CN101998823B - 体细胞植物胚胎的分散方法和装置 - Google Patents
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Abstract
公开了一种将悬浮在液体中的体细胞植物胚胎簇分散的方法。所述方法包括：i)使胚胎簇经受流体力学力以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；ii)使胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和iii)顺序重复所述步骤，直至单个胚胎彼此分离。该设备可包括具有至少一个收缩的流道，使得流过所述流道的胚胎簇首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
Description
发明背景
问题领域的一般性介绍
植物中体细胞胚胎发生是由作为植物组织细胞的初始外植体形成体细胞胚胎的过程。所形成的体细胞胚胎是提供初始外植体的植物的相同基因副本。体细胞胚胎发生过程从而提供了对于具有商业利益的选定基因型的增殖获得大量基因相同植物的工具，用于保护濒危物种或出于研究目的繁育基因统一的植物材料。
该问题相关程序的生理背景
为了从针叶树体细胞胚胎来生产植物，应用多步骤程序以满足以下且示于图1的不同发展阶段的生理需要。体细胞胚胎发生启动是在含有固化培养介质的植物生长调节剂上，由初始外植体的体细胞胚胎通常是未成熟合子胚的诱导开始的。体细胞胚胎通常在相同组成的培养介质上继续形成，并且形成增殖胚胎发生培养形式。在增殖阶段，出现几个关键特征，其通常被认为对体细胞胚胎发生过程有益：(i)通过无限制增殖未成熟合子胚进行基因型相同的繁殖体的大量繁殖；(ii)增殖低温储存证实了克隆胚胎实质上的永久储存，即建立克隆银行；(iii)未成熟合子胚的转基因改良允许大规模繁殖基因改良繁殖体。在程序的下一步，增殖体细胞胚胎经受生长介质，其触发胚胎发育以进展到成熟阶段。从增殖到成熟的转换只发生在培养的部分增殖胚胎中。在来自顽拗型针叶树种基因型中更频繁地遇到低转换率，但这在所有的针叶树种以及其它植物中常见。需要人力收集随转换率下降而增加的胚胎，由此存在污染和其它不准确的成本和风险。从增殖到成熟的低转换率是体细胞胚胎发生程序的大规模商业应用的主要瓶颈。对于萌发而言，成熟体细胞胚胎在许多不同的步骤中经历不同的培养阶段，以诱导根和芽的形成；干燥、蔗糖处理、红光诱导和蓝光刺激。此后，将认为适当发育的发芽胚胎转移到堆肥材料，并逐步转移到体外环境中，在此期间蔗糖含量降低。发芽期间对植物的不同处理需要对各个芽和植物进行反复手工处理，对整体程序而言增加了可观的成本。
用于从体细胞胚生产植物的现有技术需要在几个步骤中进行手工处理，使得程序费时、昂贵和不准确。
对于针叶树种，采用的标准程序包括需要手工处理的几个步骤。一般的程序概述于图1(参见例如：von Arnold S.Clapham D.Spruceembryogenesis.2008.Methods MoI Biol.2008；427：31-47；Belmonte M F，Donald G，Reid D M，Yeung E C and Stasolla C.2005.Alterations of theglutathione redox state improve apical meristem structure and somatic embryoquality in white spruce(Picea glauca).J Exp Bot，Vol.56，No.419，pp.2355-2364)。
有四个步骤依靠手工处理以从成熟体细胞胚胎获得小植物，如图1所示。第一手工相互作用[1]是在将成熟胚胎与未成熟胚胎隔离(120)后，在无菌条件下将其水平放置在塑料容器中；第二[2]发生在静止3-7天后(130)，然后将成熟胚胎转移到用于引发萌发过程的凝胶培养介质中。萌发的体细胞胚将在适当的培养介质组合物和光照条件下开始出根(140)。第三手工转移[3]是将形成有小根的芽转移至根部分浸没在液体发芽介质(150)中的直立位置。第四[4]和最终转移是当发芽胚胎有主根和小侧根时，将其转移到盆中固体培养基中用以进一步植物形成(160)。
