CN102498878A - 一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法，包括育苗、烟苗移植及日常管理、接种体制备及烟苗切茎接种黑胫菌、病情调查与分级等步骤。本发明直接采用漂浮育苗，不需要移栽缓苗，用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的土壤盆栽和大田鉴定结果，采用茎部切断创伤接种法代替传统的茎基部创伤接种法。减少环境温度和湿度对鉴定结果的影响，避免其他病害对鉴定结果的干扰，提高鉴定结果的准确性，减少菌种培养和接种后发病调查时间，采用茎部切断创伤法接种伤口大小基本一致，接种时易于操作，避免由于不同人员操作引起的伤口大小差异，从而减少人为误差。

Description

一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法

技术领域：

本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及烟草黑胫病抗性鉴定，特别是涉及一种烟草黑胫病抗性的苗期快速鉴定方法。

背景技术：

烟草黑胫病是烟草(Nicotiana tabacum)生产上的毁灭性病害之一，是制约我国各烟区烟叶生产的最重要因素，可以危害烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟等所有的栽培烟草。美国北卡罗莱纳州每年因烟草黑胫病损失的烟叶约占总产量的1％～2％，1995年和1996年两年间因黑胫病造成的损失就达3610万美元，占病害总损失的35.13％，居各病害之首。该病在我国分布范围很广，除黑龙江省尚未发现之外，其余各植烟省区(含台湾省)均有发生。平均发病率为5％～12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76373hm2，产量损失2869.26万千克，产值损失超过1.23亿元人民币。生产实践表明，防治黑胫病最经济、有效、环保的措施就是选育抗病品种，抗性鉴定自然成为抗源挖掘利用、抗病育种、抗性监测等工作中重要的一环。

现有的烟草抗性鉴定方法主要有温室苗期鉴定接种法和病圃活体菌株人工接种鉴定法。苗期鉴定法通常采用游动孢子或菌丝体悬浮液浸根接种，病圃活体菌株人工接种鉴定是目前常用的鉴定方法，现有的接种方法采用茎基部创伤接种法，缺点是移栽缓苗后接种，时间长，工作量大，伤口大小不一致，接种过程繁琐，不易操作。接种体需要经过固体培养、菌谷培养，时间长，工作量大。

我国烟草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是当前国际上先进的育苗新技术，具有壮苗率高、操作简便、专业化程度高、省工节时、方便管理、有利环境保护等许多优点，近年来，在我省得到了大面积推广应用，因此，在漂浮育苗基础上，建立新的烟草黑胫病抗性的漂浮池水培接种快速鉴定方法，对抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究和抗病育种具有重要意义。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法，包括育苗、烟苗移植及日常管理、接种体制备及烟苗切茎接种黑胫菌、病情调查与分级等步骤。本方法直接采用漂浮育苗，不需要移栽缓苗，用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的土壤盆栽和大田鉴定结果，采用茎部切断创伤接种法代替传统的茎基部创伤接种法。减少环境温度和湿度对鉴定结果的影响，避免其他病害对鉴定结果的干扰，提高鉴定结果的准确性，减少菌种培养和接种后发病调查时间，大大减少工作量，同时可节省场地、资源和试验成本，缩短接种鉴定时间。采用菌丝片直接接种，菌种只需要固体培养，时间短而工作量小，接种时间和接种后发病时间短，采用茎部切断创伤法接种伤口大小基本一致，接种时易于操作，避免由于不同人员操作引起的伤口大小差异，从而减少人为误差。

本发明通过以下技术方案予以实现：

1)烟苗移植及日常管理

烟苗三次剪叶后，苗龄60d，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。以小黄金1025作对照，红花大金元作辅助对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg～250mg/kg。根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深。

2)接种体制备及接种

烟草黑胫病菌活化后，接种燕麦固体培养基28℃培养2周。茎部高度5cm处用无菌解剖刀切断，用打孔器打取0.5cm菌丝块，贴于茎部切断处，菌丝面朝下，每株接种1个菌丝片，上套移5mL液枪枪头保湿，每品种设3个重复，每重复接种15株。接种后将育苗盘放入28℃恒温池，日常管理。

