JP4755838B2 - アセト乳酸合成酵素遺伝子プロモーター - Google Patents

Description

本発明は、形質転換植物を作出する際などに使用することができる新規なプロモーター、及び当該プロモーターを使用して植物体における所定の組織に特異的に遺伝子を発現させる方法に関する。

真核生物の遺伝子の発現は、プロモーターと呼ばれるDNA配列の領域で誘導される。一般に、プロモーターは、コドン領域より上流に存在し、RNAポリメラーゼの結合部位を有し、そして、その下流に存在するDNAの転写開始を制御する。プロモーター領域はまた、遺伝子発現の調節遺伝子として働く他の要素をも含有する。すなわち、プロモーター領域は、開始コドンから5’側の約-30bpの位置にTATAボックスコンセンサス配列を有し、そしてしばしば約-75bpの位置にCAATボックスコンセンサス配列を有する（Breathnach and Chambon (1981) Ann. Rev. Biochem. 50: 349-383 (非特許文献1); MessingらGenetic Engineering of Plants, T. Kosuge, Meredish and Hollaender(編), pp.211-227 (1983) (非特許文献2))。

植物において、CAATボックスは、Messingら（非特許文献２）がAGGAボックスと名付けた、cap部位から同じ距離に位置するコンセンサス配列で置き換えられていても良い。転写の開始は、まずTATAボックスコンセンサス配列に転写因子（タンパク質）が結合することから始まる。これを目印に次にRNAポリメラーゼやその他の転写因子が結合し、転写開始点からの転写が開始される。RNAポリメラーゼが、転写終了を示すターミネーターまで達すると、転写は終了する。プロモーターは、RNAポリメラーゼの結合部位であるとともに、この酵素がDNA上を移動する方向も規定する。したがって、二本鎖のうちのどちらが鋳型鎖になるかは、プロモーターの配置によって決まる。植物細胞内へ導入した遺伝子を効率よく発現させることは、形質転換体植物を作出する上での重要な問題である。プロモーター配列は、植物細胞内での遺伝子の転写レベルを決定する主要な因子であり、一般に転写活性の強いプロモーター配列を用いることにより、目的遺伝子の発現レベルを向上させることが可能となる。プロモーター配列には、植物種や、器官、組織や細胞または環境条件ごとに存在するRNAポリメラーゼの違いに基づく特異性が存在することが知られている。従って、植物細胞での遺伝子発現を行おうとする場合には、目的の条件で機能するプロモーター配列を用いる必要がある。

従来、植物体内で機能することが可能なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)由来の35Sプロモーター(EP0131623(特許文献1)）、Agrobacterium T-DNA中に見いだされ得るプロモーター（ノパリンシンターゼ(nos)、マンノピン(mannopine)シンターゼ(mas))及びオクトピンシンターゼ(ocs)プロモーター（EP0122791（特許文献２）、EP0126546（特許文献３）、EP0145338（特許文献４））があげられる。

しかし、双子葉植物と単子葉植物での転写効率には差があることも知られており、CaMV由来35Sプロモーターは、ウイルス宿主範囲からかけはなれた植物を含む広い種類の植物において、高レベルのRNA産生を生じさせる強力なプロモーターであるにもかかわらず、農業上重要なイネ科植物においては比較的低い活性しか有さないことが報告されている(島本ら、1989 Nature 338、274-276（非特許文献３）、Rhodesら、1988 Science 240、204-207（非特許文献４）)。単子葉植物のプロモーターには、それらが誘導する遺伝子の5’非翻訳領域に双子葉植物には存在しない、遺伝子の発現を活性化するために必要なイントロンが存在する。したがって、これを単に連結しただけでは、有効な発現量が得られない場合が多い。このため、単子葉植物においては、5’非翻訳領域の改良、イントロンの使用や遺伝子を再合成するなどをして発現量を高める工夫がされている（Plant Mol. Biol. 32 (1996) 393-405（非特許文献５）、Plant Cell Rep. 6: 265-270（非特許文献６））。他の研究によれば、Kayらは（Science 236: 1299-1302(1987)（非特許文献７））、CaMV由来35Sプロモーターを有する遺伝子導入タバコ植物中で10倍高い転写活性を報告し、そのCaMV由来35Sプロモーター上流配列の260bpを2回に含むものであることを述べている。

