CN104285819A - 一种滇南杜鹃的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种滇南杜鹃的组培繁殖方法，该方法适用于杜鹃花科滇南杜鹃的组培快繁，属植物生物技术领域。本发明以开花后的新嫩茎段为外植体，通过外植体消毒、丛生芽诱导、继代及壮苗、瓶外生根一系列步骤，有效解决了因滇南杜鹃分布区域窄、引种驯化难造成的植株量少，由种子播种开花时间长而导致的无法满足商业提取香料的需求问题。本发明提供的组培快繁方法，在1个月内增殖系数为10-20，生根率为80％-90％，移栽成活率为95％-98％，极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存和商业生产提供了技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术中植物组织培养方法，具体地说，涉及杜鹃花滇南杜鹃的组织培养快繁方法。
背景技术
滇南杜鹃隶属于杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron L.)马银花亚属(Subgen.Azaleastrum)长蕊组(Sect.Azaleastrum)，常绿灌木。滇南杜鹃花白色，有浓郁的香味，是香料提取的良好材料，具有较高的经济利用价值。由于滇南杜鹃分布地域狭窄，材料有限，难以满足香料生产的原材料供应。
目前，组培快繁已成为中药材、花卉、濒危物种苗木生产的重要手段。据研究报道杜鹃对培养基的适应性与杜鹃的基因型密切相关，不同品种的杜鹃对培养基的适应程度不同。对于杜鹃花科植物，目前已经报道适合组织培养使用的基本培养基有Read、Anderson、WPM等，但由于杜鹃花科植物种类丰富、种间差异较大，应用时还需结合不同的杜鹃花亚属甚至亚组进行调整。
迄今，滇南杜鹃没有相关生物技术方法繁殖的研究与报道，为了使滇南杜鹃能广泛应用于香料生产，解决滇南杜鹃自然匮乏、引种驯化难的问题，以更大的量和更快的速度供应市场的需求，需要研究该种的组织培养，并形成一套专门的组织培养繁殖技术体系。
发明内容
本发明的目的是提供滇南杜鹃的组织培养方法，使之在野外分布区域狭窄，引种驯化难度大的情况，加快种苗繁殖，使之为香料市场提供足够的原材料，为滇南杜鹃的可持续利用奠定组培种苗繁育基础。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种滇南杜鹃的组培繁殖方法，该方法包括以下步骤：
1)外植体选择与消毒：取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体，冲洗干净后消毒；
2)改良培养基：改良Anderson培养基：将其中的NH4NO3由400mg/L减少为350mg/L，KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变；
3)丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，暗培养7天后进行光照培养30天；
4)继代培养：继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+0.4mg/L IAA，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，继代培养30天；
5)壮苗培养：壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+1mg/L IAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2；
6)移栽：选取3cm高，茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根，用1mg/LNAA泡根1小时后移栽。
根据所述的组培繁殖方法，其中所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为20-23℃；继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX，温度为18-23℃。
根据所述的组培繁殖方法，其中所述移栽是壮苗在瓶内生长至3cm高，茎粗达1.5mm-2mm后经瓶内炼苗后分离，移到瓶外，生根时，将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽至大棚。
根据所述的组培繁殖方法，其中所述移栽之前，移栽基质用800倍多菌灵进行喷施消毒，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土，上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，pH为5.1-5.2，大棚温度为20-30℃，空气湿度50～60％，基质湿度70～80％。
本发明的方法可以更具体地表述如下：
滇南杜鹃的组培繁殖方法，包括选择外植体、消毒、丛生芽诱导，瓶外移栽生根步骤，取滇南杜鹃的开花后的新嫩茎段为外植体，消毒先用5ml洗洁精定容于1L水溶液中进行浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75％的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗3-5遍，再用0.1％升汞消毒2min后用无菌水清洗3-5遍。
改良Anderson培养基的制备：因滇南杜鹃花生存环境土壤为坡地酸性土壤，低盐分浓度及高比值NH4+/NO3 -对滇南杜鹃的生长较利。材料在改良Anderson培养基中褐变率低、成活率高。改良Anderson培养基，是将原培养基中NH4NO3400mg/L减少为350mg/L，原培养基中KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变。丛芽诱导培养基为改良Anderson+3.0mg/L 2-iP(2-异戊烯腺嘌呤)+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC(活性炭)，pH5.1-5.2，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2；诱导期加活性炭0.5g/L，降低材料褐化死亡率，丛芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导30天，光强度为2000LUX，温度为20-23℃。
