JP2955643B2 - 抗菌性植物及びその作出方法 - Google Patents
抗菌性植物及びその作出方法Info
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- JP2955643B2 JP2955643B2 JP6040190A JP4019094A JP2955643B2 JP 2955643 B2 JP2955643 B2 JP 2955643B2 JP 6040190 A JP6040190 A JP 6040190A JP 4019094 A JP4019094 A JP 4019094A JP 2955643 B2 JP2955643 B2 JP 2955643B2
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- sarcotoxin
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、病原菌に対して耐性を
有する植物細胞又は植物体に関する。更に詳しくは、昆
虫の抗菌性ペプチドを発現し、病原菌に対して抵抗性を
有する植物体に関する。
有する植物細胞又は植物体に関する。更に詳しくは、昆
虫の抗菌性ペプチドを発現し、病原菌に対して抵抗性を
有する植物体に関する。
【０００２】
【従来の技術】農業の分野においては、食料の安定的供
給確保のため病害虫、病原菌に対して抵抗性のある品種
の改良、育種、農業開発が盛んに行われてきた。近年、
植物バイオテクノロジー技術が発達し、特に組換えＤＮ
Ａ技術を利用して病害虫あるいは病原菌に対して、抵抗
性のある植物を育種する試みがなされている。この組換
えＤＮＡ技術を用いて、すでに除草剤耐性（特開平２−
１８６９２５）、ウイルス抵抗性（特開平４−３３０２
３３）、害虫抵抗性（特開平３−２４７２２０）などの
形質転換植物が作出されている。しかし、病原菌（糸状
菌、あるいは細菌）に対しては、病原菌の生産する毒素
に対してその不活化酵素遺伝子を導入する試みがなされ
ており、（植物細胞工学ｖｏｌ．１２，７１３〜７２
０、１９９０）、糸状菌に対する耐性植物は得られてい
るが（Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：１０９
−１１８）、植物病原細菌に対して抗菌性を有する植物
は得られていないのが実情である。現在までに植物の細
菌病抵抗性遺伝子についての知見はほとんど得られてお
らず、従ってこのような細菌病抵抗性をもった植物は従
来の育種法では作出が困難であり、遺伝子組換え手法を
用いた植物の作出が待望されていた。
給確保のため病害虫、病原菌に対して抵抗性のある品種
の改良、育種、農業開発が盛んに行われてきた。近年、
植物バイオテクノロジー技術が発達し、特に組換えＤＮ
Ａ技術を利用して病害虫あるいは病原菌に対して、抵抗
性のある植物を育種する試みがなされている。この組換
えＤＮＡ技術を用いて、すでに除草剤耐性（特開平２−
１８６９２５）、ウイルス抵抗性（特開平４−３３０２
３３）、害虫抵抗性（特開平３−２４７２２０）などの
形質転換植物が作出されている。しかし、病原菌（糸状
菌、あるいは細菌）に対しては、病原菌の生産する毒素
に対してその不活化酵素遺伝子を導入する試みがなされ
ており、（植物細胞工学ｖｏｌ．１２，７１３〜７２
０、１９９０）、糸状菌に対する耐性植物は得られてい
るが（Ｐｌａｎｔ ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４：１０９
−１１８）、植物病原細菌に対して抗菌性を有する植物
は得られていないのが実情である。現在までに植物の細
菌病抵抗性遺伝子についての知見はほとんど得られてお
らず、従ってこのような細菌病抵抗性をもった植物は従
来の育種法では作出が困難であり、遺伝子組換え手法を
用いた植物の作出が待望されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記従来の課
題を解決するものであり、その目的とするところは以下
の点； （１）双翅目昆虫由来の、他の蛋白質と融合していない
抗菌性ペプチドを植物細胞で発現しうる発現カセットを
提供すること。
題を解決するものであり、その目的とするところは以下
の点； （１）双翅目昆虫由来の、他の蛋白質と融合していない
抗菌性ペプチドを植物細胞で発現しうる発現カセットを
提供すること。
【０００４】（２）前記発現カセットを有するベクター
を提供すること。
を提供すること。
【０００５】（３）前記発現カセット又はベクターを有
する抗菌性植物細胞を提供すること、および （４）前記発現カセット又はベクターを有する抗菌性植
物体を提供すること、にある。
する抗菌性植物細胞を提供すること、および （４）前記発現カセット又はベクターを有する抗菌性植
物体を提供すること、にある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＤＮＡ組
換え技術を用いて、抗菌性植物を育種することを目的と
して鋭意研究した結果、双翅目の昆虫が生産する抗菌性
ペプチドが植物病原菌にも顕著な効果を有すること及
び、この抗菌性ペプチドをコードするＤＮＡを植物細胞
又は植物体に導入することにより、該植物細胞及び植物
体の生育が阻害されることなく、種々の植物病原菌に対
して抵抗性を有することを発見して本発明を完成したも
のである。
換え技術を用いて、抗菌性植物を育種することを目的と
して鋭意研究した結果、双翅目の昆虫が生産する抗菌性
ペプチドが植物病原菌にも顕著な効果を有すること及
び、この抗菌性ペプチドをコードするＤＮＡを植物細胞
又は植物体に導入することにより、該植物細胞及び植物
体の生育が阻害されることなく、種々の植物病原菌に対
して抵抗性を有することを発見して本発明を完成したも
のである。
【０００７】本発明の発現カセットは双翅目の昆虫由来
の、他の蛋白質と融合していない抗菌性ペプチドを植物
細胞で発現しうるものであり、そのことにより、上記目
的が達成される。
の、他の蛋白質と融合していない抗菌性ペプチドを植物
細胞で発現しうるものであり、そのことにより、上記目
的が達成される。
【０００８】本発明のベクターは上記発現カセットを有
するベクターである。
するベクターである。
【０００９】このことにより、上記目的が達成される。
【００１０】本発明の抗菌性植物細胞は、前記発現ベク
ターを有する抗菌性植物細胞であり、このことにより、
上記目的が達成される。
ターを有する抗菌性植物細胞であり、このことにより、
上記目的が達成される。
【００１１】本発明の抗菌性植物体は前記発現ベクター
を有する抗菌性植物体であり、このことにより上記目的
が達成される。
を有する抗菌性植物体であり、このことにより上記目的
が達成される。
【００１２】更に、本発明の抗菌性植物細胞又は植物体
は植物細胞に発現カセット又はベクターを導入すること
により作出される。
は植物細胞に発現カセット又はベクターを導入すること
により作出される。
【００１３】又、本発明の抗菌性植物体は上記得られた
植物体を交配させて、１又は２以上の異なる抗菌性ペプ