表1.图1附图标记说明：
| 附图标记 | 说明 |
| 100 | 成熟胚胎 |
| 101 | 成熟胚胎的冠 |
| 102 | 成熟胚胎的根 |
| 103 | 成熟胚胎的冠宽度 |
| 104 | 成熟胚胎的长度 |
| 120 | 成熟阶段 |
| 130 | 静止阶段 |
| 140 | 发芽阶段 |
| 150 | 体内植物形成阶段 |
| 160 | 体外植物形成阶段 |
从增殖到成熟的转换只发生在培养的部分增殖胚胎中。在来自顽拗型针叶树种基因型中更频繁地遇到低转换率，但这在所有的针叶树种以及其它植物中常见。需要人力收集随转换率下降而增加的胚胎，由此存在污染和其它不准确的成本和风险。从增殖到成熟的低转换率是体细胞胚胎发生程序的大规模商业应用的主要瓶颈。对于萌发而言，成熟体细胞胚在许多不同的步骤中经历不同的培养阶段，以诱导根和芽的形成；干燥、蔗糖处理、红光诱导和蓝光刺激。此后，将认为适当发育的发芽胚胎转移到堆肥材料，并逐步转移到体外环境中，在此期间蔗糖含量降低。发芽期间对植物的不同处理需要对各个芽和植物进行反复手工处理，对整体程序而言增加了可观的成本。
在迄今可用的从体细胞胚胎生产植物的方法中，从未成熟胚胎发生组织中手工挑选出胚胎。这是费时和低效率的。因此，有必要提供一种使胚的分离更为有效的方法。生成的体细胞胚胎最初被未成熟胚胎发生组织粘在一起形成簇。本发明的一个目的是提供生产体细胞植物胚胎的有效方法，用于将体细胞胚胎簇轻柔分散成与胚胎发生组织分开的单个胚胎的自动化方法。本发明涉及用于这种分散的方法和设备。
发明内容
本发明涉及将体细胞植物胚胎簇轻柔分散成单个胚胎和未成熟的胚胎发生组织的方法和设备。
公开了一种将悬浮在液体中的植物胚胎簇分散成单个植物胚胎的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)使胚胎簇经受流体力学力以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；
ii)使胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
顺序重复所述步骤，直至胚胎彼此分离。
优选地，拉伸和压缩应变的强度随每个重复序列而增加。
公开了一种用于分离包含在胚胎簇中的单个胚胎的分离器，其包括具有至少一个收缩的流道，使得流过所述流道的胚胎簇首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
优选地，流道包括至少两个收缩，每个收缩的内径等于或小于紧邻其上游的收缩的内径。
优选地，流道包括在各个收缩之间具有恒定截面积的中间部分。
优选地，每个中间部分的内径等于或小于紧邻其上游处的中间部分的内径。
优选地，每个中间部分可具有至少等于待分散胚胎簇的长度。优选地，每个中间部分的长度为2.5mm-60mm，更优选为约5mm-约30mm。收缩的数目可以是3-100，优选5-20，最优选约10。优选地，收缩的截面积为0.75到1300mm2，更优选3到32mm2。
流道可具有轴对称横截面。流道可具有一个基本圆形或椭圆形的横截面。
至少部分流道可具有非轴对称横截面，如矩形截面。具有最大尺寸的每个非轴对称收缩的横截面可以优选是定向的，使得每个收缩的最大尺寸旋转，优选至少30度，更优选约90度，相对于序列中下一个非轴对称收缩的最大尺寸。每个收缩的横截面可以表现为矩形，具有第一和第二边，其中第一边长于第二边，并且收缩定向为每个收缩的第一边垂直于序列中具有矩形横截面的下一个收缩的第一边。
该分散方法和设备的优点包括：
(1)无需移动部件，因此是稳定的；
(2)自然应用于连续流动系统，从而不需要以间歇模式操作；
(3)对胚胎轻柔；
(4)速度快，使用该设备的分散只需要几秒钟就可以分散数百胚胎；
