CN102686717B - 用于分散生物材料聚结体的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于分散悬浮于液体中的生物材料聚结体(如植物胚胎形成质，植物组织，人工培养的植物细胞，动物组织和/或人工培养的动物细胞)的方法和设备。所述方法包括：i)使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；和ii)使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向压缩应变和径向拉伸应变；和iii)按序重复所述步骤i)和ii)，直至生物材料聚结体分散至所需的较小尺寸。所述设备可以包括布置于回路构造中的流动通道，用于在所述流动通道中进行再循环，所述流动通道包括至少一个压缩部分，使流过所述流动通道的所述生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，进而经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。

Description

用于分散生物材料聚结体的方法和设备
背景技术
当使用生物材料聚结体(如动物组织、人工培养的动物细胞聚结体、植物组织、人工培养的植物细胞聚结体或植物胚胎形成质的聚结体)进行工作时，司空见惯的是，希望分散这些聚结体。
例如，当在悬浮液培养基中培养哺乳动物细胞时，该细胞往往相互粘附而形成球状团簇，当对该培养基进行继代移种时，对其进行分散是必要的。在悬浮液培养基中形成球形团簇的细胞实例包括HEK293细胞、胚胎干细胞和神经干细胞。
而且，当从组织样本开始该原发细胞培养时，往往要求温和地分散这个组织。
用于分散生物材料聚结体的已知方法包括酶处理和各种机械的分散方法。在PCT/US09/39981中就公开了一种分散设备。
在需要从所述生物材料聚结体回收活体细胞的情况下，尤其重要的是，分散方法一定要足够柔和，才不会过分损伤该细胞。在许多情况下，关注的是对于分散程度的控制。
因此，本发明的目的是，提供一种温和分散生物材料聚结体(如动物组织、人工培养的动物细胞聚结体、植物组织、人工培养的植物细胞聚结体或植物胚胎形成质的聚结体)的设备和方法。这种设备和方法的优点在于，分散程度是可控的。
发明内容
本发明涉及用于将生物材料聚结体(优选的是体外人工培养的生物材料)温和分散成较小的生物材料聚结体的方法和设备。
在第一个方面，提供了将悬浮于液体中的选自植物组织，人工培养的植物细胞聚结体和植物胚胎形成质的聚结体的生物材料聚结体分散成较小的生物材料聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)提供一分散器，其包括流动通道(100)，所述流动通道布置于回路构造中，用于所述流动通道(100)中再循环待分散的聚结体，所述流动通道(100)包括至少一段压缩部分(constriction)，使得流过所述流动通道(100)的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，随后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
ii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变的；
iii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和
iv)按序重复所述步骤ii)和iii)，直至所述生物材料聚结体分散成所需的较小生物材料聚结体。
在第二方面，也提供了一种将悬浮于液体中的植物胚胎形成质聚结体分散成较小的植物胚胎形成质聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)使所述植物胚胎形成质聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；
ii)使所述植物胚胎形成质聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和
iii)按序重复所述步骤i)和ii)，直至所述植物胚胎形成质聚结体分散成所需的较小植物胚胎形成质聚结体。
优选地，所述拉伸应变和压缩应变的强度随着每次重复序列而增加。按照这种方式，较大的聚结体将不会遇到太强的分散作用，而随着该聚结体变小，获得分散作用所需的分散效应提高。逐步增加这种分散效应，由此使得温和分散成更加细小的聚结体。
优选地，所述方法包括，视觉检查所述分散步骤重复之间的分散程度，在所述所需分散度达到时，终止所述重复操作。在最佳时间终止重复过程，使得对所分散的材料施加最短的可能处理时间和最低量的应力。
优选地，所需的较小聚结体具有0.5-2mm，更优选0.7-1.7mm，0.8-1.6mm或0.8-1.2mm的粒径范围。
在第三个方面，公开了一种用于分散生物材料聚结体的分散器，其包含的流动通道(100)包括至少一段压缩部分，使得流过所述流动通道(100)的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，而随后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变，其中，所述流动通道(100)布置于回路构造中，用于在所述流动通道(100)中再循环待分散的聚结体。
优选地，所述流动通道进一步包括一个混合室(101)，用于混合再循环之间和/或期间进行分散的所述聚结体。
优选地，所述混合室(101)包括透明壁部分，用于视觉检查正在分散的所述聚结体的粒径分布。
优选地，所述流动通道包含至少两个压缩部分，每个压缩部分的内径等于或小于其紧接上游的压缩部分的内径。
