CN110235783B

CN110235783B - 一口血秋海棠的组培快速繁殖方法

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Publication number: CN110235783B
Application number: CN201910582193.9A
Authority: CN
Inventors: 姜维梅; 何晨琪; 李君珂; 李攀
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-06-30
Filing date: 2019-06-30
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-06-30
Also published as: CN110235783A

Abstract

本发明公开了一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：选择一口血秋海棠野生植株的叶片、叶柄作为外植体；将外植体消毒后作为培养材料进行愈伤组织的诱导和不定芽的分化；再进行不定芽的伸长生长、生根培养、移栽。本发明成功实现了一口血秋海棠的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为该极小种群的保护提供一种切实可行的保护方法。

Description

一口血秋海棠的组培快速繁殖方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一口血秋海棠的组培快速繁殖方法。

背景技术

秋海棠科(Begoniaeeae)秋海棠属(Begonia )植物是世界开花植物种类最丰富的10个大属之一，约有1500～1 600种（Goodall-Copestake et al, 2010; Thomas et al,2011; Hoover et al, 2004)，主要分布于非洲、美洲和亚洲的亚热带和热带地区。中国约有173种，分布于长江以南的地区，常见于云南、广西和贵州(Gu et al, 2007)。该属植物为多年生肉质草本；根状茎圆柱状、块状或球状；叶偏斜呈心形或耳状；雌雄同株稀异株；子房下位，侧膜胎座或中轴胎座；蒴果具不等或近等3翅；种子多数，具领细胞(董莉娜等，2015)。

虽然秋海棠属植物看似几乎无处不在，但大多数物种的分布范围非常狭窄（Hughes and Hollingsworth 2008)，尤其是在石灰岩喀斯特地区，单一的地方特有物种很常见(Chung et al, 2014; Kiew, 2001; Peng et al, 2008; Dewitte et al, 2011)。

一口血秋海棠(B. picturata Yan Liu, S M Ku & CI Peng)，为2005年发表的秋海棠属侧膜组(Begonia sect. Coelocentrum)的1个新种，该种仅分布于广西靖西县古文村，海拔 600～1000 m的石灰岩石壁、石缝隙和岩石上。该植物在靖西端午药市上被研究人员发现，该植物的叶子具有美丽的花纹，全株密被红色的卷曲刚毛，极具观赏价值。同时该植物全株可入药，具有清热解毒、活血散瘀等功效（Liu et al, 2005; 邹玲俐等, 2015）。该物种为广西特有，为极其狭域种类，生境十分脆弱。当地村民采集该植物药用或做猪食，其种群正遭到严重破坏，因此亟待得到有效地保护。

一口血秋海棠为根茎型，其突出特征是叶片正面深绿色或棕色，装饰有宽白色，绿白色或浅绿色环形带纹，背面红色。植株（包括子房和蒴果）密被红色刚毛。花药囊上有一个带有红色边缘的黄色花药，这在侧膜组中是独一无二的。花期3～5月，颜色为白色至粉红色；果期6月至次年的3月；体细胞染色体数目，2n = 30（Liu et al,2005）。

秋海棠属植物作为一种重要的观赏植物，其繁殖方式多样，如通过种子、叶片扦插、组培繁殖等。目前通过组织培养技术进行快速繁殖的秋海棠属植物，主要集中在丽格海棠(B. × hiemalis)（李春秀等，2003）、蟆叶秋海棠(大王秋海棠)（B. rex）(Kaviani et al,2015；徐菲等，2011)、 B. gracilis（Castillo & Smith，1997）球根海棠(B. tuberous)( Nhut et al,2010)、四季海棠(B. semperflorens)（Espino et al,2004）、紫背天葵（B. fimbristipula）(陈雄伟等，2009；陈刚等，2010; 梁廉等,2012)、铁十字秋海棠（铁甲秋海棠）（B. masoniana）(陈琼珍等，1996);掌叶秋海棠(B. hemsleyana)（王辉,2014）、牛耳秋海棠（B.sanguine） (曹芳凤等，2015) 等。组培繁殖秋海棠具有增殖系数高，能保持品种的优良特性等优点，但也存在成本高的不足。因此对一些珍稀濒危物种，采用组培快繁方法进行快速繁殖，以扩大种群规模，具有重要意义。