(5)紧凑并且完全封闭的设备使得容易消毒。
定义
术语体细胞胚胎、体细胞植物胚胎和植物体细胞胚胎可以互换使用。该术语是指从植物体细胞组织来源的植物胚胎。
挪威云杉是云杉种，拉丁文名称为Picea abies，原产于欧洲。
术语流体动力学和流体力学可以互换使用，是指相同的流体流动的物理原理。
术语通道和管可以互换使用，对于通路的几何形状没有具体限制，除非另有说明。
极坐标的正交方向，由轴向、径向和角(方位角)给出。这些方向对应垂直于圆柱圆截面的圆柱中心轴，径向和角方向分别沿半径指向并垂直于截面表面上的半径。
轴对称流动是指管内流动，其中管的横截面表面始终是圆形的，因此其相对于该管的轴线对称。换言之，沿角(或方位角)方向没有任何变化。
压力是单位面积上的力。
应变是变形的几何度量，代表材料体的点之间的相对位移；它由相对于原始尺寸的变形比率或百分比表示。
正应变定义为沿材料线性要素拉伸或压缩的比率或百分比量(在形变方向上相对于原始长度的变形比率)。
剪切应变定义为与材料平面层相互滑移相关联的相对于原始尺寸的变形比率或百分比量。
拉伸应变是要素拉伸的正应变。
轴向拉伸应变是沿轴向拉伸的要素。
径向拉伸应变是沿径向拉伸的要素。
压缩应变是要素收缩的正应变。
轴向压缩应变是指沿轴向收缩的要素变形。
径向压缩应变是指沿径向收缩的要素变形。
应变速率是应变随时间的变化。
水力直径Dh是用来表征在非圆管和通道中流动的术语。根据定义，它是由Dh＝4A/S表示，其中A是非圆管或通道的截面面积，S为横截面的润湿周长。
通道内的平均速度定义为体积流量除以通道截面积。
收缩比率定义为通道出口处的平均速度与通道入口处的平均速度之比。
平均应力是在表面上平均的压力。
平均应变率是在表面上平均的应变率。
流体力学力学粘度是牛顿流体要素中剪切应力与剪切应变率之比。水、甘油、硅油是牛顿流体的例子。
应变率曲线是显示应变率变化的曲线。
长度单位毫米简写为“mm”。
应变速率单位秒的倒数简写为“1/s”。
一般来说，具有较高的平均应变率的流动将会对悬浮在流体中的粒子(或胚胎)或粒子簇(或胚胎簇)施加较高的平均应力。
附图说明
图1示出生产体细胞植物胚胎的一般过程。
图2示出本说明书中使用的坐标参数。
图3示出流道轴对称的本发明设备的详细信息。
图4示出部分流道非轴对称的本发明设备的详细信息。
发明详述
提供一种将悬浮在液体中的植物胚胎簇分散成单个植物胚胎的方法。所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)使胚胎簇经受流体力学力以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；
ii)使胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
顺序重复所述步骤，直至胚胎彼此分离。拉伸和压缩应变的强度可随每个重复序列而增加。
体细胞胚胎分散设备
为了说明分散器设备的结构，详细描述了一些可能的实施方案。详细程度不应被视为限制，除非另有说明。
总体结构
提供一种用于分离包含在胚胎簇中的单个胚胎的分离器。所公开的设备用于与体细胞胚胎簇一起使用，所述体细胞胚胎簇被悬浮在流过设备的液体中的未成熟胚胎发生组织保持在一起。所述液体可以是任意液体，只要不过粘而难以在设备中流动且对胚胎无害即可，优选水。
所述分散器设备包括流道。流道可作为单个实体或作为两个或更多个部分制造，每个部分包括单个区段。流道可例如由两个部分构建，即第一段(1)/(81)和第二段(2)/(82)，见图3/4。具有几个单独区段对于设备制造可能是有利的，因为这将使设备能够更容易适合不同原料以及简化清洁和保养。例如，分散器流道段(1)和(2)可以通过管(41)在入口(I)处连接到含有胚胎促的流动流体源。分散器流道的第一段(1)可通过连接管(41a)连接到第二段(2)。在这个例子中，分散的胚胎留在在出口(O)连接出口管(90)的第二段(2)中。
