TR201816129T4 - Agregatlar i̇çi̇n di̇spersi̇yon ci̇hazi - Google Patents

Abstract

Bu buluş, hücre agregatlarının dispersiyonu için bir akış dispersiyon cihazını kapsamaktadır. Cihaz, bir birinci veya yukarı akış giriş engeli ve bir ikinci veya alt akış çıkış engeli içermektedir. Her bir engel, iki deliğin hizalanmadığı en az bir travers deliğe sahiptir. İki engel arasında bir türbülans bölmesi bulunur, öyle ki bir hücre süspansiyonu giriş delikleri içinden bölmeye geçer ve daha sonra ikinci engelden çıktığında, bölmedeki türbülans hücre agregatlarını bozar ve dağıtır. Cihaz isteğe bağlı olarak ikiden fazla engele ve türbülans bölmesine sahip olabilir ve bir hacim hücresine uygulanan türbülans miktarını ve süreyi arttırmak için çok sayıda ünite seri halinde yerleştirilebilir. Buluş ayrıca, hücre agregatlarını dağıtmak için aygıtı kullanma yöntemlerini ve tohumlama kültürlerini içeren ve dağılmış münferit hücreleri muhafaza eden hücre kültürü yöntemlerini kapsar.

Description

TARIFNAME AGREGATLAR IÇIN DISPERSIYON CIHAZI BULU ALANI Mevcut bulus, basta hücre agregatlari içeren kültür süspansiyonlari olmak üzere, agregatlarin dispersiyonu için içten akisli dispersiyon cihazlarina dairdir. Mevcut bulus, münferit hücreleri serbest birakmak için agregatlari disperse etmek üzere içten akis yöntemleri sunar. Mevcut bulus bunun ötesinde, hücre agregatlari içeren hayvan hücre süspansiyonlarinin homojeizasyonu için içten akis yöntemlerine dairdir.

BULUSUN ARKA PLANI Geçtigimiz 100 yil içinde hücre kültürleri biyoteknoloji alaninda pek çok uygulamayla sonuçlanmistir.

Hücre kültürlerindeki gelisme, bilhassa hücre üretkenliginin arttirilmasi, rekombinant proteinlerin ve asilarin, biyokitle üretilmesi ve hücre terapisi gibi hücrelerin yeni kullanimlari için yeni islemlerin gelistirilmesine imkan saglamistir.

Hücreler temelde iki uygulama için kültür edilir. Birincisi, alt kültür tarafindan hücre amplifikasyonu, yasama gücü olan hücrelerden olusan biyokitle üretiminde artisa neden olur. Bu söz konusu hücreler, hücre terapileri, viral enfeksiyonlar, enfekte hücrelerin elde edilmesi vb. gibi amaçlarla kullanilabilir.

Ikinci uygulama, tipik olarak hücre içinde bulunan ancak bunun her zaman söz konusu olmadigi, polinükleotidler, proteinler, hayvansal patojenler ya da bunlarin fragmanlari gibi ilgi duyulan biyolojik bilesiklerin izole edilmesidir. Bu biyoürünler ayni zamanda DNA asilari, alt ünite asilari, viral asilar, gen terapisi kompozisyonlari, ilaçlar vb. gibi baska ürünlere de katilabilir.

Hücre kültürlerinde görülen büyük bir sorun, hücre kültürü sirasinda meydana gelen hücre agregatlaridir. Hücre agregatlari, hücrelerin besine erisimini sinirlamak ve temasla büyümelerini inhibe etmek suretiyle hücre kültürlerinin, biyokitle ve amaçlanan bilesiklerin üretimi konusundaki verimini azaltirlar. Buna ek olarak hücre agregatlari basta apoptosise bagli olmak üzere hücre ölümlerini arttirirlar. Biyokitle üretimi için elde edilen hücreler, optimal alt kültür yapabilmek için Hücreler ya bir yüzeye yapisik olarak (yani ankoraj bagimli) ya da süspansiyon içinde (yani ankorajdan bagimsiz) büyürler. Hayvansal hücrelerden olusan hücre kültürleri genellikle ankoraj bagimlidir ve tekil hücre tabakalari (tek tabaka) ya da mikro tasiyicilarin yüzeyinde, kaplarda veya tüplerde büyürler. Döner sise teknolojisi, daha yüksek sayida ankoraj bagimli hayvan hücresini yetistirmek için biyoreaktörler içinde birim hacim basina mevcut olan büyüme alaninin artmasina imkan veren mikro Bu teknolojiler farmasötik ve medikal alanlarda, hücre büyümesi ve enfeksiyon, asi hazirlanmasi, rekombinant protein ekspresyonu ve bitki hücresi yetistirme gibi islemlerde 20 yildan fazladir kullanimdadir. Bu tekniklerin birçogu yayinlanmis ve rutin olarak kullanilmaktadir. (Örnegin bkz.

Freshney, R. I. Culture ofanimal cells: a manual of basic techniques. 3. Baski, 1994).

Ankoraj bagimli hücrelerin kültüründe tipik olarak, kültür hücre doluluk oranina ulastiginda, yasama kabiliyetini korumak üzere kültürün münferit hücrelere disagregasyonu arzulanir. Ankorajdan bagimsiz hücreler ayrica hücre salkimlari olusturur. Hücrelerin ne tip bir ankoraja sahip oldugundan bagimsiz olarak hücre salkimlarinin dispersiyonu sorun teskil eder. Sonuç olarak elde edilen disagrege süspansiyondan alt kültür ekilebilir ya da farmasötik olarak kabul edilebilir bir bilesigin kaynagi olarak dogrudan kullanilabilir. Hücrelerin dispersiyonu, hücre agregasyonu konusunda var olan problemlere karsi çözüm teskil edebilir ancak bu da sikintilidir. Nitekim hücrelerin kirilganligi nedeniyle stres ve ölüm ortaya çikar.

Hücreler siklikla altta yer alan kültür kabi yüzeyine 0 kadar iyi yapismislardir ki proteolitik enzimler (tripsin, kollagenaz, pronaz gibi), selatör ajanlar (etilendiamintetraasetik asid gibi) ve mekanik 67 (1985)) gerekli olur. Agregatlarin dispersiyonu için DNAz (Jordan et al. Animal Cell Technology: bu islemler genellikle münferit olarak münferit canli hücrelerin homojen bir dispersiyonunu elde etmekte yetersiz kalmaktadir. Burada her zaman mikroskop ve/veya çiplak gözle görülebilen hücre agregatlari kalmaktadir. Bir hücre agregati ya da salkimi degisen büyüklükte, bazen çiplak gözle görülebilen, münferit hücrelerin bir araya gelmesiyle ya da hücrelerin ilk hücre süspansiyonunda yer alan en az bir baska materyalle (döküntü, ekstraselüler matriks gibi) olusturduklari birliklerdir. Tanimi daha tercihen yaklasik 100 um büyüklüge sahiptir.

Yerinden çikarilip disperse edilen hücre süspansiyonlari ayni zamanda, örnegin tripsin gibi, hücreleri hasat ederken kullanilan kimyasallari ortamdan uzaklastirmak üzere birden çok asagi yönde isleme ihtiyaç duyabilir. Bu adimlar zaman alici ve üretim masraflarini arttirir ve istenmeyen reagregasyon ile sonuçlanabilir. Örnegin, bir santrifüj adimi istenmeyen kimyasal bilesiklerin uzaklastirilmasi için uygulanabilir. Ancak bu islem, kimyasali içeren ve atilacak olan bir süpernatan ve hasadi yapilacak hücreleri içeren bir çökelti olusumuna yol açar. Bir çökelti haline sikistirildiginda hücreler birbirine 0 kadar yakin ve sikistirilmistir ki hücre agregatlari olusur.