秋海棠属植物种类多，生长基质不同，物种形态差异大、内部生理状态不同，因此前人已经报道组培成功的秋海棠属物种只能提供参考。目前现有的秋海棠组培繁殖方法是以叶片、叶柄或花梗作为外植体，在MS培养基中添加一定浓度的BA和NAA来诱导不定芽，在此过程中有或无愈伤组织发生。

参考文献：

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文中所提及的缩写字母见如下缩略词表：

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种珍稀濒危植物一口血秋海棠的组培快速繁殖方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：

1）、取材：

选择一口血秋海棠野生植株的叶片、叶柄作为外植体；

2）、外植体消毒：

3）、外植体（叶片、叶柄）的愈伤组织的诱导和不定芽的分化：

以消毒后的外植体作为培养材料；

愈伤组织诱导培养基为以下任一：

愈伤组织诱导培养基Ⅰ： MS+ BA 1.5~2.0 mg/l + IBA 0.1~0.15 mg/l +蔗糖 30g/1 + 琼脂 6.9~7.0 g/ l + PVP 0.8 g/l, pH 5.8~6.0；

愈伤组织诱导培养基Ⅱ：MS+TDZ 0.05~0.1 mg/l+ NAA 0~0.1 mg/l+蔗糖 30g/1+ 琼脂 6.9~7.0 g/ l + PVP 0.8 g/l, pH 5.8-6.0；

愈伤组织的诱导和不定芽的分化的培养条件为：先黑暗培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养1~2周；然后再转入光照强度为35~40µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养（培养时间约为2~3周），当培养材料（即，小叶片、叶柄段）的愈伤组织分化形成由数量≥5个、且每个长度≥0.5 cm不定芽组成的丛生芽时，停止培养；

4）、不定芽的伸长生长

将步骤3）所得的丛生芽分成带有2~3个不定芽的小植株，然后转移到伸长培养基上进行伸长生长，

所述伸长培养基为：MS+BA 0.2~0.5 mg/l+ NAA 0~0.1 mg/l+蔗糖 30 g/l + 琼脂6.9~7.0 g/l + PVP 0.8 g/l，pH 5.8〜6.0；

所述伸长生长培养条件为：先于黑暗培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1 的光/暗（12h/12h）交替培养1周，然后再转入光照强度为 35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养2~3周，停止培养；此时，植株高度长度≥1.5cm；

5）、生根培养：

将步骤4）培养所得的幼苗（高度≥1.5cm）转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为：先在黑暗条件下培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养1周，然后再转入光照强度35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养2~3周，结束生根培养；

此时，幼苗产生至少4条且长度≥ 1.5cm时的根，是在苗的基部接触培养基的部位产生根；

所述生根培养基为以下任意一种：

1/2MS+NAA 0.2~0.4 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l，pH 5.8〜6.0；

1/2MS+IBA 0.4〜0.6 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l， pH5.8〜6.0；

6）、移栽：

将步骤5）已生根的植株，移栽至基质上培养。

作为本发明的一口血秋海棠的组培快速繁殖方法的改进：

所述步骤3）、步骤4）、步骤5）中：

黑暗培养的温度为23± 1 ℃；

光/暗交替培养时，黑暗培养的温度为23± 1 ℃，光照培养的的温度为25± 1℃。

作为本发明的一口血秋海棠的组培快速繁殖方法的进一步改进：

所述步骤2）为：

以叶脉为中心线，切成长、宽各为1.5~2 cm的小块，得小叶片；

将叶柄切成长度为1.5~2 cm的叶柄段；

将小叶片和叶柄段分别进行消毒，相应得到消毒后小叶片、消毒后叶柄段；

所述步骤3）为：

先将消毒后小叶片的四周边缘各去除0.9~1.1mm（约1 mm），然后在叶脉处每间隔3~5 mm 进行切割（可用手术刀切割，要求不能切断叶脉），再将该叶片的远轴面（即，向地面）贴在培养基表面作为培养材料；

