektory odpowiednie do transformowania roślin. Do takich odpowiednich wektorów należą między innymi pozbawione ramion plazmidy Ti stosowane w technikach z udziałem Agrobacterium. Wektory te mogą zawierać marker odporności, sekwencje graniczne 1-2 T-DNA i źródło replikacji dla E. coli i Agrobacterium oraz jeden lub kilka żądanych genów i towarzyszące regiony regulatorowe. Specjaliści mają świadomość, że w technice z udziałem Agrobacterium można użyć wiele szczepów i sposobów. Do takich szczepów należą między innymi szczepy Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 i EHA105. Szczepami szczególnie korzystnymi są

PL 204 789 B1 szczepy Agrobacterium tumefaciens. Znane są też specjalistom inne systemy dostarczania do transformowania roślin. Między innymi należy do nich bombardowanie cząstkami wybranych tkanek roślinnych.

Przykłady kwasów nukleinowych, jakie mogą być wprowadzone metodami objętymi wynalazkiem obejmują między innymi sekwencje DNA lub geny z innych gatunków lub nawet geny lub sekwencje, które pochodzą z lub występują w tym samym gatunku ale są wprowadzone do komórki przyjmującej metodami inżynierii genetycznej a nie metodami klasycznych technik reprodukcji lub hodowli. Jednakże termin egzogenny odnosi się również do genów, które normalnie nie występują w transformowanej komórce lub być może po prostu nie występują w takiej formie, strukturze itp. jaka występuje w transformującym segmencie DNA lub genie lub też odnosi się do genów, które normalnie są obecne, jednak pożądana jest np. ich nadekspresja. Tak więc, termin gen lub DNA egzogenny oznacza każdy gen lub segment DNA, który jest wprowadzony do komórki biorcy, niezależnie od tego, czy podobny gen już w tej komórce występuje. Typy DNA objęte terminem egzogennych obejmują DNA, który normalnie jest już obecny w komórce roślinnej, DNA z innej rośliny, DNA z innego organizmu albo DNA generowany zewnętrznie, taki jak sekwencja DNA zawierająca antysensowną informację o genie albo sekwencja DNA posiadająca kod syntetycznej lub zmodyfikowanej wersji genu.

Wektory do transformowania roślin zawierające opisane sekwencje promotorowe według wynalazku mogą być do roślin wprowadzane dowolną metodą transformowania roślin. Znanych i dostępnych jest wiele sposobów wprowadzania sekwencji DNA do komórek roślinnych. Stosowne metody obejmują między innymi zakażenie bakteriami, binarne bakteryjne, sztuczne wektory chromosomowe, bezpośrednie dostarczanie DNA (np. drogą transformacji za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG), pobierania DNA podczas suszenia/hamowania, elektroporacji, mieszania z włóknami węgliku krzemu i poddanie cząstek powleczonych DNA przyspieszeniu (przeglądu dokonał Potrykus w Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205, 1991).

W sposobach transformowania roślin dwuliściennych stosuje się przede wszystkim Agrobacterium tumefaciens. Przykładowo, do opisanych roślin transgenicznych należą między innymi bewełna (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.004.863, US 5.159.135, US 5.518.908, publikacja zgłoszenia patentowego międzynarodowego WO 97/43430), soja (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.569.834, US 5.416.011; McCabe i wsp., Bio/Technology, 6: 923, 1988; Christou i wsp., Plant Physiol., 87: 671, 1988), kapusta (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.463.174) i orzeszki ziemne (Cheng i wsp., Plant Cell Rep. 15: 653, 1996).

Podobne sposoby opisano dla transformowania roślin jednoliściennych. Transformowanie i regenerację roślin z użyciem tych sposobów opisano dla wielu roślin uprawnych, w tym między innymi dla szparagów (Asparagus officinalis; Bytebier i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345, 1987), jęczmienia (Hordeum vulgarae; Wan and Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994), kukurydzy (Zea mays; Rhodes C. A. i wsp., Science 240: 204, 1988; Gordon-Kamm i wsp., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm i wsp., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel i wsp., Bio/Technology, 11: 194, 1993), owsa (Avena sativa; Somers i wsp., Bio/Technology, 10: 1589, 1992), kupkówki pospolitej (Dactylis glomerata; Horn i wsp., Plant Cell Rep.,7: 469, 1988), ryżu (Oryza sativa, w tym odmian indyjskiej i japońskiej, Toriyama i wsp., Bio/Technology 6: 10, 1988; Zhang i wsp., Plant Cell Rep. 7: 379, 1988; Luo i Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang i Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou i wsp., Bio/Technology 9: 957, 1991); sorga (Sorghum bicolor; Casas A. M. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212, 1993), trzciny cukrowej (Saccharum spp.; Bower i Birch, Plant J. 2: 409, 1992); kostrzewy wysokiej (Festuca arundinacea; Wang Z. Y. i wsp., Bio/Technology, 10: 691, 1992), trawy darniowej (Agrostis palustris; Zhong i wsp., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993), pszenicy (Triticum aestivum; Vasil i wsp., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T. i wsp., Plant Physiol. 102: 1077, 1993; Becker i wsp., Plant J. 5: 299, 1994) i lucerny (Masoud S. A. i wsp., Transgen Res. 5: 313, 1996). Dla specjalistów jest oczywiste, że można wykorzystać wiele metodologii transformowania i zmodyfikować je do celów produkcji trwałych roślin transgenicznych z dowolnej ilości docelowych roślin uprawnych.

Transformowane rośliny analizuje się na obecność żądanych genów oraz na poziom i/lub profil ekspresji nadawany przez sekwencje promotorowe według wynalazku. Specjaliści z tej dziedziny wiedzy znają wiele dostępnych metod analizy transformowanych roślin. Do oceny ekspresji genów i oznaczania, czy wprowadzony gen (geny) są zintegrowane, prawidłowo funkcjonują i są dziedziczone, jak przewidywano, stosuje się wiele różnych metod.

PL 204 789 B1

W niniejszym wynalazku promotory moż na oceniać przez oznaczanie poziomów ekspresji genów z którymi promotory te są operacyjnie związane. Wstępną ocenę funkcji promotora można przeprowadzić wykonując próbę przejściową z użyciem genów reporterowych ale bardziej dokładną ocenę promotora można przeprowadzić analizując utrwalone rośliny. Analizę roślin można przykładowo prowadzić wykorzystując techniki blottingu typu southern albo Northern'a, reakcje PCR, analizy biochemiczne, metody przesiewania według fenotypu, próby polowe i analizy immunodiagnostyczne.

Sposoby wykorzystywane w niniejszym wynalazku, w tym między innymi sporządzanie biblioteki cDNA, sporządzanie biblioteki genomowej, sekwencjoncwanie, analiza sekwencji, technologie oparte na reakcji PCR, konstruowanie wektorów, analizy przejściowe i metody transformowania roślin są dobrze znane specjalistom i prowadzi się je wykorzystując standardowe techniki i ich modyfikacje.

W celu zilustrowania wynalazku podane są nastę pujące przykł ady.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Materiał roślinny, izolacja DNA i konstruowanie biblioteki

Do sporządzenia bibliotek kukurydzy wybrano wiele tkanek w wielu stadiach rozwoju rośliny. Specjaliści zdają sobie sprawę z różnic w selekcji tkanek i w preparatach, występujących w poszczególnych próbkach tkanek. Biblioteki sporz ądzano w następujących warunkach:

Warunki wzrostu roślin: Nasiona wysiewano na głębokość około 3 cm do gleby, do doniczek o ś rednicach 2 do 3 cali z medium wzrostowym Metro Mix 200 i po 2-3 tygodniach siewki flancowano do doniczek o średnicy 10 cali z tą samą glebą. Po flancowaniu, podawano nawóz sztuczny Peters 15-16-17 około 3 razy w tygodniu, w stężeniu 150 ppm azotu, 2 do 3 razy podczas życia rośliny od flancowania do zakwitnięcia. Do każdej doniczki dodawano łącznie około 900 mg żelaza. Sadzonki kukurydzy rosły w cieplarni przy cyklach naświetlania 15 godzin dnia/9 godzin nocy. Temperatura w dzień wynosiła 80°F a temperatura w nocy 70°F. Światło pochodziło z lamp sodowych o mocy 1000 W.

Izolowanie tkanki.

