CN104285819A - 一种滇南杜鹃的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滇南杜鹃的组培繁殖方法,该方法适用于杜鹃花科滇南杜鹃的组培快繁,属植物生物技术领域。本发明以开花后的新嫩茎段为外植体,通过外植体消毒、丛生芽诱导、继代及壮苗、瓶外生根一系列步骤,有效解决了因滇南杜鹃分布区域窄、引种驯化难造成的植株量少,由种子播种开花时间长而导致的无法满足商业提取香料的需求问题。本发明提供的组培快繁方法,在1个月内增殖系数为10-20,生根率为80%-90%,移栽成活率为95%-98%,极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数,为该物种的引种驯化、保存和商业生产提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术中植物组织培养方法,具体地说,涉及杜鹃花滇南杜鹃的组织培养快繁方法。
背景技术
滇南杜鹃隶属于杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron L.)马银花亚属(Subgen.Azaleastrum)长蕊组(Sect.Azaleastrum),常绿灌木。滇南杜鹃花白色,有浓郁的香味,是香料提取的良好材料,具有较高的经济利用价值。由于滇南杜鹃分布地域狭窄,材料有限,难以满足香料生产的原材料供应。
目前,组培快繁已成为中药材、花卉、濒危物种苗木生产的重要手段。据研究报道杜鹃对培养基的适应性与杜鹃的基因型密切相关,不同品种的杜鹃对培养基的适应程度不同。对于杜鹃花科植物,目前已经报道适合组织培养使用的基本培养基有Read、Anderson、WPM等,但由于杜鹃花科植物种类丰富、种间差异较大,应用时还需结合不同的杜鹃花亚属甚至亚组进行调整。
迄今,滇南杜鹃没有相关生物技术方法繁殖的研究与报道,为了使滇南杜鹃能广泛应用于香料生产,解决滇南杜鹃自然匮乏、引种驯化难的问题,以更大的量和更快的速度供应市场的需求,需要研究该种的组织培养,并形成一套专门的组织培养繁殖技术体系。
发明内容
本发明的目的是提供滇南杜鹃的组织培养方法,使之在野外分布区域狭窄,引种驯化难度大的情况,加快种苗繁殖,使之为香料市场提供足够的原材料,为滇南杜鹃的可持续利用奠定组培种苗繁育基础。
为了实现本发明的目的,本发明提供了如下的技术方案:
一种滇南杜鹃的组培繁殖方法,该方法包括以下步骤:
1)外植体选择与消毒:取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体,冲洗干净后消毒;
2)改良培养基:改良Anderson培养基:将其中的NH4NO3由400mg/L减少为350mg/L,KNO3由480mg/L减少为380mg/L,其余元素不变;
3)丛生芽诱导:丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,暗培养7天后进行光照培养30天;
4)继代培养:继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+0.4mg/L IAA,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,继代培养30天;
5)壮苗培养:壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+1mg/L IAA,蔗糖35g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2;
6)移栽:选取3cm高,茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根,用1mg/LNAA泡根1小时后移栽。
根据所述的组培繁殖方法,其中所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导,光强度为2000LUX,温度为20-23℃;继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX,温度为18-23℃。
根据所述的组培繁殖方法,其中所述移栽是壮苗在瓶内生长至3cm高,茎粗达1.5mm-2mm后经瓶内炼苗后分离,移到瓶外,生根时,将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽至大棚。
根据所述的组培繁殖方法,其中所述移栽之前,移栽基质用800倍多菌灵进行喷施消毒,所述移栽基质为底层为碎石,中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土,上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土,pH为5.1-5.2,大棚温度为20-30℃,空气湿度50~60%,基质湿度70~80%。
本发明的方法可以更具体地表述如下:
滇南杜鹃的组培繁殖方法,包括选择外植体、消毒、丛生芽诱导,瓶外移栽生根步骤,取滇南杜鹃的开花后的新嫩茎段为外植体,消毒先用5ml洗洁精定容于1L水溶液中进行浸泡清洗20min,再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75%的酒精灭菌20s,无菌水冲洗3遍后,用0.1%升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min,分两次进行,第一次消毒4min,不断震荡后用无菌水清洗3-5遍,再用0.1%升汞消毒2min后用无菌水清洗3-5遍。
改良Anderson培养基的制备:因滇南杜鹃花生存环境土壤为坡地酸性土壤,低盐分浓度及高比值NH4+/NO3 -对滇南杜鹃的生长较利。材料在改良Anderson培养基中褐变率低、成活率高。改良Anderson培养基,是将原培养基中NH4NO3400mg/L减少为350mg/L,原培养基中KNO3由480mg/L减少为380mg/L,其余元素不变。丛芽诱导培养基为改良Anderson+3.0mg/L 2-iP(2-异戊烯腺嘌呤)+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC(活性炭),pH5.1-5.2,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2;诱导期加活性炭0.5g/L,降低材料褐化死亡率,丛芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导30天,光强度为2000LUX,温度为20-23℃。