优选地，所述流动通道在各压缩部分之间包括具有恒定截面的中间部分。
优选地，每一中间部分的内径等于或小于其紧接上游的所述中间部分的内径。
优选，每一中间部分可以具有至少等于待分散的生物材料的粒径的长度。优选，每一中间部分的长度处于2.5mm～60mm，更优选约5mm～约30mm的区间(间隔)内。压缩部分的数目可以为3-100，优选5-20，最优选约10。优选，压缩部分具有区间为0.75～1300mm2，更优选区间为3～32mm2的横截面面积。
所述流动通道可以具有轴对称的横截面。所述流动通道可以具有基本圆形的或椭圆形的横截面。
流动通道的至少部分可以具有非轴对称的横截面，如矩形横截面。具有最大尺寸的每一非轴对称压缩部分的横截面可以优选定向为使得最大尺寸的每一压缩部分相对于按序的下一最大尺寸的非轴对称压缩部分而旋转，优选至少30°，更优选约90°。每一压缩部分的横截面可以代表一个矩形，具有第一侧和第二侧，其中，所述第一侧比所述第二侧长，所述压缩部分定向成使得每个压缩部分的第一侧垂直于按序的具有矩形横截面的下一压缩部分的第一侧。
分散器可以优选包含用于再循环所述流动通道(100)内的液体的装置。所述再循环装置优选包括一个泵(104)，优选蠕动泵。
在第四个方面，提供了一种分散生物材料聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)提供根据本发明所述第三方面的分散器；
ii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；
iii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和
iv)按序重复步骤ii)和iii)，直至所述生物材料聚结体分散成所需的较小生物材料聚结体。
所述分散的方法和设备的优点包括：
(1)除了可选的驱动液流通过分散器的装置之外，不需要移动部件，因此坚固耐用；
(2)提供可控的分散装置
(3)对生物材料是温和的
(4)快速
(5)该设备紧凑且完全封闭，使得易于消毒灭菌。
术语
术语“生物材料聚结体”包括可以分散的所关注的所有类型的生物材料聚结体。这些聚结体的实例包括动物组织、人工培养的动物细胞聚结体、植物组织、人工培养的植物细胞聚结体或植物胚胎形成质聚结体。
术语“植物胚胎形成质”总体地指，由存在于体细胞晶胚的液体或固体培养基中的未成熟胚胎形成组织，或晶胚和未成熟的胚胎形成组织构成的材料。
术语“未成熟胚胎形成组织”是指，除了存在于“植物胚胎形成质”中的晶胚之外的所有材料。术语“组织”在本文中按照非常规方式使用，由主要未分化的细胞构成，而不应混淆为具有专门细胞的植物组织的正常参考。
术语“胚胎形成团簇，晶胚簇或团簇”可以互换使用。这些术语是指在固体介质上或液体介质中结合到一起而作为有限尺寸的连续固体材料的植物胚胎形成质聚结体。
术语“体细胞胚胎、胚胎和植物体细胞胚胎”可以互换使用，是指衍生于植物体细胞组织的植物晶胚。
挪威云杉(Norway spruce)是具有拉丁名称欧洲土生云杉属(Piceaabies)的云杉物种。
术语“流体力学和流体动力学”可以互换使用，是指流体流动的相同物理原理。
术语“通道和管道”可以互换使用，除非另外指出，否则不特定暗示通路的几何形状。
在极坐标中的“正交方向”是以轴向、径向和角度(方位角)方向给出的。这些方向分别对应于垂直于圆柱体圆形横截面的圆柱体中心轴线，和沿着半径指向的径向方向，和垂直于横截面表面上的半径的角度方向。
“轴对称液流”是指管道横截面表面一直是圆形的管道内部的液流，因此，存在相对于该管道的轴线的对称性。换句话说，沿着角度(或方位角)方向没有变化。
“应力”是指每单位面积的作用力。
“应变”是代表材料本体内各点之间相对位移的变形几何度量，其表示为相对于原始尺寸的变形比率或百分数。
“法向应变”定义为沿着材料线元件的拉伸或压缩之比或百分量(在变形方向上的变形与原始长度之比)。
“剪切应变”定义为，变形相对于原始尺寸的比率或百分量，原始尺寸与材料平面层在彼此之上的滑动有关。
“拉伸应变”是元件拉伸时的法向应变。
“轴向拉伸应变”是沿着轴向拉伸的元件。
“径向拉伸应变”是沿着径向方向拉伸的元件。
“压缩应变”是元件收缩时的法向应变。
“轴向压缩应变”是指沿着轴向收缩的元件的形变。
“径向压缩应变”是指沿着径向方向收缩的元件的形变。
“应变速率”是应变关于时间的变化。
“液压直径”，Dh，是用于表征非圆形管道和通道中液流的术语。根据定义，Dh＝4A/S，其中，A是非圆形管道或通道的横截面面积，S是该横截面的润湿周长。
通道内的“平均速率”定义为体积流量除以该通道的横截面面积。
“收缩率”定义为出口处平均速率与通道进口处的平均速率之比。
“平均应力”是整个表面上平均的应力。
“平均应变率”是整个表面上平均的应变率。
流体的“动态粘度”是牛顿流体单元中剪切应力与剪切应变率之比。水、甘油、硅油都是牛顿流体的实例。
“应变分布(曲线)的速率”是显示应变速率变化的分布(曲线)。
以毫米计的长度单位缩写为“mm”。
作为秒倒数的应变速率单位缩写为“1/s”。
一般而言，具有较高平均应变速率的液流将会对悬浮于流体中的粒子或粒子聚结体施加较高的平均应力。
附图说明
图1图示说明了本说明书中所用的坐标轴参数。
图2图示说明了本发明设备的细节，其中，所述流通通道(100)是轴对称。
图3图示说明了本发明设备的细节，其中，所述流通通道(100)的部件是非轴对称的。
图4图示说明了本发明自动分散设备的一个实施方式。
表1.这些附图涉及的标号列表。
1        轴对称流动通道(100)的分段
2        轴对称流动通道(100)的分段
3～40    根据表3的尺寸
41       连接器管道
81       非轴对称流动通道(100)的分段
81a      81的横截面
82       非轴对称流动通道(100)的分段
