CN101911915A

CN101911915A - 农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基

Info

Publication number: CN101911915A
Application number: CN2010102754397A
Authority: CN
Inventors: 孔芳; 田丽
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Anhui Polytechnic University
Priority date: 2010-09-08
Filing date: 2010-09-08
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基，包括基本培养基(MS)以及基于所述基本培养基的预培养基(B₀)、共培养基(B₁)、分化筛选培养基(B₂)、生根培养基(B₃)以及壮苗培养基。所述培养基通过采用一定浓度的相应物质配制而成，适应于油菜下胚轴转化的各个阶段的需求，克服了转化过程中诸多因素的影响，实现了提高油菜下胚轴转化率的目的，具有制备简单、原料易得、使用方便、高效的特点。

Description

农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基

技术领域

本发明涉及生化培养基领域，更具体地，是一种通过农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基。

背景技术

植物转基因受体系统是指选择合适的器官、组织或细胞进行转基因后，能通过组织培养或其它途径再生出新生植株的无性繁殖体系。因此，适宜的油菜转基因受体系统的建立，是创造转基因油菜的关键环节。众所周知，芸薹属油菜在转化过程中存在多种影响因素，如外植体、苗龄、预培养时间、浸染时间、菌液浓度、共培养时间等，都对浸染后的愈伤组织的形成存在各种不同的影响作用，其中，苗龄与转化后愈伤组织的形成关系密切，随着苗龄的增长，下胚轴在侵染后形成愈伤的能力大大减弱，下胚轴的端部不易膨大，易于溃烂并有黑色斑点附着或出现白化或褐化现象；下胚轴在预培养期间，随着培养时间的延长，在转化过程中由于细胞活跃分裂且结构紧密，对农杆菌的侵害具有较强的抗性；随着农杆菌菌液侵染时间的增加，下胚轴在转化后形成为愈伤的比率也会略有增加；随着共培养时间的延长，愈伤分化形成能力受阻，上述因素容易导致转基因油菜转化率低，传统的培养基克服不了上述诸多因素对油菜转化过程所造成的影响，从而导致油菜转化率收到限制。

Moloney等于1989年发现芸薹属植物种子萌发以后，切取带有1-2mm子叶柄末端切口处的细胞不但再生能力强，而且易被农杆菌感染和转化。近年来，国内外许多学者分别以油菜的子叶、下胚轴、茎段为受体进行基因转化，也有采用原生质体受体系统，以原生质体为受体虽能得到高度纯合体，但其再生及分化困难，转化频率低，且操作复杂(段英姿等，2003)。Pua等于1987年建立了油菜茎段再生体系，并以此为受体，转化率为10％。郎春秀等于1999年在油菜农杆菌转基因体系的建立及转PEP反义基因油菜研究中，所用外植体为培养8～10天的无菌苗下胚轴，外植体经农杆菌感染后共培养2天，转入含500mg/L的羧青霉素的MS培养基上，1周后转入含羧青霉素及潮霉素的MS培养基上，以后每2周继代一次，转化频率仅为2.75％。

发明内容

本发明目的在于提供一种农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基，具有促进油菜下胚轴外植体高效再生的特点。

本发明是通过如下技术手段实现的：针对油菜下胚轴转化的不同阶段需要不同化学成分的特点，以特定的基本培养基为基础，加入相应浓度的激素、抗生素等其他组分，配制而成适合不同阶段的特定培养基。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用基本培养基(MS)，包括大量元素、微量元素、有机质、铁盐，其中，

所述大量元素的组成及浓度如下：

CaCl₂·2H₂O (420-450)mg/L；

KH₂PO₄ (165-185)mg/L；

KNO₃ (1800-2000)mg/L；

MgSO₄·7H₂O (360-380)mg/L；

NH₄NO₃ (1600-1700)mg/L；

所述微量元素的组成及浓度如下：

CoCl₂·6H₂O (0.023-0.027)mg/L；

CuSO₄·5H₂O (0.023-0.027)mg/L；

H₃BO₃ (6.0-6.4)mg/L；

KI (0.81-0.84)mg/L；

MnSO₄·H₂O (16.7-17.2)mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O (0.24-0.26)mg/L；

ZnSO₄·7H₂O (8.4-8.8)mg/L；

所述有机质的组成及浓度如下：

甘氨酸 (1.9-2.1)mg/L；

肌醇(环己六醇) (98.0-102.0)mg/L；

烟酸 (0.45-0.53)mg/L；

盐酸吡哆醇(VB₆)(0.46-0.53)mg/L；

盐酸硫胺素(VB₁)(0.08-0.11)mg/L；

所述铁盐为(36.5-36.9)mg/L的EDTA三铁钠盐溶液；

所述培养基的pH值为5.8。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用预培养基(B₀)，包括上述基本培养基(MS)、1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)，所述培养基的PH值为5.8。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用共培养基(B₁)，包括上述基本培养基(MS)、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、5.0mg/L的AgNO₃，所述培养基的PH值为5.8。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用分化筛选培养基(B₂)，包括上述基本培养基(MS)、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、5.0mg/L的AgNO₃、10mg/L卡那霉素(Kanamycin)、500mg/L氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)，所述培养基的PH值为5.8。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用生根培养基(B₃)，包括上述基本培养基(MS)、0.3mg/L萘乙酸(NAA)、10mg/L卡那霉素(Kanamycin)、500mg/L氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)，所述培养基的PH值为5.8。

本发明的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用壮苗培养基，包括1/2上述基本培养基(1/2MS)，所述培养基的PH值为5.8。

按照本发明配方制成的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用培养基，可有效克服油菜下胚轴转化过程中的外植体、苗龄、预培养时间、浸染时间、菌液浓度以及共培养时间等因素的影响，从而促进油菜下胚轴外植体的高效再生，出愈率最高可达47.2％，以下详细介绍本发明对各因素的具体优化效果：

1、苗龄：将在MS培养基上生长4d或5d的甘蓝型油菜幼苗切下其下胚轴，置于B₀培养基预培养3天，在同样菌液浓度条件下侵染25min，置于共培养基(B₁)在暗培养箱中培养3天，换入B₂培养基中分化筛选培养1～2周，观察其再生为愈伤的数目和比率。苗龄为4天的幼苗在转化后出愈率较高，达到29.7％；

2、不同预培养时间下的外植体：下胚轴在预培养期间，随着培养时间的延长，在转化过程中由于细胞活跃分裂且结构紧密，对农杆菌的侵害具有较强的抗性，在4天预培养条件下，其出愈率高达35.3％，3天预培养的外植体的出愈能力也达到22.6％；

3、侵染时间：随着农杆菌菌液侵染时间的增加，下胚轴在转化后形成为愈伤的比率也略有增加，因此侵染25min的下胚轴的出愈率高达36.2％，而侵染20min的下胚轴出愈率亦高达29.7％；

4、共培养时间：随着共培养时间的延长，愈伤分化形成能力受阻，在3天时愈伤的形成率高达47.2％，而4天时出愈率仍达到11.4％。

在对农杆菌介导的油菜下胚轴转化体系的优化过程中，采用接种萌发生长4天的油菜幼苗切取其下胚轴，置于B₀培养基上预培养4天，在菌液中侵染25min，接着置于暗培养箱中暗培养3天，下胚轴侵染3天后换至筛选分化培养基B₂上生长，每隔2～3星期将其继代一次，转入新鲜培养基上。当绿色分裂活跃的愈伤团较大，部分出现墨绿的芽体时，将其转入生根培养基B₃中，经过1～2个月的生长，植株重新分化形成幼苗，并形成根部，在其生根后继续在1/2MS上进行壮苗处理，使其根系更为致密。