将消毒后叶柄段的两端各切除0.9~1.1mm（约1 mm）后，平放在培养基表面作为培养材料。

作为本发明的一口血秋海棠的组培快速繁殖方法的进一步改进：所述步骤6）的移栽为：将植株从培养瓶中取出置于自然环境下锻炼5~7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇水，再放置1~2 天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗（已生根的植株）移栽到混合基质上培养20~35天，开始10~14天温度为22~24°C ，相对湿度为75〜85%；而后为自然温度和自然湿度。

混合基质由多肉颗粒土：泥炭 =2 : 1质量比组成。

在本发明中，可在光源下设置1针的遮阳网从而实现30~35 µmol•m^-2•s^-1的光照强度与35~40 µmol•m^-2•s^-1的光照强度的调节。

步骤2）的消毒为：将小叶片/叶柄段先用含洗洁精的清水（每100 ml清水中加入约0.2 ml洗洁精）进行洗涤，再用流水冲洗（约10 min）；然后用吸水纸将叶片及叶柄上的水吸干，放入超净台上进行消毒；先用70%（体积%）的酒精浸泡30 sec，然后用含有有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液（50 ml次氯酸钠溶液，加入2滴吐温T-20）灭菌5~10 min，无菌水冲洗5次。

在本发明的步骤3）中，叶柄段长度约1.5～2cm长，小叶片的长、宽各为1.5～2 cm，消毒后经相应的切割处理后放置于启动培养基（愈伤组织诱导培养基）上，培养一定时间后，叶柄的一端或者叶片基部切口处有少量愈伤组织，并且在此部位能直接形成不定芽。将丛生芽在无菌条件下取出，用解剖刀分割成带有2～3个芽的小块，置于伸长培养基中培养，在4～5周的时间内，各小块又可再生出5～8个新芽，并且芽的高度能达到1.5 cm以上。

在本发明的步骤5）中，将无菌苗（长度≥1.5 cm）接种到生根培养基上，经过4～5周的培养，每个幼苗能产生4～10条根，根的长度≥1.5 cm。

在本发明的方案中：是通过一口血秋海棠的野生植株的叶片和叶柄作为外植体，在同一种培养基上既能进行叶片或叶柄愈伤组织的诱导，同时在愈伤组织上又能进行不定芽的分化。此操作减少了培养步骤，省时、省力，可以在短时间内获得大量的试管苗。

愈伤组织诱导培养基Ⅰ：在1L的MS基本培养基加入 BA 1.5~2.0 mg、 IBA 0.1~0.15 mg、蔗糖 30 g、琼脂 6.9~7.0 g、 PVP 0.8 g；均匀混合后调节pH为 5.8～6.0；可利用1 mol/L的KOH或1 mol /L的HC1调节pH。

其余培养基按照上文中告知的配方相应制备而得。

1/2MS为 1/2MS基本培养基，即溶液中所有物质的含量为MS基本培养基的一半。

发明人在科技部西南地区极小种群物种调查项目中，有幸从事一口血秋海棠的资源调查，从不同种群中，各随机采集1株，利用叶片、叶柄作为外植体，建立了一口血秋海棠不同种群离体快繁的技术体系，用于该种质资源的保存、快繁及后续原产地的仿生栽培等研究，为该极小种群的延续、种群规模的扩大奠定了基础。

本发明具有如下的技术优势：

（1）一口血秋海棠的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约。

（2）增殖速度快，生产周期短（全程从叶片或叶柄到形成有根的植株仅需约12周），设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便干工厂化生产。

（3）该技术方法解决了一口血秋海棠快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高的要求，可应用于工业化生产。

