CN104745672B - 一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于作物抗病性鉴定领域，特别是一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，可有效解决现有鉴定中存在的不足一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：步骤一、烟草黑胫病菌培养：步骤二、取待测烟草种子表面消毒：步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：本发明不仅节省了人力物力，还大幅度的缩短鉴定时间，对黑胫病的抗性水平不受生长季节限制，且鉴定操作步骤简单，试验室要求条件较低，该方法完全实现了低成本，高通量、快速鉴定烟草黑胫病的目的，适宜于烟草育种研究中大批量种质材料黑胫病抗性鉴定方法，以加速抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究、抗病品种的育种与推广应用。

Description

一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法

技术领域

本发明属于作物抗病性鉴定领域，特别是一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法

背景技术

烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var.nicotianae Tucker)是危害烟草的一种毁灭性土传病害，其分布范围广、潜伏期短、发病快、发病率高，会与其他病害混合发生。美国北卡罗莱纳州每年因烟草黑胫病损失的烟叶约占总产量的1％～2％；1955、1966年两年间因黑胫病造成的损失达3610万美元，占病害损失的35.13％，居各病害之首。我国烟草黑胫病病害的发生始于1919～1945年，到80年代以后，烟草黑胫病在我国迅速扩展。据调查，除黑龙江省尚未发生该病外，其余各植烟省区均有发生。尤其以山东、河南、安徽发病较重，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。

据不完全统计，我国平均每年因烟草黑胫病造成的损失达到1亿元以上，已严重威胁部分烟区烟叶生产的发展。而目前生产的植烟品种对该病害的抗性都较差，又缺乏安全有效的化学手段防治，一旦发病，便束手无策。因此控制该病害发生和流行的最根本的思路是选育和利用抗病材料。

而准确快速有效的鉴定是对烟草抗源的挖掘、利用和抗病品种选育的首要环节。

现有的烟草黑胫病抗性鉴定方法主要有3种，一是温室苗期鉴定接种法，二是田间病圃鉴定，三是毒素浸种法。

苗期鉴定法通常采用孢子悬浮液或菌丝体悬浮液浸根接种，此种方法因接种时所用孢子分布不均会出现接种强度不一致的现象，易造成鉴定误差；

田间病圃鉴定是目前常用的鉴定方法，是移栽缓苗后接种，其鉴定结果受地块本身菌落分布均匀度、环境条件等影响，往往不同年份的鉴定结果会存在一定的差异，并且田间病圃鉴定需要时间长，占地面积大，试验费用高；

毒素浸种法是将烟草黑胫病菌接种于燕麦固体培养基中，培养7～14天，待菌丝长满整个皿后，取菌块加入燕麦液体培养基中振荡培养7～14天，得烟草黑胫病菌分生孢子悬浮液，稀释为9×10⁵，滤纸过滤，高速离心后无菌滤膜过滤得粗度素。其缺点：第一是整个粗度素的提取过程步骤繁琐，时耗长，需要28天左右，且提取毒素量有限；其次病原菌毒素产毒条件要求较为苛刻，对光照，温度，暗处理时间，培养基等都有一定的选择；另外毒素处理种子或组织时毒素浓度的大小也不容易确定，需要反复试验，才可以确定适宜的浓度范围，因此工作量也比较大。

发明内容

针对现有烟草黑胫病抗性鉴定技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，可有效地克服现有技术的缺陷；

其解决问题的技术方案是：

一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草黑胫病菌培养：

将烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae Tucker)0号小种；接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7～10天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用，燕麦培养基的制作方法为在1000ml无菌水中加入15～20g燕麦片，煮至燕麦片开花状，定容1000ml，分装到500ml三角瓶中，高压121℃，灭菌20min，无菌条件下分装于一次性无菌培养皿中，每皿10ml；

步骤二、取待测烟草种子表面消毒：

取待测烟草种子置于无菌培养皿中，用75％的酒精浸泡3分钟，再用10％的次氯酸钠浸泡5分钟，随后用无菌水反复清洗3次，减少消毒液残留；无菌蒸馏水的制作方法取1000ml蒸馏水分装100ml的三角瓶中，高压121℃，灭菌20min；

步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：

分别将步骤二中消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基(CK)上，每皿100粒，保持在相对湿度80％～90％、光照强度1000lx～2000lx、温度25～28℃,3～7天后开始观察发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥50％为感病品种，15％≤发病率＜50％为中抗品种，发病率＜15％为抗病品种。

所用的黑胫病菌种由中国农业科学院烟草研究所提供，其余试剂均为市售产品；所用仪器光学显微镜、超净工作台VS-1300L-U和MGC-300H光照培养箱。

本发明涉及的烟草黑胫病快速鉴定方法，具有以下特点，第一，直接利用种子鉴定，可以在黑胫病菌皿中直接完成烟草种子对黑胫病的抗性鉴定，比毒素浸种鉴定法省略了黑胫病毒素的提取和保存、毒素活性鉴定、毒素浸种适宜浓度筛选等一系列步骤；比利用成苗或烟株鉴定试验省略了培养烟株的繁琐，此方法不仅节省了人力物力，还大幅度的缩短鉴定时间，一批次完成只需7～10天即可，对于发芽势较强的种子3～5天即可鉴定出其对黑胫病的抗性水平；第二，使烟草对黑胫病的抗性不受生长季节限制，任何季节都能展开鉴定工作；第三，鉴定在恒温光照培养箱中进行，对温湿度进行控制，发病条件不存在差异，鉴定结果受外界影响小，结果更准确，且鉴定操作步骤简单；第四，与毒素浸种抗性鉴定方法相比对试验室要求条件较低；该方法完全实现了低成本，高通量、快速鉴定烟草黑胫病的目的，更适宜于烟草育种研究中大批量种质材料黑胫病抗性鉴定，以加速抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究、抗病品种的育种与推广应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的内容做进一步的解释说明：