Virüs ve bakteriler gibi mikroorganizmalarla karsilastirildiginda ökaryotik hücreler ve bilhassa hayvan hücreleri, hücre duvarlari olmamasindan dolayi oldukça kirilgan ve kesme hassasiyetine sahiptirler.

Kesme hassasiyeti ayni zamanda hücre tipine (yani fibroblast mi, akciger hücresi mi, böbrek hücresi mi vs. olmasi), hücre yasi ve öyküsüne (çok sayida pasaj yapilmis yasli kültürler daha çok fragil hücre içerir) ve bakim sartlarina (sicaklik, osmotik basinç vb. gibi kültür sartlarinin varyasyonu stres yaratir) baglidir. Virüs enfeksiyonu da enfekte hücrelerin kesme hassasiyetine sahip olmasina neden olabilir.

Insan ve fare hücre kültürü deneylerinde 100 N/m2'lik duvar kesme kuvvetlerinin 0,5 saniye direnç süresi boyunca uygulanmasi önemli derecede hücre ölümlerine neden olur. EMbriyonik böbrek üzerinde yapilan çalismalar 0,26 N/m2 altindaki kesme kuvvetlerinin hücrelerin hayatiyetinde hafif düsüse yol açmakla birlikte hücre morfolojisinde herhangi bir degisiklik meydana getirmedigini göstermistir. (Harbour et al., Adv. Biochem. Eng., Vol. 29. pub: Springer-Verlag (New York), (1984)).

Bu bakimdan genel bir bakis açisi olarak hücre süspansiyonlarina uygulanacak kesme kuvvetleri hücre hayatiyetinde düsüse neden olabilir. Kesme kuvvetleri canli hücre elde etme verimini ve ayni zamanda mitozu inhibe etmek suretiyle hücrelerin çogalma yetenegini düsürebilir.

Farmasötik kullanim için iyi hayatiyet gösteren hücreler tercih edildiginden, hücre agregatlari içeren bir hücre süspansiyonunun dispersiyonunu nazik bir biçimde gerçeklestirecek bir metoda ihtiyaç duyulmaktadir. Kullanilan teknoloji bir yandan münferit hücreleri yüksek verimle salmayi saglarken, diger yandan hücrelerin hayatiyetini düsürmeyecek kadar da nazik olmalidir.

Bilinen hücre kültürü manipülasyon metotlari, nazik pipetleme (ECACC Handbook, Fundamental Techniques in Cell Culture. A Laboratory Handbook, "Protocol 5 - Subculture of suspension cell lines", 2005, edited by Sigma-Aldrich) gibi nazik metotlarla dispersiyonu içerebilir. Pipetleme tipik olarak hücre süspansiyonunun, içindeki tüm hücre salkimlari ortadan kalkana kadar manüel sekilde mükerrer sekilde aspirasyon ve rejeksiyonu seklinde uygulanir. Ancak bu manüel islem tutarli ve tekrarlanabilir degildir. Ayni hücre kültürü kullanilarak pipetten pipete ve operatörden operatöre farkli sonuçlar ortaya çikabilir. Ek olarak kesme hasari hem kesme kuvvetleri hem de etki süresinin bir fonksiyonudur. Fazla enerjik sekilde ve/veya uzun bir süre boyunca pipetlemek hücrelere zarar vererek hayatiyetlerini azaltabilir. Alternatif olarak fazla nazik ya da tutarsiz bir sekilde pipetlemek ve hücre salkimlarinin ne zaman ortadan kalktiginin tespit edilmesinde güçlük yasanmasi düsük bir hücre verimine neden olabilir. Nitekim kalan hücre agregatlari takip eden filtreleme islemlerinde atilacaktir.

Bu saglamlik eksikliginin yaninda nazik pipetleme metodu mesakkatli bir islemdir ve kontaminasyon riskini arttiran açik fazlara ihtiyaç duyar. Pipetleme, büyük hacimlerdeki islemlerde uygulanamayacak bir metottur. EP 590504 A no'lu uygulama, perforasyonlara sahip iki kesme plakasi elemani ve tübüler bir hazne içeren bir disagregasyon cihazini tarif etmektedir. Buna göre halen hücre agregatlarinin dispersiyonuna yönelik, kontaminasyon riskini önlemek üzere tercihen kapali bir sistemde gerçeklestirilecek büyük çapli islemlere ihtiyaç bulunmaktadir. Mevcut bulus, basta hücre agregatlari içeren kültür süspansiyonlari olmak üzere, kesme kuvvetlerine hassas agregatlarin dispersiyonu ve ayni zamanda münferit hücrelerin bütünlügünü korumak için bir içten akisli dispersiyon cihazi ve kesme kuvvetlerine hassas hücre agregatlarinin dispersiyonu ile münferit hücrelerin salinmasi için içten akis metotlari ile bu problemlere atifta bulunmaktadir.

Bu bulus, hücre agregatlarinin dispersiyonu için bir akis dispersiyon cihazini kapsamakta olup, cihaz, bir kanalin bir ucunda bir üst akis girisini, kanal içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'u oraninda tikanmasini saglayan en az bir travers delige sahip olan, bir birinci veya yukari akis giris engelini, kanalin içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'u oraninda tikanmasini saglayan en az bir travers delige sahip olan ikinci veya alttan bir çikis engelini içermekte olup, herhangi bir deligin herhangi bir engelden geçen longitüdinal aksi, daha önceki veya sonraki hiçbir engelin hiçbir deliginin Iongitüdinal aksiyla ayni düzelemde yer almaz ve birbirini takip eden iki engel arasindaki mesafe, iki engelden birinde yer alan en küçük deligin çapinin 0,1 ila yaklasik 10 katidir ve ayrica kanalin diger kolunda yer alan alt akis çikisi içermekte olup, burada cihaz kanalina giris ve yukari akis giris engeli cihazin birinci bölümünü olusturur ve cihaz kanalinin çikis ve asagi akis çikis engeli, cihazin ikinci bir bölümünü olusturur ve burada birinci ve ikinci bölümler ayrilabilir, buradaki cihaz ayrica bir aralayici conta içerir; ayrica, birinci ve ikinci bölümlerin her birindeki kanal, en az iki engel ve en azindan ara parçasi contasinin bir iç duvari tarafindan bir türbülans haznesini olusturacak sekilde, yan yana yerlestirilip sabitlenmistir. Bulusa göre cihazin çesitli düzenlemeleri, bu kanal boyunca dolasan akis yönüne dik olabilen, kanal içinde birinci bir engel içermektedir, ancak bunlarla sinirli degildir. Bu ilk engel, kanalin Iongitüdinal eksenine paralel, dairesel, oval, esmerkezli, dogrusal ve paralel olabilen ancak bunlarla sinirli olmayan herhangi bir konfigürasyondaki ve kanalin kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unu tikayan çok sayida delige sahip olabilir. Bulus en az bir tane de bu kanal boyunca dolasan akis yönüne dik olabilen ikinci bir engel içerir. Bu ikinci engel de, kanalin Iongitüdinal eksenine paralel, dairesel, oval, esmerkezli, dogrusal ve paralel olabilen ancak bunlarla sinirli olmayan herhangi bir konfigürasyondaki ve kanalin kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik ayni Iongitüdinal düzlemde yer almayip birinci ve ikinci engel arasindaki mesafe, bir deligin çapinin 0,1 ila yaklasik 10 katidir.