82a 82   的横截面
42～90   根据表4的尺寸
100      具有压缩部分(分散器管道)的流动通道
101      具有可选的视觉检查开口/窗口的混合室
102      进口
103      出口
104      泵，优选蠕动泵
105      阀门，优选三通阀门
106      阀门，优选三通阀门
107      流体储备池
108      连接管道
具体实施方式
用于分散生物材料聚结体的方法
本发明公开了一种将悬浮于液体中的生物材料聚结体(优选，体外人工培养的生物材料)分散成较小的生物材料聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)提供一分散器，包括布置于回路构造中的流动通道(100)，用于在所述流动通道(100)中再循环待分散的聚结体，所述流动通道包括至少一段压缩部分，使得流过所述流动通道的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，随后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
ii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变的；
iii)使用所述分散器而使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
iv)按序重复所述步骤ii)和iii)，直至所述生物材料聚结体分散成所需的较小生物材料聚结体。
本发明也公开了一种将悬浮于液体中的植物胚胎形成质聚结体分散成较小的植物胚胎形成质聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)使所述植物胚胎形成质聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；
ii)使所述植物胚胎形成质聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；按序重复所述步骤，直至所述植物胚胎形成质聚结体分散成所需的较小植物胚胎形成质聚结体。
优选，所述拉伸应变和压缩应变的强度随着每次重复序列而增加。
优选，所述方法包括如下步骤：视觉检查所述分散步骤重复之间的分散度，而在所述所需分散度达到时，终止所述重复过程。
优选，所述生物材料聚结体选自由以下组成的组：体外人工培养的动物细胞聚结体，植物组织，人工培养的植物细胞聚结体和植物胚胎形成质聚结体。
优选，生物材料是植物胚胎形成质聚结体，并且所需的较小聚结体具有0.5-2mm，更优选0.7-1,7mm，0.8-1.6mm或0.8-1.2mm的粒径范围。
用于分散生物材料聚结体的设备
为了举例说明该分散设备的构造，本文详细公开了某些可能的实施方式。不应该将细节的内容诠释为限制性，除非明确说明是这样的。
整体构造
本发明提供了用于分散生物材料聚结体的分散设备。这种液体可以是任何不太发粘而能在该设备中流动并对生物材料温和的液体，优选是水、水基缓冲液或液体培养基。
分散器设备包括流动通道100。所述流动通道100可以制造成单一实体，或均包含单一分段的两个或更多个部件。所述流动通道100例如可以分别由两个部件(第一分段1/81和第二分段2/82)构成，参见图2/3。采用若干各个分段制作该设备是很有利的，因为这将会使该设备能够更容易适应不同起始材料并将会简化清洗操作和维护操作。
例如，该分散器的流动通道分段100可以连接至混合室101，其包含(在工作期间)含有生物材料聚结体的液体。该分散器流体通道100的第一分段100a可以通过连接管道108连接至第二分段100b，其中，设置了一个泵104。在该实例中，分散的生物材料在出口处离开第二分段100b，出口连接至同一混合室101，因而将现在更加分散的液体和生物材料返回至所述混合室101。
该分散器设备的流动通道100包括至少一段压缩部分，使得流过所述流动通道100的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，随后经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变。当所述流动通道100包括至少两个压缩部分，每一压缩部分可以具有的内径等于或小于其紧接上游的压缩部分的内径，以便对所述生物材料聚结体施加有效的分散力。优选，该分散器设备具有一套压缩部分，藉此重复施加应变，使得实现更有效的分散。例如，在一套压缩部分中的压缩部分数目可以为1～100，1～20，4～16或6～12，而优选的压缩部分数目为约10，这取决于待分散的聚结体的性质。较高的数目提供更强烈的分散作用，但是提高了要分散的生物材料上的应力。
所述流动通道100在每一压缩部分之间可以包括具有基本恒定横截面的中间部分。每一中间部分具有的内径可以等于或小于其紧接上游的所述中间部分的内径，由此一步步地提高分散力。
优选，所述流动通道100(除了经过专门考虑的压缩部分之外)具有基本圆形的横截面，如下所述。可以使用其它几何形状(如，椭圆形，六角形，八角形，具有倒角的矩形，或具有倒角的三角形)，只要生物材料不会在其通过所述流动通道100期间因为几何结构的原因而被破坏即可。具有圆形横截面的管道易于生产。
根据生物材料的类型，可以优选的是，所述流动通道100内侧是平滑的。内表面上的任何粗糙可能易于破坏某些脆弱的生物材料，由此最好为这些材料加以避免。对于其它类型的生物材料，可以优选的是，内表面可以具有一定程度的粗糙度。在某些情况下，这可能有助于分散作用，并且促进生物材料的生长和发育。
流体力学考虑因素