Bibliotekę cDNA z niedojrzałego kwiatostanu męskiego (SATMON021) generowano z niedojrzałego kwiatostanu męskiego kukurydzy, odmiany DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA) w stadium rozwoju roś liny V8. Kwiatostanami był y niedojrzał e kwiatostany o długoś ci 2-3 cm. Kwiatostany zbierano i zamrażano w ciekłym azocie i zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z korzeni kukurydzy (SATMON010) generowano z tkanki korzeni kukurydzy, odmiana DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA) w stadium rozwoju V8. Tkankę korzeni zebrano, kiedy rośliny były w stadium rozwoju ósmego liścia. Układ korzeniowy wycinano z rośliny, płukano wodą dla usunięcia gleby, tkankę zamrażano w ciekłym azocie i zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z liści kukurydzy (SATMON004) generowano z całkowitej tkanki liści kukurydzy, odmiana B73 x Mo17 (Illinois Foundation Seeds, Champaign, Illinois, USA), zebranej w stadium rozwoju V6. Starsze liście w pozycji podstawowej i liście młodsze w pozycjach górnych ścinano u nasady liści. Liście zbierano i natychmiast zamrażano w ciekłym azocie i kruszono. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z korzeni kukurydzy pierwszego rzędu (SATMON007) generowano z tkanki korzeni kukurydzy pierwszego rzędu, z odmiany DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA;, z sadzonek 5-dniowych. Nasiona wysiewano na zwilżoną bibułę na przykrytej tacy, utrzymywanej w ciemności do czasu kieł kowania (jeden dzień ). Po kieł kowaniu, tace zawierające wilgotną bibułę przenoszono do cieplarni utrzymywanej w cyklu naświetlania 15 godzin dnia i 9 godzin nocy i prowadzono wzrost do czasu, aż sadzonki miał y 5 dni. Temperatura w dzie ń wynosił a 80°F a temperatura w nocy 70°F. Tkankę zbierano, gdy sadzonki miały 5 dni. W tym stadium, korzenie pierwszego rzędu (zawiązki korzeni) przebiły już koleoryzę i przeszły przez pokrywę nasienną. Korzeń pierwszego rzędu o długości 2-3 cm cięto i zamrażano w ciekłym azocie. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80:C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z pierwszych pędów kukurydzy (SATMON008) generowano z tkanki pierwszych pędów (koleoptyli) o długości 2-3 cm, z odmiany DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA) z około 5-dniowych sadzonek kukurydzy (hodowlanych w tych samych warunkach jakie opisano dla biblioteki z korzeni pierwszorzędowych). Koleoptyle wycinano z reszty sadzonki, natychmiast zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z nierozwiniętych liści kukurydzy (SATMON011) generowano z odmiany kukurydzy DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Tkankę zebrano w stadium rozwoju szóstego

PL 204 789 B1 liścia. Drugi najmłodszy liść, znajdujący się u nasady liścia wierzchołkowego rośliny w stadium wzrostu V6 wycinano u nasady, natychmiast przenoszono do pojemnika z ciekłym azotem i kruszono. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z metystemy (tkanki twórczej) kukurydzy (SATMON013) generowano z odmiany DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Sadzonki znajdowały się w stadium wzrostu czwartego liścia. Liść na wierzchołku sadzonki kukurydzy w stadium wzrostu V4 jest znany jako podstawa merystemu.

Wierzchołkową podstawę merystemu wycinano, natychmiast zamrażano w ciekłym azocie i kruszono. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z pochwy kukurydzy (SATMON016) generowano z kukurydzy, odmiana DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Tkankę pochwy zebrano z sadzonek w stadium wzrostu V8. Gdy roślinki kukurydzy osiągały stadium wzrostu V8, wówczas piąty i szósty liść od nasady sadzonki miały w pełni rozwinięte blaszki. U nasady tych liści różnicuje się ligula (języczek liściowy) a blaszka liścia łączy się z pochwą. Pochwę odcięto od nasady liścia, zamrożono w ciekłym azocie i skruszono. Tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z łodyg kukurydzy (SATMON019) generowano z kukurydzy, odmiana DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Sadzonki kukurydzy znajdowały się w stadium wzrostu V8 a piąty i szósty liść od dołu miały w pełni rozwinięte blaszki. Odcinki między kolankami między piątym a szóstym liściem od dołu były regionem łodygi, który zbierano. Z łodygi odrywano liście i odrzucano pochwy. Tkanka łodygi była całkowicie wolna od liści i tkanki pochwy. Tkankę tę zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z niedojrzałego kwiatostanu męskiego (SATMON001) generowano z kukurydzy, odmiana B73 (Illinois Foundation Seeds, Champaign, Illinois, USA). Niedojrzałe kwiatostany męskie kukurydzy zbierano w stadium wzrostu V6. Kwiatostany, które miały długość 2-3 cm zbierano i zamrażano w ciekłym azocie. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze - 80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z kolby kukurydzy (SATMON023) generowano z kukurydzy, odmiana DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Tkankę zbierano, gdy sadzonki kukurydzy znajdowały się w stadium wzrostu V8. Długość zbieranych kolb wynosiła około 10-15 cm a wiechy były dopiero widoczne (miały długość około jednego cala). Kolby razem z wiechami zamrażano w ciekłym azocie i tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z blednących z braku światła sadzonek kukurydzy (SATMON023) generowano z kukurydzy, odmiana DK604 (DEKALB Genetics, Dekalb Illinois, USA). Nasiona wysiewano na mokrą bibułę na przykrytej tacy i utrzymywano w ciemności przez 4 dni. Temperatura w dzień wynosiła 80°F a temperatura w nocy 70°F. Tkankę zbierano, gdy sadzonki miały 4 dni. Wszystkie części sadzonek były cienkie i wydłużone. Korzeń pierwszego rzędu przechodził przez koleryzę i miał długość około 4-5 cm. Boczne korzenie drugiego rzędu również się pojawiły. Koleoptyl również przebił się przez pokrywę nasioną i miał długość 4-5 cm. Sadzonki zamrażano w ciekłym azocie i kruszono. Zebraną tkankę przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

Bibliotekę cDNA z bielm (endospermy) kukurydzy (22 dni po zapyleniu albo 22-DAP) (SATMON036) generowano z kukurydzy, odmiana RX601. Warunki wzrostu były następujące: Ziarna kukurydzy sterylizowano przez minutę w 10% roztworze Clorox'u, zawinięto w bibułę do kiełkowania i prowadzono kiełkowanie w 0,5 mM roztworze siarczanu wapnia przez 2 dni, w temperaturze 30°C. Sadzonki flancowano do doniczek o średnicy 3 cale z mieszanką torfową w ilości po trzy sadzonki na doniczkę. Sadzonki hodowane w cieplarni. Dwadzieścia doniczek umieszczono w środowisku o wysokim stężeniu CO2 (około 1000 ppm CO2) a 20 roślinek hodowano w środowisku o stężeniu około 450 ppm CO2. Sadzonki podlewane ręcznie i lekko nawożono nawozem Peters 20-20-20. Po 10 dniach od flancowania, pędy z obydwu atmosfer umieszczono w ciekłym azocie i lekko ręcznie pokruszono. Korzenie przemyto wodą destylowaną dla usunięcia resztek podłoża i zamrożono w ciekłym azocie. Tkanki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu preparowania RNA.

W celu przygotowania bibliotek cDNA, RNA oczyszczano z użyciem odczynnika Trizol dostępnego z firmy Life Technologies (Gaithersburg, Maryland), w zasadzie w sposób zalecany przez producenta. Poli A+RNA (mRNA) oczyszczano stosując magnetyczne perełki oligo dT, w zasadzie w sposób zalecany przez producenta (Dynabeads, Dynal Corporation, Lake Success, Nowy Jork).

Konstruowanie bibliotek cDNA jest znane, istnieje wiele strategii klonowania. Na rynku dostępnych jest wiele zestawów do konstruowania bibliotek cDNA. Użyto Superscript™ Plasmid System do

PL 204 789 B1 syntezy cDNA i Plasmid Cloning (Gibco BRL, Life Technologies, Gaitherburg, MD), utrzymując warunki zalecane przez producenta.

Biblioteki cDNA wysiewano na płytki z agarem LB zawierającym odpowiednie antybiotyki dla umożliwienia selekcji i prowadzono inkubację w temperaturze 37°C przez czas potrzebny do wzrostu poszczególnych kolonii. Pojedyncze kolonie indywidualnie umieszczano w oddzielnych studzienkach w 96-dołkowej płytce do mikromianowania zawierającej ciekły agar LB z selekcyjnymi antybiotykami. Płytki inkubowano przez dobę w temperaturze około 37CC, lekko wstrząsając dla pobudzenia wzrostu hodowli. Plazmidowy DNA izolowano z każdego klonu w zestawie Qiaprep Plasmid Isolation kit, utrzymując warunki zalecane przez producenta (Qiagen Inc., Santa Clara, CA).