さらに、Owら（Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 4870-4874 (1987) （非特許文献８））によって、35Sプロモーター（-148〜-89位間）の末端領域の多重体は、35Sプロモーターコアを天然の35Sプロモーターよりもさらに高い発現のレベルに活性化し得ることが報告された。さらにまた、Fangら（The Plant Cell 1: 141-150 (1989)（非特許文献９））は、上流35Sプロモーター 断片（-209〜-46）の単量体および多重体は、異種体プロモーター からの転写を増大させるエンハンサーとして作動し得ることを報告した。これらの研究において、35Sプロモーターの-209〜-46位間にある上流領域の8反復が、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットであるrbcS-3A遺伝子の-50位にクローン化された。8量体はrbcS-3A上流領域を用いて得られるよりも、さらに高いレベルにrbcS-3A転写を増大させた（非特許文献９）。

このような状況から、強力な活性を有するプロモーターを提供することは、形質転換法を用いた植物の分子育種を行う上で極めて重要であり、イネ、ムギ、トウモトコシなど主要な穀物が属する特に単子葉植物で効率良く機能するプロモーターの重要性は特に高い。そのため、単子葉植物由来のプロモーターとしては、イネのアクチンプロモーター（USP5641876（特許文献５））、とうもろこしのユビキチンプロモーター（USP5510474（特許文献６））などの数例の使用が試みられている。

ところで、アセト乳酸合成酵素（アセトラクテートシンターゼ；ALS）は植物及び微生物に存在する分岐アミノ酸生合成経路の最初の段階の共通酵素であり、スルホニルウレア骨格、イミダゾリノン骨格、トリアゾロピリミジンスルホンアミド骨格、ピリミジンカルボキシ骨格を含む少なくとも4つの構造的に異なった除草剤の標的酵素として知られている。また、アセトラクテートシンターゼ（ALS）は動物に存在しないためこれら除草剤は人体に対する影響が少ない。また、ALSは特に植物においてその塩基配列が高く保存されている（MazurらAnnu Rev Plant Physiol 40 441-447 （1987）（非特許文献１０））。Gailらは（Pesticide Sci. 30(4) 418-419（1990）（非特許文献１１））、ライママメを用いた酵素測定によりアセトラクテートシンターゼ（ALS）の葉、茎、根、花、さや、および分裂組織のさまざまな組織での発現を調べている。葉、茎、根および分裂組織において播種後14、28、42日のALS活性が測定され、花、さやにおいて播種後42日のALS活性が測定されている。茎以外の組織では加齢とともに活性が減少しているが、いずれの組織においても構成的にＡＬＳが発現していることを述べている。Sharon J. Keeler らは、タバコにおけるALSの構成的な発現を幼苗、葉、茎、根および花のさまざまな組織において観察している（Plant Physiol. 102、1009-1018（1993）（非特許文献１２））。ALSの発現は幼苗、若葉などの発達中の器官でもっとも高く、成熟した葉でもっとも低い発現を示した。In situ ハイブリダイゼーションの結果でも根、茎および花の代謝的に活性な細胞または分裂細胞にもっとも高いＡＬＳの発現が観察された。たとえば根では先端でもっとも発現が高く、先端から離れるにしたがって、すなわち古い細胞ほど徐々に発現が低下している。ALSの転写産物はmRNA全体の約0.1％の発現が見られ、組織間での発現レベルには4倍までの差が見られた。

EP 0131623 EP 0122791 EP 0126546 EP 0145338 USP 5641876 USP 5510474 Breathnach and Chambon (1981) Ann. Rev. Biochem. 50: 349-383 MessingらGenetic Engineering of Plants, T. Kosuge, Meredish and Hollaender(編), pp.211-227 (1983) 島本ら、1989 Nature 338、274-276 Ｒhodesら、1988 Science 240、204-207 Plant Mol. Biol. 32 (1996) 393-405 Plant Cell Rep. 6: 265-270 Science 236: 1299-1302 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 4870-4874 (1987) The Plant Cell 1: 141-150 (1989) MazurらAnnu Rev Plant Physiol 40 441-447 Pesticide Sci. 30(4) 418-419（1990） Plant Physiol. 102、1009-1018（1993）

植物においては、上述したように、遺伝子発現を制御するための種々のプロモーターが報告されているが、実用的に使用されうるプロモーターは限られており、特徴的な遺伝子発現制御を可能ならしめるプロモーターが待望されていた。

そこで、本発明は、このような実状に鑑み、特徴的な遺伝子発現制御を可能とする新規なプロモーター及び当該プロモーターを用いて植物体における所定の組織に特異的に遺伝子を発現させる方法を提供する事を目的としている。

上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。

(1)以下の(a)〜(c)いずれかのDNAを含むプロモーター。
(a)配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
(b)配列番号１に示す塩基配列における１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入及び付加された塩基配列からなり、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA
(c)配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるDNA断片であって、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA

(2)種子における活性が種子を除く植物組織における活性と比較して低いことを特徴とする(1)記載のプロモーター。

(3)種子を除く植物組織のみに活性を示すことを特徴とする(1)記載のプロモーター。

(4)根における活性が根及び種子を除く植物組織における活性と比較して低いことを特徴とする(1)記載のプロモーター。

(5)分裂組織における活性が、種子を除く植物組織における活性と比較して高いことを特徴とする(1)記載のプロモーター。

(6)(1)乃至(5)いずれか一項記載のプロモーターを含む発現ベクター。

(7)上記プロモーターの下流に遺伝子を含むことを特徴とする(6)記載の発現ベクター。

(8)(6)又は(7)記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体。

(9)トランスジェニック植物であることを特徴とする(8)記載の形質転換体。

(10)(9)記載の形質転換体を培養することにより、上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を、種子を除く植物組織において特異的に発現誘導することを特徴とする組織特異的発現誘導方法。

(11)上記プロモーターの下流に位置する遺伝子が、薬剤抵抗性アセト乳酸合成酵素遺伝子であることを特徴とする(10)記載の組織特異的発現誘導方法。

本発明によれば、特に植物を形質転換する際に好適な新規なプロモーターを提供することができる。本発明に係るプロモーターは、特異的な発現誘導を示すため、新規な形質転換植物を作出する際に広く使用することができる。

以下、図面を参照して本発明を詳細に説明する。

本発明に係るプロモーターは、イネ由来のアセト乳酸合成酵素遺伝子（アセトラクテートシンターゼ遺伝子、以下ALS遺伝子と称する）の上流（5'末端から3'末端に向かう方向）に位置するDNAに由来するDNA領域である。本プロモーターは、配列番号１に示す塩基配列からなるDNA断片を有し、下流（3'末端から5'末端に向かう方向）に位置する遺伝子の転写を制御することができる。

本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示す塩基配列からなるDNA断片を有するものに限定されず、配列番号１に示す塩基配列において１又は複数の塩基が欠失、置換、挿入及び付加された塩基配列からなり、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA断片であっても良い。ここで、複数の塩基とは、１〜２００個、好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜５０個の連続した又は連続しない塩基を意味する。

さらに、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるDNA断片であって、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA断片であっても良い。

配列番号１に示す塩基配列と異なる塩基配列からなるDNA断片がプロモーターとして機能するか否かは、例えば、当該DNA断片の下流にレポーター遺伝子が位置するように発現ベクターを構築し（後述を参照）、当該発現ベクターで形質転換した植物細胞或いは植物体におけるレポーター遺伝子の発現を確認することで知ることができる。ここで、レポーター遺伝子としては、GUS遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセイントプロテイン遺伝子等を使用することができる。

また、本発明に係るプロモーターは、配列番号１に示す塩基配列における1344〜2843番目の領域からなるDNA断片であっても良い。すなわち、配列番号１に示す塩基配列において1344〜2843番目の領域は、特にプロモーターとしての機能を示す上で重要な領域であると考えられるため、単独でプロモーターとして機能する。

具体的に、配列番号１に示す塩基配列を植物転写調節因子予測プログラムPlace（Nucleic Acids Research Vol.27 No.1 pp. 297-300参照）及び理研SNP Research Centerによる、独自の閾値を用いた転写因子結合部位検索プログラムTFBIND (BIOINFORMATICS, Vol.15, No.7/8, pp.622-630, 1999参照)を用いた検索結果よりALS遺伝子翻訳開始点（ATG）上流約1.5kbp以内（配列番号１に示す塩基配列における塩基配列1344番目〜2843番目）にTATAボックス、CAATボックス、CCAATボックスなどのプロモーター配列に重要なモチーフが認められる。より具体的には、配列番号1に示す塩基配列において1672-1675番目の領域にCAATボックスが存在し、CAATボックスの存在から予測される約45bp下流付近、すなわち1710-1716番目の領域にTATAボックスが存在する。また、プロモーター活性を増強することが知られているCCAATボックスが、配列番号1に示す塩基配列において1421-1425番目の領域、1501-1505番目の領域、2196-2200番目の領域及び2606-2610番目の領域に存在した。さらに、CaMV由来35Sプロモーターに認められるモチーフのほとんどが配列番号1に示す塩基配列において1344番目〜2843番目の領域に存在した。以上の検討より、配列番号１に示す塩基配列1344番目〜2843番目の領域は、プロモーターとしての機能に特に重要な領域であると言える。