（4）可以保存一口血秋海棠的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。

在本发明中，在叶片和叶柄培养时，添加一定浓度的BA和IBA组合能得到较好的不定芽发生率。较低浓度的TDZ和NAA组合，使每个叶片切块不定芽的数量显著增多。叶片培养时，叶脉处每隔切割3~5 mm 进行切割，造成创伤，但不切断，在此部位容易形成不定芽。秋海棠是阴生植物，采用本发明由暗培养逐渐过渡到光培养的方法[暗培养——光/暗交替（30~35 µmol•m^-2•s^-1）——光/暗交替（35~40 µmol•m^-2•s^-1）]能够使苗生长健壮。喀斯特地貌石灰岩基质上生长的秋海棠，根系沿基质蔓延，不是深入基质内部。因此炼苗及移栽的基质对移栽成活率影响很大。本发明采用多肉颗粒土：泥炭 (2 : 1) 的混合基质上进行炼苗，能兼顾根系的透气性和营养。到目前为止，未见一口血秋海棠组培快繁的研究。因此，作为该濒危物种保护的一种方法，建立一种高效、离体快繁的方法，用于保存该资源刻不容缓。

综上所述，本发明通过大量试验，摸索出一套成熟的方法，成功实现了一口血秋海棠的组培快繁，可以快速培育出大量幼苗，为该极小种群的保护提供一种切实可行的保护方法。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为一口血秋海棠的组培快繁图；

A.无菌的叶片切块在MS+ BA 2 mg/l+ IBA 0.15 mg/l+蔗糖 30 g/l +琼脂 6.9g/ l + PVP 0.8 g/l的培养基上，在叶片基部形成的愈伤组织和丛生芽；

B. 无菌的叶片切块在MS + TDZ 0.1 mg/l+ NAA 0.05 mg/l+ 蔗糖 30 g/l + 琼脂 6.9 g/ l + PVP 0.8 g/l的启动培养基上形成的愈伤组织和大量的丛生芽；

C. 无菌的叶柄在 MS+TDZ 0.1 mg/l+ NAA 0.05 mg/l+ 30 g/l蔗糖+ 琼脂 6.9g/ l + PVP 0.8 g/l的培养基上，在叶柄一端形成的愈伤组织和不定芽；

D.丛生芽切成带有2〜3个芽的小块，在MS+ BA 0.5 mg/l+ NAA 0.02 mg/l+ 蔗糖30 g/l + 琼脂 6.9 g/ l + PVP 0.8 g/l 的培养基上进行伸长生长；

E.长度≥1.5 cm的不定芽在1/2MS+ NAA 0.2 mg/l+ 蔗糖 20 g/l + 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l的培养基上生根培养

F.移栽到基质上，生长1个月的幼苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实施例中：

黑暗培养（24小时全部黑暗培养）的温度为22〜24℃ ；

光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养（即，光下带有1针的遮阳网）：光培养时，光照强度为30～35 µmol•m^-2•s^-1，时间为12小时，温度为24〜26℃ ；黑暗培养时，培养时间为12小时，温度为22〜24℃。

光照强度为35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养时：光培养时，光照培养时光照强度为35〜40 µmol•m^-2•s^-1 ，时间为12小时，温度为24〜26℃；黑暗培养时，培养时间为12小时，温度为22〜24℃。

实施例1 、一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，依次进行以下步骤：

1）、取材：

选择一口血秋海棠野生植株的叶片和叶柄作为外植体；

2）、外植体消毒：

将叶片切去顶端和边缘后，以叶脉为中心线，切成长、宽各为1.5～2 cm的小块，得小叶片；

将叶柄切成1.5～2 cm 的切段，每100 ml清水中加入约0.2 ml洗洁精，先用此含洗洁精的清水进行洗涤，再用流水冲洗10 min。然后用吸水纸将叶片及叶柄上的水吸干，放入超净台上进行消毒。先用70%的酒精浸泡30 sec，然后用含有有效氯浓度为1%的次氯酸钠溶液（50 ml，加入2滴吐温T-20）灭菌5～10 min，无菌水冲洗5次。