Mevcut bulusun avantajli bir düzenlemesinde, cihaz silindir seklindeki bir kanalin bir ucunda bir yukari akis girisini, birinci bir engel ve kanalin içinde bu kanal boyunca dolasan akis yönüne dik olarak, uzunlamasina eksenleri, kanalin uzunlamasina eksenine paralel olan ve kanalin kesitinin yaklasik % 98'ini tikayan 3 adet kesisme deligine sahip olan ikinci bir engel içerebilir. Birinci engel ile ikinci engelin deliklerinin Iongitüdinal eksenleri ayni düzlemde olmayacak ve iki engel arasindaki mesafe, her iki engelin en küçük deliginin yaklasik iki katidir ve kanalin diger ucunda bir asagi akis çikisi Mevcut bulus ayrica, agregatlarin dispersiyonu için, (1) bulusa göre bir dispersiyon düzenegi içinden hücre agregatlari içeren bir süspansiyon akmasini ve böylece agregatlari bozarak, istege bagli olarak (1) adimini tekrarlayarak süspansiyonun cihaz içinden yeniden akitilmasi veya seriye bulusa uygun akis dispersiyon cihazlarindan birden fazlasinin yerlestirilmesi ve (4) münferit hücreler ihtiva eden süspansiyonun elde edilmesi için bir akis metodu saglar.

Bulusun baska bir konusu, (1) besi yeri ve kültür edilecek hücreleri ile doldurulmus bir kültür partisine hücreleri ekmek, (2) adim (1)'de elde edilen ve hücre agregatlari içeren süspansiyonun bulus kapsamindaki en az bir akis dispersiyon cihazindan geçirilmesi, böylece agregatlarin bozulmasi, (3) adim (2)'de elde edilen ve münferit hücreler içeren süspansiyonun yeniden kültür partisine konmasi, (4) istege bagli olarak (1) ve (3)üncü adimlarin tekrari, ve (5) münferit hücreler içeren süspansiyonun hasadi asamalarini içeren bir hücre kültürü metodu sunmaktir.

Bu ve diger düzenlemeler, asagidaki Ayrintili Açiklama ile açiklanmakta veya anlasilmaktadir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Örnek olarak verilen ve bulusu tarif edilen spesifik düzenlemelerle sinirlama amaci tasimayan asagidaki detayli açiklama, burada referans olarak zikredilen ilisikteki sekiller ile baglantili olarak anlasilabilir; Sekil 1A, bir conta ile baglanmis ve tek delikli giris ve çikis engelleri ve tek bir türbülans odasina sahip iki kanal parçasini içeren bir dispersiyon cihazinin uzunlamasina kesit görünümünü göstermektedir.

Cihazdan sivi akis yönü, kalin okla gösterilir.

Sekil 13, bir sizdirmazlik elemani ve bir sabitleme vasitasi ile baglanmis iki kanal bölümünü içeren bir dispersiyon cihazinin uzunlamasina kesit görünümünü göstermektedir.

Sekil 2, bir conta ile baglanmis iki kanal parçasini içeren ve tek delikli giris ve çikis engellerine ve tek bir türbülans odasina sahip olan ve burada engellerin çikarilabilir plakalar oldugu akis dispersiyon cihazinin bir uzunlamasina kesit görünüsünü göstermektedir. Cihaz içerisinden akiskan akis yönü kalin okla gösterilir.

Sekil 3A, bir giris engelinin önden görünüsünü göstermektedir.

Sekil BB, bir çikis engelinin önden görünüsünü gösterir, burada çapraz delikler konsantrik degildir.

Sekil 4A, iki ardisik türbülans odasi içeren akis-dispersiyon cihazinin bir düzenlemesinin uzunlamasina kesit görünüsünü göstermektedir.

Sekil 48, iki ardisik odacigi ve bir emniyet aracini içeren, akis dispersiyon cihazinin bir düzenlemesinin bir uzunlamasina kesit görünümünü göstermektedir.

Sekil 4C, iki ayrilmaz türbülans odasina sahip olan bir tek bir ünite içeren, akis dispersiyon cihazinin bir düzenlemesinin bir uzunlamasina kesit görünümünü göstermektedir.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Bu açiklamada ve özellikle istemlerde, "içerir", “içermektedir”, "içeren" ve benzeri gibi terimlerin, ABD Patent yasasinda kendisine atfedilen anlama sahip olabilecegi belirtilir. Örnegin, "kapsar", sahiptir, örnegin, açikça belirtilmeyen elemanlara izin verirler, ancak önceki teknikte bulunan veya bulusun temel veya yeni bir özelligini etkileyen unsurlari hariç tutarlar.

Mevcut bulus, agregatlarin, özellikle hücre agregatlarini içeren kültür süspansiyonlarinin dispersiyonu için bir akis dispersiyon cihazini kapsamaktadir. Örnegin, Sek. 1A-2 ve 4A-C'nin, bir hücre kültürü sisteminden bir ortam/ hücre süspansiyonu çikisi ile seri olarak yerlestirilmesi tasarlanir, bu sayede hücre süspansiyonu, cihazin bir kanali (1) yoluyla ve dolayisiyla bir türbülans odasi yoluyla geçirilebilir. (2). Hücre süspansiyonu, kanalin (1) bir yukari akis girisi (3) yoluyla akis dispersiyon cihazina girecek ve kanaldan (1) bir asagi akis çikisi (4) yoluyla cihazdan çikacaktir.

Borunun (1) girisinin (3) ve çikisinin (4) iç duvarlari (10, 11), türbülans odasinin (2) çapindan küçük veya ona esit olan enine kesit çaplarina sahip olabilir. Bir kanal girisinin (3) veya çikisinin (4) bir enine kesiti, borunun (1) içinden geçen bir sivi akisinin yönüne dik olan bir kesittir.

Borunun (1) belirli bir biçimi, özellikle enine kesiti formlarinda herhangi bir kisitlama yoktur. Örnegin, kanalin (1) enine kesiti, bir dairesel, oval, kare veya dikdörtgen kesit olabilir, ancak bunlarla sinirli degildir. Türbülans odasinin (2) enine kesiti, avantajli olarak, zorunlu olarak, kanalin (1) formuna göre konfigüre edilir.

Içten akisli dispersiyon cihazinin türbülans odasi (2), iki engelin (sirasiyla 14, 15) karsit iç duvarlari, kanalin (1) yukari akis girisine (3) en yakin olan bir giris giris engeli (14) ve borunun (1) akis asagi çikisina (4) en yakin olan bir çikis çikis engeli (15) ve engelleri birbirinden ayiran mesafeyi belirleyen bir iç duvar (16) ile tanimlanir. Bu nedenle her bir engel (14, 15) kanal (1) içinde yer alir ve kanaldan geçen hücre kültürü akisinin akisini engellemek üzere akis dispersiyon cihazinin merkez eksenine en avantajli sekilde dik olarak yönlendirilir (1). Ayrica, Sekil 2'de gösterildigi gibi ikiden fazla engel olabilecegi düsünülmektedir. Örnegin Sekil 4A-4C'de, her bitisik çift engel ve kanalin iç duvari, her biri bir türbülans odasini (2) tanimlar, böylece seri olarak düzenlenmis çok sayida oda (2) olusturur.

Ayrica, bir birinci türbülans odasinin (2 ') çikis engeli (15), Sekiller 4A-4C`de gösterildigi gibi, birinci bölmenin (2') hemen asagiya dogru seri olarak yerlestirilmis ikinci türbülans odasi (2 ") için giris engeli olarak da islev görebilir.

Her bir yukari yönde giris engeli (14) ve bir alt çikis engeli (15), kanalin girisinin (3) ve çikisinin (4) türbülans odasi (2) ile iletisimine izin veren en az bir travers delik (16) ile delinmektedir. Bulusun akis dispersiyon cihazinin amaci için, bir travers delik, ayni bölüme sahip olan silindirik olarak sekilli bir deligin esdeger bir çapi ile tanimlanmaktadir. Bu esdeger çap avantajli olarak, kültürün tek bir canli hücresinin çapindan en az 25 kat daha büyük, daha avantajli olarak 50 kat daha büyük ve daha avantajli olarak en az yüz kat daha büyüktür.