Matrycowe klony plazmidowego DNA użyto do następnego sekwencjonowania. Do sekwencjonowania użyto zestaw ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit z polimerazą DNA AmpliTaq®, FS (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

P r z y k ł a d 2. Identyfikacja promotora

Bazę danych o sekwencjach EST wyprowadzonych z bibliotek cDNA sporządzonych z różnych tkanek kukurydzy użyto do identyfikacji kandydatów na promotorów do ekspresji operacyjnie związanych sekwencji DNA w wielu tkankach. Sekwencje te użyto również jako sekwencje - pytania do poszukiwań w bazie danych GenBank zawierającej sekwencje uprzednio zidentyfikowane i wprowadzone do bazy i poszukiwano regionów homologii z użyciem oprogramowania BLAST. Selekcja etykietek sekwencji kodujących tag (EST) służąca do następnej izolacji promotora odzwierciedla obecność jednej lub większej ilości sekwencji wśród reprezentatywnych EST z losowego pobierania próbek z poszczególnych bibliotek cDNA lub z kolekcji bibliotek cDNA. W celu zidentyfikowania sekwencji regulatorowych, które regulują ekspresję transkryptów w żądanych tkankach docelowych na podstawie sekwencji EST znajdujących się w bazie danych, dokonuje się określenia funkcji w podzbiorze, pytając o sekwencje EST znajdujące się w bibliotekach docelowych, a więc bibliotekach sporządzonych z liści, kolb, łodyg, kwiatostanów męskich, merystemu, korzeni i sadzonek. W przypadku promotorów do ekspresji genów tolerancji glifosatu, prowadzi się poszukiwania wybierając szczególnie te biblioteki, które zostały sporządzone z tkanek reprodukcyjnych i szybko się dzielących, ponieważ można wówczas zidentyfikować odpowiednie sekwencje regulatorowe 5' dla tolerancji wegetatywnej i reprodukcyjnej. Wybrane sekwencje docelowe poddaje się obróbce elektronicznej na funkcję Northern, gdzie dla danej sekwencji EST wyświetla się jej przypuszczalny profil ekspresji w tkance i poziomy częstości występowania w bibliotece. Identyfikuje się w ten sposób docelowe sekwencje EST z żądanym profilem ekspresji i odpowiednimi poziomami częstości występowania i w oparciu o zidentyfikowaną sekwencję EST projektuje się primery specyficzne dla genu. Procentowa częstość występowania oznacza ile razy członkowie grupy sekwencji pokrewnych pojawiają się w bibliotece, z której pochodzi dana sekwencja EST. Dla uzyskania wybranych sekwencji EST można podać wiele parametrów. Parametry te będą zależne cd bazy danych EST i programów komputerowych dostępnych do analizy sekwencji i stawiania pytań. Dla promotorów lub sekwencji regulatorowych 5' SEQ ID nr. 5375, stosuje się procentową częstość występowania w wybranych bibliotekach wynoszącą około 0,05 do 0,50.

W tabeli 1 podana jest informacja o podstawowym klonie ID (EST), o surowcach, z których otrzymano biblioteki i informacja o identyfikatorze (g) w bazie GenBank dla sekwencji EST użytych do następnego izolowania sekwencji promotorowych SEQ ID nr. 54-75. Numery sekwencji są podane dla klonów ID w oparciu o poszukiwania w bazie danych GenBank BLAST przy wartości odcięcia p równej 10-8. Informacja ta będzie podlegać zmianie wraz z dopływem nowych sekwencji do baz danych o sekwencjach. Poniżej podane są numery sekwencji EST z komentarzami w nawiasach: Klon ID 700333814 (mRNA kukurydzy dla proteinazy cysteinowej, klon CCP, całkowite cds); Klon ID 700806028 (mRNA kukurydzy dla enolazy); Klon ID 700210506 (mRNA z H. vulgare dla pirofosforylazy UPD); Klon ID 700043360 (mRNA dla pirogronianu z kukurydzy, dikinazy ortofosforanowej, całkowite cds); Klon ID 700094769 (mRNA pszenicy dla cytozolowej kinazy fosfoglicerynianowej); Klon ID 700150082 (mRNA beta-D-glukozydazy z kukurydzy, szczep B73, gen jądrowy kodujący białko chloroplastów, całkowite cds); Klon ID 700094721 (mRNA pszenicy dla cytozolowej kinazy fosfoglicerynianowej); Klon ID 700164347 (mRNA z kukurydzy, szczep W-22, dla histonu H2A, całkowite cds); dwa klony (SEQ ID nr. 53 i SEQ ID nr. 54, która zawiera około 2,0 kilozasad dodatkowej sekwencji); klon ID 700154443 (czynnik pelengacyjny 1-alfa z kukurydzy); klon ID 700017196 (gen dla cyklofiliny z kukurydzy); klon ID 700342364 (mRNA z kukurydzy do inicjacji translacji czynnika 5A); klon ID 700342580 (MNB1b mRNA z kuPL 204 789 B1 kurydzy dla białka wiążącego DNA); klon ID 700342746 (mRNA z kukurydzy dla rybosomalnego białka S8, całkowite cds); klon ID 700164205 (gen mdJ1 z kukurydzy dla białka ZMDJ1 związanego z DnaJ, całkowite cds); klon ID 700343485 (mRNA z Sorghum bicolor dla częściowo poznanego białka szoku cieplnego 70 hsc70), częściowe cds); klon ID 700345557 (mRNA z kukurydzy dla enzymu koniugującego ubikwitynę (UBC), całkowite cds); klon ID 700345819 (gen z kukurydzy dla dysmutazy supertlenkowej 4A (sod4A), całkowite cds), klon ID 700345704 (mRNA z V. Faba dla białka regulacyjnego nukleotyd guaninę, całkowite cds)

T a b e l a 1. Informacja podsumowująca o promotorach

SEQ ID Nr.	Numer klonu ID	Rodzaj biblioteki źródłowej	Identyfikator (g) w bazie GenBank
57	700046047	liście	brak
62	700333814	łodygi	g643596
58	700806028	bielmo, 22-dap	g22272
61	700210506	pochwy	g212995
59	700043360	liście	G168579
60	700094769	pierwsze pędy	g21834
63	700150082	korzenie pierwszego rzędu	G4096601
64	700094721	pierwsze pędy	g21834
53	700164347	merystem	g473602
54	700164347	merystem	g473602
55	700154443	korzenie pierwszego rzędu	g2282583
56	700017196	niedojrzałe kwiatostany męskie	g829147
65	700342364	niedojrzałe kwiatostany męskie	g1546918
72	700342580	niedojrzałe kwiatostany męskie	g397395
73	700342976	niedojrzałe kwiatostany męskie	brak
66	700342746	niedojrzałe kwiatostany męskie	g1498052
75	700350638	kolby z wiechą	brak
67	700342649	niedojrzałe kwiatostany męskie	brak
68	700164205	merystem	g2984708
69	700343485	niedojrzałe kwiatostany męskie	g1181672
70	700345557	niedojrzałe kwiatostany męskie	g2668743
71	700345819	niedojrzałe kwiatostany męskie	g1899026
74	700345704	niedojrzałe kwiatostany męskie	g395071

P r z y k ł a d 3. Konstruowanie biblioteki genomowej, amplifikacja PCR i izolacja promotora W celu założenia bibliotek genomowych, izolowano DNA kukurydzy (z hybrydowej odmiany kukurydzy, Fr27xFrMo17) według procedury oczyszczania z użyciem CsCl opisanej przez Ausubel'a i wsp. (1992), metodą oczyszczania CTAB (Rogers i Bendich, Plant Mol. Biel., 5: 69, 1988) bądź podobną metodą izolowania DNA odpowiednią do izolowania roślinnego DNA. Odczynniki są dostępne na rynku (patrz np. katalog Sigma Co., St. Louis, MO). Biblioteki sporządzano postępując według instrukcji producenta (GENOME WALKER, nazwa handlowa CLONTECH laboratories, Inc, Palo Alto, CA). W oddzielnych reakcjach poddawano genomowy DNA trawieniu enzymem restrykcyjnym przez dobę w temperaturze 37°C, stosując następujące endonukleazy dające tępe końce: EcoRV, Scal, Dral, PvuII albo Stul (CLONTECH Laboratories, Inc. Palo Alto, CA). Mieszaniny reakcyjne ekstrahowano mieszaniną fenolu i chloroformu, strącano etanolem i po26

PL 204 789 B1 wtórnie zawieszano w buforze Tris-EDTA. Oczyszczone fragmenty DNA z tępymi końcami poddawano ligacćji z adaptorami GenomeWalker™, prowadząc ligację uzyskanych fragmentów DNA z adartorami według instrukcji producenta. Pobrano odliczone ilości materiału jako pod-biblioteki GenomeWalker™ i przechowywano je w temperaturze -20°C.

Genomowy DNA przyłączony do adaptera GenomeWalker™ (powyżej) poddawano pierwszemu cyklowi amplifikacji PCR ze swoistym dla genu primerem 1 (GSP1) i primerem, który przyłącza się do sekwencji adaptorowej, adaptorowym primerem 1 (AP1) SEQ ID Nr. 1. Rozcieńczoną w proporcji 1:50 próbkę mieszaniny reakcyjnej z pierwszego cyklu reakcji PCR użyto jako DNA wsadowy do gniazdowego cyklu amplifikacji PCR z użyciem swoistego dla genu primera 2 (GSP2) i primera adaptorowego 2 (AP2), SEQ ID Nr. 2 albo primera adaptorowego 3 (AP3), SEQ ID Nr. 3. Temperatury reakcji z użyciem pierwszego primera GenomeWalker™ (AP1) i primera gniazdowego (AP2) wynosiły odpowiednio 59°C i 71 °C. Generalnie, specyficzne dla genu primery tak zaprojektowano aby posiadały one następujące właściwości: długość 26-30 nukleotydów, zawartość GC w zakresie 40-60% i reaktywność w temperaturach odpowiednich dla większości specyficznych dla genu primerów w zakresie od 60°C do około 70°C. Jako Taq polimerazę użyto produkt Amplitaq Gold™ dostępny w firmie Perkin-Elmer Biosystems (Branchbury, New Jersey). Wiele termocyklerów i zestawów odczynników do prowadzenia reakcji PCR jest dostępnych na rynku, między innymi dostarczają je firmy PE Biosystems (Foster City, CA), Strategene (La Jolla, CA) i MJ Research Inc. (Watertown, MA). Po pierwszorzędowej reakcji PCR pobierano próbki (po 10-15 μθ do analizy w żelu agarozowym. Izolacja każdej nieznanej sekwencji wymagała amplifikacji z pięciu pod-bibliotek genomowych i kontroli negatywnej (bez DNA).