分散器设备流道包括至少一个收缩，使得流过流道的胚胎簇首先受到轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后受到来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。当流道至少包括至少两个收缩时，每个收缩可具有等于或小于紧邻其上游的收缩内径的内径，以对胚胎簇施加有效的分散力。优选地，分散器设备具有一组收缩。收缩组中收缩的数目可以是例如1到100、1至20、4至16、或6至12，优选的收缩数目为约10，并取决于待分散簇的性质。数目越大则提供的分散越激烈，但增加了对待分散胚胎的应力。
流道可包括在各个收缩之间的具有基本恒定截面的中间部分。每个中间部分可以具有等于或小于紧邻其上游处的中间部分内径的内径，从而逐步提高分散力。
优选地，流道具有基本圆形的横截面，除了如下所述进行特殊考虑的收缩以外。也可使用其它几何形状(如椭圆形、六角形、八角形、具有圆角的矩形、或具有圆角的三角形)，只要胚胎在通过留到的过程中不因几何形状而受损即可。具有圆形截面的管容易制造。而且优选地，流道内部光滑。内表面上的任何粗糙都会容易破坏脆弱的胚胎，因此最好避免。
流体动力学的考虑
关键是要避免过大的流体力学应力，这可能导致胚胎受损。另一方面，应力必须足以分散至少大部分的簇。对于待分散的特定类型胚胎簇、细胞系或种的最优应力水平可能需要通过实验确定。一旦已经确定或获得最优水平，则可以据此计算必要的分散器设备参数。或者，可构建具有由胚胎尺寸和簇尺寸规定的最小和最大尺寸的施加温和应力的分散器以确定这种分散对于附近的胚胎是否足够(详见下文)。如果不够，则可以构建和测试具有更激烈分散作用的分散器，并重复该过程直到获得满意的结果为止。
优选在计算分散器涉及的其余参数之前决定一些常数。流体的动力粘度影响流体力学力，因此应该选择期望的流体。优选地，流体基本是水，其具有对于分散器设备设计而言在常温环境中可视为恒定的已知动力粘度。水的动力粘度一般不会受少量盐、简单的碳水化合物、氨基酸或类似的低分子量化合物的显著影响。如果流体的动力粘度无法从文献中获得，则可能利用技术人员已知的手段实验测量。
流量也会影响流体力学力。所需的流量可部分取决于所需的分散器设备容量，其中流动越快则允许的容量就越大。为简单起见，分散器的设计优选基于恒定的流量，它可以作为分散器装置设计采取的另一个常数。通过改变流量，流体力学力可随之被微调而不必修改设备的尺寸。
根据本发明，流道的内部尺寸沿流动方向而变化以形成至少一个收缩(优选一组收缩)。这些收缩处的内部尺寸是关键参数，因为它是决定拉伸和压缩流体力学应变幅度的收缩处内部尺寸值，即对胚胎簇施加拉伸和压缩应力以迫使胚胎彼此分离的所述拉伸和压缩流体力学应变。
根据本发明，根据需要对胚胎簇施加的拉伸和压缩应力水平以及待分散的簇和具体胚胎品种的尺寸，考虑预先选定的流体类型和流量，来选择收缩的尺寸。优选地，该收缩的内部尺寸从管上游进口处的最大尺寸逐步减小至管下游出口处的最小尺寸。在最下游处(即胚胎已被完全分散的出口处)的最小内部尺寸必须至少足够大以允许单个胚胎通过而不损伤胚胎。优选的最小尺寸等于或大于待分散胚胎的最宽部分。
关键尺寸
考虑以上问题，需要为流道考虑几个关键尺寸：
I.收缩的内截面尺寸和几何形状
II.收缩的长度
III.收缩的内截面尺寸和外部几何形状
IV.收缩外部或之间的区段长度
流道的最小截面尺寸应大于最大的待分散胚胎的最大尺寸。流道的最大截面尺寸不必大于最大的待分散簇的最大尺寸。流道的中间部分(收缩之间)的尺寸不必大于最大的待分散簇的最大尺寸。
为了说明目的，定义圆柱坐标系，如图2所示。分散器设备中的一般流动方向为轴z指示的轴向。在通过分散器设备扩张和收缩时，流动也具有方向r的速度径向分量。流体速度的轴向、径向和角(θ方向)分量定义为uz、ur和uθ。
术语轴对称流定义是指在角方向上没有任何变化，或更精确的是
其中(·)表示任意流动变量。术语
是数学中常用的偏导数记号，其度量在保持所有其它自变量不变的情况下因变量相对于分母中自变量的变化率。在分散器设备的轴对称实施方案中，流动时轴对称的并且角速度分量uθ为0。
