CN102960251B - 一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其培养基。所述培养基为成套培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和/或生根培养基；所述诱导培养基为在MS基本培养基中添加细胞分类素(6-BA或KT)0.1mg/L和生长素（2,4-D或NAA）0.1mg/L；所述增殖培养基为在MS基本培养基中添加细胞分类素(6-BA)1.0—2.0mg/L和生长素（2,4-D或NAA）0.5mg/L；所述生根培养基为在1/2—1/8MS基本培养基中添加NAA 0.01—0.1mg/L。本发明的优点如下：诱发巴戟天不定芽的时间短，从接种带节茎段至获得1-3cm长的不定芽只需15天；增殖频率高，繁殖系数为（46—56）/50天；生长周期短、且苗齐苗壮、生长良好。本发明为巴戟天组培快繁提供了一种高效的方法和途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种获得巴戟天体细胞再生植株的方法及其培养基。
背景技术
巴戟天（Morinda officinalis How.）是茜草科多年生木质藤本植物，肉质根入药，根皮含蒽醌化合物，环烯醚萜甙、植物甾醇及多糖、低聚糖等药用成分。具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿等功效，用途十分广泛，是目前我国出口创汇和内需的主要中药品之一，加上近年来巴戟天的市场需求量大，以至巴戟天的栽培规模不断扩大，由于巴戟天种植是剪取自身藤条作为种苗，对于大规模种植时所需种苗产生了瓶颈制约，本技术是利用植物细胞的全能性进行苗木培育：植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育为完整植株的潜能，因为每个细胞都是来自于受精卵，所以有与受精卵具有相同的遗传物质。基于植物此特点，有必要对巴戟天进行组培快繁研究，为种植户提供优质、大量巴戟天种苗，切实解决巴戟天苗木需求的瓶颈，提高巴戟天种植产量。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于获得巴戟天（Morinda officinalis How.）体细胞再生植株的成套培养基，它含有独立包装的培养基A（即诱导培养基），所述培养基A为由MS基本培养基、细胞分裂素、生长素、蔗糖或葡萄糖、和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基A中的所述细胞分裂素的含量为0.1mg/L；
所述培养基A中的所述生长素的含量为0.1mg/L。
在上述成套培养基中，所述培养基A中的所述细胞分裂素为6-BA或KT；
和/或，所述培养基A中的所述生长素为2,4-D或NAA；
和/或，所述培养基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量为20g/L；
和/或，所述培养基A中的所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述培养基A中的含量为7—8g/L。
在上述成套培养基中，还可含有独立包装的培养基B（即增殖培养基），所述培养基B为由MS基本培养基、细胞分裂素、生长素、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基B中的所述细胞分裂素的含量为1.0—2.0mg/L；
所述培养基B中的所述生长素的含量为0.5mg/L。
在上述成套培养基中，所述培养基B中的所述细胞分裂素为6-BA；
和/或，所述培养基B中的所述生长素为2,4-D或NAA；
和/或，所述培养基B中的所述蔗糖的含量为20g/L；
和/或，所述培养基B中的所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述培养基B中的含量为7—8g/L。
在上述成套培养基中，还可含有独立包装的培养基C（即生根培养基），所述培养基C为由1/2—1/8的MS基本培养基、NAA和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基C中的所述NAA的含量为0.01—0.1mg/L，如0.01mg/L、0.05mg/L或0.1mg/L；
所述培养基C中的所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述培养基C中的含量为4—6g/L。
本发明的另一个目的是提供一种获得巴戟天（Morinda officinalis How.）体细胞再生植株的方法，所述方法包括将所述巴戟天的带节茎段用所述培养基A进行诱导培养获得巴戟天不定芽的步骤。
所述方法还可包括将所述巴戟天不定芽用所述培养基B进行扩繁培养以获得更多不定芽的步骤。