Poniżej podane są składniki użyte w PCR i generalnie stosowane warunki reakcji.

Pierwszorzędowa PCR (metoda 1)

Składnik Ilość w wymaganej objętości

Próbka z pod-biblioteki 1 μl

Specyficzny dla genu 1 μl (100 pmoli) primer 1

Primer adaptorowy 1 1 μl (AP1) GenomeWalker™

Mieszanina dNTP 1 μl (po 10 mM każdej dNTP)

DMSO

Bufor 10 x PCR (zawierający MgCl2)

Amplitaq Gold™

Woda destylowana

Warunki reakcji dla pierwszorzędowej PCR:

A. 9 minut w temperaturze 95°C

B. 94°C przez 2 sekundy, 70°C przez 3 minuty, powtórzenie cyklu 94°C/70°C ogółem 7 razy,

C. 94°C przez 2 sekundy, 65°C przez 3 minuty, powtórzenie cyklu 94°C/65°C ogółem 36 razy,

D. 65°C przez 4 minuty jako końcowe wydłużenie,

E. 10°C dla przedłużonej inkubacji.

Gniazdowa PCR (drugorzędowa reakcja PCR)

2,5 μl (albo 2-5% stężenia końcowego) μl (końcowe stężenie 1 X)

0,5 μί

Do końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50 μl

Ilość w wymaganej objętości 1 μl μl (100 pmoli) μ

Składnik

Rozcieńczenie 1:50 produktu z pierwszorzędowej reakcji PCR Specyficzny dla genu primer 2 Primer adaptorowy GenomeWalker 2 albo 3 (AP2 albo AP3)

Mieszanina DTP (po 10 mM każdej DTP) 1 μl

TM

DMSO

Bufor 10 x PCR (zawierający MgCl2)

Amplitaq Gold^TM

Woda destylowana

Warunki reakcji dla gniazdowej PCR:

A. 9 minut w temperaturze 95°C

2,5 μl μl (końcowe stężenie 1 X)

0,5 μl

Do końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50 μl

PL 204 789 B1

B. 94°C przez 2 sekundy, 70°C przez 3 minuty, potówrzenie cyklu 94°C/70°C ogółem 5 razy,

C. 94°C przez 2 sekundy, 65°C przez 3 minuty, potówrzenie cyklu 94°C/65°C ogółem 24 razy,

D. 65°C przez 4 minuty jako końcowe wydłużenie,

E. 10°C dla przedłużonej inkubacji.

Specjaliści zdają sobie sprawę możliwości różnicowania parametrów reakcji PCR, w tym wyboru polimerazy, warunków prowadzenia poszczególnych cykli i doboru stężeń komponentów reakcji. Inne modyfikacje powyższej procedury obejmują użycie polimerazy Expand High Fidelity polymerase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), Taq polimerazy (Promesa Corp., Madison, WI) i niewielkich odchyleń w temperaturach. Modyfikacje te są podane poniżej.

Modyfikacja 1: Polieraza (Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)

Pierwszorzędowa reakcja PCR:

Etap 1: 95°C, 2 minuty,

Etap 2: 94°C, 2 sekundy,

Etap 3: 72°C, 3 minuty,

Etap 4: powtórzenie 7 razy etapów 2 i 3,

Etap 5: 94°C, 2 sekundy,

Etap 6: 68°C, 3 minuty,

Etap 7: powtórzenie 36 razy etapów 5 i 6.

Drugorzędowa reakcja PCR:

Etap 1, etap 2 i etap 3 - tak samo jak w reakcji pierwszorzędowej,

Etap 4: powtórzenie 5 razy etapów 2 i 3,

Etap 5 i etap 6: tak samo jak w reakcji pierwszorzędowej,

Etap 7: powtórzenie 24 razy etapów 5 i 6.

Modyfikacja 2: Polimeraza (Amplitaq Gold™, Perkin Elmer, Foster City, CA)

Pierwszorzędowa reakcja PCR:

Etap 1: 95°C, 10 minut,

Etap 2: 94°C, 2 sekundy,

Etap 3: 70°C, 3 minuty,

Etap 4: powtórzenie 7 razy etapów 2 i 3,

Etap 5: 94°C, 2 sekundy,

Etap 6: 68°C, 3 minuty,

Etap 7: powtórzenie 24 razy etapów 5 i 6.

Modyfikacja 3: Polimerazą była Taq polimeraza (Promega Corp., Madison, WI), warunki cykli takie same jak w Modyfikacji 2, z tym, że etap 1 prowadzono przez 2 minuty.

Modyfikacja 4: Polimerazą była AccuTaq (Sigma, St. Louis, MO), warunki cykli takie same jak w Modyfikacji 3.

Modyfikacja 5: Polimerazą był produkt o nazwie Expand High Fidelity (BM): Mieszanina Pierwszorzędowa PCR Drugorzędowa PCR

Bufor 10 x PCR 2 DNTP

Primer adaptorowy (10 mM)

Primer specyficzny dla genu (10 mM)

Polimeraza

Matrycowy DNA

Woda μ l μ l μ l AP1 μί GSP1

2,5 jednostki Biblioteka

GenomeWalker™, 1 μl Do 20 μl

Modyfikacja 5: parametry cykli reakcji PCR Etap 1: 94°C, 1 minuta,

Etap 2: 94°C, 2 sekundy,

Etap 3: 70°C, 3 minuty,

Etap 4: powtórzenie etapu 2 w następnych 5 cyklach, Etap 5: 94°C, 2 sekundy,

Etap 6: 68°C, 3 minuty,

Etap 7: powtórzenie etapu 5 w następnych 34 cyklach, μl μl μl AP2 μl GSP2

3,5 jednostki

Produkt rekaji

PCR w rozcieńczeniu 1:50

Do 50 μl

PL 204 789 B1

Etap 8: 68°C, 10 minut,

Etap 9: 10°C, utrzymywać.

Modyfikacja 6: Parametry reakcji PCR

Etap 1: 95°C, 2 minuty,

Etap 2: 94°C, 30 sekund,

Etap 3: 65°C, 30 sekund, obniżanie temperatury o 1°C w każdym następnym cyklu w 14 cyklach,

Etap 4: 72°C, 3 minuty,

Etap 5: powtórzenie 14 razy cykli 2-4,

Etap 6: 50°C,

Etap 7: 72°C,

Etap 8: powtórzenie 15 razy cykli 6-7.

Modyfikację 5 stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 53 (klon ID#700164347). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 6, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 7, w drugorz ę dowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Modyfikację 5 stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 54 (klon ID#700164347 zawierający dodatkową sekwencję 5' o długości 2 kilozasad). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 6, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 7, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Modyfikację 5 stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 55 (klon ID#700154443). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 8, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 9, w drugorz ę dowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Modyfikację 5 stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 56 (klon ID#700017196). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 10, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 11, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 62 (klon ID#700333814). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 22, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 23, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 59 (klon ID#7 00043360). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 16, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 17, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 60 (klon ID#700094769). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 18, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 19, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 61 (klon ID#700210506). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 20, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 21, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 57 (klon ID#700046047). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 12, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 13, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 58 (klon ID#700806028). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 14, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 15, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotoroej SEQ ID Nr. 63 (klon ID#700150082). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 24, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 25, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

PL 204 789 B1

Metodę 1 PCR stosowano do wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID Nr. 64 (klon ID#70094721). SEQ ID nr. 1 łączono z GSP1, SEQ ID nr. 26, w pierwszorzędowej reakcji PCR. W gniazdowej reakcji PCR, SEQ ID nr. 2 łączono z GSP2, SEQ ID nr. 27, w drugorzędowej reakcji PCR i izolowano produkt tej reakcji.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 65 (klon ID #700342364), primer GSP1, SEQ ID nr. 28, łączono z SEC ID nr 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 1. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 2, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 29 i izolowano produkt PCR, klonowano go do wektora pGEM-T easy (Promego, Madison, WI) i wektorem tym transformowano E. coli HB101. Miejsce restrykcyjne Stul na końcu 3' i miejsce Hindlll na końcu 5' tego promotora wprowadzano w ten sposób, że klon promotora pGEM-T użyto jako matrycę w reakcji PCR prowadzonej metodą 6, z użyciem SEQ ID nr. 3 i primera GSP, SEQ ID nr. 30.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 66 (klon ID #700342746), primer GSP1, SEQ ID nr. 31, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 1. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 2, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 32 i izolowano produkt PCR (produkt PCR o długości około 1,2 kilozasady, wykorzystując trawioną Dral bibliotekę genomową). Miejsce restrykcyjne Stul na końcu 3' i miejsce Hindlll na końcu 5' tego promotora wprowadzano w ten sposób, że klon tego promotora użyto jako matrycę w reakcji PCR prowadzonej metodą 6, z użyciem primera adaptorowego, SEQ ID nr. 3 i primera GSP, SEQ ID nr. 33. Izolowano produkt PCR i klonowano go do wektora pGEM-T easy (Promega Corp., Madison, WI).