チドを発現する植物体であり、そのことにより上記目的
が達成される。
植物体を交配させて、１又は２以上の異なる抗菌性ペプ
チドを発現する植物体であり、そのことにより上記目的
が達成される。
【００１４】以下、本発明を詳しく説明する。
【００１５】本発明の発現カセットは双翅目の昆虫由来
の抗菌性ペプチドを発現しうる。好ましい双翅目の昆虫
は、ハエ、カであり、入手の容易性からハエ、特にセン
チニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｒｇａ ｐｅｒｅｇｒｉ
ｎａ）が好ましい。抗菌性ペプチドとしては、センチニ
クバエに由来する、ザルコトキシンＩＡ、ザーペシン又
は抗真菌蛋白が好ましい。尚、ここで抗菌性とは抗糸状
菌性及び抗細菌性の両方をいう。「他の蛋白質と融合し
ていない」とは、抗菌性ペプチドが、他の蛋白質、例え
ばβ−グルクロニダーゼ蛋白の全部又は一部と結合して
いないことをいう。このためには、抗菌性ペプチドはシ
グナル配列と結合していること、あるいは結合している
シグナル配列と抗菌性ペプチドが正しい位置でプロセッ
シングされることが必要である。好ましいシグナル配列
はその抗菌性ペプチドのシグナル配列であるが、昆虫の
シグナルペプチドが植物細胞で正確にプロセッシングさ
れることは本発明において初めて明らかにされたもので
ある。
の抗菌性ペプチドを発現しうる。好ましい双翅目の昆虫
は、ハエ、カであり、入手の容易性からハエ、特にセン
チニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｒｇａ ｐｅｒｅｇｒｉ
ｎａ）が好ましい。抗菌性ペプチドとしては、センチニ
クバエに由来する、ザルコトキシンＩＡ、ザーペシン又
は抗真菌蛋白が好ましい。尚、ここで抗菌性とは抗糸状
菌性及び抗細菌性の両方をいう。「他の蛋白質と融合し
ていない」とは、抗菌性ペプチドが、他の蛋白質、例え
ばβ−グルクロニダーゼ蛋白の全部又は一部と結合して
いないことをいう。このためには、抗菌性ペプチドはシ
グナル配列と結合していること、あるいは結合している
シグナル配列と抗菌性ペプチドが正しい位置でプロセッ
シングされることが必要である。好ましいシグナル配列
はその抗菌性ペプチドのシグナル配列であるが、昆虫の
シグナルペプチドが植物細胞で正確にプロセッシングさ
れることは本発明において初めて明らかにされたもので
ある。
【００１６】シグナル配列を有する結果、抗菌性蛋白は
分泌され得る。細胞間隙に分泌される結果、植物細胞に
対する損傷を防ぎ、更に細胞間隙に侵入して植物体内で
増殖する病原菌に対する抗菌活性が向上することが期待
される。
分泌され得る。細胞間隙に分泌される結果、植物細胞に
対する損傷を防ぎ、更に細胞間隙に侵入して植物体内で
増殖する病原菌に対する抗菌活性が向上することが期待
される。
【００１７】「発現カセット」とは、上記抗菌性ペプチ
ドが発現されるために必要なＤＮＡ配列の一組をいい、
プロモーターＤＮＡ配列と抗菌性ペプチドをコードする
ＤＮＡ配列とが植物細胞で発現可能な状態で結合されて
いるものであれば、いづれをも使用しうる。好ましくは
特定の制限酵素で切断され、容易に回収されて、ベクタ
ーへの組換え、形質転換に用いられ得る。
ドが発現されるために必要なＤＮＡ配列の一組をいい、
プロモーターＤＮＡ配列と抗菌性ペプチドをコードする
ＤＮＡ配列とが植物細胞で発現可能な状態で結合されて
いるものであれば、いづれをも使用しうる。好ましくは
特定の制限酵素で切断され、容易に回収されて、ベクタ
ーへの組換え、形質転換に用いられ得る。
【００１８】好ましい発現カセットは、高発現プロモー
ターを有するカセットである。プロモーターとしては、
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプ
ロモーター、あるいはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）由来のＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅ
ｌａｔｅｄ １ａ（ＰＲ１ａ）遺伝子プロモーターが好
ましい。高発現のために、エンハンサーを使用し得る。
エンハンサーとしては上記３５Ｓプロモーター上流の配
列を含むエンハンサー領域（以下、Ｅｎ３５Ｓ等とい
う）が好適であり２個又はそれ以上を含み得る。７個連
続して含むものも好適に使用しうる。発現カセットとし
ては図１に示すＰＳＴ１０、Ｓ−ｓａｒｃｏ、Ｓ１２、
４−１５が挙げられる。
ターを有するカセットである。プロモーターとしては、
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプ
ロモーター、あるいはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔ
ａｂａｃｕｍ）由来のＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｒｅ
ｌａｔｅｄ １ａ（ＰＲ１ａ）遺伝子プロモーターが好
ましい。高発現のために、エンハンサーを使用し得る。
エンハンサーとしては上記３５Ｓプロモーター上流の配
列を含むエンハンサー領域（以下、Ｅｎ３５Ｓ等とい
う）が好適であり２個又はそれ以上を含み得る。７個連
続して含むものも好適に使用しうる。発現カセットとし
ては図１に示すＰＳＴ１０、Ｓ−ｓａｒｃｏ、Ｓ１２、
４−１５が挙げられる。
【００１９】発現カセットの構築は、常法に従って行わ
れ得る。例えば作成に用いるエンハンサーとしてＣａＭ
Ｖ３５Ｓ遺伝子のプロモーターの上流−４１７〜−９０
の領域又は−２９０〜−９０の領域を一単位として切り
出し、これを３５Ｓプロモーターの上流に結合すること
により行う。３５Ｓプロモーターの下流にタバコモザイ
クウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列を接続することにより、
更に高発現するプロモーターカセットを構築し得る。
れ得る。例えば作成に用いるエンハンサーとしてＣａＭ
Ｖ３５Ｓ遺伝子のプロモーターの上流−４１７〜−９０
の領域又は−２９０〜−９０の領域を一単位として切り
出し、これを３５Ｓプロモーターの上流に結合すること
により行う。３５Ｓプロモーターの下流にタバコモザイ
クウイルス（ＴＭＶ）のΩ配列を接続することにより、
更に高発現するプロモーターカセットを構築し得る。
【００２０】発現カセットを有するベクターは、前記発
現カセットとベクター、例えばｐＢＩ系であるバイナリ
ーベクター系又は中間ベクター系のようなアグロバクタ
リウムを介して植物に発現カセットを導入しうるもの、
あるいはｐＵＣ系のようなベクターであって植物に直接
導入し得るものが含まれる。
現カセットとベクター、例えばｐＢＩ系であるバイナリ
ーベクター系又は中間ベクター系のようなアグロバクタ
リウムを介して植物に発現カセットを導入しうるもの、
あるいはｐＵＣ系のようなベクターであって植物に直接
導入し得るものが含まれる。
【００２１】ｐＢＩ系のベクターとしては、ｐＢＩ１２
１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．