采用上述消毒方式，叶片的存活率约为45~50%；叶柄切段的存活率为60%。

3）、叶片、叶柄愈伤组织的诱导和不定芽的分化：

先将消毒后小叶片的四周边缘各去除约1 mm，然后在叶脉处每间隔3~5 mm 进行切割（用手术刀切割），切割深度为不切断叶脉；再将该叶片的远轴面（即，下面）贴在培养基表面作为培养材料；

或者，将消毒后叶柄段的两端各切除1 mm后，平放在培养基表面作为培养材料；

愈伤组织的诱导和不定芽的分化的培养条件为：先黑暗培养1周，温度为23± 1℃；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养（光下带有1针遮阳网）1~2周；然后再转入光照强度为35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养（培养时间约为2~3周）；当培养材料（即，小叶片、叶柄段）的愈伤组织分化形成由数量≥5个、且每个长度≥0.5 cm不定芽组成的丛生芽时，停止培养。

愈伤组织诱导培养基为以下任一：

愈伤组织诱导培养基Ⅰ：MS+ BA 1.5～2.0 mg/l + IBA 0.1～0.15 mg/l +蔗糖30 g/1 + 琼脂 6.9～7.0 g/ l + PVP 0.8 g/l, pH 5.8～6.0；

和MS+TDZ 0.05～0.1 mg/l+ NAA 0～0.1 mg/l+蔗糖 30g/1 + 琼脂 6.9～7.0g/ l + PVP 0.8 g/l, pH 5.8-6.0；

4）、不定芽的伸长生长

将步骤3）所得的丛生芽切开分成带有2~3个不定芽的小植株，然后转移到伸长培养基上进行伸长生长；

先于黑暗培养1周，温度为23± 1 ℃；然后转入光/暗（12h/12h）交替培养（光下带有1针遮阳网）1周，光照强度为30～35 µmol•m^-2•s^-1 ；然后再置于25± 1 ℃，光/暗（12h/12h）交替培养约2～3周，光照强度为 35～40 µmol•m^-2•s^-1。

停止培养后，植株高度长度≥1.5cm。

伸长培养基为：MS+BA 0.2～0.5 mg/l+ NAA 0～0.1 mg/l+蔗糖 30 g/l + 琼脂6.9～7.0 g/l + PVP 0.8 g/l，pH 5.8〜6.0；

5）、生根培养：

将步骤4)培养所得高度≥1.5cm的幼苗转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为首先在黑暗条件下培养1周，温度为23± 1 ℃；然后转入光/暗（12h/12h）交替培养（光下带有1针遮阳网）1周，光照强度为30～35 µmol•m^-2•s^-1；然后再置于25± 1 ℃, 光/暗（12h/12h）交替培养约2～3周，光照强度35～40 µmol•m^-2•s^-1。

结束生根培养后，苗的基部接触培养基的部位产生根的数量≥4，长度≥1.5cm。

所述生根培养基为以下任意一种：

1/2MS+NAA 0.2～0.4 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l，pH 5.8〜6.0；

1/2MS+IBA 0.4〜0.6 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l, pH5.8〜6.0；

6）、移栽：

将步骤5）已生根的植株的培养瓶取出，置于自然环境下锻炼5～7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇水，再放置1～2 天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到多肉颗粒土：泥炭 (2 : 1) 的混合基质上培养20～35天，开始10～14天温度为22～24°C ，相对湿度为75〜85%；而后为自然温度和自然湿度。

移栽成活率达到80～85%。

按照上述实施例1所述方法进行如下实验：

实验1 、

选用叶片作为外植体；

步骤3）所用为愈伤组织诱导培养基Ⅰ： MS+ BA2.0 mg/l + IBA0.15 mg/l +蔗糖30 g/1 + 琼脂 6.9~7.0 g/ l + PVP 0.8 g/l, pH 5.8~6.0；将叶片置于暗中培养1周，愈伤组织从叶片主脉切割处形成，愈伤组织诱导率为75.6%。然后将叶片转入光/暗（12h/12h）交替培养（光下带有1针的遮阳网）培养2周后，再将叶片置于光/暗（12h/12h）交替培养2周。结果在愈伤组织上形成不定芽，不定芽的发生频率为55.6%。丛生芽的数目平均为5.4个（长度≥0.5 cm）。