实施例一

一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草黑胫病菌培养：

将烟草黑胫病菌0号小种；接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7～10天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用；

步骤二、取待测烟草种子表面消毒：

取革新三号种子置于无菌培养皿中，用75％的酒精浸泡3分钟，再用10％的次氯酸钠浸泡5分钟，随后用无菌水反复清洗3次，减少消毒液残留；

步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：

分别将步骤二消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基(CK)上，每皿100粒，保持在相对湿度80％、光照强度1000lx、温度25℃,3～7天后开始观察发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥50％为感病品种，15％≤发病率＜50％为中抗品种，发病率＜15％为抗病品种。

实施例二

一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草黑胫病菌培养：

将烟草黑胫病菌0号小种；接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7～10天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用；

步骤二、取待测烟草种子表面消毒：

取待测金星6007种子置于无菌培养皿中，用75％的酒精浸泡3分钟，再用10％的次氯酸钠浸泡5分钟，随后用无菌水反复清洗3次，减少消毒液残留；

步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：

分别将步骤二消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基(CK)上，每皿100粒，保持在相对湿度90％、光照强度2000lx、温度28℃,3～7天后开始观察发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥50％为感病品种，15％≤发病率＜50％为中抗品种，发病率＜15％为抗病品种。

实施例三

一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，包括以下步骤：

步骤一、烟草黑胫病菌培养：

将烟草黑胫病菌0号小种，接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7～10天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用；

步骤二、取待测烟草种子表面消毒：

取待测红花大金元种子置于无菌培养皿中，用75％的酒精浸泡3分钟，再用10％的次氯酸钠浸泡5分钟，随后用无菌水反复清洗3次，减少消毒液残留；

步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：

分别将步骤二消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基(CK)上，每皿100粒，保持在相对湿度85％、光照强度1500lx、温度27℃,3～7天后开始观察发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥50％为感病品种，15％≤发病率＜50％为中抗品种，发病率＜15％为抗病品种。

结果对比试验

用本发明所述方法对菌皿直接接种后对烟草种子发芽率的影响程度，相同条件下得出3个不同抗性材料的鉴定结果。

表一 供试材料经处理后发芽数(成活烟芽)和发病率(未发芽和感病芽)

取相同的种子在相同条件下田间病圃做相应的病圃接种抗性鉴定。

1.采用历年黑胫病高发区连作烟田作病圃，通过增加田间湿度诱导烟株发病。

2.黑胫病抗性鉴定方法及病情调查：待测烟苗移栽大田后15～20天用菌谷颈部创伤接种，每株接种量3～5g。接种后大田满灌水，使土壤含水量处于饱和状态，以利于黑胫病充分发病。接种后定期调查感病情况，当感病对照病指达60.0以上，调查各品种全部烟株发病情况。

表二 供试材料田间病圃发病情况(多重比较)

调查统计植株发病率，病害调查统计按照GB/T23222进行。

品种抗病性评价：参照烟草病虫害分级及调查方法GB/T 23222-2008。

发病率＝(发病株数/调查总株数)×100％

病情指数＝[∑(各级发病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级值)]×100

表二中同列字母不同表示差异达0.05显著水平。

通过实验对比发现结果与菌皿发芽试验一致，革新三号属于抗黑胫病种质。金星6007为中抗，红花大金元易感黑胫病。

Claims (4)

1.一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、烟草黑胫病菌培养：

将烟草黑胫病菌0号小种；接种于燕麦培养基上在28℃条件下培养7～10天，待菌丝长满整个皿后，用接种环除去菌皿表面附着的菌丝，留菌皿备用；

步骤二、取待测烟草种子表面消毒：

取待测均匀饱满烟草种子，置于无菌培养皿中，用75%的酒精浸泡3分钟，再用10%的次氯酸钠浸泡5分钟，随后用无菌水反复清洗3次，减少消毒液残留；

步骤三、发芽率，发病率统计，并进行抗病性评价：

分别将步骤二中消毒烟草种子无菌条件下转移到步骤一培养的烟草黑胫病菌皿和没有接种烟草黑胫病菌的燕麦培养基上，保持在相对湿度80%～90%、光照强度1000lx～2000lx、温度25～28℃、3～7天后开始观察种子发芽情况，根据发病率判断供试材料的抗性，发病率≥50%为感病品种，15%≤发病率＜50%为中抗品种，发病率＜15%为抗病品种。

2.所述的一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于：步骤一中燕麦培养基的制作方法为在1000ml无菌水中加入15～20g燕麦片，煮至燕麦片开花状，定容1000ml，分装到500ml三角瓶中，高压121℃，灭菌20min，无菌条件下分装于无菌培养皿中。

3.所述的一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于：步骤二中无菌水制作方法为：取1000ml蒸馏水分装到100ml的三角瓶中，高压121℃，灭菌20min。

4.所述的一种快速鉴定烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于：步骤三中把已消毒的待测烟草种子播种于烟草黑胫病菌菌皿，每皿100粒。