３などが挙げられる。
１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．
３などが挙げられる。
【００２２】ｐＵＣ系のベクターとしては、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ９などが挙げられる。ベクター
の構築はＤＮＡの組換え技術の常法が使用され得る。
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ９などが挙げられる。ベクター
の構築はＤＮＡの組換え技術の常法が使用され得る。
【００２３】上記得られた発現カセットあるいはベクタ
ーを細胞に導入するには、アグロバクテリウムを介する
方法と直接導入する方法とがある。アグロバクテリウム
を介する方法は、例えばＮａｇｅｌらの方法を用い、エ
レクトロポレーションによって、まずベクターをアグロ
バクテリウムに導入しついで、形質転換されたアグロバ
クテリウムを、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ ｅ
ｔ．ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ）に記載されている方法で、植物細胞に導入する方法
である。
ーを細胞に導入するには、アグロバクテリウムを介する
方法と直接導入する方法とがある。アグロバクテリウム
を介する方法は、例えばＮａｇｅｌらの方法を用い、エ
レクトロポレーションによって、まずベクターをアグロ
バクテリウムに導入しついで、形質転換されたアグロバ
クテリウムを、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎ ｅ
ｔ．ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
ｓ）に記載されている方法で、植物細胞に導入する方法
である。
【００２４】発現カセットを直接、植物細胞に導入する
方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法
がある。
方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法
がある。
【００２５】発現カセットあるいはベクターを導入され
た植物細胞は、カナマイシン耐性等でまず選択され、次
いで、植物体を再生させる。この植物体にモデル菌、例
えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒ
ｉｎｇａｅ ＰＶ．ｔａｂａｃｉ）を細針束を用いて接
種し、５日後にコントロールの植物体と比較して接種に
よる変化が認められないもの或いは軽度のハローが形成
されるものを選択することによって選択しうる。又、ノ
ーザン法により、導入した遺伝子の発現を検出しうる。
た植物細胞は、カナマイシン耐性等でまず選択され、次
いで、植物体を再生させる。この植物体にモデル菌、例
えばタバコ野火病菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒ
ｉｎｇａｅ ＰＶ．ｔａｂａｃｉ）を細針束を用いて接
種し、５日後にコントロールの植物体と比較して接種に
よる変化が認められないもの或いは軽度のハローが形成
されるものを選択することによって選択しうる。又、ノ
ーザン法により、導入した遺伝子の発現を検出しうる。
【００２６】本発明に使用し得る植物としては、単子葉
植物及び双子葉植物のいづれをも使用し得る。特に好ま
しい植物としては、カンキツ類、白菜、レタス、タバ
コ、モモ、イネ、ジャガイモ、トマト、オオムギ、コム
ギおよびリンゴが挙げられる。例えば、ザルコトキシン
はこれらの植物の病原菌に対して抗菌性を有するととも
に、けん濁培養細胞を用いた場合１００μｇ／ｍｌの濃
度でも生育阻害をおこさないからである。
植物及び双子葉植物のいづれをも使用し得る。特に好ま
しい植物としては、カンキツ類、白菜、レタス、タバ
コ、モモ、イネ、ジャガイモ、トマト、オオムギ、コム
ギおよびリンゴが挙げられる。例えば、ザルコトキシン
はこれらの植物の病原菌に対して抗菌性を有するととも
に、けん濁培養細胞を用いた場合１００μｇ／ｍｌの濃
度でも生育阻害をおこさないからである。
【００２７】抗菌性ペプチドの発現ベクターを導入され
た植物体を自家受粉又は交配して、第２世代の植物体を
得ることができる。この場合、異る抗菌性ペプチドを有
する発現カセットを有する植物体を交配することによ
り、より抗菌性が強化された植物体が得られる。ザルコ
トキシンＩＡと抗真菌蛋白の組みあわせが好ましい。
た植物体を自家受粉又は交配して、第２世代の植物体を
得ることができる。この場合、異る抗菌性ペプチドを有
する発現カセットを有する植物体を交配することによ
り、より抗菌性が強化された植物体が得られる。ザルコ
トキシンＩＡと抗真菌蛋白の組みあわせが好ましい。
【００２８】以下実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明は実施例のみに限定されるものではない。
本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）（ザルコトキシンＩＡの各種病原菌に対す
る活性） ５０℃のＰＤ培地（ポテトデキストロース培地、１．８
％寒天）１２ｍｌに１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの表１に記載
の病原菌懸濁液２ｍｌを加え、ステンレス円筒をおいた
直径９ｃｍのシャーレに流して固めた。ステンレス円筒
を引き抜いたあとにできた穴に、注意深く合成ザルコト
キシンＩＡ５μｇ、１０μｇをそれぞれ含む溶解したサ
ンプルを注いだ。２５℃で培養し、２日おきに阻止円を
測定した。８日後の結果を表１に示す。
る活性） ５０℃のＰＤ培地（ポテトデキストロース培地、１．８
％寒天）１２ｍｌに１０8ｃｅｌｌ／ｍｌの表１に記載
の病原菌懸濁液２ｍｌを加え、ステンレス円筒をおいた
直径９ｃｍのシャーレに流して固めた。ステンレス円筒
を引き抜いたあとにできた穴に、注意深く合成ザルコト
キシンＩＡ５μｇ、１０μｇをそれぞれ含む溶解したサ
ンプルを注いだ。２５℃で培養し、２日おきに阻止円を
測定した。８日後の結果を表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】なお、合成ザルコトキシンＩＡは、天然の
Ｃ末端のアミドをカルボキシル化したものである。
Ｃ末端のアミドをカルボキシル化したものである。
【００３２】（実施例２）（抗菌性ペプチド存在下での
培養細胞の増殖） ザルコトキシンＩＡまたはザーペシンの濃度を変えて、
単子葉植物であるイネの、および双子葉植物であるタバ
コのけん濁培養細胞に対する生育阻害を調べた。５０ｍ
ｌ三角フラスコにいれた１０ｍｌの培養細胞に、合成ザ
ルコトキシンＩＡを２０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／