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 67 (klon ID #700342649), primer GSP1, SEQ ID nr. 34, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 2. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 2, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 35 i izolowano produkt PCR. Miejsce restrykcyjne Stul na końcu 3' i miejsce Hindlll na końcu 5' tego promotora wprowadzano w ten sposób, że klon tego promotora użyto jako matrycę w reakcji PCR prowadzonej metodą 6, z użyciem primera adaptorowego, SEQ ID nr. 3 i primera GSP, SEQ ID nr. 33.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 68 (klon ID #700164205), primer GSP1, SEQ ID nr. 37, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 3. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 38 i izolowano produkt PCR (produkt PCR o długości około 0,5 kilozasady, wykorzystując trawioną Stul bibliotekę genomową) i klonowano go do wektora pGEM-T easy (Promega Corp., Madison, WI).

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 69 (klon ID #700343485), primer GSP1, SEQ ID nr. 39, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 3. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 40. Produkt PCR izolowano i klonowano go do wektora pGEM-T easy (Promega Corp., Madison, WI).

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 70 (klon ID #700345557), primer GSP1, SEQ ID nr. 41, łączono z SEC ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 3. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 42 i izolowano produkt PCR.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 71 (klon ID #700345819), primer GSP1, SEQ ID nr. 43, łączono z SEC ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 3. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 44 i izolowano produkt PCR z użyciem biblioteki trawionej EcoRV.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 71 (klon ID #700342580), primer GSP1, SEQ ID nr. 45, łączono z SEC ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 4. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 46. Izolowano produkt PCR o długości około 2,2 kilozasad z użyciem biblioteki trawionej Scal.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 73 (klon ID #700342976), primer GSP1, SEQ ID nr. 47, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 4. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem

PL 204 789 B1

GSP2, SEC ID nr. 43. Izolowano produkt PCR o długości około 4,0 kilozasad z użyciem biblioteki trawionej Scal.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEQ ID nr. 74 (klon ID #700345704), primer GSP1, SEQ ID nr. 49, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędowej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 4. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 50. Izolowano produkt PCR c długości około 1,3 kilozasad z użyciem biblioteki trawionej EcoRV.

W celu wyizolowania sekwencji promotorowej SEC ID nr. 75 (klon ID #700350638), primer GSP1, SEQ ID nr. 51, łączono z SEQ ID nr. 1 w pierwszorzędcwej reakcji PCR, postępując według modyfikacji 4. W drugorzędowej reakcji PCR, primer gniazdowy, SEQ ID nr. 3, łączono z primerem GSP2, SEQ ID nr. 52. Izolowano produkt PCR o długości około 1,0 kilozasad z użyciem biblioteki trawionej Stul (metoda 4).

P r z y k ł a d 4. Izolowanie i klonowanie promotora

Fragmenty DNA otrzymane z amplifikacji metodą gniazdowej PCR opisanej powyżej izolowano i oczyszczano w żelu. Ilości po 40 μl produktów drugorzędowej PCR rozdzielano w żelu agarozowym. Fragment DNA produktu drugorzędowej PCR oczyszczano z żelu agarozowego w zestawie BI01C1 Geneclean II Kit (Midwest Scientific, Valley Park, MO), utrzymując warunki zalecane przez producenta. Oczyszczony DNA wprowadzano przez ligację do wektora pGEM-T Easy (pGEM-T Easy Vector System I, Promega Corp., Madison, WI), utrzymując warunki zalecane przez producenta. Określoną ilością mieszaniny ligacyjnej transformowano odpowiedniego gospodarza E. coli, takiego jak szczep DH10B i komórki posiewano na podłożu selekcyjnym (dla DH10B - karbenicylina w stężeniu 100 μg/ml). Transformanty bakteryjne selekcjonowano, prowadzono ich wzrost w pożywce ciekłej i izolowano plazmidowy DNA stosując dostępny na rynku zestaw, taki jak Qiaprep Spin Microprep Kit (Qiagen Corp., Valencia, CA). Oczyszczony plazmid zawierający zakładany insert o wielkości oznaczonej przez analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych sekwencjonowano metodą terminacji łańcucha z użyciem barwnika, w obydwu kierunkach, stosując primery M13 dla kierunku 5' a dla kierunku odwrotnego, primery rewersyjne przedstawione na SEQ ID nr. 4 (primer M13 dla kierunku 5') i SEC ID nr 5 (primer M13 rewersyjny). Enzymy restrykcyjne można nabyć u wielu wytwórców (np. Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Oznaczono region 5' flankujący, zawierający sekwencję promotorową, przedstawioną na SEQ ID nr. 53-75. Do wprowadzania miejsc restrykcyjnych potrzebnych do klonowania do odpowiednich wektorów na ogół stosowano reakcję PCR opisaną w metodzie 6, wykorzystując standardowe techniki biologii molekularnej znane specjalistom.

P r z y k ł a d 5. Analiza komórek roślinnych na aktywność promotora

Do celów ekspresji w komórce roślinnej, fragmenty promotora klonowano do wektorów ekspresyjnych, takich jak pMCN19469, przedstawiony na fig. 1. Plazmid pMON19469 jest wektorem ekspresyjnym, w skład którego wchodzą następujące komponenty genetyczne: P-CaMV.35S:en będący promotorem dla 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiorowej, zawierający powtórzenie regionu -90 do -300; I-Zm.Hsp70 będący intronem z genu białka szoku cieplnego kukurydzy opisany w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.593.874 i US 5.859.347, włączonych w całości do niniejszego opisu jako odnośniki; Ec.GUS:1 (GUS:1), będący regionem kodującym glukuronidazę; T-AGRTU.nos, będący sygnałem terminacji z genu syntazy nopalinowej, wyizolowany z Agrobacterium tumefaciens; ori-M13 i ori-pUC będące źródłami replikacji, AMP będący regionem regulatorowym do selekcji z użyciem ampicyliny. Po zidentyfikowaniu AUG docelowego promotora, fragment klonowano do pMON19469 w miejsce elementu genetycznego P-CaMV.35S:en. W przypadku, gdy AUG nie został zidentyfikowany, fragment promotora klonowano do wektora ekspresyjnego zmodyfikowanego tak, aby umożliwić fuzje translacyjne z genem reporterowym, takim jak gen β-glukuronidazy (GUS) (Jefferson i wsp., EMBO J. 6: 3901, 1987) albo gen białka zielonej fluorescencji (GFP) opisany przez Pang'a i wsp. (Plant Physiol. 112: 893, 1996). Plazmid pMON25455 (fig. 5) jest podstawowym wektorem ekspresyjnym składającym się z promotora aktyny ryżu z genu Act1, sekwencji kodującej GUS:1 i terminatora T-AGRTU.nos. Do dodatkowych podstawowych wektorów ekspresyjnych zawierających różne elementy ekspresyjne należą między innymi pMON42410 (fig. 3), pMON42411 (fig. 4) i pMON46124 (fig. 6). Promotorowe fragmenty DNA według wynalazku mogą zastąpić elementy promotorowe podstawowego wektora ekspresyjnego w celu oznaczenia aktywności promotorowej tych fragmentów DNA.

PL 204 789 B1

Promotorowe fragmenty DNA będące klonami ID #: 700342746 (SEQ ID nr. 66), 700342364 (SEQ ID nr. 65), 700350638 (SEQ ID nr. 75), 700164205 (SEQ ID nr. 68), 700343485 (SEQ ID nr. 69), 700345557 (SEQ ID nr. 70), 700345819 (SEQ ID nr. 71), 7003442580 (SEQ ID nr. 72),

