CN102919132A - 组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物组培技术，尤其是一种组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法，其特征在于组织培养时，以滇杨的叶柄作为组培材料，并在滇杨叶柄分化培养基中加入秋水仙素诱导滇杨产生多倍体，处理时间为20-30天，处理完后转入未附加秋水仙素的滇杨叶柄分化培养基中再进行分化培养，然后截取分化出的丛生芽上变异明显的部位，再在分化培养基上进行5-6次的反复培养，可使其多倍化变异稳定，将变异稳定的丛生幼苗进行生根，可得四倍体滇杨组培幼苗。本发明是一种操作简便且能有效减少嵌合体的组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法。

Description

组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法

技术领域

本发明涉及植物组培技术，尤其是滇杨的组织培养方法。

背景技术

滇杨（Populus yunnanensis Dode）是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）青杨派（section Tacamahaca）树种，乔木，高20余米，产于云南、贵州和四川，生于海拔1300-3200m的山地。具有生长较快，适应性较强，成材较早，而且易于繁殖等特点。该树种也是我国西南地区特有的一种乡土树种，是全国乃至世界少有的分布于低纬度高海拔地区的极宝贵杨树种质资源。然而，滇杨具有易感染杨树黑斑病、杨树溃疡病、易遭蛀干虫害且分枝多的弊端，其优良特性也不能得到充分的利用。因此，有必要充分开发、利用现有的滇杨资源，对该树种进行有效的遗传改良，以充分利用其生产潜力。通过组织培养与秋水仙碱诱导相结合选育植物多倍体技术在国内外被育种学家广泛应用，以求达到改良植物品种和丰富种质资源的目的。其优点主要是可以有效减少嵌合体，实验条件容易控制，可以多次重复试验，目前已在许多植物的多倍体育种中得到应用。近年来，随着滇杨离体培养技术的不断完善，使得利用组织培养技术对滇杨进行种质资源保存及遗传改良成为现实。“组织培养与秋水仙碱诱导相结合”应用于滇杨遗传改良国内外未见相关报道。Mashkina等（Mashkina O S, Burdaeva L M,Belozerova M M, et al. Method of obtaining diploid pollen of woody species[J].Lesovedenie,1989a,1:19-25.）在银白杨合子的第一次有丝分裂时利用秋水仙素对其进行处理，获得了四倍体植株，但需要对大量材料进行逐日处理，工作量大、重复性差、嵌合体多且诱导率较低。张志毅等（张志毅,李凤兰.白杨染色体加倍技术研究及三倍体育种(Ⅰ)-花粉染色体加倍技术[J].北京林业大学学报,1992,14(增3):52-58.）、康向阳等（康向阳,张平冬,高鹏,等.秋水仙碱诱导白杨三倍体新途径的发现[J].北京林业大学学报,2004,26(1):1-4.）、王君（王君.青杨派树种多倍体诱导技术研究[D].北京：北京林业大学博士学位论文. 2009.）利用杨树花芽或者花絮为材料，施加秋水仙素诱导配子或合子染色体加倍，产生2n配子，经受精结合后获得多倍体材料，并且没有嵌合体材料出现，诱导效果较好，但该法难度技术要求高，不易操作。利用“组织培养与秋水仙碱诱导相结合”诱导获得滇杨多倍体种质，可为滇杨乃至组织培养技术成熟的其他木本植物的遗传育种工作提供理论依据和实践指导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简便且能有效减少嵌合体的组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法。

本发明公开了一种组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法，其特征在于组织培养时，以滇杨的叶柄作为组培材料，并在滇杨叶柄分化培养基中加入秋水仙素诱导滇杨产生多倍体，处理时间为20-30天，处理完后转入未附加秋水仙素的滇杨叶柄分化培养基中再进行分化培养，然后截取分化出的丛生芽上变异明显的部位，再在分化培养基上进行5-6次的反复培养，可使其多倍化变异稳定，将变异稳定的丛生幼苗进行生根，可得四倍体滇杨组培幼苗。

具体步骤如下：

步骤一、采集生长健壮、无病虫害的滇杨两年生枝条，将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培25-35天，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料；

步骤二、将采集的滇杨叶柄放入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6-8min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；

步聚三、配制浓度为1000mg/L的秋水仙素溶液，用移液枪将配制好的秋水仙素溶液注入过滤器，过滤灭菌后加入MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基中，按照每L分化培养基加入80-90毫升秋水仙素溶液的量加入，将消毒后的叶柄接种在附加有秋水仙素的的分化培养基上，培养时间为20-30d； 

步骤四、将步骤三中培养得到的诱导材料转接至不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L分化培养基继续进行培养，分化出丛生芽；

步骤五、当分化出的从生芽长成1-2cm的芽苗时，对其进行观察，筛选其中生长缓慢、茎杆变粗、叶片变大、变厚、皱缩以及叶缘锯齿明显变大的变异芽苗，切取其幼嫩茎段，接种在不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基上再次产生丛生芽，按照此步骤经过5-6次反复分化培养，得到多倍化性状稳定的变异植株；

步骤六、将变异植株接种在1/2MS+NAA0.01-0.05mg/L的生根培养基上进行生根培养，10-15天后得到生根组培苗；

步骤七、截取生根组培苗的根尖，用常规制片法进行染色体数目鉴定，确认染色体数目为76条的植株，便可认定为四倍体滇杨。

 常规方法是直接用不同浓度的秋水仙素溶液处理植物的茎尖或种子，该方法需要对大量材料进行处理，工作量大、重复性差、嵌合体多、多倍化特性不易固定且诱导率较低。本发明公开的组织培养结合秋水仙素诱导过程中，由于组织培养分化培养中产生的不定芽是由单个表皮细胞或邻近的几个细胞发育而成，较易获得相对同质的多倍化不定芽，也即产生的滇杨多倍化嵌合体相对较少，经5-6次的分化培养后，其多倍化特性便可稳定，且多次继代无分离现象发生，是诱导产生滇杨多倍体的有效方法。