ｍｌになるように添加し、２８℃で１週間培養し、細胞
の増殖をｐａｃｋｅｄ ｖｏｌｕｍｅを測定することに
より調べた。タバコ培養細胞におけるザルコトキシンＩ
Ａの阻害効果を実施例として図２に示した。この結果、
用いた濃度下ではザルコトキシンＩＡはタバコ培養細胞
の増殖を全く阻害しないことが示された。またイネにつ
いても全く同様の結果が、さらにザーペシンを用いたタ
バコ、イネ細胞に対する効果も上記と全く同様の結果が
得られた。
培養細胞の増殖） ザルコトキシンＩＡまたはザーペシンの濃度を変えて、
単子葉植物であるイネの、および双子葉植物であるタバ
コのけん濁培養細胞に対する生育阻害を調べた。５０ｍ
ｌ三角フラスコにいれた１０ｍｌの培養細胞に、合成ザ
ルコトキシンＩＡを２０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／
ｍｌになるように添加し、２８℃で１週間培養し、細胞
の増殖をｐａｃｋｅｄ ｖｏｌｕｍｅを測定することに
より調べた。タバコ培養細胞におけるザルコトキシンＩ
Ａの阻害効果を実施例として図２に示した。この結果、
用いた濃度下ではザルコトキシンＩＡはタバコ培養細胞
の増殖を全く阻害しないことが示された。またイネにつ
いても全く同様の結果が、さらにザーペシンを用いたタ
バコ、イネ細胞に対する効果も上記と全く同様の結果が
得られた。
【００３３】（実施例３）（ザルコトキシンＩＡ発現カ
セットの構築） (1).シグナルペプチドを有するザルコトキシンＩＡコー
ディング配列の調製 本発明者らによってクローニングされた、ザルコトキシ
ンＩＡのｃＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９，７１
７（１９８６））を含むｐＴＯ１９を鋳型として、配列
番号：１および配列番号：２に示すプライマー１および
プライマー２を用いたＰＣＲ反応により、上記ザルコト
キシンＩＡ ｃＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩサイト、
および３’末端にＳａｃＩサイトを有する、ＤＮＡ断片
を調製した。反応液の組成を表２およびＰＣＲ反応条件
を表３に示す。
セットの構築） (1).シグナルペプチドを有するザルコトキシンＩＡコー
ディング配列の調製 本発明者らによってクローニングされた、ザルコトキシ
ンＩＡのｃＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９，７１
７（１９８６））を含むｐＴＯ１９を鋳型として、配列
番号：１および配列番号：２に示すプライマー１および
プライマー２を用いたＰＣＲ反応により、上記ザルコト
キシンＩＡ ｃＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩサイト、
および３’末端にＳａｃＩサイトを有する、ＤＮＡ断片
を調製した。反応液の組成を表２およびＰＣＲ反応条件
を表３に示す。
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】同様の手法により、シグナルペプチドを有
するザルコトキシンＩＡコーディング配列およびそれ自
身のターミネーター配列より成るザルコトキシンＩＡ
ｃＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩサイト、および３’末
端にＥｃｏＲＩサイトを導入したＤＮＡ配列を調製し
た。
するザルコトキシンＩＡコーディング配列およびそれ自
身のターミネーター配列より成るザルコトキシンＩＡ
ｃＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩサイト、および３’末
端にＥｃｏＲＩサイトを導入したＤＮＡ配列を調製し
た。
【００３７】（２）上記コーディング領域と高発現プロ
モーター領域との連結による発現カセット作製 本発明者らにより構築され、１９９３年度日本育種学会
大会で報告した高発現プロモーターを含む、ｐＢＩ１２
１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）由来のベクターを図３に示
す。図中のＰNOSは、ノパリンシンテターゼ遺伝子のプ
ロモーター領域、ＮＰＴIIはネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼIIコーディング領域、ＴNOSはノパリンシ
ンテターゼ遺伝子のターミネーター領域を表す。
モーター領域との連結による発現カセット作製 本発明者らにより構築され、１９９３年度日本育種学会
大会で報告した高発現プロモーターを含む、ｐＢＩ１２
１（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）由来のベクターを図３に示
す。図中のＰNOSは、ノパリンシンテターゼ遺伝子のプ
ロモーター領域、ＮＰＴIIはネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼIIコーディング領域、ＴNOSはノパリンシ
ンテターゼ遺伝子のターミネーター領域を表す。
【００３８】ＥｌはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエン
ハンサー領域（−４１７〜−９０）を表し、本ベクター
では該領域はタンデムに連結されている。（Ｊ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４ ３３３ （１９９
０））。Ｐ３５Ｓは、上記３５Ｓプロモーター領域（−
９０〜−１）である。Ωは、タバコモザイクウィルスの
オメガ配列（Ｇｅｎｅ，２１７，２１７（１９８７））
を表す。図３のベクター中のＰ３５Ｓを含むＨｉｎｄII
I／ＢａｍＨＩ断片を発現カセットのプロモーター配列
とした（図１のＰＳＴ１０の発現プロモーターとして使
用した）。
ハンサー領域（−４１７〜−９０）を表し、本ベクター
では該領域はタンデムに連結されている。（Ｊ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４ ３３３ （１９９
０））。Ｐ３５Ｓは、上記３５Ｓプロモーター領域（−
９０〜−１）である。Ωは、タバコモザイクウィルスの
オメガ配列（Ｇｅｎｅ，２１７，２１７（１９８７））
を表す。図３のベクター中のＰ３５Ｓを含むＨｉｎｄII
I／ＢａｍＨＩ断片を発現カセットのプロモーター配列
とした（図１のＰＳＴ１０の発現プロモーターとして使
用した）。
【００３９】次に、発現効率の高いプロモーターを構築
するため、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターエンハンサー領
域（−２９０〜−９０）を多重連結した。エンハンサー
領域（−２９０〜−９０）を７つ連結し、その上流にさ
らにＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（約６５０ｂｐ）（Ｅ
３５Ｓ）を連結したプロモーターを農業生物資源研究
所、廣近洋彦博士より分与を受けた（図１のＳ−Ｓａｒ
ｃｏの発現プロモーターとして使用した）。
