CN1379972A - 巴戟天组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种植物的组织培养方法。该方法包括消毒、诱导、分化增殖、生根和移栽等阶段,在消毒阶段采用抗菌素(例如青霉素)无菌水溶液浸泡消毒;在诱导、分化增殖、生根和移栽等阶段的培养基以MS常规基本培养基为基础,辅以6－苄基嘌呤、2,4－二氯苯氧基乙酸、LAA、萘乙酸和蔗糖等营养素、激素、生长素等。具有诱发时间短、出苗快、增殖频率高、生长周期短,且苗齐苗壮、生长良好等优点。

Description

巴戟天组织培养方法

技术领域：本发明涉及一种植物的组织培养方法。

背景技术：巴戟天是茜草科多年生攀援木质藤本植物，是我国四大南药之一。其肉质根可供药用，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的作用，为主要的出口创汇药材。传统的栽繁殖技术主要是用种子和扦插繁殖，其繁殖速率很低，严重影响其产量和质量。长期以来，其繁殖技术一直是生产中亟待解决的突出问题之一。

采用组织培养技术繁殖植物可以得到很高繁殖速率，植物组织培养技术是利用植物细胞全能性(即每一个细胞都潜在着发育成一个新个体的能力)。采取植物上的细胞团，分生组织或营养器官的微小部分，通过人工配制不同营养成分和激素调控，使这些组织细胞形成成千上万小植株并且保存了母体内全部优良遗传性状，这种方法可以在短时间内获得大量试管苗。由于生产幼苗是在试管内进行并摆放在有光照条件下的恒温房间内，四季都可以进行，而且在极少的面积内进行大规模生产，因而不占用土地。如果利用组织培养技术成功地繁殖巴戟天，不但可以有效提高其成活率，提高药用价值，节约资源，节省人力，物力，而且还可提高经济效益，为我国出口创汇，这是一个很好的发展方向。

巴戟天的试管快繁至少在以下四个方面具有重要的意义：

第一，繁殖速度极快。由于巴戟天植物生命周期长，通过种子繁殖往往难以满足生产上对苗木的需求量。扦插繁殖虽然可以在一定程度上加快繁殖速度，但大面积生产仍难以用这种方法满足苗木需求量，试管繁殖不受气候因素的影响、可以一年四季在室内繁殖，而且繁殖速度极快。所以，在速度上具有其他方法无法比拟的优点。

第二，便于保持优良种性。在自然界，巴戟天在遗传上往往是高杂合的。如果用种子繁殖，则会导致严重的性状分离；而通过试管快繁获得的苗木在遗传性状上则一般是高度一致的，因为试管繁殖是一种严格的无性繁殖途径。

第三，试管快繁在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面也具有非常重要的意义。一株具有明显优势的巴戟天突变体，或者一个具有明显优势的后代，经过试管快繁后即可大面积推广种植。

第四，经济效益显著。巴戟天植物的试管快繁较之草本植物更具有利用价值，因为一株优良巴戟天苗木定植后可生长几年甚至更长时间，而且单位面积上用苗量不大。所以，单株巴戟天试管苗所得的经济效益就更加显著。

草本植物的组织培养方法已有报道，但木质藤本植物巴戟天的组织培养方法未见报道。由于巴戟天表面有绒毛，从野外采集的外植体，如茎尖、嫩茎、嫩叶等，其表面滋生着菌类病毒，有的菌类甚至长入组织内部，致使表面消毒剂很难杀死组织内部的菌类而导致材料在接种之后污染，因此，巴戟天外植体的表面消毒往往是一件令研究者伤透脑筋的事，是巴戟天的组织培养的关键技术内容。巴戟天病害迄今已知有10种，主要为巴戟枯萎病，发病率可高达80％以上。如果消毒处理不彻底，则培养成功率很低。

发明内容：本发明的目的是提供一种可以快速、大规模繁殖巴戟天的组织培养方法。

本发明提供的巴戟天组织培养方法，包括以下步骤：

1、消毒：将从巴戟天外植体取下的分生组织首先按常规方法消毒，然后采用抗菌素无菌水溶液浸泡消毒，例如采用500万单位/升的青霉素无菌水溶液浸泡60分钟，并在超净工作台上用无菌水冲洗2-3次，再用滤纸吸干水份。

为了减少污染机会，进行表面消毒之前应根据具体情况采取以下几项措施：(1)从健壮的植株上取材料，不要取有伤口或者有病虫的材料；(2)要在晴天中午或下午取材料；(3)在室内或无菌条件下进行预培养；(4)对取自田间的材料在表面消毒之前要进行预处理；(5)初接种时采用小容器，每个容器中尽量少接外植体。

2、诱导：将巴戟天的分生组织(如带节茎段、茎尖等)，接种在诱导培养基上，该培养基含有常规基本培养基(Murashige and Skoog培养基，以下简称MS培养基)、6-苄基嘌呤(6-BA)1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0.5毫克/升、蔗糖3％。培养20天后，待培养物膨大形成愈伤组织时，即开始下阶段。