700342976 (SEQ ID nr. 73), 700345704 (SEQ ID nr. 74) klonowano do podstawowych konstrukcji ekspresyjnych zawierających GUS przez trawienie enzymem restrykcyjnym i traktowanie ligazą DNA tych fragmentów w odpowiednich warunkach znanym specjalistom z dziedziny biologii molekularnej. Oczyszczony plazmidowy DNA z otrzymanych kaset ekspresyjnych testowano na aktywność GUS w próbie elektroporacji protoplastów kukurydzy. Specjalistom znanych jest wiele takich prób. Analiza genów reporterowych w układzie protoplastów może być użyta do oceny aktywności elementu regulatorowego, takiego jak promotor związany operacyjnie z genem reporterowym. Zastosowano zasadniczo protokół izolacji protoplastów liści i elektroporacji opisany przez Sheen'a (Plant Cell 3: 225-245, 1991) z następującymi modyfikacjami: użyto nasiona FR27RHM X FRMol7RHM z Illinois Foundation Seeds. Nasiona sterylizowano powierzchniowo przez 2 minuty w 95% etanolu, przemywano dwa razy wodą destylowaną, utrzymywano przez 30 minut w 50% wybielaczu (Clorox) z dodatkiem 2 kropel Tween'u 20, trzy razy płukano w wodzie sterylnej, nastźpnie moczono przez 5 minut w roztworze Benlat/Kaptan dla zapobieżenia wzrostowi grzybów. Nasiona poddano kiełkowaniu na fitotacach zawierających po 100 ml podłoża ½ MS (2,2 g/litr soli MS, 0,25% gelritu), podając 7 nasion na tacę. Nasiona rosły przez 5 dni w temperaturze 26°C w cyklu naświetlania 16 godzin dnia/8 godzin nocy i 7 dni w ciemności w temperaturze 28°C. Z każdej rośliny wycinano wzdłużnie skrawki drugiego liścia, stosując ostrza chirurgiczne Feather nr. 11. Trawienie prowadzono w czasie 2 godzin i 10 minut, na świetle, w temperaturze 26°C. Po trawieniu, płytki wirowano dwa razy z szybkością 80-100 obrotów/min., po 20 sekund każdą i roztwór protoplasty/enzym pipetowano przez kolektor tkanek o średnicy 190 μm. Protoplasty zliczano w hemacytometrze zliczającym tylko protoplasty całe i okrągłe. Do każdej kuwety dodawano od 10 do 50 μg DNA zawierającego żądany wektor. Końcowe gęstości protoplastów podczas elektroporacji wynosiły od 3 x 106/ml do 4,5 x 106/ml. Elektroporacje prowadzono na świetle, stosując impulsowe kuwety Bio-rad Gene (Bio/Rad Hercules, CA) ze szczeliną 0,4 cm, o maksymalnej objętości 0,8 ml, przy kapacytancji 125 mikrofaradów i przy 250 woltach. Po zawieszeniu w buforze do elektroporacji protoplasty inkubowano na lodzie i utrzymywano na lodzie w kuwetach przez 10 minut po elektroporacji. Protoplasty utrzymywano w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym dodano 7 ml pożywki wzrostowej do protoplastów. Pożywki do hodowli protoplastów są opisane w literaturze (Fromm i wsp., Methods in Enzymology 153, 351-366, 1987). Płytki hodowlane pokrywano warstwą pożywki wzrostowej i 1,5% agarozy SeaPlaque (FMC BioProducts, Rockland, ME) w celu zapobieżenia utracie protoplastów. Hodowlę próbek prowadzono na świetle, w temperaturze 26°C, w cyklu 16 godzin dnia i 8 godzin nocy do czasu pobrania do analizy (na ogół 18-22 godzin od elektroporacji). Próbki pobierano pipetą z płytek petriego do 15 ml probówek do wirowania i wirowano z szybkością 800-1000 obrotów/minutę. Supernatant usuwano i próbki natychmiast analizowano na obecność żądanego genu. Próbki te można również zamrażać do późniejszych analiz.

Ekspresję GUS inicjowaną promotorami DNA według wynalazku oznaczano jako procent aktywności obserwowanej wówczas, gdy do protoplastów kukurydzy wprowadzono przez elektroporację podstawowy wektor ekspresyjny, pMON25455 (P-Os.Act1/GUS/AGRTU.nos) (tabela 2). Próby MUG umożliwiają analizę ilościową ekspresji GUS w transgenicznych komórkach roślinnych. Z każdej próbki ekstrahowano całkowite białko. W próbach MUG, do tkanek dodawano 500 μl buforu do ekstrakcji GUS, tkanki rozdrabniano teflonowym tłuczkiem w 1,5 ml probówce eppendorfa i wirowano z szybkością 10K obrotów/minutę przez 5 minut w temperaturze 4°C (Beckman GS-15R). Próbki po 400 μl supernatantu przenoszono na świeżą płytkę 96-dołkową. Ekstrakty zamrażano na suchym lodzie i utrzymywano w temperaturze -80°C do czasu użycia. W skład próby MUG wchodziło generowanie standardowej krzywej aktywności przy seryjnych rozcieńczeniach 4-metylo-umbelliferonu (Sigma Chemical Co. M1381), od 31,2 pikomoli do 2000 pikomoli. Po dokonaniu wstępnego odczytu płytek w celu ustalenia poziomu tła w ślepej próbie, do studzienek w 96-dołkowej płytce płaskodennej (Falcon 3872) dodawano po 5 μl każdego ekstraktu, wykonując jednocześnie duplikaty. Do każdej studzienki dodawano po 200 μl roztworu do próby GUS o składzie: 0,1 M KPO4 (pH 7,8), 1,0 mM EDTA, 5% glicerolu, 10,0 mM DTT, 2 mM glukuronidu 4-metyloumbelliferylu (Fluka 69602) i zmieszano z próbkami przez pipetowanie. Odczyt płytki prowadzono metodą kinetyczną, w temperaturze 37°C, w urządzeniu F-max (Molecular Devices),

PL 204 789 B1 wyposażonym w parę filtrów: pobudzenie przy 355 nm /emisja przy 460 nm. Typowy odczyt składał się z 21 zapisów dokonywanych w odstępach czasu co 3 minuty i ostatniego zapisu po godzinie. Aktywność GUS (pmoli/minutęAg białka) wyliczano na podstawie wyników próby MUG i zawartości białka w każdej próbce. Całkowite białko oznaczano w zestawie Bio-Rad Protein Assay kit. Do wykreślenia krzywej standardowej użyto seryjne rozcieńczenia białka BSA, od 0,05 mg/ml do 0,5 mg/ml. Próbki po 1,5 μl ekstraktów dodano do studzienek w 96-dołkowej płytce z płaskimi dnami (Falcon). Próbę prowadzono z duplikatem. Dodano po 200 μl rozcieńczonego barwnego odczynnika i zmieszano z próbkami. Po 5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dokonywano pomiarów absorbancji przy 595 nm w spektrometrze Spectromax 250 (Molcecular Devices).

Dla oznaczenia ekspresji 10 sekwencji promotorowych, przeprowadzono trzy doświadczenia (1, 2 i 3), każde z dwoma powtórzeniami, jak to jest przedstawione w tabeli 2. W tej analizie zidentyfikowano 4 sekwencje promotorowe o aktywności równej lub wyższej od tej jaką obserwowano dla sekwencji promotorowej aktyny 1 z ryżu. Te kasety ekspresyjne są zawarte w pMON43716 (fig. 9), pMON43722 (fig. 12), pMON43734 (P-Zm. 700342976/I-Os.Act1/GUS/T-Ta.Hsp17) i pMON43736 (P-Zm. 70034504/I-Os.Act1/GUS/T-Ta.Hps17).

T a b e l a 2. Analiza protoplastów kukurydzy na obecność promotorowych sekwencji DNA pobudzających ekspresję GUS:1

		pMON	Fragment promotora ~Kb	GUS (%Os.Act1/GUS)
1	2	3
1	700342746 SEQ ID Nr.66	43710	1,2	1,4; 2,4
2	700342364 SEQ ID Nr.65	43716	2,0	66, 145	126, 111
3	700350638 SEQ ID Nr.75	43730	1,0		24, 32
4	700164205 SEQ ID Nr.68	43720	0,5		16, 17
5	700343485 SEQ ID Nr.69	43722	1,3		232, 275
6	700345557 SEQ ID Nr.70	43726	1,5		26, 29
7	700345819 SEQ ID Nr.71	43728	0,6		47, 54
8	700342580 SEQ ID Nr.72	43732	2,2		7, nie ozn.
9	700342976 SEQ ID Nr.73	43734	1,2			118,2 100
10	700345704 SEQ ID Nr.74	43736	4,0			300, 409
	CaMV.35S	46124		484, 573	831, 682	1445,5 1081,8
	Os.Act1	25455		100	100	100

P r z y k ł a d 6. Transformowanie pszenicy roślinnymi wektorami ekspresyjnymi zawierającymi promotorowe sekwencje DNA według wynalazku