するため、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターエンハンサー領
域（−２９０〜−９０）を多重連結した。エンハンサー
領域（−２９０〜−９０）を７つ連結し、その上流にさ
らにＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（約６５０ｂｐ）（Ｅ
３５Ｓ）を連結したプロモーターを農業生物資源研究
所、廣近洋彦博士より分与を受けた（図１のＳ−Ｓａｒ
ｃｏの発現プロモーターとして使用した）。
【００４０】次に感染特異的タンパク（ＰＲタンパク）
ＰＲ１ａをコードするゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＰＲ−γ（Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒ，２２５，２４３
（１９８７））を鋳型とし、配列番号：７に示すプライ
マー７及び配列番号：８に示すプライマー８を用いたＰ
ＣＲ反応により、ＰＲ１ａプロモーター９３０塩基対を
含み、翻訳開始コドンの１塩基上流までのＤＮＡ断片を
調製した。本断片の５’末端はＸｈｏＩサイトとなって
おり、３’末端はＢａｍＨＩサイトとなっている。一方
同じプラスミドｐＰＲ−γより、プロモーター領域の−
２４００から−９０２までの領域を含むＤＮＡ断片をＥ
ｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって切り出した。このＤＮＡ
断片の５’末端はＥｃｏＲＩサイトであり、３’末端は
ＸｈｏＩサイトとなっているため、上記９３０塩基対を
含むＤＮＡ断片と結合した。更にこの結合された断片の
５’末端を通常の手法によってＨｉｎｄIIIサイトに変
換した。その結果最終的に本ＤＮＡ断片はＰＲ１ａ遺伝
子のプロモーター領域の−２４００から翻訳開始コドン
の１塩基上流までを含み、５’末端はＨｉｎｄIIIサイ
トおよび３’末端はＢａｍＨＩサイトを有する。
ＰＲ１ａをコードするゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＰＲ−γ（Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒ，２２５，２４３
（１９８７））を鋳型とし、配列番号：７に示すプライ
マー７及び配列番号：８に示すプライマー８を用いたＰ
ＣＲ反応により、ＰＲ１ａプロモーター９３０塩基対を
含み、翻訳開始コドンの１塩基上流までのＤＮＡ断片を
調製した。本断片の５’末端はＸｈｏＩサイトとなって
おり、３’末端はＢａｍＨＩサイトとなっている。一方
同じプラスミドｐＰＲ−γより、プロモーター領域の−
２４００から−９０２までの領域を含むＤＮＡ断片をＥ
ｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって切り出した。このＤＮＡ
断片の５’末端はＥｃｏＲＩサイトであり、３’末端は
ＸｈｏＩサイトとなっているため、上記９３０塩基対を
含むＤＮＡ断片と結合した。更にこの結合された断片の
５’末端を通常の手法によってＨｉｎｄIIIサイトに変
換した。その結果最終的に本ＤＮＡ断片はＰＲ１ａ遺伝
子のプロモーター領域の−２４００から翻訳開始コドン
の１塩基上流までを含み、５’末端はＨｉｎｄIIIサイ
トおよび３’末端はＢａｍＨＩサイトを有する。
【００４１】以上で得られたプロモーター配列と（１）
で得られたザルコトキシンＩＡコーディング配列とを互
いのＢａｍＨＩサイトで常法により結合させた。
で得られたザルコトキシンＩＡコーディング配列とを互
いのＢａｍＨＩサイトで常法により結合させた。
【００４２】さらに上記ｐＰＲ−γを鋳型として、配列
番号：３に示す、プライマー３および配列番号：４に示
す、プライマー４を用いて上記と同様のＰＣＲ反応によ
りＰＲ１ａのプロモーター９３０塩基対およびシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ断片で調製した。本断片は
５’末端にＢａｍＨＩサイトを有し、３’末端は平滑末
端となっている。一方、ザルコトキシンＩＡ成熟ペプチ
ド部分は、上記と同様に配列番号５：に示すプライマー
５および配列番号６に示すプライマー６を用いたＰＣＲ
反応により調製した。本断片の５’末端は平滑末端とな
っており、３末端はＥｃｏＲＩサイトとなっている為、
ＰＲ１ａ遺伝子のプロモーター配列およびシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ断片と結合した。
番号：３に示す、プライマー３および配列番号：４に示
す、プライマー４を用いて上記と同様のＰＣＲ反応によ
りＰＲ１ａのプロモーター９３０塩基対およびシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡ断片で調製した。本断片は
５’末端にＢａｍＨＩサイトを有し、３’末端は平滑末
端となっている。一方、ザルコトキシンＩＡ成熟ペプチ
ド部分は、上記と同様に配列番号５：に示すプライマー
５および配列番号６に示すプライマー６を用いたＰＣＲ
反応により調製した。本断片の５’末端は平滑末端とな
っており、３末端はＥｃｏＲＩサイトとなっている為、
ＰＲ１ａ遺伝子のプロモーター配列およびシグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ断片と結合した。
【００４３】以上により本発明の発現カセット、ＰＳＴ
１０、Ｓ−Ｓａｒｃｏ、Ｓ−１２、４−１５を得た。コ
ントーロール発現カセットとしてｐＢＩ１２１の３５Ｓ
−ＧＵＳ領域を得た。これらの構造を図１に示す。図中
のＥｎ３５Ｓは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサー領域（−４１７〜−９０）、Ｐ３５Ｓは、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター（−９０〜−１）、Ωはタバコモ
ザイクウィルスのオメガ配列（Ｇｅｎｅ，２１７，２１
７（１９８７））、ＳｉｇはザルコトキシンＩＡのシグ
ナルペプチドコーディング領域、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ
はザルコトキシンＩＡの成熟ペプチドコーディング領
域、ＴNOSがノパリンシンテターゼ遺伝子のターミネー
ター領域、ＥｎはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサー領域（−２９０〜−９０）、Ｅ３５ＳはＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター（約６５０ｂｐ）領域、ＴPRはＰＲ
１ａのターミネーター領域、Ｓ−１２におけるＰＲ１ａ
は、約２．４ｋｂのＰＲ１ａプロモーター領域、Ｔｓａ
ｒｃｏはザルコトキシンＩＡｃＤＮＡのターミネーター
領域、４−１５におけるＰＲ１ａは、約０．９９ｋｂの
ＰＲ１ａプロモーター領域、ＳｉｇＰＲは、ＰＲ１ａシ