Bir engelin (14, 15) travers delik (ler) inin (16) enine kesit alani veya kombine enine kesit alanlari, kanal (1) boyunca akiskan akisini yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9 arasinda engeller. Yüzde olarak ifade edilen sivi akis tikanikligi, asagidaki formül (X-Y) /X ile hesaplanir, burada X, kanalin kesit alanidir ve Y, engelin delik veya çok sayida deliginin alanlarinin toplamidir. Avantajli olarak, bir engel tarafindan yaratilan sivi akisi tikanikligi yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'dur. Daha avantajli olarak, engel tarafindan yaratilan sivi akisi tikanikligi yaklasik % 60 ila yaklasik % 99.9, daha avantajli olarak olarak yaklasik % 90 ila yaklasik % 99.9'dur.

Giris memesi giris engelinin (14) herhangi bir travers deligi (16), hemen akabinde asagi akim çikis engelinin (15) herhangi bir deligi (16) ile es-merkezli olabilir, yani bir deligin (16) Iongitüdinal ekseni, örnegin Sekiller 3A ve 3B'de gösterildigi gibi, akis dispersiyon cihazinin herhangi bir baska deliginin Yukari akis giris engelinin (14) ve asagi çikis çikis engellerinin (15) ve buradaki travers deliklerin (16) konfigürasyonlari, sinirlandirici olmamakla birlikte, bir dairesel, oval, kare veya dikdörtgen kesit, ne olan engellerin kalinligi ne de travers deliklerin sayisi, boyutlari ve formlari (16) ile sinirli degildir.

Travers delikler (16) ayni zamanda tek biçimli olmayabilir ve çesitli enine kesitlere sahip olabilir.

Cihazin, örnegin, tüm engelleri birer delige sahip olabilir. Cihazin tüm engelleri (14, 15) ayni büyüklük ve sekle sahip birkaç delige (16) sahip olabilir. Alternatif olarak, cihaz, farkli boyut ve biçimlere sahip sahiptir, ancak deliklerin boyutu ve sekli diger bir engelden farklidir.

Bulus kapsamindaki akis dispersiyon cihazinin, akiskanin türbülans odasindan (2) sizmasini önlemek ve iki karsit engel arasindaki ayrismaya katkida bulunmak (14, 15) üzere en azindan iki ayrilabilir kisim, bir giris kismi (3) ve örnegin Sekil lA'da gösterildigi gibi bir çikis kismi (4), istege bagli bir ayirici conta (5) içerebilecegi düsünülmektedir. Alternatif olarak, Sekil 2'de gösterildigi gibi, engeller (14, ), iki bölümün (3, 4) ayrilmasindan sonra kanaldan (1) ayrilabilir ve çikarilabilir. Baska bir düzenlemede cihaz, örnegin Sekil 4C'de gösterildigi gibi tek bir entegre ünitedir. Akisin içinden geçen dagitma düzeneginin ayrica, Sekiller 18 ve 4B'de sematik olarak gösterildigi gibi, örnegin, aygitin iki parçasinin (3, 4) ve istege bagli olarak ara parçasinin saglanmasi için bir sabitleme araci (6) içerebilecegi de düsünülmüstür. Conta (5), cihazdan geçen akiskan sizintisi olmaksizin çalisir sekilde baglanir. Sabitleme araçlari, bir kelepçe, karsit yaylar, elastik bir conta ve benzerleri olabilir, ancak bunlarla sinirli degildir.

Bu nedenle, bulusun bir yönü, agregatlarin dispersiyonu için bir akis dispersiyon cihazini kapsamakta olup, cihaz, bir kanalin (1) bir ucunda bir yukari akis girisi (3), kanalin (1) içerisindeki bir birinci veya üst akis giris engeli (14), kanalin (1) iç enine kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unu tikamayi saglayan en az bir travers deligine (16) sahip olan bu giris giris engeli (14), kanalin (1) içindeki ikinci veya alt akis çikis engeli (15), borunun iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'Iuk bir tikaniklik saglayan en az bir travers deligine (16) sahip olan bu asagi çikis deligi (15) burada herhangi bir engeli (14, 15) perfore eden herhangi bir deligin (16) uzunlamasina ekseni, önceki veya sonraki bir engelin herhangi bir deliginin longitüdinal ekseni ile hizalanmaz ve burada birbirini takip eden iki engel arasindaki mesafe, iki ardisik engelin en küçük deliginin yaklasik 0.1 ila yaklasik 10 kat olarak bulunur, ve kanalin (1) karsit ucunda bir alt çikis (4) içerir.

Bulusun kapsamindaki akis dispersiyon cihazinin çesitli düzenlemelerinde, birinci veya yukari akis giris engeli (14), deliklerin (16) enine kesit konfigürasyonlarinin dairesel, esmerkezli ve dogrusal arasindan seçilebilecegi, her bir deligin (16) uzunlamasina ekseninin, kanalin uzunlamasina eksenine paralel oldugu, böylece kanalin (1) kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unun tikanmasina neden oldugu ve burada deliklerin (16) birbiriyle ayni veya farkli olabildigi, çok sayida travers deligi (16) içerir.

Bulus kapsamindaki akis dispersiyon düzeneginin düzenlemelerinde, ikinci veya alt akis çikis engeli (15), deliklerin (16) enine kesit konfigürasyonlarinin dairesel, es merkezli veya dogrusal olarak seçildigi, her deligin uzunlamasina ekseninin, kanalin (1) uzunlamasina eksenine paralel oldugu, böylece kanalin (1) kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unun tikanmasina neden oldugu ve burada deliklerin (16) birbiriyle ayni veya farkli olabildigi, çok sayida travers deligi (16) içerir.

Bulus kapsamindaki akis dispersiyon düzeneginin avantajli bir düzenlemesinde, Sekil 3A'da gösterildigi gibi, birinci veya yukari akis giris engeli (14), deliklerin enine kesit konfigürasyonlarinin (16) dairesel, esmerkezli ve düzlemsel olarak seçilebildigi ve burada her deligin uzunlamasina ekseninin, kanalin uzunlamasina eksenine paralel seyrettigi, böylece kanalin kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unun tikanmasina neden oldugu ve burada deliklerin (16) birbiriyle özdes veya farkli olabildigi üç çapraz delik (16) ve Sekil SB'de gösterildigi gibi ikinci veya alt akis çikis engeli (15), deliklerin enine kesit konfigürasyonlarinin dairesel, esmerkezli ve düzlemsel olarak seçilebildigi ve burada her deligin uzunlamasina ekseninin, kanalin uzunlamasina eksenine paralel seyrettigi, böylece kanalin kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unun tikanmasina neden oldugu ve burada deliklerin (16) birbiriyle özdes veya farkli olabildigi ve herhangi bir deligin (16) birinci engel (14) boyunca uzanan longitüdinal ekseninin, ikinci engelin (15) herhangi bir deliginin longitüdinal ekseni ile hizalanmadigi üç çapraz delik (16) içerir.

Bulus kapsamindaki akis dispersiyon cihazinin çesitli düzenlemelerinde, üst akis giris engeli (14) ve asagi çikis çikislarinin (15), kanaldan (1) geçen akis yönüne dik olmasi, avantajlidir ancak zorunlu degildir.