本発明に係るプロモーターは、下流に位置する遺伝子の転写を植物の特定の組織に特異的に発現制御する。具体的には、本プロモーターは、種子における活性が極めて低い、換言すると種子においては実質的に活性を示さないという第１の機能を有する。ここで、『実質的に活性を示さない』とは、例えば、プロモーターの下流にレポーター遺伝子を組み込んだ発現ベクターによって形質転換植物を作出し、当該形質転換植物から採取した種子においてレポーター遺伝子の発現を検出できないレベルを意味する。

また、本プロモーターは、根においては極めて低い活性を示すといった第２の機能を有する。ここで、『極めて低い活性』とは、根及び種子を除く他の植物組織における活性と比較したときに大幅に低活性であることを意味する。根を除く組織とは、例えば、葉、花弁及び茎等の植物器官並びに例えば、表皮、師部、柔組織、木部及び維管束等の植物組織を意味する。

さらに、本プロモーターは、分裂組織における活性が、種子を除く植物組織における活性と比較して高いといった第３の機能を有する。ここで、分裂組織とは、細胞分裂が活発に進行している組織或いは部位を意味する。分裂組織としては、頂端分裂組織（茎端分裂組織、根端分裂組織）、側部分裂組織（形成層、コルク形成層）、生殖細胞が挙げられる。

ところで、本発明に係る発現ベクターは、上述したプロモーターを基本ベクターに組み込んだものである。発現ベクターは、プロモーターの下流に当該プロモーターによる発現制御の対象となる遺伝子を組み込むための領域を有していることが好ましい。なお、発現ベクターは、プロモーターの下流に発現制御の対象となる遺伝子を予め組み込まれたものであっても良い。

基本ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミドなどが挙げられる。プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。

基本ベクターに上述したプロモーターを挿入するには、まず、精製されたイネ染色体DNAを適当な制限酵素で切断してプロモーターを単離する。或いは、精製されたイネ染色体DNAを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを単離する。そして、単離したプロモーターを適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法などが採用される。

本発明においては、任意の遺伝子を発現させるため、上記発現ベクターに、さらに当該任意の遺伝子を挿入することができる。任意の遺伝子を挿入する手法は、ベクターにプロモーターを挿入する方法と同様である。任意の遺伝子は特に限定されるものではない。

上述したプロモーターに目的の任意遺伝子をセンス又はアンチセンス方向で接続したものを作製し、これをバイナリーベクターと呼ばれるpBI101(Clonetech社)などのベクターに挿入することもできる。

一方、本発明に係る発現ベクターを用いて植物を形質転換することができる。換言すれば、本発明に係る発現ベクターを利用して形質転換体（形質転換植物）を作出することができる。具体的に、形質転換体は、所望の遺伝子を導入した発現ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プロモーター又は目的遺伝子、環境ストレス応答性転写因子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、植物が好ましい。植物としては、トウモロコシ(Zea mays) 、イネ(Oryza sativa)に代表される単子葉植物が好ましい。その他にも形質転換に用いられる植物としては、アブラナ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。

アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）
マメ科：ダイズ(Glycine max)

上記発現ベクターは、通常の形質転換方法、例えば電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法等によって植物細胞中に導入することができる。

例えばエレクトロポレーション法を用いる場合は、パルスコントローラーを備えたエレクトロポレーション装置により、電圧500〜1600V、25〜1000μF、20〜30msecの条件で処理し、発現ベクターを宿主に導入する。

また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばBio-Rad社のPDS-1000/He等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は1000〜1800psi程度の圧力、5〜6cm程度の距離で行う。

また、植物ウイルスを基本ベクターとして利用することによって、上述したプロモーターの制御下にある目的遺伝子を植物体に導入することができる。利用可能な植物ウイルスとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスが挙げられる。すなわち、まず、ウイルスゲノムを大腸菌由来のベクターなどに挿入して組換え体を調製した後、上述したプロモーターを有する植物ウイルスのゲノム中に、これらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修飾されたウイルスゲノムを制限酵素によって組換え体から切り出し、植物宿主に接種することによって、上述したプロモーター及び目的遺伝子を植物宿主に導入することができる。

アグロバクテリウムのTiプラスミドを利用する方法においては、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属に属する細菌が植物に感染すると、それが有するプラスミドDNAの一部を植物ゲノム中に移行させるという性質を利用して、上述したプロモーター及び目的遺伝子を植物宿主に導入する。アグロバクテリウム属に属する細菌のうちアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)は、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成し、また、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacteriumu rhizogenes)は、植物に感染して毛状根を発生させる。これらは、感染の際にTiプラスミド又はRiプラスミドと呼ばれる各々の細菌中に存在するプラスミド上のT-DNA領域(Transferred DNA)と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。