グナルペプチド領域、およびコントロールにおけるＧＵ
Ｓは、β−グルクロニダーゼ構造遺伝子を表す。
１０、Ｓ−Ｓａｒｃｏ、Ｓ−１２、４−１５を得た。コ
ントーロール発現カセットとしてｐＢＩ１２１の３５Ｓ
−ＧＵＳ領域を得た。これらの構造を図１に示す。図中
のＥｎ３５Ｓは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサー領域（−４１７〜−９０）、Ｐ３５Ｓは、ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター（−９０〜−１）、Ωはタバコモ
ザイクウィルスのオメガ配列（Ｇｅｎｅ，２１７，２１
７（１９８７））、ＳｉｇはザルコトキシンＩＡのシグ
ナルペプチドコーディング領域、Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ
はザルコトキシンＩＡの成熟ペプチドコーディング領
域、ＴNOSがノパリンシンテターゼ遺伝子のターミネー
ター領域、ＥｎはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのエンハ
ンサー領域（−２９０〜−９０）、Ｅ３５ＳはＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター（約６５０ｂｐ）領域、ＴPRはＰＲ
１ａのターミネーター領域、Ｓ−１２におけるＰＲ１ａ
は、約２．４ｋｂのＰＲ１ａプロモーター領域、Ｔｓａ
ｒｃｏはザルコトキシンＩＡｃＤＮＡのターミネーター
領域、４−１５におけるＰＲ１ａは、約０．９９ｋｂの
ＰＲ１ａプロモーター領域、ＳｉｇＰＲは、ＰＲ１ａシ
グナルペプチド領域、およびコントロールにおけるＧＵ
Ｓは、β−グルクロニダーゼ構造遺伝子を表す。
【００４４】（３）発現カセットのｐＢＩ１２１への導
入 市販のｐＢＩ１２１をＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩで切断
し、ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび
ＧＵＳを除いた後、上記（２）で作製した発現カセット
をＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩに導入した。
入 市販のｐＢＩ１２１をＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩで切断
し、ｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよび
ＧＵＳを除いた後、上記（２）で作製した発現カセット
をＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩに導入した。
【００４５】実施例４（発現カセットのタバコへの導入
による組換えタバコの作成） （１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓの形質転換 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
のＬＢＡ４４０４株（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を２５０μ
ｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌのリフ
ァンピシンを含むＬ培地中、２８℃で培養し、Ｎａｇｅ
ｌら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．，６７，３２
５（１９９０））の方法に従って、細胞懸濁液を調製
し、実施例３で作成した各発現カセットを含むプラスミ
ドを各々エレクトロポレーションにより、上記菌株に導
入した。上記Ｌ培地で２８℃，３日培養し、各々形質転
換体を得た。
による組換えタバコの作成） （１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓの形質転換 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
のＬＢＡ４４０４株（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を２５０μ
ｇ／ｍｌのストレプトマイシンと５０μｇ／ｍｌのリフ
ァンピシンを含むＬ培地中、２８℃で培養し、Ｎａｇｅ
ｌら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．，６７，３２
５（１９９０））の方法に従って、細胞懸濁液を調製
し、実施例３で作成した各発現カセットを含むプラスミ
ドを各々エレクトロポレーションにより、上記菌株に導
入した。上記Ｌ培地で２８℃，３日培養し、各々形質転
換体を得た。
【００４６】（２）タバコの形質転換 上記（１）で得られた形質転換Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４をＹＥ
Ｂ培地（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ 第２巻７８頁）で振
とう培養（２８℃，２００ｒｐｍ）した後、滅菌水で２
０倍に希釈し、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｔａｂａ
ｃｕｍ Ｓａｍｍｓｕｎ ＮＮを供試）の葉片を共存培
養した。２〜３日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を
除去し、２週間ごとに選択培地で継代し、形質転換した
タバコ細胞を選抜し、常法によりカルスを誘導し、植物
体に両分化した。本明細書では、これらカルスより再分
化した植物帯をＲ0世代と規定する。
ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ＬＢＡ４４０４をＹＥ
Ｂ培地（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ 第２巻７８頁）で振
とう培養（２８℃，２００ｒｐｍ）した後、滅菌水で２
０倍に希釈し、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ Ｔａｂａ
ｃｕｍ Ｓａｍｍｓｕｎ ＮＮを供試）の葉片を共存培
養した。２〜３日後、抗生物質を含む培地で上記細菌を
除去し、２週間ごとに選択培地で継代し、形質転換した
タバコ細胞を選抜し、常法によりカルスを誘導し、植物
体に両分化した。本明細書では、これらカルスより再分
化した植物帯をＲ0世代と規定する。
【００４７】得られた再分化植物は、順化し、自家受粉
させ、Ｒ0世代の自殖次世代を得た。本明細書中ではこ
の世代をＲ1世代と規定する。
させ、Ｒ0世代の自殖次世代を得た。本明細書中ではこ
の世代をＲ1世代と規定する。
【００４８】図１中の各発現カセットが導入された組換
えタバコのいずれの系統もＲ1世代の種子を多数得た。
これらは、カナマイシン含有（１００μｇ／ｍｌ）ＭＳ