步骤4）中伸长培养基的配方为： MS+ BA 0.5 mg/l+ NAA 0.02 mg/l +蔗糖 30g/l + 琼脂6.9~7.0 g/l + PVP 0.8 g/l，pH 5.8〜6.0；将伸长培养的材料经过暗中培养1周；12h/12h（光/暗）培养1周（光下带1针遮阳网）；12h/12h（光/暗）培养3周，从生芽的增殖倍数为4.5，芽的平均高度为2.7 cm。

步骤5）中生根培养基的配方为1/2 MS+ NAA 0.2 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l，pH 5.8。先在黑暗条件下培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养1周，然后再转入光照强度35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗（12h/12h）交替培养2周。经过上述4周培养，生根率可达100%。植株高度平均为3.2 cm。

炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达82.8%。

说明：

愈伤组织的诱导率=产生愈伤组织的叶片切块/接种的叶片切块数；

不定芽的发生频率=发生不定芽的愈伤组织块/接种的愈伤组织块数；

从生芽的增殖倍数=增殖培养后芽的数目/最初接种的芽的数目；

成活率=成活的幼苗数/移栽的幼苗总数。

实验2 选用叶片作为外植体；

步骤3）所用为愈伤组织诱导培养基Ⅱ：MS + TDZ 0.1 mg/l+ NAA 0.05 mg/l+蔗糖30 g/l + 6.9 g/ l琼脂+0.8 g/l PVP，pH 5.8〜6.0；培养条件同实验1。结果愈伤组织的诱导率为87.5%，不定芽的发生频率为81.3%，从生芽的数目大于20个。

步骤4）中伸长培养基的配方为：MS+ BA 0.5 mg/l+ NAA 0.05 mg/l+30 g/l蔗糖+琼脂6.9 g/ l + PVP 0.8 g/l，pH 5.8〜6.0；培养条件同实验1。经过5周的生长，从生芽的增殖倍数为4.2，芽的平均高度为2.5 cm。

步骤5）中生根培养基的配方为：1/2 MS+ IBA 0.5 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂7.3g/l + PVP 0.8g/l，pH 5.8〜6.0；培养条件同实验1。经过4周培养，生根率可达100%，植株高度平均为 3.8 cm。

炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达85.0%。

实验3 、将实验2中的外植体由叶片改成叶柄，其余等同于实验2。

所得结果为：愈伤组织从叶柄的一端形成，愈伤组织诱导率为65.2%。在愈伤组织上能形成不定芽，不定芽的发生频率为44.5%，丛生芽的数目平均为6.0个。从生芽的增殖倍数为4.6，芽的平均高度为2.6 cm。生根率可达100%，植株高度平均为 3.0 cm。炼苗一个月后移栽到林下，成活率可达83%。

对比例1-1、将实验1的愈伤组织诱导培养基Ⅰ中“BA 2mg/l+ IBA 0.15 mg/l ”改为“KT 2 mg/l + IBA 0.15 mg/l”，其余等同于实验1；则叶片切块愈伤组织的诱导率为56.5%，不定芽的发生频率为38.7%。

对比例1-2 将实验1的伸长培养基中BA的浓度保持不变，去除NAA（即，NAA浓度改为0），其余等同于实验1；结果芽的增殖倍数为3.2倍，并且芽呈现黄绿色。

对比例1-3，将实验1的生根培养基改为 1/2MS不加激素（即，NAA浓度改为0），其余等同于实验1，经过4周培养，生根率为78%，但根短，细，数量少，移栽成活率为 65%。