3)病情调查

接种后2d调查发病情况，以后每隔2d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到70％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。

4)病害严重度分级

以株为单位分级调查。

0级：茎部绿色，无病斑。

1级：茎部病斑不超过茎围。

3级；茎部病斑环绕茎围，病斑高度不超过茎高的三分之一。

5级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度占茎高的三分之一至三分之二。

7级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度超过茎高的三分之二以上。

9级：茎部全部变色，基本死亡。

本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：1)直接采用漂浮育苗，不需要移栽缓苗，减少劳动量。2)采用菌丝片直接接种，菌种只需要固体培养，时间短而工作量小，接种时间和接种后发病时间短。3)采用茎部切断创伤法接种伤口大小基本一致，接种时易于操作，避免由于不同人员操作引起的伤口大小差异，从而减少人为误差。

该方法的实用性在于：占地面积小，在几十平方米的面积上一次可同时鉴定上千株烟苗；用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的土壤盆栽和大田鉴定结果，采用茎部切断创伤接种法代替传统的茎基部创伤接种法，结果重复性高，能有效排除土壤温度差异和其他病害对抗性结果的干扰，有利于年度间和不同实验室间结果重现和比较，提高鉴定结果的准确性，减少菌种培养，大大减少工作量，同时可节省场地、资源和试验成本，缩短接种鉴定时间，发病迅速，从接种到调查结束可在一周内完成；结果可靠性高，抗感品种的发病率和病情指数差异明显。该方法在抗病资源和育种中间材料的抗性鉴定、抗性遗传规律研究中应用潜力较大。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但不是对本发明保护范围的限定。

实施例1

1材料与方法

1.1供试材料

供试烟草材料包括I-35、NC1071、NC729、SC 71、Virginia 182、筑波1号、Burley21、Banket A-1、Tennessee90、Virginia509、TI245、安麻山晒烟-3、祥云土烟-1、克撒锡巴斯玛、土耳其巴斯玛、希腊巴斯玛、红大、小黄金1025，其中小黄金1025和红花大金元为国内外报道的感黑胫病资源。接种用黑胫菌强致病力菌株162#，分离自云南省文山州文山县。

1.2室内苗期抗性鉴定

1.2.1茎部切断创伤接种法

烟苗三次剪叶后，苗龄60d，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。以红花大金元品种、小黄金1025为对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg～250mg/kg。根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深。烟草黑胫病菌活化后，接种燕麦固体培养基28℃培养2周。茎部高度5cm处用无菌解剖刀切断，用打孔器打取0.5cm菌丝块，贴于茎部切断处，菌丝面朝下，每株接种1个菌丝片，上套移液枪枪头(5mL)保湿，每品种设3个重复，每重复接种15株。接种后将育苗盘放入28℃恒温池，日常管理。接种后2d调查发病情况，以后每隔2d调查一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到70％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。病害严重度分级：以株为单位分级调查。0级：茎部绿色，无病斑。1级：茎部病斑不超过茎围。3级；茎部病斑环绕茎围，病斑高度不超过茎高的三分之一。5级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度占茎高的三分之一至三分之二。7级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度超过茎高的三分之二以上。9级：茎部全部变色，基本死亡。

1.2.2茎基部创伤接种鉴定法

在塑料拱棚温室内进行。盆栽苗龄50d烟苗，每材料30株。采用直径12cm的一次性黑色塑料花盆，每盆装红壤土约500g。移栽成活后，在烟株两侧将刀刮伤烟苗茎基部，每株伤口处接种5g菌谷。通过温室通风帘控制室内白天温度、傍晚关闭通风帘保温。接种后每周观察一次发病情况，在感病对照发病率达到20％左右详细调查病情，以感病对照发病率达到75％左右的调查结果作为品种抗性评价标准。