继代培养基为改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.4mg/L IAA，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，继代培养30天；壮苗培养基为改良Anderson+1mg/L IAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2；瓶外生根为移栽前使用1mg/LNAA泡根1小时候移栽。继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX，温度为20-23℃。
移栽是瓶外生根，壮苗在瓶内生长至3cm高，茎粗达到1.5mm-2mm后经棚内炼苗后分离，将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽。移栽基质为底层为碎石，中层为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土，上层为1份珍珠岩+1份腐殖土(均为体积比，移栽前，移栽基质需用800倍多菌灵进行喷施消毒)，pH为5.1-5.2。大棚温度为20-30度，空气湿度50～60％，基质湿度70～80％。
本发明技术方案的提出是基于下述的研究基础：滇南杜鹃为杜鹃花科为数不多的具有香味的植物，但滇南杜鹃分布区域狭窄，人工引种驯化难，为解决其自然资源少，达到大量繁殖、保存和可持续利用，故此发明滇南杜鹃的组织培养技术。组培扩繁不仅可以在短时间内获得大量的再生植株，而且以成年植株为原材料，缩短开花年限，为供应充足的原材料市场，促进香料提取有积极的作用。
相比现有技术，本发明存在如下的优益性和有益效果：
1.本发明通过改良基础培养基配方，使得材料成活率较其他常用培养基提高36％；
2.本发明建立了有效的滇南杜鹃组培快繁方法，解决了其分布狭窄，引种驯化难的状况；
3.本发明通过组培快繁得到的幼苗，成苗容易，保持了木本优良的性状；
4.本发明利用一年生枝条进行组培快繁的方法大大缩短了开花年限，使其能迅速的投入到香料生产原材料供应行列。
本发明的组培快繁方法繁育的滇南杜鹃在1个月内增殖系数为10-20，生根率为80％-90％，移栽成活率为95％-98％，极大地提高了滇南杜鹃的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存和商业价值发挥利用提供了非常有效的繁殖方法。
具体实施方式
下面用本发明的具体实施例来进一步阐述本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1
1.培养基及基质筛选实施例
取滇南杜鹃的开花后的新嫩茎段为外植体，消毒为常规组培外植体消毒，先用5ml洗洁精定容于1L水溶液中进行浸泡清洗20min，再用无菌水冲洗至无泡沫后采用75％的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，用0.1％升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0.1％升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍。将消毒后的嫩茎段两端褐化组织切去，并将其切成1cm左右的茎段，每段上至少带一个腋芽。将茎段分别接种在WPM、Read、Anderson、改良Anderson培养基上。
各培养基激素及添加物都为3.0mg/L 2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/LAC(活性炭)，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2。暗培养基7天后，光照培养30天统计其诱导率及新稍长。光强度为2000LUX，温度为18-23℃。
表1基本培养基的筛选
对杜鹃花科组培中常用的培养基为WPM、Read、Anderson进行筛选，结果如表1，在改良Anderson培养基上，茎段的诱导率为75％，且新稍长可达到1-2cm，是适合滇南杜鹃组织培养的培养基。
表2继代培养激素的筛选
以改良Anderson培养基为继代激素筛选的基本培养基，细胞分裂素浓度范围为(0.5mg/L，1mg/L，2mg/L,3mg/L,4mg/L,5mg/L，6个浓度梯度)，生长素浓度分别为(0mg/L,0.1mg/L,0.2mg/L，0.4mg/L,0.8mg/L,1.0mg/L，6个浓度梯度),采用均匀设计法进行，结果如下：
表3继代激素筛选较优结果
| 序号 | 均匀设计配方 | 增殖率 |
| ① | 改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.4mg/L IAA | 98％ |
| ② | 改良Anderson+3mg/l ZT+0.6mg/L IAA | 94％ |
| ③ | 改良Anderson+3mg/l ZT+0.2mg/L IAA | 93％ |
| ④ | 改良Anderson+3mg/l 2-iP+0.6mg/L IAA | 90％ |
| ⑤ | 改良Anderson+2mg/l 2-iP+0.2mg/L IAA | 80％ |
栽培基质的筛选，目前广泛用于杜鹃花栽培的基质为腐殖土、红土、珍珠岩等，筛选实验如下：
实验⑤底层碎石增加了根部透气性，中层三种基质配合，增加了基质疏松度，为根部提供足够的营养及加固根部，同时红土为酸性土壤，适合杜鹃花生长；上层为珍珠岩及腐殖土，防止浇水产生土壤板结，为盆栽提供良好透气性。
上述提及的改良Anderson培养基，均是将原Anderson培养基中NH4NO3从400mg/L减少为350mg/L，KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变。
实施例2：
取滇南杜鹃开花后嫩枝，带回实验室，浸泡于清水中。取5ml洗洁精溶于1L自来水中，将材料泡入其中清洗，可同时用小刷进行表明刷洗20min后，将其用无菌水冲洗至无泡沫产生。
将材料用洁净的容器带至超净台上，采用75％的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，配置0.1％升汞溶液(0.1g升汞定容至1L)添加2滴表面活性剂吐温-20(可在生物试剂公司购买)进行表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0.1％升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用。