对比例1-4、将实验1步骤 3）、步骤4）和步骤5）中的“光下带有1针的遮阳网，即，

光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的光/暗交替培养”均改成“光照强度为 35~40 µmol•m^-2•s^-1的光/暗交替培养” ，其余等同于实验1。所得结果为：不定芽的发生频率约为47%，从生芽的增殖倍数约为4；生根率约为90%。

对比例2-1 、将实验2的愈伤组织诱导培养基Ⅱ中的TDZ的浓度改为0.5 mg/l，其余等同于实验2；则叶片切块愈伤组织的诱导率为77.5%，不定芽的发生频率为68.5%。

对比例2-2 、将实验2的伸长培养基中BA的浓度保持不变，NAA的浓度由0.05 mg/l增加到0.1 mg/l，其余等同于实验2；结果芽的增殖倍数为3.4倍，并且芽呈现黄绿色。

对比例2-3、将实验2步骤4）的伸长生长和步骤5）的生根培养的光照时间由12h/12h(光/暗)，改为16h/8 h(光/暗)；其余等同于实验2；结果芽的增殖倍数为2.5，部分植株出现黄绿色，移栽成活率为60%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于依次进行以下步骤：

1）、取材：

选择一口血秋海棠野生植株的叶片作为外植体；

2）、外植体消毒：

3）、外植体的愈伤组织的诱导和不定芽的分化：

以消毒后的外植体作为培养材料；

愈伤组织诱导培养基为：MS + TDZ 0.1 mg/l+ NAA 0.05 mg/l+蔗糖30 g/l + 6.9 g/l琼脂+0.8 g/l PVP，pH 5.8〜6.0；

愈伤组织的诱导和不定芽的分化的培养条件为：先黑暗培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养1~2周；然后再转入光照强度为35~40 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养，当培养材料的愈伤组织分化形成由数量≥5个不定芽组成的丛生芽时，停止培养；

4）、不定芽的伸长生长

将步骤3）所得的丛生芽分成带有2~3个不定芽的小植株，然后转移到伸长培养基上进行伸长生长；

所述伸长培养基为：MS+BA 0.5 mg/l+ NAA0.05 mg/l+蔗糖 30 g/l + 琼脂6.9~7.0g/l + PVP 0.8 g/l，pH 5.8〜6.0；

所述伸长生长培养条件为：先于黑暗培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养1周，然后再转入光照强度为 35~40 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养2~3周，停止培养；

5）、生根培养：

将步骤4）培养所得的幼苗转入生根培养基中进行生根培养；

生根培养的条件为：先在黑暗条件下培养1周；然后转入光照强度为30~35 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养1周，然后再转入光照强度35~40 µmol•m^-2•s^-1的12h光/12h暗交替培养2~3周，结束生根培养；

所述生根培养基为以下任意一种：

1/2MS+IBA 0.4〜0.6 mg/l+蔗糖 20g/l+ 琼脂 7.3g/l + PVP 0.8g/l，pH 5.8〜6.0；

所述步骤3）、步骤4）、步骤5）中：

黑暗培养的温度为23± 1 ℃；

光/暗交替培养时，黑暗培养的温度为23± 1 ℃，光照培养的温度为25± 1 ℃；

6）、移栽：

将步骤5）已生根的植株，移栽至基质上培养。

2.根据权利要求1所述的一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于：

所述步骤2）为：

将小叶片进行消毒，得到消毒后小叶片；

所述步骤3）为：

先将消毒后小叶片的四周边缘各去除0.9~1.1mm，然后在叶脉处每间隔3~5 mm 进行切割，再将该叶片的远轴面贴在培养基表面作为培养材料。

3.根据权利要求1或2所述的一口血秋海棠的组培快速繁殖方法，其特征在于：

所述步骤6）的移栽为：将植株从培养瓶中取出置于自然环境下锻炼5~7天，然后打开瓶盖，在培养基表面浇水，再放置1~2 天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到混合基质上培养20~35天，开始10~14天温度为22~24°C ，相对湿度为75〜85%；而后为自然温度和自然湿度。