避免施加可能导致生物材料破坏的太多流体力学应力是至关重要的。另一方面，这些应力必须足以分散至少显著部分的这种聚结体。对于具体类型的生物材料聚结体、细胞线或要分散物质的最佳应力水平，可能需要通过实验进行确定。一旦已确定或获得最佳水平，就可以相应地计算分散器设备的必要参数。另外，分散器的最小和最大尺寸由所要分散的生物材料聚结体尺寸和分散后的生物材料聚结体所需尺寸所确定(施加温和应力)，该分散器可以构造成确定这种分散作用是否对即将形成的聚结体有效(详情见下文)。如果无效，则就可以构造和测试具有更强烈的分散活动的分散器，而该过程重复进行，直至获得满意的结果。
某些常数优选地在计算分散器设计的剩余参数之前进行确定。流体动态粘度影响流体力学力，并且应该选择预期的流体。优选地，该流体基本上是水，其公知的动态粘度能够用作分散器设备设计的恒定温度环境下的常数。水的动态粘度一般基本不会受少量的盐、简单碳水化合物、氨基酸或类似的低分子化合物影响。如果该流体的动态粘度不能从文献中获得，可以通过技术人员已知的方式进行实验确定。
流量也会影响流体力学力。所需流量可能部分取决于该分散器设备的所需容量，其中，更快的流速可能会允许更高的容量。为简单起见，分散器的设计优选基于恒定的流量，其能够作为分散器设备设计的另一个常数。通过改变流量(流速，flow rate)，随后就可以微调流体力学力，而无需修改设备的尺寸。
根据本发明，所述流动通道的内部尺寸沿着形成至少一段压缩部分(优选一套压缩部分)的流动方向而变化。这些压缩部分的内部尺寸是一个关键的参数，因为这是指示拉伸和压缩流体力学应变幅度的压缩部分内部尺寸的值，其为所述的拉伸和压缩流体力学应变，其对生物材料聚结体施加拉伸和压缩流体力学应变，温和地迫使该聚结体分散。
根据本发明，根据施加于所述生物材料聚结体上所需的拉伸和压缩应力水平和要分散的聚结体尺寸和具体类型，考虑到先前选择的流体类型和流量，来选择压缩部分尺寸。优选，压缩部分的内部尺寸从该管上游进口侧的最大尺寸至该管下游出口侧最小直径而按序降低。最下游侧的最小内部尺寸(在聚结体已完全分散的出口处)不得不至少足够大，以允许单个聚结体通过且不会破坏这种生物材料的分散聚结体。优选的最低尺寸等于或大于生物材料在所需分散水平下的聚结体的最宽部分。
关键尺寸
考虑到以上方面，对于所述流动通道100需要考虑几个关键的尺寸：
I.压缩部分的内部横截面尺寸及几何形状
II.压缩部分的长度
III.压缩部分内部的横截面尺寸及其外部几何形状
IV.压缩部分外部或之间的部分的长度
所述流动通道100的最低横截面尺寸应该大于要分散的最大聚结体的最大尺寸。所述流动通道100的最大横截面尺寸没有必要大于要分散的的最大聚结体的最大尺寸。所述流动通道100的中间部分(中间压缩部分)的尺寸没有必要大于要分散的最大聚结体的最大尺寸。
为了举例说明的目的，定义了圆柱坐标系统，如图1中所示。分散器设备中流动的大体方向是由z轴指示的轴向方向。该流动随着其通过分散器设备的膨胀和收缩而在方向r也具有速率的径向分量。流体速率的轴向、径向和角度(在θ方向上)分量分别定义为uz，ur和uθ。
所述术语“轴对称流”定义为是表示在角度方向上没有发生变化，或更精确地是其中(·)表示任何流动变量。术语是数学中所用的常见符号，是指偏导数，其在保持所有其它自变量不变的情况下测量因变量变化相对于分母中的自变量的速率。在该分散器设备的轴对称实施方式中，流体流动是轴对称的而角度速率分量uθ为零。
在轴对称管道的中心线上的流体流动的轴向应变的速率由定义，其中，当这个量为正时，流体流动处于拉伸应变，而当这个量为负时，处于压缩应变中。类似地，径向应变的速率通过测量，其中，一般而言，当该量为正时代表径向拉伸而当为负时代表径向压缩。
按照以上对于轴对称拉伸和压缩的相同定义，对于非轴对称分散器设备，流体流动不是轴对称的，由此，应变张量速率的所有分量都将为非零。
确定压缩部分和中间部分的长度
能够基于应变平均速率变化的各轴向分布来计算分散器不同部分的长度，其中，U是定义为体积流量除以r-θ平面上管道横截面面积的平均速率的符号。沿着流动方向的应变速率能够是常数，随着z呈线性变化，随着z呈2次方变化，沿着“平壁”通道随着应变速率变化而变化，或具有对z的其它函数依赖性。
关于z的平均应变速率的精确函数依赖性和变化并不是与平均应变速率的实际幅度一样显著。为了简便起见，我们使用了由限定的应变平均速率，B为常数时的情况。因此，每一分段的长度(如，例如图3中i＝61，...80)对于轴对称管道由Li表示，其能够基于那个分段中应变的恒定平均速率，Bi，进行计算，给出如下：
L i = Q π B i [ 1 R 1 , i 2 - 1 R 0 , i 2 ] 等式1
其中，Q是沿着该通道一直恒定不变的体积流量(基于质量守恒定律)，R是该管道半径，而关于该半径R的下标“0”和“1”分别定义了每一分段的进口和出口的半径。从现在开始，对于长度的这个关系式称之为等式(1)。这个平均应变速率Bi能够是正值或负值，这意味着，对于正的Bi，聚结体经历了一个拉伸应变的平均速率，而对于Bi的负值，该聚结体经历了一个压缩应变的平均速率。对于长度Li和平均应变速率Bi的大量组合是可能的。
等式(1)能够通过使用流体力学半径，Rh，的概念而被概括至非轴对称的情况，对于每一种情况，这个流体力学半径定义为流体力学直径的一半，或数学上描述为Rh≡Dh/2，其中，Dh为以上定义的流体力学直径。
也可以考虑基于线性、二次方或“平壁”的表述而确定收缩或膨胀分段长度的等式。这些等式可以发现于各种类型的收缩的文献(对于文献，请参阅，例如，Parsheh M.，Brown，M.，and Aidun，C.K.，“Fiber Orientationin a Planar Contraction：Shape Effect”Int.J.Multiphase Flow，32，1354-1369，2006)中。
如果分散器单元的长度存在限制，则能够考虑线性或二次方平均应变速率的情况。然而，如果按照逐步升高平均应变速率的幅度进行施加，则恒定的平均应变速率将会足以分散该聚结体。