Komórki pszenicy transformowano wektorami DNA zawierającym i promotorowe sekwencje DNA według wynalazku inicjującymi ekspresję reporterowej sekwencji kodującej GUS:1. pMON43644 (klon ID #700154443), fig. 7, pMON43738 (klon ID #700342364), fig. 10 i pMON43739 (klon ID #700343485), fig. 13, inicjują ekspresję genu GUS w liściach, zalążniach i pylnikach transgenicznych roślin pszenicy. Roślinki pszenicy transformowano promotorowymi sekwencjami DNA według wynalazku, wywołującymi ekspresję sekwencji kodującej AGRTU.aroA:CP4 (CP4) dla enzymu EPSPS glifozatu, nadającej tolerancję na glifozat tym transgenicznym roślinom pszenicy. Rośliny pszenicy zawierały pMON45360 (P-Zm. 700343485/I-Os.Act/CP4/Ta.hsp17::P-CaMV.35S/Zm.Hsp70/CP4/T-AGRTU.nos), fig. 14, podwójny kasetowy wektor ekspresyjny z promotorem P-Zm.700343485 pobudzającym ekspresję sekwencji kodującej CP4 EPSPS i promotorem P-CaMV.35S pobudzającym ekspresję dodatkowej kopii sekwencji kodującej CP4 EPSPS; pMON45361 (P-Zm.700154443/Ta.CAB/I-Os.Act/CP4/Ta.Hsp17::PCaMV.35S/Zm.Hsp70/CP4/T-AGRTU.nos), fig. 8, podwójny kasetowy wektor ekspresyjny z promotorem P-Zm.70015443 pobudzającym ekspresję sekwencji kodującej CP4 EPSPS i promotoPL 204 789 B1 rem P-CaMV.35S pobudzającym ekspresję dodatkowej kopii sekwencji kodującej CP4 EPSPS; pMON 45362 (P-Zm.7 00342 364/I-Os.Act/CP4/Ta.Hsp17::P-CaMV.35S/Zm.Hsp70/CP4/T-AGRTU.nos), fig. 11, podwójny kasetowy wektor ekspresyjny z promotorem P-Zm.700342364 pobudzającym ekspresję sekwencji kodującej CP4 EPSPS i promotorem P-CaMV.35S pobudzającym ekspresję dodatkowej kopii sekwencji kodującej CP4 EPSPS; pMON43623 (P-700164347/Ta.CAB/IOs.Act/CP4/Ta.Hsp17), fig. 2, pojedynczy kasetowy wektor ekspresyjny z promotorem P-Zm.700164347 pobudzającym ekspresję sekwencji kodującej CP4 EPSPS. Tymi wektorami i wektorami kontrolnymi, pMON42411 (fig. 4), pMON42410 (fig. 3) i pMON30167 (P-Os.Act/I-Os.Act/CP4/T-AGRTU.nos) transformowano komórki pszenicy w niżej podany sposób.

Niedojrzałe zarodki pszenicy (Triticum aestivum L.) odmiana Bobwhite, izolowano z niedojrzałych ziarniaków po 13-15 dniach od zapylenia i prowadzono hodowlę na pożywce CM4C (tabela 3) przez 3-4 dni. Zarodki, w których odbywał się aktywny podział komórek ale nie powstawała tkanka kalusowa wybrano do zakażenia przez Agrobacterium.

T a b e l a 3. Składniki uzupełniające w pożywkach podstawowych¹

Składniki	CM4	CM4C	MMS.2C	MMS0
2,4-D (mg/litr)	0,5	0,5	0,2	- -
Pichloram (mg/litr)2		2,2	2,2
Maltoza (g/litr)	40,0	40,0	40,0	40,0
Glutamina (g/litr)		0,5	0,5
Chlorek magnezu (g/litr)		0,75	0,7
Hydrolizat kazeiny (g/litr)		0,1	0,1
MES (g/litr)		1,95	1,95	1,95
Kwas askorbinowy (mg/litr)2		100,0	100,0	100,0
Środek żelujący (g/litr)3	2 (P)	2 (P)	2 (G)	2 (G)

¹ Wszystkie pożywki zawierał y sole podstawowe (sole podstawowe MS) i witaminy (witaminy MS) z firmy Murashige and Skoog (1962). Wartość pH każdej pożywki ustawiano na 5,8.

² Sterylizowany przez filtrację i dodawany do poż ywki po autoklawowaniu.

³ Phytagel™ (P) albo Gelrite® (G).

We wszystkich doświadczeniach stosowano pozbawiony zjadliwości Agrobacterium, szczep

C58 (ABI) niosący binarny, żądany wektor (pMON45367, fig. 5). Wektory pMON wprowadzano do Agrobacterium metodą kojarzenia trójrodzicielskiego (Ditta i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7347-7351). Płynne hodowle Agrobacterium nastawiano z zapasów podstawowych w glicerolu albo ze świeżo zdrapanych hodowli na płytkach i prowadzono wzrost przez dobę w temperaturze 2628°C, wstrząsając (z prędkością około 150 obrotów/minutę) do czasu uzyskania średniej logarytmicznej fazy wzrostu (OD660 = 1 - 1,5), w ciekłej pożywce LB o wartości pH 7,0, z dodatkiem kanamycyny (50 mg/litr), streptomycyny i spektynomycyny (50 mg/litr) oraz chloramfenikolu (25 mg/litr) z acetosyringonem (200 μΜ, AS). Komórki Agrobacterium zawieszano w pożywce do inokulacji (ciekła CM4C) i doprowadzano gęstość optyczną do wartości OD660 równej 1. Niedojrzałe zarodki hodowane w pożywce CM4C przenoszono do sterylnych płytek petriego (16 x 20 mm) albo do studzienek w płytkach 6-dołkowych do hodowli komórkowych (Costar Corporation, Cambridge, MA) zawierających po 10 ml pożywki do inokulacji na jedną płytkę petriego albo 5 ml na całą płytkę wielodołkową do hodowli komórek. Następnie dodawano jednakowe ilości zawiesiny komórek Agrobacterium, takie, aby końcowe stężenie komórek Agrobacterium wynosiło OD660 = 0,5. W większości eksperymentów, do mieszaniny inokulacyjnej dodawano Pluronic F68 w ilości odpowiadającej końcowemu stężeniu 0,01%. Stosunek ilości Agrobacterium do niedojrzałych zarodków (IE) wynosił około 10 ml : 20-200 IE. Inokulację prowadzono w temperaturze 23-26°C w czasie od 5 do 60 minut. Po okresie inkubacji usuwano pozostające komórki Agrobacterium z eksplantów za pomocą ręcznego wyposażenia próżniowego. Do każdej płytki petriego (60 x 15 mm albo 60 x 20 mm) wkładano kawałek sterylnej bibuły filtracyjnej Whatman nr. 1 (pasujący rozmiarem do płytki petriego). Na środku bibuły umieszczano 200 μl sterylnej wody i po 2-3 minutach, na płytkach umieszczano inokulowane niedojrzałe zarodki. Na ogół, w jednej stercie grupo34

PL 204 789 B1 wano 20-50 eksplantów (o wielkości około 1 cm i 60-80 mg/stertę), po 4-5 stert na jednej płytce. Płytki natychmiast pokrywano parafilmem (Parafilm®) i prowadzono ko-hodowle w ciemności, w temperaturze 24-26°C przez 2-3 dni.

Ko-hodowane PCIE przenoszono w ciemności do pożywki CM4C z dodatkiem 500 mg/litr karbenicyliny (pożywka spowalniająca). Po 7 dniach hodowli na pożywce spowalniającej, niedojrzałe zarodki przenoszono do pożywki CM4C z dodatkiem 2 mM glifozatu (nie o składzie Roundup®) i 500 mg/litr karbenicyliny do selekcji i utrzymywano w tej pożywce przez tydzień. Kalusy przenoszono do pożywki MMS0.2C z dodatkiem 0,1 mM glifozatu (nie o składzie Roundup©) i 250 mg/litr karbenicyliny i prowadzono hodowlę przez 2 tygodnie na świetle do dalszej selekcji. Embriogeniczne kalusy przenoszono do drugiej pożywki regeneracyjnej MMS0C z niższym stężeniem glifozatu (nie o składzie Roundup®) (0,02 mM) i z dodatkiem 500 mg/litr karbenicyliny i prowadzono regenerację roślin. Embriogeniczne kalusy przenoszono do świeżej pożywki co dwa tygodnie. Regenerowane roślinki przenoszono do doniczek Sundae (Sweetheart Cup Company, Chicago, IL) zawierających drugie podłoże regeneracyjne do dalszego wzrostu i selekcji. Po trwałym wyrośnięciu korzeni z transgenicznych roślinek, roślinki te przenoszono do gleby w celu dalszej oceny.