继代培养基为改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.4mg/L IAA,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,继代培养30天;壮苗培养基为改良Anderson+1mg/L IAA,蔗糖35g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2;瓶外生根为移栽前使用1mg/LNAA泡根1小时候移栽。继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX,温度为20-23℃。
移栽是瓶外生根,壮苗在瓶内生长至3cm高,茎粗达到1.5mm-2mm后经棚内炼苗后分离,将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽。移栽基质为底层为碎石,中层为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土,上层为1份珍珠岩+1份腐殖土(均为体积比,移栽前,移栽基质需用800倍多菌灵进行喷施消毒),pH为5.1-5.2。大棚温度为20-30度,空气湿度50~60%,基质湿度70~80%。
本发明技术方案的提出是基于下述的研究基础:滇南杜鹃为杜鹃花科为数不多的具有香味的植物,但滇南杜鹃分布区域狭窄,人工引种驯化难,为解决其自然资源少,达到大量繁殖、保存和可持续利用,故此发明滇南杜鹃的组织培养技术。组培扩繁不仅可以在短时间内获得大量的再生植株,而且以成年植株为原材料,缩短开花年限,为供应充足的原材料市场,促进香料提取有积极的作用。
相比现有技术,本发明存在如下的优益性和有益效果:
1.本发明通过改良基础培养基配方,使得材料成活率较其他常用培养基提高36%;
2.本发明建立了有效的滇南杜鹃组培快繁方法,解决了其分布狭窄,引种驯化难的状况;
3.本发明通过组培快繁得到的幼苗,成苗容易,保持了木本优良的性状;
4.本发明利用一年生枝条进行组培快繁的方法大大缩短了开花年限,使其能迅速的投入到香料生产原材料供应行列。
本发明的组培快繁方法繁育的滇南杜鹃在1个月内增殖系数为10-20,生根率为80%-90%,移栽成活率为95%-98%,极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数,为该物种的引种驯化、保存和商业价值发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
具体实施方式
下面用本发明的具体实施例来进一步阐述本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。
实施例1
1.培养基及基质筛选实施例
取滇南杜鹃的开花后的新嫩茎段为外植体,消毒为常规组培外植体消毒,先用5ml洗洁精定容于1L水溶液中进行浸泡清洗20min,再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75%的酒精灭菌20s,无菌水冲洗3遍后,用0.1%升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min,分两次进行,第一次消毒4min,不断震荡后用无菌水清洗5遍,再用0.1%升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍。将消毒后的嫩茎段两端褐化组织切去,并将其切成1cm左右的茎段,每段上至少带一个腋芽。将茎段分别接种在WPM、Read、Anderson、改良Anderson培养基上。
各培养基激素及添加物都为3.0mg/L 2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/LAC(活性炭),蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2。暗培养基7天后,光照培养30天统计其诱导率及新稍长。光强度为2000LUX,温度为18-23℃。
表1基本培养基的筛选
对杜鹃花科组培中常用的培养基为WPM、Read、Anderson进行筛选,结果如表1,在改良Anderson培养基上,茎段的诱导率为75%,且新稍长可达到1-2cm,是适合滇南杜鹃组织培养的培养基。
表2继代培养激素的筛选
以改良Anderson培养基为继代激素筛选的基本培养基,细胞分裂素浓度范围为(0.5mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L,5mg/L,6个浓度梯度),生长素浓度分别为(0mg/L,0.1mg/L,0.2mg/L,0.4mg/L,0.8mg/L,1.0mg/L,6个浓度梯度),采用均匀设计法进行,结果如下:
表3继代激素筛选较优结果
序号 | 均匀设计配方 | 增殖率 |
① | 改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.4mg/L IAA | 98% |
② | 改良Anderson+3mg/l ZT+0.6mg/L IAA | 94% |
③ | 改良Anderson+3mg/l ZT+0.2mg/L IAA | 93% |
④ | 改良Anderson+3mg/l 2-iP+0.6mg/L IAA | 90% |
⑤ | 改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.2mg/L IAA | 80% |
栽培基质的筛选,目前广泛用于杜鹃花栽培的基质为腐殖土、红土、珍珠岩等,筛选实验如下:
实验⑤底层碎石增加了根部透气性,中层三种基质配合,增加了基质疏松度,为根部提供足够的营养及加固根部,同时红土为酸性土壤,适合杜鹃花生长;上层为珍珠岩及腐殖土,防止浇水产生土壤板结,为盆栽提供良好透气性。
上述提及的改良Anderson培养基,均是将原Anderson培养基中NH4NO3从400mg/L减少为350mg/L,KNO3由480mg/L减少为380mg/L,其余元素不变。
实施例2:
取滇南杜鹃开花后嫩枝,带回实验室,浸泡于清水中。取5ml洗洁精溶于1L自来水中,将材料泡入其中清洗,可同时用小刷进行表明刷洗20min后,将其用无菌水冲洗至无泡沫产生。
将材料用洁净的容器带至超净台上,采用75%的酒精灭菌20s,无菌水冲洗3遍后,配置0.1%升汞溶液(0.1g升汞定容至1L)添加2滴表面活性剂吐温-20(可在生物试剂公司购买)进行表面消毒6min,分两次进行,第一次消毒4min,不断震荡后用无菌水清洗5遍,再用0.1%升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用。
将材料切去两端后,将带芽茎段斜插入丛芽诱导培养基—改良Anderson+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/l IAA+0.5g/L AC(活性炭),蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2;先进行黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导,光强度为2000LUX,温度为18-23℃。光照强度测量采用光强计。所述的改良Anderson培养基,是将原Anderson培养基中NH4NO3从400mg/L减少为350mg/L,原培养基中KNO3由480mg/L减少为380mg/L,其余元素不变。