基于要分散的聚结体尺寸来确定所述流动通道中间部分(中间压缩部分部分)的长度，而该长度应该至少等于要分散的任何聚结体的最大尺寸。例如，就实验室陪替氏(Petri)培养皿中成熟的挪威云杉体细胞胚胎团簇的情况下，直管部分需要至少10mm长，因为该团簇尺寸约10mm。对于生物反应器中成熟的胚胎团簇，其中团簇尺寸较大，则该管道长度和初始直径应该调节以适应该团簇的较大尺寸。由于该团簇随着分散过程的进行而变得较小时，中间部分的长度也可以逐步降低。例如，中间部分的长度在分散器流动通道开始之处可以为约60mm(优选约30mm)而在所述流动通道的末端之处为约2.5mm(优选约5mm)。
横截面尺寸的确定
平均流体力学应力与平均应变速率成正比(通过流体(优选是水)的动态粘度)。
收缩率，CRi，定义为进口至出口的横截面面积或平均速率之比，或根据流体力学半径而描述，这能够描述为，
CR i ≡ R o , i 2 R 1 , i 2 , 等式2
因为面积与半径的平方成正比。从现在起，这个关系式称之为等式(2)。这些对于几种情况计算的参数实例在表1中示出。对于挪威云杉胚胎团簇而言，收缩率＝3对应于某个平均应变速率，对于9.5毫米(mm)至5.5mm的收缩直径，B＝11(1/s)被认为对该胚胎团簇施加了温和的拉伸和压缩应力。对于收缩直径＝9.5mm～3.5mm，收缩率＝7对应于平均应变速率＝36(1/s)的情况，被认为是相对较强的拉伸和压缩应力。每当流体流遇到收缩通道或要不然称之为由流动方向上通道横截面面积降低表征的收缩时，该流体流一般将会经历轴向拉伸的应变速率和径向压缩的应变速率。当流体流遇到扩张通道或要不然称之为由流动方向上通道横截面面积增加表征的扩张时，该流体流一般将会经历轴向压缩的应变速率和径向拉伸的应变速率。所述术语“轴向”和“径向”是指在流动的一般方向上沿着管道中心轴线的空间方向(轴向)，和沿着管道从中心朝着垂直于轴向的表面的半径的空间方向(径向)。当聚结体进入压缩部分时，就会在流动方向上拉伸。随着聚结体离开压缩部分而进入膨胀部分时，沿着流动方向压缩而沿着径向方向而拉伸。这种反复拉伸和压缩(通过该分散器)就彼此相对地对生物材料的不同部分施加了温和的作用力。例如，当团簇中两个相连的植物晶胚进入压缩部分时，迫使前列的胚胎(leading embryo)比尾部的胚胎(trailing embryo)移动更快，因为围绕前列胚胎的流体向下游移动得比围绕尾部胚胎的流体快。这种作用产生了施加于某个胚胎上温和而又有限的拉力(相对于促进该晶胚分离的另一胚胎)。另一方面，当这对晶胚进入膨胀(扩张)部分时，该晶胚沿着轴向相互相对施压，而在径向上相互推离，进一步促进晶胚分离。
轴对称的横截面
所述流动通道100可以在整个长度上具有基本上轴对称的横截面。例如，所述流动通道100可以具有基本圆形的横截面。
非轴对称的横截面
所述流动通道100至少部分可以具有非轴对称的横截面。非轴对称分散器设备(参见例如图3)具有与对称分散器设备类似的内部，而不同之处在于，该压缩部分内部基本上不是圆形的。
这个内部能够是任何非圆形的横截面形式，比如，横截面43a，45a，47a，49a，53a，55a，57a或59a的椭圆形，六角形，八角形，三角形，椭圆形，椭圆形，正方形或长方形。甚至可以使用不规则形状的横截面。
轴对称的横截面和非轴对称的横截面能够组合于同一分散器中。
优选，具有最大尺寸的每一非轴对称压缩部分的横截面经过定向而使每一压缩部分的最大尺寸相对于按序的下一非轴对称压缩部分的最大尺寸旋转优选至少30℃，更优选约90°。这种定向不同的横截面比相似定向的横截面提供了更有效的分散作用。
优选，所述流动通道100至少部分具有矩形横截面。压缩部分的优选形式是具有圆角的矩形形式。
优选，每一压缩部分的所述横截面代表矩形，具有第一侧和第二侧，其中所述第一侧比第二侧长，而这些压缩部分经过定向而使每个压缩部分的第一侧垂直于按序的下一具有矩形横截面的压缩部分的第一侧。这种矩形交替的横截面比恒定横截面提供了更为有效的分散作用。横截面的角优选圆形化，以最小化对聚结体的应力。
表示该横截面尺寸的方式是其横截面面积(垂直于流动方向)。这种压缩部分可以具有区间为0.75～1300mm2，优选区间为3～32mm2的横截面面积。
所述流动通道的回路构造
本发明分散器的所述流动通道100布置于回路构造中，用于在所述流动通道100中再循环所述生物材料聚结体。这种回路排布设计使得通过相同的压缩部分重复循环这些聚结体，由此可构建更紧凑的、更简单而又更廉价的设备(相比于线性流动通道100的构造)。优选，所述流动通道进一步包含一个具有在再循环之间(或期间)混合要分散的物质的装置的混合室101。如果这种流动自身并不足以发挥混合作用，则这个混合装置例如就可以通过使用混合室101中移动(例如，旋转或振动)的物体或通过搅拌混合室101自身而实现。
优选，这个混合室101包含透明壁部分，用于视觉检查要分散的物质的粒径分布。与混合室101一起使用这种回路构，其中，可以视觉观察正分散的聚结体，使之能够监测和控制分散的程度。当混合室101中观察到所需分散水平时，就可以手动或自动终止这种分散。
可以通过确定正在分散的所述聚结体粒径分布而确定分散水平。这种粒径分布的确定可以视觉观察完成，优选，通过数字图像分析装置完成。例如，可以采用数字照相机对混合室101的内容物进行成像，而所得的图像通过计算机化的图像分析方式进行分析。这种图像分析可以用于确定正在分散的所述聚结体的粒径分布。一旦这种聚结体的粒径分布满足预定的阈值，就可以终止这种分散过程而回收所分散的物质，用于进一步的使用。