具体实施方式

以下描述本发明的优选实施方式，但并非用以限定本发明。

实施例1：

按照如下配方配制相关溶液，其中，称取以下重量的各组分配成10倍大量元素母液：

CaCl₂·2H₂O 4.40g；

KH₂PO₄ 1.70g；

KNO₃ 19.0g；

MgSO₄·7H₂O 3.70g；

NH₄NO₃ 16.50g；

称取以下重量的各组分配成100倍微量元素母液：

CoCl₂·6H₂O 0.0025g；

CuSO₄·5H₂O 0.0025g；

H₃BO₃ 0.62g；

KI 0.083g；

MnSO₄·H₂O 1.69g；

Na₂MoO₄·2H₂O 0.025g；

ZnSO₄·7H₂O 0.86g；

称取以下重量的各组分配成100倍有机质母液：

甘氨酸 0.20g；

肌醇(环己六醇) 10.0g；

烟酸 0.05g；

盐酸吡哆醇(VB₆)0.05g；

盐酸硫胺素(VB₁)0.01g；

称取3.67gEDTA的三铁钠盐配成200倍母液；

称取4gNaOH片状固体溶于100mL重蒸水(ddH₂O)中，得到1mol/L的NaOH溶液，常温放置；

取8.6mL浓盐酸，用重蒸水(ddH₂O)配制成1mol/L的盐酸溶液，常温放置；

称取8.45gAgNO3溶于10mL重蒸水(ddH₂O)中，得到5.0mol/L的AgNO₃溶液，常温放置；

称取0.05g的6-苄基腺嘌呤(6-BA)，加少量NaOH/HCl溶解后再加重蒸水(ddH₂O)至50mL，得到1.0mg/mL的6-BA溶液，常温放置；

称取10mg的2，4-D，加少量NaOH溶解后再加重蒸水(ddH₂O)至100mL，得到0.1mg/mL的2，4-D溶液，常温放置；

称取10mg的萘乙酸(NAA)，溶于100mL的重蒸水(ddH₂O)，得到0.1mg/mL的萘乙酸溶液，常温放置；

称取300mg的乙酰丁香酮(Acetosyringone)，先加7mL甲醇，慢慢搅拌至溶解，再加8mL重蒸水(ddH₂O)，抽滤后得到20mg/mL的乙酰丁香酮溶液，分装后置于-20℃下冷冻保藏；

称取10g氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)溶于40mL重蒸水(ddH₂O)后，过滤除菌，得到250mg/mL的氨噻肟头孢菌素溶液，置于-20℃下冷冻保藏；

称取4g卡那霉素(Kanamycin)溶于80mL重蒸水(ddH₂O)后，过滤除菌，得到250mg/mL的卡那霉素溶液，置于-20℃下冷冻保藏；

按照下表配制相应的培养基：

其中，所述培养基的PH值均通过NaOH/HCl调节至5.8，得到相应种类的产品。

长期实验证明，本实施例所得的培养基具有对油菜下胚轴转化的促进作用，有效提高了出愈率。

Claims

1.一种农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用基本培养基(MS)，其特征在于，包括大量元素、微量元素、有机质、铁盐，其中，

所述大量元素的组成及浓度如下：

CaCl₂·2H₂O (420-450)mg/L；

KH₂PO₄ (165-185)mg/L；

KNO₃ (1800-2000)mg/L；

MgSO₄·7H₂O (360-380)mg/L；

NH₄NO₃ (1600-1700)mg/L；

所述微量元素的组成及浓度如下：

CoCl₂·6H₂O (0.023-0.027)mg/L；

CuSO₄·5H₂O (0.023-0.027)mg/L；

H₃BO₃ (6.0-6.4)mg/L；

KI (0.81-0.84)mg/L；

MnSO₄·H₂O (16.7-17.2)mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O (0.24-0.26)mg/L；

ZnSO₄·7H₂O (8.4-8.8)mg/L；

所述有机质的组成及浓度如下：

甘氨酸 (1.9-2.1)mg/L；

肌醇(环己六醇) (98.0-102.0)mg/L；

烟酸 (0.45-0.53)mg/L；

盐酸吡哆醇(VB₆)(0.46-0.53)mg/L；

盐酸硫胺素(VB₁)(0.08-0.11)mg/L；

所述铁盐为(36.5-36.9)mg/L的EDTA三铁钠盐溶液；

所述培养基的pH值为5.8。

2.一种基于权利要求1的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用预培养基(B₀)，其特征在于，包括上述基本培养基(MS)、1.0mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)，所述培养基的PH值为5.8。

3.一种基于权利要求1的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用共培养基(B₁)，其特征在于，包括上述基本培养基(MS)、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、5.0mg/L的AgNO₃，所述培养基的pH值为5.8。

4.一种基于权利要求1的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用分化筛选培养基(B₂)，其特征在于，包括上述基本培养基(MS)、0.1mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、5.0mg/L的AgNO₃、10mg/L卡那霉素(Kanamycin)、500mg/L氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)，所述培养基的pH值为5.8。

5.一种基于权利要求1的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用生根培养基(B₃)，其特征在于，包括上述基本培养基(MS)、0.3mg/L萘乙酸(NAA)、10mg/L卡那霉素(Kanamycin)、500mg/L氨噻肟头孢菌素(Cefotaxime)，所述培养基的pH值为5.8。

6.一种基于权利要求1的农杆菌介导的油菜下胚轴转化专用壮苗培养基，其特征在于，包括1/2上述基本培养基(1/2MS)，所述培养基的pH值为5.8。