在轴对称管中线处的流动轴向应变率定义为
其中当该量为正时，流动处于拉伸应变，并且当该量为负时，流动处于压缩应变。类似地，径向应变率由
测量，其中通常正数表示径向拉伸，负数表示径向压缩。
非轴对称分散器设备满足上述对于轴对称拉伸和压缩的相同定义，流动是非轴对称的，从而所有的应变率张量的分量不为0。
测定收缩和中间部分的长度
分散器的不同部分的长度可根据平均应变率变量的不同轴向曲线计算，其中U为平均速度记号，定义为体积流量除以r-θ平面的管截面积。沿流动方向的应变率可以不变、随z线性变化、随z二次方变化、随应变率沿具有“平坦壁”的通道变化而变化或者对z具有其它函数相关性。
对z的精确函数相关和平均应变率变化不如平均应变率实际幅度那么显著。为简单起见，我们采用的情况是平均应变率B，定义为
为常数。因此，每一区段(例如图4中的i＝61，...80)的长度(对于轴对称管而言以Li表示)可以基于该区段中恒定的平均应变率Bi计算如下，
其中Q为体积流量，其始终沿通道恒定(基于质量守恒原理)。R为管半径，与半径R相关的下标“0”和“1”分别定义每个区段的入口和出口半径。这种长度关系从现在起称为方程(1)。平均应变率Bi可正可负，这意味着胚胎簇对于正的Bi经历平均拉伸应变率，对于负值的Bi经历平均压缩应变率。长度Li和平均应变率Bi的大量组合是可能的。
方程(1)可利用水力半径Rh的概念推广到非轴对称情况，对于各个情况，其定义为水力直径的一半，或者数学表示为Rh＝Dh/2，其中水力直径定义如上。
也可以考虑基于线性、二次或“平坦壁”公式确定收缩或膨胀区段长度的方程。这些方程可以在针对不同收缩类型的文献中发现(供参考，参见如，Parsheh M.，Brown，M.，and Aidun，C.K.，″Fiber Orientation in aPlanar Contraction：Shape Effect″Int.J.Multiphase Flow，32，1354-1369，2006.)
如果对分散器设备存在长度限制，则可考虑线性或二次平均应变率的情况。然而，如果施加逐步增加的平均应变率幅度，则恒定的平均应变率将足以分散簇。
流道中间部分(收缩之间的部分)的长度基于待分散胚胎簇的尺寸确定并并应至少等于任意待分散簇的最大尺寸。例如，在实验室培养皿中成熟的挪威云杉簇的情况下，直管段需要至少10毫米长，因为簇的尺寸约为10毫米。对在生物反应器中成熟的胚胎簇而言，那里的簇尺寸较大，管长度和初始直径应调整以适应较大尺寸的簇。由于簇随着分散进展而变小，因此中间部分的长度也可相继下降。例如，在分散器留到开始处的中间部分长度可为约60mm(优选约30mm)，而在流道末端处为约2.5mm(优选约5mm)。
确定截面尺寸
平均流体力学应力通过流体(优选水)的动力粘度与平均应变率成正比。
收缩率CRi定义为进口与出口截面积或平均速度之比，或以水力半径表示，可以表述为，
其原因是面积正比于半径的平方。这一关系从现在起被称为方程(2)。对几种情况计算的这些参数的例子示于表5。对于挪威云杉，对于收缩直径从9.5毫米(mm)至5.5毫米，对应于平均应变率B为11每秒(1/s)的收缩率3被认为是对胚胎簇施加温和的拉伸和压缩应力。对于收缩直径从9.5毫米至3.5毫米，对应于平均应变率36(1/s)的收缩率7被认为是相对强的拉伸和压缩应力。每当流动遇到汇流通道或以通道截面面积在流动方向上减小为特点的其它所谓收缩时，流动一般将经历轴向拉伸应变率和径向压缩应变率。与此相反的情况是当流动遇到分歧通道或以通道截面面积在流动方向上增大为特点的其它所谓扩张时，流动一般将经历轴向压缩应变率和径向拉伸应变率。术语“轴向”和“径向”是指流动方向通常沿管中心轴方向的空间方向(轴向)，以及沿管半径从管中心到管表面垂直于轴向的空间方向(径向)。当簇进入收缩时，其在流动方向上拉长。当簇离开收缩并进入扩张时，其沿流动方向压缩并沿径向拉伸。通过分散器如此反复伸长和压缩对单个胚胎相对于彼此施加温和的力。例如，当簇中两个相连胚胎进入收缩时，在先的胚胎被迫移动快于在后的胚胎，这是因为包围在先胚胎的流体比包围在后胚胎的流体向下游流动更快。该动作导致对于一个胚胎施加相对于另一胚胎的温和且有限的拉动，以利于胚胎分离。另一方面，当成对胚胎进入扩张时，胚胎被沿轴向方向压向对方，但在径向方向上彼此拉开，进一步有利于胚胎分离。