Ti又はRiプラスミド上のT-DNA領域中に、植物ゲノム中に組み込みたい遺伝子及び上述したプロモーターを挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物宿主に感染する際に目的とするDNA及びプロモーターを植物ゲノム中に組込むことができる。

形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。

なお、上述した発現ベクターは、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、又はシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞、あるいはSf9等の昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできる。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の発現ベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、上述したプロモーター、リボソーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、発現ベクターには、上述プロモーターを制御の制御下にある遺伝子が含まれていてもよい。

細菌への発現ベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への発現ベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。

動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞などが用いられる。動物細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。

昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への発現ベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、そして増幅産物を1本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。

上記形質転換植物細胞から形質転換植物体に再生することができる。再生方法としては、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法が採用される。使用する培地としては、LS培地、MS培地などが例示される。

再生した形質転換植物から植物種子を得て、該植物種子から植物体を生産することもできる。生産される植物体は、上述したプロモーター及び当該プロモーターによって発現制御された遺伝子を含むこととなる。

形質転換植物から植物種子を得るには、例えば、形質転換植物を発根培地から採取し、水を含んだ土を入れたポットに移植し、一定温度下で生育させて、花を形成させ、最終的に種子を形成させる。また、種子から植物体を生産するには、例えば、形質転換植物上で形成された種子が成熟したところで、単離して、水を含んだ土に播種し、一定温度、照度下で生育させることにより、植物体を生産する。

以上、説明したように、本発明に係るプロモーターは、例えば遺伝子の導入により植物の形質を転換するに際し、強力に機能する植物用の新規なプロモーターとして広範に使用することができる。

一例としては、植物に２つ以上の植物発現用遺伝子を組み込んで植物の形質転換を行うに際し、それぞれの植物発現用遺伝子に異なるプロモーターを用いていることが好ましい。これは、植物の遺伝子発現において、プロモーターに関して、いわゆるジーンサイレンシング現象というものが報告（Park et al.、The Plant Journal 9、183-194[1996]）されているからである。これは、ジーンサイレンシング現象とは、同一核内に同種のプロモーターが２つ以上存在すると、その転写促進作用が抑制されるという現象である。

したがって、本発明によれば、特に植物を形質転換する際に有用なプロモーターを提供できるといった利点がある。例えば、２つ以上の遺伝子を植物の同一染色体に導入する場合に、それらの構造遺伝子にそれぞれ連結するプロモーターとして通常良く用いられるCaMV35Sプロモーターを用いた場合に、該プロモーター１種類のみを使用したのでは、このジーンサイレンシング現象が起こると考えられる。この場合にはCaMV35Sプロモーター以外のプロモーターが必要であり、かかるプロモーターはCaMV35Sプロモーターと同等程度の能力かそれ以上の能力をもつことが望ましい。このような要求が生じた場合、本発明に係るプロモーターを好適に使用することができる。

さらに、本発明に係るプロモーターは、イネ由来のプロモーターであり、他の植物由来、微生物由来、或いはウイルス由来プロモーターと異なり、イネ等の植物体中で予測できない挙動を示すとは考えにくい。したがって、本発明に係るプロモーターを組み込んだイネは、社会的に受け入れられやすい実用的な植物となり得る。

さらにまた、本発明に係るプロモーターは、種子における活性が極めて低いといった第１の機能を有するため、所望の遺伝子を、種子においては発現を抑制すると同時に種子を除く他の植物組織においては発現させるといった、組織特異的発現調節に使用することができる。このような組織特異的発現調節を可能とするプロモーターは、遺伝子の機能解析実験等にとって非常に有用なツールとなりうる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例1〕ALS遺伝子の単離
日本型イネALS遺伝子の完全長cDNA塩基配列はすでに決定されている。タバコやシロイヌナズナで示されたようにイネALS遺伝子にもイントロンが存在しないことを確認している（Genbank accession AB049822）。このイネALS cDNA塩基配列をクエリーとして使用し、インディカイネゲノムデータベース（http://btn.genomics.org.cn/rice）を調査した結果、イネALS cDNAの5’領域の487塩基を含む18kbpのコンティグ配列を見出した。この18kbpのインディカ型イネの塩基配列情報を基にいくつかのオリゴヌクレオチドプライマーを合成してPCRを行ったところ、5’-tgggagaaaagggtcttagggtggacat-3’(配列番号２；翻訳開始点から約2.9kbp上流のプライマー)と5’-acgtggtgtcgctggtggttctta-3’(配列番号３；翻訳開始点から約60bp下流のプライマー)のプライマーの組み合わせにおいて日本型イネ（日本晴）ALS遺伝子の5'上流2.9kbpのフラグメントを増幅する事に成功した。

