CN104250620A

CN104250620A - 一株厚垣孢镰刀菌株及其应用

Info

Publication number: CN104250620A
Application number: CN201410492924.8A
Authority: CN
Inventors: 李健; 李美; 高兴祥; 房锋
Original assignee: Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2034-09-24
Also published as: CN104250620B

Abstract

本发明涉及镰刀菌株技术领域，特别涉及一株厚垣孢镰刀菌株ZC201301，保藏编号为CGMCC No.9562。从田间天然发病的马唐叶片上分离得到，对马唐具有强烈、快速的致病力，室内实验证明，将本发明菌株的孢子喷洒到马唐叶片上，2天后，马唐即出现斑点和枯死症状，14天后对马唐的鲜重抑制率可达91%。本发明的真菌菌株厚垣孢镰刀菌ZC201301同时对反枝苋、麦蒿、等杂草具有一定生物防效，对大豆、玉米、小麦等作物安全。

Description

一株厚垣孢镰刀菌株及其应用

技术领域

本发明涉及镰刀菌株技术领域，特别涉及一株厚垣孢镰刀菌株，还涉及所述厚垣孢镰刀菌株的应用。

背景技术

马唐(Diditaria sanguinaris)是世界上公认的分布广泛的恶性杂草之一，主要危害小麦、大麦、玉米、水稻、高粱等禾本科作物，以及蔬菜园和草坪等。在中国，马唐的危害面积大约在6千万公顷左右，由其引起的作物损失占秋熟旱作物田杂草总损失的一半以上，而其在黄淮海免耕玉米田出现以及危害的频率更高。目前，南京农业大学已申请了利用双曲孢霉(Nakataea Hara)菌株QZ-2000(保藏号: CGMCC No.0640)生物控制马唐的专利，但其单菌株防效并不理想，需由几个单株的孢子按比例混合后喷施才能达到较好的防除效果。

近些年来，化学除草剂的长期使用引起抗性杂草的产生和严重的环境污染，同时伴随人们环保意识逐渐增强，对农药残留低的绿色食品的需求越来越高。因此，研制生物除草剂进行杂草的防除，不仅可以有效防除目标杂草，而且对环境安全性高，已成为生产上的迫切需求。目前，已经一些生物除草剂已经商业化推广，例如80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。这些除草剂在控制相对的目标杂草上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保证使用一次2-3年无须再除草。目前，有希望商业化的生物除草剂项目有数十项，其中防除马唐、稗草、婆婆纳等杂草的生物除草剂品种具有十分诱人的前景。

发明内容

为了解决以上现有技术中商业化的生物除草剂所存在的现状及问题，本发明提供了一株厚垣孢镰刀菌株ZC201301（Fusarium chlamydosporum）。

本发明还提供了所述厚垣孢镰刀菌株ZC201301（Fusarium chlamydosporum）的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明所提供的厚垣孢镰刀菌为厚垣孢镰刀菌ZC201301，其保藏编号为CGMCC No. 9562。

本发明还提供了厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子。

一种制备厚垣孢镰刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的孢子的方法：

用PDA培养基培养厚垣孢镰刀菌ZC201301，培养的温度为22℃-28℃，培养的光照条件为光照（12小时）/黑暗（12小时），培养的时间为10-12天，得到厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子；所述培养的温度具体为22℃，25℃或28℃，所述培养的时间具体为12天。

本发明的另一个目的是提供一种培养厚垣孢镰刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的方法：

用PDA培养基培养厚垣孢镰刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562，培养的温度为22℃-28℃，培养的光照条件为光照（12小时）/黑暗（12小时），培养的时间为10-12天，得到厚垣孢镰刀菌ZC201301 CGMCC No. 9562的孢子；所述培养的温度具体为22℃，25℃或28℃，所述培养的时间具体为10、11、12天。

一种厚垣孢镰刀菌ZC201301和/或其培养液和/或厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子在生物除草剂中的应用。

优选所述生物除草剂的作用对象为马唐、反枝苋、麦蒿、狗尾草、稗草等杂草。

上述生物除草剂具体由厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子、表面活性剂和无菌水组成；优选所述生物除草剂中含有孢子1×10⁷/mL和表面活性剂。

优选所述表面活性剂在所述生物制剂中的质量浓度为0.1%。

优选所述表面活性剂为吐温80。

本发明的生物除草剂对马唐具有强烈、快速的致病力，将本发明菌株的孢子喷洒到两叶一心期的马唐叶片上，2天后即出现水渍状斑点，7天后斑点逐渐扩大，出现枯死症状，两周后马唐的死亡率达到60%，感病率达到100%，4周后对马唐的鲜重抑制率达到91%。

本发明的有益效果：

1）本发明的厚垣孢镰刀菌ZC201301由发明人分离自田间自然发病的马唐叶片，未经任何基因修饰，因此将它们释放到自然界中不会在成任何生态的、环境的隐患，是绝对安全的生物防治介体；

2）本发明中厚垣孢镰刀菌ZC201301对大豆、玉米、小麦等作物安全，同时对反枝苋、马唐、麦蒿等杂草具有一定的生物防治作用，显示出该菌有较大的潜力开发成商品化生物除草剂，具有极为显著的经济和社会效益。

菌种保藏信息

保藏时间：2014年8月15日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No. 9562，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，

分类命名：厚垣孢镰刀菌Fusarium chlamydosporum。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1: 厚垣孢镰刀菌菌株ZC201301的分离与鉴定

1.1 菌株的分离

野外采集自然感病的马唐叶片，剪下病叶的柄、健结合部位，用无菌水冲洗3次，用2% (v/v)次氯酸钠溶液进行表面消毒6分钟，之后用70% (v/v)酒精表面消毒1分钟，用无菌水漂洗后将这些组织转移到空的灭菌培养皿内，超净台内吹干后置于28℃培养箱培养，经过单孢子分离、纯化得到纯培养菌菌株ZC201301。