待培养25-35天后,将丛生芽在超净台上分离,接入继代培养基为改良Anderson+2.5mg/l 2-iP+0.8mg/l IAA,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,进行继代,培养;待继代30天后将苗分离,转接至壮苗培养基改良Anderson+1mg/lIAA,蔗糖35g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2中培养;继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX,温度为18-23℃。
培养25-35天后,选取3cm高,茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根,移栽前使用1mg/LNAA泡根1小时候移栽。移栽基质为底层为碎石,盆土中层为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土,上层为1份珍珠岩+1份腐殖土(移栽前,移栽基质需用800倍多菌灵进行喷施消毒),pH为5.1-5.2。置于大棚中,培养温度为20-30度,空气湿度50~60%,基质湿度70~80%。
一个茎段在一个月内可获得分化试管苗18株,大于2cm的苗约有8株,进行移栽,可平均成活7.9株,增殖系数为10-20,生根率为80%-90%,移栽成活率为95%-98%。
Claims (5)
1.一种滇南杜鹃的组培繁殖方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
1)外植体选择与消毒:取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体,冲洗干净后消毒;
2)改良培养基:改良Anderson培养基:将其中的NH4NO3由400mg/L减少为350mg/L,KNO3由480mg/L减少为380mg/L,其余元素不变;
3)丛生芽诱导:丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,暗培养7天后进行光照培养30天;
4)继代培养:继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+0.4mg/L IAA,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,继代培养30天;
5)壮苗培养:壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+1mg/L IAA,蔗糖35g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2;
6)移栽:选取3cm高,茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根,用1mg/LNAA泡根1小时后移栽。
2.根据权利要求1所述的组培繁殖方法,其特征在于所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导,光强度为2000LUX,温度为20-23℃;继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX‐3000LUX,温度为18-23℃。
3.根据权利要求1所述的组培繁殖方法,其特征在于所述移栽是壮苗在瓶内生长至3cm高,茎粗达1.5mm-2mm后经瓶内炼苗后分离,移到瓶外,生根时,将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽至大棚。
4.根据权利要求1所述的组培繁殖方法,其特征在于所述移栽之前,移栽基质用800倍多菌灵进行喷施消毒,所述移栽基质为底层为碎石,中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土,上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土,pH为5.1-5.2,大棚温度为20-30℃,空气湿度50~60%,基质湿度70~80%。
5.根据权利要求1所述的组培繁殖方法,其特征在于该方法包括取滇南杜鹃开花后嫩枝,浸泡于清水中,将材料泡入洗洁精中清洗,然后将其用无菌水冲洗至无泡沫产生,将材料用洁净的容器带至超净台上,采用75%的酒精灭菌20s,无菌水冲洗3遍后,配置0.1%升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min,分两次进行,第一次消毒4min,不断震荡后用无菌水清洗5遍,再用0.1%升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用;
将材料切去两端后,将带芽茎段斜插入丛芽诱导培养基即改良Anderson+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/l IAA+0.5g/L AC,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,先进行黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导,光强度为2000LUX,温度为18-23℃;
待培养25-35天后,将丛生芽在超净台上分离,接入继代培养基为改良Anderson+2.5mg/l 2-iP+0.8mg/l IAA,蔗糖30g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2,进行继代培养;待继代30天后将苗分离,转接至壮苗培养基改良Anderson+1mg/lIAA,蔗糖35g/L,琼脂7g/L,pH5.1-5.2中培养;继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX‐3000LUX,温度为18-23℃;
培养25-35天后,选取3cm高,茎粗达1.5mm-2mm进行瓶外生根,移栽前用1mg/L NAA泡根1小时,然后移栽入装有移栽基质的盆内,所述移栽基质为底层为碎石,中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土,上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土,pH为5.1-5.2,移栽基质使用前用800倍多菌灵进行喷施消毒,移栽盆放在大棚内,培养温度为20-30度,空气湿度50~60%,基质湿度70~80%。
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |