CN102301946A - 一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物新种质创建领域，具体的说是属于黄籽甘蓝型油菜新种质的创建方法的发明。涉及十字花科芸薹属内的远缘杂交技术和常规田间杂交技术。选择具有黄籽性状的白菜（染色体组为AA，n＝10）和黄籽性状的甘蓝（染色体组为CC，n＝9）为亲本，两者杂交后利用胚抢救技术和染色体加倍技术得到异源四倍体杂种苗，即为甘蓝型油菜（染色体组成为AACC，n＝19），花期开放授粉后收获种子。次年种植于大田，在花期采用人工两两单株套袋的方式杂交并收获种子，筛选偏黄种子的株系，经系谱法选择得到黄籽甘蓝型油菜种质。此方法不仅具有效率高、选育周期短的优点，而且得到的黄籽种质可用于黄籽甘蓝型油菜品种的选育。

Description

一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法

技术领域

本发明属于作物的新种质创建领域，具体的说是属于甘蓝型油菜黄籽新种质的创建方法的发明。涉及十字花科芸薹属内的远缘杂交技术和常规田间杂交技术。

背景技术

油菜为十字花科芸薹属栽培植物，而甘蓝型油菜则是芸薹属中作为油料作物的主要栽培种。日本学者盛永、禹长春等人（实用油菜栽培学，刘后利主编，上海科学技术出版社，1987，p37-40），通过对芸薹属内植物不同的种间杂交及其杂种细胞学研究，提出了“禹氏三角”的模型，即十字花科芸薹属的三个基本种为甘蓝（染色体组为CC，n＝9）、白菜（染色体组为AA，n＝10）和黑芥（染色体组为BB，n＝8），三者两两杂交分别可人工合成三个异源四倍体复合种甘蓝型油菜（染色体组为AACC，n＝19）、荠菜型油菜（染色体组为AABB，n＝18）和埃芥（染色体组为BBCC，n＝17）。它首次系统的在理论上明确了采用甘蓝（染色体组为CC，n＝9）和白菜（染色体组成为AA，n＝10）可以定向的合成甘蓝型油菜（染色体组为AACC，n＝19）。该模型也在随后大量的人工合成实践中得到证实。近年来，随着甘蓝型油菜应用研究的迅速深入，甘蓝型油菜的遗传资源也日显狭窄。研究者积极通过采用不同的甘蓝和白菜品系来合成甘蓝型油菜新品系，以扩充甘蓝型油菜种质的遗传基础。

黄籽油菜，顾名思义，是指种子颜色表现为偏黄色至纯黄色的甘蓝型油菜。黄籽油菜所生产的菜籽以其含油量相对较高、纤维素少、油脂鲜亮等优点，在国际市场具有较高的竞争力，因此黄籽性状是现今油菜育种上一个十分重要的目标。黄籽油菜品种的选育离不开黄籽种质的利用，因此创建新的黄籽甘蓝型油菜种质，扩大黄籽基因源是促进我国黄籽油菜品种选育的一个重要内容。

黄籽油菜种质创建的方法很多，大致有以下几种：1）利用天然突变技术人工定向选择黄籽种质。在自然界中，甘蓝型油菜本身具有一些偏向于黄籽的种子颜色，如棕黄、浅黄等，通过人工定向选择，将偏黄的种子选出播种，多代选择，有可能选育出具有黄籽性状的株系。该方法是较传统的黄籽选育方法，但存在选育时间长、株系经济性状差等缺点；2）利用诱变技术改变基因序列从而获得具有黄籽突变进而选择黄籽材料。利用物理的射线或化学的诱变剂对种子等外植体进行诱变，在后代分离群体中寻找具有黄籽性状的单株，再结合定向选择获得黄籽种质。该方法存在诱变方向不明确、工作量极大、选育时间很长等缺点；3）利用转基因技术将外源黄籽基因转入油菜中获得黄籽材料。随着现代分子生物学和转基因技术的不断完善，将外源黄籽基因转入油菜已相对容易，但由于缺乏已知的黄籽基因、基因表达不稳定以及性状不表现等诸多缺陷，到目前为止，该技术在油菜黄籽研究领域还未能进入实用阶段；4）利用芸薹属黄籽原始亲本进行远缘杂交获得黄籽材料。已有研究者利用该方法获得黄籽甘蓝型油菜种质。但此法成功率相对较低。