所述方法还可包括将所述巴戟天不定芽用所述培养基C进行生根培养的步骤。
在上述方法中，所述将所述巴戟天的带节茎段用所述培养基A进行诱导培养前，包括将所述巴戟天的带节茎段按照包括如下步骤1）-2）的方法进行消毒的步骤：
1）用体积百分含量为75%的乙醇溶液浸泡30秒；
2）用有效氯质量百分含量为10%的次氯酸钠溶液浸泡20分钟。
在上述方法中，所述诱导培养的光照条件为先黑暗培养7天再按照如下光照条件培养：每天24小时中光照12小时，光照的强度为1000—3000lux，其余时间为黑暗；所述诱导培养的温度为26℃—28℃；
和/或，所述扩繁培养的光照条件为先在每天24小时中光照12小时、光照强度为2000lux、其余时间为黑暗的条件下培养7天，再移至每天24小时中光照12小时，光照强度为1000—1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养；所述扩繁培养的温度为26℃—28℃；
和/或，所述生根培养的光照条件为先在每天24小时中光照12小时，光照强度为1000—1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养，再移至1000-2000lux条件下培养；所述生根培养的温度为22℃。
所述MS基本培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。
使用本发明所提供的培养基和培养方法进行巴戟天体细胞再生植株培养的优点如下：诱发巴戟天不定芽的时间短，从接种带节茎段至获得1-3cm长的不定芽只需15天，而现有技术一般为20-30天；增殖频率高，繁殖系数为（46-56）/50天，现有技术一般为6/50天；生长周期短、且苗齐苗壮、生长良好。本发明为巴戟天组培快繁提供了一种高效的方法和途径。
附图说明
图1为巴戟天经诱导培养获得的带不定芽的茎段。
图2为巴戟天不定芽经扩繁培养获得的丛生芽。
图3为巴戟天的生根培养。
图4为包括根茎叶的巴戟天再生植株。
图5为经组织培养获得的巴戟天再生植株移栽后的杯苗。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的MS基本培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。
表1.MS基本培养基
| 大量元素 | 培养基中浓度（g·L-1） |
| NH4NO3 | 1.65 |
| KNO3 | 1.9 |
| KH2PO4 | 0.17 |
| MgSO4·7H2O | 0.37 |
| CaCl2·2H2O | 0.44 |
| 微量元素 | 培养基中浓度（mg·L-1） |
| FeSO4·7H2O | 27.8 |
| Na2EDTA | 37.3 |
| MnSO4·4H2O | 22.3 |
| ZnSO4·4H2O | 8.6 |
| H3BO3 | 6.2 |
| KI | 0.83 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| 有机成分 | 培养基中浓度（mg·L-1） |
| 甘氨酸 | 2.0 |
| 盐酸硫胺素 | 0.1 |
| 盐酸吡哆素 | 0.5 |
| 烟酸VB5 | 0.5 |
| 肌醇 | 100 |
实施例1、获得巴戟天体细胞再生植株的方法
1、外植体的获取
选择生长优良的巴戟天（Morinda officinalis How.）枝条，采集巴戟天新梢生至30～50㎝的茎，选择晴好的天气，剪下新枝，除去叶子，留一小段叶柄，立即放入装有少量清水的塑料袋运回组培室；先用自来水冲洗15分钟，去掉老叶，剪成约3㎝～5㎝长的带节茎段。
2、外植体的消毒
将步骤1获得的巴戟天带节茎段在超净工作台中进行如下消毒处理：
用体积百分含量为75%的乙醇溶液浸泡30秒；除去液体后用无菌水洗一遍；用有效氯质量百分含量为10%的次氯酸钠溶液浸泡20分钟，除去液体用无菌水洗三至五次；用无菌吸水纸吸干巴戟天带节茎段表面水份。
3、芽的诱导培养
无菌条件下，将经步骤2消毒处理过的带节茎段的两端伤口剪去，获得1—2cm长的带节茎段，插入诱导培养基中进行不定芽诱导培养；培养的光照条件为先黑暗培养1周再按照如下光照条件培养：每天24小时中光照12小时，光照的强度为1000—3000Lux，其余时间为黑暗；培养温度为26℃—28℃；空气湿度在70%以下。
经上述诱导培养的茎段，其茎节处会长出不定芽（图1），当不定芽长为1—3㎝时，可用于步骤4的增殖培养。
上述诱导培养基的基础培养基是MS基本培养基（表1），向MS基本培养基中添加激素NAA 0.1mg/L、6-BA 0.1mg/L，葡萄糖20g/L和琼脂7g/L，灭菌前调pH值为5.7，121℃高压灭菌20min，得到的固体培养基即为该诱导培养基。
