CN104335832A - 植物种子接种禾草内生真菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了可以用于农业育种技术的接种方法，即通过植物种子接种禾草内生真菌的方法。本发明的方案包括接种针的处理，培养瓶的准备，植物种子的处理，接种，幼苗管理和内生真菌的检测等步骤，将带有内生真菌菌丝和孢子的接种针刺穿植物种子，并将种子放置在内生真菌菌落上萌发，使内生真菌侵染并进入植物种子和幼苗，从而达到接种的效果。操作简单，成功率高，有效提高育种选育效率，可以服务于各类型种子公司和品种选育机构，用于新优良品种的选育和市场化。

Description

植物种子接种禾草内生真菌的方法
技术领域
本发明涉及农业育种技术领域，具体是一种通过植物种子接种禾草内生真菌的方法。
背景技术
禾草内生真菌(grass endophyte，fungal endophyte，endophytic fungi)是指生长在植株体内并完成全部或大部生活周期，而禾草不显示外部症状的一大类真菌。很多禾草内生真菌与宿主植物互利共生，为植物带来多种有益性能，如抗虫能力、抗旱能力、抗寒能力、抗病能力、抗线虫能力，还能促进植物的生长、分蘖，提高植物的竞争能力，促进苗期生长和恢复再生，促进植物对磷的利用，促进植物对土壤残留有效磷和氮素的利用，而且还能提高光合作用，提高植物的产量。国际上通过接种禾草内生真菌到经济型禾本科植物中，获得了许多优良的草坪草、牧草等品种，如著名牧草苇状羊茅Kentuky31等，改善了草坪、草场等的品质，并且创造出巨大的经济利益。
由于自然界的禾草内生真菌具有极高的宿主特异性，所以只有通过人工接种才能创造新的“禾草内生真菌-植物”组合，进而筛选出具有更高经济价值的草坪草、牧草等品种。目前，国际上常用的接种方法是“植物幼苗生长点接入禾草内生真菌法”，即暗室培养禾草幼苗迫使其生长点上移，在显微镜下找到植物生长点后用接种针将禾草内生真菌菌丝塞入植物生长点。
然而，“植物幼苗生长点接入禾草内生真菌法”严重破坏植物。通过暗室培养和接种针损害的幼苗往往因为自身的损伤不能正常生长发育而表现出病态，大多数情况没有体现禾草内生真菌的功能。而且，此方法操作周期长，技术要求高，接种成功率只在3/100左右，限制了通过接种禾草内生真菌改良禾本科经济作物的育种工作的进度。
发明内容
本发明的目的在于为利用禾草内生真菌资源改良禾本科经济作物的育种工作提供一种通过植物种子接种禾草内生真菌的方法，将带有内生真菌菌丝和孢子的接种针刺穿植物种子，并将种子放置在内生真菌菌落上萌发，使内生真菌侵染并进入植物种子和幼苗，从而达到接种的效果。
采用本发明提供的“植物种子接种禾草内生真菌的方法”接种后的植株，经过内生真菌检测，植株群特性分析，E+和E-群落形状对比等方法，评估内生真菌对于植物生长的作用，挑选具有优良农艺形状的“禾草内生真菌-植物”组合，同时淘汰无益无效甚至有害的组合，提高育种选育效率；此外，该方法不破坏植物幼苗正常生长，操作简单周期短，成功率高，可以服务于各类型种子公司和品种选育机构，用于新优良品种的选育和市场化。
具体实施方式
1.接种针处理：
选取不锈钢接种针若干，放置于直径90mm的玻璃平皿中，高压蒸汽灭菌锅120℃处理40min后放入无菌操作台冷却待用。在保持接种针韧性的前提下杀死接种针上的微生物，防止其携带的微生物污染植物种子，影响植物生长。
2.培养瓶准备：
选取培养瓶，每个瓶中放入适量内生真菌培养基，高压蒸汽灭菌锅120℃处理40min，冷却后在无菌操作台接种禾草内生真菌，待内生真菌生长3-15天时将接种针转移到菌落上，每个菌落一根接种针，使真菌菌丝和孢子散落到接种针上。
3.植物种子处理：
选取饱满的植物种子若干，每20粒放置在一个250ml锥形瓶中，分别经过50％硫酸，20％酒精处理，无菌水清洗后，排列在90mm玻璃平皿内放入无菌操作台待用。硫酸和酒精处理时间需要根据植物种子情况而定，保证种子存活前提下杀死尽可能多的微生物。
4.接种：
在无菌操作台，利用无菌镊子将接种针取出，刺穿植物种子后放回培养瓶内内生真菌菌落上继续培养。将培养瓶密封后放入培养箱中，使种子正常发芽生长。
5.幼苗管理：
每天观察种子发芽和生长情况，及时清理杂菌。植物幼苗生长2-3天后移栽到盆中，定期浇水施肥。植物幼苗长至高度10cm左右时，将其移栽到田间，任其自然生长繁殖。
6.内生真菌检测：
收集成熟植物种子和茎秆。选取部分种子和茎秆用于检测。种子孟加拉红染液处理后压片，在显微镜下观察内生真菌菌丝体。茎秆刮取其髓质染色，在显微镜下观察菌丝体。从而获得接种成功的植株和种子。

Claims (2)

1.一种通过植物种子接种禾草内生真菌的方法，其特征是将接种针刺穿植物种子，并将种子放置在内生真菌菌落上萌发，使内生真菌侵染并进入植物种子和幼苗，从而达到接种的效果，有效淘汰无效无益组合，提高选育效率。
2.根据权利要求1所述接种方法，其特征是：接种针刺穿植物种子前放置在内生真菌菌落上，其表面沾有内生真菌菌丝和孢子。
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