以上方法在实用中均具有各自的优点和缺点。在黄籽甘蓝型油菜的种质创建过程中，仍需要一种成功率更高的方法。

发明内容：

技术问题  本发明的目的就是针对目前我国黄籽油菜种质创建效率不高的现状，利用现有芸薹属原始亲本的黄籽资源创建黄籽甘蓝型油菜新种质，扩大黄籽油菜种质资源，从而获得能够商业化利用的新的基因资源，以提高我国商品油菜籽的优质化，提升其国际竞争力。同时该技术仅涉及远缘杂交技术和常规田间杂交技术，比较容易操作而且具有较高的成功率。

技术方案

一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法，包括：

1）原始亲本：采用具有黄籽性状的甘蓝品种（系）和黄籽性状的白菜品种（系）杂交；

2）远缘杂交：采用花期人工授粉，并结合胚抢救和染色体加倍技术获得四倍体杂种；通过对F1代胚抢救、染色体加倍技术和人工进行自交授粉后得到四倍体远缘杂种；

3）细胞学鉴定：对获得的杂种进行细胞学鉴定，确认所获得杂交种为甘蓝型油菜（染色体组为AACC，n＝19）；

4）开放授粉：杂种种植后采取开放授粉获得后代种子；

5）杂交：后代单株采用两两套袋杂交的方式促进黄籽基因的组合，对具有黄籽性状的株系进行系谱法选择，进而获得黄籽甘蓝型油菜新种质。

所述胚抢救为：将胚取出放于MS培养基上，待其长成小苗后，移栽入大田；

所述染色体加倍技术为：在远缘杂种花期，对杂种单株的花蕾喷施0.5g/L的秋水仙素溶液，连续喷施7天，待发现其花药具有花粉，证实加倍成功；

所述细胞学鉴定为：于杂种花期取花蕾固定压片，并选取处于中期或后期的花粉母细胞进行染色体数目计数，若为19对，该杂种即是甘蓝型油菜，染色体组为AACC，n＝19。

有益效果

本发明的技术思路是：

1、选择黄籽的甘蓝和白菜品种（系），保证在后代选择中具有黄籽基因来源；

2、远缘杂种开放授粉，不仅让两原始亲本的黄籽微效基因在杂种内互作，而且使原始亲本中黄籽基因位点的等位基因能够重新组合；

3、采用两两杂交的方式进一步促进黄籽基因在内部重组进而提高黄籽出现频率，提高新种质选择效果。

本发明主要技术效果：

1、采用具有黄籽性状的原始亲本，可保证后代具有黄籽基因来源；

2、杂种后代开放授粉加速黄籽基因重组，可提高分离世代选择到黄籽种质的频率；

3、两两套袋杂交进一步促进黄籽基因内部重组，促进黄籽种质出现。

本发明具体实施方式

一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法，包括：

1、原始亲本选择：选取我国较为广泛存在的黄籽白菜和黄籽甘蓝资源；

2、远缘杂交：采用花期人工授粉，并结合胚抢救和染色体加倍技术获得四倍体杂种；

3、开放授粉：由于甘蓝与白菜杂交后代多表现为自交不亲合，因此采取开放授粉获得后代种子；

4、后代单株两两杂交：采用两两套袋杂交的方式促进黄籽基因的迅速组合，提高黄籽种质出现频率；

5，常规选择黄籽种质：利用目测比较，系谱法选择获得黄籽甘蓝型油菜新种质。

实施时间：2005-2009年度

实施地点：江苏省农业科学院经济作物所油菜育种试验田