统计方法：随机取30—45个带节茎段，每10—15个为一个重复，在带节茎段插入诱导培养基7天后，统计污染率（长菌茎段数/插入茎段数）；在插入诱导培养基14天后，统计诱导率（即获得长1—3㎝不定芽的茎段数占插入茎段数的百分比）。结果如表2所示。
4、芽的扩繁培养
无菌条件下，将步骤3获得的长为1-3㎝的不定芽切下，接种于增殖培养基上进行扩繁培养获得丛生芽（图2）；培养的光照条件为先在每天24小时中光照12小时、光照强度为2000lux、其余时间为黑暗的条件下培养7天，再移至每天24小时中光照12小时，光照强度为1000-1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养；培养温度为26℃—28℃；空气湿度在70%以下。
上述增殖培养基的基础培养基是MS基本培养基，向MS基本培养基中添加NAA0.5mg/L、6-BA 2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂7g/L，灭菌前调pH值为5.7，121℃高压灭菌20min，得到的固体培养基即为该增殖培养基。
每个接种的不定芽经扩繁培养发育为一个丛生芽，当丛生芽长到高为2㎝时，将丛生芽分成的高为1—2cm单个不定芽，转移至新配制的增殖培养基按照同样方法进行再次扩繁培养。
统计方法：随机取96—120个初次扩繁培养的不定芽，每32—40个不定芽为一个重复，经扩繁培养50天后（即扩繁2次，每次25天），统计繁殖系数（即获得高为1—2cm的不定芽数目/初次扩繁培养的不定芽数目），结果如表2所示。
5、生根培养
从经步骤4扩繁培养2次获得的高为2㎝的丛生芽上取高为1—2㎝的不定芽转移到生根培养基中进行生根培养（图3），获得包括根茎叶的巴戟天再生植株（图4）；生根培养的光照条件：为先在每天24小时中光照12小时，光照强度为1000—1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养，再移至1000-200Lux条件下培养；所述生根培养的温度为22℃。
上述生根培养基的基础培养基是1/2的MS基本培养基，向1/2MS基本培养基中添加NAA 0.01mg/L、琼脂4g/L，灭菌前调pH值为5.7，121℃高压灭菌20min，得到的固体培养基即为该生根培养基。
统计方法：随机取60个进行生根培养的不定芽，每20个为一个重复，经生根培养7天后，统计生根率（即生根的再生植株数占进行生根培养的不定芽数的百分比），同时观察再生植株主根粗壮，须根较多，叶色浓绿，苗茎紫红。结果如表2所示。
6、再生植株的移栽
待步骤5获得的包括根茎叶的再生植株长至含5片叶以上时，从培养基中取出，洗去培养基，用多菌灵浸泡10分钟，移栽到黄心土和泥炭土（或椰糠）为2:10的混合基质中，置于温室中进行常规栽培管理，定时浇水，注意遮光保湿。30天后统计再生植株的移栽成活率，结果如表2所示。
表2.巴戟天体细胞植株再生实验结果（一）
| 重复 | 污染率(%） | 诱导率(%） | 繁殖系数(50天) | 生根率(%） | 成活率(%） |
| 1 | 10 | 80 | 59 | 80 | 85 |
| 2 | 6 | 85 | 52 | 75 | 90 |
| 3 | 7 | 89 | 58 | 78 | 84 |
| 平均 | 7.7 | 85 | 56 | 77 | 86 |
实施例2、获得巴戟天体细胞再生植株的方法
1、外植体的获取
与实施例1中步骤1的方法相同。
2、外植体的消毒
与实施例1中步骤1的方法相同。
3、芽的诱导培养
按照实施例1中步骤3的方法进行，不同之处在于：诱导培养基是向MS基本培养基中添加2,4-D 0.1mg/L,KT 0.1mg/L,蔗糖20g/L和琼脂8g/L。
4、芽的扩繁培养
按照实施例1中步骤4的方法进行，不同之处在于：增殖培养基是向MS基本培养基中添加NAA 0.5mg/L、6-BA 2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂7.5g/L。
5、生根培养
按照实施例1中步骤5的方法进行，不同之处在于：生根培养基的基础培养基是1/6的MS基本培养基，向该基础培养基中添加NAA 0.05mg/L和琼脂5g/L。
6、再生植株的移栽
按照实施例1中步骤6的方法进行。结果如表3所示。
表3.巴戟天体细胞植株再生实验结果（二）
| 重复 | 污染率(%） | 诱导率(%） | 繁殖系数(50天) | 生根率(%） | 成活率(%） |
| 1 | 8 | 88 | 48 | 95 | 84 |
| 2 | 8 | 72 | 52 | 88 | 87 |
| 3 | 7 | 80 | 54 | 89 | 74 |
| 平均 | 7.7 | 80 | 51 | 90 | 82 |
实施例3、获得巴戟天体细胞再生植株的方法
1、外植体的获取
与实施例1中步骤1的方法相同。
2、外植体的消毒
与实施例1中步骤1的方法相同。
3、芽的诱导培养