Ocenę tolerancji glifozatu przez rośliny transgeniczne przeprowadzono na pokoleniu roślin transgenicznych R0. Glifozat podawano przy użyciu liniowego opryskiwacza gąsienicowego, ustawionego na podawanie 64 uncji glifozatu na ar. Rośliny opryskano raz lub dwa razy. Tolerancję wegetatywną na glifozat oceniano wizualnie, po tygodniu od opryskania, w skali od 0 do 5 (0 = brak obserwowalnego/wegetatywnego wpływu glifozatu; 1 = obserwowana chloroza; 2 = zaawansowana chloroza, niewielka nekroza; 3 = zaawansowana chloroza, umiarkowana nekroza; 4 = zaawansowana chloroza, ciężka nekroza; 5 = całkowity zanik żywej tkanki). Pozwalano na samozapylenie wyprodukowanych rcślin R0 i oznaczono stopień zapłodnienia jako procent zapłodnień u kontrolnych roślin nie opryskanych. Rośliny, które wykazały tolerancję wegetatywną i płodność równą lub przewyższającą 80% hodowano dalej, aby przeprowadzić skining potomstwa R1 stosując opryskiwanie glifozatem i ocenę w skali punktowej podanej powyżej dla populacji R0. W ten sposób oznaczano skuteczność promotora. Efektywna tolerancja roślin transgenicznych herbicydu glifozatu i innych herbicydów układowych jest często funkcją konstytutywnego charakteru wzoru ekspresji promotora. Jak to jest podane w ocenie promotorów przedstawionej w tabeli 3, procentowa ilość wyprodukowanych roślin, które wykazywały tolerancję wegetatywną i reprodukcyjną jest odzwierciedleniem użyteczności danego promotora do ekspresji konstytutywnej. Promotory P-Zm.700343485 i P-Zm.70015443, w połączeniu z kasetą ekspresyjną P-CaMV.35S, powodowały wzrost tolerancji wegetatywnej i reprodukcyjnej transgenicznych roślinek pszenicy na herbicyd glifozat. P-Zm.700342364 dawał wzrost tolerancji wegetatywnej, jednak obserwowano zmniejszenie się tolerancji reprodukcyjnej. P-Zm.700164347, jako promotor pojedynczej kasety ekspresyjnej, skutecznie nadawał tolerancję wegetatywną i reprodukcyjną transgenicznym roślinkom pszenicy. Te promotory w połączeniu z elementami regulatorowymi kasety ekspresyjnej innymi niż testowane w niniejszych przykładach, takimi jak introny, lidery, peptydy przejściowe i nie podlegające translacji terminatorowe regiony 3' mogą również wyrażać pożądane wzory ekspresji, które mogą być wyselekcjonowane przez specjalistów z dziedziny nauki o roślinach. Przykładowo, jak to jest podane w tabeli 3, z większą częstością można wyselekcjonować linie transgenicznych roślin tolerujących glifozat, demonstrujących tolerancję zarówno wegetatywną jak i reproduktywną, wówczas, gdy promotor CaMV.35S został związany operacyjnie z intronem Os.Act1 niż z intronem Zm.Hsp.70. Promotory te są przydatne do użycia w nadawaniu roślinom uprawnym tolerancji na herbicyd, użyteczne są również do kierowania ekspresją genów odporności na owady, genów odporności na choroby, genów odporności na stres i cech wysokiego plonowania, co jest jednym z aspektów wynalazku.

T a b e l a 3. Wyniki opryskiwania pokolenia R0 transgenicznej pszenicy

PMO.M#	Elementy promotora	Rośliny R0	Tolerancja wegetatywna	Reprodukcja >=80%	% roślin hodowanych dalej
1	2	3	4	5	6
42411	P-CaMV.35S/I-Zm.Hsp70	71	26 (37%)	1 (4%)	1
42410	P-aMV.35S/I-Os.Act1	150	73 (52%)	38 (49%)	25

PL 204 789 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5	6
30167	P-Os.Act/I-Os.Act1	63	4 (6%)	2 (50%)	3
45360	P-Zm.700343433 P-CaMV.35S	25	20 (80%)	14 (70%)	56
45361	P-Zm.70015443 P-CaMV.35S	26	22 (85%)	20 (91%)	77
45362	P-Zm.700342364 P-CaMV.35S	23	14 (61%)	5 (36%)	22
43623	P-Zm.700164347	166	95 (57%)	20 (21%)	12

P r z y k ł a d 7. Identyfikacja elementów cis

Elementy regulacyjne cis niezbędne do prawidłowej regulacji promotorowej można zidentyfikować wieloma sposobami. W jednym ze sposobów, prowadzi się analizę przez delecję, usuwając pewne regiony promotora i pozostałe fragmenty promotora analizuje się na aktywność promotorową. Fragmenty DNA uznaje się za niezbędne do regulacji promotorowej jeśli aktywność skróconego promotora uległa zmianie w porównaniu z oryginalnym fragmentem promotora. Przez analizę metodą delecji można zidentyfikować małe regiony DNA, które są potrzebne do pozytywnej lub negatywnej regulacji transkrypcji. Można również zidentyfikować motywy sekwencji promotora i skonstruować nowe promotory, tak, aby zawierały te elementy cis, które są potrzebne do modulowania ekspresji związanych operacyjnie sekwencji podlegających transkrypcji (patrz np. opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.223.419, US 4.990.607 i US 5.097.025, wprowadzone w całości do niniejszego opisu jako odnośniki).

W alternatywnym podejściu, poszukuje się podobnych sekwencji pomiędzy promotorami o podobnych profilach ekspresji. Promotory z nakładającymi się wzorami aktywności mogą posiadać wspólne mechanizmy regulacyjne. Do identyfikacji zachowawczych motywów sekwencji wśród promotorów można użyć kilka programów komputerowych, w tym między innymi MEME, SIGNAL SCAN lub GENE SCAN. Te motywy mogą reprezentować miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych, które działają regulująco na promotory. Po zidentyfikowaniu motywów sekwencji można oznaczyć ich funkcje. Przykładowo, motywy sekwencji można wyciąć z promotora przez delecję i sprawdzić, czy dany motyw jest potrzebny do prawidłowego funkcjonowania promotora. Alternatywnie, do minimalnego promotora można dodać motyw i sprawdzić, czy jest on wystarczający do aktywacji transkrypcji. Przypuszczalne negatywne elementy regulatorowe można testować na skuteczność przez dodanie danego elementu do aktywnego promotora i wykonanie testu na osłabienie jego aktywności. Do funkcjonowania niektórych elementów regulatorowych cis mogą być potrzebne inne elementy. Należy zatem testować wiele elementów w różnych kombinacjach wieloma metodami znanymi specjalistom.

Po zidentyfikowaniu funkcyjnych elementów promotora, elementy te można modyfikować na poziomie nukleotydów, wpływając na wiązanie z białkami. Modyfikacje te mogą powodować zwiększenie lub osłabienie powinowactwa wiązania, co może mieć wpływ na poziom transkrypcji z pod tego promotora.

Elementy promotora mogą wpływać na aktywność promotora działając addytywnie lub synergicznie. Pod tym względem, można umieścić elementy promotora z różnych regionów regulatorowych 5' tandemowo, otrzymując promotor o innym spektrum aktywności lub o innym profilu ekspresji. Tak więc, kombinacje elementów promotora ze źródeł heterologicznych albo powtórzenie podobnych elementów albo tego samego elementu może nadać wyższy poziom ekspresji związanym operacyjnie sekwencjom podlegającym transkrypcji. Element promotora można np. zwielokrotnić dla zwiększenia poziomów ekspresji swoiście, we wzorze podlegającym wpływowi tego elementu promotora.

Techniczne sposoby konstruowania wektorów ekspresyjnych zawierających nowe, modyfikowane metodami inżynierii elementy regulatorowe 5' są znane specjalistom. Skonstruowane promotory testuje się w wektorach ekspresyjnych i w próbach przejściowych przez operacyjne związanie tych nowych promotorów z odpowiednim genem reporterowym, takim jak GUS i testowanie w próbie przejściowej na roślinach. Nowe promotory wiąże się operacyjnie z jednym lub

PL 204 789 B1 z kilkoma żądanymi genami i wprowadza się do wektora do transformowania roślin razem z jednym lub z kilkoma dodatkowymi elementami regulatorowymi i transformuje się docelową roślinę odpowiednim układem dostarczania DNA. Trwale transformowane rośliny i następne pokolenie ocenia się wieloma metodami molekularnymi, immunodiagnostycznymi, biochemicznymi, fenotypowymi lub polowymi, odpowiednimi do oceny żądanych właściwości agronomicznych.

Claims (10)

1. Promotor zawierający sekwencję SEQ ID nr. 69.

2. Promotor posiadający sekwencję SEQ ID nr: 69.

3. Promotor według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto drugą cząsteczkę polinukleotydu połączoną ze wspomnianym promotorem, przy czym ten drugi polinukleotyd zawiera cząsteczkę DNA kodującą EPSPS odporny na glifosat.

4. Promotor według zastrz. 3, znamienny tym, że wspomniany odporny na glifosat EPSPS jest AGRTU.aroA:CP4.

5. Rekombinowana konstrukcja DNA, znamienna tym, że zawiera sekwencję SEQ ID nr. 69 związaną operacyjnie z sekwencją kodującą i nie ulegającym translacji regionem 3'.

6. Transgeniczna komórka roślinna zawierająca izolowaną konstrukcję DNA jak zdefiniowano w zastrz. 5.

7. Transgeniczna roślina zawierająca komórkę rośliny jak zdefiniowano w zastrz. 6.

8. Transgeniczna roślina według zastrz. 7, znamienna tym, że jest rośliną jednoliścienną.

9. Transgeniczna roślina według zastrz. 7, znamienna tym, że zawarta w niej wspomniana konstrukcja DNA nadaje tej roślinie cechę tolerancji herbicydu.

10. Sposób wytwarzania transgenicznej rośliny znamienny tym, że: (i) wprowadza się do komórki roślinnej konstrukcję DNA zawierającą (a) promotor zawierający polinukleotyd o sekwencji SEQ ID nr. 69, przy czym promotor ten jest operacyjnie związany z (b) sekwencją kodującą i (c) nie ulegającym translacji regionem 3', (ii) dokonuje się selekcji tej komórki roślinnej i (iii) regeneruje się z tej komórki roślinnej całą roślinę.