实施方案：2005年秋田间种植黄籽白菜品种扬油3号（江苏省油菜审定品种）和黄籽甘蓝品种青峰（国家甘蓝审定品种），2006年春季花期以扬油3号为母本，于当日午后人工授以甘蓝花粉，随后套袋以免外来花粉传入，约20-25天后，选取具有膨大状角果（仍呈现绿色的角果）进行胚抢救处理，即将胚取出放于MS培养基上，待其长成小苗后，于2006年秋季移栽入大田。2007年春季花期，对杂种株的花蕾喷施0.5mg/L的秋水仙素溶液，连续喷施7天，发现其花药具有花粉，证实加倍成功，随后进行人工自交授粉，套袋，得到杂种种子。

2007年秋季播种大田，2008年春季花期杂种开花正常。于蕾期取长度约2mm的花蕾直接放入卡诺固定液中固定，直至花蕾褪色变白。从幼嫩花蕾中任意取出花药并捣碎，滴加番红染液，镜检选择具有减数分裂时期花粉母细胞的花蕾。中选花蕾重新放入固定液中-20℃保存备用。然后将花药从中选花蕾中剥出，置于柠檬酸缓冲液中静置20分钟后，取出吸干水分，酸解后，采用卡宝品红染液染色，压片后镜检观察。染色体计数后发现杂种为19对染色体，因此确认其染色体组组成为AACC（n＝19），即为甘蓝型油菜。

选取部分单株套袋，其余开放授粉，收获时发现套袋分支未收到一粒种子，而未套袋分支结实良好，说明远缘杂种表现为高度自交不亲合。故收取开放结实种子。2008年秋种植该种子，2009年花期采取大量（约100对）两两单株套袋的方式进行杂交，收获种子时获得14份黄籽率>90％的株系（比率达14%），其中黄籽率≥95％、含油量大于43％的材料有5份，这在甘蓝型油菜新种质选育中比率已经很可观，较常规选育频率高。因此这些黄籽株系为定向合成的具有实用价值的新型黄籽甘蓝型油菜种质。

实施效果：仅经过4年的时间即得到基因组组成为AACC（n＝19）的黄籽甘蓝型油菜新种质14份，这在油菜新种质创建中具有相对较高的效率。本方法是利用具有黄籽性状的原始亲本，故在后期的选择中有的放矢，比利用其它方法创建黄籽新种质具有较高的成功率。

Claims (3)

1.一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法，其特征在于：

1）原始亲本均具有黄籽性状；

2）远缘杂交：采用花期人工授粉，并结合胚抢救和染色体加倍技术获得四倍体杂种；通过对F1代胚抢救、染色体加倍技术和人工进行自交授粉后得到四倍体远缘杂种；

3）细胞学鉴定：对获得的杂交种进行细胞学鉴定，确认所获得杂种为甘蓝型油菜；

4）开放授粉：杂种种植后采取开放授粉的方式获得后代种子；

5）杂交：后代单株采用两两套袋杂交的方式促进黄籽基因的组合，对具有黄籽性状的株系进行系谱法选择，进而获得黄籽甘蓝型油菜新种质。

2.根据权利要求1所述一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法，其特征在于所述原始亲本为具有黄籽性状的白菜品种，染色体组为AA，n＝10和具有黄籽性状的甘蓝品种，染色体组为CC，n＝9。

3.根据权利要求1或2所述一种黄籽甘蓝型油菜种质的创建方法，其特征在于：

所述胚抢救为：将杂种胚取出后放于MS培养基上，待其长成小苗后，移栽入大田；

所述染色体加倍技术为：在远缘杂种花期，对杂种单株的花蕾喷施0.5g/L的秋水仙素溶液，连续喷施7天，待发现其花药具有花粉，证实加倍成功；

所述细胞学鉴定为：于杂种花期取花蕾固定压片，并选取处于中期或后期的花粉母细胞进行染色体数目计数，若为19对，该杂种即是甘蓝型油菜，染色体组为AACC，n＝19。