Bulus kapsamindaki akis dispersiyon cihazinin çesitli düzenlemelerinde, giris engelini (14) ve asagi akis çikis engelini (15) çaprazlayan delikler, silindirik sekilli, esmerkezli ya da dogrusal olabilir, burada deliklerin uzunlamasina eksenleri borunun uzunlamasina eksenine paraleldir. Sekil 18`deki uzunlamasina kesitte gösterildigi gibi bulus kapsamindaki bir cihaz, bir birinci (3) ve bir ikinci kisim (4) içerir, burada sözü edilen birinci (3) ve ikinci (4) kisimlarin her biri bir kanal (1), bir uzunlamasina bir engele (14, 15) sahiptir. Böylece birinci (3) ve ikinci (4) kisimlar yan yana yerlestirilebilir ve bir türbülans odasi iki engel (14, 15) ve en azindan ara contanin (5) iç duvari (17) tarafindan tanimlanacak sekilde birbirine sabitlenebilir. (Bkz. asagidaki Örnek 1 ve Sekil 18).

Mevcut bulusun bir baska yönü, bu bulusa göre akis-dispersiyon cihazinin kullanilmasina yönelik bir yöntemi kapsamaktadir. Özellikle mevcut bulus, agregatlari, özellikle hücre agregatlarini içeren kültür süspansiyonlarini dagitmak için mevcut bulus kapsamindaki cihazin kullanimini kapsamaktadir. Bulus kapsamindaki, agregatlarin dispersiyonuna yönelik yöntem (1), bulus kapsamindaki en az bir tane akis dispersiyon cihazindan bir hücre içeren bir süspansiyonun akitilmasi, (2) agregatlari bozma, (3) istege bagli olarak adim (1) tekrarlayarak cihaz içerisinden hücre süspansiyonunu tekrar geçirmek ve (4) münferit hücreleri içeren süspansiyonu hasat etme asamalarini içerir. Agregatlarin dispersiyonu için bir yöntem, (1) en az bir dispersiyon düzenegi içinden bir hücre içeren bir süspansiyonun akitilmasi adimlarini içerir, bahsedilen düzenek silindirik sekilli bir kanalin bir ucunda bir yukari akis girisi içerir; borunun içinde bir ilk engel ve bu kanal boyunca dolasan akis yönüne dik olarak, bu ilk engel, kanalin uzunlamasina eksenine paralel üç çapraz delige sahiptir ve deliklerin birlestirilmis kesit alani kanalin toplam kesit alaninin yaklasik %Z'dir. Çikis borusu içinde bir ikinci asagiya dogru engel ve bu kanal boyunca dolasan akis yönüne dik olarak, bu ikinci engel, borunun uzunlamasina eksenine paralel olarak 3 adet travers delige sahiptir ve deliklerin birlestirilmis kesit alani yaklasik olarak kanalin toplam enine kesit alaninin % 2'si olup, buradaki asagi akis çikis engelinin delikleri, üst akis engelinin herhangi bir deligine ayni uzunlamasina hizalamaya sahip olmamak üzere, üst taraftaki engelin deliklerine göre konumlandirilir ve burada, bu iki engel arasindaki mesafe, bir deligin çapinin iki kati kadardir ve kanalin diger ucunda bir asagi akis çikisi, (2) agregalari bozar, (3) istege bagli olarak (1) adim tekrarlanarak süspansiyon yeniden akitilir, (4) münferit hücreler içeren süspansiyon hasat edilir.

Bulusun yönteminin bir düzenlemesinde, bulusun akiskan dispersiyon cihazlarinin bir çogunun agregatlarin dispersiyonu için kullanilabilecegi, cihazlarin seri olarak yerlestirildigi ve seri olarak yerlestirilmis cihazlarin tümünden hücre agregatlari içeren süspansiyonun akabilecegi de düsünülmektedir. Örnegin, iki ila yedi cihaz seri olarak yerlestirilebilir veya çoklu ardisik türbülans odalarina sahip tek bir cihaz kullanilabilir. Bir dispersiyon cihazi, resirkülasyon modunda kullanilabilir.

Hücre süspansiyon kabi, kanalin giris tarafindaki girisine ve kanalin asagi akis çikisina baglanir. Hücre süspansiyonu ardisik olarak ve sürekli olarak kanalin giris tarafindaki girisinden, türbülans bölmesinden, kanalin asagi akis agzindan akar ve hücre süspansiyon konteynerinin içinde geri dönüstürülür. Dagilim cihazindan litre/saat cinsinden islem akis hizinin, litre cinsinden hücre süspansiyonunun hacminin ve toplam islem süresinin bilinmesiyle, toplam islem süresi ile akis hizinin çarpilmasiyla ortalama sayida geçisin tespit edilmesi ve elde edilen degeri sonra hücre süspansiyonu hacmine bölmek mümkündür. Seriye üç ila bes dispersiyon cihazi yerlestirilebilir ve daha avantajli bir düzenlemede, bes dagitma cihazi seri olarak yerlestirilir. Bulusun bir baska yönü, (1) bir kültür ortamina kültürlenecek hücrelerin ekilmesi, (2) kültürlenmis hücrelerin bir besi yerine aktarilmasi veya süspansiyon haline getirilmesi- ki bu süspansiyonlar hücre agregatlari içerir - (4) istege bagli olarak adim (1) ila (3)'ün gerektigi kadar tekrari, (5) Adim (3)'te elde edilen dagitilmis hücre süspansiyonunun en azindan bir kisminin kültür kabina geri konarak yeniden kültür edilmesi adimlarini içerir.

Bulusun bu yönünün bir düzenlemesinde, kültür ortami mikro-tasiyicilar içerebilir.

Bulusun bu yönünün somut örneklerinde, bulus kapsamindaki akis dispersiyon cihazinin, sürekli bir döngü içinde kullanilabilecegi, bu suretle, kültür ortaminin, bunlar olusturuldugu gibi hücre kümelerini bozmak için cihaz içinde sirküle edildigi düsünülmektedir.

Mevcut bulus kapsamindaki cihaz ve usuller, sürekli bir akisli modda, agregatlari dagitmak ve parçalamak, böylece tek tek canli hücreleri serbest birakmak için hücre agregatlarini içeren bir hücre süspansiyonunu sivi türbülanslarina maruz birakmaya izin verir. Cihaz, pasif bir cihazdir ve rotor veya piston gibi herhangi bir hareketli parça içermez, bu sayede kolay temizlik ve hücrelerin hasar görme olasiligini azaltir.

Türbülans kuvvetleri, engelleri çaprazlayan engel delikleri boyunca ve iki ardisik engel arasindaki akisin yeniden yönlendirilmesi sirasinda sivinin hizlanmasi sirasinda agregatlara uygulanir. Birbirini izleyen iki engel arasindaki mesafe ve ilk engelin delik (ler) inin, bir sonraki engelin herhangi bir deliginin ayni Iongitüdinal düzlemde yerlesmemis olmasi türbülans olusturur. Ayrica, agregatlar ve daha spesifik olarak makroskobik agregatlar, agregat dispersiyonunu da destekleyebilecek engellerle çarpismaya yatkindir.

Mevcut bulusun sürekli akma modu, bir parti moduna (yani pipetleme yöntemine) kiyasla, türbülans sisteminin içinde ölü bosluklardan kaçinmanin avantajina sahiptir. Tüm hücreler, verimli bir agregat dispersiyonu için türbülans odasindan geçer ve sonuç olarak, bu bulusun sürekli akma modu, agregatlarin gelistirilmis dispersiyonuna yol açar. Mevcut bulusun cihazi ayni zamanda sürekli akis modunda çalisarak açik fazlari azaltmaya da izin verir, bu da kontaminasyon riskinin azalmasina neden olur.