轴对称横截面
流道可在整个长度上具有基本轴对称的横截面。例如，流道可具有基本圆形的横截面。
非轴对称横截面
至少部分流道可具有非轴对称横截面。非轴对称分散器设备(参见，如图4)具有与对称的分散器设备类似的内部，不同之处在于收缩处的内部不是基本圆形的。
内部可具有任意非圆截面形式，如卵形、六角形、八角形、三角形、椭圆形、椭圆形、方形或矩形的截面(43a)、(45a)、(47a)、(49a)、(53a)、(55a)、(57a)或(59a)。也可以使用甚至是形状不规则的横截面。
轴对称横截面和非轴对称横截面可以同一分散器中组合。
优选地，各个非轴对称收缩的具有最大尺寸的横截面定向为各收缩的最大尺寸相对于与序列中下一个非轴对称收缩的最大尺寸旋转优选至少30度，更优选约90度。这种差异化的定向横截面比类似定向的横截面提供更有效的分散。
优选地，至少部分流道具有矩形截面。优选地收缩形状是具有圆角的矩形。
优选地，各收缩的横截面呈现具有第一和第二边的矩形，其中第一边长于第二边，并且收缩定向为各收缩的第一边垂直于序列中具有矩形横截面的下一个收缩的第一边。这种矩形交替截面比恒定截面提供更有效的分散。横截面的角优选圆化，以最小化对胚胎的应力。
表达横截面尺寸的一种方式是其截面面积(垂直于流动方向)。收缩可具有0.75到1300mm2，优选3到32mm2的截面面积。
一些具体实施方案
轴对称分散器的示例性尺寸示于表2和3中。表2和3给出了对于在典型实验室方案中或利用部分浸没生物反应器成熟的挪威云杉胚胎簇的的优选尺寸组合。
对于适用于挪威云杉胚胎的非轴对称分散器的示例性尺寸示于表4和5中。在表4中，提出两种可供选择的实施方案，标记为Alt 1和Alt 2。收缩为基本矩形并以交替方式定向。Alt 1中的分散器对胚胎簇施加更具有梯度的拉伸和压缩应力，而Alt 2施加更大的拉伸和压缩应力。根据胚胎的成熟过程使用Alt 1和Alt 2。当胚胎簇发展为簇松散堆积时，与轴对称分散器组合的Alt 1将足以分散胚胎。否则，需要使用Alt 2。
表5提供基于方程(1)计算的例子，其中基于固定的期望应变率确定各收缩的长度，或者基于固定长度Li计算应变率。该表格的第一列是进口水力直径，第二列是出口或收缩的水力直径。第三列是从方程(2)计算的收缩率。第四列是典型值为4000mm3/s(等于4毫升/s)的体积流量，第五列是期望应变率10(1/s)。第六列是基于第五列中的固定应变率10(1/s)计算的收缩长度。第七列是基于相等的10mm长度从得自方程(1)的一下关系计算的平均应变率
这种关系得自方程(1)，将从现在开始称为方程(3)。例如，对于图4的设备，i＝61，...80。
实施例
实施例1：优选的分散器尺寸
表2.流道的内直径测量
表3.轴对称流道不同部位对于挪威云杉的示例性优选长度。
| 图3中的具体长度 | 长度[mm] |
| (21) | 30.0 |
| (22) | 10.0 |
| (23) | 30.0 |
| (24) | 5.0 |
| (25) | 30.0 |
| (26) | 5.0 |
| (27) | 20.0 |
| (28) | 10.0 |
| (29) | 20.0 |
| (30) | 30.0 |
| (31) | 5.0 |
| (32) | 30.0 |
| (33) | 5.0 |
| (34) | 30.0 |
| (35) | 5.0 |
| (36) | 30.0 |
| (37) | 5.0 |
| (38) | 20.0 |
| (39) | 10.0 |
| (40) | 10.0 |
表4.对于挪威云杉的示例性内截面尺寸，参考图4。
表5.基于期望的平均应变率和/或基于固定长度计算的尺寸参数的实例，其中管的水力半径也应用于分散器的非轴对称区段