3、分化增殖：将上阶段所得培养物转移到分化增殖培养基上，该培养基含有MS培养基、6-苄基嘌呤(6-BA)1.5毫克/升、蔗糖3％。培养30天后，开始出现丛生巴戟天苗，待小苗长到2cm高度时，进行下阶段。

4、生根：将上阶段所得小苗齐根取下，转移至常规生根培养基。该培养基含有1/2MS培养基、吲哚丁酸(IAA)0.5毫克/升、萘乙酸(NAA)0.2毫克/升、蔗糖1％。15天后，小苗基部开始出现白色短根，并继续长出完整的根系，之后15天，即可按常规方法移栽长成正常的巴戟天植株。

本发明的培养基有以下优点：诱发时间短，出苗快，增殖频率高，生长周期较其它培养基短，且苗齐苗壮，生长良好。

采用本发明提供的方法在诱导阶段一般20天左右就可开始出现脱分化，在分化阶段，30天左右即可开始出现丛生种苗，在生根阶段约15天后，可见白色短根，再过约15天，便可移栽了，而常规繁殖方法一般只能一年繁殖一次，一次繁殖数株，本发明方法可周年繁殖，一个茎尖一年可繁殖几十万株。

故本发明的方法，不仅培养植株速度快，繁殖率高，而且易于操作大规模生产。

具体实施方式：

1、取材：取巴戟天的茎尖，用水冲洗干净。

2、材料消毒方法：将取下的茎尖在75％酒精中浸泡30秒，放入0.1％升汞溶液中浸泡10-15分后，在超净工作台上用无菌水冲洗8-10次，后用滤纸吸干水份。然后采用500万单位/升的青霉素无菌水溶液浸泡60分钟后，在超净工作台上用无菌水冲洗2-3次，后用滤纸吸干水份。

3、接种：在超净工作台上，用常规无菌操作方法将洗干净的巴戟天茎尖用剪刀剪成2cm长，使茎尖分生组织向上，直插或斜插在诱导培养基上。该培养基含有MS培养基、6-苄基嘌呤(6-BA)1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)0.5毫克/升、蔗糖3％。

4、分化增殖；将已形成愈伤组织的茎尖接种到分化增殖培养基上，该培养基含有MS培养基、6-苄基嘌呤(6-BA)1.5毫克/升、蔗糖3％。一周后可见到绿色微凸的芽点，四周后芽点明显增大，并分化出丛生芽。

5、生根：巴戟天组织培养诱导形成的芽，生长至2cm长时，切下转入含有生长素的生根培养，该培养基含有1/2 MS培养基、IAA 0.5毫克/升、NAA 0.2毫克/升、蔗糖1％。转瓶后一般1个月左右开始形成根，获得完整植株。

培养温度及光照条件：培养温度为：25℃士2℃；光照强度为：1500-2000勒克斯。

6、移栽：当试管小苗长到具有完整的根、茎、叶时，将试管口打开，在常温下敞开瓶口24小时，让幼苗在自然光下或培养室光照下锻炼2天，然后取出转入已消毒的细沙中沙培炼苗，添加1/2 MS培养液作养分，待生长稳定，长出新叶后移栽于露天种植，幼苗移栽获得成活。一般成活率在90％左右。

Claims (2)

1、巴戟天的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)消毒：将从巴戟天外植体取下的分生组织首先按常规方法消毒，然后采用抗菌素无菌水溶液浸泡消毒，并用无菌水冲洗2-3次，再用滤纸吸干水份；

(2)诱导：将巴戟天的分生组织，接种在诱导培养基上，该培养基含有MS培养基、6-苄基嘌呤1毫克/升、2，4-二氯苯氧基乙酸0.5毫克/升、蔗糖3％，培养20天后，待培养物膨大形成愈伤组织时，即转入下阶段；

(3)分化增殖：将上阶段所得培养物转移到分化增殖培养基上，该培养基含有MS培养基、6-苄基嘌呤1.5毫克/升、蔗糖3％，培养30天后，开始出现丛生巴戟天苗，待小苗长到2cm高度时，即转入下阶段；

(4)生根：将上阶段所得小苗齐根取下，转移至生根培养基，该培养基含有1/2MS培养基、吲哚丁酸0.5毫克/升、萘乙酸0.2毫克/升、蔗糖1％，15天后，小苗基部开始出现白色短根，并继续长出完整的根系；

2、根据权利要求1所述的巴戟天的组织培养方法，其特征在于：所述采用抗菌素无菌水溶液浸泡消毒方法，采用500万单位/升的青霉素无菌水溶液浸泡60分钟，并在超净工作台上用无菌水冲洗2-3次，再用滤纸吸干水份。