Bir rotor / stator ajitatörü ve yüksek kesme kosulu ile karsilastirildiginda, bu bulusun sürekli akis modu, agregatlari cihazin içinde benzersiz ve hizli bir geçis ile sinirlar. Akis nedeniyle, agregatin engellerin deliklerinden iki kez geçmesi mümkün degildir ve sonuç olarak hücreler daha az streslidir ve hücre canliligi daha iyidir. Hücre tipi, kültür yasi ve tarih ve bakim kosullari ile ilgili oldugundan, hücre akis duyarliligi, islem akis hizi cihaz geometrisine ve hücre tipine göre ayarlanacaktir. Virüs enfeksiyonu genellikle kesme hassasiyetinin artmasina yol açar.

Bir hemasitometre ve bir mikroskop kullanilarak, hücre agregatlarinin yogunlugu, hücre agregatlarinin varligini veya belirlenmesini belirleyebildigi gibi kolaylikla ve hizli bir sekilde kurulabilir.

Hemositometre, canli hücrelerin yüzdesini belirlemek için canli hücreleri ölü hücrelerden ayirmak için de kullanilabilir. Bu amaçla sadece hayati olmayan dokulari ve hücreleri boyayan hayati leke göstergelerini kullanmak mümkündür. Hücreler bu tür göstergeler için geçirgen, ancak canli hücreler bunlari disarida tutabilmektedir. Ölü ve ölmekte olan hücreler, göstergeleri hariç tutamaz ve bu nedenle lekelenmeyi sergileyemezler. En yaygin yasamsal leke göstergesi tripan mavisidir hücre numaralandirma tekniklerini birlestirerek, canli hücrelerin sayisi (ölü hücrelerin sayisi + yasayan hücre sayisi) X 100 olarak hesaplanan bir hücre süspansiyonundaki canli hücrelerin yüzdesini kolayca degerlendirmek mümkündür. Ayni bilgiyi, propidyum iyodür veya 7-a aminoasinomisin D (7-AAD) gibi nükleik asit araya sokma ajanlari kullanilarak akis sitometrisi ile elde etmek mükündür (Wattre P., (2002)).

Bir hücre süspansiyonundaki canli hücrelerin yüzdesini bilmekle, tek tek hücrelerin yasayabilirligine saygi gösterirken, etkili bir hücre dagiliminin elde edilmesine izin veren optimal kosullari belirlemek kolaydir. Teknikte uzman bir kisi, optimal akis oranini belirleyebilmekte ve cihazdaki en uygun engel sayisini veya istenen sonucu elde etmek için seri olarak yerlestirilecek en uygun cihaz sayisini, yani münferit hücrelerin canliligini ve bütünlügü korurken etkili dispersiyonu belirleyecektir. Ideal olarak, hücre agregatlarini içeren süspansiyonun, mevcut bulus kapsamindaki cihazin delikleri boyunca arasinda ve daha tercihen yaklasik 0.5 ila yaklasik 5 m/ 5 arasinda olmalidir. Hücre kültürü metotlari (1) bir kültür ortami ile kültürlenmis ve hücrelerin kültürlenmesi, (2) asama (1) 'de elde edilen hücre agregatlari içeren süspansiyonun bulus kapsamindaki en az bir cihazdan akarak agregatlarin dispersiyonu, (3) asama (2) 'de elde edilen ve münferit hücreler içeren süspansiyonun yeniden kültür kabina ekilmesi, (4) istege bagli olarak (1) ila (3) adimlarini tekrarlamak; ve (5) adim (2) veya asama (4) 'den sonra elde edilen münferit hücreleri içeren süspansiyonun hasat edilmesi.

Bu, mikro tasiyicilar üzerinde kültür ile de yapilabilir, yani hücreler/ mikro tasiyici agregatlarini içeren kültür süspansiyonu bulus kapsamindaki en az bir cihazdan geçirilir. Hücreler/ mikro tasiyici agregatlarin dispersiyonu sirasinda, bulus kapsamindaki dispersiyon cihazinin kullanilmasi, dispersiyon için gerekli olan zamana ve/ veya ilave edilen triptik ajan veya proteolitik enzimlerin, özellikle tripsin miktarinin azaltilmasina izin verebilir. Kimyasal veya proteolitik dispersiyon basamaginda, bulusa uygun dispersiyon cihazi, devridaim veya sürekli akis modunda sürekli olarak kullanilabilir. Bir baska avantaj, kimyasal veya proteolitik dispersiyon asamasi sirasinda bulusa göre dispersiyon cihazinin kullaniminin, hücrelerin mikro tasiyicilardan daha iyi salinmasiyla sonuçlanmasidir. Bu kullanim, mikro-tasiyicilarin bertaraf edilmesinden sonra hasat edilen hücrelerin verimini arttirir. Hücre kültürü sirasinda en az bir dagitma cihazi sürekli olarak sirkülasyonda kullanilabilir. Hücre tipine, kültür tarihine ve bakim kosullarina bagli olarak, hücre agregatlari kültür sirasinda ortaya çikabilir. Bu agregatlari tek tek hücrelere dagitmak (yani apoptoz fenomenini önlemek için hücreler ve kültür ortami arasindaki temas yüzeyinin artmasi) faydali olacaktir. Bu özel durumda, bu bulusun dispersiyon cihazi, kapali devrede çalismasina izin verdigi için yeniden dolasimda kullanilabilir.

Bulusun araçlari ve yöntemleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, bakteri ve özellikle Escherichia coli (E. coli) gibi prokaryotik hücreleri ve bunlarla sinirli olmamak üzere maya, böcek hücreleri veya memeli hücreleri dahil, bitki hücreleri ve hayvan hücreleri gibi ökaryotik hücreleri içeren çesitli hücrelerle kullanim için uygundur. Ilgili biyolojik bilesikler, RNA'lar, DNA'lar, virüsler veya fajlar, proteinlerdir.

Mevcut bulusun kullanimi için özellikle uygun olan hayvan hücreleri, insan, primat, kemirgen, domuz, sigir, köpek, kedi, küçükbas, kus menseli ve bunlarin türevlerini içerir. Genel olarak, hayvan hücreleri, embriyonik bir doku numunesinden veya keratinositler, servikal epitel hücreleri, bronsiyal epitel hücreleri, trakeal epitel hücreleri, böbrek epitel hücreleri veya retinal epitelyal hücreleri gibi yetiskin doku örneginden türetilen birincil hücreler olabilen epitelyal hücreleri veya dönüstürülmüs hücreler veya yerlesik hücre dizileri (örnegin, 293 insan embriyonik böbrek hücreleri, HeLa servikal epitel hücreleri veya bunlarin türevleri (örnegin HeLaS3), PER-C6 insan retinal hücreleri ve HCAT insan keratinositleri) veya bunlarin türevleridir. Hücreler normal hücreler olabilir veya genetik olarak degistirilebilir. CHO hücreleri, COS hücreleri, VERO hücreleri, BHK hücreleri (BHK-21 hücreleri dahil), CLDK hücreleri, CRFK hücreleri, PK15 hücreleri, MDBK hücreleri, MDCK hücreleri, TCF hücreleri, TDF hücreleri, CEF hücreleri ve türevleri gibi diger hayvan hücreleri bunun da mevcut bulusun uygulanmasi için uygundur.

Hücreler, yerlesim veya santrifüjleme dahil olmak üzere teknikte uzman kisilerce bilinen herhangi bir yolla toplanir. Hücreler hasat edilebilir ve santrifüjleme, özellikle de kepçe santrifüjleme yoluyla konsantre edilebilir. Ayrica hücreler, sogutulmus bir formda veya dondurulmus bir formda saklanabilir.

Bulus simdi asagidaki sinirlayici olmayan örneklerle açiklanacaktir.