实施例2：挪威云杉体细胞胚胎的分散
根据本发明建立的分散器系统之一具有类似于表3的Alt 2情况的尺寸，具有6个非轴对称和4轴对称的区段，其以收缩的横截面面积逐渐减小的方式依次顺序串联。
从周期性部分浸没生物反应器中收集挪威云杉的胚胎发生物的几个簇(细胞系06:28:05)(其中截取自簇的中间截面的横截面的水力直径为5毫米至30毫米)，并将其送入上述本发明的分散器中。共十个(10)管区段以螺旋方式通过180度圆管弯曲来连接。管弯曲的下部固定在塑料中，因此整个结构永久固定就位。当通过蠕动泵启动流动时，观察到簇加入分散器并穿过具有轴对称和非轴对称收缩和扩张区段的区段。观察到胚胎在穿过分散器的最后区段时完全分散，显示出本发明充分分散簇的效果。分散不会对胚胎造成物理损伤。
Claims (17)
1.一种用于分离包含在胚胎簇中的单个体细胞植物胚胎的分散器，其特征在于，其包括具有至少两个收缩的流道，
其中每个收缩的内径等于或小于紧邻其上游的所述收缩的内径，
其中所述流道包括在各个收缩之间具有实质恒定截面积的中间部分，
其中所述收缩的截面积为0.75-1300mm2，
前提是所述流道的最小横截面尺寸大于待分散的最大胚胎的最大尺寸，
使得流过所述流道的胚胎簇首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。
2.根据权利要求1所述的分散器，其中每个中间部分的内径等于或小于紧邻其上游的所述中间部分的内径。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分散器，其中每个中间部分具有至少等于待分散胚胎簇的长度。
4.根据权利要求3所述的分散器，其中每个中间部分的长度为2.5mm-60mm。
5.根据权利要求4所述的分散器，其中每个中间部分的长度为5mm-30mm。
6.根据权利要求1所述的分散器，其中所述收缩的数目是2-100。
7.根据权利要求6所述的分散器，其中所述收缩的数目是5-20。
8.根据权利要求1所述的分散器，其中所述收缩的截面积为3-32mm2。
9.根据权利要求1所述的分散器，其中所述流道具有轴对称横截面。
10.根据权利要求1所述的分散器，其中所述流道具有基本圆形或椭圆形的横截面。
11.根据权利要求1所述的分散器，其中至少部分所述流道具有非轴对称横截面。
12.根据权利要求1所述的分散器，其中至少部分所述流道具有矩形横截面。
13.根据权利要求11或12所述的分散器，其中每个非轴对称收缩的具有最大尺寸的横截面定向为使得每个收缩的最大尺寸相对于序列中下一个非轴对称收缩的最大尺寸旋转至少30度。
14.根据权利要求13所述的分散器，其中每个非轴对称收缩的具有最大尺寸的横截面定向为使得每个收缩的最大尺寸相对于序列中下一个非轴对称收缩的最大尺寸旋转90度。
15.根据权利要求12所述的分散器，其中每个收缩的横截面呈现为具有第一和第二边的矩形，其中所述第一边长于所述第二边，并且所述收缩定向为使得每个收缩的第一边垂直于序列中具有矩形横截面的下一个收缩的第一边。
16.一种将悬浮在液体中的植物胚胎簇分散成单个植物胚胎的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)使所述胚胎簇经受流体力学力，以引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；
ii)使所述胚胎簇经受流体力学力以引起来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
顺序重复所述步骤，直至所述单个胚胎彼此分离，
其中所述步骤(i)和(ii)利用根据权利要求1的分散器来进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中拉伸和压缩应变的强度随每个重复序列而增加。
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