1.2 ZC201301菌株对马唐的致病性测定

ZC201301菌株在PDA培养基上培养10d后，收集孢子并配制成浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬浮液喷施2叶1心期马唐植株上，2天后，观察菌株的致病特性，喷洒ZC201301菌株孢子液的马唐叶片在2天后出现水渍状病斑，后病斑扩大连接导致叶片枯黄死亡。将ZC201301菌株以滤纸片法保存于-20℃冰箱内。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 形态鉴定

方法：将菌株ZC201301在PDA平板上培养10天，观察其菌落形态。同时用无菌水将培养基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子悬浮液，调节浓度至1×10⁴个孢子/ml。显微镜下观察菌株ZC201301的分生孢子形态；对照真菌鉴定手册，对菌株ZC201301进行形态学鉴定。

1.3.2 分子鉴定

提取菌株ZC201301的基因组DNA，用引物ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)和ITS5 (5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)进行PCR扩增，将PCR产物回收测序，测得序列。

将测得序列提交到NCBI(National Center forBiotechnology information，美国生物信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的GeneBank进行BLAST分析。

1.4 结果

ZC201301菌株在PDA培养基上培养10天后，菌落质地紧密、呈厚絮状，淡粉红色。产生两种孢子，一种产生量较少、呈镰刀形；一种产生量较大、呈类椭圆形。结合BLAST分析结果表明，ZC201301菌株为厚垣孢镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）。

该菌株已于2014年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号CGMCC No.9562，分类命名为厚垣孢镰刀菌Fusarium chlamydosporum，菌株名称为ZC201301。

实施例2：孢子液的制备

将厚垣孢镰刀菌ZC201301接种于PDA平板培养基，在28℃，光、暗交替条件下，培养12天，培养基表面即存在菌株产生的大量分生孢子。加入占总质量量0.1%的吐温80，用棉棒轻轻刷下培养基表面生长的孢子，收集孢子液，显微镜下用血球计数板计数并调整孢子液浓度至1×10⁷个/mL。制取的孢子悬浮液直接用于马唐等杂草的生物防治。

实施例3：菌株ZC201301 CGMCC寄主范围的测定

经寄主范围测定明确，菌株ZC201301对大豆、玉米、小麦等作物安全；对马唐、反枝苋、麦蒿具有生防效果，而马唐生防效果最佳，两周后的鲜重抑制率在91%左右。

表1菌株ZC201301的寄主范围测定

鲜重抑制率的计算公式: 鲜重抑制率=(对照平均鲜重-处理平均鲜重)/ 对照平均鲜重×100%。

本实验中的各植物均是非常常见和常用的植物。

具体方法为：温室中种植各植物，在各植株生长至2-3叶期，对每种植物的植株进行孢子液喷雾；接种后14天，进行结果统计，并以未喷雾的作为对照。

结果统计包括以下方面：在结果统计当日，目测各植株在接种ZC201301之后的症状，并记录；剪取各处理植株的地上部分,立即称取植株鲜重,计算鲜重抑制率。

结果具体如下:

表1 ZC201301菌株孢子液对不同杂草生物防效和作物安全性比较

杂草种类	发病率（%）	致死率（%）	鲜重抑制率（%）
				马唐	100	63.6±4.2	91.7±2.3
反枝苋	69.3±6.1	48.2±3.3	72.9±5.1
				麦蒿	51.5±3.2	0	47.2±5.1
狗尾草	63.1±6.2	10.3±0.9	33.2±3.8
				稗草	29.2±3.8	0	28.2±1.9

注:表中数据均为平均值±标准误

杂草生防实验结果表明，ZC201301菌株孢子液对马唐生防效果最佳，接菌14天后马唐发病率为100%，鲜重抑制率达到91.7%；对反枝苋、麦蒿、狗尾草和稗草均具有一定的生防效果，鲜重抑制率分别达到72.9%、47.2%、33.2%和28.2%。

作物安全性试验结果表明在喷雾接菌5天后，小麦叶片上发现零星较小病斑，14天后，病斑未扩大，对鲜重没有明显的抑制作用，表现为安全。

ZC201301菌株对大豆、玉米未发现病斑，14天后植株鲜重不受抑制，均表现为安全。

本实验中水稻品种为：吉粳88；小麦品种为：济麦22；大豆品种为：中黄57；玉米品种为：鲁单981；以上作物种子均是购自种子公司。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株厚垣孢镰刀菌ZC201301，其特征在于其保藏编号为CGMCC No. 9562。

2.一种权利要求1所述的厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子。

3.根据权利要求2所述的孢子，其特征在于是通过以下步骤得到的：

用PDA培养基培养厚垣孢镰刀菌ZC201301，培养温度为22℃-28℃，培养的光照条件为光暗交替，光照12小时，黑暗12小时，培养时间为10-12天，即得。

4. 一种培养厚垣孢镰刀菌ZC201301的方法，其特征是包括以下步骤：

用PDA培养基培养厚垣孢镰刀菌ZC201301，培养温度为22℃-28℃，培养的光照条件为光暗交替，光照12小时，黑暗12小时，培养时间为10-12天。

5.一种权利要求1所述的厚垣孢镰刀菌ZC201301和/或其培养液和/或权利要求2或3所述的厚垣孢镰刀菌ZC201301的孢子在生物除草剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述生物除草剂的作用对象为马唐、反枝苋、麦蒿、狗尾草、稗草。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述生物除草剂中含有孢子1×10⁷/mL和表面活性剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述表面活性剂在所述生物制剂中的质量浓度为0.1%。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述表面活性剂为吐温80。