Tavuk embriyo hücrelerinin hazirlanmasi, üreme ve Marek Hastaligi Virüsü (MDV) ile enfekte edilmesi 1700 cmz'lik döner siselerde gerçeklestirilmistir. Bütün döner siselerdeki enfekte tavuk embriyosu hücreleri % tamamlandiktan sonra tripsinasyon ile ayristirilmis, ardindan 12 dakika boyunca 500g'de santrifüjlenerek hasat edilmistir.

Santrifüjlendikten sonra süpernatan ayrilarak çökeltiye dondurucu medya eklenmek suretiyle bir hücre süspansiyonu elde edilmis, ancak bu çiplak gözle görülebilen pek çok agregat içermekteydi.

Agregatlarin dispersiyonu için iki metot kullanilmistir. Birinci metotta, 406 döner sisedeki hücre süspansiyonlari 50 ml'Iik pipetle manüel pipetleme yapilarak homojenize edilmistir. Sonuçta elde edilen süspansiyon dogaçlama olarak SOOum bir naylon torbada süzülmüs, dondurucu medya eklenerek hacmi ayarlanmis ve ardindan analiz edilmistir.

Paralel olarak 48 döner sisede yer alan hücre süspansiyonu, bulus kapsamindaki ve Sekil 1'de gösterilen bir içten akisli dispersiyon cihazinda ardi ardina 8 kez islem görmüstür.

Dispersiyon cihazi iki bölümden olusmakta olup bunlarin her biri bir engel (kanal aksina dik bir plaka) ile sonlanan bir kanala (silindirik sekilli, 34 mm uzunlukta ve 36,5 mm iç çapa sahip) sahipti. Her plaka üç silindirik sekle sahip dik açili, her biri 3 mm çapinda, esit mesafelerde ve kanalin aksina paralel üç delik içermekteydi.

Bir kisimda delik ile kanal aksi arasi mesafe 31 mm idi (Bkz. Sekil 2A). Diger kisimda ise mesafe 10 mm idi (Bkz. Sekil 28 model).

Iki kanal, iki engel arasindaki mesafe yaklasik 6 mm olacak biçimde uç uca birlestirilmistir.

Santrifüjden elde edilen hücre süspansiyonu dispersiyon, bir peristaltik pompa kullanilarak cihazindan 150 I/saat'lik bir akis hiziyla enjekte edilmistir. Cihazdan her pasajdan önce ve sonra numuneler alinmis, 800um naylon filtrasyondan sonra analiz edilmistir. Dispersiyon cihazindan enjeksiyon ve numune alma ve analiz islemleri 7 kez tekrarlanmistir.

Numuneler münferit hücre miktarlari açisindan, Thomas hücresi kullanilarak görsel hücre sayimi metodu ile, yasama kabiliyeti açisindan FACS (floresan aktivasyonlu hücre ayirma) ile, agregat varliklari ise filtrasyon kalintilarinin görsel gözlemi ile analiz edilmistir. Bu sonuçlar tablo 1'de yer almaktadir.

Numune alinmasi Münferit hücre Yasama ka biliyeti Görsel gözlemler Virüs titresi sayisi (hücre/ml) (%) (LoglOpfu/ml) Filtrasyondan 3,0E07 80 Çok koyu, birçok 6,99 önce 1. pasaj büyük küme Filtrasyondan 4,4 E07 84 Filtrenin üzerinde 7,05 sonra 1. pasaj birçok küme, birçok kalinti Filtrasyondan 3,8 E07 77 Filtrenin üzerinde 7,16 sonra 2. Pasaj birçok küme, birçok kalinti Filtrasyondan 4,3 E07 75 Filtrenin üzerinde 6,83 daha az kalinti Filtrasyondan 5,2 E07 71 Filtrenin üzerinde 7,14 sonra 4. pasaj daha az kümeler, az kalinti Filtrasyondan 5,8 E07 70 Filtrenin üzerinde 6,95 az kalinti Filtrasyondan 4,9 E07 68 Filtrenin üzerinde 7,17 az kalinti Filtrasyondan 4,8 E07 66 Filtrenin üzerinde 7,1 az kalinti Filtrasyondan 4,4 E07 68 A2 kümeler 6,9 önce 8. pasaj Filtrasyondan 6,2 E07 69 Filtrenin üzerinde 6,95 az kalinti Filtrasyondan 4,1E07 63 Filtrenin üzerinde 7,02 sonra manüel çok az kümeler, az kalinti Bu sonuçlar, hücre agregati içeren kültür süspansiyonlarinin, bulus uyarinca içten akis dispersiyon cihazlarindan her pasajinin, hücre agregatlari üzerinde etkisi oldugunu göstermektedir. FACS analizi ile tespit edilen yasama kabiliyeti pasaj sayisiyla azalirken, diger yandan çiplak gözle görülebilen küme sayisi azalmis, viral titre ise sabit kalmistir. Bu tip hücre kültürüyle (MDV ile enfekte tavuk embriyosu hücreleri) agregatlarin dispersiyonu açisinda optimal sonuç bes pasajda elde edilmistir.

Bu sonuçlar ayrica, enfekte hücrelerin bulus kapsamindaki bir içten akisli dispersiyon cihaziyla sirali dispersiyonunun birçok agregatin dispersiyonu, münferit hücrelerin veriminin artmasi ve manüel pipetlerin kullanilmasina oranla daha çok hayatiyet kalmasina imkan saglamaktadir.

Tavuk embriyo hücrelerinin hazirlanmasi, üreme ve Marek Hastaligi Virüsü (MDV) ile enfekte edilmesi 1700 cmz'lik döner siselerde gerçeklestirilmistir. Bütün döner siselerdeki enfekte tavuk embriyosu hücreleri % tamamlandiktan sonra tripsinasyon ile ayristirilmis, ardindan 10 dakika boyunca 500g'de santrifüjlenerek hasat edilmistir. Yaklasik 2300 döner sise islemden geçirilmistir.

Santrifüjlendikten sonra süpernatan ayrilarak çökeltiyi içeren santrifüj kovasina dondurucu medyasi eklenmistir. Kaba bir hücre süspansiyon elde etmek üzere kova elle döndürülmüs, ancak bu halen çiplak gözle görülebilecek birçok agregat içermekteydi. Hücre süspansiyonu 10 dakika bekletilerek esit olarak alti konteynira bölünmüstür.

Bir konteynir hücre ayirma gerçeklestirilmeksizin standart olarak islem görmüstür. Hücre süspansiyonu dogrudan tülbentle süzülmüstür. Filtrat, doldurma isleminden önce dondurucu medya ile inceltilmistir.

Kalan konteynirlar, tülbent filtrasyonu ve dondurucu medya ile inceltme öncesi sürekli bir sekilde ayrilmistir. Ayirma için dispersiyon cihazlarinin (Örnek 1'de açiklanan dispersiyon aykitlari) sayisi ve islem akis orani bir seriden digerine degistirilmistirç Nihai ürünler deney karsilastirmasi için, döner sise basina hücre sayisi seklinde ifade edilen hücre sayilari bakimindan analiz edilmistir. Sonuçlar Tablo 2'de yer almaktadir.

Ayirma sartlari Islem gören sise sayisi Münferit hücre sayisi (milyon hücre/döner sise) cihazi 250 I/saat Standart 388 423 Seri halinde 3 dispersiyon 388 466 cihazi 50 l/saat Seri halinde 7 dispersiyon 388 452 cihazi 50 l/saat Seri halinde 5 dispersiyon 388 466 cihazi 150 I/saat Seri halinde 3 dispersiyon 367 431 cihazi 250 I/saat Seri halinde 7 dispersiyon 388 436 Bu sonuçlar, hücre agregati içeren kültür süspansiyonlarinin mevcut bulus uyarinca seriler halinde birden çok cihazda islem görmesinin, islem sonunda elde edilen münferit hücre sayisi üzerinde etkili oldugunu göstermektedir.