一方、約1.9kbp のイネALS遺伝子の3’下流塩基配列は、Universal genome Walker Kit (クローンテック社製)を用いてクローニングした。最終的に日本晴れゲノムDNAを鋳型としてPCR法により5’上流2.8kbpの塩基配列（配列番号１）と2.0kbpのコーディング配列（配列番号４）および3’下流1.9kbpの塩基配列（配列番号５）を含む約6.7kbp のイネALSゲノムDNAを増幅し、pBluescript KS-にクローニングした（図1）。

クローニングされた約6.7kbpのフラグメントの塩基配列はシーケンシングおよびPCR産物のダイレクトシーケンシングと比較することによって決定した。5’上流2.8kbpの塩基配列を配列番号１に示す。約2.0kbpのコーディング配列を配列番号４に示す。3’下流1.9kbpの塩基配列を配列番号５に示す。

最近Rice Genome Research Program(RGP)によってイネALSを含むBAC DNA塩基配列（Genbank accession AP005841）が決定されており、本実施例で決定した塩基配列と比較したところ、両者は完全に一致した。

なお、本例で構築した、イネALS遺伝子の5’上流2.8kbpを含む約6.7kbpのイネALSゲノムDNAをクローニングしたLITMUS28プラスミドは、ブタペスト条約に基づき、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第5）に2004年3月9日付けて受託番号FERM BP-08655として寄託した。

〔実施例2〕除草剤抵抗性イネALS遺伝子の構築とその形質転換
2.0kbpのイネALS遺伝子およびその5’上流2.2kｂpの塩基配列と3’下流0.8kbの塩基配列を含む5.0Kbp のKpnI/SnaBI DNA断片をpBluescript KS- にサブクローニングした。QuickChange Site-directed Mutagenesis Kit(Stratagene社製)を用いて部位直接変異により548番目のトリプトファンがロイシンにそして627番目のセリンがイソロイシンに変異した2点変異イネALS遺伝子を得た。図2に示すように、これら2点の変異は二つの新しいMfe I 制限酵素サイトをイネALS遺伝子に与える。5.0Kbpの除草剤抵抗性ALS遺伝子のフラグメントはさらにバイナリーベクターpPZP200のKpn I/平滑末端化されたHind IIIサイトにサブクローニングされた(図3)。

pPZPOsALS(m)を用いたアグロバクテリウム法によるイネ形質転換を土岐(Plant Mol. Biol. Rep 15(1) 16-21, 1997) によって報告された方法で行った。形質転換１週間後、感染されたカルスを0.25 または0.5μM のビスピリバックナトリウム塩（BS）を含む新しい培地に移植した。移植3週間後、活発に増殖しているカルスを再び同濃度のBSを含む培地に移植した。さらに3週間後選抜倍地上で活発に増殖しているカルスを同濃度のBSを含んでいる再分化培地に移植した。再分化した植物体は根の成長を促進するためさらにホルモンフリー培地で生育し、土に移植し成熟させた。形質転換植物のT0世代は自家受粉させ、得られたT1種子は除草剤抵抗性試験に用いた。図4に示すように形質転換植物のT1世代から得られた種子は1μM のBSを含む選抜倍地上で3（抵抗性）：1(感受性)に分離した。したがってBS抵抗性の表現型はメンデルの法則にしたがって遺伝している。ここでは8個体中6個体が抵抗性を示している。

われわれは形質転換植物のT1世代においていかなる異常な分離も観察しなかった。したがってわれわれが試験した限りにおいて形質転換によるジーンサイレンシングやイネALS遺伝子の過剰発現は起こらなかった。

〔実施例3〕 ALSプロモーターでドライブしたBS抵抗性ALS遺伝子を導入したイネのALS検定による抵抗性の確認
選抜倍地上でBS抵抗性を示したイネを土に移植し成熟させた後、葉150mgを採取し細かく刻んでシャーレに入れた。ここに処理溶液（25％MS培地用混合塩類；500μM（最終濃度） 1,1-cyclopropanedicarboxilic acid(CPCA);5μg Triton X-100 ;0.15μM（最終濃度）BS)を加え30℃、明条件(14000lx)で1日静置した。反応後、処理葉を1.5mlマイクロチューブに入れ、0.025％Triton X-100を含む蒸留水200μlを加えた。60℃で5分間静置した後、超音波（周波数40kHz）で15分抽出した。200μlの上清を別のチューブに移し、20μlの5％(v/v)の硫酸を加え、60℃で30分間静置した。その後、100μｌの0.5％(ｗ/v)クレアチン溶液および2.5ＮNaOH溶液に溶かした100μｌの5％(ｗ/v)1-ナフトール溶液（用時調製）を加え37℃で30分間静置した。30分経過後抵抗性を示すイネはBS添加区でも無添加区同様の赤色発色を示した（図5）。一方、野生型イネではBS添加によりALS遺伝子が阻害され赤色発色を示していないことが分かる。