寒天培地上に播種し、各発現カセットを伴に導入された
ｐＢＩ１２１由来のＮＰＹII発現によるカナマイシン抵
抗性の有無で発現カセットの導入されたＲ1のみを選択
し栽培を行った。
えタバコのいずれの系統もＲ1世代の種子を多数得た。
これらは、カナマイシン含有（１００μｇ／ｍｌ）ＭＳ
寒天培地上に播種し、各発現カセットを伴に導入された
ｐＢＩ１２１由来のＮＰＹII発現によるカナマイシン抵
抗性の有無で発現カセットの導入されたＲ1のみを選択
し栽培を行った。
【００４９】（実施例５）（Ｒ1世代組換えタバコのノ
ーザン解析） Ｒ1世代で、上記の各発現カセットがｍＲＮＡレベルで
発現することを確認する為、ノーザン解析を常法により
行った。プローブとして、本発明の発現カセット中に含
まれるザルコトキシン成熟ペプチドコーディング領域を
α−３２ＰｄＣＴＰでＲＩラベルした断片を使用した。
ーザン解析） Ｒ1世代で、上記の各発現カセットがｍＲＮＡレベルで
発現することを確認する為、ノーザン解析を常法により
行った。プローブとして、本発明の発現カセット中に含
まれるザルコトキシン成熟ペプチドコーディング領域を
α−３２ＰｄＣＴＰでＲＩラベルした断片を使用した。
【００５０】解析結果のオートラジオグラムを図４に示
す。レーン１はコントロール植物、レーン２は図１の３
５−ＧＵＳ導入タバコ、レーン３は図１のＳ−Ｓａｒｃ
ｏ導入タバコ、およびレーン４〜７は図１のＰＳＴ１０
導入タバコの各々Ｒ1世代である（カナマイシン抵抗
性）、また、レーン８は、図１のＳ−Ｓａｒｃｏ導入タ
バコの次世代であるが、カナマイシン感受性のＲ1世代
である。
す。レーン１はコントロール植物、レーン２は図１の３
５−ＧＵＳ導入タバコ、レーン３は図１のＳ−Ｓａｒｃ
ｏ導入タバコ、およびレーン４〜７は図１のＰＳＴ１０
導入タバコの各々Ｒ1世代である（カナマイシン抵抗
性）、また、レーン８は、図１のＳ−Ｓａｒｃｏ導入タ
バコの次世代であるが、カナマイシン感受性のＲ1世代
である。
【００５１】レーン１、２および８ではシグナルが認め
られず、レーン３〜７に明確な上記プローブとハイブリ
ダイズするシグナルが認められる。従って、本発明の発
現カセットは安定して自殖次世代植物に遺伝継承され得
る。
られず、レーン３〜７に明確な上記プローブとハイブリ
ダイズするシグナルが認められる。従って、本発明の発
現カセットは安定して自殖次世代植物に遺伝継承され得
る。
【００５２】（実施例６）（ザルコトキシン遺伝子を導
入した植物のタバコ野火病菌抵抗性の検定） Ｒ1世代の形質転換タバコの葉の表面に、６０本の細針
の束で傷をつけ、野火病菌（５×１０7／ｍｌ）を傷面
に塗布した。５日後に病微の程度を判定した。結果を表
４に示す。
入した植物のタバコ野火病菌抵抗性の検定） Ｒ1世代の形質転換タバコの葉の表面に、６０本の細針
の束で傷をつけ、野火病菌（５×１０7／ｍｌ）を傷面
に塗布した。５日後に病微の程度を判定した。結果を表
４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】この結果、ザルコトキシン遺伝子が導入さ
れたタバコから、自家受粉によって得られた次世代（Ｒ
１）植物に安定してこの遺伝子が遺伝し、しかもこれが
Ｒ１植物で発現することにより細菌病抵抗性が示された
ことが明らかになった。
れたタバコから、自家受粉によって得られた次世代（Ｒ
１）植物に安定してこの遺伝子が遺伝し、しかもこれが
Ｒ１植物で発現することにより細菌病抵抗性が示された
ことが明らかになった。
【００５５】実施例７（抗菌性タバコの軟腐病菌に対す
る抗菌性試験） ６ｃｍの滅菌プラスチックシャーレ中に５ｍｌの滅菌水
をいれ直径１ｃｍの円状に切りぬいた抗菌性タバコの葉
を６枚を脱イオン水でよく洗浄した後いれて、３日間、
２８℃でゆるやかに浸透しながらインキュベートした。
この中には当初１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの軟腐病菌（Ｅ．
Ｃａｒｏｔｏｖａｒａ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖ
ｏｒａ）を加えておいた。
る抗菌性試験） ６ｃｍの滅菌プラスチックシャーレ中に５ｍｌの滅菌水
をいれ直径１ｃｍの円状に切りぬいた抗菌性タバコの葉
を６枚を脱イオン水でよく洗浄した後いれて、３日間、
２８℃でゆるやかに浸透しながらインキュベートした。
この中には当初１０6ｃｅｌｌ／ｍｌの軟腐病菌（Ｅ．
Ｃａｒｏｔｏｖａｒａ ｓｕｂｓｐ．ｃａｒｏｔｏｖ
ｏｒａ）を加えておいた。
【００５６】３日後、その一部をとり、ＬＢ培地にまい
てコロニーをカウントした。当初の細胞数を１０6／ｍ
ｌを１として、以下に結果を示す。
てコロニーをカウントした。当初の細胞数を１０6／ｍ
ｌを１として、以下に結果を示す。
【００５７】
【表５】
【００５８】尚、葉を加えないコントロールは３日間で
０．１に減少した。コントロールとは非組み換えタバコ
植物由来の葉である。
０．１に減少した。コントロールとは非組み換えタバコ
植物由来の葉である。
【００５９】上記の結果は、抗菌性ペプチドを生産して
いる組換えタバコの葉組織からザルコトキシンＩＡが細
胞間隙に分泌され、シャーレ中の軟腐病菌を含む水溶中
に溶け出したために、この細菌の増殖を阻害したことを
示している。即ち、この抗菌性ペプチドのシグナルペプ
チドが正常に切断され、成熟ペプチドとして細胞外に分
泌されることにより抗菌性が示されたものと考えられ
る。
いる組換えタバコの葉組織からザルコトキシンＩＡが細
胞間隙に分泌され、シャーレ中の軟腐病菌を含む水溶中
に溶け出したために、この細菌の増殖を阻害したことを
示している。即ち、この抗菌性ペプチドのシグナルペプ
チドが正常に切断され、成熟ペプチドとして細胞外に分
泌されることにより抗菌性が示されたものと考えられ
る。
【００６０】
【発明の効果】本発明の発現カセット、ベクターを植物
細胞を導入することにより、昆虫由来の抗菌性ペプチド
を生産する植物体が得られる。病原菌に抵抗性のある植
物新品種が提供される。
細胞を導入することにより、昆虫由来の抗菌性ペプチド
を生産する植物体が得られる。病原菌に抵抗性のある植
物新品種が提供される。
【００６１】
【００６２】
【配列番号：１】 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 ＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣ ＡＡＣＡＴＧＡＡＴＴ ＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴ ＴＴＴ
Ｃ ３４
Ｃ ３４
【００６３】
【配列番号：２】 配列の長さ：35 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 ACGTGAGCTC TTAACCTCTG GCTGTAGCAG CAACA 35
【００６４】
【配列番号：３】 配列の長さ：30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 CCAGAAGCTT GATTTCAAAC TCTAGCTTCA 30