Bu sonuçlar ayrica seri haldeki içten akisli dispersiyon cihazi elemanlarinin sayisinin ve islem akis oraninin etkisi oldugunu göstermektedir. Optimal sonuçlar 50 I/saat islem akis hizi ve seri haldeki 3 dispersiyon cihaziyla, ayrica 150 l/saat islem akis hizi ve seri halde 5 dispersiyon cihaziyla elde edilmistir.

Claims (15)

ISTEMLER

1. Agregatlarin dispersiyonu için bir akis dispersiyon cihazi olup, cihaz, bir kanalin bir ucunda bir üst akis girisini, kanal içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'u oraninda tikanmasini saglayan en az bir travers delige sahip olan, bir birinci veya yukari akis giris engelini, kanalin içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'u oraninda tikanmasini saglayan en az bir travers delige sahip olan ikinci veya alttan bir çikis engelini içermekte olup, burada herhangi bir deligin herhangi bir engelden geçen Iongitüdinal aksi, daha önceki veya sonraki hiçbir engelin hiçbir deliginin Iongitüdinal aksiyla ayni düzlemde yer almaz, birbirini takip eden iki engel arasindaki mesafe, iki engelden birinde yer alan en küçük deligin çapinin 0,1 ila yaklasik 10 katidir ve ayrica kanalin diger kolunda yer alan alt akis çikisi içermekte olup, burada cihaz kanalina giris ve yukari akis giris engeli cihazin birinci bölümünü olusturur ve cihaz kanalinin çikis ve asagi akis çikis engeli, cihazin ikinci bir bölümünü olusturur ve burada birinci ve ikinci bölümler ayrilabilir, buradaki cihaz ayrica bir aralayici conta içerir; ayrica, birinci ve ikinci bölümlerin her birindeki kanal, en az iki engel ve en azindan ara parçasi contasinin bir iç duvari tarafindan bir türbülans haznesini olusturacak sekilde, yan yana yerlestirilip sabitlenmistir.

Istem 1'e göre cihaz olup, burada giris ve çikis engelleri, cihazdan veya bunlarin bölümlerinden çikarilabilirdir.

Istem 1'e göre cihaz olup, burada yukari akis giris engeli ve asagi akis çikis engeli, kanal boyunca sivi akisinin yönüne diktir.

Istem 1' göre cihaz olup, burada yukari akis giris engelini ve asagi akis çikis engelini geçen bir delik veya delikler, kanalin uzunlamasina ekseniyle paraleldir.

Istem 1'e göre cihaz olup, ayrica cihazin bütünlügünü korumak için bir güvenlik araci içermektedir.

Istem 1'e göre cihaz olup, burada giris borusu, giris ve çikis engelleri, türbülans odasi ve çikis borusu tek bir entegre ünite olarak olusturulmaktadir.

Istem 1'e göre cihaz olup, ayrica en az iki türbülans hücresini tanimlayacak sekilde en az bir ek engel içermektedir.

Istem 1'e göre cihaz olup, burada yukari akis giris engeli ve alt akis çikis engelinde, deliklerin enine kesit konfigürasyonlarinin dairesel, esmerkezli ve düzlemsel olarak seçildigi, böylece kanalin kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'unun tikanmasina neden oldugu ve burada deliklerin birbiriyle özdes veya farkli olabildigi, ve burada birinci engel boyunca herhangi bir deligin uzunlamasina ekseni, ikinci engelin herhangi bir deliginin uzunlamasina ekseni ile hizalanmadigi üç çapraz delik içermektedir.

Istem 1'e göre cihaz olup, bir kanalin bir ucunda bir üst akis girisini, zit yüzeylere sahip en az iki engel, bahsedilen engellerin kanal içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik yukari akis giris engelini, kanalin içinde, kanalin iç kesitinin yaklasik % 50 ila yaklasik % 99.9'u oraninda tikanmasini saglayan en az bir travers delige sahip olan ikinci veya alttan bir çikis engelini içermekte olup, burada yukari akis giris engeli ve asagi akis çikis engeli kanal boyunca akiskan akisin yönüne diktir ve giris engelini ve asagi akis çikis engelini geçen delikler,kanalin uzunlamasina eksenine paraleldir ve, burada herhangi bir deligin herhangi bir engelden geçen Iongitüdinal aksi, daha önceki veya sonraki hiçbir engelin hiçbir deliginin Iongitüdinal aksiyla ayni düzlemde yer almaz, ve türbülans odasi, birinci ve ikinci engellerin karsit yüzeyleri ve söz konusu engeller arasindaki kanalin iç duvariyla tanimlanmaktadir,ve burada birbirini takip eden iki engel arasindaki mesafe, iki engelden birinde yer alan en küçük deligin çapinin 0,1 ila yaklasik 10 katidir ve ayrica kanalin diger kolunda yer alan alt akis çikisi içermekte olup, burada cihaz kanalina giris ve yukari akis giris engeli cihazin birinci bölümünü olusturur ve cihaz kanalinin çikis ve asagi akis çikis engeli, cihazin ikinci bir bölümünü olusturur ve burada birinci ve ikinci bölümler ayrilabîlir, ve cihaz ayrica bir aralayici conta içerir; burada türbülans odasi iki engelin karsit yüzeyleri ve cihazin engeller arasinda kalan iç duvari ile tanimlanmaktadir.

Istem 9'a göre cihaz olup, burada kanal silindirik sekillidir, giris engeli, kanalin enine kesitinin yaklasik % 98 tikanmasini meydana getiren 3 delige sahiptir; çikis engeli, kanalin enine kesitinin yaklasik % 98 tikanmasini meydana getiren 3 delige sahiptir, burada çikis engelinin delikleri, giris engelinin herhangi bir deligi ile ayni Iongitüdinal hizalamaya sahip degildir ve burada, bu iki engelin ayrildigi mesafe herhangi bir deligin iki kati kadardir.

11. Agregatlarin dispersiyonu için bir yöntem olup, asagidaki adimlardan olusmaktadir: (1) hücre agregatlarini ihtiva eden bir hücre süspansiyonunun, Istem I'e göre en az bir cihazdan geçirilmesi; (2) hücre süspansiyonu içinde hücre agregatlarinin bozulmasi, (3) istege bagli olarak süspansiyonun cihaza geri gönderilmesiyle (1) adiminin tekrarlanmasi; (4) bozulan hücre agregatlarini içeren hücre süspansiyonunun hasat edilmesi

12. Istem 11'e göre yöntem olup, burada hücre süspansiyonu, Istem l'e göre çok sayida cihazin seri bir düzenlemesinden geçirilmektedir.

13. Bir hücre kültürü yöntemi olup, asagidaki asamalari içermektedir: (1) bir kültür ortamina kültürlenecek hücrelerin ekilmesi, (2) kültürlenmis hücrelerin bir besi yerine aktarilmasi veya süspansiyon haline getirilmesi- ki bu süspansiyonlar hücre agregatlari içerir (3) hücre agregatlarini içeren hücre süspansiyonunu, Istem 1'e göre bir akitma dispersiyon cihazi içinden veya bu tür cihazlarin bir seri düzenlemesinden geçirerek, hücre agregatlarini bozmak ve münferit hücreleri serbest birakmak; (4) istege bagli olarak adim (1) ila (3)'ün gerektigi kadar tekrari, (5) Adim (3)'te elde edilen dagitilmis hücre süspansiyonunun en azindan bir kisminin kültür kabina geri konarak yeniden kültür edilmesi

14. Istem 13'e göre yöntem olup, burada kültür ortamin mikro tasiyicilar içermektedir.

15. Istem 13'e göre yöntem olup, burada kültür asamasinda (3). adim süreklidir.