可以通过连接至所述流动通道100的泵104的装置来实现再循环操作，这种泵可以是任何合适的泵，优选低吸头和低容量泵。这种泵104的进口和出口被连接成使得在泵104运行时导致所述流动通道100中的液体发生再循环。这种泵也应该是不会破坏正分散的生物材料的泵类型。合适的泵实例是蠕动泵，但是，其它合适的泵在本技术领域内也是已知的。例如，所述流动通道第一分段100a的出口连接至泵104(优选蠕动泵)的进口，而第二分段100b的进口连接至泵104的出口。第一分段100a的进口连接至混合室101，而第二分段100b的出口也连接至混合室101。待分散的聚结体可以通过进口102供给至该混合室。通过使用可选的阀门105和106控制流量，这种阀门优选三通阀。连接至阀门105的流体储备池107可以用于在需要进一步移动分散的聚结体时提供流体。分散的聚结体可以通过出口103移除。参见图4进行举例说明。
某些具体实施方式
适用于挪威云杉胚胎形成质的非轴对称分散器的示例性尺寸表示在表2中。表2提供了基于等式(1)的计算的实例，其中，每一收缩管的长度都基于固定的所需应变速率确定，或该应变速率基于固定长度，Li，进行计算。该表中的第1栏是进口流体力学直径，第2栏是出口或收缩管的流体力学直径。第3栏是由等式(2)计算的收缩率。第4栏是典型值为1000mm3/s(即等于1mL/s)的体积流量。第5栏是10(1/s)的所需应变速率。第6栏是基于第5栏中固定应变速率(在这种情况下为10(1/s))的收缩管的计算长度。第7栏是基于来自等式(1)推导的以下关系式的等于10mm的长度的平均应变速率计算值。
B i = Q π L i [ 1 R 1 , i 2 - 1 R 0 , i 2 ] 等式(3)。
由等式(1)推导的这个关系式从现在起将称之为等式(3)。例如，对于图3的设备，i＝61，...80。
表2.基于所需平均应变速率和/或基于也施加于该分散器非轴对称部分的流体力学管半径的固定长度计算的尺寸参数的实例
并未对本文公开的本发明各种形式和组合作出任何限制，本文提供了两个具体实施方式，一个是手动分散器系统而一个是自动分散器系统，以及达到的操作结果的实例。
表3.涉及图2的尺寸标号列表
  横截面位置   内径[mm]   挪威云杉的优选内径
  (3)   3.0-10.0   9.0-9.5
  (4)   2.0-9.0   5.0-5.5
  (5)   3.0-10.0   9.0-9.5
  (6)   2.0-9.0   4.75-5.0
  (7)   3.0-10.0   9.0-9.5
  (8)   2.0-9.0   4.0-4.25
  (9)   3.0-10.0   9.0-9.5
  (10)   2.0-9.0   5.5-6.0
  (11)   2.0-9.0   5.75-6.0
  (12)   1,0-8.0   3.25-3.5
  (13)   2.0-9.0   5.75-6.0
  (14)   1,0-8.0   3.0-3.25
  (15)   2.0-9.0   5.75-6.0
  (16)   1,0-8.0   2.5-2.75
  (17)   2.0-9.0   5.75-6.0
  (18)   1,0-8.0   2.5-2.75
  (19)   2.0-9.0   5.75-6.0
  (20)   2.0-9.0   5.75-6.0
  有关细节的长度   长度[mm]
  (21)   30,0
  (22)   10,0
  (23)   30,0
  (24)   5,0
  (25)   30,0
  (26)   5,0
  (27)   20,0
  (28)   10,0
  (29)   20,0
  (30)   30,0
  (31)   5,0
  (32)   30,0
  (33)   5,0
  (34)   30,0
  (35)   5,0
  (36)   30,0
  (37)   5,0
  (38)   20,0
  (39)   10,0
  (40)   10,0
表4.涉及图3的尺寸标号的列表；例证内横截面尺寸
以下实施例应该诠释为非限制性的。
实施例
实施例1：手动分散器
根据本发明构建的分散器系统之一(手动分散器)由两个玻璃分散器管构成，一个内径9mm(管A)，而另一个内径6mm(管B)。管A具有3个轴对称压缩部分，每一个内径为5mm。管B具有4个非轴对称压缩部分，所有4个压缩部分具有基本上为矩形的横截面，内侧边等于3.5mm和4.5mm，而每一后续矩形压缩部分定向为相对于紧接相邻的压缩部分为90度。玻璃管A的出口附接有耐高压加热的柔软塑料(TYGON 3350硅树脂)管，连接至玻璃管B的进口。玻璃管B的出口附接有耐高压加热的塑料管，连接至蠕动泵上特殊耐高压加热的橡胶管道，并连接至另一内径6mm的玻璃管(管C)，具有内径20mm、长度55mm的圆柱形储液池，之后接着4mm的2个轴对称压缩部分，之后是内径3mm。
储液池提供了用于精密而清楚地观察和检查分散器管A和B下游团簇并确定该团簇是够足够小的装置。如果这些团簇并非足够小，则操作者能够使这些团簇再一次通过分散器管道，直至获得满意的尺寸。
实施例2：自动分散器
在本发明的一个实施方式中，该系统是自动的(自动分散器)，具有两个分散器管道100a和100b，这两个分散器管每一个具有四个(4)压缩区，一端连接至蠕动泵104而另一端连接至流动回路，如图4中所示。这个流动回路由宽10mm(垂直于观察平面的方向)，长50mm，高40mm的混合-可视化室101构成。这个混合可视化室101具有双重目的。其用于(a)连续保持所述生物材料聚结体分散和混合，如果必要，可采用该混合室下面安装的磁力搅拌器，和(b)采用数字视频成像和粒径分布的图像分析软件检查该聚结体的粒径(例如，参见http://www.smartimtech.com/analysis/images/sc_r21_2big.jpg)。一旦该聚结体的粒径分布降低至低于设定的阈值，该聚结体将会按照该工艺需要进一步引导至，例如，生物反应器或培养皿上。本文中描述了该设备的组件和操作步骤。
