CN101066039A - 秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，为将胚性细胞经秋水仙素处理——振荡、洗涤——分化生根的组织培养方法，本发明是将杨树胚性细胞置于诱变液Q－1中诱变，接着置于清洗液中清洗，然后进行分化壮苗、生根培养，其中，所述的秋水仙素诱变液Q－1为：MS+6－BA 0.1－0.4mg/L+秋水仙素0.05－0.5％+蔗糖20－30g/L。本发明的优点是：便于操作控制，变异率高，周期短等优点，获得变异率高的杨树突变群体。
Description
技术领域
本发明秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法涉及一种诱导杨树突变体的组织培养方法，尤其是将胚性细胞经秋水仙素处理—洗涤—分化生根培养，从而得到突变体的组织培养方法。
背景技术
秋水仙素是一种微管特异性药物，由于适宜浓度的秋水仙素，能破坏细胞分裂时纺锤丝的形成，因此可使分生细胞复制的染色体在细胞分裂时不能分向两极，从而导致新生细胞的染色体加倍或染色体的畸变。因此秋水仙素是有效诱导突变体的化学药剂。
通过秋水仙素进行诱变，利用组织培养方法选出突变体的技术具有便于操作控制，变异率高，周期短等优点。
杨树是世界上分布最广、适应性最强的树种，以它为材料，进行突变体育种，该方法已作为国内外学者研究课题。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，解决木本植物因个体大不易处理和不易大量处理的困难，从而降低诱变所需成本、提高处理的精确性。
本发明目的通过下述技术方案实现：、一种秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，将杨树的愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行诱变处理后，置于清洗液中清洗，将清洗过的变异细胞分化壮苗，最后进行生根培养，其中，所述的秋水仙素诱变液Q-1为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+秋水仙素0.05-0.5％+蔗糖20-30g/L。
在上述方案基础上，所述的诱变处理是将愈伤组织胚性细胞置于Q-1中振荡12-72小时，振荡转速60-200RPM，处理温度为25℃±2℃。
在上述方案基础上，所述的清洗是将秋水仙素处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2中，清洗12-48小时，其中，Q-2为：MS+6-BA0.1-0.4mg/L+蔗糖20-30g/L。
将清洗后的胚性细胞置于培养基Y-2中，分化培养20～50天，Y-2为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L。
所述的生根培养是在生根培养基M5中进行，生根培养20～50天，培养基M5为：1/2MS+IBA 0.1-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂3-8g/L。
所述的杨树的愈伤组织胚性细胞的获得方法是切取1～2mm茎段的杨树组培苗作为外植体，用培养基Y-2进行分化培养，其中，Y-2为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA 0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入活跃的胚性状态。
所述的杨树的愈伤组织胚性细胞的获得方法也可以是包括外植体选择及处理、脱分化处理、再分化处理，选取杨树组培苗1～2mm茎段为外植体，经过脱分化处理、再分化处理后，获得愈伤组织胚性细胞。
其中，所述的脱分化培养基为Y-1，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入脱分化状态。
所述的再分化养基为Y-2，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入活跃的胚性状态。
所述的Y-1培养基为：MS+2.4-D0.1-0.5mg/L+KT0.1-0.5mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L。
本发明一种秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，是以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，采用秋水仙素进行诱变处理，包括外植体选择及处理、脱分化处理、采用秋水仙素诱变处理、诱变细胞的分化和生根培养，其中，处理，振荡洗涤，分化培养和生根培养。
本发明的优点是：
本发明以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，解决了木本植物因个体大不易处理和不易大量处理的困难，大大降低了诱变所需成本、提高了处理的精确性。便于操作和控制，变异率高，周期短。
具体实施方式
实施例1
秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，以木本植物愈伤组织胚性细胞为诱变对象，包括再分化培养，秋水仙素处理，洗涤，分化生根培养，其中，选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段，经过再分化培养后，愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液中进行诱变处理，接着置于清洗液中洗涤，然后置于分化培养基中分化壮苗，在生根培养基中生根。
具体步骤为：
第一步：选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段。
第二步：胚性细胞置于培养基Y-2上，在温度25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入活跃的胚性状态。该Y-2为：MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+IAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L。
第三步：将愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行振荡处理，处理时间为12小时-72小时，振荡转速60-200RPM，处理温度25℃±2℃。该诱变液Q-1为：MS+6-BA0.1mg/L+秋水仙素0.1％+蔗糖30g/L。
第四步：将处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2中清洗12-48小时。该清洗液Q-2为：MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L。
第五步：将清洗好的胚性细胞依次转入分化培养基Y-2中分化培养天数为20～50天，再转入生根培养基M5中生根，培养天数为20～50天。其中，该Y-2培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，该M5培养基为：1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L。
实施例2
秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，具体步骤为：
第一步：选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段。
第二步：胚性细胞置于培养基Y-2上，在温度25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入活跃的胚性状态。该Y-2为：MS+6-BA 0.1mg/L+KT 0.4mg/L+IAA 0.1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L。
第三步：将愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行振荡处理，处理时间为72小时，振荡转速60RPM，处理温度25℃±2℃。该诱变液Q-1为：MS+6-BA0.2mg/L+秋水仙素0.5％+蔗糖20g/L。
第四步：将处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2中清洗12-48小时。该清洗液Q-2为：MS+6-BA0.4mg/L+蔗糖25g/L。