按照实施例1中步骤3的方法进行，不同之处在于：诱导培养基是向MS基本培养基中添加2,4-D 0.1mg/L,6-BA 0.1mg/L,蔗糖20g/L和琼脂8g/L。
4、芽的扩繁培养
按照实施例1中步骤4的方法进行，不同之处在于：增殖培养基是向MS基本培养基中添加2,4-D 0.5mg/L,6-BA 1.0mg/L,蔗糖20g/L和琼脂8g/L。
5、生根培养
按照实施例1中步骤5的方法进行，不同之处在于：生根培养基的基础培养基是1/8的MS基本培养基，向该基础培养基中添加NAA 0.1mg/L和琼脂6g/L。
6、再生植株的移栽
按照实施例1中步骤6的方法进行。结果如表4所示。
表4.巴戟天体细胞植株再生实验结果（三）
| 重复 | 污染率(%） | 诱导率(%） | 繁殖系数(50天) | 生根率(%） | 成活率(%） |
| 1 | 7 | 71 | 42 | 71 | 76 |
| 2 | 10 | 82 | 56 | 72 | 78 |
| 3 | 9 | 73 | 40 | 72 | 76 |
| 平均 | 8.6 | 75 | 46 | 72 | 77 |
Claims (4)
1.用于获得巴戟天（Morinda officinalis How.）体细胞再生植株的成套培养基，其特征在于：所述成套培养基中含有独立包装的培养基A、独立包装的培养基B和独立包装的培养基C；
所述培养基A为由MS基本培养基、细胞分裂素、生长素、蔗糖或葡萄糖、和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基A中的所述细胞分裂素的含量为0.1mg/L；
所述培养基A中的所述生长素的含量为0.1mg/L；
所述培养基A中的所述细胞分裂素为6-BA或KT；
所述培养基A中的所述生长素为2,4-D或NAA；
所述培养基A中的所述蔗糖或葡萄糖的含量为20g/L；
所述培养基A中的所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述培养基A中的含量为7—8g/L；
所述培养基B为由MS基本培养基、细胞分裂素、生长素、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基B中的所述细胞分裂素的含量为1.0—2.0mg/L；
所述培养基B中的所述生长素的含量为0.5mg/L；
所述培养基B中的所述细胞分裂素为6-BA；
所述培养基B中的所述生长素为2,4-D或NAA；
所述培养基B中的所述蔗糖的含量为20g/L；
所述培养基B中的所述凝固剂为琼脂，所述琼脂在所述培养基B中的含量为7—8g/L；
所述培养基C为1/2—1/8的MS基本培养基、NAA和凝固剂制成的固体培养基；
所述培养基C中的所述NAA的含量为0.01—0.1mg/L；
所述培养基C中的所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述培养基C中的含量为4—6g/L。
2.获得巴戟天（Morinda officinalis How.）体细胞再生植株的方法，其特征在于：所述方法包括将巴戟天的带节茎段用权利要求1所述成套培养基中所述培养基A进行诱导培养获得巴戟天不定芽的步骤；
所述方法包括将所述巴戟天不定芽用权利要求1所述成套培养基中所述培养基B进行扩繁培养的步骤和将所述巴戟天不定芽用权利要求1所述成套培养基中所述培养基C进行生根培养的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：将所述巴戟天的带节茎段用权利要求1中的所述培养基A进行诱导培养前，将所述巴戟天的带节茎段按照包括如下步骤1）-2）的方法进行消毒的步骤：
1）用体积百分含量为75%的乙醇溶液浸泡30秒；
2）用有效氯质量百分含量为10%的次氯酸钠溶液浸泡20分钟。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
所述诱导培养的光照条件为先黑暗培养7天再按照如下光照条件培养：每天24小时中光照12小时，光照的强度为1000—3000lux，其余时间为黑暗；所述诱导培养的温度为26℃—28℃；
和/或，所述扩繁培养的光照条件为先在每天24小时中光照12小时、光照强度为2000lux、其余时间为黑暗的条件下培养7天，再移至每天24小时中光照12小时，光照强度为1000—1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养；所述扩繁培养的温度为26℃—28℃；
和/或，所述生根培养的光照条件为先在每天24小时中光照12小时，光照强度为1000—1500Lux，其余时间为黑暗的条件下培养，再在1000-2000Lux条件下培养；所述生根培养的温度为22℃。
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