病害严重度分级标准按照GB/T 23222-2008的规定。0级：全株无病；1级：茎部病斑不超过茎围得三分之一，或三分之一以下叶片萎焉；3级：颈部病斑环绕茎围三分之一至二分之一，或三分之一至二分之一叶片轻度凋萎，或下部少数叶片出现病斑；5级：茎部病斑超过茎围得二分之一，但未全部环绕茎围，获二分之一至三分之二叶片凋萎；7级：茎部病斑全部环绕茎围，或三分之二以上叶片凋萎；9级：病株基本枯死。

2结果与分析

2.1两种不同接种方法抗性鉴定结果相关性比较

表1两种不同黑胫病抗性鉴定方法发病情况

在茎基部创伤接种鉴定中，已知感病对照红花大金元和小黄金1025表现为感病，在茎基部创伤接种鉴定法中，已知感病对照红花大金元和小黄金1025表现为感病。茎部切断创伤接种法与传统的茎基部创伤接种鉴定方法得到的供试品种的病情指数表现为正相关，相关系数为0.80857。

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：池水温度设置为30℃。

实施例3

重复实施例1，有以下不同点：苗龄50d。

实施例4

重复实施例1，有以下不同点：苗龄70d。

实施例5

重复实施例1，有以下不同点：茎部高度5cm处用无菌解剖刀切断。

实施例6

重复实施例1，有以下不同点：茎部高度6cm处用无菌解剖刀切断。

参考文献：

[1]Lucas，G.B.Disease of tobacco，3rd ed.biologicalconsulting associates[C]，Raleigh，NC.1975.

[2]Shew，H.D.Effect of host resistance on spread ofPhytophthora parasitica var.nicotianae and subsequentdevelopment of tobacco black shank under fieldconditions[J].Phytopathology，1987，77：1090-1093.

[3]中华人民共和国国家标准.烟草病害分级及调查方法(GB/T23222-2008)[S].北京：中国标准出版社出版发行，2008。

[4]张竹林.抗烟草黑胫病品种(系)试验简报[J].烟草科技，1995，110：38～39.

[5]刘凤兰，王素琴，段旺军等.烤烟品种黑胫病抗性筛选与评价[J].河南农业科学，2004，9：22～25.

[6]梁元存，刘延荣，王玉军等.烟草黑胫病菌致病性分化和烟草品种的抗病性差异[J].植物保护学.报，2003，30(2)：143～147.

[7]许美玲.优质抗病烤烟种质资源的筛选[J].2006，22(10)：402-406.

[8]雷永和，许美玲，黄学跃.云南烟草品种志[C].昆明：云南科技出版社，1999，14，-15.

[9]李梅云，卢秀萍，李永平.烟草黑胫病菌培养特性的研究[J].植物保护，2006，32(6)：81-84.

Claims (1)

1.一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法，其特征在于步骤为：

（1）烟苗移植及日常管理

烟苗三次剪叶后，苗龄60d，每个待鉴定材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中；以小黄金1025作对照，红花大金元作辅助对照，漂浮池营养液的氮素浓度控制在100 mg/kg～250 mg/kg，根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深；

（2）接种体制备及接种

烟草黑胫病菌活化后，接种燕麦固体培养基，28℃培养2周；茎部高度5cm处用无菌解剖刀切断，用打孔器打取0.5cm菌丝块，贴于茎部切断处，菌丝面朝下，每株接种1个菌丝片，上套5mL移液枪枪头保湿，每品种设3个重复，每重复接种15株；接种后将育苗盘放入28℃恒温池，日常管理；

（3）病情调查

接种后2 d调查发病情况，以后每隔2d调查一次发病情况；记录发病率及病情指数，以感病对照发病率达到70% 左右的病情指数作为品种抗性评价标准；

（4）病害严重度分级

以株为单位分级调查，

0级：茎部绿色，无病斑；

1级：茎部病斑不超过茎围；

3级；茎部病斑环绕茎围，病斑高度不超过茎高的三分之一；

5级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度占茎高的三分之一至三分之二；

7级：茎部病斑环绕茎围，病斑高度超过茎高的三分之二以上；

9级：茎部全部变色，基本死亡。