【００６５】
【配列番号：４】 配列の長さ：20 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 ＧＧＣＡＣＧＧＣＡＡ ＧＡＧＴＧＧＧＡＴＡ
２０
２０
【００６６】
【配列番号：５】 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 GGTTGGTTGA AAAAGATTGG 20
【００６７】
【配列番号：６】 配列の長さ：30 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 TAGCGAATTC CTTAAAATTT TTATTACAAT 30
【００６８】
【配列番号：７】 配列の長さ：24 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 AGCTCTCGAG GATTTCAAAC TCTA 24
【００６９】
【配列番号：８】 配列の長さ：28 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：プライマー 配列 AGCTGGATCC GACTATAGGA GAAATGTT 28
【図１】本発明の発現カセットを示す。
【図２】ザルコトキシンのタバコの成育に対する影響を
示す図である。
示す図である。
【図３】ｐＢＩ１２１由来のベクターを示す。
【図４】ノーザン解析によるオートラジオグラムを示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ 42［２ ］（1992）ｐ．180−181 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】 双翅目昆虫由来の、他の蛋白質と融合し
ていない抗菌性ペプチドを植物細胞で発現しうる、発現
カセットであって、ここでプロモーターDNA配列と該抗
菌性ペプチドをコードするDNA配列とが発現可能な状態
で結合され、該抗菌性ペプチドが植物細胞で分泌される
ように構築されている、発現カセット。 - 【請求項２】 前記抗菌性ペプチドが、ザルコトキシン
ＩＡ、ザーペシンまたは抗真菌蛋白のいづれかである請
求項１記載の発現カセット。 - 【請求項３】 前記発現カセットが、ザルコトキシンＩ
Ａのシグナル配列とザルコトキシンｃＤＮＡとを含む、
請求項１又は２に記載の発現カセット。 - 【請求項４】 請求項１ないし３いづれかの項記載の発
現カセットを有するベクター。 - 【請求項５】 請求項１ないし３いづれかの項記載の発
現カセット又は請求項４のベクターを有する抗菌性植物
細胞。 - 【請求項６】 請求項１ないし３いづれかの項記載の発
現カセット又は請求項４のベクターを有する抗菌性植物
体。 - 【請求項７】 前記抗菌性植物体がタバコ、トマト、レ
タス、白菜、イネ、オオムギ、コムギ、ジャガイモ、カ
ンキツ類、モモ、およびリンゴからなる群から選ばれる
請求項６に記載の植物体。 - 【請求項８】 請求項１ないし３いづれかの項記載の発
現カセット又は請求項４のベクターを植物細胞に導入す
ることを包含する抗菌性植物細胞又は抗菌性植物体を作
出する方法。 - 【請求項９】 請求項６又は７の植物体を交配させた抗
菌性植物体であって、１又は２以上の異なる抗菌性ペプ
チドを発現する植物体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6040190A JP2955643B2 (ja) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | 抗菌性植物及びその作出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6040190A JP2955643B2 (ja) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | 抗菌性植物及びその作出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07250685A JPH07250685A (ja) | 1995-10-03 |
| JP2955643B2 true JP2955643B2 (ja) | 1999-10-04 |
Family
ID=12573863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6040190A Expired - Lifetime JP2955643B2 (ja) | 1994-03-10 | 1994-03-10 | 抗菌性植物及びその作出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2955643B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6750381B2 (en) * | 1996-03-25 | 2004-06-15 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Pathogen-resistant plants transformed with a DNA encoding sarcotoxin 1A linked to a signal peptide and a method for production thereof |
| US8373021B2 (en) | 2005-05-26 | 2013-02-12 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Improving disease resistance in plants by introducing transcription factor gene |
| JP5858368B2 (ja) | 2011-03-10 | 2016-02-10 | 国立研究開発法人農業生物資源研究所 | 農業形質を最適化した複合病害抵抗性単子葉植物 |
| US9605271B2 (en) | 2013-01-23 | 2017-03-28 | National Institute Of Agrobiological Sciences | Disease resistant plant expressing WRKY45 under control of infection-responsive promoter |
-
1994
- 1994-03-10 JP JP6040190A patent/JP2955643B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂｒｅｅｄ ４２［２］（１９９２）ｐ．１８０−１８１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07250685A (ja) | 1995-10-03 |
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