最初，胚胎形成团簇将会引入混合-可视化室，同时关闭三通电磁阀105和双通电磁阀106，并关闭蠕动泵，如图4中的示意性所示。随后混合可视化室的进口管102塞住并打开电磁阀105，以从分散器管道1流向混合可视化室。泵速度被调节以保持聚结体连续分散于该室内。如果该液流需要进一步搅拌才能保持该聚结体分散，则能够在混合室内安装磁力搅拌器。图像分析系统用于监测该聚结体的粒径分布，同时该团簇通过分散器管道并分离成较小尺寸的聚结体。该聚结体对液体介质的体积比不应该超过5％，才能获得最好的自动可视化和图像分析结果。然而，实际上，能够处理高达10％的体积比，但是体积比越大，结果由于聚结体的相互作用和聚结体图像重叠而越不精确。一旦图像分析系统报告了可接受的粒径分布，如就挪威云杉情况1mm或更低的团簇，则电磁阀106将会打开而105将会关闭，分散的物质通过出口103排出。
实施例3：在临时浸没式生物反应器系统中生长和培育挪威云杉的体 细胞晶胚
小簇挪威云杉的胚胎形成质(细胞线06:28:05，06:04:12，04:45:34)采用本文描述的分散设备(实施例1)进行处理后，通过50mL吸液管转移至临时浸没式生物反应器系统，并在低筛上均匀分散，以进行未成熟胚胎形成组织的增殖。在转移所述分散的体细胞胚胎团簇之前，支撑该体细胞晶胚增殖的培养基(用2,4D和BA进行1/2LP补充)用于该体细胞晶胚增殖。根据细胞线在增殖培养基上2～3星期之后，(a)增殖培养基根据以下实施例3中概述的方法重新分散；或(b)该培养基变化成未成熟培养基(pre-maturation medium)，例如DKM，或(c)成熟培养基，例如用ABA补充的DKM。在处理(b)和(c)后或单独(c)后，4～6星期后，在生物反应器筛表面上观察到许多浓密的成熟晶胚。这些成熟的晶胚基本上比不使用分散作用的情况更加均匀，具有显著的差异。在将分散的小团簇作为生物反应器中增殖的起始物质的情况下，每平方厘米的筛表面积平均有10～20个基本均匀的成熟晶胚数目。在临时浸没式生物反应器中的未分散团簇的情况下，这些晶胚出现在胚胎形成质的基本上呈球形的大团簇表面上。这些未分散团簇的直径约为20mm或更大。在大球形团簇的表面上平均有15个晶胚，基本上非均匀的发育状态表明了粒径变化的广谱分布。在人工培养于本文中使用的相同组成的固体介质上的体细胞晶胚的培养基中，即用ABA补充的DKM，成熟体细胞晶胚的产率和质量与临时浸没式生物反应器中的未分散培养基相当。
实施例4：固体培养基上人工培养的挪威云杉胚胎形成质的团簇的分 散
手动分散器管道的管A和C的两端都浸没于分散器容器内的液体介质中。整个系统在高压釜中灭菌并且在菌帽下完成本文中所述的过程。挪威云杉胚胎形成质(细胞线06:28:05，06:04:12，04:45:34)的几个团簇(从团簇的中截面选取的横截面平均流体力学直径范围为5～10mm)通过钳子夹至以上本发明的所述分散器容器(实施例1)中而从固体培养基表面收集。在培养基中最大的原始胚胎形成质(直径约10mm或更大)通过由钳夹撕扯而破成较小的团簇。尺寸上超过约5mm，则很难以进一步采用钳夹破碎。在加入这些团簇之前，向分散器容器中加入一定体积液体培养基，其与收集这些团簇的固体培养基组成相同。通过在这些团簇之上手动引导操作杆而通过连接至回路的蠕动泵施加的压力梯度使之通过分散器管道1，将分散器容器内液体培养基中的团簇收集至第一分散器管中。据观察，始终观察到，随着这些团簇通过第一分散器管并离开第二分散器管，这些离开第二分散器管的团簇要比进入第一分散器管的原始团簇小得多。这些由分散器管中的压缩部分产生的压缩和拉伸作用而产生的小团簇从分散器容器的第二分散器管释放出来。收集通过分散器管道一次的团簇并进行测定。据发现，通过分散器管道一次的团簇具有的直径处于团簇横截面流体力学直径0.5～2mm的范围内。一旦后续通过，该团簇将进一步破碎成较小的团簇，但是速率较慢。据观察，相比于较小的团簇，破碎较大的团簇比较容易。即，团簇越小，其进行破碎需要通过的次数越多。这是可以理解的，因为团簇尺寸比压缩部分小得多，则拉伸和压缩应变的效应将不太会发生。
小的细胞团簇均匀分散于部分浸没的生物反应器的筛上，用于进一步增殖和成熟。用2,4D和BA补充的培养基1/2LP或DKM应用于这种体细胞晶胚的增殖，或未成熟处理。根据细胞线在增殖培养基中2～3个星期之后，培养基变成未成熟培养基DKM，或用ABA补充的成熟培养基DKM。4～6星期之后，在生物反应器筛的表面上观察到许多浓密的成熟晶胚。成熟的晶胚基本上比未实施分散的情况更加均匀，具有显著的差异。在分散的小细胞团簇作为生物反应器中增殖的起始物质的情况下，每平方厘米的筛表面积平均有数目为10～20个基本均匀的成熟晶胚。在未分散团簇的情况下，这些晶胚出现在胚胎形成质基本上呈球形的大团簇表面上。这些未分散团簇的直径约为20mm或更大。在大球形团簇的表面上平均有15个晶胚，而基本上非均匀的发育状态表明了粒径变化的广谱分布。
实施例5：临时浸没式生物反应器中人工培育挪威云杉的挪威云杉胚 胎形成质的分散
将临时浸没式生物反应器系统尼龙筛顶上的挪威云杉胚胎形成质(细胞线04:45:34)的连续薄片浸没于液体培养基中。通过将第一分散器管(实施例1)手动引导至薄片中而破碎薄片，以将其破碎成较小的团簇。通过第一分散器管收集这些团簇并通过连接至回路的蠕动泵施加的压力梯度使之通过分散器设备(实施例1)。通过本发明关键功能的压缩和拉伸作用产生的这些团簇的较小部分从第二分散器管释放出来。反复地从分散器容器收集团簇并将其通过该分散器管道，导致该团簇横截面的平均流体力学学直径逐渐降低至约1mm，团簇尺寸变化约50％。分散的团簇通过50mL吸液管收集并转移至新的生物反应器容器中，用于进行新生物反应器培养的增殖。

Claims (27)