〔実施例4〕 ALS遺伝子のプロモーター解析
イネALS遺伝子の5’上流塩基配列を含む2.2kbp のKpnI/NcoIフラグメントをバイナリーベクターpSMAHdN628omega-M2GUSのKpnI/NcoIサイトに導入してALSプロモーターでGUS遺伝子を誘導するコンストラクトを構築した(図6)。

これを土岐によって報告された方法に従ってイネに形質転換した。GUSの発現はX-Glucを基質として組織化学的染色により解析した。4つの独立した形質転換体の２週間の幼苗においてGUS活性の局在を解析した。図7に示すようにGUSの活性が根では弱いものの全体的に観察された。

本実施例により、配列番号１に示す塩基配列からなるプロモーターは、根を除く植物組織において特異的な発現を誘導するということが明らかとなった。

〔実施例5〕
形質転換体を用いたプロモーターの部位別発現
上述した方法と同様に、ALSプロモーターでGUS遺伝子をドライブしたベクターによりイネを形質転換した後、ハイグロマイシンで選抜したイネの3系統(HF1-1、HF1-3、HF1-4)のT₀世代及び比較対照として原品種の日本晴を栽培した。日中温度30℃夜間20℃で、日長条件13時間明期、11時間暗期で栽培した。栽培開始から約2ヵ月後に栽培個体から葉（10葉〜12葉すべて）、茎(10葉と12葉が付いていた葉鞘を含む茎)、根をそれぞれサンプリングし、部位ごとにGUS活性を測定した。根は根元から半分に切断し、根元（基部）と先端部に分けて測定した。また、その後各々の系統から出穂した穂から未成熟種子及び登熟種子を5粒ずつサンプリングしてGUS活性を測定した。GUS活性を測定するまでサンプルは-80℃に保存し、サンプリング後1週間以内に活性を測定した。

幼苗期のALSプロモーターの部位別発現
イネ形質転換個体HF1-1、HF1-3、HF1-4系統から得られたT₁世代のそれぞれ6個体及び比較対照とし原品種の日本晴を栽培した。日中温度30℃夜間25℃で、日長条件16時間明期、18時間暗期で栽培した。栽培開始から約3週間後に(3〜4齢期に該当)栽培個体から葉（1葉〜4葉すべて）、茎(葉鞘を含む茎全体)、根（全体）、に分けてサンプリングし、部位ごとにGUS活性を測定した。GUS活性を測定するまでサンプルは-80℃に保存し、サンプリング後1週間以内に活性を測定した。

GUSの抽出及びGUS活性測定並びにタンパク質定量
サンプルを液体窒素で凍結粉砕し100mgずつ1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。これに200μlの下記EX bufferを加え、15000rpm、4℃で5分間遠心し、上澄を回収した。回収した上澄10μlを下記4-MUG/EX bufferの100μlに添加し、37℃で1時間インキュベートした。上澄を添加しない区を対照区とした。インキュベート終了後、1.4mlの0.2M Na₂CO₃を加え、反応を停止した後、蛍光光度計（（株）日立製作所製F-2500形分光蛍光光度計）を使用して、励起波長355nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を測定した（測定を行うまでサンプルは遮光して氷中に入れておいた）。検量線は4-methyl umbelliferone (4-MU)を用いて作成した。タンパク質濃度はバイオラッドプロテインアッセイキットを使用して添付のプロトコールに従い測定した。

EX buffer組成（100ｍｌ作成時）
0.5M NaHPO₄ (pH7.0) 3ml、0.5M EDTA 200μl
0.1％(v/v) TritonX-100
2-mercaptoethanol 71μl
Distilled Waterで100mlにメスアップ

4-MUG/EX buffer
3.2mgの4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide (4-MUG)を8ml EX bufferに溶解(最終4-MUG濃度：0.4mg/ml)

形質転換イネの各部位のGUS比活性
本実施例で得られたT₀世代におけるGUS活性を測定した結果を表１及び図８に示す。

なお、表中、数値の単位はnmol 4MU/min/mg proteinであり、葉及び茎並びに根のデータは1個体から採種した3〜4サンプルの平均値±標準誤差で表示しており、種子は1個体から採種した5粒の平均値±標準誤差で表示している。

表1及び図8に示したように、形質転換体当代（T₀）の3系統すべてにおいて未成熟種子及び約2ヶ月間栽培した根の先端部に強いGUS活性が認められた。しかし、成熟種子のGUS活性は極めて弱かった。約2ヶ月間栽培した根の基部及び茎のGUS活性はあまり強くはなかった。葉のGUS活性は根の基部及び茎の活性よりも強い傾向であった。種子については導入形質がメンデル則に従って分離するため、GUS遺伝子が導入されていない個体のGUS活性データが表中の結果に含まれている可能性があるが、未成熟種子と登熟種子の活性差が極めて大きかったことから、成熟に伴い配列番号1に示すプロモーターは種子中で機能しなくなると考えられた。また上述のGUS活性染色では、本プロモーターの機能性は根部では弱いことが示唆されたが、GUS活性測定で得られた結果は、本プロモーターは根においても分裂の盛んな部分（生長点を含む）では強く機能していることを示した。

本実施例で得られたT₁世代におけるGUS活性を測定した結果を表２及び図８に示す。なお、表２及び図８に示すT₁植物体のGUS活性については、測定した6個体の内、活性が非形質転換体と同程度であった個体のデータ（GUS遺伝子が導入されていないと考えられる個体のデータ）を外した3個体のデータを採用した（なお、GUS遺伝子が導入されていないと考えられるGUS活性の弱い個体が3つの系統すべてに存在していたので、T₀にはGUS遺伝子がヘテロに導入されていると判断された）。

なお、葉及び茎並びに根のデータは3個体の平均値±標準誤差で表示している。

表２及び図８に示すように、葉の場合も茎の場合も3系統すべてにおいて前述のT₀の場合よりも強いGUS活性が認められ、植物体が若い程、配列番号1に示すプロモーターは強く機能すると考えられた。従って、本プロモーターは細胞分裂の活発な部位で強く機能するプロモーターであると判断された。

実施例１において、PCRにより増幅されたALS遺伝子OsALSの5’上流約2.8kbpの塩基配列、約2.0ｋｂのコーディング配列及び3’下流約1.9kbpの塩基配列を含む約6.7kbp のフラグメントを示す模式図である。 2点変異を導入したALS遺伝子の塩基配列を示す模式図であり、図中矢印で示す部分が変異部位である。 バイナリーベクターpPZP200のKpnI/平滑末端化されたHindIIIサイトにサブクローニングされた5.0kbp のALS遺伝子のフラグメントを示す模式図である。 T1世代から得られた種子の1μM BSを含む選抜培地上での分離を示す写真である。 ALS検定法によるALS遺伝子の発現の確認結果を示す写真である。 ALSプロモーターでGUS遺伝子を誘導するコンストラクトを構築するのに用いたバイナリーベクターpSMAHdN628omega-M2GUSの模式図である。 形質転換体の2週間の幼苗におけるGUS活性の局在化を示す写真である。 形質転換イネ（HF1-1、HF1-3及びHF1-4系統）におけるGUS活性を測定した結果を示す特性図である。

Claims (9)

1. 以下の(a)〜(c)いずれかのDNAを含み、未成熟種子において発現誘導活性を示し、登熟種子において実質的に発現誘導活性を示さないプロモーター。
   (a)配列番号１に示す塩基配列からなるDNA
   (b)配列番号１に示す塩基配列における１〜１００個の塩基が欠失、置換、挿入及び付加された塩基配列からなり、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA
   (c)配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNA断片に対して、ストリンジェント条件でハイブリダイズできるDNA断片であって、下流に位置する遺伝子の転写を制御することができるDNA
2. 根における活性が根及び登熟種子を除く植物組織における活性と比較して低いことを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
3. 分裂組織における活性が、登熟種子を除く植物組織における活性と比較して高いことを特徴とする請求項１記載のプロモーター。
4. 請求項１乃至３いずれか一項記載のプロモーターを含む発現ベクター。
5. 上記プロモーターの下流に遺伝子を含むことを特徴とする請求項４記載の発現ベクター。
6. 請求項４又は５記載の発現ベクターを宿主細胞に導入してなる形質転換体。
7. トランスジェニック植物であることを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
8. 請求項７記載の形質転換体を培養することにより、上記プロモーターの下流に位置する遺伝子を、登熟種子を除く植物組織において特異的に発現誘導することを特徴とする組織特異的発現誘導方法。
9. 上記プロモーターの下流に位置する遺伝子が、薬剤抵抗性アセト乳酸合成酵素遺伝子であることを特徴とする請求項８記載の組織特異的発現誘導方法。

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