将材料切去两端后，将带芽茎段斜插入丛芽诱导培养基—改良Anderson+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/l IAA+0.5g/L AC(活性炭)，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2；先进行黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为18-23℃。光照强度测量采用光强计。所述的改良Anderson培养基，是将原Anderson培养基中NH4NO3从400mg/L减少为350mg/L，原培养基中KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变。
待培养25-35天后，将丛生芽在超净台上分离，接入继代培养基为改良Anderson+2.5mg/l 2-iP+0.8mg/l IAA，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，进行继代,培养；待继代30天后将苗分离，转接至壮苗培养基改良Anderson+1mg/lIAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2中培养；继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX-3000LUX，温度为18-23℃。
培养25-35天后，选取3cm高，茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根，移栽前使用1mg/LNAA泡根1小时候移栽。移栽基质为底层为碎石，盆土中层为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土，上层为1份珍珠岩+1份腐殖土(移栽前，移栽基质需用800倍多菌灵进行喷施消毒)，pH为5.1-5.2。置于大棚中，培养温度为20-30度，空气湿度50～60％，基质湿度70～80％。
一个茎段在一个月内可获得分化试管苗18株，大于2cm的苗约有8株，进行移栽，可平均成活7.9株，增殖系数为10-20，生根率为80％-90％，移栽成活率为95％-98％。
Claims (5)
1.一种滇南杜鹃的组培繁殖方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)外植体选择与消毒：取滇南杜鹃开花后嫩茎段为外植体，冲洗干净后消毒；
2)改良培养基：改良Anderson培养基：将其中的NH4NO3由400mg/L减少为350mg/L，KNO3由480mg/L减少为380mg/L，其余元素不变；
3)丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/L IAA+0.5g/L AC，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，暗培养7天后进行光照培养30天；
4)继代培养：继代培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+2mg/L 2-iP+0.4mg/L IAA，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，继代培养30天；
5)壮苗培养：壮苗培养基为步骤2)的改良Anderson培养基+1mg/L IAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2；
6)移栽：选取3cm高，茎粗达到1.5mm-2mm进行瓶外生根，用1mg/LNAA泡根1小时后移栽。
2.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述丛生芽诱导为全黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为20-23℃；继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX‐3000LUX，温度为18-23℃。
3.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述移栽是壮苗在瓶内生长至3cm高，茎粗达1.5mm-2mm后经瓶内炼苗后分离，移到瓶外，生根时，将切口泡入1mg/LNAA 1小时后移栽至大棚。
4.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于所述移栽之前，移栽基质用800倍多菌灵进行喷施消毒，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土，上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，pH为5.1-5.2，大棚温度为20-30℃，空气湿度50～60％，基质湿度70～80％。
5.根据权利要求1所述的组培繁殖方法，其特征在于该方法包括取滇南杜鹃开花后嫩枝，浸泡于清水中，将材料泡入洗洁精中清洗，然后将其用无菌水冲洗至无泡沫产生，将材料用洁净的容器带至超净台上，采用75％的酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍后，配置0.1％升汞溶液添加2滴表面活性剂吐温-20进行表面消毒6min，分两次进行，第一次消毒4min，不断震荡后用无菌水清洗5遍，再用0.1％升汞消毒2min后用无菌水清洗5遍待用；
将材料切去两端后，将带芽茎段斜插入丛芽诱导培养基即改良Anderson+3.0mg/L2-iP+0.5mg/L ZT+0.8mg/l IAA+0.5g/L AC，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，先进行黑暗诱导7天后进行人工辅助光诱导，光强度为2000LUX，温度为18-23℃；
待培养25-35天后，将丛生芽在超净台上分离，接入继代培养基为改良Anderson+2.5mg/l 2-iP+0.8mg/l IAA，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2，进行继代培养；待继代30天后将苗分离，转接至壮苗培养基改良Anderson+1mg/lIAA，蔗糖35g/L，琼脂7g/L，pH5.1-5.2中培养；继代及壮苗培养的光照条件为人工辅助光2500LUX‐3000LUX，温度为18-23℃；
培养25-35天后，选取3cm高，茎粗达1.5mm-2mm进行瓶外生根，移栽前用1mg/L NAA泡根1小时，然后移栽入装有移栽基质的盆内，所述移栽基质为底层为碎石，中层为体积比为1份珍珠岩+2份腐殖土+1份红土，上层为体积比为1份珍珠岩+1份腐殖土，pH为5.1-5.2，移栽基质使用前用800倍多菌灵进行喷施消毒，移栽盆放在大棚内，培养温度为20-30度，空气湿度50～60％，基质湿度70～80％。
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