第五步：将清洗好的胚性细胞依次转入分化培养基Y-2中分化培养天数为20～50天，再转入生根培养基M5中生根，培养天数为20～50天。其中，该Y-2培养基为：MS+6-BA0.4mg/L+KT0.05mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂8g/L，该M5培养基为：1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3g/L。
实施例3
秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，具体步骤为：
第一步：选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段。
第二步：胚性细胞置于培养基Y-2上，在温度25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天，使其完全进入活跃的胚性状态。该Y-2为：MS+6-BA 0.4mg/L+KT 0.05mg/L+IAA 0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂4g/L。
第三步：将愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行振荡处理，处理时间为12小时，振荡转速200RPM，处理温度25℃±2℃。该诱变液Q-1为：MS+6-BA0.4mg/L+秋水仙素0.05％+蔗糖25g/L。
第四步：将处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2中清洗12-48小时。该清洗液Q-2为：MS+6-BA0.2mg/L+蔗糖20g/L。
第五步：将清洗好的胚性细胞依次转入分化培养基Y-2中分化培养天数为20～50天，再转入生根培养基M5中生根，培养天数为20～50天。其中，该Y-2培养基为：MS+6-BA0.1mg/L+KT0.4mg/L+IAA0.05mg/L+蔗糖28g/L+琼脂4g/L，该M5培养基为：1/2MS+IBA0.01mg/L+蔗糖25g/L+琼脂8g/L。
实施例4
一种秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，以杨树愈伤组织胚性细胞为诱变对象，采用秋水仙素进行诱变处理，包括外植体选择及处理、脱分化处理、再分化处理、采用秋水仙素诱变处理、诱变细胞的分化和生根培养，其中，诱变处理，振荡洗涤，分化培养和生根培养，选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段，经过脱分化处理、再分化处理后，愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液中进行诱变处理，接着置于清洗液中洗涤，然后置于分化培养基中分化壮苗，在生根培养基中生根。
具体步骤为：
第一步：选取木本植物组培苗为外植体切成1～2mm茎段。
第二步：外植体置于脱分化Y-1上，在温度25℃±2℃，光照时间为14小时/天，连续培养7天，使其完全进入脱分化状态。该Y-1培养基为：MS+2.4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L。
第三步：外植体置于再分化培养基Y-2上，在温度25℃±2℃，光照时间为14小时/天，连续培养3天，使其完全进入活跃的胚性状态。该Y-2培养基为：MS+6-BA 0.2mg/L+KT 0.2mg/L+IAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5g/L。
第四步：将愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行振荡处理，处理时间为48小时，振荡转速60-200RPM，处理温度25℃±2℃。该诱变液Q-1为：MS+6-BA0.1mg/L+秋水仙素0.1％+蔗糖30g/L。
第五步：将处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2中清洗48小时。该清洗液Q-2为：MS+6-BA0.1mg/L+蔗糖30g/L。
第六步：将清洗好的胚性细胞依次转入分化培养基Y-2中分化培养天数为20天，再转入生根培养基M5中生根，培养天数为30天。其中，该Y-2培养基为：MS+6-BA0.2mg/L+KT0.2mg/L+IAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，该M5培养基为：1/2MS+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L。
Claims (9)
1、一种秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，将杨树的愈伤组织胚性细胞置于秋水仙素诱变液Q-1中进行诱变处理后，置于清洗液中清洗，将清洗过的变异细胞分化壮苗，最后进行生根培养，其中，所述的秋水仙素诱变液Q-1为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+秋水仙素0.05-0.5％+蔗糖20-30g/L。
2、根据权利要求1所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的诱变处理是将愈伤组织胚性细胞置于Q-1中振荡12-72小时，振荡转速60-200RPM，处理温度为25℃±2℃。
3、根据权利要求1或2所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的清洗是将秋水仙素处理过的胚性细胞转入清洗液Q-2为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+蔗糖20-30g/L中，清洗12-48小时。
4、根据权利要求1或2所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：将清洗后的胚性细胞置于培养基Y-2中，分化培养20～50天，Y-2为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L。
5、根据权利要求1或2所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的生根培养中在生根培养基M5中，生根培养20～50天，其中，M5培养基为：1/2MS+IBA 0.1-1.0mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂3-8g/L。
6、根据权利要求1或2所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的杨树的愈伤组织胚性细胞的获得方法是切取1～2mm茎段的杨树组培苗作为外植体，用培养基Y-2进行分化培养，其中，Y-2为：MS+6-BA 0.1-0.4mg/L+KT 0.05-0.4mg/L+IAA0.05-0.2mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天。
7、根据权利要求1或2所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的杨树的愈伤组织胚性细胞的获得包括选取杨树组培苗切取1～2mm茎段为外植体，经过培养基Y-1脱分化处理、再经过培养基Y-2再分化处理后获得愈伤组织胚性细胞，其中，Y-1培养基为：MS+2.4-D0.1-0.5mg/L+KT0.1-0.5mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂4-8g/L。
8、根据权利要求7所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的脱分化培养条件是，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天。
9、根据权利要求7所述的秋水仙素诱导杨树突变体的组织培养方法，其特征在于：所述的再分化培养条件是，温度为25℃±2℃，光照时间为14小时/天，培养1～10天。
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2007
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