具体实施方式

实施例1、采集滇杨林中生长健壮、无病虫害优树的两年生枝条。将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培30天左右，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料。

步骤一、将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培30天，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料；

步骤二、将采集的滇杨叶柄放入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6-8min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；

步聚三、配制浓度为1000mg/L的秋水仙素溶液，用移液枪将配制好的秋水仙素溶液注入过滤器，过滤灭菌后加入MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基中，按照每L分化培养基加入80毫升秋水仙素溶液的量加入，将消毒后的叶柄接种在附加有秋水仙素的的分化培养基上，培养时间为25d；

步骤四、步骤三完成后，将诱导材料转接至不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基继续进行培养；

步骤五、当分化出的从生芽长至1-2cm的芽苗时，对其进行观察，筛选其中生长缓慢、茎杆变粗、叶片变大、变厚、皱缩以及叶缘锯齿明显变大的芽苗，切取其变异明显部分的嫰茎，接种在不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基上再次产生丛生芽，按照此步骤经过5次反复分化培养，变异植株的多倍化性状便可稳定；

步骤六、将变异植株接种在1/2MS+NAA0.01-0.05mg/L的生根培养基上进行生根培养，10-15d即可生根；

步骤七、截取生根组培苗的根尖，用常规制片法进行染色体数目鉴定，确认染色体数目为76条的植株，便可认定为四倍体滇杨。

 实施例2、采集滇杨林中生长健壮、无病虫害优树的两年生枝条。将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培30天左右，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料。

步骤一、将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培30天，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料；

步骤二、将采集的滇杨叶柄放入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6-8min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；

步聚三、配制浓度为1000mg/L的秋水仙素溶液，用移液枪将配制好的秋水仙素溶液注入过滤器，过滤灭菌后加入MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基中，按照每L分化培养基加入90毫升秋水仙素溶液的量加入，将消毒后的叶柄接种在附加有秋水仙素的的分化培养基上，培养时间为20d；

步骤四、步骤三完成后，将诱导材料转接至不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基继续进行培养；

步骤五、当分化出的从生芽长至1-2cm的芽苗时，对其进行观察，筛选其中生长缓慢、茎杆变粗、叶片变大、变厚、皱缩以及叶缘锯齿明显变大的芽苗，切取其变异明显部分的嫰茎，接种在不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基上再次产生丛生芽，按照此步骤经过6次反复分化培养，变异植株的多倍化性状便可稳定；

步骤六、将变异植株接种在1/2MS+NAA0.01-0.05mg/L的生根培养基上进行生根培养，10-15d即可生根；

步骤七、截取生根组培苗的根尖，用常规制片法进行染色体数目鉴定，确认染色体数目为76条的植株，便可认定为四倍体滇杨。

 按照上述步骤滇杨叶柄产生多倍化丛生芽，多倍体诱导率可达14.59%-16.18%。

Claims (2)

1.一种组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法，其特征在于组织培养时，以滇杨的叶柄作为组培材料，并在滇杨叶柄分化培养基中加入秋水仙素诱导滇杨产生多倍体，处理时间为20-30天，处理完后转入未附加秋水仙素的滇杨叶柄分化培养基中再进行分化培养，然后截取分化出的丛生芽上变异明显的部位，再在分化培养基上进行5-6次的反复培养，可使其多倍化变异稳定，将变异稳定的丛生幼苗进行生根，可得四倍体滇杨组培幼苗。

2.如权利要求1所述的一种组织培养结合秋水仙素诱导滇杨四倍体的方法，其特征在于具体步骤如下：

步骤一、采集生长健壮、无病虫害的滇杨两年生枝条，将枝条上叶片全部摘除后，置于室温下水培25-35天，待其长出新叶后用剪刀将叶柄剪下，作为滇杨多倍体诱导的材料；

步骤二、将采集的滇杨叶柄放入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6-8min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍；

步聚三、配制浓度为1000mg/L的秋水仙素溶液，用移液枪将配制好的秋水仙素溶液注入过滤器，过滤灭菌后加入MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基中，按照每L分化培养基加入80-90毫升秋水仙素溶液的量加入，将消毒后的叶柄接种在附加有秋水仙素的的分化培养基上，培养时间为20-30d； 

步骤四、将步骤三中培养得到的诱导材料转接至不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L分化培养基继续进行培养，分化出丛生芽；

步骤五、当分化出的从生芽长成1-2cm的芽苗时，对其进行观察，筛选其中生长缓慢、茎杆变粗、叶片变大、变厚、皱缩以及叶缘锯齿明显变大的变异芽苗，切取其幼嫩茎段，接种在不附加秋水仙素的MS+6BA0.5-1.0mg/L+NAA0.05-0.08mg/L的分化培养基上再次产生丛生芽，按照此步骤经过5-6次反复分化培养，得到多倍化性状稳定的变异植株；

步骤六、将变异植株接种在1/2MS+NAA0.01-0.05mg/L的生根培养基上进行生根培养，10-15天后得到生根组培苗；

步骤七、截取生根组培苗的根尖，用常规制片法进行染色体数目鉴定，确认染色体数目为76条的植株，认定为四倍体滇杨。