1.一种将悬浮于液体中的选自植物组织、人工培养植物细胞聚结体和植物胚胎形成质聚结体的生物材料聚结体分散成较小生物材料聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)提供一个分散器，所述分散器包括布置于回路构造中的流动通道(100)，用于在所述流动通道(100)中再循环待分散的聚结体，所述流动通道(100)包括至少两个压缩部分，在所述至少两个压缩部分之间包括具有恒定横截面的中间部分，其中，所述至少两个压缩部分的纵轴线彼此对齐，并且，其中，所述流动通道(100)的内侧是平滑的，使得流过所述流动通道(100)的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，进而经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；
ii)使用所述分散器，以使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；
iii)使用所述分散器，以使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变；以及
iv)按序重复步骤ii)和iii)，直至所述生物材料聚结体分散成所需的较小生物材料聚结体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述拉伸应变和压缩应变的强度随着每次重复序列而增加。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤：视觉检查所述步骤ii)和iii)的重复之间的分散程度，并且在达到所需分散程度时终止所述重复。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所需的较小尺寸的范围为0.5mm-2mm。
5.一种用于分散生物材料聚结体的分散器，包括流动通道(100)，所述流动通道包括至少两个压缩部分，使得流过所述流动通道的生物材料聚结体首先经受轴向拉伸应变和径向压缩应变，并进而经受来自流体力学力的轴向压缩应变和径向拉伸应变，其特征在于，所述流动通道布置于回路构造中，用于在所述流动通道(100)中再循环待分散的聚结体，其中，所述至少两个压缩部分的纵轴线彼此对齐，
进一步的特征在于，在所述至少两个压缩部分之间的具有恒定横截面的中间部分，并且
所述流动通道(100)的内侧是平滑的。
6.根据权利要求5所述的分散器，其中，所述流动通道(100)进一步包括混合室(101)，用于混合在再循环之间和/或期间正在被分散的所述聚结体。
7.根据权利要求6所述的分散器，其中，所述混合室(101)包括透明壁部分，用于视觉检查正在分散的所述聚结体的粒径分布。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的分散器，其中，每个压缩部分具有内径，所述内径等于或小于其上游紧接的所述压缩部分的内径。
9.根据权利要求5-7中任一项所述的分散器，其中，所述流动通道(100)在各压缩部分之间包括具有恒定截面的中间部分。
10.根据权利要求9所述的分散器，其中，每一中间部分具有内径，所述中间部分的内径等于或小于其上游紧接的所述中间部分的内径。
11.根据权利要求9所述的分散器，其中，每一中间部分具有长度段，所述长度段至少等于待分散的所述生物材料聚结体。
12.根据权利要求11所述的分散器，其中，每一中间部分的所述长度段在2.5mm～60mm的区间内。
13.根据权利要求5-7中任一项所述的分散器，其中压缩部分的数目为1-100。
14.根据权利要求5-7中任一项所述的分散器，其中，所述压缩部分具有的横截面面积在0.75～1300mm2的区间内。
15.根据权利要求5-7中任一项中任一项的所述分散器，其中，所述流动通道(100)具有轴对称的横截面。
16.根据权利要求5-7中任一项所述的分散器，其中，所述流动通道(100)具有基本圆形的或椭圆形的横截面。
17.根据权利要求5-7中任一项的所述分散器，其中，所述流动通道(100)的至少部分具有非轴对称的横截面。
18.根据权利要求17所述的分散器，其中，每一非轴对称压缩部分的具有最大尺寸的横截面被定向，以使每一压缩部分的最大尺寸相对于按序的下一非轴对称压缩部分的最大尺寸旋转至少30°。
19.根据权利要求17所述的分散器，其中，每一压缩部分的横截面代表具有第一侧和第二侧的矩形，其中，所述第一侧比所述第二侧长，并且所述压缩部分被定向成使得每个压缩部分的第一侧垂直于按序的下一具有矩形横截面的压缩部分的第一侧。
20.根据权利要求5-7中任一项的所述分散器，其中，所述分散器包括在所述流动通道(100)内再循环液体的装置。
21.根据权利要求20所述的分散器，其中，所述装置包括泵(104)。
22.一种分散生物材料聚结体的方法，所述方法包括至少一个分散序列，其包括以下步骤：
i)提供一个根据权利要求5-21中任一项所述的分散器；
ii)使用所述分散器以使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致轴向拉伸应变和径向压缩应变；
iii)使用所述分散器以使所述生物材料聚结体经受流体力学力，导致来自流体力学的轴向压缩应变和径向拉伸应变；和
iv)按序重复步骤ii)和iii)，直至所述生物材料聚结体分散成所需的较小生物材料聚结体。
23.根据权利要求18所述的分散器，其中，每一压缩部分旋转90°。
24.根据权利要求12所述的分散器，其中，每一中间部分的所述长度段在5mm～30mm的区间内。
25.根据权利要求13所述的分散器，其中，所述压缩部分的数目为5-20。
26.根据权利要求25所述的分散器，其中，所述压缩部分的数目为10。
27.根据权利要求14所述的分散器，其中，所述压缩部分具有的横截面面积在3～32mm2的区间内。
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